KR20190138264A - 인산화된 tfcp2l1을 포함하는 고형암 예후 예측용 바이오마커 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

인산화된 tfcp2l1을 포함하는 고형암 예후 예측용 바이오마커 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인산화된 TFCP2L1 단백질을 포함하는 고형암 예후 예측용 바이오마커 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 상기 인산화된 TFCP2L1 단백질의 양이 증가함에 따라 고형암 환자의 예후가 현저히 나빠지는 바, 이를 항암 치료 시 개인별 맞춤치료에 활용할 수 있으며, 또한 고형암세포로부터 치료제를 개발하기 위한 스크리닝 방법에 활용할 수 있다.

Description

인산화된 TFCP2L1을 포함하는 고형암 예후 예측용 바이오마커 조성물 및 이의 용도{Biomarker Composition for Prognosing Solid Cancer Comprising Phosphated TFCP2L1, and Uses thereof}
본 발명은 인산화된 전사인자 CP2-유사 단백질 1(Transcription factor CP2-like protein 1; TFCP2L1)을 포함하는 고형암 예후 예측용 바이오마커 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
배아 발달 및 성인 조직의 항상성 발달은 줄기세포(Stem cells: SCs)의 숫자에 의해, 줄기세포 자체 풀(pool)의 자가-갱신/유지를 겪거나 일생 동안 사용되는 대체 세포인 분화된 전구체들을 생성시킴으로써 조절된다. 전사인자(Transcription-factors; TFs)와 크로마틴 조절 단백질은 특정 유전자 발현 패턴을 유지함으로써 배아 단계에서 성인기까지 나타나는 줄기세포의 핵심 기능을 조절하는 데에 중요한 역할을 한다. 실제로, 독특한 만능특성을 유지하기 위해, 배아 줄기세포들(Embyonic SCs)은 OCT4, NANOG, SOX2와 같은 특정한 핵심 전사인자를 발현하는데, 이들은 분화된 체세포에서는 발현이 멈춰있다. 이러한 전사인자들은 만능성의 줄기세포가 미분화된 상태를 계속 유지하도록 유전자 발현을 강화하고, 반대로 분화-유도 전사는 억제함으로써 만능성의 핵심 회로망(circuitry)을 형성한다. 기대되는 바와 같이, 만능성 연관 전사인자들의 발현은 한 번 조직 발달이 완료되면 크게 억제된다.
특별히, 종양에서 배아 줄기세포 표현형을 유지하거나, 배양 시 배아 줄기세포의 급격한 증식에 공헌하는, STAT3, E-RAS, cMYC, KLF4 및 β-카테닌과 같은 여러 유전자가 장시간동안 비정상적으로 활성화 되는 것이 자주 발견되어왔다. 그러므로, 배아 줄기세포와 성체 줄기세포에서 상기 전사인자들과 신호전달의 엄격한 조절의 구체적인 메커니즘을 연구하는 것은 줄기세포의 정확한 분자적 본성과, 노화 및 발암 현상과 같은 병리학적 다양성의 이해를 증진시킬 것이다.
한편, 전사인자 CP2 패밀리의 하나인 Tfcp2l1은 마우스 배아에서 WNT 반응성 유전자로서 식별된 바 있다. Tfcp2l1의 발현은 일시적으로 배반포(blastocyst)의 내세포 집단에서 발견되었으며, 이식 후에는 즉시 하향조절되었다. 상기 초기 배아 발달 단계에서, Tfcp2l11은 만능성의 완전(naive)한 상태를 유지하는 데에 핵심적인 역할을 한다. 트랜스크립톰 프로파일에서 변화 분석을 기반으로, KLF2, KLF4, OCT4의 과발현에 의해 인간 배아 줄기세포가 완전한 상태와 유사하게 전환될 때, TFCP2L1의 발현이 특징적으로 상향조절됨이 발견되었고, 뮤린과 인간 배아줄기세포에서 만능성-연관 전사인자가 없어짐이 보고되었다. 기계적으로, 여러 가지 만능성 연관 유전자들이 TFCP2L1에 의해 표적되며, TFCP2L1의 전사는 Oct4, Nanog 및 Jmjd1a와 같은, 만능성에 요구되는 히스톤 디메틸화효소 만능성 인자들에 의해 조절된다. 게다가 TFCP2L1은 Oct4-중심 단백질 상호작용 네트워크의 구성원으로서 식별된 바 있다.
OCT4, NANOG와 같은 전형적인 만능성 전사인자와 달리, Tfcp2l1은 발달 중인 조직 또는 성체 조직의 상피, 특별히 상피 형태발생(morphogenesis), 기능 성숙 및/또는 항상성에 중요한 역할을 하는 외분비샘과 신장에서 발현된다. 실제로, Tfcp2l1 결함 마우스의 70%가 출생 후 5주가 되기 전에 신장의 형성 부전(hypoplasia) 때문에 죽었다. 만능성과 WNT 신호 사이의 연관성을 고려할 때, 성인 조직에서의 TFCP2L1의 발현은 엄격하게 조절되며 상주 줄기세포수로 제한된다. 조직 손상은 손상된 조직을 재생하기 위해 TFCP2L1-중심 발달성 경로의 활성화를 일으킬 수 있고, 조직에 대한 초과 자극은 악성 종양과 같은 병리학적 조건을 발생시키는데, 이러한 현상은 여러 주요한 배아 발달 유전자들(예를 들어 STAT3, E-RAS, CMYC, KLF4, β-카테닌)과 신호 전달 경로(NOTCH, WNT, HEDGEHOG)에서도 관찰된 바 있다. 그럼에도 불구하고, 아직까지 성인기의 병리생리학적 조건에서 TFCP2L1의 발현 레벨, 활성 및 번역 후 변형(post-translational modification) 상태를 조절하는 구체적인 분자적 메커니즘은 연구된 바가 없다.
한편, 방광암은 미국 남성에서 가장 흔히 나타나는 암 종으로, 방광암 중에서도 요로상피세포암종(urothelial carcinoma)이 환자의 90% 이상이 보이는 가장 흔한 조직학적 서브타입이다. 대략 70-80%의 방광암 환자들은 초기 진단 시 비침습적이거나 초기 침습적인(비-고유근육층 침습적; non-muscularis propria-invasive, NMIBC) 질병을 나타낸다. NMICB는 생명을 위협하지는 않지만, 결과적으로 NMICB 케이스의 50-70%가 재발하고, 15-25%가 고유근육층 침습적 방광암(muscularis propria-invasive, MIBC)으로 발달하여, 원격 전이(distant metastases)와 사망과 같은 높은 위험성과 관련되게 된다. 방광암에서 종양 단계 및 정도 등과 같은 임상병리학적 특징은 위험성 평가에 유용하다. 그러나 비슷한 임상병리학적 특징을 나타내는 환자들 사이에서 오직 소수의 도구만이 임상적 결과를 예측할 수 있다. 그러므로 방광암을 조절하는 데에 있어서 가장 큰 도전 중 하나는, 맞춤식 항암 치료에 있어서 공격적인 질병의 신규 예후 예측용 마커를 식별하는 것이다.
한국등록특허 제10-1557183호(2015.09.24 등록).
본 발명의 목적은 보다 효과적으로 고형암의 예후를 예측할 수 있는 바이오마커 조성물, 고형암 예후 예측용 조성물, 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 효과적으로 고형암을 예방, 개선 내지 치료할 수 있는 약학 조성물 또는 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 고형암 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 고형암 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인산화된 TFCP2L1 단백질 또는 상기 단백질의 단편을 포함하는 고형암 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 인산화된 TFCP2L1 단백질 또는 상기 단백질의 단편을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 고형암 예후 예측용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 고형암 예후 예측용 키트를 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TFCP2L1 단백질 또는 상기 단백질 단편의 인산화를 억제하는 인산화 억제제를 유효성분으로 포함하는 고형암 예방 또는 치료용 약학 조성물, 또는, 고형암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 고형암 환자로부터 분리된 시료에서, 인산화된 TFCP2L1 단백질 또는 상기 단백질 단편의 양을 측정하는 단계; (b) 상기 인산화된 TFCP2L1 단백질 또는 상기 단백질 단편의 양을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및 (c) 상기 인산화된 TFCP2L1 단백질 또는 상기 단백질 단편의 양이 대조군 시료보다 높을 경우, 예후가 좋지 않다고 판단하는 단계를 포함하는, 고형암 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 고형암세포에 시험 물질을 처리하는 단계; (b) 상기 고형암세포에서, 인산화된 TFCP2L1 단백질 또는 상기 단백질 단편의 양을 측정하는 단계; (c) 상기 인산화된 TFCP2L1 단백질 또는 상기 단백질 단편의 양을 시험 물질을 처리하지 않은 대조군 시료와 비교하는 단계; 및 (d) 상기 인산화된 TFCP2L1 단백질 또는 상기 단백질 단편의 양이 대조군 시료보다 감소된 경우, 상기 시험 물질을 암 치료제로 판단하는 단계를 포함하는, 고형암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은 인산화된 TFCP2L1을 포함하는 고형암 예후 예측용 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로, TFCP2L1은 CDK1에 의해 인산화되며, 이와 같이 인산화된 TFCP2L1의 양이 많아질수록 고형암 환자의 예후가 좋지 않은 바, 고형암의 예후를 예측하여 보다 효과적으로 암을 치료할 수 있을 뿐만 아니라, 새로운 암 치료제를 스크리닝하는 방법으로 활용할 수 있다.
도 1은 (A) TCGA 데이터세트로부터 얻은 방광암 코호트에서 TFCP2L1의 높거나 낮은 발현 레벨을 나타내는 환자들의 전반적인 생존율의 카플란-메이어 플롯 및 (B) 정상 방광 상피세포(HB1EpC) 및 두 개의 방광암 세포주인 J82 및 T24에서 특정 단백질들의 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 HB1EpC 및 T24 세포주에서 세포 증식(A) 및 종양 구 형성 어세이(B) 결과를 각각 나타낸 것이다(n=5, 인간 TFCP2L1 및 CDK1에 대한 개방형 해독틀(ORF) 또는 shRNA는 렌티바이러스 감염에 의해 전달되었다. T24 방광암 세포에서 종양 구 형성의 대표적인 그림은 X40(상층 패널) 또는 X200(하층 패널)의 배율로 나타내었다. 스케일 바 = 100 mm).
도 3은 (A) 25 uM 로스코비틴(Roscovitine)을 처리 혹은 비처리 5시간 후의 Flag가 태그된 TFCP2L1(Flag-TFCP2L1) 발현 세포에서의 인산화된 트레오닌 177(p-Thr) 검출을 위한 Flag-면역침전(IP) 분석 결과를 나타낸 것이고, (B) CDK1을 침묵시킨 Flag-TFCP2L1 발현 세포에서의 p-Thr 검출을 위한 Flag-IP 분석 결과를 나타낸 것이며, (C) Flag-TFCP2L1 및 CDK1 단백질 사이의 물리적 상호작용을 식별하기 위한 Flag-IP 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 400명의 환자의 방광암 시료의 경뇨도적 절제술을 포함한 조직 마이크로어레이 중 면역조직화학적 염색에 의해 측정된 트레오닌 177이 인산화된 TFCP2L1(p-TFCP2L1) 및 CDK1 발현의 조직 마이크로어레이 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 p-TFCP2L1(p=0.001) 및 CDK1(p=0.002) 단백질의 발현 레벨과 연관된 암-특이적 생존율의 카플란-메이어 플롯을 나타낸 것이다.
도 6은 400명의 환자 케이스의 p-TFCP2L1 또는 CDK1 단백질들의 H-스코어를 산점도로 나타낸 것이다(선형회귀분석 결과, p-TFCP2L1 및 CDK1 단백질 발현 사이에 양성 상관관계(p<0.001)가 있음을 나타냄).
도 7은 400명의 환자의 방광암 시료의 경뇨도적 절제술을 포함한 조직 마이크로어레이 중 오팔 다중 면역 형광 염색법의 결과를 나타낸 것으로, 방광암에서의 p-TFCP2L1(노란색), CDK1(빨간색) 및 사이토케라틴(초록색)의 대표적인 그림을 나타낸 것이다(핵은 DAPI[파란색]로 카운터염색하였다).
도 8은 p-TFCP2L1 및 CDK1 단백질 발현 및 공 발현의 임상병리학적 상관관계를 나타낸 것이다(통계학적 유의성 파라메터[p<0.05])들은 빨간색으로 표지하였다. * Not assessable : 소작 변성(cautery artifact), 파편화, 또는 부정확한 종양 조직의 방향이 원인임; PUNLMP; 낮은 악성화 가능성을 갖는 유두상 요로 상피 신생물).
도 9는 본 발명의 방광암 코호트에서 p-TFCP2L1 및 CDK1 단백질의 공 발현 비율과 관련된 암-특이적 생존율(p<0.001)의 카플란-메이어 플롯을 나타낸 것이다.
도 10은 암-특이적 생존율의 단변수 및 다변수분석 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 방광암 환자 400명의 p-TFCP2L1+ 세포에서 방광암 줄기세포 마커인 SALL4 및 CD44 발현의 조직 마이크로 어레이 분석(TMA)을 수행한 것으로, 보다 구체적으로 방광암에서 오팔 다중 형광 면역 염색 시, 사이토케라틴(초록색), p-TFCP2L1(노란색), CDK1(빨간색), CD44(초록색) 및 SALL4(주황색)의 대표적인 그림을 나타낸 것이다(핵은 DAPI[파란색]으로 카운터염색하였고, 결과이다).
도 12는 (A) p-TFCP2L1을 높이 또는 낮게 발현하는 세포들 중 CDK1, SALL4 및 CD44 발현 세포들의 비율을 사분범위수 변수의 중간값(n = 322, ***p<0.001)의 산점도로 나타낸 것 및 (B) 제안된 모델의 도식적 개요이다.
도 13은 KM 플로터 데이터베이스를 이용하여, 위암, 유방암, 자궁암, 폐암, 대장암, 신장암, 간암, 흑색종 및 신경교종암 환자에서, 높은 TFCP2L1 발현(빨간색) 레벨 또는 낮은 TFCP2L1 발현 레벨(검은색)에 기반한 생존율을 나타낸 것이다.
도 14는 유방암 세포주인 MCF7 세포에서 종양 구 형성 어세이 결과, 대표적인 그림을 나타낸 것(A; X40, X100, 또는 X200 확대; 스케일 바 = 100 mm), 이의 정량 데이터를 나타낸 것(B; 모든 데이터는 평균±SEM[n = 5]로 나타냄; 빈 대조군과 비교했을 때, ***p<0.001, 본페로니 사후분석과 함께 이원변량분석을 수행하였고, 인간 TFCP2L1 및 CDK1의 ORF는 렌티바이러스로 감염시켜 전달함), 및 총 TFCP2L1(t-TFCP2L1) 또는 인산화된 TFCP2L1(p-TFCP2L1) 및 CDK1 단백질의 발현량을 웨스턴 블롯 분석을 통해 분석한 결과(C)이다.
도 15는 (A) 인간 기형암종 세포(NTERA2)와 분화된 1차 섬유아세포(IMR90)로부터 준비된 세포 펠렛 블록에서, p-TFCP2L1, SOX2 및 SALL4 줄기세포 마커 단백질들에 대한 면역조직화학 결과(조직 마이크로어세이의 면역조직화학 분석법에 사용된 모든 항체들은 NTERA2로부터 얻은 항원에 특이적이며, 상업적으로 이용 가능한 TFCP2L1 항체(Aviva Systems Biology; OAAB09732)는 NTERA2 염색 시 신호를 거의 나타내지 않아 배제되었다), 및 (B) 정상 요로상피 시료에서의 p-TFCP2L1 및 CDK1의 면역조직화학 염색 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 400명의 방광암 환자의 종양 시료를 경뇨도적 절제술을 수행하여 얻은 조직 마이크로어세이 구조에서, (A) p-TFCP2L1 또는 CDK1 발현에 대한 수용자 작용 특징 곡선(Receiver operating characteristic curve; ROS) 및 (B) p-TFCP2L1 및 CDK1 단백질의 공발현에 대한 수용자 작용 특징 곡선을 나타낸 것이다.
도 17은 암 줄기세포 마커인 p-TFCP2L1, CDK1, SALL4 및 CD44의 오팔 다중 면역 형광 염색 시의 대표적인 도면을 나타낸 것이다.
도 18은 인간 TFCP2L1의 서열 정렬(sequence alignment)을 나타낸 것이다( 인산화된 트레오닌 177(T177) 잔기가 빨갛게 표시되어 있음).
도 19는 실험에 사용된 유전자 온톨로지(Gene-Ontology; GO) 카테고리와 대응 유전자들을 나타낸 것이다.
도 20은 Flag-태그되거나 비태그된 Tfcp2l1 발현 플라스미드로 트랜스펙션된 mESC을 대상으로 인산화된 Tfcp2l1의 Thr177(p-Tfcp2l1(T177))에 특이적인 다클론성 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다.(P-Tfcp2l1[T177]의 특이성은 블로킹 과정에서 2 mg 포스포-펩타이드 항원을 사용한 경쟁 어세이를 통해 확인하였고, Tfcp2l1-T177A 돌연변이 발현 세포는 신호를 거의 나타내지 않았다[왼쪽 패널]. 뮤린 및 인간 Tfcp2l1을 나타내는 펩타이드 항원의 아미노산 서열이 아래쪽에 기재되어 있고, 펩타이드 항원에서 인산화에 의해 변형된 T177는 빨간색으로 표시되었다. Tfcp2l1 단백질의 발현은 Flag 및 Tfcp2l1 특이적 항체를 이용해 확인되었으며[오른쪽 페널], 내재적 대조군으로 β-액틴을 사용하였다; W.B.; 웨스턴 블롯).
본 발명의 발명자들은, 방광암 환자에서, CDK1 및 TFCP2L1 캐스캐이드의 우연한 공활성화가, 높은 종양 정도, 림프혈관강침윤(lymphovascular invasion), 및 고유근육층 침습, 원격 장기로의 빈번한 전이 및 짧은 환자 생존율 등을 포함하는 공격적인 임상병리학적 파라메터와 관련된 암 줄기세포 활성을 자극함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 인산화된 TFCP2L1 단백질 또는 상기 단백질의 단편을 포함하는 고형암 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 TFCP2L1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있고, 상기 인산화된 TFCP2L1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열 중 177번째 트레오닌이 인산화된 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 상기 인산화된 TFCP2L1 단백질의 단편은 서열번호 2의 아미노산 서열 중 17번째 트레오닌이 인산화되거나 서열번호 3의 아미노산 서열 중 7번째 트레오닌이 인산화된 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 TFCP2L1 단백질 또는 상기 단백질 단편은 CDK1에 의해 인산화될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
이때, 상기 인산화된 TFCP2L1 단백질 또는 상기 단백질 단편의 양이 증가하는 경우, 고형암의 예후가 좋지 않다고 예측할 수 있다.
상기 고형암은 방광암, 대장암, 위암 및 신장암으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 명세서에서 용어 "예후(prognosis)"는 질병을 진단하여 판단된 장래의 증세 또는 경과에 대한 전망을 말한다. 예후의 예측은 향후 항암 치료의 방향에 대한 단서를 제시하므로 매우 중요한 임상적 과제이다.
더불어, 본 발명은 인산화된 TFCP2L1 단백질 또는 상기 단백질의 단편을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 고형암 예후 예측용 조성물을 제공한다.
상기 TFCP2L1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있고, 상기 인산화된 TFCP2L1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열 중 177번째 트레오닌이 인산화된 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 상기 인산화된 TFCP2L1 단백질의 단편은 서열번호 2의 아미노산 서열 중 17번째 트레오닌이 인산화되거나 서열번호 3의 아미노산 서열 중 7번째 트레오닌이 인산화된 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
이때, 상기 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 화합물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 고형암 예후 예측용 키트를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "항체"는 당해 기술분야에 공지된 용어로서 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로불린을 의미한다. 본 발명에서의 항체는 본 발명의 인산화된 TFCP2L1 또는 인산화된 TFCP2L1 단편에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 항체를 제조할 수 있다. 상기 항체의 형태는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 포함하며, 모든 면역글로불린 항체가 포함된다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태를 의미한다. 또한, 상기 항체는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.
본 명세서에서 용어 "펩타이드"는 표적 물질에 대한 결합력 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 붙여서 융합 단백질로의 이용이 가능하다. 구체적으로 고분자 단백질 체인에 붙여서 이용이 가능하므로 진단 키트 및 약물전달 물질로 이용될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "앱타머(aptamer)"란, 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지면서 표적 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 특별한종류의 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)으로 구성된 폴리뉴클레오티드의 일종을 의미한다. 상술한 바와 같이, 앱타머는 항체와 동일하게 항원성 물질에 특이적으로 결합할 수 있으면서도, 단백질보다 안정성이 높고, 구조가 간단하며, 합성이 용이한 폴리뉴클레오티드로 구성되어 있으므로, 항체를 대체하여 사용될 수 있다
또한, 본 발명의 키트는 마커 성분에 특이적으로 결합하는 항체, 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체(conjugate), 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액, 세척액 및 효소반응 정지용액 등을 포함할 수 있으며, 사용되는 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
더불어, 본 발명은 TFCP2L1 단백질 또는 상기 단백질 단편의 인산화를 억제하는 인산화 억제제를 유효성분으로 포함하는 고형암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 TFCP2L1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있고, 상기 인산화는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 TFCP2L1 단백질의 177번째 트레오닌에서 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 인산화는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 TFCP2L1 단백질 단편의 17번째 트레오닌에서 이루어지거나 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 TFCP2L1 단백질 단편의 7번째 트레오닌에서 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 인산화 억제제는 항체일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 약학 조성물은 상기 인산화 억제제 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 투여를 위해서 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약학 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 시간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있으며, 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 TFCP2L1 단백질 또는 상기 단백질 단편의 인산화를 억제하는 인산화 억제제를 유효성분으로 포함하는 고형암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 TFCP2L1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있고, 상기 인산화는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 TFCP2L1 단백질의 177번째 트레오닌에서 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 인산화는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 TFCP2L1 단백질 단편의 17번째 트레오닌에서 이루어지거나 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 TFCP2L1 단백질 단편의 7번째 트레오닌에서 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 인산화 억제제는 항체일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
상기 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일 주스, 합성 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 건강기능식품 조성물은 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알코올 및 비타민 복합제 중 어느 하나의 형태일 수 있다.
또한, 상기 건강기능식품 조성물은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, "식품첨가물"로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품 안정청에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반 시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 "식품첨가물공전"에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산 칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고랭색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류 첨가 알칼리제, 보존료제제, 타르색소 제제 등의 혼합 제제류 등을 들 수 있다.
더욱이, 본 발명은 (a) 고형암 환자로부터 분리된 시료에서, 인산화된 TFCP2L1 단백질 또는 상기 단백질 단편의 양을 측정하는 단계; (b) 상기 인산화된 TFCP2L1 단백질 또는 상기 단백질 단편의 양을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및 (c) 상기 인산화된 TFCP2L1 단백질 또는 상기 단백질 단편의 양이 대조군 시료보다 높을 경우, 예후가 좋지 않다고 판단하는 단계를 포함하는, 고형암 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
더불어, 본 발명은 (a) 고형암세포에 시험 물질을 처리하는 단계; (b) 상기 고형암세포에서, 인산화된 TFCP2L1 단백질 또는 상기 단백질 단편의 양을 측정하는 단계; (c) 상기 인산화된 TFCP2L1 단백질 또는 상기 단백질 단편의 양을 시험 물질을 처리하지 않은 대조군 시료와 비교하는 단계; 및 (d) 상기 인산화된 TFCP2L1 단백질 또는 상기 단백질 단편의 양이 대조군 시료보다 감소된 경우, 상기 시험 물질을 암 치료제로 판단하는 단계를 포함하는, 고형암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 TFCP2L1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있고, 상기 인산화는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 TFCP2L1 단백질의 177번째 트레오닌에서 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 인산화는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 TFCP2L1 단백질 단편의 17번째 트레오닌에서 이루어지거나 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 TFCP2L1 단백질 단편의 7번째 트레오닌에서 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상세하게는, 상기 인산화된 TFCP2L1 단백질 또는 상기 단백질 단편의 양을 측정하는 방법으로서, 웨스턴 블랏, 면역 효소 측정법(enzyme linked immunosorbent asay; ELISA), 방사선면역분석(Radioimmunoassay; RIA), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케이트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법 (Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩을 이용하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 "시험물질"은 TFCP2L1단백질 또는 상기 단백질 단편의 인산화에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 후보 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 고형암은 방광암, 대장암, 위암 및 신장암으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이며 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐이므로 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> TFCP2L1의 방광암 예후 예측용 마커로서의 용도 확인
1. 실험방법
1) 세포배양
인간 HBlEpC 1차 방광 상피세포(Cell Applications, Inc, San Diego, CA), J82 및 T24 방광암 세포주(ATCC), 유방암 세포주 MCF7(ATCC) 및 인간 기형암종 세포주 NTERA2(ATCC), IMR900 1차 섬유아세포(ATCC)들은 다음과 같은 조건에서 배양되었다: 정상 인간 방광(Cell Applications, Inc, San Diego, CA)으로부터 유래된 HBlEpC는 방광 상피 세포 성장 배지(Cell Applications, Inc)에서 배양시켰다. 배양 시 필요한 배양액으로 페니실린/스트렙토 마이신(Cellgro) 및 10% 열 불활성화 우태아혈청(FBS; Hyclone)이 보충된 둘베코의 수정 이글 배지(Dulbecco 's modified Eagle 's)의 배지액을 사용하였다. 또한, 맥코이의 5A 배지(McCoy 's 5A 배지 ; ATCC)에서 인간 방광암 세포주 J82 및 T24(ATCC, Manassas, 피츠버그, PA)를 37℃, 5%의 조건으로 CO2 인큐베이터에서 매일 배양액을 교체해 주면서 배양하였다.
2) TFCP2L1 상호작용체 및 인산화 부위 식별을 위한 프로테오믹 분석
인간 TFCP2L1 단백질의 전체 아미노산 서열은 도 18에 나타내었다.
TFCP2L1 상호작용 단백질 복합체는 면역 침전(IP) 실험에 의해 준비되었다. 구체적으로 다음과 같았다: IP 분석을 위해, 세포 추출물을 프로테아제/프로테아제 활성을 보충한 IP 용해 완충액(50 mM Tris-Cl [pH 7.4], 0.5 % NP-40, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 2 mM DTT, 2 mM EGTA) 및 포스파타제 저해제 혼합물(Roche)로 세척한 후, 원심 분리(12,000 g, 4℃에서 10 분간)하였다. 이후 세포 추출물에 벤조나아제 뉴클레아제(Benzonase Nuclease)의 200 단위의 존재 또는 부재 하에서, 4℃ 조건으로 3 시간동안 1 ㎍ 항체와 혼합된 ANTI-FLAG® M2 자기 비드(Sigma-Aldrich) 또는 단백질 G 자기 비드(Millipore, Sigma-Aldrich)를 처리하였다. 이렇게 면역 침전된 단백질을 IP 용해 완충액으로 4회 세척하였고, 결합된 단백질을 제조자의 지시에 따라 3x FLAG 펩티드(Sigma-Aldrich) 또는 0.1M 글라이신-염산(HCl) 완충액(pH 3.0)으로 용출시켰다.
상기 복합체는 다이티오트레이톨 및 알킬화된 이오도아세트아마이드로 환원되었고, 트립신으로 16시간 동안 37℃에서 분해되었다. 펩타이드 혼합물은 C18 카트리지를 이용한 고체상 추출물로 탈염되었고, 나노 LC 시스템(Shimadzu, Japan)과 연결된 질량분석기(Thermo Scientific LTQ Orbitrap-XL)에서 분석되었다. 식별을 위해서 유저 작성 스크립트(user written script)를 이용하여 로우(raw) 파일들을 mgf 파일로 처리하였고, 프로틴파일럿 소프트웨어(ProteinPilot Software ; AB Sciex, Framingham, MA, USA version 5.0) 및 콤파스 알고리즘(CompPASS algorithm ; Sowa et al., 2009)을 일반적인 오염물 단백질을 포함하는 유니프롯(UniProt) 표적-데코이 시퀀스 데이타베이스의 데이터들을 찾는 데에 사용하였다. 단백질 식별 시 2% FDR(false discovery rate)를 사후확률(Posterior Error Probability ; PEP) 알고리즘을 이용하여 결정하였다. 프로테오믹스 분석의 데이터세트는 하기 <표 1>에 나타난 바와 같았다.
Figure pat00001
3) TFCP2L1 상호작용 복합체 및 전사 표적의 정의
TFCP2L1의 전체-유전자 전사 표적은 이전에 보고된, 컷 오프 값(≥0.5 관련 스코어)을 갖는 TFCP2L1 ChIP-seq 데이터세트(GED11431; Chen, X. et al., Integration of External Signaling Pathways with the Core Transcriptional Network in Embryonic Stem Cells. Cell 133, 1106-1117)를 이용하여 선택되었다. 유전자 네트워크, 생기능 및 규범적 경로(canonical pathways)와 관련된 TFCP2L1 프로테오믹스 및 ChIP-seq 데이터세트의 기능성 분석은 디폴트 값이 셋팅된 메타코어(Clarivate Analytics, Philadelphia, PA) 마이크로어레이 소프트웨어를 이용하여 수행되었다. 구체적인 유전자 온톨로지(Gene-Ontology; GO) 카테고리와 대응 유전자들은 도 19에 나타난 바와 같았다.
4) 인간 방광암 연구 샘플
이 후향성 연구(retrospective study)는 서울아산병원(Asan Medical Center; AMC; 2013-107)의 생명윤리위원회(Institutional Review Board)에 의해 승인되었다. 본 연구의 인간 시료는 1996년 1월부터 2006년 12월까지 서울아산병원에서 경뇨도적 방광종양 절제술(transurethral resection of bladder tumor; TURBT)를 겪었으면서, 조직 마이크로어레이(tissue microarray; TMA) 구조에 사용할 수 있는 암 조직을 가진 403명의 환자를 포함하였다. 환자의 종양 재발, 원격 조직 전이 및 생존율을 포함하는 임상적 정보는 병원 차트의 전자 의무 기록으로부터 얻었고, 진단 재평가 및 2016 세계보건기구의 분류에 따른 조직학적 종양 단계를 평가하기 위해 초기 및 재발 종양을 포함하는 모든 병리학적 자료들을 검토하였다. TNM 분류 단계는 AJCC(American Joint Committee on Cancer Staging System)의 8번째 판에 따라 부여되었다.
또한, 조직 마이크로어레이(TMA)에 대한 보다 구체적인 실험 방법은 다음과 같았다: 방광암 환자 TMA 블록을 조직 마이크로 어레이 기구(Beecher Instruments, Silver Spring, MD)를 사용하여 분석하였고, 이때 방광암 환자 TMA 블록은 요도 절제술(TURBT) 시편이 10% 중성 완충 포르말린으로 고정된 뒤, 파라핀으로 포매된 요로 상피 방광암 조직 블록으로부터 제작되었다. 종양 이형성의 문제를 극복하기 위해, 각 종양의 다른 영역에서 3개의 대표적인 코어를 포함하도록 블록을 제조하였다. 또한 대조군으로 자궁경부암(대조군 1)과 대장암(대조군 13) 동물 및 자궁 절제술 또는 결장 절제술 중에 방광을 제거한 정상 유뇨 판막이(대조군 14)의 조직으로부터 블록을 제조하였다.
면역조직화학(immunohustochemistry; IHC) 염색 및 오팔 다중 면역 형광 염색(Opal multiplexed IF staining) 방법은 다음과 같았다: TMA 슬라이드는 2 명의 독립적인 병리학자(노병주 및 조영미)에 의해 평가되었으며, 이때 TMA 슬라이드의 IHC 및 오팔 다중 면역 형광 염색 후, p-TFCP2L1의 핵 양성율 및 암 세포에서의 CDK1의 핵 및 세포질 양성률을 각각 기록하였다. 염색 강도는 음성(0), 약한 (1+), 보통(2+) 또는 강함(3+)의 4 단계 시스템으로 분류하였다.
단백질 발현에 대한 도 16A 및 16B에 나타난 바와 같은 병리학적 및 면역 조직화학적 평가와 H-스코어링은 다음과 같이 수행하였다: 암 세포의 염색 강도(점수 0 내지 3+)에 면역 반응 세포의 백분율을 곱하여 0 내지 300 사이의 H 점수를 얻었으며 이를 표시하였다.
또한, 종양 구 형성 어세이는 다음과 같이 수행하였다: 먼저 방광암 환자에서 분리한 방광암 세포의 단일 세포 현탁액을 제조하였고, 혈청이 없는 케라티노사이트 성장 배지(Keratinocyte Growth Media ; Gibco, Waltham, MA)와 성장 인자 감소 마트리겔(Matrigel ; BD Biosciences, Mountain View, CA)를 1 : 1 비율로 재현탁한 뒤, 세포 현탁액 및 재현탁된 배지액을 울트라 로우 부착 플레이트(Ultra Low Attachment Plate ; Costar, Corning, NY)에 분주하여 단일 암 세포를 배양하였다. 이후, 종양 구체 형성을 첫 번째 배양 후 7일째에 분석하였는데, 배양체(embryoid body) 또는 종양 구체의 크기를 각 그룹으로부터 무작위로 선택된 8개의 대표 영역으로부터 경계를 깎아내어 Image J 소프트웨어(National Health, Bethesda, MD)를 사용함으로써 정량화하였다.
마지막으로 공발현 소집단화(co-expression subgrouping)은 다음과 같이 수행하였다: p-TFCP2L1 및 CDK1을 공동 발현하는 세포의 비율을 기록하였고, 각각의 경우를, 수신기 작동 특성 (ROC) 곡선 분석을 사용하여 계산 된 컷-오프 포인트에 기초하여 높은 공-발현 대 낮은 공-발현으로 분류하였다.
5) 통계학적 분석
인 비트로(in vitro) 분자적 및 세포 생물학 데이터들은 본페로니 사후분석(Bonferroni's post-hoc analysis)와 함께 일원분산분석(one-way ANOVA) 또는 이원분산분석(two-way ANOVA)으로 분석하였다. 또한, 모든 분석을 수행하기 위해 GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA)를 사용하였다.
방광암 환자 연구에서는, SPSS 버전 12.0을 사용하여 통계학적 분석을 수행하였고, 시험된 항체들과 임상병리학적 파라메터 사이의 상관관계를 결정하기 위해 피어슨의 카이 스퀘어(Pearson's Chi-square) 및 피셔의 정확 검정(Fisher's exact) 테스트를 수행하였다. 또한, 항체 발현과 임상병리학적 파라메터들의 임상적 유의성을 확인하기 위해 단변량 생존율 분석을 수행하였고, 다변량 분석을 통해 콕스의 비례위험모형(Cox proportional hazards model)으로 각 요소별 95%의 신뢰구간(confidence intercal; CI)을 사용하여 위험비(hazard ratio; HR)를 평가하였다. 모든 실험은 양측 검정으로 수행되었고, 0.05 이하의 P 값을 통계학적으로 유의하다고 간주하였다.
2. 실험결과
1) 요로상피세포암종에서 비호의적 예후의 바이오마커로서의 TFCP2L1
먼저, 성인기의 TFCP2L1의 비정상적 발현이 나타나는 방광의 상피조직에서, 종양형성에 미치는 TFCP2L1 인산화의 임상적 중요성을 확인하고자 하였다. 이에, 카플란-마이어 플로터(http://kmplot.com/) 또는 암 유전체 지도(Cancer Genome Atlas Cancer Genome; TCGA)의 공개된 데이터베이스를 이용하여, 특히 도 1A 및 도 13에 나타난 바와 같이, 방광암 및 위암, 대장암, 신장암 환자 중 높은 TFCP2L1 발현을 나타내는 환자들은 짧은 전반적인 생존률을 나타냄을 발견하였다. 반면에, 간암, 흑색종(menaloma) 및 신경교종(glioma) 환자에서는 TFCP2L1 발현과 생존률이 유의적인 관계를 나타내지 못했다. 더욱이, 1차 인간 방광 상피세포(HBlEpC)와 비교했을 때, 도 1B에 나타난 바와 같이, J82 및 T24와 같은 방광암 세포주들에서 TFCP2L1 및 CDK1 단백질과, KLF2 및 KLF4와 같은 전사 표적들의 발현량은 모두 매우 높았지만, OCT4 및 NANOG 단백질들은 거의 발현되지 않았다.
또한, 도 2A에 나타난 바와 같이, HB1EpC의 세포 증식은 TFCP2L1의 이소성 발현에 의해 자극되었고, TFCP2L1 및 CDK1의 공발현에 의해 더욱 강화되었지만, 이들을 침묵시키는 경우 이러한 증식은 억제되었다. 게다가, 도 2B에 나타난 바와 같이, 방광암 세포들의 종양 구 형성 능력은 TFCP2L1 및 CDK1 침묵에 의해 심각하게 손상되었고, 도 14A 내지 도 14C에 나타난 바와 같이, 유방암 세포주인 MCF7을 이용한 종양구 형성 어세이에서도 유사한 결과가 관찰되었다.
2) CKD1에 의한 TFCP2L1의 트레오닌 177번에서의 인산화 확인
다음으로, 여러 종들에서 TFCP2L1 단백질들의 트레오닌 177번(Thr177) 위치가 매우 잘 보존되어 있다는 사실에 기반하여, 방광암에서의 CDK1에 의한 TFCP2L1의 인산화(p-TFCP2L1)를 확인하였다. 즉, T24 세포에서의 Flag로 태그된 TFCP2L1의 면역 침전 분석을 수행하였고, 그 결과, 도 3A 및 도 3B에 나타난 바와 같이, CDK1의 발현 또는 활성에 의존해서 TFCP2L1 단백질들의 상당한 양이 인산화되었음을 확인할 수 있었다. 또한, 도 3C에 나타난 바와 같이, T24 세포에서 TFCP2L1 및 CDK1 단백질들은 물리적으로 상호작용하였는데, 이는 CDK1-TFCP2L1의 방광암에서의 기능적 경로를 입증해준다.
3) 방광암 진행과 TFCP2L1 및 CDK1 단백질과의 관계 확인
방광암 진행에 있어서, 인산화된 TFCP2L1 및 CDK1 단백질들의 발현 레벨과 공-발현의 기능을 확인하기 위하여, 400명의 환자들로부터 얻은 TURBT 시료로부터 형성된 조직 마이크로어레이 구조를 확인하였고, 임상적 결과와의 상관관계를 평가하였다. 또한, p-TFCP2L1(T177) 단백질에 특이적인 다클론 항체를 위하여 하기 표 2의 아미노산 서열을 표적으로 하는 항체를 제조하였으며, 도 20에 나타난 바와 같이, 웨스턴 블롯을 수행하였다.
아미노산 서열 서열번호
KRASAFIQVH CISTEFTPRK HGGEKGVPFR VQIDTFKQNE 2
CISTEFTPRK HG 3
이때, 400개의 모든 케이스들의 임상적 및 병리학적 특징들은 하기 표 3 및 표 4에 기재하였다.
Figure pat00002
Figure pat00003
그 결과, 도 15A 및 하기 표 5에 나타난 바와 같이, 인간 기형암종 세포주인 NTERA2으로부터 얻은 세포 블록을 대상으로 한 면역 형광(IF) 염색에서, p-TFCP2L1 항체는 특이적으로 p-TFCP2L1 단백질을 특이적으로 검출해내었지만, IMR900 1차 섬유아세포에서는 검출되지 않았다.
Figure pat00004
또한, 도 15B를 참조하면, p-TFCP2L1 및 CDK1 단백질은 정상적인 요로상피세포의 기저층 및 부기저층의 적은 세포에서만 발현되었는데, 이는 평균 10.0 H-스코어를 나타내었다. 대조적으로, 방광암 시료의 대다수에서, 도 6에 나타난 바와 같이, 매우 넓은 범위의 H-스코어가 나타남과 동시에(p-TFCP2L1; 87.7의 중간값, 0.0-231.0. CDK1; 100.0의 중간값, 0.0-291.0), 도 4에 나타난 바와 같이, p-TFCP2L1 및 CDK1의 발현이 현저하게 증가하였으며(각각 92.8%, 371/400 및 93.0%, 372/400), 이는 도 1B 및 도 2에 나타난 바와 같이 방광암 세포주로부터 얻은 인 비트로 실험 결과와 일치하였다.
다음으로 도 5를 참조하면, p-TFCP2L1 또는 CDK1 단백질들은 공격적인 임상병리학적 특징을 갖는 종양 시료에서 매우 높게 발현되었으며, 이러한 높은 발현량을 나타내는 환자군은 매우 현저하게 짧은 암 특이적 생존율을 보였다.
이에 따라, p-TFCP2L1의 높은 발현은, 도 8에 나타난 바와 같이, 높은 종양 정도(p=0.002), 높은 종양 단계(p=0.022), pT 카테고리(p=0.022), LVI(p-0.042), 고유근육층 침습(p-0.026) 및 암-특이적 사망(p-0.01)과 상관관계가 있는 것으로 나타났다. 또한, 높은 CDK1의 발현량도 높은 종양 단계(p<0.001), pT 카테고리(p=0.018), LVI(p= 0.023), 고유근육층 침습(p=0.011), 원격 전이(p=0.016) 및 암 특이적 생존율(p=0.001)과 관련이 있었다.
4) 방광암에서 TFCP2L1 및 CDK1 공발현의 임상적 중요성 확인
전술한 바와 같이, p-TFCP2L1 및 CDK1 단백질의 발현은 서로 양성(positive) 상관관계를 나타내었다(p<0.001, 도 6 참조). 이에, 이러한 공발현의 방광암에서 임상적인 중요성을 확인하기 위하여, 도 7에 나타난 바와 같이, 사이토케라틴(cytokeratin; CK)로 표지된, 방광암 환자에서 채취한 방광암 조직을 대상으로 오팔 다중 면역 형광 염색을 수행한 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, p-TFCP2L1 및 CDK1의 높은 공발현은 높은 종양 단계(p<0.001), 고유근육층 침습(p-0.041), 원격 전이(p=0.040) 및 암 특이적 사망(p<0.001)과 관련된 공격적인 임상 병리학적 특징과 현저하게 관련이 있음을 알 수 있었다. 또한, 도 9에 나타난 바와 같이, 이러한 공발현은 낮은 암-특이적 생존율(p<0.001)과 관련이 있었고, 도 10에 나타난 바와 같이, 나이, 림프절 전이 및 고유근육층 침습에 더하여, 다변량 분석에서의 암-특이적 생존율에 대한 독립적 예후인자(independent prognostic factor, p=0.04)와도 관련이 있었다.
또한, 도 11 및 도 17에 나타난 바와 같이, 오팔 다중 면역형광 염색 결과, 방광암 환자의 조직 내 p-TFCP2L1+ 방광암 세포들이 SALL4 및 CD44를 포함한 방광암 줄기세포(Cancer Stem cell)의 보고된 마커들을 많이 발현하였음을 확인할 수 있었다. 이들의 정량 결과는 도 12에 나타난 바와 같이, CDK1도 마찬가지로 높은 p-TFCP2L1 레벨을 나타내는 암세포들에 SALL4 및 CD44 단백질도 동시에 위치되어 있음을 나타내었는데, 이러한 결과로부터, 방광암의 발암 시 p-TFCP2L1+ 세포들이 암 줄기세포군을 대표할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.
<110> University of Ulsan Foundation For Industry Cooperation THE ASAN FOUNDATION <120> Biomarker Composition for Prognosing Solid Cancer Comprising Phosphated TFCP2L1, and Uses thereof <130> ADP-2019-0028 <150> KR 10-2018-0064199 <151> 2018-06-04 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 479 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TFCP2L1 <400> 1 Met Leu Phe Trp His Thr Gln Pro Glu His Tyr Asn Gln His Asn Ser 1 5 10 15 Gly Ser Tyr Leu Arg Asp Val Leu Ala Leu Pro Ile Phe Lys Gln Glu 20 25 30 Glu Pro Gln Leu Ser Pro Glu Asn Glu Ala Arg Leu Pro Pro Leu Gln 35 40 45 Tyr Val Leu Cys Ala Ala Thr Ser Pro Ala Val Lys Leu His Glu Glu 50 55 60 Thr Leu Thr Tyr Leu Asn Gln Gly Gln Ser Tyr Glu Ile Arg Leu Leu 65 70 75 80 Glu Asn Arg Lys Leu Gly Asp Phe Gln Asp Leu Asn Thr Lys Tyr Val 85 90 95 Lys Ser Ile Ile Arg Val Val Phe His Asp Arg Arg Leu Gln Tyr Thr 100 105 110 Glu His Gln Gln Leu Glu Gly Trp Arg Trp Ser Arg Pro Gly Asp Arg 115 120 125 Ile Leu Asp Ile Asp Ile Pro Leu Ser Val Gly Ile Leu Asp Pro Arg 130 135 140 Ala Ser Pro Thr Gln Leu Asn Ala Val Glu Phe Leu Trp Asp Pro Ala 145 150 155 160 Lys Arg Ala Ser Ala Phe Ile Gln Val His Cys Ile Ser Thr Glu Phe 165 170 175 Thr Pro Arg Lys His Gly Gly Glu Lys Gly Val Pro Phe Arg Val Gln 180 185 190 Ile Asp Thr Phe Lys Gln Asn Glu Asn Gly Glu Tyr Thr Glu His Leu 195 200 205 His Ser Ala Ser Cys Gln Ile Lys Val Phe Lys Pro Lys Gly Ala Asp 210 215 220 Arg Lys Gln Lys Thr Asp Arg Glu Lys Met Glu Lys Arg Thr Ala Gln 225 230 235 240 Glu Lys Glu Lys Tyr Gln Pro Ser Tyr Glu Thr Thr Ile Leu Thr Glu 245 250 255 Cys Ser Pro Trp Pro Asp Val Ala Tyr Gln Val Asn Ser Ala Pro Ser 260 265 270 Pro Ser Tyr Asn Gly Ser Pro Asn Ser Phe Gly Leu Gly Glu Gly Asn 275 280 285 Ala Ser Pro Thr His Pro Val Glu Ala Leu Pro Val Gly Ser Asp His 290 295 300 Leu Leu Pro Ser Ala Ser Ile Gln Asp Ala Gln Gln Trp Leu His Arg 305 310 315 320 Asn Arg Phe Ser Gln Phe Cys Arg Leu Phe Ala Ser Phe Ser Gly Ala 325 330 335 Asp Leu Leu Lys Met Ser Arg Asp Asp Leu Val Gln Ile Cys Gly Pro 340 345 350 Ala Asp Gly Ile Arg Leu Phe Asn Ala Ile Lys Gly Arg Asn Val Arg 355 360 365 Pro Lys Met Thr Ile Tyr Val Cys Gln Glu Leu Glu Gln Asn Arg Val 370 375 380 Pro Leu Gln Gln Lys Arg Asp Gly Ser Gly Asp Ser Asn Leu Ser Val 385 390 395 400 Tyr His Ala Ile Phe Leu Glu Glu Leu Thr Thr Leu Glu Leu Ile Glu 405 410 415 Lys Ile Ala Asn Leu Tyr Ser Ile Ser Pro Gln His Ile His Arg Val 420 425 430 Tyr Arg Gln Gly Pro Thr Gly Ile His Val Val Val Ser Asn Glu Met 435 440 445 Val Gln Asn Phe Gln Asp Glu Ser Cys Phe Val Leu Ser Thr Ile Lys 450 455 460 Ala Glu Ser Asn Asp Gly Tyr His Ile Ile Leu Lys Cys Gly Leu 465 470 475 <210> 2 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TFCP2L1 fragment <400> 2 Lys Arg Ala Ser Ala Phe Ile Gln Val His Cys Ile Ser Thr Glu Phe 1 5 10 15 Thr Pro Arg Lys His Gly Gly Glu Lys Gly Val Pro Phe Arg Val Gln 20 25 30 Ile Asp Thr Phe Lys Gln Asn Glu 35 40 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TFCP2L1 fragment <400> 3 Cys Ile Ser Thr Glu Phe Thr Pro Arg Lys His Gly 1 5 10

Claims (21)

  1. 인산화된 TFCP2L1 단백질 또는 상기 단백질의 단편을 포함하는 고형암 예후 예측용 바이오마커 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 인산화된 TFCP2L1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열 중 177번째 트레오닌이 인산화된 것을 특징으로 하는 고형암 예후 예측용 바이오마커 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 단백질의 단편은 서열번호 2의 아미노산 서열 중 17번째 트레오닌이 인산화되거나 서열번호 3의 아미노산 서열 중 7번째 트레오닌이 인산화된 것을 특징으로 하는 고형암 예후 예측용 바이오마커 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 고형암은 방광암, 대장암, 위암 및 신장암으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 고형암 예후 예측용 바이오마커 조성물.
  5. 인산화된 TFCP2L1 단백질 또는 상기 단백질의 단편을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 고형암 예후 예측용 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 인산화된 TFCP2L1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열 중 177번째 트레오닌이 인산화된 것을 특징으로 하는 고형암 예후 예측용 조성물.
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 단백질의 단편은 서열번호 2의 아미노산 서열 중 17번째 트레오닌이 인산화되거나 서열번호 3의 아미노산 서열 중 7번째 트레오닌이 인산화된 것을 특징으로 하는 고형암 예후 예측용 조성물.
  8. 제 5 항에 있어서, 상기 제제는 상기 단백질 또는 단백질 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 화합물인 것을 특징으로 하는 고형암 예후 예측용 조성물.
  9. 제 5 항 내지 제 8 항에 따른 조성물을 포함하는 고형암 예후 예측용 키트.
  10. TFCP2L1 단백질 또는 상기 단백질 단편의 인산화를 억제하는 인산화 억제제를 유효성분으로 포함하는 고형암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 인산화는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 TFCP2L1 단백질의 177번째 트레오닌에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 고형암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  12. 제 10 항에 있어서, 상기 인산화는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 TFCP2L1 단백질 단편의 17번째 트레오닌에서 이루어지거나 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 TFCP2L1 단백질 단편의 7번째 트레오닌에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 고형암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  13. TFCP2L1 단백질 또는 상기 단백질 단편의 인산화를 억제하는 인산화 억제제를 유효성분으로 포함하는 고형암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 인산화는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 TFCP2L1 단백질의 177번째 트레오닌에서 이루어지 것을 특징으로 하는 고형암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  15. 제 13 항에 있어서, 상기 인산화는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 TFCP2L1 단백질 단편의 17번째 트레오닌에서 이루어지거나 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 TFCP2L1 단백질 단편의 7번째 트레오닌에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 고형암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  16. (a) 고형암 환자로부터 분리된 시료에서, 인산화된 TFCP2L1 단백질 또는 상기 단백질 단편의 양을 측정하는 단계;
    (b) 상기 인산화된 TFCP2L1 단백질 또는 상기 단백질 단편의 양을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및
    (c) 상기 인산화된 TFCP2L1 단백질 또는 상기 단백질 단편의 양이 대조군 시료보다 높을 경우, 예후가 좋지 않다고 판단하는 단계
    를 포함하는, 고형암 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 인산화는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 TFCP2L1 단백질의 177번째 트레오닌에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 고형암 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  18. 제 16 항에 있어서, 상기 인산화는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 TFCP2L1 단백질 단편의 17번째 트레오닌에서 이루어지거나 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 TFCP2L1 단백질 단편의 7번째 트레오닌에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 고형암 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  19. (a) 고형암세포에 시험 물질을 처리하는 단계;
    (b) 상기 고형암세포에서, 인산화된 TFCP2L1 단백질 또는 상기 단백질 단편의 양을 측정하는 단계;
    (c) 상기 인산화된 TFCP2L1 단백질 또는 상기 단백질 단편의 양을 시험 물질을 처리하지 않은 대조군 시료와 비교하는 단계; 및
    (d) 상기 인산화된 TFCP2L1 단백질 또는 상기 단백질 단편의 양이 대조군 시료보다 감소된 경우, 상기 시험 물질을 암 치료제로 판단하는 단계
    를 포함하는, 고형암 치료제의 스크리닝 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 인산화는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 TFCP2L1 단백질의 177번째 트레오닌에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 고형암 치료제의 스크리닝 방법.
  21. 제 19 항에 있어서, 상기 인산화는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 TFCP2L1 단백질 단편의 17번째 트레오닌에서 이루어지거나 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 TFCP2L1 단백질 단편의 7번째 트레오닌에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 고형암 치료제의 스크리닝 방법.

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