KR20190114341A - A liposome for delivering miRNA using a specific ligand to pancreatic beta cell - Google Patents

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Abstract

Provided by the present invention is a liposome nanocarrier carrying miRNA therein and having a surface with which ligand peptide specific to pancreatic beta cells is combined. According to the present invention, the liposome nanocarrier is able to collect miRNA stably when carrying miRNA by containing cationic phospholipid as inner layer phospholipid, and is able to combine beta cell-specific peptide with maleimide as a ligand by including DSPE-PEG2k-maleimide as outer layer phospholipid. The liposome nanocarrier of the present invention can be used beneficially as an active ingredient of a pharmaceutical composition for preventing or treating diabetes using miRNA since the level of miRNA delivery ability is high due to the increase of intake efficiency into beta cells and a targeting ability is not exhibited to other cells besides beta cells when using Ex-4(9-30) peptide of a sequence, from which the N-terminal and C-terminal of exendin-4 are removed, as the beta cell-specific peptide.

Description

베타 세포 특이적 리간드를 이용한 miRNA 전달용 리포좀{A liposome for delivering miRNA using a specific ligand to pancreatic beta cell}A liposome for delivering miRNA using a specific ligand to pancreatic beta cell}

본 발명은 췌장의 베타 세포를 특이적으로 표적할 수 있는 리간드를 표면에 표지하는 miRNA 전달용 리포좀 나노입자, 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to liposome nanoparticles for miRNA delivery, and their use for labeling a ligand that can specifically target beta cells of the pancreas.

당뇨병(Diabetes mellitus, DM)은 인슐린의 분비 장애와 저항성으로 인해 발생하는 만성질환으로, 고혈당을 비롯한 대사이상이 장기간 지속되어 미세혈관 및 대혈관 합병증을 유발하고 이로 인해 심각한 삶의 질 감소와 사망률 증가를 초래하게 되는 대표적인 중대질환이다.Diabetes mellitus (DM) is a chronic disease caused by impaired insulin secretion and resistance. Long-term metabolic disorders, including hyperglycemia, lead to microvascular and macrovascular complications, resulting in severe loss of quality of life and increased mortality. This is a representative serious disease.

당뇨병은 크게 2 가지 유형으로 나뉘는데, 제 1형 당뇨병은 췌장의 기능 저하로 인해 인슐린이 충분히 생산되지 못하는 것이 원인이 되는 유형으로 인슐린 의존적 당뇨병의 유형으로 분류될 수 있다. 이에 비해, 제 2형 당뇨병은 췌장 베타세포의 기능 저하와 당대사이상으로 인한 인슐린 저항성이 원인이 되어, 생산된 인슐린이 제기능을 하지 못하여 발생되는 유형으로 인슐린 비의존적 당뇨병의 유형으로 분류될 수 있다.Diabetes is largely divided into two types. Type 1 diabetes can be classified into a type of insulin dependent diabetes due to a lack of insulin production due to a decrease in pancreatic function. In contrast, type 2 diabetes is caused by decreased pancreatic beta cell function and insulin resistance due to glucose metabolism abnormality, and can be classified as a type of insulin-independent diabetes that is caused by the insufficiency of produced insulin. have.

이러한 당뇨병의 치료 방법으로, 당뇨병 유형에 따라 다양한 치료 방법이 개발되었다. 대표적인 당뇨병 치료제로는 설폰요소제로 대표되는 인슐린분비 촉진제, 바이구아니드, 알파글루코시다제 억제제, 치아졸리딘다이온 및 인슐린 등이 대표적으로 사용되고 있다. 그러나, 이러한 치료제들은 기존의 병태생리를 기준으로 하여 인슐린 결핍이나 인슐린 저항성 등을 개선하기 위해 만들어진 약제로, 이들 약제의 사용에 있어서 효능이 제한적이고 부작용이 동반될 수 있는 것으로 보고됨에 따라, 새로운 당뇨병 치료 타겟의 연구가 계속 요구되고 있다.As a method of treating diabetes, various treatment methods have been developed according to the type of diabetes. Representative antidiabetic agents include insulin secretagogues, biguanides, alphaglucosidase inhibitors, chiazolidinedione, and insulin, which are typically represented by sulfone urea. However, these drugs are designed to improve insulin deficiency or insulin resistance on the basis of existing pathophysiology, and the use of these drugs is reported to be limited in efficacy and may be accompanied by side effects. There is a continuing need for the study of therapeutic targets.

최근, 당뇨병의 원인과 병태생리를 보다 정확히 이해하고, 기존 약제의 한계를 극복하여 보다 완벽한 치료제를 개발하기 위한 분자생물학적 연구가 활발히 이루어지고 있다. 이러한 분자생물학적 연구에 따라, 당뇨병 치료제로서 췌장의 베타 세포(pancreatic β cell)을 타겟으로 하는 miRNA가 제시되고 있다. 제기능을 하지 못하는 췌장 세포에 표적 유전자에 대한 miRNA를 투여하면, miRNA에 의한 유전자 발현의 조절을 통해 세포의 기능을 조절할 수 있으므로, 이것이 당뇨병 치료의 방법으로 제시되어 활발한 연구가 계속되고 있다(Mary P.Lapierre, MicroRNAs as stress regulators in pancreatic beta cells and diabetes, Molecular metabolism (2017)).In recent years, molecular biology research has been actively conducted to more accurately understand the causes and pathophysiology of diabetes mellitus and to develop more complete therapeutic agents by overcoming the limitations of existing drugs. According to these molecular biological studies, miRNAs targeting pancreatic β cells of the pancreas have been proposed as diabetes therapeutics. Administration of miRNAs to target genes to non-functional pancreatic cells can modulate cell function through regulation of gene expression by miRNAs, which has been suggested as a method for the treatment of diabetes. P. Lapierre, MicroRNAs as stress regulators in pancreatic beta cells and diabetes , Molecular metabolism (2017)).

이와 같이, miRNA를 이용하여 당뇨병을 치료하고자 하는 방법에 있어서, miRNA의 용도에 관한 연구가 계속되고 있는 만큼, 원하는 miRNA를 효율적으로 췌장의 베타 세포에 전달할 수 있는 전달 시스템에 대한 개발이 함께 이루어지고 있다. 다양한 약물 전달 시스템 중, miRNA를 리포좀 내에 담지하여 약물 전달체로서 사용하는 시도가 이루어지고 있다. As such, in the method for treating diabetes using miRNA, as research on the use of miRNA continues, development of a delivery system capable of efficiently delivering desired miRNA to the beta cells of the pancreas is made together. have. Among various drug delivery systems, attempts have been made to support miRNAs in liposomes as drug carriers.

이에, 본 발명자들은 당뇨병 치료용도로서 miRNA를 사용함에 있어서 보다 효율적으로 miRNA를 전달할 수 있는 전달체를 제공하기 위해 노력한 결과, miRNA를 담지하는 리포좀의 표면에 췌장 베타 세포를 표적하는 펩타이드 분자를 결합시킨 형태의 miRNA 담지 리포좀 나노전달체를 제조하였으며, 상기 나노전달체의 표면에 결합된 펩타이드(베타세포 표적 리간드)에 따라 베타 세포에 대한 표적능이 조절될 수 있음을 확인함으로서, 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors have tried to provide a carrier capable of delivering miRNAs more efficiently in the use of miRNAs for the treatment of diabetes mellitus, resulting in the binding of peptide molecules targeting pancreatic beta cells to the surface of liposomes carrying miRNAs. The miRNA-supported liposome nanocarrier was prepared, and the present invention was completed by confirming that the target ability for beta cells can be controlled according to the peptide (beta cell target ligand) bound to the surface of the nanocarrier.

본 발명의 목적은 베타 세포에 대한 표적능을 나타내면서 miRNA를 담지한 리포좀 나노전달체를 제공하여, 이를 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로 사용하는 용도를 제공하고자 하는 것이다.An object of the present invention is to provide a liposome nanocarrier carrying a miRNA while showing a target ability to beta cells, to provide a use of this as an active ingredient of a pharmaceutical composition for preventing or treating diabetes.

상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 miRNA를 담지하고, 내부층 인지질로 양이온성 인지질을 포함하는, miRNA 전달용 리포좀 나노전달체로서, 상기 리포좀 나노전달체의 외부층 인지질로 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[말레이미드(폴리에틸렌글리콜)-2000](1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000]; DSPE-PEG2k-maleimide)을 포함하고, 상기 말레이미드에 췌장 베타 세포 표적능을 가지는 펩타이드가 결합된, 리포좀 나노전달체를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention is a liposome nanotransmitter for miRNA delivery, carrying a miRNA, comprising a cationic phospholipid as an inner layer phospholipid, the outer layer phospholipid of the liposome nanocarrier to 1,2-distea Mono-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [maleimide (polyethylene glycol) -2000] (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [maleimide (polyethylene glycol)- 2000]; DSPE-PEG2k-maleimide), and provides a liposome nanocarrier in which a peptide having pancreatic beta cell targeting ability is bound to the maleimide.

또한, 본 발명은 상기 miRNA 전달용 리포좀 나노 전달체를 유효성분으로 포함하는, 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating diabetes, comprising the miRNA delivery liposome nano-carrier as an active ingredient.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 miRNA는 miR-30a-5p, miR-374 및 miR-137로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.In a preferred embodiment of the present invention, the miRNA may be any one or more selected from the group consisting of miR-30a-5p, miR-374 and miR-137.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 양이온성 인지질은 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP; 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane)인 것일 수 있다.In a preferred embodiment of the present invention, the cationic phospholipid may be 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (DOTAP; 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane).

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 외부층 인지질은, 하이드로제네티드 대두 포스파티딜콜린(hydrogenated soy phosphatidylcholine; HSPC), 1,2-디르테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌 글리콜)-2000])(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000]; DSPE-PEG2k) 및 콜레스테롤(cholestrol; Chol)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 것일 수 있다.In a preferred embodiment of the present invention, the outer layer phospholipid is hydrogenated soy phosphatidylcholine (HSPC), 1,2-ditearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N -[Amino (polyethylene glycol) -2000]) (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [amino (polyethylene glycol) -2000]; DSPE-PEG2k) and cholesterol (Chol) It may further include any one or more selected from the group consisting of.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 엑센딘-4(exendin-4) 펩타이드, 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 Ex-4(9-39) 펩타이드 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성되는 Ex-4(9-30) 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.In a preferred embodiment of the invention, the peptide is an exendin-4 peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, Ex-4 (9-39) peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 And it may be any one or more selected from the group consisting of Ex-4 (9-30) peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 펩타이드의 함량은, 펩타이드 및 말레이미드가 1:1 내지 4:1의 몰비율이 되도록 포함되는 것일 수 있다.In a preferred embodiment of the present invention, the content of the peptide, peptide and maleimide may be included so that the molar ratio of 1: 1 to 4: 1.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 약학적 조성물은 췌장의 베타 세포를 특이적으로 표적하는 것일 수 있다.In a preferred embodiment of the present invention, the pharmaceutical composition may specifically target the beta cells of the pancreas.

본 발명은 miRNA를 내부에 담지하면서 표면에 췌장 베타세포에 특이적인 리간드 펩타이드가 결합된 리포좀 나노전달체를 제공한다.The present invention provides a liposome nanocarrier in which a ligand peptide specific for pancreatic beta cells is bound to a surface thereof while supporting miRNA.

본 발명에 따른 리포좀 나노전달체는 내부층 인지질로서 양이온 인지질을 포함하고 있어 miRNA를 담지할 때 안정적으로 miRNA를 포집할 수 있으며, 외부층 인지질로서 DSPE-PEG2k-maleimide를 포함하고 있어, 말레이미드에 베타 세포 특이적인 펩타이드를 리간드로서 결합시킬 수 있다. 상기 베타 세포 특이적인 펩타이드로서 엑센딘-4(exendin-4)의 N말단 및 C말단이 제거된 서열의 Ex-4(9-30) 펩타이드를 사용하였을 때, 베타 세포 내로의 흡수 효율이 상승하여 miRNA 전달능이 높은 수준으로 나타나며, 베타 세포 외의 다른 세포에 대하여는 표적능을 나타내지 않으므로, 본 발명의 리포좀 나노전달체는 miRNA를 이용한 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.The liposome nanocarriers according to the present invention contain cationic phospholipids as inner layer phospholipids, which can stably capture miRNAs when supporting miRNAs, and contain DSPE-PEG2k-maleimide as outer layer phospholipids, which are beta to maleimide. Cell specific peptides can be bound as ligands. As the beta cell specific peptide, when the Ex-4 (9-30) peptides of the N- and C-terminal sequences of exendin-4 were removed, the absorption efficiency into the beta cells was increased. The miRNA delivery ability is shown at a high level and does not show the target ability against other cells other than the beta cells, the liposome nanocarrier of the present invention can be usefully used as an active ingredient of a pharmaceutical composition for preventing or treating diabetes using miRNA.

도 1은 본 발명의 miRNA 담지 리포좀 나노전달체의 제조 과정을 나타낸다:
도 1a는 본 발명의 리포좀 나노전달체의 구성 요소를 나타내는 모식도이며; 및
도 1b는 리포좀의 외부층 인지질에 췌장세포 특이적 리간드 펩타이드가 결합되는 과정을 나타내는 모식도이다.
도 2는 본 발명의 miRNA 담지 리포좀의 안정성 수준을 확인한 과정을 나타낸다.
도 3은 표면 펩타이드 리간드의 종류에 따른 세포 내 전달 효율성을 비교한 결과를 나타낸다.
도 4는 표면 펩타이드 리간드로서 Ex-4 (9-30) 및 Ex-4 (1-39)를 사용하였을 때의 세포 내 전달 효율성을 비교한 형광 현미경 영상(도 4a) 및 이의 정량분석 결과(도 4b)이다.
도 5는 표면 펩타이드 리간드로서 사용한 Ex-4 (9-30)의 농도에 따른 세포 내 전달 효율성을 비교한 형광 현미경 영상(도 5a) 및 이의 정량분석 결과(도 5b)이다.
도 6은 Ex-4(9-30) 리간드를 표지한 miRNA 담지 리포좀의 베타세포에 대한 특이적 표적 유무를 확인한 결과를 나타낸다.Figure 1 shows the preparation of the miRNA loaded liposome nanocarrier of the present invention:
Figure 1a is a schematic diagram showing the components of the liposome nanocarrier of the present invention; And
Figure 1b is a schematic diagram showing the process of binding the pancreatic cell-specific ligand peptide to the outer layer phospholipids of liposomes.
Figure 2 shows the process of confirming the stability level of the miRNA loaded liposome of the present invention.
Figure 3 shows the result of comparing the intracellular delivery efficiency according to the type of surface peptide ligand.
4 is a fluorescence microscopy image (FIG. 4A) comparing the intracellular delivery efficiency when using Ex-4 (9-30) and Ex-4 (1-39) as the surface peptide ligand (FIG. 4A) and its quantitative analysis result (FIG. 4b).
5 is a fluorescence microscopy image (FIG. 5A) and a quantitative analysis result thereof (FIG. 5B) comparing the intracellular delivery efficiency according to the concentration of Ex-4 (9-30) used as the surface peptide ligand.
Figure 6 shows the results of confirming the presence or absence of a specific target for the beta cells of miRNA bearing liposomes labeled with the Ex-4 (9-30) ligand.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 miRNA를 담지하고, 내부층 인지질로 양이온성 인지질을 포함하는, miRNA 전달용 리포좀 나노전달체로서,The present invention is a liposome nanocarrier for miRNA delivery, carrying a miRNA, comprising a cationic phospholipid as an inner layer phospholipid,

상기 리포좀 나노전달체의 외부층 인지질로 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[말레이미드(폴리에틸렌글리콜)-2000](1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000]; DSPE-PEG2k-maleimide)을 포함하고, 상기 말레이미드에 췌장 베타 세포 표적능을 가지는 펩타이드가 결합된, 리포좀 나노전달체를 제공한다.1,2-dstearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [maleimide (polyethylene glycol) -2000] (1,2-distearoyl-sn) as an outer layer phospholipid of the liposome nanocarrier Provides a liposome nano-carrier comprising -glycero-3-phosphoethanolamine-N- [maleimide (polyethylene glycol) -2000]; DSPE-PEG2k-maleimide), the peptide is coupled to the maleimide having pancreatic beta cell target ability do.

본 발명의 리포좀 나노 전달체에 있어서, 상기 miRNA는 miR-30a-5p, miR-374 및 miR-137로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 베타 세포 내부에서 당뇨병의 예방, 개선 또는 치료의 효과를 나타낼 수 있도록 조절하는 것으로 당업계에 공지된 miRNA 라면 제한없이 사용될 수 있다.In the liposome nanocarrier of the present invention, the miRNA is preferably at least one selected from the group consisting of miR-30a-5p, miR-374 and miR-137, but is not limited thereto. It may be used without limitation as long as it is a miRNA known in the art to modulate the effect of improving, improving or treating.

본 발명의 리포좀 나노 전달체에 있어서, 상기 양이온성 인지질은 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP; 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 리포좀 나노 전달체는 내부에 miRNA를 담지하여 이를 췌장의 베타 세포에 특이적으로 전달하는 기능을 제공하고자 한다는 관점에서 사용될 수 있다. miRNA의 표면 전하는 음전하를 나타내고 있으므로, 양이온성 인지질이 내부층을 이루는 구조로 본 발명의 리포좀을 제조하였을 때, 내부층인 양이온성 인지질과 목적의 miRNA가 안정적으로 정전기결합을 통해 리포좀 내부에 위치할 수 있어, miRNA 전달체로서의 효과를 가져올 수 있다.In the liposome nanocarrier of the present invention, the cationic phospholipid is preferably 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (DOTAP; 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane), but is not limited thereto. It doesn't work. The liposome nanocarrier of the present invention can be used in view of providing a function of carrying a miRNA therein and specifically delivering it to the beta cells of the pancreas. Since the surface charge of the miRNA shows a negative charge, when the liposome of the present invention is prepared with a structure in which the cationic phospholipid forms an inner layer, the cationic phospholipid, which is an inner layer, and the target miRNA can be stably located inside the liposome through electrostatic bonding. Can produce effects as miRNA transporters.

본 발명의 리포좀 나노 전달체에 있어서, 상기 외부층 인지질은, 하이드로제네티드 대두 포스파티딜콜린(hydrogenated soy phosphatidylcholine; HSPC), 1,2-디르테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌 글리콜)-2000])(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000]; DSPE-PEG2k) 및 콜레스테롤(cholestrol; Chol)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. In the liposome nanocarrier of the present invention, the outer layer phospholipid is hydrogenated soy phosphatidylcholine (HSPC), 1,2-dirtearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N -[Amino (polyethylene glycol) -2000]) (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [amino (polyethylene glycol) -2000]; DSPE-PEG2k) and cholesterol (Chol) It may further include any one or more selected from the group consisting of, but is not limited thereto.

본 발명의 리포좀 나노 전달체에 있어서, 상기 췌장 베타 세포에 표적능을 가지는 펩타이드는 GLP-1 펩타이드 또는 이의 유사체 펩타이드일 수 있으며, 당업계에서 췌장 베타 세포에 대하여 표적능을 가지는 것으로 공지된 서열을 선택하여 사용할 수 있다. 상기 펩타이드는 리포좀 외부층 인지질을 이루고 있는 말레이미드와 결합되기 위해, 말단에 시스테인 잔기를 가지는 서열로 구성되는 것이 바람직하다. 펩타이드 말단의 시스테인 잔기는 -SH 기를 가지고 있어, 상기 -SH 기가 말레이미드 분자와 티오에테르 결합(thioether bond)을 이루어 공유결합으로 안정적이고 강력하게 펩타이드가 리포좀 나노전달체의 표면에 표지될 수 있도록 한다.In the liposome nanocarrier of the present invention, the peptide having a target ability against pancreatic beta cells may be a GLP-1 peptide or an analog peptide thereof, and selects a sequence known in the art to have a target ability against pancreatic beta cells. Can be used. The peptide is preferably composed of a sequence having a cysteine residue at its end in order to bind to the maleimide constituting the liposome outer layer phospholipid. The cysteine residue at the end of the peptide has a -SH group so that the -SH group forms a thioether bond with the maleimide molecule so that the peptide can be labeled stably and strongly on the surface of the liposome nanocarrier by covalent bond.

바람직하게는, 상기 췌장 베타 세포에 표적능을 가지는 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 엑센딘-4(exendin-4) 펩타이드, 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 Ex-4(9-39) 펩타이드 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성되는 Ex-4(9-30) 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드는 총 39 개의 잔기를 포함하며, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N 말단이 제거된 서열로 이루어진다. 또한, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N 말단 및 C 말단이 제거된 서열로 이루어진다. 본 발명의 리포좀 나노전달체는 췌장 베타 세포를 표적으로 하여 miRNA의 세포 내 흡수를 최적으로 나타내는 것을 목적으로 한다는 관점에서, 본 발명에서 사용하는 펩타이드 리간드는 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성되는 Ex-4(9-30) 펩타이드인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.Preferably, the peptide having the ability to target the pancreatic beta cells is an exendin-4 peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, Ex-4 (9- consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2). 39) at least one selected from the group consisting of a peptide and an Ex-4 (9-30) peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. The peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 includes a total of 39 residues, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 consists of a sequence in which the N terminal is removed from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. In addition, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 consists of a sequence in which the N terminal and the C terminal is removed from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. The liposome nanocarrier of the present invention aims to optimally express the uptake of miRNA by targeting the pancreatic beta cells, and the peptide ligand used in the present invention is Ex-4 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 (9-30) The peptide is most preferred, but is not limited thereto.

또한, 본 발명의 리포좀 나노 전달체에 있어서, 상기 펩타이드의 함량 또한 조절하여 사용할 수 있다. 구체적으로, 펩타이드 및 말레이미드가 1:1 내지 4:1의 몰비율이 되도록 포함되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 보다 구체적으로 펩타이드 및 말레이미드가 2:1 내지 3:1의 몰비율이 되도록 펩타이드를 포함하는 것이 가장 바람직하다. 상기 몰비율보다 펩타이드의 함량이 낮은 경우, 유의적으로 리포좀 나노 전달체는 베타 세포 표적의 리간드를 표면에 나타내지 못하므로 베타 세포에 대한 표적능이 유의적으로 나타날 수 없다. 또한, 상기 몰비율보다 펩타이드의 함량이 높은 경우, 리포좀 나노 전달체의 표면에 과도한 펩타이드가 결합되어 리포좀 나노 전달체의 응집이 유도되므로, 나노 전달체로서 사용할 수 없으므로 효과적이지 않다.In addition, in the liposome nano-carrier of the present invention, the content of the peptide can also be used to adjust. Specifically, the peptide and maleimide is preferably included to be a molar ratio of 1: 1 to 4: 1, but is not limited thereto. More specifically, the peptide and maleimide to be a molar ratio of 2: 1 to 3: 1. Most preferably it comprises a peptide. When the content of the peptide is lower than the molar ratio, the liposome nanocarrier does not show the ligand of the beta cell target on the surface, and thus the target ability against the beta cell cannot be significantly displayed. In addition, when the content of the peptide is higher than the molar ratio, since excessive peptide is bound to the surface of the liposome nanocarrier to induce aggregation of the liposome nanocarrier, it is not effective because it cannot be used as a nanocarrier.

또한, 본 발명은 상기 miRNA 전달용 리포좀 나노 전달체를 유효성분으로 포함하는, 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating diabetes, comprising the miRNA delivery liposome nano-carrier as an active ingredient.

본 발명의 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 유효 성분으로 제공되는 miRNA 전달용 리포좀 나노 전달체는 상술한 바를 따른다.The liposome nanocarrier for delivery of miRNA provided as an active ingredient of the pharmaceutical composition for preventing or treating diabetes of the present invention is as described above.

본 발명의 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 췌장의 베타 세포를 특이적으로 표적하는 것이 바람직하며, 베타 세포를 표적한 후 담지된 miRNA가 세포 내에서 당뇨병에 대한 예방, 개선 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.The pharmaceutical composition for preventing or treating diabetes of the present invention preferably specifically targets the beta cells of the pancreas, and after targeting the beta cells, the supported miRNA exhibits a prophylactic, improvement or therapeutic effect on diabetes in the cells. Can be.

본 발명의 베타 세포 특이적 리포좀 나노전달체는 임상투여시 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 비경구 투여는 직장, 정맥, 복막, 근육, 동맥, 경피, 비강(Nasal), 흡입, 안구 및 피하와 같은 경구 이외의 투여경로를 통한 투여를 의미할 수 있다. 본 발명의 베타 세포 특이적 리포좀 나노전달체를 의약품으로 사용하는 경우, 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.The beta cell specific liposome nanocarriers of the present invention can be administered parenterally during clinical administration and can be used in the form of general pharmaceutical preparations. Parenteral administration may refer to administration via a route other than oral such as rectal, intravenous, peritoneal, muscular, arterial, transdermal, nasal, inhaled, ocular and subcutaneous. When the beta cell specific liposome nanocarrier of the present invention is used as a medicine, it may further contain one or more active ingredients exhibiting the same or similar functions.

즉, 본 발명의 베타 세포 특이적 리포좀 나노전달체는 실제로 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(Witepsol), 마크로골, 트윈(Tween) 61, 카카오지, 리우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. That is, the beta cell specific liposome nanocarriers of the present invention can be administered in various parenteral formulations, and when formulated, diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, etc. that are commonly used. Is prepared using. Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories. As the non-aqueous solvent and the suspension solvent, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used. As the base of the suppository, Whitepsol, macrogol, Tween 61, cacao butter, uririnji, glycerogelatin and the like can be used.

또한, 본 발명의 베타 세포 특이적 리포좀 나노전달체는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(Carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 탄수화물, 아스코르브산(Ascorbic acid) 또는 글루타치온(Glutathione)과 같은 항산화제(Antioxidants), 킬레이트화제(Chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(Stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.In addition, the beta cell specific liposome nanocarriers of the present invention can be used in admixture with various carriers accepted as a medicament, such as physiological saline or organic solvents, and in order to increase stability or absorption, glucose, sucrose or dextran Carbohydrates such as, ascorbic acid or antioxidants such as glutathione, chelating agents, small molecule proteins or other stabilizers can be used as medicaments.

본 발명의 베타 세포 특이적 리포좀 나노전달체의 유효용량은 0.01 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.1 내지 10 ㎎/㎏ 이며, 하루 1회 내지 3회 투여될 수 있다.The effective dose of the beta cell specific liposome nanocarrier of the present invention is 0.01 to 100 mg / kg, preferably 0.1 to 10 mg / kg, and may be administered once to three times a day.

본 발명의 약학적 조성물에서 본 발명의 베타 세포 특이적 리포좀 나노전달체의 총 유효량은 볼루스(Bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 주입(Infusion) 등에 의해 단일 투여량(Single does)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(Multiple does)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(Fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로 이러한 점을 고려할 때, 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 베타 세포 특이적 리포좀 나노전달체의 약학적 조성물로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다.In the pharmaceutical composition of the present invention, the total effective amount of the beta cell specific liposome nanocarrier of the present invention is administered to the patient in a single dose by bolus form or infusion for a relatively short period of time. Multiple doses may be administered by a long term administered Fractionated treatment protocol. Since the concentration is determined by taking into consideration various factors such as the age and health condition of the patient as well as the route of administration and the number of treatments of the drug, in view of the above, the present invention is a person having ordinary skill in the art. Appropriate effective dosages of beta cell specific liposome nanocarriers can be determined according to the particular use as pharmaceutical compositions.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention, it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not to be construed as limited by these examples.

베타세포 특이적 리간드를 포함하는 miRNA 리포좀의 제조Preparation of miRNA liposomes containing beta cell specific ligands

본 발명에서 제공하고자 하는, 베타세포 특이적인 리간드를 포함하면서, miRNA를 담지하는 리포좀을 제조하였다(도 1). 이 때 사용한 베타세포 특이적인 리간드는 GLP-1 펩타이드이며, 상기 리포좀은 인지질의 리포좀 구조 내에 당뇨병 치료를 위한 miRNA를 담지하고, 리포좀 외부에는 췌장의 베타세포를 특이적으로 인식할 수 있는 GLP-1 펩타이드로 표지되어 있는 구조를 이루고 있다.To provide a liposome carrying a miRNA, including a beta cell specific ligand to be provided in the present invention (Fig. 1). The beta cell specific ligand used at this time is a GLP-1 peptide, and the liposome carries miRNA for the treatment of diabetes in the liposome structure of phospholipid, and the GLP-1 which can specifically recognize the beta cells of the pancreas outside the liposome. It is a structure labeled with a peptide.

먼저, miRNA로서는 negative miRNA를 사용하였으며, 2 nmol의 negative miRNA를 500 ㎕ 증류수에 용해하여 준비하였다. 그런 다음, 1 nmol miRNA에 대하여 8.588 ㎍의 농도가 되도록, 양이온성 인지질인 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP; 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane)을 500 ㎕ 클로로포름에 용해시키고, 1040 ㎕ 메탄올을 더해 단일층이 되도록 혼합하였다. 각각 준비한 miRNA 용액 및 DOTAP 용액은 실온에서 30 분간 보관한 다음, 이들을 혼합하였다. 혼합한 용액은 4℃에서 800×g로 8 분간 원심분리하여 이중층이 되도록 분리한 후, 이 중 유기용매층(상층)만을 분별하여, DOTAP-miRNA 혼합물로서 추출하였다. 추출한 DOTAP-miRNA 혼합물에, 건조 지질로서 HSPC(hydrogenated soy phosphatidylcholine): DSPE-PEG2k(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000]): Chol(cholestrol): DSPE-PEG2k-maleimide(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000])을 각각 106.96 ㎍, 22.44 ㎍, 34.57 ㎍, 13.76 ㎍으로 첨가하였다. 그런 다음, 혼합물에 500 ㎕의 증류수를 혼합하고 볼텍싱하여 20 초간 혼합한 후, 2 분간 초음파를 가하여 에멀젼화해, DOTAP-miRNA 및 지질의 리포좀을 포함하는 혼합물을 수득하였다. 혼합물은 진공 데시게이터(vacuum desiccator)를 사용하여 유기용매층을 증발시켰다. 30 분 후, 다시 500 ㎕의 증류수를 혼합물에 가하고, 유기용매층이 모두 없어질 때까지 진공 데시게이터에서 유기용매를 모두 증발시켰다. 유기용매가 모두 증발되면, 55℃에서 100 ㎚의 폴리카보네이트 막(polycarbonate membrane)으로 나노파티클 입자를 석출하였다. 그런 다음, 나노파티클 입자에 14 nmol의 GLP-1 유사체 펩타이드(exenatide peptide)를 가해 혼합한 다음, 100 kDa 아미콘 필터를 이용하여 나노파티클에 결합되지 않은 자유 펩타이드를 제거하고, 최종적으로 miRNA를 담지한 리포좀(miRNA cationic coated liposome; miRNA-CCL)을 수득하였다.First, negative miRNA was used as a miRNA, and 2 nmol of negative miRNA was prepared by dissolving in 500 μl distilled water. Then cationic phospholipid 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (DOTAP; 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane) was added at a concentration of 8.588 μg for 1 nmol miRNA. It was dissolved in [mu] l chloroform and 1040 [mu] l methanol was added and mixed to form a single layer. Each prepared miRNA solution and DOTAP solution were stored at room temperature for 30 minutes and then mixed. The mixed solution was centrifuged at 800 × g for 8 minutes at 4 ° C., separated into a double layer, and then only an organic solvent layer (upper layer) was separated and extracted as a DOTAP-miRNA mixture. In the extracted DOTAP-miRNA mixture, as a dry lipid, HSPC (hydrogenated soy phosphatidylcholine): DSPE-PEG2k (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [amino (polyethylene glycol) -2000]): Chol ( cholestrol): added DSPE-PEG2k-maleimide (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [maleimide (polyethylene glycol) -2000]) at 106.96 μg, 22.44 μg, 34.57 μg and 13.76 μg respectively It was. Thereafter, 500 µl of distilled water was mixed with the mixture, vortexed, mixed for 20 seconds, and then emulsified by applying ultrasonic waves for 2 minutes to obtain a mixture including liposomes of DOTAP-miRNA and lipids. The mixture was evaporated to an organic solvent layer using a vacuum desiccator. After 30 minutes, 500 μl of distilled water was further added to the mixture, and all organic solvents were evaporated in a vacuum desiccator until all organic solvent layers were gone. When all of the organic solvent was evaporated, nanoparticle particles were precipitated with a polycarbonate membrane of 100 nm at 55 ℃. Then, 14 nmol of GLP-1 analog peptide (exenatide peptide) was added to the nanoparticle particles, mixed, and then the free peptide not bound to the nanoparticles was removed using a 100 kDa Amicon filter, and finally the miRNA was loaded. One liposome (miRNA cationic coated liposome; miRNA-CCL) was obtained.

상기 GLP-1 유사체 펩타이드로서, 엑센딘-4(Exendin-4)를 사용하였다. 엑센딘-4은 총 39 개의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드로서, N터미널 및 C터미널을 가지는 Ex-4(1-39) 펩타이드를 전장 서열로서 사용하였다. Ex-4(1-39) 펩타이드 중, N터미널을 제거한 Ex-4(9-39) 펩타이드; 및 C터미널과 N터미널이 모두 제거된 Ex-4(9-30)를 각각 사용하여 miRNA를 담지한 리포좀에 이용하였다. 비교 펩타이드로서, ABCC8 펩타이드(SUR-1)을 사용하였다.As the GLP-1 analog peptide, Exendin-4 was used. Exendin-4 is a peptide having a total of 39 amino acid sequences, and an Ex-4 (1-39) peptide having N and C terminals was used as the full length sequence. Ex-4 (9-39) peptides having N terminals removed from among Ex-4 (1-39) peptides; And Ex-4 (9-30), in which both C and N terminals were removed, were used for liposomes carrying miRNA. As a comparative peptide, ABCC8 peptide (SUR-1) was used.

펩타이드의 최적 농도를 확인하기 위해, Ex-4(9-30)의 농도는 리포좀 구조체에 포함된 말레이미드(maleimide)의 몰 수 대비 2배, 3배, 4배 및 5배로 혼합하여 리포좀 나노구조체를 제조하였다(Ex-4(9-30) 2x; Ex-4(9-30) 3x; Ex-4(9-30) 4x; 및 Ex-4(9-30) 5x).In order to determine the optimal concentration of the peptide, the concentration of Ex-4 (9-30) is mixed with 2 times, 3 times, 4 times and 5 times the number of moles of maleimide contained in the liposome structure to form liposome nanostructures. Were prepared (Ex-4 (9-30) 2x; Ex-4 (9-30) 3x; Ex-4 (9-30) 4x; and Ex-4 (9-30) 5x).

최종적으로 제조한 miRNA 리포좀 나노구조체는 크기 및 표면 전하(zeta-potential)를 측정하여 펩타이드 유무에 따른 나노구조체의 크기를 확인하였다. 또한, 제조한 나노구조체는 10% FBS 용액에 용해하고 37℃에서 50 시간 동안 보관하면서, 시간대별로 입자의 크기의 변화를 확인하여 리포좀 나노구조체의 안정성(stability)을 확인하였다.Finally, the prepared miRNA liposome nanostructure was determined by measuring the size and surface charge (zeta-potential) to determine the size of the nanostructure according to the presence or absence of the peptide. In addition, the prepared nanostructures were dissolved in 10% FBS solution and stored at 37 ° C. for 50 hours, and the stability of the liposome nanostructures was confirmed by checking the change in particle size with time.

그 결과, 하기 [표 1]에서 나타난 바와 같이 펩타이드로 표지하지 않은 리포좀 구조체에 비해, 첨가한 펩타이드의 농도가 증가할 수록 나노구조체의 크기(직경)이 증가하고 표면 전하 역시 -9.73 ㎷에서 -8.12 ㎷ 내지 -7.22 ㎷로 증가하는 것을 확인하였다(표 1). 또한, 도 2에서 나타난 바와 같이 리포좀 나노구조체는 24 시간까지 입자의 크기가 유의적으로 증가하지 않다가 24 시간 동안 보관한 이후부터 서서히 입자가 뭉져짐을 확인하여, 24 시간 동안 구조적으로 안정함을 유지할 수 있는 것으로 확인하였다(도 2).As a result, as shown in Table 1 below, as the concentration of the added peptide increases, the size (diameter) of the nanostructure increases and the surface charge also increases from -9.73 kPa to -8.12 as compared to the liposome construct not labeled with the peptide. It was confirmed to increase from ㎷ to -7.22 ㎷ (Table 1). In addition, as shown in FIG. 2, the liposome nanostructure is not significantly increased in size until 24 hours, but after storage for 24 hours, particles are gradually agglomerated to maintain structural stability for 24 hours. It was confirmed that it can be (Fig. 2).

실험군 명Experimental group No peptideNo peptide Ex-4(9-30) 2xEx-4 (9-30) 2x Ex-4(9-30) 3xEx-4 (9-30) 3x Ex-4(9-30) 4xEx-4 (9-30) 4x 크기(㎚)Size (nm) 119.2119.2 177.6177.6 208.1208.1 254.9254.9 표면전하(㎷)Surface charge -9.73-9.73 -7.56-7.56 -8.12-8.12 -7.22-7.22

베타세포 특이적 리간드를 포함하는 miRNA 리포좀의 베타세포 표적능 확인Confirmation of beta cell target ability of miRNA liposomes containing beta cell specific ligand

<2-1> 표면 펩타이드 리간드의 종류에 따른 세포 내 전달 효율성 비교<2-1> Comparison of Intracellular Delivery Efficiency According to Types of Surface Peptide Ligands

췌장의 베타 세포에 특이적으로 miRNA를 전달함에 있어서, 리포좀 표면의 리간드를 최적의 효과로 적용할 수 있도록 하는 조건을 선별하기 위해, INS-1 세포에 대한 세포 내 흡수 효율을 확인하였다.In the delivery of miRNA specifically to the beta cells of the pancreas, the intracellular uptake efficiency of INS-1 cells was confirmed in order to select conditions for applying the ligand on the surface of liposomes with an optimal effect.

구체적으로, 상기 [실시예 1]에서 miRNA 담지 리포좀을 제조함에 있어서, 표면 펩타이드로서 시스테인(cysteine), 엑센딘 4(Exendin 4; Ex-4(1-39)) 전장, Ex-4(9-39) 또는 Ex-4(9-30)를 표면에 결합시킨 리포좀 나노구조체를 제조하였다. 그런 다음, 췌장에서 인슐린을 분비하는 β-세포인 INS-1 세포주를 6-웰 플레이트에서 배양한 후, 붉은색 염료인 Dil로 표지한 리포좀 나노구조체를 처리해 4 시간 동안 배양하였다. 배양 종료 후, 형광 현미경으로 관찰하여 INS-1 세포 주변에 위치한 리포좀 나노구조체의 위치를 확인하였다. INS-1 세포는 호크스트(hoechst) 염색을 하여 위치를 확인하으며, 대조군(control)으로는 펩타이드로 표지되지 않은 miRNA 담지 리포좀 구조체(miRNA-CCL)을 사용하였다.Specifically, in the preparation of the miRNA-supported liposome in [Example 1], as the surface peptide, cysteine, exendin 4 (Exendin 4; Ex-4 (1-39)) full length, Ex-4 (9- 39) or liposome nanostructure was prepared by binding Ex-4 (9-30) to the surface. Then, the INS-1 cell line, which is a β-cell secreting insulin from the pancreas, was cultured in a 6-well plate, and then treated with liposome nanostructures labeled with the red dye Dil and incubated for 4 hours. After incubation, the fluorescence microscope was used to confirm the location of the liposome nanostructures located around the INS-1 cells. INS-1 cells were identified by hochst staining, and the control group used a miRNA-supported liposome construct (miRNA-CCL) not labeled with a peptide.

그 결과, 도 3 및 도 4에서 나타난 바와 같이 리포좀 구조체의 표면에 표지된 펩타이드에 따라 세포 내로 흡수(uptake)되는 정도의 차이를 나타내어, Ex-4(9-30) 펩타이드로 표지된 miRNA-CCL이 INS-1 세포 내로 흡수되는 전달 효율성이 가장 높은 것으로 확인하였다(도 3 및 도 4). As a result, the miRNA-CCL labeled with the Ex-4 (9-30) peptide showed a difference in the degree of uptake into the cells according to the peptide labeled on the surface of the liposome structure as shown in FIGS. 3 and 4. It was confirmed that the delivery efficiency absorbed into these INS-1 cells was the highest (FIGS. 3 and 4).

<2-2> 표면 펩타이드 리간드의 농도에 따른 베타 세포 내 전달 효율성 비교<2-2> Comparison of Delivery Efficiency in Beta Cells According to Surface Peptide Ligand Concentration

본 발명의 리포좀 나노구조체의 표면에 표지하는 베타세포 표적 리간드로서 Ex-4(9-30) 펩타이드를 사용하는 것이 가장 베타 세포로의 전달 효율이 높은 것을 확인하였으므로, 리포좀 구조체의 표면에 결합시키는 Ex-4(9-30) 펩타이드의 농도에 따른 전달 효율성을 확인하였다.Since the use of the Ex-4 (9-30) peptide as the beta cell target ligand labeled on the surface of the liposome nanostructure of the present invention was confirmed to have the highest transfer efficiency to the beta cells, Ex bound to the surface of the liposome structure The delivery efficiency was confirmed according to the concentration of -4 (9-30) peptide.

구체적으로, 상기 [실시예 1]의 방법으로 표면 펩타이드로서 Ex-4(9-30)를 표면에 결합시킨 리포좀 나노구조체를 제조할 때, 리포좀 제조에 사용한 말레이미드의 몰농도 대비 2 배 내지 4 배로 Ex-4(9-30) 펩타이드를 첨가하여 리포좀 구조체를 제조하였다. 그런 다음, 상기 실시예 <2-1>와 동일한 방법을 수행하여 각각의 리포좀 나노구조체가 INS-1 세포로 전달되는 전달 효율성을 확인하였다.Specifically, when preparing a liposome nanostructure in which Ex-4 (9-30) is bound to the surface as a surface peptide by the method of [Example 1], 2 to 4 times the molar concentration of the maleimide used for liposome preparation Liposomal constructs were prepared by adding Ex-4 (9-30) peptides in fold. Then, the same method as in Example <2-1> was performed to confirm the delivery efficiency of each liposome nanostructure delivered to INS-1 cells.

그 결과, 도 5에서 나타난 바와 같이 대조군으로 사용하기 위해 표면에 시스테인(cysteine)을 결합시킨 리포좀(miRNA-CCL)의 경우에는 전혀 세포 내로 흡수되지 못하는 것으로 확인한 반면, Ex-4(9-30) 펩타이드를 표면 표지한 리포좀은 INS-1 세포 내로 유의적인 흡수를 나타내는 것으로 확인하였다. 특히, Ex-4(9-30) 펩타이드의 농도에 따른 차이를 비교하였을 때, Ex-4(9-30) x3 실험군에서 리포좀 나노구조체가 INS-1 세포 내로 흡수된 수준이 가장 높은 것으로 확인하였다. Ex-4(9-30) x4 실험군에서는 오히려 Ex-4(9-30) x2 실험군에 비해 세포 내의 흡수 정도가 유의적으로 나타나지 않음을 확인하였는데, 이는 Ex-4(9-30) x4의 경우 리포좀 표면에 표지된 Ex-4(9-30) 펩타이드의 양이 과도하기 때문에 리포좀 입자가 불안정해지고, 이에 따라 리포좀 입자의 응집이 빠르게 나타나기 때문인 것으로 예상하였다. 실제로, Ex-4(9-30) x5 실험군에서는 빠른 속도로 리포좀 구조체가 응집되어 INS-1 세포에 유의적으로 흡수되지 않는 것으로 확인하였다.As a result, it was confirmed that the liposome (miRNA-CCL) having a cysteine bound to the surface for use as a control as shown in FIG. 5 was not absorbed into the cells at all, whereas Ex-4 (9-30) Liposomes surface-labeled with peptides were found to show significant uptake into INS-1 cells. In particular, when comparing the difference according to the concentration of the Ex-4 (9-30) peptide, it was confirmed that the level of uptake of liposomal nanostructures into INS-1 cells in the Ex-4 (9-30) x3 experimental group. . In the Ex-4 (9-30) x4 experimental group, it was confirmed that the degree of uptake in cells was not significant compared to the Ex-4 (9-30) x2 experimental group. It was expected that the liposome particles became unstable due to excessive amounts of the Ex-4 (9-30) peptide labeled on the surface of the liposome, and thus, the aggregation of the liposome particles appeared rapidly. Indeed, in the Ex-4 (9-30) x5 experimental group, it was confirmed that the liposome constructs aggregated rapidly and were not significantly absorbed by INS-1 cells.

Ex-4(9-30) 리간드를 표지한 miRNA 담지 리포좀의 베타세포에 대한 특이적 표적 유무 확인Identification of Specific Targets on Beta Cells of MiRNA Carrying Liposomes Labeled with Ex-4 (9-30) Ligand

Ex-4(9-30)를 표면에 표지한 리포좀 구조체가 췌장의 베타 세포에 대하여 흡수 효율이 유의적으로 높은 것으로 확인하여, 본 발명에서 선정한 Ex-4(9-30) 표지 리포좀이 췌장 베타 세포에 대하여만 특이적으로 표적능을 나타내는지 여부를 확인하고자 하였다.It was confirmed that the liposome construct labeled Ex-4 (9-30) on the surface of the pancreatic beta cells was significantly higher in absorption efficiency, and the Ex-4 (9-30) labeled liposomes selected in the present invention were expressed in pancreatic beta. The purpose of this study was to determine whether the cells show specific target ability only.

구체적으로, 상기 [실시예 2]와 동일한 방법을 수행하여 Ex-4(9-30) x3 리포좀을 준비한 다음, INS-1 세포 실험군에 더해, 간세포주인 HepG2 세포, 췌관세포주(ductal cell)인 PANC-1 세포, 지방 세포주인 3T3L1 세포 및 피부유래 세포인 섬유아세포(fibroblast)를 대상으로 세포내 흡수 여부를 확인하였다.Specifically, Ex-4 (9-30) x3 liposomes were prepared by performing the same method as in [Example 2], and then, in addition to the INS-1 cell experimental group, hepatic cell line HepG2 cells and pancreatic cell line (ductal cell) PANC Intracellular uptake was confirmed in -1 cells, fat cell lines 3T3L1 cells and skin-derived cells fibroblasts (fibroblast).

그 결과, 도 6에서 나타난 바와 같이 본 발명의 Ex-4(9-30) x3 리포좀은 췌장 베타 세포인 INS-1 세포로 전달이 효과적으로 나타나는 것을 확인하였다. 이 외의 세포 중 지방 세포인 3T3-L1 세포에 대하여 일부 리포좀이 흡수된 것으로 확인되나, 유의적인 수준으로 나타나지 않았으며, 이외 세포에서는 리포좀이 표적능을 나타내지 않아 세포 내 흡수가 이루어지지 않은 것을 확인하였다.As a result, as shown in Figure 6 Ex-4 (9-30) x3 liposomes of the present invention was confirmed that the delivery to INS-1 cells, which are pancreatic beta cells. It was confirmed that some liposomes were absorbed to 3T3-L1 cells, which are fat cells, but did not appear at a significant level. In other cells, the liposomes did not show the target ability and thus did not undergo intracellular uptake. .

<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> A liposome for delivering miRNA using a specific ligand to pancreatic beta cell <130> 1063327 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 39 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 2 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu 1 5 10 15 Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 20 25 30 <210> 3 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu 1 5 10 15 Trp Leu Lys Asn Gly Gly 20 <110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> A liposome for delivering miRNA using a specific ligand to          pancreatic beta cell <130> 1063327 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 39 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu   1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser              20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser          35 <210> 2 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu   1 5 10 15 Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser              20 25 30 <210> 3 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu   1 5 10 15 Trp Leu Lys Asn Gly Gly              20

Claims (8)

miRNA를 담지하고, 내부층 인지질로 양이온성 인지질을 포함하는, miRNA 전달용 리포좀 나노전달체로서,
상기 리포좀 나노전달체의 외부층 인지질로 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[말레이미드(폴리에틸렌글리콜)-2000](1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000]; DSPE-PEG2k-maleimide)을 포함하고,
상기 말레이미드에 췌장 베타 세포 표적능을 가지는 펩타이드가 결합된,
리포좀 나노전달체.
A liposome nanocarrier for miRNA delivery, carrying a miRNA and including a cationic phospholipid as an inner layer phospholipid,
1,2-dstearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [maleimide (polyethylene glycol) -2000] (1,2-distearoyl-sn) as an outer layer phospholipid of the liposome nanocarrier -glycero-3-phosphoethanolamine-N- [maleimide (polyethylene glycol) -2000]; DSPE-PEG2k-maleimide),
The peptide having pancreatic beta cell targeting ability is bound to the maleimide,
Liposome nanocarriers.
제 1항에 있어서, 상기 miRNA는 miR-30a-5p, miR-374 및 miR-137로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 리포좀 나노전달체.
The liposome nanocarrier of claim 1, wherein the miRNA is at least one selected from the group consisting of miR-30a-5p, miR-374 and miR-137.
제 1항에 있어서, 상기 양이온성 인지질은 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP; 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane)인 것을 특징으로 하는, 리포좀 나노전달체.
The liposome nanocarrier according to claim 1, wherein the cationic phospholipid is 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (DOTAP; 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane).
제 1항에 있어서, 상기 외부층 인지질은, 하이드로제네티드 대두 포스파티딜콜린(hydrogenated soy phosphatidylcholine; HSPC), 1,2-디르테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌 글리콜)-2000])(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000]; DSPE-PEG2k) 및 콜레스테롤(cholestrol; Chol)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 리포좀 나노전달체.
The method of claim 1, wherein the outer layer phospholipid is hydrogenated soy phosphatidylcholine (HSPC), 1,2-ditearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [amino (Polyethylene glycol) -2000]) (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [amino (polyethylene glycol) -2000]; DSPE-PEG2k) and cholesterol (cholestrol; Chol) Liposome nanocarrier, characterized in that it further comprises any one or more selected.
제 1항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 엑센딘-4(exendin-4) 펩타이드, 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 Ex-4(9-39) 펩타이드 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성되는 Ex-4(9-30) 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 리포좀 나노 전달체.
According to claim 1, wherein the peptide is an exendin-4 (exendin-4) peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, Ex-4 (9-39) peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: Liposome nano-carrier, characterized in that any one or more selected from the group consisting of Ex-4 (9-30) peptide consisting of the amino acid sequence of 3.
제 1항에 있어서, 상기 펩타이드의 함량은, 펩타이드 및 말레이미드가 1:1 내지 4:1의 몰비율이 되도록 포함되는 것을 특징으로 하는, 리포좀 나노 전달체.
According to claim 1, wherein the content of the peptide, the liposome nano-carrier, characterized in that the peptide and maleimide is included in a molar ratio of 1: 1 to 4: 1.
제 1항의 miRNA 전달용 리포좀 나노 전달체를 유효성분으로 포함하는, 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
Claim 1, comprising a liposome nano-carrier for miRNA delivery as an active ingredient, a pharmaceutical composition for preventing or treating diabetes.
제 7항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 췌장의 베타 세포를 특이적으로 표적하는 것을 특징으로 하는, 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
The pharmaceutical composition for preventing or treating diabetes of claim 7, wherein the pharmaceutical composition specifically targets the beta cells of the pancreas.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20120024626A (en) * 2009-04-23 2012-03-14 펙바이오 컴퍼니 리미티드 Novel exendin variant and conjugate thereof
KR20150134628A (en) * 2014-05-22 2015-12-02 가톨릭대학교 산학협력단 Pharmaceutical composition for treating or preventing diabetes mellitus comprising mir-137

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