KR20190121289A - Cd40 및 sting 경로를 활성화하는 유전자 보조제의 발현을 위한 바이러스 벡터 작제물 - Google Patents

Cd40 및 sting 경로를 활성화하는 유전자 보조제의 발현을 위한 바이러스 벡터 작제물 Download PDF

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Abstract

예방용 및 치료용 백신뿐만 아니라 세포 면역반응 및 선천성 면역반응을 향상시키는 조성물을 포함하는 유전자 면역치료제로서 사용하기 위한 바이러스 벡터가 제공된다. 상기 벡터는 특히 암 및 감염성 질환을 치료 또는 예방하는 데 유용하다. 상기 벡터는 하나 이상의 항원, 보조제들의 조합을 코딩하고 임의로 하나 이상의 가용성 및 분비형 체크포인트 억제제 분자를 코딩할 수 있는 렌티바이러스 벡터를 포함한다. 보조제는 엡스타인 바르 바이러스 유래의 잠재성 막 단백질 1(LMP1), 및 세포질내 도메인이 STING 경로를 활성화할 수 있는 인간 IPS1 또는 이의 변이체로 대체된 LMP1을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 벡터-코딩된 서열은 인간 발현을 위해 코돈 최적화된다.

Description

ＣＤ40 및 ＳＴＩＮＧ 경로를 활성화하는 유전자 보조제의 발현을 위한 바이러스 벡터 작제물
항체-기반 면역반응의 유도에 기반하는 표준 백신 전략은 천연두, 소아마비 및 파상풍과 같은 이전의 치명적인 다수의 감염성 질환을 근절시키거나 거의 근절시켰다. 그러나, 이러한 고전적인 인간 백신은 HIV 및 간염과 같은 다른 감염성 질환 및 암과 같은 비감염성 질병에 사용하기에 비효율적이거나 안전하지 않았다.
세포 면역반응의 유도를 목표로 하는 차세대 면역치료 제품은 병원체 자체 대신에 암 세포 및 감염된 세포를 인식하고 사멸시킴으로써 전통적인 백신의 한계를 극복할 수 있다. 핵산 백신 및 특히 바이러스 벡터는 진료소로 번역될 수 있는 큰 잠재력을 보여주었다.
암 세포 및 많은 감염 인자는 면역계를 피하는 방법이 갖고 있고 이로 인해 효과적인 백신을 창출하기가 어렵다. 고전적인 백신은 종종 최적의 효과를 위해 보조제(adjuvant), 예를 들어 알루미늄 염을 필요로 하지만, 통상적인 보조제는 전형적으로 세포 면역반응의 불량한 향상제이다. 바이러스 벡터에 의해 유발되는 세포 면역반응의 질과 정도를 개선시키기 위한 몇 가지 전략이 제안되었다. 벡터- 기반 면역요법에 의해 유도되는 세포 면역반응을 개선시키는 새로운 종류의 유전자 보조제가 개발되었다. 유전자 보조제는 면역 조절 분자를 코딩하는 DNA 서열로 이루어진다.
분화 클러스터 40(cluster of differentiation 40: CD40)은 다양한 세포, 가장 주목할 만하게는 수지상세포(DC)와 같은 항원-제시 세포에 존재하는 막 단백질이다. CD40은 특히 DC 성숙, 사이토카인 생산, 항체 이소타입 전환, 기억 B 세포 발달 및 배중심 형성에 관여하는 세포성 및 체액성 적응 면역의 개시 및 진행에 필수적이다. CD40의 활성화는 CD40이 막 내에 클러스터화(clustering)되어 이의 세포질 신호전달 도메인이 초분자 신호전달 복합체를 형성하고 이어서 이것이 상이한 염증촉진성(pro-inflammatory) 신호전달 경로를 활성화하는 것을 필요로 한다. CD40의 클러스터화는 이의 리간드(CD40 리간드 또는 CD40L)의 다량체 형태에 의해 또는 Fc 수용체에 대한 결합을 통해 인접한 세포상에 배열되어야 하는 항-CD40 항체에 의해 개시된다. CD40 리간드는 이의 mRNA 형태에서 세포 면역반응을 유도하는 백신에서 보조제로서 사용되어 왔다(예를 들어, Argos Therapeutics AGS003, TriMix).
스톤(Stone) 등(WO 2013/0039942)은 활성화된 CD40 수용체의 것을 모방하는 세포 면역반응을 유도하는 유전자 보조제의 사용을 개시하고 있다. 상기 접근법에서, 핵산 백신은 엡스타인 바르(Epstein Barr) 바이러스의 잠재성 막 단백질 1(LMP1)을 코딩한다. 결과는 전장 LMP1이 다양한 형태(예: 플라스미드, mRNA, 바이러스 및 벡터)로 발현될 때 자발적으로 클러스터를 형성하여 활성화된 CD40L 및 이의 보조제 효과를 모방함을 입증하였다. 예를 들어:
(i) 시험관내에서 LMP1 발현 HIV-1로 감염된 대식세포는 IL-8, MIP-1β, IL-1β, IL-6, IL-12p70 및 TNFα를 포함하는 면역자극성 사이토카인을 생성하도록 자극된다(면역억제성 사이토카인인 IL-10의 어떠한 생산도 없이);
(ii) 인간 수지상 세포는 시험관내에서 LMP1 발현 HIV-1로의 감염에 의해 IL-8, IL-1β, TNF-α, IL-6 및 IL-12p70을 포함하는 자극성 사이토카인을 생산하도록 자극된다;
(iii) 인간 수지상 세포는 LMP1을 발현하는 단일 주기 SIV(scSIV)에 의해 IL-8, IL1-β, IL-6, IL-12p70 및 TNFα를 포함하는 자극성 사이토카인을 생산하도록 자극된다;
(iv) 면역자극성인 것 이외에도, HIV-1-LMP1 및 scSIV-LMP1은 또한 시험관내에서 세포의 항원 제시 기능이 향상됨으로써 자가-보조되어 HIV 및 SIV 항원-특이적 T-세포의 증식을 유도한다;
(v) HIV-LMPI는 시험관내에서 DC 및 대식세포를 자극하여 CD40, CD80 및 CD83과 같은 면역학적으로 중요한 세포 표면 공자극성 분자 및 CCR-7과 같은 이동 신호를 상향조절한다; 및
(vi) LMP1 및 흑색종 특이적 항원(gp100)을 코딩하는 플라스미드들의 혼합물이 2 주에 3회 근육내 주사된 마우스는 종양 성장으로부터 보호된다.
스톤 등(WO 2014/039961)은 인터페론 알파 및 베타의 분비를 유도하여 인터페론 자극된 유전자의 발현을 유도하는 유전자 보조제의 용도를 개시하고 있다. 상기 접근법에서, 핵산 백신은, 임의로 마커 단백질 또는 항원을 코딩하는 전이유전자(transgene)에 추가하여, 세포질내 도메인이 면역 이펙터 또는 어댑터 단백질, 예컨대 IPS1 단백질로 대체된 LMP1 단백질의 막관통(transmembrane) 부분을 포함하는 융합 단백질을 코딩한다. IFN-β 프로모터 자극인자(IPS1; MAVS, VISA 또는 카디프(Cardif)로서도 지칭됨)의 활성화는 STING(인터페론 유전자의 자극인자) 경로를 통해 강력한 T 세포 반응을 생성한다. 세포에서 발현될 때, LMP1의 막관통 도메인은 IPS1가 세포질내 클러스터로 응집될 수 있게 하는 클러스터를 자발적으로 형성하여 STING 경로를 활성화한다. 전장 뮤린(murine) IPS1과 융합된 LMP1의 막관통 도메인은 IFNα, IFNβ 및 IL-6의 분비를 유도하고 또한 마우스 대식세포에서 성숙 마커(CD40 및 CCR7) 및 활성화 마커(CD80 및 CD86)의 발현을 유도하는 것으로 나타났다.
암, HIV과 같은 적응증에서 관찰되는 면역 관용을 파괴하는 데 필요한 강력한 세포 면역반응을 유도하는 자가-보조 백신에 대한 필요성 및 기타 충족되지 않은 의학적 필요성이 있다.
본 기술은 면역반응, 특히 암 또는 감염에 대해 지시된 것과 같은 세포-매개성 면역반응을 개선시키기 위한 유전자 보조제를 코딩하는 바이러스 벡터 및 이러한 바이러스 벡터를 사용하는 방법을 제공한다. 본 기술의 항원 및 보조제 작제물은 CD40 활성화를 모방면서 동시에 STING 경로를 활성화하는 활성화 과정에 의해 면역반응을 향상시킨다. 작제 서열은 인간 대상체에서 사용하기에 최적화되었다.
본 기술의 한 양상은 (i) 하나 이상의 마커 단백질, 항원, 에피토프 또는 이들의 조합을 코딩하는 하나의 전이유전자, (ii) 인간 발현을 위해 코돈 최적화된 엡스타인 바르 바이러스의 전장 잠재성 막 단백질 1(LMP1) 및 (iii) 세포질내 도메인이 STING 경로를 활성화할 수 있는 인간 IPS1 또는 이의 변이체로 대체된 엡스타인 바르 바이러스의 잠재성 막 단백질 1(LMP1)의 막관통 부분을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 전이유전자를 포함하는 바이러스 벡터이다. 임의로, 상기 벡터는 (iv) 하나 이상의 가용성 및 분비형 면역 체크포인트(checkpoint) 억제제 분자 또는 하나 이상의 가용성 면역 조절제 분자를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 벡터는 기능적 렌티바이러스 인테그라제 단백질을 포함하고, 이에 따라 그것이 형질도입되는 세포의 게놈에 통합될 수 있다.
본 기술의 또 다른 양상은 (i) 하나 이상의 마커 단백질, 항원, 에피토프 또는 이들의 조합을 코딩하는 하나의 전이유전자, (ii) (a) 인간 IPS1 또는 이의 변이체와 융합된 야생형 잠재성 막 단백질(LMP1) 세포질내 도메인(예를 들어, hIPS1 델타TM 또는 hIPS1 델타TM PR 또는 hIPS1 역방향 또는 hIPS1 역방향 델타TM) 또는 (b) 야생형 LMP1 세포질내 도메인과 융합된, STING 경로를 활성화할 수 있는 인간 IPS1 또는 이의 변이체(예를 들어, hIPS1델타TM, 또는 hIPS1델타TM델타PR 또는 hIPS1 역방향(reverse), 또는 hIPS1 역방향 델타TM)인 세포질내 도메인에 융합된 엡스타인 바르 바이러스의 LMP1의 막관통 도메인을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 바이러스 벡터이다. 임으로, 상기 벡터는 (iii) 하나 이상의 가용성 및 분비형 면역 체크포인트 억제제 분자 또는 가용성 면역 조절제 분자를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 벡터는 기능적 렌티바이러스 인테그라제 단백질을 포함하고, 이에 따라 그것이 형질도입되는 세포의 게놈에 통합될 수 있다.
항원은 종양 항원, 바이러스 항원 또는 미생물 항원일 수 있다. 다수의 항원 또는 하나 이상의 항원의 선택된 에피토프는 벡터에 의해 코딩될 수 있다. 특정의 실시형태에서, 적어도 하나의 항원은 NY-ESO-1, 메소텔린, PSA, MART-1, MART-2, Gp100, 티로시나제, p53, ras, MUC1, SAP-1, 서바이빈(survivin), CEA, Ep-CAM, Her2, BRCA1/2, gag, 역전사 효소, tat, 포자소체 단백질(circumsporozoite protein), HCV 비구조 단백질, 헤마글루티닌 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정의 실시형태에서, 벡터는 항-CTLA-4 분자, PD1 차단제, PDL1 차단제 또는 이들의 조합과 같은 적어도 하나의 면역 체크포인트 억제제 분자 또는 가용성 면역 조절제 분자를 추가로 코딩한다.
특정의 실시형태에서, 바이러스 벡터는 하나 초과의 핵산 서열을 포함한다. 이들 실시형태 중 일부에서, 제1 핵산 서열은 하나 이상의 마커 단백질, 항원, 에피토프 또는 이들의 조합을 코딩하고; 제2 핵산 서열은 인간 발현을 위해 코돈 최적화된 엡스타인 바르 바이러스의 잠재성 막 단백질 1(LMP1)을 코딩하며, 제3 핵산 서열은 세포질내 도메인이 STING 경로를 활성화할 수 있는 인간 IPS1 또는 이의 변이체로 대체된 엡스타인 바르 바이러스의 잠재성 막 단백질 1(LMP1)의 막관통 부분을 포함하는 융합 단백질을 코딩하고; 임의로 제4 핵산 서열은 하나 이상의 면역 체크포인트 억제제 분자("항-체크포인트") 또는 가용성 면역 조절제 분자를 코딩한다. 바람직하게는, 제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열뿐만 아니라, 제2 핵산 서열과 제3 핵산 서열 및 제3 핵산 서열과 제4 핵산 서열은 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 코딩하는 핵산 서열에 의해 분리된다. 제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열뿐만 아니라 제2 핵산 서열과 제3 핵산 서열은 자가-절단 펩티드(예를 들어, 2A 펩티드)를 코딩하는 핵산 서열에 의해 분리될 수 있다. 제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열뿐만 아니라 제2 핵산 서열과 제3 핵산 서열은 자가-절단 펩티드(예를 들어, 2A 펩티드) 또는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 코딩하는 핵산 서열에 의해 분리될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 바이러스 벡터는 하나 초과의 핵산 서열을 포함한다. 이들 실시형태 중 일부에서, 제1 핵산 서열은 하나 이상의 마커 단백질, 항원, 에피토프 또는 이들의 조합을 코딩하고; 제2 핵산 서열은 STING 경로를 활성화할 수 있는 인간 IPS1 또는 이의 변이체의 세포질내 도메인과 융합된 엡스타인 바르 바이러스의 전장 잠재성 막 단백질 1(LMP1)을 코딩하고; 제3 핵산 서열은 인간 발현을 위해 코돈 최적화된 엡스타인 바르 바이러스의 전장 잠재성 막 단백질 1(LMP1)을 코딩하고; 임의로 제4 핵산 서열은 하나 이상의 면역 체크포인트 억제제 분자("항-체크포인트") 또는 가용성 면역 조절제 분자를 코딩한다. 바람직하게는, 제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열뿐만 아니라, 제2 핵산 서열과 제3 핵산 서열은 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 코딩하는 핵산 서열에 의해 분리된다. 제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열뿐만 아니라 제2 핵산 서열과 제3 핵산 서열은 자가 절단 펩티드(예를 들어, 2A 펩티드)를 코딩하는 핵산 서열에 의해 분리될 수 있다. 제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열뿐만 아니라 제2 핵산 서열과 제3 핵산 서열은 자가 절단 펩티드(예를 들어, 2A 펩티드) 또는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 코딩하는 핵산 서열에 의해 분리될 수 있다.
본 기술의 또 다른 양상은 본 바이러스 벡터를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 병태를 예방 또는 치료하기 위한 면역치료 제형이다. 바람직한 실시형태에서, 질환 또는 병태는 암 또는 감염이다.
본 기술의 또 다른 양상은 대상체에서 암 또는 감염에 대한 면역반응을 유도하는 방법으로서, 바이러스 벡터 또는 면역치료 제형을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법이다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터를 대상체에게 투여하는 것은 대상체에게 암 또는 감염에 대한 백신접종을 하는 것이다.
일부 실시형태에서, 암은 흑색종, 신경교종, 전립선암, 유방암, 자궁경부암, 대장암, 신장암, 폐암, 림프종, 난소암, 육종 및 췌장암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 암은 상기 열거된 종양 항원을 보유한다. 일부 실시형태에서, 암은 항-체크포인트에 민감하다. 일부 실시형태에서, 감염성 질환은 HIV/AIDS, C형 간염, HPV, 폐렴, 인플루엔자, 말라리아, 리슈마니아증, 결핵, 한센병, 광견병, 뎅기열, 지카 바이러스 감염, 에볼라 바이러스 감염 및 주혈흡충증으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 감염 인자는 앞서 열거된 바이러스 또는 미생물 항원을 보유한다. 일부 실시형태에서, 감염성 질환은 항-체크포인트에 민감하다.
본 기술은 또한 다음의 실시형태들의 목록으로 요약될 수 있다:
1. 항원 또는 항원 에피토프를 코딩하는 제1 핵산 서열, 엡스타인 바르 바이러스의 전장 잠재성 막 단백질 1(LMP1)을 코딩하는 제2 핵산 및 세포질내 도메인이 STING 경로를 활성화할 수 있는 인간 IPS1 또는 이의 변이체로 대체된 LMP1의 막관통 부분을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 제3 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터로서, 벡터의 코딩된 서열이 인간 발현을 위해 코돈 최적화되어 있고 상기 제2 핵산 서열과 제3 핵산 서열이 임의의 순서로 제1 핵산 서열을 뒤따르는 바이러스 벡터.
2. 항원 또는 항원 에피토프를 코딩하는 제1 핵산 서열, STING 경로를 활성화할 수 있는 인간 IPS1 또는 이의 변이체와 융합된 엡스타인 바르 바이러스의 전장 잠재성 막 단백질 1(LMP1)을 코딩하는 제2 핵산 서열(생성된 융합 단백질은 인간 발현을 위해 코돈 최적화되었다) 또는 잠재성 막 단백질 1(LMP1)의 세포질내 도메인과 융합된, 세포질내 도메인이 STING 경로를 활성화할 수 있는 인간 IPS1 또는 이의 변이체로 대체된 엡스타인 바르 바이러스의 잠재성 막 단백질 1(LMP1)의 막관통 부분을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 제2 핵산 서열(생성된 융합 단백질은 인간 발현을 위해 코돈 최적화되었다)을 포함하는 바이러스 벡터;
3. 실시형태 1 또는 실시형태 2에 있어서, 상기 벡터가 렌티바이러스 벡터인, 바이러스 벡터.
4. 상기 실시형태들 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 핵산 서열이 2종 이상의 항원 또는 2종 이상의 항원 에피토프를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는, 바이러스 벡터.
5. 상기 실시형태들 중 어느 하나에 있어서, 실시형태 1 또는 2의 제2 핵산 서열 또는 실시형태 1의 제3 핵산 서열이 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21 및 서열번호 23으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는, 바이러스 벡터.
6. 상기 실시형태들 중 어느 하나에 있어서, 상기 벡터가 가용성 및 분비형 면역 체크포인트 억제제 분자 또는 가용성 면역 조절제 분자를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는, 바이러스 벡터.
7. 실시형태 6에 있어서, 상기 가용성 면역 체크포인트 억제제 분자 또는 가용성 면역 조절제 분자가 CTLA-4, PD-1, PDL-1, LAG-3, TIM 3, B7-H3, ICOS, IDO, 4-1BB, CD47, B7-H4, OX-40, TIGIT, CD160 및 이들의 조합을 포함하는, 바이러스 벡터.
8. 상기 실시형태들 중 어느 하나에 있어서, 상기 벡터가 기능적 렌티바이러스 인테그라제 단백질을 추가로 포함하고, 상기 벡터가 자가-불활성화되는, 바이러스 벡터.
9. 상기 실시형태들 중 어느 하나에 있어서, 항원이 NY-ESO-1, 메소텔린, PSA, MART-1, MART-2, Gp100, 티로시나제, p53, ras, MUC1, SAP-1, 서바이빈, CEA, Ep-CAM, Her2, BRCA1/2, gag, 역전사 효소, tat, 포자소체 단백질, HCV 비구조 단백질, 헤마글루티닌 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 바이러스 벡터.
10. 실시형태 1 내지 9 중 어느 하나의 바이러스 벡터를 포함하는, 대상체에서 암 또는 감염을 예방 또는 치료하기 위한 면역치료 제형.
11. 대상체에서 암 또는 감염성 질환에 대한 면역반응을 유도하거나 향상시키는 방법으로서, 실시형태 1 내지 9 중 어느 하나의 바이러스 벡터 또는 실시형태 10의 면역치료 제형을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 이를 통해 상기 암 또는 감염성 질환에 대한 면역반응이 대상체에서 유도되거나 향상되는, 방법.
12. 실시형태 11에 있어서, 암에 대한 면역반응이 유도되거나 향상되고, 상기 암이 흑색종, 신경교종, 전립선암, 유방암, 자궁경부암, 대장암, 신장암, 폐암, 림프종 및 췌장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
13. 실시형태 11에 있어서, 감염성 질환에 대한 면역반응이 유도되거나 향상되고, 상기 감염성 질환이 HIV/AIDS, C형 간염, HPV, 폐렴, 인플루엔자, 말라리아, 리슈마니아증, 결핵, 한센병, 광견병, 뎅기열, 지카, 에볼라 및 주혈흡충증으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
도 1은 전장 LMP1 단백질의 2차 구조의 개략도를 도시한다.
도 2는 세포질내 신호전달 도메인이 제거된 절두된(truncated) LMP1 단백질의 2차 구조의 개략도를 도시한다.
도 3a는 IPS1 단백질의 개략도를 도시하고, 도 3b는 미토콘드리아 막에서의 배향을 도시한다.
도 4는 LPM1-IPS1 융합 단백질의 개략도를 도시한다.
도 5는 WO 2014/039961에 기재된 순서로 발현될 때 생산되어야 하는 LPM1-IPS1 융합 단백질의 2차 구조의 개략도를 도시한다.
도 6은 IPS1 막관통 도메인이 제거된 LPM1-IPS1 융합 단백질의 2차 구조의 개략도이다.
도 7은 IPS 막관통 도메인이 제거되고 역전된 배향으로 카스파제 동원 도메인(CARD)과 프롤린-풍부(PRO) 도메인을 갖는 LPM1--역전된 IPS1 융합 단백질의 구조를 도시한다.
도 8a 내지 도 8b는 몇 가지 분자 작제물의 개략도를 도시한다.
도 8a는 (a) 프로모터(인간 유비퀴틴, Ubi); (b) 리포터 유전자(예, 녹색 형광 단백질) 또는 대안 적으로 하나 이상의 항원 유전자; (c) 전장 LMP1에 대한 유전자; (d) 융합 단백질 LMP1-IPS1(융합 단백질은 STING 향상 활성을 갖는 인간 IPS1 또는 이의 기능적 변이체를 함유할 수 있다)에 대한 유전자 및 (e) 가용성 및 분비형 면역 체크포인트 억제제 또는 가용성 및 분비형 면역 조절제 분자를 코딩하는 유전자를 함유하는 작제물을 도시한다. 도 8b는 (a) 프로모터(인간 유비퀴틴, Ubi); (b) 리포터 유전자 (예: 녹색 형광 단백질) 또는 대안적으로 하나 이상의 항원 유전자; (c) 전장 LMP1에 대한 유전자; (d) 융합 단백질 LMP1-IPS1(융합 단백질은 STING 향상 활성을 갖는 인간 IPS1 또는 이의 기능적 변이체를 함유할 수 있다)에 대한 유전자; 및 (e) 가용성 및 분비형 면역 체크포인트 억제제 또는 가용성 및 분비형 면역 조절제 분자를 코딩하는 유전자를 함유하는 작제물을 도시한다.
도 9a 및 도 9b는 본 기술의 단일 분자 보조제 실시형태를 도시한다. 도 9a에서, 보조제는 결국 hIPS1 세포질 신호전달 도메인(STING 활성화인자) 또는 이의 기능적 등가물에 융합되어 있는 LMP1의 세포질 신호전달 도메인과 LMP1(델타TM)의 융합체이다. 도 9b는 도 9a의 것과 유사하지만 2개의 세포질 신호 도메인이 반대 순서로 제시된 융합체를 도시한다.
도 10은 단일 분자 보조제를 특징으로 하는 바이러스 벡터 작제물을 도시한다.
도 11a 내지 도 11b는 렌티바이러스 벡터에 의해 형질도입된 인간 수지상 세포 및 대식세포에서의 GFP 전이유전자의 발현 수준을 도시한다. 도 11a는 렌티바이러스 작제물로 형질도입된지 96시간 후 인간 수지상 세포에서의 GFP 전이유전자 발현을 도시한다. 도 11b는 렌티바이러스 작제물로 형질도입된지 96시간 후 인간 대식세포에서의 GFP 전이유전자 발현을 도시한다.
도 12a 내지 도 12d는 시험관내에서 렌티바이러스 벡터에 의해 유도된 인간 수지상 세포 및 대식세포의 활성화 및 성숙을 도시한다. 도 12a는 렌티바이러스 작제물로 형질도입된지 96시간 후 인간 수지상 세포에서 상향조절된 사이토카인의 패널을 도시한다. 도 12b는 렌티바이러스 작제물로 형질도입된지 96시간 후 인간 GFP-양성 수지상 세포에서 상향조절된 마커의 패널을 도시한다(GFP에 대해 정규화된 발현). 도 12c는 렌티바이러스 작제물로 형질도입된지 96시간 후 인간 대식세포에서 상향조절된 사이토카인의 패널을 도시한다. 도 12d는 렌티바이러스 작제물로 형질도입된지 96시간 후 GFP-양성 인간 대식세포에서 상향조절된 마커의 패널을 도시한다(GFP에 대해 정규화된 발현). (GFP에 대해 정규화된 발현).
본 기술은 면역치료용 제품에서 사용하기 위한 유전자 보조제의 발현을 위한 바이러스 벡터 작제물 및 상기 벡터의 사용 방법을 제공한다. 벡터 작제물은 암 또는 감염에 대해 지시된 것과 같은 면역반응의 질과 강도를 향상시킬 수 있으며, 특히 세포-매개성 면역반응을 유도하고/하거나 향상시키는 데 적합하다. 본 기술의 벡터 작제물은 면역반응을 향상시키는 데 특히 효과적인데, 그 이유는 본 작제물이 EBV 유래의 LMP1의 세포질내 신호전달 도메인의 발현 및 활성화에 의해 촉진되는 CD40-유사 경로의 활성화에 의해 매개되는 특이적 세포-매개성 면역반응의 활성화와, LMP1-IPS1 융합 단백질의 발현 및 활성에 의해 촉진되는 STING 경로의 활성화를 통한 선천성 면역반응의 활성화 둘 다를 유도하기 때문이다. CD-40-유사 경로 또는 STING 경로의 활성화는 세포질내 신호전달 도메인을 활성화하는 LMP1 막관통 도메인의 클러스터화에 의해 매개될 수 있다.
본 기술은 항원 카세트 및 유전자 보조제를 포함하는 단일 벡터 작제물의 사용을 설명한다. 2종의 벡터(항원을 코딩하는 하나 및 보조제를 코딩하는 하나)의 동시적 주사와 비교할 때, 단일 생성물의 사용은 개발(산업, 규제 및 임상 측면을 포함)을 단순화하고 치료의 효능 및 안전성을 향상시킬 것이다. 이러한 독특한 작제물을 이용함으로써, 항원 카세트를 발현하는 세포는 촉발된 면역반응의 강도 및 질을 개선시키는 보조제의 발현으로부터 항시(constitutively) 이익을 얻을 것이다. 형질도입된 세포는 면역반응에 의해 빠르게 제거될 것이고, 이것은 규제 기관에 있어 심각한 고려 사항이 될 수 있는 유전적 서열의 임의의 장기간의 바람직하지 않은 발현의 위험성을 감소시킨다. 또한, 1종의 벡터만을 제조하고 주사하는 것은 2종의 별개의 벡터를 주사하는 것과 비교할 때 더 비용 효율적일 것이다.
본 기술의 바이러스 벡터 작제물은 2가지 상이한 전략 중 하나에 따라 구성된다. 제1 전략에서, 벡터는 2종의 분리된 보조제 발현 카세트를 함유하는데, 하나는 전장 LMP1 단백질을 코딩하고, 다른 하나는 세포질내 도메인이 STING 경로를 활성화하는 인간 IPS1 또는 이의 변이체로 대체된 LMP1을 함유하는 융합 단백질을 코딩한다. 이러한 전략 하에, 벡터는 (i) 인간 발현을 위해 코돈 최적화된 전장 EBV LMP1 단백질, (ii) 세포질내 도메인이 STING 경로를 활성화할 수 있는 인간 IPS1 또는 이의 변이체로 대체된 EBV LMP1 단백질 및 (iii) 하나 이상의 항원을 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 함유한다.
제2 전략에서, 벡터는 (i) STING 경로를 활성화할 수 있는 인간 IPS1 또는 이의 변이체의 세포질내 도메인과 융합된 전장 LMP1 또는 (ii) LMP1의 세포질내 도메인과 융합된, 세포질내 도메인이 STING 경로를 활성화할 수 있는 인간 IPS1 또는 이의 변이체로 대체된 LMP1의 막관통 부분을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 단일 보조제 발현 카셋트를 함유한다. 또한, 벡터는 하나 이상의 항원을 코딩한다.
전형적인 실시형태에서, 본 기술은 세포 막 내의 2개 이상의 전장 LMP1 단백질의 응집뿐만 아니라 세포 막 내의 2개 이상의 절두된 LMP1 단백질(이의 원래의 세포질내 신호전달 도메인이 결여됨)의 응집 및/또는 절두된 LMP1 단백질에 융합된 2개 이상의 IPS1 세포질내 신호전달 도메인의 응집에 의한 면역반응의 활성화를 제공한다.
직접 주사 후, 핵산 서열의 도입 및 그에 따른 단백질 발현은 임의의 유형의 세포에서 발생할 수 있지만, 바람직하게는 골격근 세포 또는 면역 세포에서 발생한다. 이러한 기술은 암 및 감염성 질환에 대한 전통적인 예방용 또는 치료용 백신뿐만 아니라 수지상 세포 요법과 같은 세포-기반 요법을 위해 사용될 수 있다. 본원에 기재된 실험에서, 바이러스 벡터는 면역반응 및 감염과 암으로부터의 보호 또는 이의 치료를 현저하게 향상시킬 것으로 예상된다.
"벡터"는 전사될 수 있는 유전자 산물의 적어도 일부분을 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 분자를 지칭한다. 일부 경우에, 핵산 분자는 이어서 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드로 번역된다. 다른 경우에, 이러한 서열들은 안티센스 분자, 리보 자임 또는 압타머의 생산에서와 같이 번역되지 않는다. 벡터는 특정 숙주 유기체에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열의 전사 및 가능하게는 번역에 필요한 핵산 서열을 지칭하는 다양한 제어 서열을 함유할 수 있다. 벡터 및 발현 벡터는, 전사 및 번역을 통제하는 제어 서열 이외에도, 다른 기능을 제공하는 핵산 서열을 또한 함유할 수 있다.
"작제물"은 핵산 서열 코딩 서열의 일부 또는 전부가 전사될 수 있는 유전자 산물을 코딩하는 임의의 유형의 조작된 핵산일 수 있다. 전사체는 일반적으로 단백질로 번역되지만 반드시 그럴 필요는 없다. 특정의 실시형태에서, 발현은 유전자의 전사와 mRNA의 유전자 산물로의 번역 둘 다를 포함한다. 다른 실시형태에서, 발현은 관심대상의 유전자를 코딩하는 핵산의 전사만을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "백신"은 모든 예방용 및 치료용 백신을 포함한다. "보조제"는 항원에 대한 면역반응을 활성화하거나 향상시키는 임의의 분자 또는 조성물일 수 있다. 보조제는 특정 유형의 면역계 세포에 대한 면역반응을 변형시키는 것을 도움으로써 백신의 효능을 향상시킬 수 있다. 보조제는 수지상 세포, 대식세포 및 B 세포와 같은 항원-제시 세포의 활성화를 촉발하는 면역자극제일 수 있다. 보조제는 또한 면역계가 경계 상태로 들어가야 한다는 것을 알리는 "위험" 신호를 제공하는 것으로 이해된다. 보조제는 항원-제시 세포에 의한 항원 제시를 촉진하고/하거나, 대식세포 및 림프구를 활성화하고/하거나, 사이토카인 생성을 지원함으로써 작용할 수 있다. 보조제가 없다면, 면역반응은 진행하지 못하거나 비효율적인 면역 또는 관용으로 전환될 수 있다. 보조제는 종종 효과적인 예방용 또는 치료용 백신을 위해 필요하거나 항-종양 면역반응의 유도를 위해 필요하다. "유전자 보조제"는 핵산의 형태로 제공되어 표적 세포에 의해 발현되어 보조제로서 작용하는 분자를 생산하는 보조제이다.
항원-제시 세포(APC)는 이의 세포 표면상에(또는 이의 세포 표면에) 적어도 하나의 항원 또는 항원 단편을 표시, 획득 또는 제시할 수 있는 다양한 세포 중 어느 하나이다. 일반적으로, "항원-제시 세포"란 용어는 항원 또는 항원 조성물에 대한 면역반응(즉, 면역계의 T-세포 또는 B-세포 아암(arm)으로부터)의 향상을 도움으로써 기술의 목표를 달성하는 임의의 세포를 지칭할 수 있다. 이러한 세포는 본원 및 당업계에 개시된 방법을 사용하여 당업자에 의해 정의될 수 있다. 당업자가 이해하고 본원의 특정 실시형태에서 사용되는 바와 같이, 클래스 II 주조직 적합성 분자 또는 복합체와 함께 항원을 정상적으로 또는 우선적으로 면역 세포에 표시하거나 제시하는 세포가 "항원-제시 세포"이다. 특정의 양상에서, 세포(예: APC)는 목적하는 항원을 발현하는 재조합 세포 또는 종양 세포와 같은 다른 세포와 융합될 수 있다. 2종 이상의 세포의 분열(fission)을 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 일부 경우에, 항원-제시 세포가 그에 대해 항원을 표시하거나 제시하는 면역 세포는 CD4+ T 또는 CD8+ T 세포이다. APC 또는 기타 면역 세포상에서 발현되는 추가 분자는 면역반응의 향상을 돕거나 면역반응을 개선시킬 수 있다. 예를 들어, 사이토카인 및 보조제와 같은 분비형 또는 가용성 분자도 항원에 대한 면역반응을 돕거나 향상시킬 수 있다. 수지상 세포(DC)는 생체내, 시험관내, 생체외 또는 숙주 또는 대상체에 존재하거나 또는 조혈 줄기세포 또는 단핵구로부터 유래될 수 있는 항원-제시 세포이다. 수지상 세포 및 이의 전구체는 다양한 림프 기관, 예를 들어 비장, 림프절뿐만 아니라 골수 및 말초혈로부터 단리될 수 있다. DC는 수지상 세포체로부터 여러 방향으로 뻗어있는 박판(라멜리포듐)을 갖는 특징적인 형태를 갖는다. 전형적으로, 수지상 세포는 높은 수준의 주조직 적합성 복합체(MHC) 및 공자극성(예를 들어, B7-1 및 B7-2) 분자를 발현한다. 수지상 세포는 시험관내에서 T 세포의 항원 특이적 분화를 유도할 수 있고, 시험관내 및 생체내에서 1차 T 세포 반응을 개시할 수 있다.
"면역반응"이란 어구는 항원 또는 항원들 또는 알레르겐(들) 또는 약물 또는 생물학적 제제에 대한 특이적인 항체 및/또는 면역 세포-매개성 반응의 유도를 의미한다. 면역반응의 유도는 챌린지된(challenged) 유기체의 면역원성 구성, 항원 또는 알레르겐 또는 약물 또는 생물학적 제제의 화학적 조성 및 입체배치, 및 항원 또는 알레르겐 또는 약물 또는 생물학적 제제의 투여 방식 및 기간을 포함하는 많은 요인들에 의존한다. 면역반응은 많은 측면을 가지고 있는데, 이 중 일부는 면역계의 세포(예: B-림프구, T-림프구, 대식세포 및 형질세포)에 의해 나타난다. 면역계 세포는 항원 또는 알레르겐 또는 면역계의 다른 세포와의 상호작용, 사이토카인의 방출 및 이들 사이토카인에 대한 반응성을 통해 면역반응에 참여할 수 있다. 면역반응은 일반적으로 2가지 주요 범주-체액성 및 세포-매개성으로 나뉜다. 면역반응의 체액성 성분은 항원 또는 알레르겐 또는 약물 또는 생물학적 제제에 특이적인 항체의 생성을 포함한다. 세포-매개성 성분은 항원 또는 알레르겐에 대한 지연형 과민성 및 세포 독성 이펙터 세포의 생성을 포함한다.
면역계의 활성화 또는 자극은 림프구, 대식세포, 수지상 세포, 자연 살해 세포(NK 세포) 및 세포독성 T 림프구(CTL)와 같은 면역 이펙터 세포의 활성화에 의해 매개될 수 있다. 이것은 수지상 세포와 같은 항원 제시 세포의 활성화 및 성숙에 의해 매개될 수 있다. 이것은 면역 체크포인트 분자를 억제하는 것과 같은 억제 경로의 차단에 의해 매개될 수 있다.
용어 "LMP1 유전자"란, 고유한 엡스타인 바르 바이러스 LMP1-코딩 핵산 서열, 예를 들어 고유한 엡스타인 바르 바이러스 LMP1 유전자; LMP1 cDNA가 전사될 수 있는 서열을 갖는 핵산; 및/또는 상기한 것들의 대립유전자 변이체 및 상동체를 의미한다. LMP1의 예시적인 핵산 서열은 GenBank 수탁번호 M58153.1이다. 상기 용어는 이중가닥 DNA, 단일가닥 DNA 및 RNA를 포괄한다.
용어 "LMP1 단백질"이란, LMP1 유전자의 발현 산물 또는 상기의 것과 적어도 65%(그러나 바람직하게는 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99%)의 아미노산 서열 동일성을 공유하고 고유한 LMP1 단백질의 기능적 활성을 나타내는 단백질을 의미한다. 단백질의 "기능적 활성"은 단백질의 생리적 기능과 관련된 임의의 활성을 의미한다. LMP1은 면역 세포상의 CD40 수용체와 유사한 C-말단 세포 신호전달 영역에 연결된 N-말단 막관통 영역으로 이루어진다. 막에 LMP1을 고정시키는 것 외에도, LMP1의 N-말단은 자가 응집되고 LMP1 또는 LMP1 N-말단 도메인에 연결된 임의의 단백질의 클러스터화를 유도한다. LMP1 단백질의 막관통(응집) 도메인은 GenBank 수탁번호 AAA66330.1에 기재된 아미노산 서열의 아미노산 1 내지 190번이다.
잠재성 막 단백질-1(LMP1)은 엡스타인 바르 바이러스(EBV) 내의 유전자이다. 이의 N-말단은 단백질을 막에 고정시키는 6개의 인접한 막관통 도메인으로 구성된다. 도 1은 막관통 도메인(101)과 세포질내 신호전달 도메인(102)을 나타내는 LMP1 단백질의 구조를 도시한다. LMP1은, 이의 N-말단 막관통 도메인이 세포막에서 자발적으로 클러스터를 형성하고 이에 따라 펩티드 결합을 통해 이에 연결되는 세포질내 도메인을 단일 폴리펩티드 쇄로서 클러스터화하기 때문에, 이의 세포질 도메인을 통해 신호전달을 개시하기 위해 리간드나 항체를 필요로 하지 않는다. 이러한 의미에서, LMP1은 "항시(constitutively) 활성화"된다고 언급된다. 마찬가지로, 기능을 하기 위해 클러스터화를 필요로 하는 신호전달 도메인(들)에 N-말단 막관통 도메인을 연결시키는 융합 단백질도 "항시 활성화"된다고 언급될 수 있으며 이들이 취해지는 수용체로부터의 리간드를 더 이상 필요로 하지 않을 수 있다.
인터페론 프로모터 자극인자-1(IPS1; MAVS, VISA 또는 카디프로서도 지칭됨)은 STING 경로("인터페론 유전자의 자극인자"; TMEM173, MPYS, MITA 및 ERIS로서도 공지됨)와 관련된 막관통 미토콘드리아 단백질로서, 세포질에서 병원체 유래의 핵산에 대한 선천성 반응에 중요하다. IPS1은 미토콘드리아의 외막에 단백질을 고정시키는 C-말단 막관통 도메인을 함유하며, 미토콘드리아의 외막에서 이것이 일단 활성화되면 응집체(즉, 다량체)를 형성한다. IPS1은 퍼옥시좀 및 미토콘드리아-관련 막 중에도 존재한다. IPS1은 또한 하류 단백질-단백질 상호작용에 필수적인 카스파제 동원 도메인(CARD)과 3개의 TRAF 상호작용 모티프(TIM), 즉 N-말단 프롤린-풍부 영역에 포함된 2개 및 C-말단 영역에 위치에 위치하는 세번째를 함유한다. 막관통 도메인의 제거가 IPS1-매개 항바이러스 반응을 억제하기 때문에, IPS1의 막 국소화는 이의 활성에 중요할 수 있다. IPS1은 세포질을 돌아다니며 바이러스 RNA의 존재에 대해 살피는 레티노산-유도성 유전자-I(RIG-I)-유사 수용체(RLR)와 같은 병원체 인식 수용체에 대한 어댑터 단백질로서 기능한다. 이중가닥 RNA가 RLR에 결합하면, 이들은 이들의 CARD 도메인을 통해 IPS1과 복합체를 형성하여 IPS1 다량체화 및 활성화를 유도한다. 이어서, 활성화된 IPS1 복합체는 IKK 및 TBK1/IKKi 복합체를 동원하여, 전사 인자 NF-κB 및 IRF3의 활성화를 초래하는 신호전달 캐스케이드(signaling cascade)를 촉발한다. NF-κB 및 IRF3은 인터페론 프로모터에 결합하고 이를 활성화하여 1형 인터페론의 생산을 통해 강력한 세포-매개성 면역반응을 일으킨다. RIG-1 활성화도 STING 경로를 활성화하여 바이러스에 대한 세포-매개성 면역반응을 추가로 향상시킨다. 본 기술에서, IPS1과 LMP1 N-말단 도메인의 융합은 dsRNA에 의한 활성화를 모방하는 LMP1-IPS1 클러스터화 및 활성화를 촉진한다.
본 기술의 바이러스 벡터는 대상체에서 면역반응을 활성화하거나 향상시킬 수 있는 하나 이상의 핵산 서열을 코딩한다. 핵산은 세포질내 도메인이 STING 경로를 활성화할 수 있는 인간 IPS1 또는 이의 변이체로 대체된 엡스타인 바르 바이러스의 잠재성 막 단백질 1(LMP1)을 코딩한다. LMP1 DNA 서열은 인간 발현을 위해 코돈 최적화되었다. LMP1-IPS1 융합 단백질의 발현은 2개 이상의 LMP1 단백질의 응집(즉, 다량체화)에 의한 면역반응의 활성화를 제공한다.
바이러스 벡터는 발현 벡터 또는 플라스미드와 같은 임의의 유형의 적합한 벡터일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 렌티바이러스 벡터는 예를 들어 인간 면역결핍 바이러스(HIV-1 또는 HIV-2), 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV), 말 감염성 뇌염 바이러스(EIAV), 염소 관절염 뇌염 바이러스(CAEV), 소 면역결핍 바이러스(BIV) 및 고양이 면역결핍 바이러스(FIV)로부터 유래된 변형된 렌티바이러스이다. 변형된 렌티바이러스 벡터는 감소된 병원성을 갖는다. 벡터는 또한 유익한 치료 효과를 도입하도록 변형될 수 있다. 렌티바이러스 벡터 자체는 독성이 아니고, 다른 레트로바이러스와 달리, 렌티바이러스는 비분열 세포, 특히 수지상 세포를 형질도입할 수 있어 내인성 경로를 통한 항원 제시가 가능하다.
렌티바이러스 벡터는 RNA 또는 DNA 분자를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 플라스미드와 같은 재조합 DNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 재조합 DNA 분자뿐만 아니라 관련 바이러스 단백질을 포함하여 입자를 형성한다. 렌티바이러스 벡터 입자는 단일가닥 또는 이중가닥 핵산 분자를 함유할 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 형질도입되는 세포의 게놈 내로의 통합을 위한 능력을 갖는다. 바람직한 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 기능적 인테그라제 단백질을 함유한다. 비-통합 벡터 입자는 숙주 게놈 내로 통합되는 렌티바이러스 벡터 입자 능력을 방해하는 유전자 돌연변이를 나타낸다. "형질 감염" 및 "형질도입"이란 용어는 외인성 DNA 서열이 진핵 숙주 세포 내로 도입되게 하는 과정을 지칭한다. 형질감염은 핵산(DNA 또는 RNA)의 비-바이러스성 전달이며 전기천공, 미세주사, 유전자 총 전달, 레트로바이러스 감염, 리포펙션, 중합체 매개 전달 등을 포함하는 다수의 수단 중 어느 하나에 의해 달성될 수 있다. 형질도입은 바이러스 또는 바이러스 벡터에 의한 핵산 전달을 지칭하는 것으로, 여기서 핵산은 DNA 바이러스의 경우 전형적인 DNA이고 RNA 바이러스의 경우 RNA이다.
일부 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 자가-불활성화되고 인핸서를 함유하지 않는다. 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터는 이 벡터가 숙주 세포 내에서 복제할 수 없게 만드는 3'LTR의 U3(ΔU3) 영역 내의 변형을 갖는다. U3 영역은 기본적인 프로모터 활성 및 바이러스 복제에 필수적인 결합 부위를 코딩하고, 이러한 결합 부위의 제거는 바이러스 복제의 사실상 완전한 불활성화를 초래한다.
심지어 성공적인 형질도입 및 임의로 숙주 게놈으로의 통합 후에도 무수히 많은 요인들이 바이러스 벡터의 효능에 영향을 미칠 수 있다: 몇가지 예를 들면, 유전자 발현 및 번역; 단백질 폴딩, 수송 및 전환율(turnover); 세포 대 세포 상호작용. 이러한 요인들은 다른 것들 중에서도 벡터에 의해 코딩되는 핵산 서열에 의존한다. 본 기술을 수행하기 위한 바람직한 DNA 서열은 바이러스 벡터 효능 및 효율을 증가시키는 것을 목적으로 하는 고유한 서열의 변형을 포함한다. 이러한 변형은 인간 사용을 위한 코돈 최적화; 융합 단백질에서 IPS1 서열의 첫 번째 메티오닌 제거; IPS1 막관통 도메인과 프롤린-풍부 도메인의 제거뿐만 아니라 역전된 IPS1 서열의 사용을 포함한다. 이러한 변형은 전사 및/또는 번역의 속도에 영향을 줄 뿐만 아니라 세포 내 단백질 위치 및 단백질 활성에 영향을 미칠 수 있다.
본 기술의 바이러스 벡터는 하나 이상의 항원을 코딩한다. 본원에서 사용되는 "항원"이란 용어는 면역반응을 일으키는 분자를 지칭한다. 이러한 면역반응은 항체 생산 또는 특정한 면역학적으로 적격한 세포의 활성화 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 항원은 유기체, 단백질/항원의 서브 유닛, 사멸되거나 불활성화된 전체 세포 또는 용해물로부터 유래될 수 있다. 따라서, 당업자는 사실상 모든 단백질 또는 펩티드를 포함한 임의의 거대분자가 항원으로서 작용할 수 있음을 인지하고 있다. 또한, 항원은 재조합 또는 게놈 DNA로부터 유래될 수 있다. 당업자는 병원성 게놈 또는 면역반응을 유발하는 단백질에 대한 유전자 또는 유전자 단편의 뉴클레오티드 서열 또는 부분적 뉴클레오티드 서열을 함유하는 어떠한 DNA라도 항원의 합성을 야기한다는 것을 인지하고 있다. 게다가, 당업자는 본 기술이 유전자 또는 게놈의 전체 핵산 서열의 사용으로 제한되지 않는다는 것을 인지하고 있다. 본 기술은 핵산 서열이 목적하는 면역반응을 일으키는 다양한 조합으로 배열되어 있는 하나 초과의 유전자 또는 게놈의 부분적 핵산 서열의 사용을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
항원은 향상된 면역반응이 바람직한 임의의 항원일 수 있다. 이러한 항원은 보호성 면역반응이 유도될 수 있는 감염성 질환을 유발하는 병원체 유래의 항원을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 예를 들어, HIV의 항원에는 단백질 gag, env, pol, tat, rev, nef, 역전사 효소 및 기타 HIV 성분이 포함된다. 인간 유두종 바이러스 유래의 E6 및 E7 단백질도 적합한 항원이다. 또한, 단순포진 바이러스 유래의 EBNA1 항원이 적합하다. 본 기술에서 사용하기 위한 기타 바이러스 항원은 B 형 간염 바이러스의 S, M 및 L 단백질, B 형 간염 바이러스의 전(pre)-S 항원 및 기타 간염, 예를 들어 A형, B형 및 C형 간염, C형 간염 바이러스 RNA와 같은 바이러스 성분과 같은 간염 바이러스 항원; 헤마글루티닌, 뉴라미니다제, 핵단백질, M2 및 기타 인플루엔자 바이러스 성분과 같은 인플루엔자 바이러스 항원; 홍역 바이러스 융합 단백질 및 기타 홍역 바이러스 성분과 같은 홍역 바이러스 항원; 단백질 E1 및 E2 및 기타 풍진 바이러스 성분과 같은 풍진 바이러스 항원; VP7sc 및 기타 로타 바이러스 성분과 같은 로타 바이러스 항원; 외피 당단백질 B 및 기타 사이토메갈로 바이러스 항원 성분과 같은 사이토메갈로바이러스 항원; RSV 융합 단백질, M2 단백질 및 기타 호흡기 합포체 바이러스 항원 성분과 같은 호흡기 합포체 바이러스 항원; 즉시 초기 발현 단백질(immediate early protein), 당단백 D 및 기타 단순포진 바이러스 항원 성분과 같은 단순 포진 바이러스 항원; gpl, gpll 및 기타 대상포진 바이러스 항원 성분과 같은 대상포진 바이러스 항원; 단백질 E, M-E, M-E-NS1, NS 1, NS 1-NS2A, 80% E, 및 기타 일본 뇌염 바이러스 항원 성분과 같은 일본 뇌염 바이러스 항원; 광견병 당단백질, 광견병 핵단백질 및 기타 광견병 바이러스 항원 성분과 같은 광견병 바이러스 항원; 웨스트나일 바이러스 prM 및 E 단백질; 및 에볼라 외피 단백질이다. 바이러스 항원의 추가적 예에 대해서는 문헌[Fundamental Virology, Second Edition, eds. Knipe, D. M. and, Howley P. M. (Lippincott Williams & Wilkins, New York, 2001)]을 참고한다. 또한, 세균 항원도 개시되어 있다. 본 기술의 조성물 및 방법에 사용될 수 있는 세균 항원은 백일해 독소, 필라멘트형 헤마글루티닌, 퍼탁틴(pertactin), FIM2, FIM3, 아데닐레이트 사이클라아제 및 기타 백일해 세균 항원 성분과 같은 백일해 세균 항원; 디프테리아 독소 또는 톡소이드 및 기타 디프테리아 세균 항원 성분과 같은 디프테리아 세균 항원; 파상풍 독소 또는 톡소이드 및 기타 파상풍 항원의 성분과 같은 파상풍 세균 항원; M 단백질 및 기타 연쇄상구균 세균 항원 성분과 같은 연쇄상구균 세균 항원; IsdA, IsdB, SdrD, 및 SdrE와 같은 포도상구균 세균 항원; 지질다당류, 플라젤린 및 기타 그람-음성 세균 항원 성분과 같은 그람-음성 바실러스 세균 항원; 마이콜산, 열쇼크 단백질 65 (HSP65), 30 kDa의 주요 분비형 단백질, 항원 85A, ESAT-6 및 기타 마이코박테리아 항원 성분과 같은 마이코박테리움 튜베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 세균 항원; 헬리코박터 파일로리 세균 항원 성분; 폐렴구균용혈소(pneumolysin), 페렴구균 피막 다당류 및 기타 폐렴구균 세균 항원 성분과 같은 폐렴구균 세균 항원; 피막 다당류 및 기타 헤모필루스 인플루엔자 바이러스 항원 성분과 같은 헤모필루스 인플루엔자 바이러스 항원; 탄저병 보호 항원, 탄저병 치사 인자(anthrax lethal factor) 및 기타 탄저병 세균 항원 성분과 같은 탄저병 세균 항원; 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis) 유래의 F1 및 V 단백질; 롬스(romps) 및 기타 리케치아 세균 항원 성분과 같은 리케치아 세균 항원을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 본원에 기재된 세균 항원과 함께 포함되는 것은 임의의 기타 세균 항원, 마이코박테리아 항원, 마이코플라스마 항원, 리케치아 항원 또는 클라미디아 항원이다. 원생동물 및 기타 기생충 항원의 예는, 낭충 표면 항원, 포자소체 표면 항원, 외주포자소체(circumsporozoite) 항원, 생식모세포/생식세포(gametocyte/gamete) 표면 항원, 혈액-단계 항원 pf 155/RESA 및 기타 플라스모디아 항원 성분과 같은 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum) 항원; SAG-1, p30 및 기타 톡소플라스마 항원 성분과 같은 톡소플라스마 항원; 글루타티온-S-트랜스퍼라제, 파라미오신, 및 기타 주혈흡충 항원 성분과 같은 주혈흡충 항원; gp63, 리포포스포글리칸 및 이의 연합 단백질 및 기타 리슈마니아 항원 성분과 같은 리슈마니아 주요 항원 및 기타 리슈마니아 항원; 및 75-77kDa 항원, 56kDa 항원 및 기타 트리파노소마 항원 성분과 같은 트리파노소마 크루지 항원을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 진균 항원의 예는 칸디다(Candida) 종, 아스퍼길러스(Aspergillus) 종, 블라스토마이세스(Blastomyces) 종, 히스토플라스마(Histoplasma) 종, 콕시디오도미코시스(Coccidiodomycosis) 종, 말라세지아 퍼르퍼르(Malassezia furfur) 및 기타 종, 엑소피알라 웨르네키(Exophiala werneckii) 및 기타 종, 피에드라이아 호르타이(Piedraia hortai) 및 기타 종, 트리코스포룸 베이겔리(Trichosporum beigelii) 및 기타 종, 소포자균(Microsporum) 종, 백선균(Trichophyton) 종, 표피사상균(Epidermophyton) 종, 스포로트릭스 첸키(Sporothrix schenckii) 및 기타 종, 폰세카애 페드로소이(Fonsecaea pedrosoi) 및 기타 종, 반길라 더마티티디스(Wangiella dermatitidis) 및 기타 종, 수달레체리아 보이디(Pseudallescheria boydii) 및 기타 종, 마두렐라 그리시아(Madurella grisea) 및 기타 종, 리조푸스(Rhizopus) 종, 압시디아(Absidia) 종 및 무코르(Mucor) 종을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 프리온 질환 항원의 예는 PrP, 베타-아밀로이드 및 기타 프리온-관련 단백질을 포함한다.
상기 언급한 감염성 및 기생충성 인자들 이외에도, 비감염성 인자들에 대한 바람직한 향상된 면역원성에 대한 또 다른 분야는 염증 및 자가면역 질환, 신경퇴행성 질환, 및 암을 포함하나 이에 한정되지 않는 증식성 질환의 분야에 있고, 여기서 암 항원을 발현하는 세포는 신체로부터 바람직하게 제거된다. 본 기술의 조성물 및 방법에서 사용될 수 있는 종양 항원은 전립선 특이적 항원(PSA), 유방, 난소, 고환, 흑색종, 텔로머라제; P-당단백질과 같은 다제 내성 단백질; MAGE- 1, 알파 태아단백, 암배아 항원, 돌연변이체 p53, 파필로마바이러스 항원, 흑색종 또는 다른 종양 세포의 강글리오시드 또는 다른 탄수화물-함유 성분을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 본 기술에 의해 어떠한 유형의 종양 세포 유래의 항원이라도 본원에서 설명되는 조성물 및 방법에서 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 항원은 암 세포, 또는 막 단백질과 같은 암 세포로부터 단리된 면역원성 물질일 수 있다. 서바이빈 및 텔로머라제 범용 항원(universal antigen) 및 고환암 항원의 MAGE 계열이 포함된다. 자가면역에 관여하는 것으로 나타났고 본 기술의 방법에서 관용을 유도하기 위해 사용될 수 있는 항원은 미엘린 염기성 단백질, 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 및 다발성 경화증의 단백지질 단백질(proteolipid protein) 및 류마티스 관절염의 CI1 콜라겐 단백질을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
항원은 비제한적 예로서 HIV-1, EBV, HBV, 인플루엔자 바이러스, SARS 바이러스, 폭스바이러스, 말라리아 또는 HSV와 같은 감염성 인자의 일부분일 수 있고, 이들에 대해 (수지상 세포를 통해) 강력한 T-세포 매개 면역을 동원하는 백신이 필요하다.
본원에서 사용되는 "암"이란 용어는 조절되지 않는 성장, 분화의 결여, 국소 조직 침습 및 전이를 야기하는 독특한 특질-정상적 제어의 상실-을 가진 세포의 과다증식으로서 정의된다. 예에는 흑색종, 비소세포 폐, 소세포 폐, 폐, 간암종, 백혈병, 망막모세포종, 성상세포종, 아교모세포종, 치은, 혀, 신경모세포종, 두부, 경부, 유방, 췌장, 전립선, 신장, 뼈, 고환, 난소, 중피종, 자궁경부, 위장관, 림프종, 뇌, 결장, 육종 또는 방광을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
"종양"이란 용어는 조직 신생(tissue neoformation)의 형태, 특히 내인성 조직의 거의 탈억제된 자발적, 자율적 및 비가적인 과도한 성장의 형태의 적어도 하나의 세포 또는 세포 덩어리를 나타내며, 그 성장은 대체로 특정 세포 및 조직 기능의 거의 확연한 상실과 연관된다. 이러한 세포 또는 세포 덩어리는 이의 성장과 관련하여 스스로 또는 숙주 유기체의 조절 기작에 의해 효과적으로 억제되지 않으며, 그 예는 흑색종 또는 암종이다. 종양 항원은 악성 세포 자체 내에 또는 그 위에 존재하는 항원을 포함할 뿐만 아니라, 내피 세포 및 다른 혈관 성분을 포함하는 종양의 조직을 지지하는 기질(stromal)에 존재하는 항원도 포함한다. 관련 양상에서, "신생물"은 비정상적인 신생 성장을 지칭하며 따라서 양성 또는 악성일 수 있는 종양과 동일한 것을 의미한다. 추가로, 이러한 신생물은 세포 증식 장애를 포함할 수 있다.
본 기술의 렌티바이러스 벡터는 하나 이상의 보조제를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 인간 사용을 위한 코돈 최적화(LMP1 CO)를 갖는 전장 LMP1을 코딩하는 DNA 서열은 서열번호 1(하기)을 포함한다. 전장 LMP1의 코딩된 아미노산 서열은 서열번호 2로서 하기에 나타낸다.
Figure pct00001
유용한 대조군 유전자 보조제는 세포질내 신호전달 도메인이 결실된 절두된 형태의 LMP1(LMP1_CO 델타 IC)에 의해 제공된다. 이러한 형태의 DNA 서열(인간 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화됨)은 서열번호 3으로서 하기에 나타내고, 코딩된 아미노산 서열은 서열번호 4로서 나타낸다. 신호전달 도메인의 기능은 서열번호 1(신호전달 도메인을 포함)의 발현에 대한 반응을 서열번호 3(신호전달 도메인이 결여됨)의 발현에 대한 반응과 비교함으로써 밝혀질 수 있다.
Figure pct00002
바람직한 보조제는, 세포질내 영역이 없이 전장 인간 IPS1과 융합된 엡스타인 바르 바이러스의 LMP1을 함유하는 융합 단백질 LMP1(델타 IC) hIPS1이다. 융합 단백질에서, 인간 IPS1의 첫 번째 아미노산(메티오닌)은 제거되었다. 융합 단백질은 인간 사용을 위해 코돈 최적화된다. 상기 융합 단백질의 DNA 및 코딩된 아미노산 서열을 하기에 나타낸다:
DNA 서열
Figure pct00003
단백질 서열
Figure pct00004
다른 바람직한 보조제는 막관통 영역이 없는 인간 IPS1의 아미노산 2 내지 439번과 융합된, 세포질내 영역이 없는 엡스타인 바르 바이러스의 LMP1을 함유하는 융합 단백질 LMP1(델타 IC) hIPS1(델타TM)이다. 융합 단백질에서, 인간 IPS1의 첫 번째 아미노산(메티오닌)은 제거되었다. 융합 단백질은 인간 사용을 위해 코돈 최적화된다. 상기 융합 단백질의 DNA 및 코딩된 아미노산 서열을 하기에 나타낸다:
DNA 서열
Figure pct00005
단백질 서열
Figure pct00006
또 다른 바람직한 보조제는 인간 IPS1의 아미노산 2 내지 93번(C-말단 프롤린-풍부 도메인 및 막관통 도메인이 제거된 절두된 IPS1)과 융합된, 세포질내 영역이 없는 엡스타인 바르 바이러스의 LMP1을 함유하는 융합 단백질 LMP1(델타IC) hIPS1(델타TM 델타Pro)이다. 융합 단백질에서, 인간 IPS1의 첫 번째 아미노산(메티오닌)은 제거되었다. 융합 단백질은 인간 사용을 위해 코돈 최적화된다. 상기 융합 단백질의 DNA 및 코딩된 아미노산 서열을 하기에 나타낸다:
DNA 서열
Figure pct00007
단백질 서열
Figure pct00008
또 다른 바람직한 보조제는 인간 IPS1의 아미노산 2 내지 439번(막관통 도메인이 제거되었고 역 아미노산 순서, 즉 고유한 IPS1의 C-말단에서 N-말단 방향으로 439 내지 2번으로 제시된 절두된 IPS1)과 융합된, 세포질내 영역이 없는 엡스타인 바르 바이러스의 LMP1을 함유하는 융합 단백질 LMP1(델타 IC) hIPS1 역전(델타 TM)이다. 융합 단백질에서, (천연의 직접적 DNA에 의해 코딩된) 인간 IPS1의 첫 번째 아미노산(메티오닌)은 제거되었다. 융합 단백질은 인간 사용을 위해 코돈 최적화된다. 상기 융합 단백질의 DNA 및 코딩된 아미노산 서열을 하기에 나타낸다:
DNA 서열:
Figure pct00009
단백질 서열
Figure pct00010
또 다른 바람직한 보조제는 인간 IPS1의 아미노산 2 내지 513번(C 말단 막관통 도메인이 제거된 절두된 hIPS1)과 융합된 엡스타인 바르 바이러스의 전장 LMP1을 함유하는 융합 단백질 LMP1 hIPS1(델타TM)이다. 융합 단백질에서, 인간 IPS1의 첫 번째 아미노산(메티오닌)은 제거되었다. 융합 단백질은 인간 사용을 위해 코돈 최적화된다. 상기 융합 단백질의 DNA 및 코딩된 아미노산 서열을 하기에 나타낸다:
DNA 염기 서열
Figure pct00011
단백질 서열
Figure pct00012
서열번호 13 및 14의 강조 표시된 부분은 프롤린-풍부 도메인을 나타낸다.
또 다른 바람직한 보조제는 프롤린-풍부 도메인과 막관통 도메인이 제거된 변형된 인간 IPS1의 아미노산 2 내지 462번과 융합된 엡스타인 바르 바이러스의 전장 LMP1을 함유하는 융합 단백질 LMP1 hIPS1(델타Pro 델타TM)이다. 융합 단백질에서, 인간 IPS1의 첫 번째 아미노산(메티오닌)은 제거되었다. 융합 단백질은 인간 사용을 위해 코돈 최적화된다. 상기 융합 단백질의 DNA 및 코딩된 아미노산 서열을 하기에 나타낸다:
DNA 염기 서열
Figure pct00013
단백질 서열
Figure pct00014
또 다른 바람직한 보조제는 역 순서로, 즉 천연 서열의 C-말단부터 N-말단으로 제시된 2 내지 514번 인간 IPS1 서열(막관통 도메인이 제거됨)과 융합된 엡스타인 바르 바이러스의 전장 LMP1을 함유하는 융합 단백질 LMP1 hIPS1 델타TM(Rev)이다. 융합 단백질에서, 인간 IPS1의 첫 번째 아미노산(메티오닌, 본래의 직접적 인간 DNA에 의해 코딩된 바와 같음) 및 TM 도메인은 제거되었다. 융합 단백질은 인간 사용을 위해 코돈 최적화된다. 상기 융합 단백질의 DNA 및 코딩된 아미노산 서열을 하기에 나타낸다:
DNA 염기 서열
Figure pct00015
단백질 서열
Figure pct00016
서열번호 17 및 18의 강조 표시된 부분은 프롤린-풍부 도메인을 나타낸다.
또 다른 바람직한 보조제는 LMP1 세포질내 도메인에 융합된 막관통 도메인이 결여된 인간 IPS1과 융합된 절두된 LMP1 서열(세포질내 도메인이 결여됨)을 함유하는 융합 단백질 LMP1(델타IC) hIPS1(델타TM) LMP1(cyt)이다. 융합 단백질에서, 인간 IPS1의 첫 번째 아미노산(메티오닌)은 제거되었다. 융합 단백질은 인간 사용을 위해 코돈 최적화된다. 상기 융합 단백질의 DNA 및 코딩된 아미노산 서열을 하기에 나타낸다:
DNA 염기 서열
Figure pct00017
Figure pct00018
단백질 서열
Figure pct00019
서열번호 19 및 20의 강조 표시된 부분은 프롤린-풍부 도메인을 나타낸다.
또 다른 바람직한 보조제는 LMP1 세포질내 도메인에 융합된, 막관통 도메인과 프롤린-풍부 도메인이 결여된 인간 IPS1에 융합된 절두된 LMP1 서열(세포질내 도메인이 결여됨)을 함유하는 융합 단백질 LMP1(델타IC) hIPS1(델타TM Pro) LMP1(cyt)이다. 융합 단백질에서, 인간 IPS1의 첫 번째 아미노산(메티오닌)은 제거되었다. 융합 단백질은 인간 사용을 위해 코돈 최적화된다. 상기 융합 단백질의 DNA 및 코딩된 아미노산 서열을 하기에 나타낸다:
DNA 염기 서열
Figure pct00020
단백질 서열
Figure pct00021
또 다른 바람직한 보조제는 LMP1 세포질내 도메인에 융합된, TM 도메인이 없이 역 순서로, 즉 천연 서열의 C-말단부터 N-말단으로 제시된 인간 IPS1 서열과 융합된 절두된 LMP1 서열(세포질내 도메인이 결여됨)을 함유하는 융합 단백질 LMP1 (델타IC) hIPS1(델타TM Rev) LMP1(cyt)이다. 융합 단백질에서, 인간 IPS1의 첫 번째 아미노산(메티오닌)은 제거되었다. 융합 단백질은 인간 사용을 위해 코돈 최적화된다. 상기 융합 단백질의 DNA 및 코딩된 아미노산 서열을 하기에 나타낸다:
DNA 염기 서열
Figure pct00022
단백질 서열
Figure pct00023
서열번호 23 및 24의 강조 표시된 부분은 프롤린-풍부 도메인을 나타낸다.
바람직한 실시형태에서, 면역 체크포인트 억제제 분자 또는 가용성 면역 조절제 분자는 본 바이러스 벡터 내에서 코딩되어 종양에 대한 면역반응을 향상시킬 것이다. 면역 체크포인트 억제제 분자는 항-MAdCAM 분자, PD1 차단제 및 PDL1 차단제일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 면역 체크포인트 억제제 분자는 항체와 같은 단백질일 수 있거나 가용성 형태의 항-체크포인트일 수 있다.
특정의 실시형태에서, 바이러스 벡터는 하나 초과의 발현 카세트를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터 입자는 개별적으로 전달될 수 있거나 작동 가능하게 연결될 수 있는 하나 초과의 핵산 분자, 예컨대 2개 또는 3개의 핵산 분자를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 핵산은 항원 및/또는 가용성 면역 체크포인트 억제제 분자 또는 가용성 면역 조절제 분자를 코딩한다. 일부 실시형태에서, 제3 핵산은 제2 핵산 분자에 의해 코딩된 것과 상이한 항원 및/또는 면역 체크포인트 억제제 분자를 코딩한다.
하나의 양상에서, 본 기술은 대상체에서 질환 또는 병태를 예방 또는 치료하기 위한 면역치료 제형이다. 백신은 치료적 유효량의 바이러스 벡터를 포함한다. 질환은 암 또는 감염과 같은, 인자에 대한 백신접종이 바람직한 임의의 질환일 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 기술은 대상체에서 암 또는 감염에 대한 면역반응을 유도하거나 향상시키는 방법이다. 상기 방법은 치료적 유효량의 바이러스 벡터 또는 면역치료 제형을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
실시예
실시예 1. 분자 작제물
2분자 보조제 전략에 따라, 다음 요소들을 함유하는 벡터를 작제하였다: (a) 프로모터, 바람직하게는 인간 유비퀴틴 프로모터; (b) 리포터 유전자(예를 들어, 녹색 형광 단백질) 또는 대안으로 단일 전이유전자 내의 융합체로서의 하나 이상의 항원; (c) IRES에 이어서 제1 보조제 유전자(즉, LMP1 또는 LMP1 CO); (d) IRES에 이어서 제2 보조제 유전자(즉, LMP1-IPS1 융합 단백질); 및 (e) 임의로, IRES에 이어서 가용성 및 분비형 면역 체크포인트 억제제 또는 가용성 면역 조절제 분자를 코딩하는 하나 이상의 유전자(예를 들어,도 8a 내지 8c를 참조). 일반적으로, 서열은 바람직하게는 상기 언급된 순서(특히, (c) 및 (d)의 순서가 역전될 수 있음)로 있지만, 유전자는 임의의 다른 적합한 순서로 벡터 내에 위치할 수 있다. 앞서 언급한 모든 영역이 아닌 일부 영역을 갖는 대조군 벡터도 작제하였다.
단일 분자 보조제 전략에 따라, 다음 요소들을 함유하는 벡터를 작제하였다: (a) 프로모터, 바람직하게는 인간 유비퀴틴 프로모터; (b) 리포터 유전자(예를 들어, 녹색 형광 단백질) 또는 대안으로 단일 전이유전자 내의 융합체로서의 하나 이상의 항원; (c) IRES에 이어서 보조제 융합 단백질 유전자(즉, hIPS1 또는 이의 기능적 등가물(예를 들어, hIPS1 델타TM)에 융합된, 세포질내 신호전달 도메인이 결여된 LMP1, 또는 LMP1의 세포질내 신호전달 도메인에 융합된 hIPS1 또는 이의 기능적 등가물에 융합된, 세포질내 도메인이 결여된 LMP1; 및 (d) 임의로, IRES에 이어서 가용성 및 분비형 면역 체크포인트 억제제 또는 가용성 면역 조절제 분자를 코딩하는 하나 이상의 유전자(예를 들어, 도 8a 내지 8c를 참조). 일반적으로, 서열은 바람직하게는 상기 언급된 순서로 있지만, 유전자는 임의의 다른 적합한 순서로 벡터 내에 위치할 수 있다. 앞서 언급한 모든 영역이 아닌 일부 영역을 갖는 대조군 벡터도 작제하였다.
실시예 2. 바이러스 벡터의 생산.
렌티바이러스 벡터는 문헌[Nasri et al. (2014)]에 기재된 바와 같이 HEK 293T 세포주를 일시적 칼슘-포스페이트 형질감염시켜 생산하였다. HEK 293T 세포를 250 mL의 완전 배양 배지에서 2개의 챔버 셀 스택(Cell Stack)(Corning)에 1.6x108개 세포로 접종하고, 부착될 때까지 37℃에서 5% CO2의 가습된 대기를 함유한 항온배양기에서 24시간 동안 유지시켰다. 생산된 각 벡터에 대해, 하나의 셀 스택을 다음과 같이 형질감염시켰다. 렌티바이러스 골격 플라스미드(235 ㎍), 외피 코딩 플라스미드(47 ㎍) 및 패키징 플라스미드(235 ㎍)를 8,6 mL의 멸균 증류수 및 3.0 mL의 CaCl2와 혼합하였다. 이어서, DNA 혼합물을 37℃의 예열된 HBS 2X(pH = 7,1)에 적가하고, 24.2 mL의 수득된 침전물을 실온에서 30분 동안 항온배양한 후 세포의 배양 배지에 첨가하였다. 형질감염된 세포를 37℃, 5% CO2에서 항온배양하였다. 배지는 형질감염 24시간 후에 혈청 및 페놀 레드가 없는 수거 배지 210 mL로 교체하였고, 추가로 24시간 후에 바이러스 상청액을 수거하고, 2500 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 청정화시켰다. 수거된 청정한 벌크(bulk)(210 mL)를 MgCl2의 존재 하에 30분 동안 DNase I로 처리하여 임의의 잔류 DNA를 절단하고 22000 rpm, 4℃에서 1시간 동안 원심분리하여 농축시켰다. 벡터 펠렛을 70 ㎕의 Tris-트레할로오스(50 mM)에 재현탁시키고 1,5 mL 마이크로튜브에 풀링(pooling)하고 50 ㎕ 분취액으로 나누어 냉동하고 ≤ -70℃에서 저장하였다.
생산 수율은 GFP 벡터에 비해 보조제 포함된 벡터의 효과가 다소 떨어졌는데, 이는 분명히 더 긴 DNA 카세트의 존재 때문이다. 그러나, 모든 보조제 포함된 작제의 경우, 역가는 적어도 109 TU/mL 범위 내였고 상이한 생산 실행들 간에 일관되게 발견되었다. 산업적 생물제조에 영향을 줄만한 문제는 없었다.
실시예 3. CD40L 및 STING 경로 둘 다를 활성화하는 이중 보조된 렌티바이러스 벡터의 시험관내 효과
신선한 인간 수지상 세포와 대식세포를 건강한 인간 공여자(백혈구 원뿔(leukocyte cone))로부터 밀도 구배를 통해 얻었다. CD14-양성 단핵구를 마그네틱 단리 키트(양성 선택)를 사용하여 PBMC로부터 정제하고, 완전 RPMI 내에 6-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 단핵구를 공개된 방법을 사용하여 GM-CSF 및 IL-4를 이용하여 DC로 분화시켰다. 3일 후 사이토카인을 보충하기 위해 10% 배지 교환을 실시하고, 비-효소 세포 해리 용액을 사용하여 총 6일 배양한 후 세포를 수거하였다. 그 다음, DC를 완전 RPMI + 4 ㎍/ml의 폴리브렌 + 렌티바이러스 작제물(MOI 15에서) + GM-CSF 및 IL-4에 재-플레이팅하였다. 2시간 후, 700 ㎕의 완전 RPMI + GM-CSF/IL-4를 첨가하고, 세포를 총 96시간 동안 배양하였다. 추가 대조 웰을 96시간 동안 IFN-γ 및 LPS로 자극하여 활성화 마커 발현을 위한 양성 대조군으로서 작용하도록 하였다.
CD14+ 단핵구를 GM-CSF(M1) 또는 M-CSF(M2)를 이용하여 M1 또는 M2 대식세포로 분화시켰다. 3일 후 사이토카인을 보충하기 위해 10% 배지 교환을 실시하고, 비-효소 세포 해리 용액을 사용하여 총 6일 배양한 후 세포를 수거하고, 대식세포를 1:1 비율에서 풀링하였다. M1/M2 대식세포를 300 ㎕의 완전 RPMI + 4 ㎍/ml의 폴리브렌 + 렌티바이러스 작제물(MOI 15에서) + M-CSF)에 재-플레이팅하였다. 2시간 후, 700 ㎕의 완전 RPMI + M-CSF를 첨가하고, 세포를 총 96시간 동안 배양하였다. 추가 대조 웰을 총 96시간 동안 IFN-γ 및 LPS(M1) 또는 IL-13 및 IL-4(M2)로 자극하여 활성화 마커 발현을 위한 양성 대조군으로서 작용하도록 하였다.
인간 DC 및 대식세포는 하기 설명하는 발현 카세트들을 함유하는 렌티바이러스 벡터들로 15의 MOI로 형질감염시켰다:
작제물 1 : GFP-IRES-LMP1(dIC)-IPS1(dTM)-LMP1(IC)
작제물 2 : GFP-IRES-LMP1(dIC)-IPS1(dTMdPro)-LMP1(IC)
작제물 3 : GFP-IRES-LMP1(dIC)-IPS1(dTMRev)-LMP1(IC)
작제물 4 : GFP-IRES-LMP1-IPS1(dTM)
작제물 5 : GFP-IRES-LMP1- IPS1(dTMdPro)
작제물 6 :GFP-IRES-LMP1-IPS1(dTMRev)
대조 작제물 1 : GFP
대조 작제물 2 : GFP-IRES-LMP1(dIC)
보조제 작제물의 예시에 대해서는 도 8a 내지 8b를 참조하고 대조 작제물에 대해서는 도 10을 참조한다.
수지상 세포와 대식세포 증식을 24시간 배양한 후 정량하였다. 삼중 샘플을 3H-TdR로 펄스 처리하고 수거하기 전에 밤새 배양하고 방사성 티미딘의 혼입을 표준 섬광 계수에 의해 결정하였다. 증식은 GFP 벡터에 비해 보조제 포함된 벡터를 사용할 때 약간 감소되었는데, 이는 더 긴 DNA 카세트의 존재 때문일 가능성이 크다. 이미 언급한 바와 같이, 형질도입된 세포의 생존력은 BD FACS Canto System 유세포계측기를 사용하여 분석하기 전에 고정가능한 생존력 염료로 염색하여 결정하였다. 보조제 포함된 벡터들 간에는 약간의 차이가 관찰되었지만, 유의한 독성은 발견되지 않았다.
96시간 배양한 후 Attune NxT 유세포계측기로 형광을 측정하여 각 작제물로 형질도입된 세포에 대해 GFP의 발현을 측정하였고, 그 결과를 도 11a(수지상 세포) 및 도 11b(대식세포)에 나타낸다. 생존 가능한 GFP-양성 세포의 백분율은 잔사(debris) 배제된/생존 가능한/단일 세포상에서의 개폐(gating)에 의해 결정하였다. 3회의 독립적인 실험을 상이한 공여자들로부터 단리된 PBMC로 수행하였다. 그래프 데이터는 중복 실시된 대표 실험의 평균을 나타낸다. 도 11a(수지상 세포) 및 도 11b(대식세포)에 제시된 결과는, 두 세포 유형 모두에서 보조제 포함된 벡터들 간에 약간의 차이가 관찰되었지만 IRES 작제의 경우에는 GFP 전이유전자의 유의적 발현이 관찰되었음을 보여준다. 작제물에서 Pro 도메인을 제거하는 것은 작제물 2 및 작제물 5에서 GFP 전이유전자 발현을 증가시켰는데, 이는 보다 짧은 DNA 카세트의 존재 때문일 가능성이 크다. IPS1 CARD 및 PRO 도메인의 배향 역전은 작제물 3 및 작제물 6에서 관찰된 바와 같이 GFP 전이유전자의 발현을 강하게 감소시켰다.
렌티바이러스 벡터에 의해 유도된 수지상 세포 및 대식세포의 활성화 및 성숙은 표면 마커의 발현을 측정하고 이들의 사이토카인 및 케모카인 방출 프로파일을 평가함으로써 평가하였다. 렌티바이러스 통합 및 DC/대식세포 활성화의 수준을 결정하기 위해, 96시간 배양 후 세포를 수거하고, BD FACS Canto System 유세포계측기를 사용하여 분석하기 전에 고정가능한 생존력 염료 및 다음의 표면 마커를 인식하는 염색 항체의 패널로 염색하였다: CD25, CD40, CD69, CD80/86, CD83, CCR7, MHC I 및 MHC II. 세포 빈도 및 기하평균 마커 발현 값을 잔사 배제된/생존 가능한/단일 세포상에서의 개폐에 의해 결정하였다. 모든 발현 수준은 GFP 발현에 대해 정규화하였다. 수지상 세포와 대식세포 둘 다의 경우, STING 및 CD40 경로의 활성화는, 고효율 유체소자(high throughput fluidic)를 갖는 Bioplex 200 시스템(Biorad)을 이용한 Luminex 분석에 의해 96시간 배양 후의 IFN-α 및 IFN-β뿐만 아니라 면역자극성 사이토카인 IL-8, IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-12p70의 생성을 측정함으로써 평가하였다. 면역-억제성 사이토카인 IL-10의 생성을 대조군으로서 측정하였다. 상이한 건강한 공여자들로부터 단리된 PBMC를 이용하여 3회의 독립적인 실험을 수행하였다. 그래프 데이터는 중복 실시된 대표 실험의 평균을 의미한다. 그 결과는 도 12a(수지상 세포, 사이토카인), 도 12b(수지상 세포, 막 마커), 도 12c(대식세포, 사이토카인) 및 도 12d(대식세포, 막 마커)에 제시한다.
형질도입된 수지상 세포의 경우, GFP 양성 세포에 의한 표면 마커의 발현에 대한 결과는 IRES 작제물이 다음의 면역 활성화 마커의 발현을 상향조절하였다는 것을 보여주었다: MHCII(작제물 1, 2, 4 및 5를 이용하였을 때 관찰된 상향조절); CD40(작제물 1, 2, 3, 및 6을 이용하였을 때 유의적인 증가); CD83(작제물 1, 3, 4 및 5을 이용하였을 때 2배 증가), CD80/86(작제물 1, 2, 3, 4 및 6을 이용하였을 때 약간 상향조절). 이러한 활성화 마커들의 상향조절과 일치하여, 사이토카인 발현의 증가는 다음과 같았다: 염증촉진성 IL-6은 작제물 1 및 2을 이용하였을 때 발현되었고; 염증촉진성 TNF-α는 작제물 1, 2 및 5를 이용하였을 때 유의적으로 증가하였고; IL-12는 작제물 1 및 5를 이용하였을 때 유의적으로 증가하였다. 소염 IL-10 수준은 평가된 작제물들 중 어느 것에 의해서도 영향을 받지 않았다.
유사하게, 형질도입된 대식세포에서, GFP-양성 세포에 의한 마커의 발현 결과는 IRES 작제물이 면역 활성화 마커의 발현을 상향조절하였다는 것을 보여주었다: MHCII는 작제물 1, 2, 4 및 5에 의해 유도되었다; CD83은 작제물 1 및 6을 이용하였을 때 2배 증가하였다; CD80/86은 작제물 1 및 2를 이용하였을 때 증가하였다. 이러한 활성화 마커들의 상향조절과 일치하여, 사이토카인 발현의 증가는 염증촉진성 IL-1β는 작제물 1을 이용하였을 때 4배 양만큼 증가하였고 작제물 3, 4 및 6을 이용하였을 때 더 낮은 정도로 증가하였고; 염증촉진성 IL-6 수준은 작제물 1, 2, 4 및 5를 이용하였을 때 유의적으로 증가하였고; 염증촉진성 TNF-α는 작제물 1 및 2를 이용하였을 때 4배 증가하였다. 소염성 IL-10 수준은 평가된 작제물들 중 어느 것에 의해서도 영향을 받지 않았다.
결론적으로, IPS1 CARD 도메인과 PRO 도메인의 배향을 역전시키면서 IPS1 막관통 도메인을 제거하는 것은 어떠한 면역 자극 효과도 나타내지 않았다. IPS1 막관통 도메인의 제거는 보조제의 활성을 증가시킨 반면, LMP1과 IPS1의 배향은 IRES 작제물에 의한 보조제 효과에 유의적인 영향을 미치지 않았다.
실시예 4. 단일 또는 다수의 항원으로 처리된 건강한 마우스에서의 생체내 면역원성은 이중 보조제 포함된 LMP1-IPS1(CD40L 및 STING) 렌티바이러스 벡터를 사용할 때 우수한 면역원성을 나타낸다.
건강한 마우스를 실시예 1에서 설명한 바와 같은 발현 카세트를 함유하는 바이러스 벡터로 상이하게 처리한다. 항원과 보조제(즉, CD40L 경로 및 STING 경로)가 단독으로 또는 2회 투여(프라임(prime) + 부스트(boost)) 후에 함께 발현될 때의 면역반응을 비교하기 위한 실험을 수행한다. 생체내 면역원성의 단기(3주) 및 장기(3개월) 평가를 마우스 혈액 바이오마커(IFN-γ 및 다양한 인터류킨)의 FACS 분석에 의해 수행하고, 이는 제시된 항원을 벡터로 표적화 하는 CD4+ 및 CD8+과 같은 항원-특이적 면역 세포 및 기억 T 세포를 검출 및 정량할 수 있게 한다. 항원(들) 및 LMP1-IPS1 융합체를 코딩하는 이중 보조제 포함된 렌티바이러스 벡터로의 처리는 단일 보조제 포함된 렌티바이러스 벡터와 비교하여 특이적 면역원성을 증가시키거나 LMP1의 막 도메인만을 발현시킬 것으로 예상된다.
실시예 5. 특정 종양의 마우스 모델에서의 생체내 면역원성은 다수의 항원들과 CD40L 및 STING 경로 활성제의 조합을 함유하는 이중 보조제 포함된 렌티바이러스 벡터의 우수한 효과를 나타낸다.
특정 종양의 마우스 모델을 실시예 1에서 설명한 바와 같은 발현 카세트를 함유하는 바이러스 벡터로 처리한다. 마우스를 벡터 유형 및 작제물, 용량 및 주사 횟수(프라임 + 부스트 주사)에 따라 상이한 처리군으로 나눈다. 생체내 유효성 및 면역원성은 종양 성장 속도, 생존, 및 마우스 혈액 바이오마커(IFN-γ 및 다양한 인터루킨)의 FACS 분석에 의한 CD4+, CD8+ 및 기억 T 세포와 같은 항원 특이적 면역 세포의 검출에 의해 평가한다. 적응증-특이적 항원을 코딩하는 이중 보조제 포함된 렌티바이러스 벡터는 모든 실험군의 가장 강력하고 장기 지속되는 면역반응을 유도하여, 처리된 마우스 군에서 더 높은 생존율 및/또는 더 낮은 종양 성장을 유도할 것으로 예상된다.
실시예 6. 특정 항-체크포인트 민감성 종양의 마우스 모델에서의 생체내 면역원성은 다수의 항원들과 항-체크포인트의 조합을 함유하는 이중 보조제 포함된 렌티바이러스 벡터의 우수한 효과를 나타낸다.
특정 종양의 마우스 모델을 실시예 1에서 설명한 바와 같은 발현 카세트 및 하나 이상의 항-체크포인트 분자의 가용성 및 분비형 형태를 함유하는 바이러스 벡터로 처리한다. 마우스를 벡터 작제물, 용량 및 주사 횟수(프라임 + 부스트 주사)에 따라 상이한 처리군으로 나눈다. 생체내 유효성 및 면역원성은 종양 성장 속도, 생존, 및 마우스 혈액 바이오마커(IF-γ 및 다양한 인터루킨)의 FACS 분석에 의한 CD4+, CD8+ 및 기억 T 세포와 같은 항원 특이적 면역 세포의 검출에 의해 평가한다. 적응증-특이적 항원을 코딩하는 이중 보조제 포함된 렌티바이러스 벡터는 모든 실험군의 가장 강력하고 장기 지속되는 면역반응을 유도할 것으로 예상된다.
본 출원은 2016년 11월 28일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/426,860호에 대한 우선권을 주장하며, 이는 그 전체가 본 명세서에서 참고로 인용된다.
본원에서 사용되는 "로 본질적으로 이루어진(consisting essentially of)"은 청구항의 기본적이고 신규한 특성에 실질적으로 영향을 주지 않는 물질 또는 단계의 포함을 허용한다. 본원에서 "포함하는"이란 용어의 기재는, 특히 조성물의 구성요소의 설명 또는 장치의 요소의 설명에서 "로 본질적으로 이루어진" 또는 "로 이루어진"과 교환될 수 있다.
본 발명은 특정의 바람직한 실시형태와 관련하여 설명되었지만, 당업자라면 상기 명세서를 읽은 후에, 본원에 기재된 조성물 및 방법에 대한 다양한 변환, 등가물 치환 및 다른 변경을 실시할 수 있을 것이다.
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Gly Ser Ser Ala Trp Leu Asp 530 535 540 Ser Ser Ser Glu Asn Arg Gly Leu Gly Ser Glu Leu Ser Lys Pro Gly 545 550 555 560 Val Leu Ala Ser Gln Val Asp Ser Pro Phe Ser Gly Cys Phe Glu Asp 565 570 575 Leu Ala Ile Ser Ala Ser Thr Ser Leu Gly Met Gly Pro Cys His Gly 580 585 590 Pro Glu Glu Asn Glu Tyr Lys Ser Glu Gly Thr Phe Gly Ile His Val 595 600 605 Ala Glu Asn Pro Ser Ile Gln Leu Leu Glu Gly Asn Pro Gly Pro Pro 610 615 620 Ala Asp Pro Asp Gly Gly Pro Arg Pro Gln Ala Asp Arg Lys Phe Gln 625 630 635 640 Glu Arg Glu Val Pro Cys His Arg Pro Ser Pro His Ser Asp Glu His 645 650 655 His His Asp Asp Ser Leu Pro His Pro Gln Gln Ala Thr Asp Asp Ser 660 665 670 Ser Asn Gln Ser Asp Ser Asn Ser Asn Glu Gly Arg His Leu Leu Leu 675 680 685 Val Ser Gly Ala Gly Asp Gly Pro Pro Leu Cys Ser Gln Asn Leu Gly 690 695 700 Ala Pro Gly Gly Gly Pro Asn Asn Gly Pro Gln Asp Pro Asp Asn Thr 705 710 715 720 Asp Asp Asn Gly Pro Gln Asp Pro Asp Asn Thr Asp Asp Asn Gly Pro 725 730 735 His Asp Pro Leu Pro Gln Asp Pro Asp Asn Thr Asp Asp Asn Gly Pro 740 745 750 Gln Asp Pro Asp Asn Thr Asp Asp Asn Gly Pro His Asp Pro Leu Pro 755 760 765 His Asn Pro Ser Asp Ser Ala Gly Asn Asp Gly Gly Pro Pro Gln Leu 770 775 780 Thr Glu Glu Val Glu Asn Lys Gly Gly Asp Gln Gly Pro Pro Leu Met 785 790 795 800 Thr Asp Gly Gly Gly Gly His Ser His Asp Ser Gly His Asp Gly Ile 805 810 815 Asp Pro His Leu Pro Thr Leu Leu Leu Gly Thr Ser Gly Ser Gly Gly 820 825 830 Asp Asp Asp Asp Pro His Gly Pro Val Gln Leu Ser Tyr Tyr Asp 835 840 845 <210> 23 <211> 2697 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Fusion of LMP1 of Epstein Barr virus and IPS1 of Homo sapiens <400> 23 atggatctgg atctcgaaag aggacctcct ggacctagac ggcctcctag aggaccacct 60 ctgagcagct ctattggact ggccctgctg ctgcttctgc tggctctgct gttctggctg 120 tacatcatca tgagcaactg gaccggcgga gcactgctgg tgctgtatgc ctttgctctg 180 atgctggtca tcatcatcct gatcatcttc atcttccggc gggacctgct gtgtcctctg 240 ggagcacttt gtctgttgct gctgatgatc accctcctgc tgatcgccct gtggaacctg 300 catggacagg ccctgtatct gggcatcgtg ctgttcatct tcggctgcct gctggttctc 360 ggcctgtgga tctacctgct ggaaatcctt tggagactgg gcgccaccat ctggcagctg 420 ctggcctttt tcctggcctt ctttctggat atcatcctcc tcatcattgc cctgtacctg 480 cagcagaact ggtggaccct gctggtggat ctgctttggc tgctgctctt tctggccatc 540 ctgatttgga tgtactacca cggccagcgg ccttctccaa gacactgccc agtggaaaga 600 gagcagttca agagggacgc ccagcctaga cctggcggag atcctgatgc tccacctgga 660 ccaaatggcg agctgctgca gatcagccct aatgaggccg tgcacatcgg cttcaccggc 720 gagtctaagt acgagaacga ggaacccggc cactgtcctg gcatgggcct ttctacatct 780 gcctctatcg ccctggacga gttctgcggc agctttccat ctgatgtgca gtctgccctc 840 gtgggcccta agtctctgga atctggcctg ggcagaaacg agagcagctc cgatctgtgg 900 gctagctctg gtggaacagc tggcgctcct acaccagccg ctcctaccga agagaataga 960 agcagcggcg acacccctgt gacaagcgcc tctgtgaaaa ccctggtcat gagcacccca 1020 gtgaagtccc cagtgatggg cgccagaacc tccaacattc ccctgaagtc tcccgctcct 1080 aacacactgg ccaactctcc agtggctggc cctcctaagt ctagcacccc tctgaaaagc 1140 cccgtgacct ctgtgtctgc ccctaacgct cctgtgaaac tggccgtgac caacgtgccc 1200 atgctgacca cacctgtgaa atccccactg agcaatgccc ctgccgaggc cggaagctct 1260 tgtatcattc ccgaggctca ggatagcgag gctggccaaa aaggcgaagc tgcaggcgct 1320 tctgctctgg gccctagctc tagctctttt agcaccggca ccagcgtggt gtctggcaca 1380 ccaggacctc tgagaagcgc cagacctacc tctagagccc tgcctcagtt tagcgtgtcc 1440 cctagtgtgc ctggcagaag ccctacactg tctagtacag ccggcgctac acacaccagc 1500 ggactggaaa cagaccaaga acagcatggc agcagcaccc tgccttctct ggctgccctt 1560 gattctagca gcgaactgcc aggcggcgac cccaatagac ctatcgctag acctagcctg 1620 acacagctgg cccaagagag caatgagggc ccttctgagc ctgctcagac cgaacaggtg 1680 ccaatgcctt acagccccga gaaagagcgg tgcagcaact accctatcag ccatgccgct 1740 gctcccacac ctcctggtcc aagagaagct cctctgagcc ctcctgagct gcccgatcct 1800 ccaagagata gcaccagacc tcagtactcc cagtacgtgt ccgccgtgga agatgccctg 1860 gatgtgctgg aatgtggcag actggccgcc atcttctacg aagtgtgggg ccctagaagg 1920 cagctgacca actttctgca ctggctgacc gacagaaacg gcagcctgac atgtaccgcc 1980 agactgagag atcaggaccg ggccacactg tgccctctgt atcctctgat cgaggtggtg 2040 gacgtgaact gcttcaacag cttcaaccgg tgcatctaca agtacaccaa ggacgaggct 2100 ttccctatgc acagcgacga acaccaccat gatgacagcc tgcctcatcc tcagcaggcc 2160 accgacgata gcagcaacca gagcgacagc aacagcaacg agggcagaca tctgctgctg 2220 gtgtctggtg ctggcgacgg acctcctctg tgttctcaaa atcttggcgc ccctggcggc 2280 ggaccaaaca atggacctca ggaccccgac aacaccgacg acaatggccc tcaagatcct 2340 gataataccg atgacaacgg cccacacgac cctctgcctc aagacccaga taacacagac 2400 gataacggtc cacaagatcc ggacaatact gacgataatg gaccccacga tccactgcct 2460 cacaacccta gcgatagcgc cggaaatgat ggcggacctc cacagctgac cgaggaagtg 2520 gaaaacaaag gcggagatca gggccctcct ctgatgaccg atggcggagg tggacactct 2580 cacgattctg gccacgacgg catcgaccct catctgccta cactgctgct cggcacatct 2640 ggctctggcg gcgacgatga tgatcctcat ggacctgtgc agctgagcta ctacgac 2697 <210> 24 <211> 899 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Fusion of LMP1 of Epstein Barr virus and IPS1 of Homo sapiens <400> 24 Met Asp Leu Asp Leu Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Arg Arg Pro Pro 1 5 10 15 Arg Gly Pro Pro Leu Ser Ser Ser Ile Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu 20 25 30 Leu Leu Ala Leu Leu Phe Trp Leu Tyr Ile Ile Met Ser Asn Trp Thr 35 40 45 Gly Gly Ala Leu Leu Val Leu Tyr Ala Phe Ala Leu Met Leu Val Ile 50 55 60 Ile Ile Leu Ile Ile Phe Ile Phe Arg Arg Asp Leu Leu Cys Pro Leu 65 70 75 80 Gly Ala Leu Cys Leu Leu Leu Leu Met Ile Thr Leu Leu Leu Ile Ala 85 90 95 Leu Trp Asn Leu His Gly Gln Ala Leu Tyr Leu Gly Ile Val Leu Phe 100 105 110 Ile Phe Gly Cys Leu Leu Val Leu Gly Leu Trp Ile Tyr Leu Leu Glu 115 120 125 Ile Leu Trp Arg Leu Gly Ala Thr Ile Trp Gln Leu Leu Ala Phe Phe 130 135 140 Leu Ala Phe Phe Leu Asp Ile Ile Leu Leu Ile Ile Ala Leu Tyr Leu 145 150 155 160 Gln Gln Asn Trp Trp Thr Leu Leu Val Asp Leu Leu Trp Leu Leu Leu 165 170 175 Phe Leu Ala Ile Leu Ile Trp Met Tyr Tyr His Gly Gln Arg Pro Ser 180 185 190 Pro Arg His Cys Pro Val Glu Arg Glu Gln Phe Lys Arg Asp Ala Gln 195 200 205 Pro Arg Pro Gly Gly Asp Pro Asp Ala Pro Pro Gly Pro Asn Gly Glu 210 215 220 Leu Leu Gln Ile Ser Pro Asn Glu Ala Val His Ile Gly Phe Thr Gly 225 230 235 240 Glu Ser Lys Tyr Glu Asn Glu Glu Pro Gly His Cys Pro Gly Met Gly 245 250 255 Leu Ser Thr Ser Ala Ser Ile Ala Leu Asp Glu Phe Cys Gly Ser Phe 260 265 270 Pro Ser Asp Val Gln Ser Ala Leu Val Gly Pro Lys Ser Leu Glu Ser 275 280 285 Gly Leu Gly Arg Asn Glu Ser Ser Ser Asp Leu Trp Ala Ser Ser Gly 290 295 300 Gly Thr Ala Gly Ala Pro Thr Pro Ala Ala Pro Thr Glu Glu Asn Arg 305 310 315 320 Ser Ser Gly Asp Thr Pro Val Thr Ser Ala Ser Val Lys Thr Leu Val 325 330 335 Met Ser Thr Pro Val Lys Ser Pro Val Met Gly Ala Arg Thr Ser Asn 340 345 350 Ile Pro Leu Lys Ser Pro Ala Pro Asn Thr Leu Ala Asn Ser Pro Val 355 360 365 Ala Gly Pro Pro Lys Ser Ser Thr Pro Leu Lys Ser Pro Val Thr Ser 370 375 380 Val Ser Ala Pro Asn Ala Pro Val Lys Leu Ala Val Thr Asn Val Pro 385 390 395 400 Met Leu Thr Thr Pro Val Lys Ser Pro Leu Ser Asn Ala Pro Ala Glu 405 410 415 Ala Gly Ser Ser Cys Ile Ile Pro Glu Ala Gln Asp Ser Glu Ala Gly 420 425 430 Gln Lys Gly Glu Ala Ala Gly Ala Ser Ala Leu Gly Pro Ser Ser Ser 435 440 445 Ser Phe Ser Thr Gly Thr Ser Val Val Ser Gly Thr Pro Gly Pro Leu 450 455 460 Arg Ser Ala Arg Pro Thr Ser Arg Ala Leu Pro Gln Phe Ser Val Ser 465 470 475 480 Pro Ser Val Pro Gly Arg Ser Pro Thr Leu Ser Ser Thr Ala Gly Ala 485 490 495 Thr His Thr Ser Gly Leu Glu Thr Asp Gln Glu Gln His Gly Ser Ser 500 505 510 Thr Leu Pro Ser Leu Ala Ala Leu Asp Ser Ser Ser Glu Leu Pro Gly 515 520 525 Gly Asp Pro Asn Arg Pro Ile Ala Arg Pro Ser Leu Thr Gln Leu Ala 530 535 540 Gln Glu Ser Asn Glu Gly Pro Ser Glu Pro Ala Gln Thr Glu Gln Val 545 550 555 560 Pro Met Pro Tyr Ser Pro Glu Lys Glu Arg Cys Ser Asn Tyr Pro Ile 565 570 575 Ser His Ala Ala Ala Pro Thr Pro Pro Gly Pro Arg Glu Ala Pro Leu 580 585 590 Ser Pro Pro Glu Leu Pro Asp Pro Pro Arg Asp Ser Thr Arg Pro Gln 595 600 605 Tyr Ser Gln Tyr Val Ser Ala Val Glu Asp Ala Leu Asp Val Leu Glu 610 615 620 Cys Gly Arg Leu Ala Ala Ile Phe Tyr Glu Val Trp Gly Pro Arg Arg 625 630 635 640 Gln Leu Thr Asn Phe Leu His Trp Leu Thr Asp Arg Asn Gly Ser Leu 645 650 655 Thr Cys Thr Ala Arg Leu Arg Asp Gln Asp Arg Ala Thr Leu Cys Pro 660 665 670 Leu Tyr Pro Leu Ile Glu Val Val Asp Val Asn Cys Phe Asn Ser Phe 675 680 685 Asn Arg Cys Ile Tyr Lys Tyr Thr Lys Asp Glu Ala Phe Pro Met His 690 695 700 Ser Asp Glu His His His Asp Asp Ser Leu Pro His Pro Gln Gln Ala 705 710 715 720 Thr Asp Asp Ser Ser Asn Gln Ser Asp Ser Asn Ser Asn Glu Gly Arg 725 730 735 His Leu Leu Leu Val Ser Gly Ala Gly Asp Gly Pro Pro Leu Cys Ser 740 745 750 Gln Asn Leu Gly Ala Pro Gly Gly Gly Pro Asn Asn Gly Pro Gln Asp 755 760 765 Pro Asp Asn Thr Asp Asp Asn Gly Pro Gln Asp Pro Asp Asn Thr Asp 770 775 780 Asp Asn Gly Pro His Asp Pro Leu Pro Gln Asp Pro Asp Asn Thr Asp 785 790 795 800 Asp Asn Gly Pro Gln Asp Pro Asp Asn Thr Asp Asp Asn Gly Pro His 805 810 815 Asp Pro Leu Pro His Asn Pro Ser Asp Ser Ala Gly Asn Asp Gly Gly 820 825 830 Pro Pro Gln Leu Thr Glu Glu Val Glu Asn Lys Gly Gly Asp Gln Gly 835 840 845 Pro Pro Leu Met Thr Asp Gly Gly Gly Gly His Ser His Asp Ser Gly 850 855 860 His Asp Gly Ile Asp Pro His Leu Pro Thr Leu Leu Leu Gly Thr Ser 865 870 875 880 Gly Ser Gly Gly Asp Asp Asp Asp Pro His Gly Pro Val Gln Leu Ser 885 890 895 Tyr Tyr Asp

Claims (16)

  1. 항원 또는 항원 에피토프를 코딩하는 제1 핵산 서열, 엡스타인 바르(Epstein Barr) 바이러스의 전장 잠재성 막 단백질 1(LMP1)을 코딩하는 제2 핵산 서열 및 세포질내 도메인이 STING 경로를 활성화할 수 있는 인간 IPS1 또는 이의 변이체로 대체된 LMP1의 막관통(transmembrane) 부분을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 제3 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터로서, 상기 벡터의 코딩된 서열이 인간 발현을 위해 코돈 최적화되어 있고 상기 제2 핵산 서열과 제3 핵산 서열이 임의의 순서로 제1 핵산 서열을 뒤따르는 바이러스 벡터.
  2. 항원 또는 항원 에피토프를 코딩하는 제1 핵산 서열, STING 경로를 활성화할 수 있는 인간 IPS1 또는 이의 변이체의 세포질내 도메인과 융합된 엡스타인 바르 바이러스의 전장 잠재성 막 단백질 1(LMP1)을 코딩하는 제2 핵산 서열 또는 LMP1의 세포질내 도메인과 융합된, STING 경로를 활성화할 수 있는 인간 IPS1 또는 이의 변이체에 융합된 LMP1의 막관통 부분을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터로서, 상기 벡터의 코딩된 서열이 인간 발현을 위해 코돈 최적화되어 있는 바이러스 벡터.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 벡터가 렌티바이러스 벡터인, 바이러스 벡터.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제1 핵산 서열이 2종 이상의 항원 또는 2종 이상의 항원 에피토프를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는, 바이러스 벡터.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제1 핵산 서열이 2개 이상의 항원 또는 2개 이상의 항원 에피토프를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는, 바이러스 벡터.
  6. 제2 항에있어서, 상기 제2 핵산 서열이, 막관통 도메인이 결여된 인간 IPS1의 변이체에 융합된 LMP1의 막관통 부분을 코딩하는, 바이러스 벡터.
  7. 제6항에 있어서, 상기 제2 핵산 서열이 막관통 도메인이 결여되었고 프롤린-풍부 도메인이 결여된 인간 IPS1의 변이체에 융합된 LMP1의 막관통 부분을 코딩하는, 바이러스 벡터.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1항 또는 제2항의 제2 핵산 서열 또는 제1항의 제3 핵산 서열이 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21 및 서열번호 23으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는, 바이러스 벡터.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 벡터가 가용성 면역 체크포인트 억제제 분자 또는 가용성 면역 조절제 분자를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는, 바이러스 벡터.
  10. 제9항에 있어서, 상기 가용성 면역 체크포인트 억제제 분자 또는 가용성 면역 조절제 분자가 CTLA-4, PD-1, PDL-1, LAG-3, TIM 3, B7-H3, ICOS, IDO, 4-1BB, CD47, B7-H4, OX-40, TIGIT, CD160 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 바이러스 벡터.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 벡터가 기능적 렌티바이러스 인테그라제 단백질을 추가로 포함하고, 상기 벡터가 자가-불활성화되는, 바이러스 벡터.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항원이 NY-ESO-1, 메소텔린, PSA, MART-1, MART-2, Gp100, 티로시나제, p53, ras, MUC1, SAP-1, 서바이빈(survivin), CEA, Ep-CAM, Her2, BRCA1/2, gag, 역전사 효소, tat, 포자소체 단백질(circumsporozoite protein), HCV 비구조 단백질, 헤마글루티닌 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 바이러스 벡터.
  13. 제1항 또는 제2항의 바이러스 벡터를 포함하는, 대상체에서 암 또는 감염을 예방 또는 치료하기 위한 면역치료 제형.
  14. 대상체에서 암 또는 감염성 질환에 대한 면역반응을 유도하거나 향상시키는 방법으로서, 제1항의 바이러스 벡터 또는 제13항의 치료 제형을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 이를 통해 상기 암 또는 감염성 질환에 대한 면역반응이 대상체에서 유도되거나 향상되는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 암에 대한 면역반응이 유도되거나 향상되고, 상기 암이 흑색종, 신경교종, 전립선암, 유방암, 자궁경부암, 대장암, 신장암, 폐암, 림프종 및 췌장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  16. 제14항에 있어서, 감염성 질환에 대한 면역반응이 유도되거나 향상되고, 상기 감염성 질환이 HIV/AIDS, C형 간염, HPV, 폐렴, 인플루엔자, 말라리아, 리슈마니아증, 결핵, 한센병, 광견병, 뎅기열, 지카, 에볼라 및 주혈흡충증으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
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