KR20190118835A - 증폭된 이중 가닥 dna 검출방법 및 이를 이용한 장치 - Google Patents

증폭된 이중 가닥 dna 검출방법 및 이를 이용한 장치 Download PDF

Info

Publication number
KR20190118835A
KR20190118835A KR1020180042230A KR20180042230A KR20190118835A KR 20190118835 A KR20190118835 A KR 20190118835A KR 1020180042230 A KR1020180042230 A KR 1020180042230A KR 20180042230 A KR20180042230 A KR 20180042230A KR 20190118835 A KR20190118835 A KR 20190118835A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
dna
stranded dna
electrode
double
amplified
Prior art date
Application number
KR1020180042230A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102062980B1 (ko
Inventor
양해식
팡취산
Original Assignee
부산대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 부산대학교 산학협력단 filed Critical 부산대학교 산학협력단
Priority to KR1020180042230A priority Critical patent/KR102062980B1/ko
Publication of KR20190118835A publication Critical patent/KR20190118835A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102062980B1 publication Critical patent/KR102062980B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
    • G01N27/3277—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction being a redox reaction, e.g. detection by cyclic voltammetry
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
    • C12Q2527/101—Temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/113—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties the label being electroactive, e.g. redox labels
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/50—Detection characterised by immobilisation to a surface
    • C12Q2565/537—Detection characterised by immobilisation to a surface characterised by the capture oligonucleotide acting as a primer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/60—Detection means characterised by use of a special device
    • C12Q2565/607—Detection means characterised by use of a special device being a sensor, e.g. electrode

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 DNA 검출 방법으로, 상기 DNA 검출 방법은, 이중 가닥 DNA를 등온 증폭하는 단계 및 증폭된 이중 가닥 DNA를 검출하는 단계가 하나의 챔버(Chamber)내에서 동시 또는 순차적으로 이루어지고, 상기 이중 가닥 DNA를 등온 증폭하는 단계는, 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머에 의한 증폭 반응으로, 상기 포워드 프라이머의 말단은 전극에 도포된 포워드 프라이머 결합층에 친화적인 물질로 표지되어 있고, 상기 증폭된 이중 가닥 DNA를 검출하는 단계는, (a) 상기 증폭된 이중 가닥 DNA와 이중 가닥 DNA에 특이적으로 결합하는 단백질의 결합으로 결합물이 생성되는 단계; 및 (b) 상기 결합물에 부착된 산화-환원 표지자와 전자 이동 매개체(electron mediator)의 산화-환원 반응에 의해 전극으로 전자가 이동되고, 전자 이동 매개체의 전자 전달 속도 차에 의해 DNA를 검출하는 단계; 를 포함하되, 상기 검출은, 증폭된 이중 가닥 DNA의 변성(Denaturation) 단계를 별도로 요구하지 않는 것인, DNA 검출 방법 및 이를 이용하는 장치에 대한 것이다.

Description

증폭된 이중 가닥 DNA 검출방법 및 이를 이용한 장치 {Amplified double-stranded DNA detection method and apparatus using the same}
본 발명은 DNA 검출 방법으로, 상기 DNA 검출 방법은, 이중 가닥 DNA를 등온 증폭하는 단계 및 증폭된 이중 가닥 DNA를 검출하는 단계가 하나의 챔버(Chamber)내에서 동시 또는 순차적으로 이루어지고, 상기 이중 가닥 DNA를 등온 증폭하는 단계는, 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머에 의한 증폭 반응으로, 상기 포워드 프라이머의 말단은 전극에 도포된 포워드 프라이머 결합층에 친화적인 물질로 표지되어 있고, 상기 증폭된 이중 가닥 DNA를 검출하는 단계는, 상기 증폭된 이중 가닥 DNA와 이중 가닥 DNA에 특이적으로 결합하는 단백질의 결합으로 결합물이 생성되는 단계; 및 상기 결합물에 부착된 산화-환원 표지자와 전자 이동 매개체(electron mediator)의 산화-환원 반응에 의해 전극으로 전자가 이동되고, 전자 이동 매개체의 전자 전달 속도 차에 의해 DNA를 검출하는 단계; 를 포함하되, 상기 검출은, 증폭된 이중 가닥 DNA의 변성(Denaturation) 단계를 별도로 요구하지 않는 것인, DNA 검출 방법 및 이를 이용한 장치에 관한 것이다.
분자 진단(molecular diagnostics)은 질병 진단이나 병원균 확인을 하는데 중요한 역할을 한다. 이러한 분자 진단을 위해 짧은 시간에 고감도로 선택적인 핵산(nucleic acid)을 검출하는 방법은 종래에 많이 개발되어 왔다. 하지만, 현재까지 개발된 분자 진단 기술은 단순하면서 빠른 검출이 요구되는 현장현시검사(point-of-care testing)에는 적합하지 않다(Craw, P.; Balachandran, W. Lab Chip 2012, 12, 2469). 현장현시검사에 적합하지 않은 이유 중 가장 큰 이유로는, 핵산 증폭(nucleic acid amplification)에 가장 많이 이용되는 중합 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)을 이용하여 검출시, 빠르고 정밀한 온도 조절 순환이 필요하기 때문이다(Li, J.; Macdonald, J. Biosens. Bioelectron. 2015, 64, 196).
최근에는, 전술한 온도 조절의 문제를 극복하기 위해서 등온 증폭(Isothermal amplification)을 분자 진단에 적용하는 시도가 증가하고 있는 추세이다. 대표적인 등온 증폭 방법으로는, 재조합효소 중합효소 증폭(recombinase polymerase amplification, RPA), 루프 매개 증폭(loop-mediated isothermal amplification, LAMP), 헬리카제-종속 증폭(helicase-dependent amplification, HDA) 등이 있다. 또, 현장현시검사용으로 사용되는 검출은, 작은 기기를 이용하여 고감도 측정이 가능해야 하므로, 전기 화학 신호 측정에 의한 것이 적합하다.
물론, 지금까지 등온 증폭과 전기화학 측정이 결합된 방법으로 핵산을 검출하려는 시도는 있었으나, 종래의 검출방법은 핵산의 증폭 반응이 끝난 후 바로 전기화학적 신호의 측정이 이루어지는 것이 아닌, 상당한 반응 시간(incubation period)을 가지고 나서 전기화학 측정이 이루어진다. 게다가, 이러한 시도는 모두 세척(washing)과정 혹은 정제(purification)과정을 필요로 한 것들이었다. 상기 세척 혹은 정제과정은 비특이적으로 전극 표면에 붙어 있는 표지(label)의 제거 및 시료(sample) 속에 존재하는 방해물질(interfering species)의 제거를 위해 필요한 과정이다. 이러한 세척 혹은 정제 과정은 낮은 배경 수준(background level)을 제공하여 검출의 정확도를 높여 줄 수는 있지만, 전체 검출 과정을 복잡하게 하고 전체 검출 시간이 길어지게 하므로 빠르고 단순한 검출을 필요로 하는 현장현시검사용으로는 부적합하다고 볼 수 있다. 게다가, 세척 강도(washing intensity)에 따라 생체 특이적 결합이 영향을 받아서 검출 결과의 재현성이 영향을 받을 수 있다. 즉, 등온 증폭 반응과 전기화학 측정이 결합되고, 빠른 시간에 고감도로 핵산을 검출하는 방법의 개발이 필요하다.
무세척으로 빠르게 생체분자를 검출하기 위해, 전극(electrode)과 산화환원 효소 표지(redox enzyme label) 사이에서 전자를 주고 받는 전자 이동 매개체(electron mediator)의 매개 속도(mediation rate)를 이용하는 방법이 적용될 수 있다. (Dutta, G.; Kim, S.; Park, S.; Yang, H. Anal. Chem. 2014, 86, 4589; Dutta, G.; Park, S.; Singh, A.; Seo, J.; Kim, S.; Yang, H. Anal. Chem. 2015, 87, 3574-3578). 하지만, 이러한 전자 매개 속도를 이용한 방법을 기존의 DNA 혼성화(DNA hybridization)를 이용한 증폭된 이중 가닥 DNA의 검출에는 쉽게 사용할 수가 없다. 기존의 혼성화를 이용한 검출은 이중 가닥 DNA를 단일가닥 DNA로 바꾸는 변성(Denaturation)과정을 필요로 하기 때문이다. 변성(Denaturation) 과정은 고온을 필요로 하므로, 큰 온도 변화가 필요하기 때문에 간단한 검사용으로는 적합하지 않다. 만일 증폭된 이중 가닥 DNA를 변성시켜 단일 가닥 DNA를 형성했더라도, 공급된 상보적 프로브와 결합하는 것이 아닌, 변성 이전의 단일가닥 DNA 간의 친화도가 더 높아 원래의 상보적인 단일가닥 DNA끼리 재결합하기가 쉽다는 문제점이 있다.
본 발명은 이중 가닥 DNA에 특이적으로 결합하는 단백질을 이용하여 하나의 챔버(Chamber)에서 등온 증폭 반응 및 증폭된 DNA 검출이 동시 혹은 순차적으로 가능하게 하는 것을 목적으로 한다. 또, 검출을 위해 증폭된 이중 가닥 DNA의 변성(Denaturation)이 별도로 요구되지 않는 것을 목적으로 한다. 또한, 전극과 산화-환원 표지자 사이의 전자 이동 매개체의 매개 속도 차를 이용한 증폭된 이중 가닥 DNA를 검출하여, 별도의 세척 과정을 요구하지 않는 것을 목적으로 하고 있다.
그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, DNA 검출 방법으로, 상기 DNA 검출 방법은, 이중 가닥 DNA를 등온 증폭하는 단계 및 증폭된 이중 가닥 DNA를 검출하는 단계가 하나의 챔버(Chamber)내에서 동시 또는 순차적으로 이루어지고, 상기 이중 가닥 DNA를 등온 증폭하는 단계는, 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머에 의한 증폭 반응으로, 상기 포워드 프라이머의 말단은 전극에 도포된 포워드 프라이머 결합층에 친화적인 물질로 표지되어 있고, 상기 증폭된 이중 가닥 DNA를 검출하는 단계는, 상기 증폭된 이중 가닥 DNA와 이중 가닥 DNA에 특이적으로 결합하는 단백질의 결합으로 결합물이 생성되는 단계 및 상기 결합물에 부착된 산화-환원 표지자와 전자 이동 매개체(electron mediator)의 산화-환원 반응에 의해 전극으로 전자가 이동되고, 전자 이동 매개체의 전자 전달 속도 차에 의해 DNA를 검출하는 단계를 포함하되, 상기 검출은, 증폭된 이중 가닥 DNA의 변성(Denaturation) 단계를 별도로 요구하지 않는 것인, DNA 검출 방법이 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 이중 가닥 DNA에 특이적으로 결합하는 단백질은, 징크 핑거 단백질(Zinc finger protein)일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 징크 핑거 단백질은 Zif268, TFIIIA, GAGA 및 Ros 로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 등온 증폭 반응은 재조합효소 중합효소 증폭(recombinase polymerase amplification, RPA), 루프 매개 증폭(loop-mediated isothermal amplification, LAMP), 헬리카제-종속 증폭(helicase-dependent amplification, HDA), 회전환 증폭(rolling circle amplification, RCA), 다중치환증폭(multiple displacement amplification, MDA), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification, SDA), 핵산 서열-기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification, NASBA) 중 어느 하나인 것 일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 DNA 검출 방법은, 검출 중에 세척 과정을 요구하지 않는 것일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 산화-환원 표지자는 글루코스 옥시데이즈, 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈, 아스코베이트 옥시데이즈, 호스래디쉬 옥시데이즈, 소이빈 옥시데이즈, 라케이즈, 빌리루빈 옥시데이즈, 타이로시네이즈, 금 나노입자, 은 나노입자, 백금 나노입자, 이리듐 나노입자, 팔라듐 나노입자, 프러시안블루 나노입자 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 전자 이동 매개체는 Ru(NH3)6 3+, Ru(NH3)6 2+, Fe(CN)6 3-, Fe(CN)6 4-, Ru(NH3)5(pyridine)3+, Ru(NH3)5(pyridine)2+, 페로센, 페로센 메탄올, 페로센 카복시산, Os(bpy)2Cl2 3+, Ox(bpy)2Cl2 2+ 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 증폭된 이중 가닥 DNA를 검출하는 단계는, 2종 이상의 전극을 포함하고, 전극 사이의 간섭이 없이 각각의 전극을 통해 동시에 2종 이상의 증폭된 DNA를 검출하는 것일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 전극은 주석산화물(Indium tin oxide, ITO) 전극, 그래핀(grapheme)이 입혀진 주석산화물 전극, 탄소나노튜브(carbon nanotube)가 입혀진 주석산화물 전극, 카본 전극, 금 전극, 은 전극, Ag/AgCl 전극, 백금 전극 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.
일 측에 따르면, 전술한 DNA 검출 방법을 이용하여 증폭된 이중 가닥 DNA를 검출하는 DNA 검출장치일 수 있다.
본 발명에 따르면, 이중 가닥 DNA에 특이적으로 결합하는 단백질을 이용하여 별도의 변성(Denaturation) 단계 없이 증폭된 이중 가닥DNA를 검출할 수 있어 빠르고 간단한 검출이 가능하다. 또, 전기화학적 신호 검출은 하나의 챔버(Chamber) 내에서 등온 증폭 반응 중 또는 후에 일어날 수 있어, 단시간에 증폭된 DNA 검출을 가능하게 한다. 더욱이, 전자 이동 매개체의 매개 속도 차를 이용하므로 별도의 세척과정 없이 증폭된 DNA를 검출 할 수 있어 DNA의 손실을 줄일 수 있다.
도 1은 이중 가닥 DNA에 특이적으로 결합하는 단백질을 이용한 증폭된 이중 가닥 DNA 검출을 개략적으로 도시한 것이다.
도 2는 이중 가닥 DNA에 특이적으로 결합하는 단백질을 이용한 2종의 증폭된 이중 가닥 DNA검출을 개략적으로 도시한 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 징크 핑거 단백질(Zinc finger protein)을 이용한 증폭된 이중 가닥 DNA의 검출을 개략적으로 도시한 것이다.
도 4는 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 Zif268을 이용한 RPA로 증폭된 DNA의 검출을 개략적으로 도시한 것이다.
도 5는 Zif268과 이중 가닥 DNA의 결합을 위한 Zn2+의 전자 이동 매개 영향을 실험한 데이터이다.
도 6은 ITO 변형전극에서 GOx-Zif268 접합체의 비특이적 흡착을 실험한 데이터이다.
도 7은 타깃 DNA의 RPA 증폭 특이성 및 증폭된 타깃 DNA의 검출 선별도를 실험한 데이터이다.
도 8은 피스시리케치아 살모니스의 DNA를 증폭하여 무세척으로 검출한 실험 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 이러한 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 실시예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
실시예에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 발명에서 사용되는 용어는 다음과 같이 정의될 수 있다.
본 발명에서 용어 “변성(Denaturation)”은 이중 가닥 DNA의 상보적인 결합이 끊어져 두 개의 단일 가닥 DNA가 되는 것을 의미한다.
본 발명에서 용어 “변형전극”은 포워드 프라이머와 결합 친화적인 물질을 전극에 도포하여 포워드 프라이머 결합층을 추가한 전극을 의미한다.
본 발명에서 용어 “포워드 프라이머 결합층”은 등온 증폭 반응에 사용되는 포워드 프라이머와 결합하도록 인위적으로 제작된 단층을 의미한다.
이하, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 DNA 검출방법은, 이중 가닥 DNA를 등온 증폭하는 단계 및 증폭된 이중 가닥 DNA를 검출하는 단계가 하나의 챔버(Chamber)내에서 동시 또는 순차적으로 이루어지고, 상기 이중 가닥 DNA를 등온 증폭하는 단계는, 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머에 의한 증폭 반응으로, 상기 포워드 프라이머의 말단은 전극에 도포된 포워드 프라이머 결합층에 친화적인 물질로 표지되어 있고, 상기 증폭된 이중 가닥 DNA를 검출하는 단계는, (a) 상기 증폭된 이중 가닥 DNA와 이중 가닥 DNA에 특이적으로 결합하는 단백질의 결합으로 결합물이 생성되는 단계; 및 (b) 상기 결합물에 부착된 산화-환원 표지자와 전자 이동 매개체(electron mediator)의 산화-환원 반응에 의해 전극으로 전자가 이동되고, 전자 이동 매개체의 전자 전달 속도 차에 의해 DNA를 검출하는 단계; 를 포함하되, 상기 검출은, 증폭된 이중 가닥 DNA의 변성(Denaturation) 단계를 별도로 요구하지 않는 것이다.
이하의 설명 및 도면에서는, 이중 가닥 DNA에 특이적으로 결합하는 단백질을 이중 가닥 DNA 결합 단백질이라고 칭하도록 한다.
이중 가닥 DNA의 등온 증폭이 진행되는 동안, 증폭된 이중 가닥 DNA가 생성될 때마다 상기 증폭된 이중 가닥 DNA의 검출이 가능하므로 증폭 단계 및 검출 단계는 동시에 진행될 수 있다. 또, 최종적으로 등온 증폭이 모두 종료된 후에도, 미처 검출되지 않은 증폭된 이중 가닥 DNA가 검출될 수 있으므로 순차적으로 진행될 수도 있다. 여기서, 이중 가닥 DNA를 등온 증폭하는 단계는, 챔버에 공급되는 리버스 프라이머와 말단이 표지된 포워드 프라이머에 의한 것이다. 또, 증폭된 이중 가닥 DNA를 전극에 인접시켜 전기화학적 신호를 검출하기 위해, 포워드 프라이머의 말단에 표지되는 물질은 작업전극에 도포된 포워드 프라이머 결합층과 친화도가 높은 물질임이 바람직하다. 등온 증폭 반응에 의해 챔버 내에 증폭된 이중 가닥 DNA가 하나 이상 존재하게 되면, 증폭된 이중 가닥 DNA를 검출하는 단계를 수행하게 된다. 증폭된 이중 가닥 DNA는 포워드 프라이머 말단과 포워드 프라이머 결합층과의 결합에 의해 전극에 인접하게 되고, 이중 가닥 결합 단백질과 특이적으로 결합하여 결합물을 생성한다. 이 때, 이중 가닥 DNA 결합 단백질에는 산화-환원 표지자가 부착된 상태로 결합이 진행되어, 결합의 유무에 따라 전극과 산화-환원 표지자의 거리가 달라지게 된다. 증폭된 이중 가닥 DNA와 결합하여 결합물이 생성되는 경우, 전자 이동 매개체는 전극과 인접한 위치에서 산화-환원 표지자에 의해 환원되고, 작업 전극에 전자를 전달하면서 다시 산화가 되는 과정을 단시간에 반복하는 빠른 매개 속도를 가지게 된다. 반면 증폭된 이중 가닥 DNA와 결합하지 않는 경우, 증폭된 이중 가닥 DNA와 결합하지 않은 이중 가닥 DNA 결합 단백질은 전극에 인접하지 않아, 상대적으로 느린 매개 속도를 가지게 된다. 즉, 증폭된 이중 가닥 DNA가 존재하는 경우, 빠른 매개 속도에 의해 전자 전달 속도가 빨라져, 전극에 높은 전기화학적 신호가 검출될 수 있다.
일 측에 따르면, 전자 이동 매개체는, Ru(NH3)6 3+, Ru(NH3)6 2+, Fe(CN)6 3-, Fe(CN)6 4-, Ru(NH3)5(pyridine)3+, Ru(NH3)5(pyridine)2+, 페로센, 페로센 메탄올, 페로센 카복시산, Os(bpy)2Cl2 3+, Ox(bpy)2Cl2 2+ 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.
일 측에 따르면, 산화-환원 표지자는 글루코스 옥시데이즈, 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈, 아스코베이트 옥시데이즈, 호스래디쉬 옥시데이즈, 소이빈 옥시데이즈, 라케이즈, 빌리루빈 옥시데이즈, 타이로시네이즈, 금 나노입자, 은 나노입자, 백금 나노입자, 이리듐 나노입자, 팔라듐 나노입자, 프러시안블루 나노입자 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.
일 측에 따르면, 이중 가닥 DNA결합 단백질은 징크 핑거 단백질(Zinc finger protein)일 수 있다. 징크 핑거 단백질은 높은 친화도로 이중 가닥 DNA 또는 RNA-DNA 하이브리드에 결합할 수 있어 이중 가닥 DNA를 검출하는데 용이하게 사용된다. 본 발명에 사용하는 징크 핑거 단백질은 구아닌(Guanine)이 상대적으로 많이 존재해 단일 가닥 DNA에는 잘 결합하지 않으며, 이중 가닥 DNA에는 강하게 결합하는 특성인 Cys2His2-type의 징크 핑거 단백질임이 적합하다. Cys2His2-type의 징크 핑거 단백질은 다양한 단백질-DNA 및 단백질-단백질의 결합을 중재한다. 또, Cys2His2-type의 징크 핑거 도메인(Domain)은 크기가 작고, 자가 접힘(self-folding) 단백질 구조로, 일반적으로 시스테인(cysteine) 또는 히스티딘(histidine) 아미노산 사이에 보존되어 있는 징크(zinc) 이온의 결합을 조정한다. 이러한 모티프(motif)로 인해 ββα 구조를 형성할 수 있으며, 징크 이온(Zn2+)과의 결합으로 안정성을 추가로 얻을 수도 있다.
일 측에 따르면, 본 발명의 징크 핑거 단백질은 Zif268, TFIIIA, GAGA 및 Ros로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
일 측에 따르면, 등온 증폭 반응은 재조합효소 중합효소 증폭(recombinase polymerase amplification, RPA), 루프 매개 증폭(loop-mediated isothermal amplification, LAMP), 헬리카제-종속 증폭(helicase-dependent amplification, HDA), 회전환 증폭(rolling circle amplification, RCA), 다중치환증폭(multiple displacement amplification, MDA), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification, SDA), 핵산 서열-기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification, NASBA) 중 어느 하나인 것일 수 있다. 타깃으로 하는 DNA의 종류 및 프라이머에 따라 열거된 등온 증폭 반응 중 적합한 어느 하나의 등온 증폭 방법을 선택적으로 사용할 수 있으며, 후술하는 실시예에서는 RPA로 타깃 DNA를 등온 증폭하여 실험한 내용을 설명하고 있다.
등온 증폭 반응과 동시 또는 순차적으로 진행되는 증폭된 이중 가닥 DNA를 검출하는 단계는 전술한 포워드 프라이머 말단 표지와 포워드 프라이머 결합층 간에 존재하는 높은 친화도로 인해 증폭된 이중 가닥 DNA가 전극에 인접함으로써 가능하게 된다. 이 때, 챔버 내의 전극은 주석산화물(Indium tin oxide, ITO) 전극, 그래핀(grapheme)이 입혀진 주석산화물 전극, 탄소나노튜브(carbon nanotube)가 입혀진 주석산화물 전극, 카본 전극, 금 전극, 은 전극, Ag/AgCl 전극, 백금 전극 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것일 수 있다. 또, 열거한 전극 중 2종 이상을 선택하고, 전극 사이의 간섭이 없이 각각의 전극을 통해 동시에 2종 이상의 증폭된 DNA를 검출 할 수도 있다. 산화-환원 표지자가 하나의 전극에 결합하여 매개 속도가 빨라지더라도 이웃하는 전극의 전류에는 거의 영향이 없기 때문에 간섭이 없이 동시 검출이 가능하게 된다. 이 경우, 챔버 내에는 선택된 2종 이상의 전극이 하나의 기판에 패턴되고, 각각의 전극에 도포되는 포워드 프라이머 결합층은 서로 다른 물질임이 바람직하다. 전자 이동 매개체에 의한 매개 속도 차를 이용하여 2종의 서로 다른 증폭된 이중 가닥 DNA를 검출하는 방법에 대해서는 도 2에서 후술하도록 한다.
일 측에 따르면, DNA 검출장치는 앞서 설명된 DNA 검출방법을 이용한 것일 수 있다. 이 경우, DNA 검출장치는 전술한 내용에 따라 적합한 물질로 구성되는 것이 바람직하다.
도 1에서는 이중 가닥 DNA에 특이적으로 결합하는 단백질을 이용한 증폭된 이중 가닥 DNA의 검출을 개략적으로 도시하고 있다.
도 1은 산화-환원 표지자가 연결된 이중 가닥 DNA 결합 단백질, 리버스 프라이머, 포워드 프라이머, 전자 이동 매개체(electron mediator), 기질 및 주형 DNA가 공급된 등온 증폭 챔버에서 전자 이동 매개체에 의해 포워드 프라이머 결합층이 도포된 전극으로 전자를 전달하는 과정이 개략적으로 도시되어 있다. 공급된 주형 DNA는 리버스 프라이머 및 포워드 프라이머에 의해 증폭 반응이 수행되고, 증폭된 이중 가닥 DNA는 상기 산화-환원 표지자가 연결된 이중 가닥 DNA 결합 단백질과 특이적으로 결합한다. 이러한 특이적인 결합은, 별도의 변성(Denaturation) 단계를 필요로 하지 않아 하나의 챔버에서 등온 증폭 반응과 신호 검출이 동시에 일어날 수 있게 한다. 또, 포워드 프라이머는 상기 포워드 프라이머 결합층과 친화도가 높은 물질로 말단이 표지 되어, 증폭된 이중 가닥 DNA와 결합하는 산화-환원 표지자가 연결된 이중 가닥 DNA 결합 단백질을 전극 가까이에 고정하는 역할을 수행한다. 여기서, 산화-환원 표지자는 기질을 산화시켜 전자를 획득하고, 획득된 전자를 이용하여 전자 이동 매개체를 환원시킨다. 환원된 전자 이동 매개체가 전극에 전자를 전달하면서 재산화되는 과정을 반복하고 이로 인해 전기화학적 신호가 생성된다. 이 때, 증폭된 이중 가닥 DNA와의 결합 유무에 따라, 전극과 산화-환원 표지자 사이의 거리가 달라지면서 전극과 산화-환원 표지자 사이에서 전자를 주고 받는 전자 이동 매개체의 매개 속도가 달라지게 된다. 증폭된 이중 가닥 DNA와 특이적으로 결합하는 이중 가닥 DNA 결합 단백질에 표지된 산화-환원 표지자는 전극 근처에 존재하게 되어 상대적으로 큰 매개 속도를 보이고, 증폭된 이중 가닥 DNA와 결합하지 않은 이중 가닥 DNA 결합 단백질에 표지된 산화-환원 표지자는 전극에서 멀리 떨어져 있게 되어 상대적으로 작은 매개 속도를 보인다. 이러한 속도차이를 이용하여 원하는 타깃 DNA의 증폭산물을 선별할 수 있어, 무세척으로 빠르게 증폭된 DNA를 검출할 수 있다.
도 2는 이중 가닥 DNA에 특이적으로 결합하는 단백질을 이용한 2종의 증폭된 이중 가닥 DNA검출을 개략적으로 도시한 것이다.
도 2는 하나의 기판에 2 개의 전극이 포함되어 있고, 제1전극에는 제1포워드 프라이머 결합층이, 제2전극에는 제2포워드 프라이머 결합층이 도포된 등온 증폭 챔버가 도시되어 있다. 상기 챔버에는 산화-환원 표지자가 연결된 이중 가닥 DNA 결합 단백질, 제1타깃 DNA주형, 제2타깃 DNA주형, 제1리버스 프라이머, 제2리버스 프라이머, 제1포워드 프라이머, 제2포워드 프라이머, 전자 이동 매개체 및 기질이 공급된다. 여기서, 제1리버스 프라이머 및 제1포워드 프라이머에 의해 제1타깃 DNA 주형이 등온 증폭되고, 제2리버스 프라이머 및 제2포워드 프라이머에 의해 제2타깃 DNA 주형이 등온 증폭된다. 이 때, 제1포워드 프라이머의 말단은 제1전극에 도포된 제1포워드 프라이머 결합층과 친화도가 높은 물질로 표지되고, 제2포워드 프라이머의 말단은 제2전극에 도포된 제2포워드 프라이머 결합층과 친화도가 높은 물질로 표지된다. 여기서, 전자 이동 매개체에 의한 전자 이동 매개 속도 차를 이용한 전기화학적 신호를 검출하는 과정은 도1에서 전술한 바와 동일하다. 다만, 매개 속도 차를 이용한 신호 검출 시, 두 전극간의 간섭을 최소화 하기 위해 제1포워드 프라이머의 말단 표지 및 제1포워드 프라이머 결합층의 물질은 제2포워드 프라이머 말단 표지 및 제2포워드 프라이머 결합층의 물질과 서로 상이한 것이어야 한다. 더 바람직하게는, 제1포워드 프라이머의 말단 표지와 제2포워드 프라이머 결합층 간의 친화도 및 제2포워드 프라이머의 말단 표지와 제1포워드 프라이머 결합층 간의 친화도는 낮을수록 좋다. 전술한 내용에 따라, 하나의 챔버에서 2종 이상의 증폭된 DNA를 검출할 수도 있다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 징크 핑거 단백질(Zinc finger protein)을 이용한 증폭된 이중 가닥 DNA의 검출을 개략적으로 도시한 것이다.
도 3은 이중 가닥 DNA 결합 단백질로 징크 핑거 단백질(Zinc finger protein)을 사용한 차이만 있을 뿐, 도1과 동일한 구성을 포함하고 있다. 여기서 사용되는 징크 핑거 단백질은 Zif268, TFIIIA, GAGA 및 Ros 로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상 일 수 있다. 그러나, 그 종류는 앞서 열거한 내용에 반드시 한정되지는 않는다.
다음은 본 발명의 일 실시예에 따른 증폭된 이중 가닥 DNA 검출방법을 도면을 첨부하여 설명한 것이다.
실시예. 글루코스 옥시데이즈(GOx), 페로센메탄올 및 Zif268을 이용한 RPA로 증폭된 이중 가닥 DNA의 검출 및 특성 평가
도 4는 Zif268를 이용한 RPA로 등온 증폭된 이중 가닥 DNA의 검출을 개략적으로 도시한 것이다.
도 4 에서는, 증폭된 이중 가닥 DNA를 검출하기 위해 타깃 DNA는 피스시리케치아 살모니스의 DNA, 이중 가닥 DNA 결합 단백질로는 Zif268, 산화-환원 표지자로는 글루코스 옥시데이즈(GOx), 기질로는 글루코스(Glucose), 전자 이동 매개체로는 페로센메탄올을 사용하였다. 포워드 프라이머의 말단에 표지된 물질로는 바이오틴(Biotin)을, 전극에 도포되는 포워드 프라이머 결합층은 바이오틴(Biotin)과 친화도가 높은 아비딘 유사체인 뉴트라비딘(neutravidin) 을 사용하였다.
도 4에서 도시한 바에 따른 증폭된 DNA 검출 방법은 다음과 같다. 이중 가닥 DNA 결합 단백질인 징크 핑거 단백질Zif268에는 글루코스 옥시데이즈(GOx)가 산화-환원 표지자로 연결되고, 리버스 프라이머와 포워드 프라이머에 의해 타깃 DNA 주형이 등온 증폭된다. 여기서, 포워드 프라이머는 아비딘(avidin)과 결합 친화적인 바이오틴(biotin)이 말단에 표지되어 있다.
이후, 설명하는 실험에서 사용되는 물질의 염기서열은 하기의 표 1과 같다.
물질 염기 서열 길이
포워드
프라이머
5'- biotin-CGACAACGGCGACAGTATTAGCACAAGCAATTATTC -3'
36 mer
리버스
프라이머
5'- CTGTGCACGGTGTAGATAAGTCTTTTAATGCAG -3'
33 mer

피스시리케치아
살모니스		 5'- CGACAACGGCGACAGTATTAGCACAAGCAATTATTCAAGAAGGCGTGAAGTCTGTTG
CTGCCGGCATGAACCCAATGGACCTAAAACGCGGCATCGATAAAGCCACTATCGCTG
CAGTTGCTGCATTAAAAGACTTATCTACACCGTGCACAG -3'
153 bp

비특이적
프라이머
5'-biotin-ATG AGT ATA AAT AGT AGA AGT TGT GCT AGA GAT AAA AG-3'
38 mer

랜덤 시퀀스
5'-agaatagctaagatccatagatcagaaatctgtgaacgtaggaaaatctgtgaa
cgtaggaaaagaatagctaagatccatagatcagaatgtgtcctgtcc-3'
102 bp
작업 전극으로는 주석 산화물 전극인 ITO를 사용하고, 상기 전극에는 포워드 프라이머 결합층으로 아비딘 유사체인 뉴트라비딘(neutravidin)이 도포된다. 상기 뉴트라비딘(neutravidin)은 포워드 프라이머의 말단에 표지된 바이오틴(Biotin)과 친화도가 높아 증폭된 이중 가닥 DNA가 전극 가까이 위치하도록 한다. 따라서, 증폭된 이중 가닥 DNA와 특이적으로 결합하는 Zif268과 이에 표지된 글루코스 옥시데이즈(GOx) 역시 전극 가까이에 위치하게 된다. 기질인 글루코스는 글루코스 옥시데이즈(GOx)에 의해 글루콘산으로 산화되면서 글루코스 옥시데이즈(GOx)에 전자를 전달하고, 산화된 페로센메탄올은 글루코스 옥시데이즈(GOx)에 의해 전자를 얻고 환원된 형태가 된다. 이후, 환원된 페로센메탄올은 전극에 전자를 전달하고 다시 산화된 형태가 되는 방식으로 산화-환원 과정을 반복하게 된다. 이러한 과정의 반복으로 전극에는 높은 전기화학적 신호가 발생하게 되고, 전극으로부터 멀리 떨어진 GOx-Zif268 접합체로부터 전자를 전달하는 전자 이동 매개체의 매개 속도는 현저히 느려져 매우 낮은 수준의 신호가 발생하게 된다. 이러한 매개 속도의 차이로 원하는 증폭된 DNA를 검출할 수 있다. 위와 같은 원리로 증폭된 DNA를 검출하는 실험은 하기와 같이 진행되었다.
1. Zif268의 발현 및 정제
Zif268을 박테리아 발현 벡터 Pmal-c2X에 클로닝하고, N말단 말토오즈 결합 단백질(maltose binding protein, MBP)을 정제 태그로 사용하여 발현하였다. 대장균 BL21(Invitrogen)에서 발현된 Zif268은 종래에 보고된 내용대로 정제하였다.
2. 글루코스 옥시데이즈(GOx)-Zif268 접합체 준비
글루코스 옥시데이즈(GOx)- Zif268 접합체 역시 종래에 보고된 절차에 따라 제조되었다.
먼저, 접합하는 동안 Zif268 구조를 유지하기 위해 Zn2+가 함유된 HEPES 완충액을 사용하였다. 100 μg / mL Zif268 및 HEPES 완충액 (1 mg / mL 설포-SMCC(sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-carboxylate)포함) 50 μL를 함유 한 HEPES 1 mL를 혼합하고 22 ± 2 ° C에서 30 분 동안 배양했다. Zif268에 접합한 설포-SMCC 을 13500g에서 20 분 동안 10K 원심 분리 필터로 여과하여 남는 설포-SMCC를 제거하고, 여과 액을 1 mL의 HEPES 완충액에 용해시켰다.
이후, 280 ㎍ / mL 글루코스 옥시데이즈(GOx)를 함유하는 1 ㎖의 HEPES 완충액과 2 ㎎ / ㎖ SATP를 함유하는 10 ㎕의 HEPES 완충액을 혼합하고, 혼합물을 22 ± 2 ℃에서 30 분 동안 배양 하였다. 그 결과액을 0.012 g / mL 의 EDTA와 0.044 g / mL 의 하이드록실 아민 염산염을 함유한 탈 아세틸화 용액(HEPES 완충액) 20 μL와 22 ± 2 ℃에서 2 시간 혼합 한 후, 30 K 원심 분리 필터로 여과 하였다. 과량의 탈 아세틸 용액을 제거하기 위해 13500g에서 20 분간 여과한다. 남은 여과액은 1 mL의 HEPES 완충액에 용해시켰다.
Zif268와 설포-SMCC의 접합체 함유용액과 SATP-GOx결합체가 포함용액을 22 ± 2 ℃에서 2 시간 동안 1 : 1의 몰비로 혼합 하였다. 혼합용액 중 GOx-Zif268을 여과하기 위해, 최종 혼합물을 13500 g에서 20 분 동안 30 K 원심 분리 필터로 여과시켰다. 마지막으로, 남은 용액을 TZ 완충액 1 mL에 용해시키고 -20 ℃에서 분취액으로 보관했다.
3. 감지전극 준비
ITO 전극 (1 × 2 cm)을 H2O, H2O2 (30 %) 및 NH4OH (30 %)의 혼합 용액에 5 : 1 : 1의 체적비로 70 ℃에서 1 시간 동안 침지하여 전처리 하였다. 뉴트라비딘(neutravidin-), 스트렙타비딘(streptavidin-) 및 아비딘(avidin-) 변형 된 ITO 전극을 얻기 위해, 10 μg / mL의 뉴트라비딘(neutravidin), 스트렙타비딘(streptavidin) 및 아비딘(avidin)을 각각 함유하는 70 μL의 탄산염 완충액 (50 mM, pH 9.6)을 전처리 된 ITO 전극 상에 20 ℃에서 2 시간 동안 배양 하였다. 전극을 blocking buffer 70 μL로 20 ℃에서 30 분간 차단 한 후, 사용하기 전에 4 ℃에서 냉장고에 보관 하였다.
4. 무세척 DNA 검출을 위한 준비
전기화학셀은 ITO 감지전극, Ag / AgCl (3M NaCl) 기준전극 및 백금 카운터 전극으로 조립되었다. 각 ITO 전극의 노출된 영역은 약 0.28 cm2였다. 동결 건조된 RPA 펠릿을 초순수 증류수에 용해시킨 후 3K 원심 분리 필터를 사용하여 DTT(전기 활성 간섭종)를 제거하였다. 남은 여과액을 사용하기 전에 펠렛당 29.5 μL의 재수화 완충액에 현탁시켰다.
RPA로 증폭된 이중 가닥 DNA를 세척과정 없이 검출하기 위해 1 mM 페로센 메탄올을 함유한 TZ 완충액 100 μL, 50 mM 글루코스 함유 TZ 완충액 100 μL, TZ 완충액 740 ㎕, 2.4 μL의 10 μM 비오틴 종결 순방향 프라이머로 이루어진 47.5 μL의 혼합용액을 미세 다공성 튜브에 넣고, 10 μM 리버스 프라이머 2.4 μL, DNA 주형의 다른 사본 번호(Copy number)를 포함하는 13.2 μL의 초순수 증류수 용해액, 29.5 μL 의 여과액을 함유하는 재수화 완충액 및 2.5 μL의 Mg (CH3COO) 2 용액을 첨가하여 RPA 반응을 개시 하였다. 이 때, 사본 번호(copy number)는 하기의 수식 1과 같이 계산되었다.
[수식 1]
Figure pat00001
이후, 혼합물을 볼텍싱 (vortexing)하여 혼합하고 37 ℃에서 배양 하였다
배양된 샘플 용액은 곧 다시 5 분 동안 볼텍싱(vortexing)한 다음 1 ㎖의 최종 부피로 10 ㎍ / ㎖의 GOx-Zif268 접합체 10 μL와 함께 조립된 전기 화학 셀에 주입 하였다. GOx-Zif268접합체, 페로센 메탄올, 글루코스, 바이오틴 - 말단 포워드 프라이머 및 역방향 프라이머의 생성 된 농도는 각각 0.1 μg / mL, 0.1 mM, 5 mM, 24 nM 및 24 nM이었다. 1 mL부피로 채운 셀을 전기 화학적 측정 전에 37 ℃에서 10 분간 추가 배양 하였다(CH Instruments, Austin, TX, USA).
5. RPA로 등온 증폭된 이중 가닥 DNA의 겔 전기 영동 확인
RPA 반응은 2.4μL의 바이오틴 말단 포워드 프라이머, 2.4μL의 리버스 프라이머, 13.2μL의 0.1ng / μL DNA(Piscirickettsia Salmonis의 주형 DNA 또는 비특이적 랜덤 서열 DNA) 및 29.5μL의 재수화 완충액으로 이루어진 용액에서 수행되었다. RPA 반응은 2.5 μL의 Mg (CH3COO)2 용액을 50 μL의 최종 부피로 첨가 한 다음, 볼텍싱(vortexing)에 의해 개시되었다. 최종 용액을 37 ℃에서 5 분 동안 인큐베이션한 뒤, 5 분동안 짧은 볼텍싱(vortexing)을 하여 다시 혼합 하였다. RPA 증폭된 용액 (50 μL)을 제조사의 지시에 따라 정제 하였다(NucleoSpin®® Gel사의 PCR Clean-up kit).
도 5에서는 Zif268와 이중 가닥 DNA의 결합을 유지하기 위해 사용된 TZ완충용액(Zn2+ 함유)의 전자 이동 매개 영향을 실험한 결과를 나타낸 데이터이다.
도 5a 및 도 5b의 (i) 내지 (iii)는 각각, (i)는 100μμM의 페로센 메탄올만 공급된 경우, (ii) 100μμM 의 페로센 메탄올에 5 μμM의 글루코스가 공급된 경우, (iii) 100 μμM 페로센 메탄올, 5 μμM 글루코스 및 200 μμM/ml 의 글루코스 옥시데이즈(GOx)가 공급된 경우로, (i) 내지 (iii)의 경우를 순환전압전류법(Cycle votammetry)과 크로노쿨로메트리(Chronocoulometry)를 이용하여 실험한 결과를 도시한 것이다.
도 5a의 실험은 도 4의 검출 방법을 이용하고, 순환 전압 전류법으로 측정된 그래프로, 20mV/s의 스캔속도로 기록되었다. 도 5a의 (i) 그래프를 보면, 페로센 메탄올을 함유한 TZ완충용액에서 얻어진 순환 전압 전류 그래프를 통해 페로센 메탄올이 빠른 외부 전자 전달을 함으로써, ITO 전극에서 가역적인 전기 화학적 양상을 보임을 확인 할 수 있다. 도 5a의 (ii) 그래프를 보면, 페로센 메탄올과 글루코스를 함유한 TZ 완충용액에서 얻은 순환 전압 전류 그래프는 도 5a의 (i)와 유사하였으나, 도 5a의 (iii) 그래프에서는 페로센 메탄올, 글루코스 및 글루코스 옥시데이즈(GOx)를 함유한 TZ 완충용액에서 얻어진 순환 전압 전류 그래프의 전류량은 높게 측정되었다. 이러한 결과를 통해, 페로센 메탄올과 글루코스 사이의 직접적인 반응이 매우 느리거나 발생하지 않았으며, 페로센 메탄올의 전자 이동 매개가 TZ 완충용액에서도 빠른 속도로 진행된다는 것을 알 수 있다.
도 5b는 페로센 메탄올이 글루코스 및 산화-환원 표지자인 글루코스 옥시데이즈(GOx)에 의해 전자 이동 매개체의 역할을 수행함을 보여주기 위해, 37 °C 의 TZ완충용액에 0.13V 전압이 인가된 ITO전극에서 크로노쿨로메트리를 측정한 결과를 그래프로 도시한 것이다. 도 5b에 도시된 바와 같이, 단순히 페로센 메탄올만 존재하는 도 5b의 (i)의 경우나 글루코스만 더 추가되는 도 5b의 (ii)의 경우에는 낮은 전하량이 측정되고 있으나, 페로센 메탄올, 글루코스 및 글루코스 옥시데이즈(GOx)가 모두 존재하는 도 5b의 (iii)에서는 전하량이 급격히 증가하는 데이터를 얻을 수 있었다. 얻어진 데이터의 결과에 따라, 페로센 메탄올과 기질인 글루코스 사이의 직접적인 산화-환원 반응은 매우 느리거나 발생하지 않았다는 사실을 확인 할 수 있었다. 또, 도 5b의 (iii) 그래프를 통해, 글루코스 옥시데이즈(GOx)가 존재하는 경우, 시간이 지남에 따라 계측되는 신호는 실질적으로 증가하므로 Zn2+의 존재와 관계없이 전자 매개 속도가 빠르다는 것을 확인 할 수 있었다.
도 6은 ITO-변형전극에서 GOx-Zif268 접합체의 비특이적 흡착을 실험한 결과를 나타낸 데이터이다.
우선, 전극에 포워드 프라이머 결합층을 도포하여 변형전극을 만들었다. 포워드 프라이머 결합층으로 사용된 물질들은 모두 아비딘 유사체 (뉴트라비딘, 스트렙타비딘 및 아비딘)였으며, 이를 이용하여 뉴트라비딘-변형전극, 스트렙타비딘-변형전극 및 아비딘-변형전극을 생성하였다. 생성된 3 개의 전극은 상이한 비특이적 결합이 나타났는데, 이는 3 가지 아비딘 유사체 각각이 상이한 PI값(각각 뉴트라비딘=6.3, 스트렙타비딘=~ 5-6 및 아비딘=~ 10)을 갖기 때문이다.
도 6에서는, 각각의 변형전극에서의 비특이적 흡착의 차이를 비교하기 위해 (i)를 대조군으로 하고, (ii) 내지 (vii)는 각각, (ii)은 결합층으로 뉴트라비딘(neutravidin)을 사용한 경우, (iii)은 (ii)에 포워드 프라이머를 함께 공급한 경우, (iv)는 결합층으로 스트렙타비딘을 사용한 경우, (v)는 (iv)에 포워드 프라이머를 함께 공급한 경우, (vi)는 결합층으로 아비딘을 사용한 경우, (vii)은 (vi)에 포워드 프라이머를 함께 공급한 경우로 하여 실험을 진행한 결과를 그래프로 나타었다. 그 결과, 스트렙타비딘 변형전극 및 아비딘 변형전극에서는 높은 전하량이 측정되어, 높은 수준의 비특이적 흡착이 일어났음을 확인할 수 있었다. 반면, (ii) 의 경우 및 (iii)의 경우는 대조군과 별반 차이 없는 낮은 비특이적 흡착을 보였음이 확인 되었다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 검증 실험에서도 포워드 프라이머의 말단은 바이오틴(Biotin)으로 표지하고, 전극은 뉴트라비딘-변형전극으로 하여 증폭된 DNA 검출을 진행하였다.
도 7은 본 발명을 이용하여 타깃 DNA의 RAP 증폭 특이성 및 증폭된 타깃DNA의 검출 선별도를 실험한 결과를 나타낸 데이터이다.
도 7a에서는 RPA 반응 후, TZ 완충용액(PH 8.5)에서 37 ℃에서 0.13V의 전위를 인가하여 100초에 측정한 크로노쿨로메트리 그래프를 도시하고 있다. (i) 내지 (v)의 경우는 각각, 대조군인 (i)는 특이적 프라이머만 공급된 경우, (ii)는 비특이적 프라이머와 타깃 DNA가 공급된 경우, (iii)은 특이적 프라이머 및 송아지 흉선 DNA가 공급된 경우, (iv)는 특이적 프라이머 및 랜덤 시퀀스 DNA 가 공급된 경우, (v)는 특이적 프라이머와 타깃 DNA가 공급된 경우로, 각각의 상이한 조건에서 DNA를 증폭하고 검출하는 실험을 진행하였다. 그래프에 도시된 내용을 보면, (i) 내지 (iv)는 비슷한 수준의 전하량이 측정되었으나, (v)의 경우에는 매우 높은 수준의 전하량이 측정 되었음을 확인할 수 있다. 이는, 타깃 DNA와 이에 상보적으로 결합하는 특이적인 프라이머를 공급하는 경우, 증폭된 DNA가 타깃이 아닌 DNA에 비해 매우 높은 신호 감지가 가능하므로 다른 물질로부터 얻어지는 신호의 간섭을 무시할 수 있는 정도임을 의미한다. 즉, 타깃 DNA와 특이적인 프라이머를 사용하는 본 발명의 검출의 선별도가 매우 높음을 입증하는 데이터라고 할 수 있다.
도 7b에서는 겔 전기영동을 통해 타깃 DNA의 RPA증폭 특이성을 확인한 데이터이다. 레인1 내지 레인4는 각각, 레인1은 마커, 레인2는 증폭 이전의 타깃 DNA 0.1ng/ μμL, 레인3은 타깃 DNA를 포함하는 RPA 증폭산물, 레인4는 타깃 DNA가 없는 랜덤 시퀀스 DNA의 RPA 증폭산물이며, RPA 증폭반응과 타깃 DNA의 증폭 특이도를 확인하기 위해 겔 전기영동을 수행한 결과, 비특이적인 랜덤 시퀀스의 DNA만 있는 경우인 레인4에서는 밴드가 관찰되지 않은 반면, 타깃 DNA를 증폭한 레인3에서는 명확한 밴드가 관찰되었다. 즉, 도 7b의 겔 전기영동으로 RPA 반응이 타깃 DNA 주형에 특이적이라는 것이 확인되었다.
도 8은 피스시리케치아 살모니스의 DNA를 증폭하여 무세척으로 검출한 실험 결과 그래프이다.
도 8a는 피스시리케치아 살모니스 DNA를 주형으로 증폭한 이중 가닥 DNA의 시간 대 전하도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 주형 DNA를 등온 증폭하는 과정은 전술한 실시예의 내용과 동일하게 진행되었다. 15분 간의 등온 증폭 반응 직후, 잠복기 없이 37 °C 의 TZ완충용액에 0.13V 전압이 인가된 ITO전극에서 각기 다른 초기 사본 번호(initial copy number)로 크로노쿨로메트리를 측정했으며, 그 결과 그래프를 도 8a에 도시하였다. 도시된 그래프를 보면, 시간이 지날수록 전하의 변화량(기울기)이 증가하고 있어, 복사된 수가 많을수록 전하의 변화량도 함께 증가함을 알 수 있다.
도 8b는 도 8a의 크로노쿨로메트리 그래프에서 100초일 때 기록된 전하 데이터를 이용한 보정 플롯 그래프이다. 측정은 제로 농도에 대해 7 회 반복하였고, 동일한 시료에 대해 새로운 감지 전극을 사용하고 농도를 달리하여 3회 반복하였다. 각 초기 사본 수에 대한 전하량은 제로 농도에 대한 평균값을 제외하고 계산했다. 점선으로 표기된 그래프는 제로 농도에 대한 크로노쿨로메트리 측정의 표준편차를 3배한 것을 나타낸 것이다. 계산된 검출한계는 약 13.2 μL에 300 복제물이 측정되었으며, 이를 통해 전술한 실시예를 이용하면 증폭된 DNA의 고감도 검출이 가능함이 확인되었다.
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기를 기초로 다양한 기술적 수정 및 변형을 적용할 수 있다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 시스템, 구조, 장치, 회로 등의 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.

Claims (10)

  1. DNA 검출 방법으로,
    상기 DNA 검출 방법은, 이중 가닥 DNA를 등온 증폭하는 단계 및 증폭된 이중 가닥 DNA를 검출하는 단계가 하나의 챔버(Chamber)내에서 동시 또는 순차적으로 이루어지고,
    상기 이중 가닥 DNA를 등온 증폭하는 단계는, 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머에 의한 증폭 반응으로, 상기 포워드 프라이머의 말단은 전극에 도포된 포워드 프라이머 결합층에 친화적인 물질로 표지되어 있고,
    상기 증폭된 이중 가닥 DNA를 검출하는 단계는,
    (a) 상기 증폭된 이중 가닥 DNA와 이중 가닥 DNA에 특이적으로 결합하는 단백질의 결합으로 결합물이 생성되는 단계; 및
    (b) 상기 결합물에 부착된 산화-환원 표지자와 전자 이동 매개체(electron mediator)의 산화-환원 반응에 의해 전극으로 전자가 이동되고, 전자 이동 매개체의 전자 전달 속도 차에 의해 DNA를 검출하는 단계; 를 포함하되,
    상기 검출은, 증폭된 이중 가닥 DNA의 변성(Denaturation) 단계를 별도로 요구하지 않는 것인, DNA 검출 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 이중 가닥 DNA에 특이적으로 결합하는 단백질은, 징크 핑거 단백질(Zinc finger protein)인, DNA 검출방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 징크 핑거 단백질은, Zif268, TFIIIA, GAGA 및 Ros 로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인, DNA 검출방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 등온 증폭 반응은, 재조합효소 중합효소 증폭(recombinase polymerase amplification, RPA), 루프 매개 증폭(loop-mediated isothermal amplification, LAMP), 헬리카제-종속 증폭(helicase-dependent amplification, HDA), 회전환 증폭(rolling circle amplification, RCA), 다중치환증폭(multiple displacement amplification, MDA), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification, SDA), 핵산 서열-기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification, NASBA) 중 어느 하나인, DNA 검출방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 DNA 검출 방법은, 검출 중에 세척 과정을 요구하지 않는, DNA 검출방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 산화-환원 표지자는, 글루코스 옥시데이즈, 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로지네이즈, 아스코베이트 옥시데이즈, 호스래디쉬 옥시데이즈, 소이빈 옥시데이즈, 라케이즈, 빌리루빈 옥시데이즈, 타이로시네이즈, 금 나노입자, 은 나노입자, 백금 나노입자, 이리듐 나노입자, 팔라듐 나노입자, 프러시안블루 나노입자 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인, DNA 검출방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 전자 이동 매개체는, Ru(NH3)6 3+, Ru(NH3)6 2+, Fe(CN)6 3-, Fe(CN)6 4-, Ru(NH3)5(pyridine)3+, Ru(NH3)5(pyridine)2+, 페로센, 페로센 메탄올, 페로센 카복시산, Os(bpy)2Cl2 3+, Ox(bpy)2Cl2 2+ 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인, DNA 검출방법.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 증폭된 이중 가닥 DNA를 검출하는 단계는, 2종 이상의 전극을 포함하고, 전극 사이의 간섭이 없이 각각의 전극을 통해 동시에 2종 이상의 증폭된 DNA를 검출하는, DNA 검출방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 전극은, 주석산화물(Indium tin oxide, ITO) 전극, 그래핀(grapheme)이 입혀진 주석산화물 전극, 탄소나노튜브(carbon nanotube)가 입혀진 주석산화물 전극, 카본 전극, 금 전극, 은 전극, Ag/AgCl 전극, 백금 전극 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인, DNA 검출방법.
  10. 제 1항의 DNA 검출 방법을 이용하여 DNA를 검출하는, DNA 검출장치.
KR1020180042230A 2018-04-11 2018-04-11 증폭된 이중 가닥 dna 검출방법 및 이를 이용한 장치 KR102062980B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180042230A KR102062980B1 (ko) 2018-04-11 2018-04-11 증폭된 이중 가닥 dna 검출방법 및 이를 이용한 장치

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180042230A KR102062980B1 (ko) 2018-04-11 2018-04-11 증폭된 이중 가닥 dna 검출방법 및 이를 이용한 장치

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190118835A true KR20190118835A (ko) 2019-10-21
KR102062980B1 KR102062980B1 (ko) 2020-02-11

Family

ID=68460572

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180042230A KR102062980B1 (ko) 2018-04-11 2018-04-11 증폭된 이중 가닥 dna 검출방법 및 이를 이용한 장치

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102062980B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114563459A (zh) * 2022-01-27 2022-05-31 宁波大学 基于氧化锌纳米粒子的“二进制”生物逻辑门设计及应用研究

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BE1029278B1 (fr) * 2021-04-07 2022-11-17 Magnetrap Dispositif pour détecter la présence d'au moins un ADN cible et/ou d'au moins un ARN cible dans un échantillon, en particulier dans un échantillon liquide
WO2023107921A1 (en) * 2021-12-06 2023-06-15 Analog Devices, Inc. Sensor assembly, system, method and ph sensor

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101192567B1 (ko) * 2005-12-08 2012-10-17 세키스이 메디칼 가부시키가이샤 핵산 증폭법을 이용한 인간 유두종 바이러스의 검출 방법 및 핵산쇄 고정화 담체
KR20140110795A (ko) * 2013-03-08 2014-09-17 부산대학교 산학협력단 산화환원 순환을 이용한 바이오센서 스트립
KR101698988B1 (ko) * 2014-04-14 2017-01-24 부산대학교 산학협력단 전자전달 매개체의 산화환원 순환을 이용한 바이오센서

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101192567B1 (ko) * 2005-12-08 2012-10-17 세키스이 메디칼 가부시키가이샤 핵산 증폭법을 이용한 인간 유두종 바이러스의 검출 방법 및 핵산쇄 고정화 담체
KR20140110795A (ko) * 2013-03-08 2014-09-17 부산대학교 산학협력단 산화환원 순환을 이용한 바이오센서 스트립
KR101698988B1 (ko) * 2014-04-14 2017-01-24 부산대학교 산학협력단 전자전달 매개체의 산화환원 순환을 이용한 바이오센서

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114563459A (zh) * 2022-01-27 2022-05-31 宁波大学 基于氧化锌纳米粒子的“二进制”生物逻辑门设计及应用研究
CN114563459B (zh) * 2022-01-27 2023-12-15 宁波大学 基于氧化锌纳米粒子的“二进制”生物逻辑门设计及应用研究

Also Published As

Publication number Publication date
KR102062980B1 (ko) 2020-02-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Jiang et al. Highly sensitive electrochemical detection of cocaine on graphene/AuNP modified electrode via catalytic redox-recycling amplification
KR102062980B1 (ko) 증폭된 이중 가닥 dna 검출방법 및 이를 이용한 장치
Farabullini et al. Disposable electrochemical genosensor for the simultaneous analysis of different bacterial food contaminants
Li et al. Quantum dot-based electrochemical biosensor for stripping voltammetric detection of telomerase at the single-cell level
Liu et al. An electrochemical strategy with tetrahedron rolling circle amplification for ultrasensitive detection of DNA methylation
Jin et al. Hyperbranched rolling circle amplification based electrochemiluminescence aptasensor for ultrasensitive detection of thrombin
US20100248231A1 (en) High specificity and high sensitivity detection based on steric hindrance & enzyme-related signal amplification
Liu et al. Electrochemical detection of telomerase in cancer cells based on the in-situ formation of streptavidin-biotin-DNA-biotin networks for signal amplification
Wei et al. DNA biosensors based on metallo-intercalator probes and electrocatalytic amplification
Das et al. Electrochemical DNA sensor for anthrax toxin activator gene atxA-detection of PCR amplicons
Gao et al. Molecular beacon mediated circular strand displacement strategy for constructing a ratiometric electrochemical deoxyribonucleic acid sensor
Bai et al. Electrochemical aptasensor for sulfadimethoxine detection based on the triggered cleavage activity of nuclease P1 by aptamer-target complex
Xia et al. Comparing the performances of electrochemical sensors using p-aminophenol redox cycling by different reductants on gold electrodes modified with self-assembled monolayers
Li et al. Amplified electrochemical detection of nucleic acid hybridization via selective preconcentration of unmodified gold nanoparticles
Li et al. A new electrochemical immunoassay for prion protein based on hybridization chain reaction with hemin/G-quadruplex DNAzyme
Ye et al. Electrogenerated chemiluminescence detection of adenosine based on triplex DNA biosensor
Sheng et al. Ultrasensitive electrical biosensing of syphilis DNA using target-guided formation of polyaniline based on enzyme-catalyzed polymerization
Mello et al. Polyaniline-based field effect transistor for DNA/RNA biomarker sensing: comparison to electrochemical impedance and inorganic layer
JP2006514264A (ja) 液体溶媒中の検体の測定
Wan et al. Ligase-based multiple DNA analysis by using an electrochemical sensor array
Campuzano et al. Electrochemical biosensing of microribonucleic acids using antibodies and viral proteins with affinity for ribonucleic acid duplexes
Gao et al. Construction of a dual-model aptasensor based on G-quadruplexes generated via rolling circle amplification for visual/sensitive detection of kanamycin
Yun et al. Proximity ligation assay induced and DNAzyme powered DNA motor for fluorescent detection of thrombin
Wu et al. Highly selective and sensitive detection of glutamate by an electrochemical aptasensor
Li et al. Binding induced strand displacement amplification for homogeneous protein assay

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant