KR20190105568A - 종양의 면역 요법적 치료 방법 - Google Patents

종양의 면역 요법적 치료 방법 Download PDF

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데보라 에이치 체리치
빌렘 오베르바이크
패트릭 후
미누 샤르마
조나단 잘레브스키
아디 디아브
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넥타르 테라퓨틱스
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Abstract

본원에는 대상체에 지속 작용성 IL-2Rαβ 편향 효현제를 투여함과 아울러 암 백신을 투여함으로써 암이 발병한 대상체를 치료하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다.

Description

종양의 면역 요법적 치료 방법
관련 출원들에 대한 상호 참조
본 출원은 35 U.S.C. §119(e) 하에, 2016년 11월 10일에 출원된 미국 가출원 62/420,442, 그리고 2017년 11월 7일에 출원된 미국 가출원 62/582,852에 대해 우선권의 이익을 주장하며, 이들의 개시내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
분야
본 출원은 (여타의 것들 중에서도) 면역 요법 분야, 특정 양태에서는 암의 면역 요법 분야에 관한 것으로서, 개체에게 지속 작용성 IL-2Rαβ 편향 효현제를 투여함과 아울러 암 백신을 투여함으로써 암이 발병한 개체를 치료하는 것을 수반한다.
치료적 암 백신은 대상체의 면역계가 감염 및 질환과 싸우는 능력을 자극하거나 회복시킴으로써 작용하는 물질의 군을 나타낸다. 예방적 또는 예방학적 백신과는 반대로, 치료적 백신은 암에 대한 몸의 자연 면역 반응을 증강시켜 현재 발병한 암을 치료하는 데 사용되는 것으로서, 면역 치료의 한 유형을 대표한다. 암 치료용 백신은 세포독성 T 세포를 활성화하여, 이것이 특정 유형의 암을 인지하여 이에 맞서 작용하게 하거나, 암 세포 표면에 존재하는 분자와 결합하는 항체의 생산을 유도하도록 디자인된다. 그러나, 백신 개입은 암을 지속시키고자 작동하는 기작에 의해 억제되는 몸의 면역계와 분투하여야 하므로, 유효한 치료적 백신을 제조하는 것은 도전적인 노력임이 증명되었다. 치료적 암 백신을 유효하게 만들기 위해, 이 백신은 의도로 하는 표적에 대해 특이적인 면역 반응을 자극하여야 할 뿐만 아니라, 암 세포가, 암 세포 자신을 살해 T 세포에 의한 공격으로부터 보호하기 위해 이용하는 장벽을 극복하기에 충분히 강력하여야 한다. 지난 수년 동안 다양한 플랫폼을 포함하는 치료적 백신을 개발하는 데 상당한 노력이 행하여졌지만, 현재까지 오로지 하나의 백신, 즉 Provenge®(시플루칼(sipuleucal)-T, 자가 백신)만이 FDA의 승인을 받았다. 치료적 백신은, 예를 들어 유방암, 폐암, 흑색종, 췌장암, 결장직장암 및 신장암 환자를 대상으로 평가된 바 있다(Melero, I., et al., Nat Rev Clin Oncol, 2014, 11 (9), 509-524).
면역화 항암 전략을 개선하기 위해, 아주반트와 같은 물질이 백신에 첨가됨으로써, 강력한 항암 면역 반응을 유도하는 백신의 능력이 증강될 수 있지만, 이와 같은 개선된 반응은 종종 부분적이고/부분적이거나 일시적일 수 있다. 암 백신용 아주반트는 다양한 공급원, 예컨대 세균, 세균에 의해 생산된 물질, 단백질 그리고 합성 또는 자연 사이토카인으로부터 유래할 수 있다. 사이토카인을 비롯한 다양한 물질이 백신 유도 항암 활성을 증진시키는지에 대해 연구되어 왔다. 일부 사이토카인은 유효한 아주반트로서의 역할을 하는 것으로 보이지만, 다른 것들은 놀랍게도 백신 효능을 조정하는 데 유효하지 않음이 발견되었다. 암 치료 백신에 사용된 사이토카인은, 예컨대 IL-2, 인터페론-알파 및 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)를 포함한다.
비록 지금까지 다양한 플랫폼을 포함하는 치료적 백신을 개발하는 데 상당한 노력들이 기울여져 왔지만, 신규하고 더 유효한 면역 요법 백신, 그리고 관련 치료 계획을 동정 및 제공하여야 할 필요가 남아있다. 그러므로 본 개시내용은 이러한 필요와 기타 다른 필요를 충족시켜줄 방법을 도모하고자 한다.
제1 양태에서, 본원에는 암이 발병한 대상체에 백신과 IL-2Rβ 활성화량만큼의 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제(이하 본원에서 더 상세히 설명됨)를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
제2 양태에서, 본원에는 암이 발병한 대상체에 치료적 암 백신과 IL-2Rβ 활성화량만큼의 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제를 투여하는 단계를 포함하는, 암 백신의 치료적 효능을 증진시키는 방법이 제공되는데, 여기서 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제는 백신에 대한 대상체의 반응을 개선하는 데 유효하다.
또 다른 추가의 제3 양태에서, 본원에는 IL-2Rβ 활성화량만큼의 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제와 암 치료 유효량만큼의 백신을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법이 제공되는데, 여기서 암의 마우스 모델을 대상으로 평가가 이루어질 때 이 치료는, 백신과 비 지속 작용성 형태의 IL-2R 효현제를 투여하는 것에 비하여, 두 치료 계획에 있어서의 50% 최대 종양 성장률 사이의 시간상의 지연을 바탕으로 하였을 때 마우스 생존을 적어도 15일까지 연장하여 주는 데 유효하다.
또 다른 제4 양태에서, 본 개시내용은 IL-2Rβ 활성화량만큼의 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제와 암성 종양 치료 유효량만큼의 백신을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료중인 대상체 내에 조절 T 세포(Treg)가 축적되는 것을 억제하는 방법을 제공하는데, 여기서 암의 마우스 모델을 대상으로 평가가 이루어질 때 이 치료는, CD4+ Treg, CD25+ Treg, 및 FoxP3+ Treg로 구성된 군으로부터 선택되는 조절 T 세포의 종양내 축적을, 비 지속 작용성 형태의 IL-2R 효현제 및 백신이 투여되었을 때 관찰되는 정도에 비하여 증가한 정도로 억제하는 데 유효하다.
백신과 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제의 투여 순서에 관한 명확성을 도모하기 위하여, 이 백신 및 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제는 동시에 투여될 수 있거나, 또는 순차적 그리고 임의의 순서로 투여될 수 있으며, 동일하고/동일하거나 상이한 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 게다가 치료는 단일 회차 치료법을 포함할 수 있거나, 또는 다수 회차 치료법을 포함할 수 있다.
본원에 제공된 양태들 또는 구현예들 중 임의의 것 하나 이상에 관련된 하나 이상의 구현예에서, 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제는 약 0.7 mg/kg 이하의 용량으로 투여된다. 하나 이상의 특정 구현예에서, 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제는 약 0.7 mg/kg 미만의 용량으로 투여된다.
상기 양태들 중 임의의 것 하나 이상에 관련된 하나 이상의 구현예에서, 백신은 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제와는 별도로 대상체에 투여된다.
또 다른 하나 이상의 추가 구현예에서, 백신은 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제가 투여되기 전에 대상체에 투여된다. 예를 들어 하나 이상의 구현예에서, 백신 및 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제는 둘 다 치료 1일차에 투여된다. 하나 이상의 대안적 구현예에서, 백신은 치료 1일차에 투여되고, 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제는 치료 1일차 내지 4일차 중 임의의 한 날에 투여된다. 예를 들어 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제는 치료 1, 2, 3 또는 4일차 중 임의의 한 날에 투여되거나, 또는 심지어 그보다 이후에 투여된다.
몇몇 구현예들에서, 대상체는 인간 대상체이다.
하나 이상의 추가의 구현예들에서, 암은 고형암이다. 예를 들어 암은 유방암, 난소암, 결장암, 전립선암, 골암, 결장직장암, 위암, 림프종, 악성 흑색종, 간암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 췌장암, 갑상샘암, 신장암, 담관의 암, 뇌암, 자궁경부암, 상악동암, 방광암, 식도암, 호지킨병 및 부신피질암으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
또 다른 하나 이상의 추가의 구현예들에서, 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제는 약 0.7 mg/kg 이하 내지 약 0.2 mg/kg 이하의 범위의 용량으로 투여된다. 또 다른 하나 이상의 추가의 구현예들에서, 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제는 약 0.7 mg/kg 미만 내지 약 0.2 mg/kg 미만의 범위의 용량으로 투여된다. 몇몇 추가의 구현예들에서, 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제는 약 0.7 mg/kg 이하 내지 약 0.3 mg/kg 이하의 용량, 또는 약 0.7 mg/kg 이하 내지 약 0.5 mg/kg 이하의 범위의 용량으로 투여된다. 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제의 예시적 투여량은, 예를 들어 0.7 mg/kg; 0.65 mg/kg, 0.6 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.3 mg/kg 및 0.2 mg/kg을 포함한다.
상기 양태들 중 임의의 것 하나 이상에 관련된 몇몇 구현예들에서, 고형 암성 종양 치료시 본 방법은 치료 1회차 이후에 평가되었을 때 고형 종양 크기의 적어도 약 25% 감소를 달성하는 데 유효하다.
몇몇 구현예들에서, 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제는 폴리에틸렌 글리콜에 방출가능하도록 공유 부착된 알데스루킨을 포함한다. 또 다른 몇몇 추가의 구현예들에서, 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제는 4, 5 및 6개의 폴리에틸렌 글리콜 중합체에 방출가능하도록 공유 부착된 알데스루킨을 포함한다. 또 다른 몇몇 추가의 구현예들에서, 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제는 평균 약 6개의 폴리에틸렌 글리콜 중합체에 방출 가능하도록 공유 부착된 알데스루킨을 포함한다. 하나 이상의 추가의 구현예들에서, 알데스루킨에 방출가능하도록 공유 부착된 폴리에틸렌 글리콜 중합체는 분지형이다.
상기 양태들 중 임의의 것 하나 이상에 관련된 또 다른 몇몇 추가의 구현예들에 있어서, 백신은, 예컨대 항원 백신, 전세포 백신, 수지상 세포 백신 및 DNA 백신으로부터 선택된다. 하나 이상의 구현예들에서, 백신은 동종유래 백신(allogenic vaccine)이다. 대안적으로 몇몇 구현예들에서, 백신은 자가 백신이다. 몇몇 추가의 특정 구현예들에서, 백신은 항원 백신이다. 하나 이상의 관련 구현예들에서, 항원 백신은 종양 특이적 항원을 포함한다. 예를 들어 몇몇 구현예들에서, 종양 특이적 항원은 고환암 항원, 분화 항원 및 범발 과발현 종양 연관 항원으로부터 선택된다.
또 다른 몇몇 추가의 구현예들에 있어서, 백신은 신생항원(neoantigen)을 포함한다.
또 다른 추가의 양태에서, 암 발병 대상체를 치료하는 데 사용하는 것에 관한 지침과 아울러, 백신 및 IL-2Rβ 활성화량만큼의 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제를 포함하는 키트가 제공된다.
키트에 관한 하나 이상의 구현예에서, 본 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제와 백신은 대상체의 투여를 위한 단일 조성물에 포함되는데, 이 단일 조성물은 선택적으로 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다.
키트에 관한 몇몇 대안적 구현예들에서, 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제 및 백신은 별도의 용기에 제공되고, 이 키트는 백신과 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제를 대상체에 별도로 투여하는 것에 관한 지침을 포함한다.
키트에 관한 몇몇 구현예들에서, 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제 및 백신 둘 다는 고체의 형태를 가진다. 하나 이상의 관련 구현예들에서, 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제 및 백신은 수성 희석제 중 재구성에 적합한 고체의 형태를 가진다.
또 다른 하나 이상의 추가 구현예들에서, 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제 및 백신 각각은 별도의 조성물(이 조성물 각각은 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함함) 중에 포함된다.
또 다른 몇몇 추가의 구현예들에서, 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제를 포함하는 조성물과, 백신을 포함하는 조성물 둘 다는 5 중량% 미만의 물을 함유한다.
추가의 양태들 및 구현예들이 하기 상세한 설명 및 청구범위에 제시되어 있는데, 본 개시내용은 이와 관련하여 제한되는 것으로 해석되어서는 안 된다.
도 1a 내지 1h. 이 도면들은 실시예 2에 상세히 기술된 바와 같이, RSLAIL-2를 1회 투여하거나 또는 알데스루킨을 매일 투여하여 5회 투여하는 처리를 받은 B16F10 마우스 흑색종 모델에 있어서 면역 세포 변경을 도시한 것이다. 표시된 시점에 종양 침윤성 림프구가 동물로부터 분리되었으며, 면역 세포 집단은 유세포 분석에 의해 평가되었다. 각각의 데이터 점은 개별 마우스 종양을 나타내고, 선은 평균을 나타낸다. 데이터는 2회 내지 4회의 독립된 연구 결과와 각 시점에서의 3회 내지 4회의 중복 실험 결과를 합한 것이다. 도 1a는 비히클(○), 알데스루킨(■) 및 RSLAIL-2(▲) 각각을 처리한 후 다양한 시점(5, 7 및 10일)에서 종양 중 CD8 T 세포의 총 백분율을 나타내는 것이고; 도 1b는 비히클(○), 알데스루킨(■) 및 RSLAIL-2(▲) 각각을 처리한 후 다양한 시점에서 종양 중 기억 CD8 T 세포의 백분율을 나타내는 것이며; 도 1c는 비히클(○), 알데스루킨(■) 및 RSLAIL-2(▲) 각각을 처리한 후 다양한 시점(5, 7 및 10일)에서 종양 중 활성화된 NK 세포의 백분율을 나타내는 것이고; 도 1d 및 1e는 처리 후 다양한 시점(5, 7 및 10일)에서 종양 중 CD4 T 세포의 백분율을 나타내는 것이며; 도 1f는 처리 후 다양한 시점(5, 7 및 10일)에서 종양 중 CD4 Treg 세포의 백분율을 나타내는 것이고; 도 1g는 처리 후 총 CD4 세포 중 Treg 세포의 백분율을 나타내는 것이며; 도 1h는 처리 후 총 CD8 세포 대 Treg 세포의 비를 제공한다.
도 2는 실시예 3에 기술된 바와 같이, 비변형 IL-1(알데스루킨, ▼)의 종양 약동학에 비한, RSLAIL-2(■)(및 이의 방출된 활성 컨쥬게이션된 IL-2 형태(●))의 종양 약동학을 나타내는 그래프이다.
도 3a 내지 3h는 상세하게 실시예 4의 다양한 처리군에 대해 상세히 기술된 바와 같이, 확립된 피하 B16 종양을 보유하는 C57BL/6 마우스에서 (i) GP-100, 즉 예시적 펩타이드 백신을 함유하는 칵테일 제형; 항 CD40 mAb; 및 TLR-7 효현제인, R848(레시퀴모드(Resiquimod), 이미다조퀴놀린)에 의한 단독 백신화; 또는 (ii) 지속 작용성 IL-2Rαβ 편향 효현제인, RSLAIL-2(IL-2 기준 0.2 mg/kg)와의 조합에 의한 백신화; 또는 (iii) 고용량 또는 저용량 비변형 IL-2(알데스루킨) 중 어느 하나와의 조합에 의한 백신화가 후속되는 처리 과정 동안의 종양 크기(mm2)를 나타내는 플롯이다.
도 4는 실시예 4에 상세히 기술된 연구 군 각각에 대한, 확립된 피하 B16 종양을 보유하는 C57BL/6 마우스에서의 처리 과정 동안의 평균 종양 크기(mm2)를 나타내는 그래프이다.
도 5는 실시예 4에 상세히 기술된 연구 군 각각에 대한, 확립된 피하 B16 종양을 보유하는 C57BL/6 마우스에서의 처리 과정 동안의 gp100 특이적 T 세포 기능과 연관된 플롯, 즉 IFN-g+ T 세포(pmel-1의 백분율로 표현됨)를 나타내는 플롯이다. 이 플롯은, 90%를 초과하는 안정적이고 지속적인 IGN-g+T 세포(pmel-1) 반응이 GP100/항 CD40/TRL-7 효현제/RSLAIL-2 처리군 백신화 후 약 40일까지 이어지고; 백신/RSLAIL-2 조합 요법은 상기 처리군이 기타 다른 처리군에 비하여 IFN-g+ T 세포(pmel-1) 반응의 최고의 백분율을 유지하였음을 나타내고 있다. 게다가 백신/RSAIL-2 조합 요법 유도성 IGN-g+T 세포(pmel-1) 반응은 기타 다른 처리군에서보다 더 느려지다가 감소하였다.
도 6은 실시예 4에 상세히 기술된 연구 군 각각에 대한, 확립된 피하 B16 종양을 보유하는 C57BL/6 마우스에서의 처리 과정 동안의 생존률 %를 나타내는 플롯이다. 처리 과정 동안의 종양 크기를 나타내는 플롯들(도 3a 내지 3h 및 도 4)과 일관되게, 백신/RSLAIL-2 처리군(GRP8)의 생존은 다른 처리군의 생존에 비하여 유의미하게 연장되었다.
도 7은 실시예 4에 기술된 연구 군 각각에 대한, 확립된 피하 B16 종양을 보유하는 C57BL/6 마우스에서의 처리 과정 동안의 pmel 세포 %(총 CD8+ T 세포의 백분율로 표현)를 나타내는 플롯이다. RSLAIL-2가 GP-100 백신과 조합되면, 펩타이드 백신 요법과 함께 행하여진 고용량 및 저용량 IL-1 처리 둘 다의 경우와 비교되었을 때 눈에 띄게 증가한 pmel-1 반응을 나타내었다.
도 8은 실시예 4에 기술된 연구 군 각각에 대한, 확립된 피하 B16 종양을 보유하는 C57BL/6 마우스에서의 처리 과정 동안 조절 T 세포, 즉 CD25+Foxp3+ T 세포를 CD4 세포의 백분율로 표현하여 나타내는 플롯이다. 이 플롯으로부터 볼 수 있는 바와 같이, RSLAIL-2 유도성 조절 T 세포의 백분율은 각각의 투여 회차 종료 즈음 급속하게 감소한다.
도 9는 실시예 5에 기술된 연구 군 각각에 대한, 확립된 피하 B16 종양을 보유하는 C57BL/6 마우스 내 처리 과정 중 5, 7, 10 및 30일 각각에서의 종양 1 그램당 Thy1.1+ pmel-1 세포 수를 나타내는 막대 그래프이다.
도 10은 실시예 5에 기술된 연구 군 각각에 대한, 확립된 피하 B16 종양을 보유하는 C57BL/6 마우스 내 5, 7, 10 및 30일 각각에서의 비장 조직 1 그램당 Thy1.1+ pmel-1 세포 수를 나타내는 막대 그래프이다.
도 11은 실시예(예컨대, 실시예 6 내지 9)에 기술된 바와 같이, CT26 마우스 종양 세포주로부터 유래한 신생항원 20개에 상응하는 NOUS-020 삽입 서열, 즉 서열 번호 5의 서열을 제공한다.
도 12a 및 12b. 실시예 6에 기술된 바와 같이, 도 12a 및 12b는 본원에 기술된 마우스 대상 연구에 사용할 예시적 마우스 신생항원 암 백신인 NOUS-020의 면역원성을 도시하는 것이다. 처녀 마우스에서의 면역화 3주 후에 측정된 T 세포 반응의, 단일 돌연변이된 펩타이드를 대상으로 한 IFN-γ ELISpot에 의한 분석 결과는 도 12a에 나타내었고, 20개 펩타이드 풀(pool)을 대상으로 한 세포내 사이토카인 염색에 의한 분석 결과는 도 12b에 나타내었다(펩타이드의 풀). 면역원성 펩타이드 5개(3, 10, 17, 18, 19번 펩타이드)에 대한 반응을 나타낸다. 에피토프 ID는 SFC가 반점 형성 세포(Spot Forming Cell)를 지칭하는 구조체 중 항원의 위치에 상응한다. 나타낸 바와 같이, 예시적 마우스 신생항원 암 백신인 NOUS-020 GAd는 CD4 T 세포 및 CD8 T 세포를 유도한다.
도 13a는 실시예 7에 기술된 연구에서 CD8 및 CD4 반응을 유도하는 신생항원을 나타내는 구조체의 개략도를 제공한다. 도 13b는 처녀 마우스에서 GAd/MVA 면역화 이후 측정된 T 세포 반응의, 백신 암호화 신생항원 20개의 풀을 대상으로 한 IFN-γ ELISpot에 의한 분석 결과를 제공한다.
도 14a 내지 14f는 실시예 8에 기술된 바와 같이, 처리가 안되었거나, NOUS-020 GAd 백신만이 단독 처리되었거나, RSLAIL-2만이 단독 처리되었거나, 또는 NOUS-020 GAd 백신과 RSLAIL-2이 조합 처리된 Balb/c 마우스에서의 CT26 종양 성장에 관한 플롯이다. 도 14a는 대조군(미처리)에 대한 결과를 제공하는 것이고; 도 14b는 GAd 백신만을 단독 처리한 마우스에 있어서의 CT26 종양 부피를 나타내는 것이며; 도 14c 및 14d는 RSLAIL-2로 처리되되(각각 0 또는 7일 중 임의의 한 날에 투여), 0일에 RSLAIL-2 및 GAd와 동시투여되거나(도 14e) 또는 순차 투여된(도 14f) 마우스에 있어 CT26 종양의 부피를 나타내는 것이다.
도 15a는 RSAIL-2만으로 단독 처리된, 확립된 종양을 가지는 개별 마우스에서의 종양 부피에 관한 플롯이고; 도 15b는 실시예 9에 기술된 바와 같이 NOUS-020 백신과 RSLAIL-2가 조합 처리된, 확립된 종양을 가지는 개별 마우스에서의 종양 부피에 관한 플롯이다. CR = 완전 반응, PR = 부분 반응(종양 수축률 40% 초과).
도 16a 및 16b는 실시예 9에 기술된 바와 같이, 54일에 (i) RSLAIL-2 단독 처리, 그리고 (ii) NOUS-020 및 RSLAIL-2 처리 각각에 반응하는 마우스의 비장을 대상으로 측정된 면역 반응 분석 결과를 제공한다. 백신에 의해 암호화된 면역원성 신생항원 상위 5개의 풀에 대한 T 세포 반응과 나머지 신생항원 15개에 대한 T 세포 반응은 ICS에 의해 정량되었다. 점선 및 실선은 CD4 T 세포 및 CD8 T 세포에 대한 양성 반응 각각의 역치값을 나타낸다.
도 17a는 실시예 10에 기술된 연구군 각각에 대한, 확립된 CT26 종양을 보유하는 BALB/c 마우스에서의 평균 종양 크기(mm2)를 나타내는 그래프이다. 도 17b는 실시예 10에 상세히 기술된 연구군 각각에 대한, 확립된 피하 CT26 종양을 보유하는 BALB/c 마우스의 처리 과정 동안의 생존률 %를 나타내는 플롯이다. 플롯과 일관되게, AH1 백신/RSLAIL-2 처리군에 대한 생존은 기타 다른 처리군에 대한 생존에 비하여 유의미하게 연장되었다.
도 18a는 실시예 10의 연구군 각각에 대해 기술된 바와 같이 처리되고, 확립된 피하 CT26 종양을 보유하는 BALB/c 마우스의 비장 조직 중 CD8+ T 세포 대 Treg의 비를 나타내는 막대 그래프이다. 도 18b는 실시예 10의 연구군 각각에 대해 기술된 바와 같이 처리되고, 확립된 피하 CT26 종양을 보유하는 BALB/c 마우스의 종양 조직 중 CD8+ T 세포 대 Treg의 비를 나타내는 막대 그래프이다.
용어
본 명세서에서 사용된 바와 같은 단수 형태("a", "an" 및 "the")는 문맥에서 달리 명확하게 지시되지 않는 한 복수의 대상을 포함한다.
본 개시내용의 특정의 특성을 기술하고 청구함에 있어서, 다음의 용어는 달리 지정되지 않는 한 이하에 기술된 정의에 따라 사용될 것이다.
본원에서 어떤 양태들이 "~를 포함하는"이란 용어와 함께 기술되더라도, "~로 구성된" 및/또는 "본질적으로 ~로 구성된"의 관점에서 기술된 다른 유사 양태들도 또한 제공된다는 것이 이해되어야 한다.
"수용성, 비-펩타이드 중합체"는 실온에서 수 중에 적어도 35%(중량 기준) 가용성인 중합체를 지칭한다. 그러나, 바람직한 수용성 비-펩타이드 중합체는, 바람직하게 70%(중량 기준)를 초과하고, 더 바람직하게는 95%(중량 기준)를 초과하여 수 중에서 가용성이다. 통상적으로 여과되지 않은 "수용성" 중합체의 수성 제조물은 여과 후 동일 용액이 투과시키는 광선 양의 적어도 75%를 투과시킨다. 바람직하게 이처럼 여과되지 않은 수성 제조물은 여과 후 동일 용액이 투과시키는 광선 양의 적어도 95%를 투과시킨다. 수중에서 적어도 95%(중량 기준) 가용성이거나 또는 수중에서 완전히 가용성인 수용성 중합체가 가장 바람직하다. "비펩타이드성"인 것에 대하여, 중합체는 그것이 아미노산 잔기의 35%(중량 기준) 미만을 함유할 때 비펩타이드성이다.
용어 "단량체", "단량체 서브유닛" 및 "단량체 단위"는 본 명세서에서 상호호환적으로 사용되며, 중합체의 기본 구조 단위 중 하나를 지칭한다. 동종중합체의 경우에, 단일 반복 구조 단위는 중합체를 형성한다. 공중합체의 경우에, 2개 이상의 구조적 단위가 (패턴으로 또는 무작위로) 반복되어 중합체를 형성한다. 본 발명과 관련하여 사용된 바람직한 중합체는 동종중합체이다. 수용성, 비펩타이드성 중합체는 연속으로 부착된 하나 이상의 단량체를 포함하여 단량체의 사슬을 형성한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "PEG" 또는 "폴리에틸렌글리콜"은 임의의 수용성 폴리(에틸렌옥사이드)를 포함하는 것으로 의미된다. 달리 나타내지 않는 한, "PEG 중합체" 또는 폴리에틸렌글리콜은, 중합체가, 예를 들어 컨쥬게이션을 위해 별개의 말단 캡핑 모이어티 또는 작용기를 함유할 수도 있지만, 실질적으로 모든(바람직하게는 모든) 단량체 서브유닛이 에틸렌옥사이드 서브유닛인 것이다. 본 발명에서 사용을 위한 PEG 중합체는 2 가지의 구조, 즉 말단의 산소(들)가, 예를 들어 합성 전환 동안 대체되었는지 여부에 따라서 "-(CH2CH2O)n-" 또는 "-(CH2CH2O)n-1CH2CH2-" 중 하나를 포함할 것이다. 상기 진술한 바와 같이, PEG 중합체에 대해, 변수(n)는 약 3 내지 4000의 범위에 있고, 말단기 및 전반적인 PEG의 구조는 다를 수 있다.
중합체의 기하학적 구조 또는 전체 구조와 관련하여 "분지된"은 중합체가, 분지점 또는 중심의 구조적 특성으로부터 연장되는 중합체 "팔(arm)" 또는 "사슬"을 2개 이상 가지는 상태를 지칭한다.
수용성 중합체, 예컨대 PEG에 관한 내용 중 분자량은 수 평균 분자량 또는 중량 평균 분자량 중 어느 하나로 표현될 수 있다. 달리 지정되지 않는 한, 본원의 분자량에 대한 모든 언급은 중량 평균 분자량을 지칭한다. 두 분자량 결정치, 즉 수 평균 분자량과 중량 평균 분자량은, 겔 투과 크로마토그래피 또는 기타 다른 액체 크로마토그래피 기법을 사용하여 측정될 수 있다. 분자량 값을 측정하기 위한 기타 다른 방법, 예컨대 말단기 분석을 이용하는 방법, 또는 총괄성(예컨대, 동결점 강하, 비등점 상승 또는 삼투압)을 측정하여 수 평균 분자량을 결정하는 방법, 또는 광선 산란 기법을 이용하는 방법, 초원심분리 또는 중량 평균 분자량 결정을 위한 점도측정법도 또한 사용될 수 있다. PEG 중합체는 통상적으로 다분산성이고(즉, 중합체의 수 평균 분자량과 중량 평균 분자량이 동일하지 않고), 다분산도 값이, 바람직하게 약 1.2 미만, 더 바람직하게 약 1.15 미만, 훨씬 더 바람직하게 약 1.10 미만, 훨씬 더 바람직하게 약 1.05 미만, 그리고 가장 바람직하게 약 1.03 미만으로 작다.
"생리적으로 절단가능한" 또는 "가수분해가능한" 또는 "분해가능한" 결합은 생리적 조건 하에서 물과 반응하는(즉, 가수분해되는) 상대적으로 불안정적인 결합이다. 수 중에서 가수분해하는 결합의 경향은 주어진 분자 내에서 2 개의 원자를 연결하는 일반적 유형의 결합뿐만 아니라 이들 원자에 부착된 치환에 좌우될 수 있다. 적절한, 가수분해에 불안정적인 또는 약한 결합은 카복실산에스테르, 인산에스테르, 무수물, 아세탈, 케탈, 아실옥시알킬에테르, 이민, 오르토에스테르, 펩타이드, 올리고뉴클레오타이드, 티오에스테르 및 탄산염을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
"효소로 분해가능한 결합"은 하나 이상의 효소에 의해 분해되는 결합을 의미한다.
"안정적인" 연결 또는 결합은 수 중에서 실질적으로 안정적이며, 즉 장기간의 시간에 걸쳐 임의의 주목할 만한 정도로 생리적 조건 하에서 가수분해를 겪지 않는 화학적 결합을 지칭한다. 가수분해에 안정적인 연결의 예는 일반적으로 탄소-탄소 결합(예를 들어, 지방족 사슬에서), 에테르, 아미드, 아민 등을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 일반적으로, 안정적인 연결은 생리적 조건 하에서 1일당 약 1 내지 2% 미만의 가수분해율을 나타내는 것이다. 대표적인 화학적 결합의 가수분해율은 대부분의 표준 화학 교재에서 찾을 수 있다.
예컨대 활성 모이어티, 예컨대 인터루킨-2에 공유 부착된 폴리에틸렌 글리콜에 관한 내용 중 “방출가능한” 공유 결합은, 생리적 조건 하에서 임의의 적합한 방출 기작에 의해 활성 모이어티, 예컨대 인터루킨-2로부터 폴리에틸렌 글리콜 중합체 모이어티를 방출 또는 탈착시키는 결합이다.
본원에 기술된 바와 같은 지속 작용성 IL-2Rαβ 편향 효현제란, 이 효현제의 약학적으로 허용가능한 염 형태를 포함하는 의미이다.
"실질적으로" 또는 "본질적으로"는 주어진 양의 거의 전체 또는 전부, 예를 들어, 95% 이상을 의미한다.
유사하게, 본원에 사용된 바와 같은 "약" 또는 "대략적으로"는 주어진 양의 ± 5% 이내를 의미한다.
"약학적으로 허용가능한 부형제" 또는 "약학적으로 허용가능한 담체"는 대상체에게 유의적으로 독성학적 부작용을 전혀 야기하지 않고 본원에 기술된 조성물에 포함될 수 있는 성분을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "환자" 또는 "대상체"란, 본원에 제공된 바와 같은 화합물, 조성물 또는 이것들의 조합의 투여에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 병태, 예컨대 암을 앓고 있거나 그러한 병태에 걸리기 쉬운, 살아있는 유기체를 지칭하며, 인간과 동물을 둘 다 포함한다. 대상체로서는 포유동물(예컨대, 마우스, 원숭이, 말, 소, 돼지, 개, 고양이 등)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 인간이다.
"투여하는 것"이란, 당업자들에게 공지된 다양한 방법과 전달 시스템 중 임의의 것을 사용하여 치료제를 대상체에 도입하는 것을 지칭한다. 예시적 투여 경로는 정맥내, 근육내, 피하, 복강내, 척수 또는 기타 다른 비경구 투여 경로, 예컨대 주사 또는 주입에 의한 투여 경로를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 어구 "비경구 투여"란, 일반적으로 주사에 의한 장내 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하고, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 림프내, 병변내, 낭내, 안와내, 심내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 치료제는 또한 비 비경구 경로 또는 경구 경로를 통해 투여될 수 있다. 기타 다른 비 비경구 경로로서는 국소, 상피 또는 점막 투여 경로, 예컨대 비내, 질, 직장, 설하 또는 국소 경로를 포함한다.
치료제의 "치료적 유효량" 또는 "치료적 유효 투여량"은, 단독으로 사용되거나 다른 치료제와 조합 사용될 때 (i) 질환의 발생으로부터 대상체를 보호하거나, 또는 (ii) 질환 증상의 심각성 감소, 질환의 무증상 기간의 발생빈도 및 지속기간의 증가, 또는 질환의 고통으로 말미암은 장애 또는 손상의 예방에 의해 입증되는 질환의 퇴행을 촉진하는, 제제의 임의의 양이다. 치료제가 질환의 퇴행을 촉진하는 능력은, 당업자에게 공지된 다양한 방법을 이용하여, 예컨대 인간 대상체, 인간에서의 효능을 예측하기 위한 동물 모델 시스템 내에서 평가될 수 있거나, 또는 해당 제제의 시험관 내 검정에서의 활성을 검정함으로써 평가될 수 있다.
종양 치료에 대해 예를 들자면, 제제 또는 제제들의 조합의 치료적 유효량은, 미치료 대상체의 경우에 비하여 세포 성장 또는 종양 성장을 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 100%까지 억제하는 양이다. 바람직하게 치료적 유효량은 세포 성장 또는 종양 성장을 적어도 약 30%까지 억제하는 양이다.
개관
현 항암 백신 전략과 연관된 단점들 중 적어도 몇몇, 예컨대 약한 면역 반응성을 해결하고자 하는 노력으로서, 본원에는 백신 및 IL-2Rβ 활성화량만큼의 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제를 암이 발병한 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 사이토카인, 예컨대 IL-2뿐만 아니라, 기타 다른 아주반트가 암 백신에 대한 항종양 반응을 개선하고자 이용될 때, 지속적이고, 재현가능하며, 유효한 백신 기반 암 요법을 제공하기 위해서는 추가의 증진이 필요하다. 따라서 본 개시내용은 적어도 부분적으로 암 백신 및 지속 작용성 IL-2R 효현제, 더 구체적으로는 IL-2Rβ 편향 효현제를 포함하는, 특히 유리한 치료적 조합의 발견을 바탕으로 한다.
Il-2는 알파 사슬 수용체(IL2Rα, CD25), 베타 사슬 수용체(IL2Rβ, CD122) 및 공통의 감마 사슬 수용체(γc, CD132)를 함유하는 수용체-신호전달 복합체를 통해 면역 세포 증식과 활성화를 자극한다. IL2가 고용량일 경우, 이는 이종이량체 IL2Rβγ 수용체와 결합하여, 종양 사멸 CD8+ 기억 효과기 T(CD8 T) 세포의 요망되는 증식을 초래한다. 그러나, IL2는 또한 자체의 이종이량체 수용체인 IL2Rαβγ와 더 큰 친화성으로 결합하여, 면역억제성 CD4+, CD25+ 조절 T 세포(Treg)를 증식시킴으로써, 암 면역 요법에 바람직하지 않는 효과를 유도할 수 있다. 따라서 IL-2 증진 항암 백신화 전략과 연관된 단점 한 가지 이상을 극복하기 위한 노력으로서 본원에는 치료적 암 백신화와, IL-2Rαβ 편향 효현제, 구체적으로 지속 작용성 IL-2Rαβ 편향 효현제의 투여를 조합한 치료 방식이 제공된다. 이론에 국한되지 않을 때, 본 출원인은 지속 작용성 IL-2 화합물, 즉 지속 작용성 IL-2Rαβ 편향 효현제가 사용될 때, 면역억제성 Treg를 활성화하는 데 관여하는 IL2Rα 서브유닛과 상호작용하는 영역이 마스킹되고(즉, 자체의 활성이 억제 또는 약화되고), 월등한 치료 효능을 달성하기 위해 백신화 유도성 T 세포 반응이 선택적으로 증폭될 수 있음을 발견하였는데, 이는 본 개시내용과 이를 뒷받침하는 실시예로부터 명백해질 바와 같다.
백신
본원에 제공된 치료 방법은 백신, 즉 암 특이적 면역 반응, 예컨대 선천성 및 적응성 면역 반응을 촉진하여, 암에 대해 숙주의 면역성을 생성하기 위한 백신을 투여하는 단계를 포함한다. 본원에 제공된 조성물과 방법은, 여타의 것들 중에서도 임상적 응용 및 연구를 위한 응용에 사용된다. 본원에 기술된 방법에 따라 다양한 암 면역원이 투여될 수 있는데, 본 발명은 이 점에 제한되지 않는다. 지속 작용성 IL-2Rαβ 편향 효현제와 암 백신의 상보적 성질로 말미암는 T 세포의 요망되는 반응을 모의하기 위한 IL-2 경로를 통해(즉, 지속 작용성 IL-2Rαβ 편향 효현제와 백신의 공동투여를 통해) 성공적인 백신화 결과가 달성될 수 있다는 것이 본 출원인의 견해이다. 다시 말해서, 백신화와 조합하여 이루어지는 지속 작용성 IL-2Rαβ 편향 효현제의 투여는 하기의 결과들, 즉 (i) 다수의 백신 군의 효능과 유용성을 많이 증진시키고, (ii) 강력한 T 세포 반응을 촉진하며, (iii) 고친화성, 중친화성 및 저친화성 항원에 대한 면역 활성을 증가시키는 것 중 임의의 것 한 가지 이상을 달성하기 위해 사용될 수 있다. 이를 뒷받침해주는 실시예들은 이 접근법의 유용성을 설명해준다. 더 구체적으로 본원에 예시된 바와 같이, 지속 작용성 IL-2Rαβ 편향 효현제, 즉 RSLAIL-2는, 암 특이적 면역 반응을 자극하기 위한 백신화와 조합하여, 하기의 결과들, 즉 유의미하게 증진된 항 종양 효과, 개선된 생존, 그리고 지속 작용성 IL-2Rαβ 편향 효현제 하나만이 투여될 때(즉, 단독 투여될 때) 또는 백신화 중 어느 하나가 행하여졌을 때보다 증가한 pmel-1 CD8+ T 세포의 종양 조직 내 증식 중 한 가지 이상을 제공하기에 유효하다.
예시적 백신으로서는, 예컨대 항원 백신, 전세포 백신, 수지상 세포 백신 및 DNA 백신을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 더군다나 백신의 구체적인 유형에 따라 백신 조성물은 백신에 대한 대상체의 면역 반응을 증진시키는 것으로 공지된 적합한 아주반트 하나 이상을 포함할 수 있다. 백신은, 예컨대 세포 기반의 것, 즉 항원을 동정 및 수득하기 위해 환자 자신의 암 세포로부터 유래한 세포를 사용하여 제조된 것일 수 있다. 대상체 유래의 활성화된 면역 세포가 기타 다른 단백질과 함께 동일 대상체에 다시 전달되어, 종양 항원으로 프라이밍(priming)된 면역 세포의 면역 활성화를 더 촉진하는 경우, 예시적 백신은 종양 세포 기반 백신 및 수지상 세포 기반 백신을 포함한다. 종양 세포 기반 백신은 전 종양 세포 및 유전자 변형 종양 세포를 포함한다. 전 종양 세포 백신은, 예컨대 종양 세포 또는 종양 용해물 중 어느 하나를 조사(irradiation)함으로써 항원 제시가 증진되도록 선택적으로 가공될 수 있다. 백신 투여는 또한 사용된 백신의 유형에 따라서 아주반트, 예컨대 바실러스 칼메트-게렝(bacillus calmette-guerin; BCG) 또는 키홀-림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin; KLH)이 동반될 수 있다. 플라스미드 DNA 백신도 또한 사용될 수 있으며, 직접 주사 또는 바이오리스틱(biolistic) 방법을 통해 투여될 수 있다. 펩타이드 백신, 바이러스 유전자 운반 벡터 백신 및 항원 변형 수지상 세포(DC)의 사용도 또한 고려된다.
몇몇 구현예들에서, 백신은 치료적 암 펩타이드 기반 백신이다. 펩타이드 백신은 공지의 서열을 사용하거나, 대상체 자신의 종양(들)으로부터 분리된 항원으로 제조될 수 있으며, 신생항원 및 변형 항원을 포함할 수 있다. 예시적 항원 기반 백신은, 항원이 종양 특이적 항원인 것들을 포함한다. 예를 들어 종양 특이적 항원은 여타의 것들 중 고환암 항원, 분화 항원 및 범발 과발현 종양 연관 항원으로부터 선택될 수 있다. 종양 연관 항원으로부터 유래한 펩타이드를 기반으로 하는 재조합 펩타이드 백신은 본 방법에 사용될 때 아주반트 또는 면역 조정제와 함께 투여될 수 있거나 제형화될 수 있다. 펩타이드 기반 백신에 사용하기 위한 예시적 항원은 하기의 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아닌데, 그 이유는 하기 목록은 순전히 예시적인 것을 의미하기 때문이다. 예를 들어 펩타이드 백신은, 보통 성체 조직에서는 침묵하고 있지만 종양 세포에서는 전사가 다시 활성화되는 유전자에 의해 암호화되는 고환암 항원, 예컨대 MAGE, BAGE, NY-ESO-1 및 SSX-2를 포함할 수 있다. 대안적으로 펩타이드 백신은 조직 분화 연관 항원, 즉 정상 조직 기원 항원으로서, 정상 조직과 종양성 조직 둘 다에 의해 공유되는 항원을 포함할 수 있다. 예를 들어, 백신은 흑색종 연관 항원, 예컨대 gp100, Melan-A/Mart-1, MAGE-3 또는 티로시나아제를 포함할 수 있거나; 또는 전립선암 항원, 예컨대 PSA 또는 PAP를 포함할 수 있다. 백신은 유방암 연관 항원, 예컨대 맘마글로빈-A(mammaglobin-A)를 포함할 수 있다. 본 방법에 사용하기 위한 백신 중에 포함될 수 있는 기타 다른 종양 항원은, 예컨대 CEA, MUC-1, HER1/Nue, hTERT, ras 및 B-raf를 포함한다. 백신에 사용될 수 있는 기타 다른 적합한 항원은 암 줄기 세포 또는 EMT 과정과 연관된 SOX-2 및 OCT-4를 포함한다.
항원 백신은 다중 항원 백신 및 단일 항원 백신을 포함한다. 예시적 암 항원은 약 5 내지 약 30개 아미노산, 또는 약 6 내지 약 25개 아미노산, 또는 약 8 내지 약 20개 아미노산을 가지는 펩타이드를 포함할 수 있다.
상기 기술된 바와 같이, (RSLAIL-2와는 상이한) 면역자극성 아주반트가 백신, 구체적으로 종양 연관 항원 기반 백신에 사용되어, 유효 면역 반응을 생성하는 것을 도울 수 있다. 예를 들어, 백신은 면역성을 개선하는 것을 돕기 위해 병원체 연관 분자 패턴(Pathogen-Associated Molecular Pattern; PAMP)을 통합할 수 있다. 추가의 적합한 아주반트는 모노포스포릴 지질 A, 또는 기타 다른 지질다당체; toll 유사 수용체(TLR) 효현제, 예컨대 이미퀴모드, 레시퀴모드(R-848), TLR3, IMO-8400 및 린타톨리모드를 포함한다. 사용하기 적합한 추가의 아주반트는 열 충격 단백질을 포함한다.
유전자 백신(genetic vaccine)도 또한 본원에 제공된 방법에 사용하기 적합하다. 유전자 백신은 통상적으로 발현 카세트를 가지는 바이러스 또는 플라스미드 DNA 벡터를 사용한다. 이 백신이 투여될 때, 이는 염증 반응의 일환으로서 체세포 또는 수지상 세포를 형질감염시키고, 그 결과 교차 프라이밍(cross-priming) 또는 직접 항원 제시가 초래된다. 몇몇 구현예들에서, 유전자 백신은 1회 면역화로 다수의 항원 전달을 제공하는 백신이다. 유전자 백신은 DNA 백신, RNA 백신 및 바이러스 기반 백신을 포함한다.
본 방법에 사용하기 위한 DNA 백신은 종양 항원을 전달 및 발현하도록 구성된 세균 플라스미드이다. DNA 백신은 임의의 적합한 투여 방식, 예컨대 피하 또는 피내 주사에 의해 투여될 수 있지만, 또한 림프절에 직접 주사될 수도 있다. 추가의 전달 방식은, 예를 들어 유전자 총, 전기천공, 초음파, 레이저, 리포좀, 마이크로입자 및 나노입자를 포함한다.
더 구체적으로 몇몇 구현예들에서, 백신은 하나의 신생항원 또는 다수의 신생항원을 포함한다. 다시 말해서, 몇몇 구현예들에서, 백신은 신생항원 기반 백신이다. 이 접근법은 마우스 암 모델을 사용하는 본원의 실시예 6 내지 9에 예시되어 있다. 예를 들어 몇몇 구현예들에서, 신생항원 기반 백신(NBV) 조성물은 다수의 암 신생항원을 동시에 암호화할 수 있으며, 이 경우 각각의 신생항원은 암 세포내에서 돌연변이된 단백질로부터 유래하는 폴리펩티드 단편이다. 예를 들어 신생항원 백신은 다수의 면역원성 폴리펩티드 단편을 암호화하는 핵산 구조체를 포함하는 제1 백터를 포함할 수 있는데, 이 경우 단백질 각각은 암 세포 내에서 돌연변이되고, 각각의 면역원성 폴리펩티드 단편은 기원 단백질로부터 유래하는 야생형 아미노산 가변적 수만큼이 측접하는 돌연변이 아미노산 하나 이상을 포함하며, 각각의 폴리펩티드 단편은 머리-꼬리(head-to-tail)의 형태로 연결되어 면역원성 폴리펩티드를 형성한다. 면역원성 폴리펩티드를 형성하는 면역원성 폴리펩티드 단편 각각의 길이는 다양할 수 있다.
바이러스 유전자 운반 백터 백신도 또한 사용될 수 있는데; 이러한 백신에 있어서, 재조합 조작 바이러스, 효모 또는 세균 등이 암 특이적 단백질을 환자의 면역 세포에 도입하는 데 사용될 수 있다. 종양 용해성 또는 종양 비용해성일 수 있는 벡터 기반 접근법에 있어서, 벡터는, 예컨대 자체의 고유의 면역자극 특성으로 말미암아 백신의 효율을 증가시킬 수 있다. 예시적 바이러스 기반 백터는 폭스바이러스 과, 예컨대 백시니아, 변형 백시니아 균주 앙카라 및 조류폭스바이러스로부터 유래하는 것들을 포함한다. 복제 수용성(replication-competent) 백시니아 프라이밍 벡터 및 복제 비수용성(replication-incompetent) 계두 면역증강 벡터를 함유하는 암 백신인 PROSTVAC도 또한 사용하기 적합하다. 각각의 벡터는 PSA에 대한 전이유전자와, 3개의 보조자극 분자(co-stimulatory molecule), 즉 CD80, CD54 및 CD58(TRICOM이라 총칭됨)을 함유한다. 기타 다른 적합한 벡터 기반 암 백신은 (MUC1 항원 및 IL-2를 암호화하는) TG4010 및 Trovax를 포함한다.
사용될 추가의 백신은 세균 및 효모 기반 백신, 예컨대 재조합 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 및 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisae)를 포함한다.
앞서 기술된 바와 같이, 상기 백신은 그 효능을 증가시키기 위하여 아주반트 및 기타 다른 면역 증강제와 함께 조합될 수 있고/있거나 제형화될 수 있다. 더욱이 특정의 백신에 따라서 투여는 종양내 또는 비종양내(즉, 전신) 중 어느 하나로 이루어질 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제와 함께 투여되는 백신은 당단백 100(GP100) 백신이 아니다. 또 다른 몇몇 구현예들에서, 백신은 항 CD40 효현제 및 TLR7 효현제를 포함하는 제형 칵테일의 일 성분으로서 투여되는 gp100 백신이 아니다.
암 백신은 본원에 기술된 바와 같은 임의의 적합한 투여 경로, 예컨대 피내, 정맥내, 피하, 소절내, 림프내 및 종양내 경로 등에 의해 투여될 수 있다.
지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제
본원에 기술된 방법, 제형 및 키트 등은, 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제의 투여를 수반한다. 이와 관련하여, 효현제가, 동일 시험관 내 모델 내 IL-2Rαβ에 대한 결합 친화성보다 적어도 5배(더 바람직하게는 적어도 10배) 더 큰, IL-2Rβ에 대한 시험관 내 결합 친화성을 나타내고, IL-2보다 10배 더 긴 생체 내 반감기(다만 반감기는 IL-2의 생체 내 소멸을 기반으로 함) 동안 적어도 유효한 한, 본 개시내용은 임의의 특정 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제에 제한되지 않는다. 예를 들어 IL-2에 대한 결합 친화성을 표준으로 하여 측정하는 것이 가능하다. 이와 관련하여, 본원의 실시예 1에 참조된 RSLAIL-2는, IL-2Rαβ에 대한 친화도에서 IL-2에 비하여 약 60배 감소이지만, IL-2Rβ에 대한 친화도에서 IL-2에 비하여 오직 약 5배 감소를 나타낸다.
지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제의 비제한적 예는 국제특허출원공보 WO　2012/065086 및 WO 2015/125159에 기술되어 있다. 예시적 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제는 본 출원의 실시예 1에서 언급된 RSLAIL-2로서, 방출가능한 PEG는 하기 나타낸 바와 같은 2,7,9-치환 플루오렌을 기반으로 하고, 폴리(에틸렌 글리콜) 사슬은 아미드 결합을 통해 플루오렌 고리상 2번 위치 및 7번 위치로부터 뻗어나가며(플루오렌-C(O)-NH~), 카바메이트 질소 원자에 대한 부착을 통한 IL-2에의 방출가능한 공유 부착은 플루오렌 고리의 9번 위치에 메틸렌기(-CH2-)를 통해 부착되어 있다. 이와 관련하여, RSLAIL-2는 하기 화학식에 의해 포함되는 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물이다:
Figure pct00001
(상기 식 중, IL-2는 IL-2의 잔기이고, "n"은 약 3 내지 약 4000의 정수임). 상기 화학식에 표시된 바와 같이, IL-2 분자는, 바람직하게 상기 나타낸 바와 같이 IL-2 분자에 공유 부착되어 있는 분지된 폴리에틸렌 글리콜 모이어티를 4, 5 또는 6개 가진다. 하나 이상의 구현예들에서, 본 조성물은 하기 화학식에 의해 포함되는 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 (몰량을 기준으로) 10% 이하, 바람직하게는 (몰량을 기준으로) 5% 이하 함유한다:
Figure pct00002
(상기 식 중, IL-2는 IL-2의 잔기이고, (IL-2에 부착된 폴리에틸렌 글리콜 모이어티의 수를 나타내는) "n"은 1, 2, 3, 7로 구성된 군으로부터 선택되는 정수 및 7을 초과하는 정수임). 몇몇 구현예들에서, RSLAIL-2는 IL-2에 부착된 폴리에틸렌 글리콜 모이어티를 평균 약 6개 가진다.
본원에 기술된 조성물, 예컨대 RSLAIL-2 조성물에 대한 평균 페길화도를 결정하기 위해, 통상적으로 단백질은 비신콘산(BCA) 검정법 또는 UV 분석과 같은 방법에 의해 정량되어, 시료 중 단백질의 몰이 결정된다. 그 다음, PEG 모이어티가 방출되는 조건에 시료가 노출됨에 의하여 PEG 모이어티가 방출되고, 이후 방출된 PEG는 (예컨대, BCA 또는 UV에 의해) 정량되어, 단백질 몰과 상관관계를 나타내어 평균 페길화도가 결정된다.
몇몇 추가의 구현예들에서, RSLAIL-2는 일반적으로 전구약물, 즉 투여시에는 비활성이었다가 생체 내에서 폴리에틸렌 글리콜 모이어티가 서서히 방출되면서, 종양 부위에서의 일정한 농도를 달성하기에 유효한 인터루킨-2의 활성 컨쥬게이션된 형태를 제공하는 것으로 간주된다. 실시예 2에 제공된 바와 같이, RSLAIL-2는 (IL-2Rβ라고도 공지된) CD-122 효현제, 즉 CD-122를 활성화 또는 자극할 수 있는 분자(IL-2Rβ)인 것으로 간주될 수 있다. 게다가 RSLAIL-2는 IL-2Rαβγ보다 IL-2Rβγ와 선택적으로 결합하여 이를 활성화하는 CD-122 효현제인 것으로 간주될 수 있다.
RSLAIL-2의 추가의 예시적 조성물은 상기 화학식에 따른 화합물로서, 분자의 전체 중합체 부분의 중량 평균 분자량이 약 250 달톤 내지 약 90,000 달톤의 범위인 화합물을 포함한다. 추가의 적합한 범위는 약 1,000 달톤 내지 약 60,000 달톤에서 선택되는 범위, 약 5,000 달톤 내지 약 60,000 달톤 범위, 약 10,000 달톤 내지 약 55,000 달톤 범위, 약 15,000 달톤 내지 약 50,000 달톤 범위, 및 약 20,000 달톤 내지 약 50,000 달톤 범위의 중량 평균 분자량을 포함한다.
폴리에틸렌 글리콜 중합체 부분에 대한 추가의 예시적 중량 평균 분자량은 약 200 달톤, 약 300 달톤, 약 400 달톤, 약 500 달톤, 약 600 달톤, 약 700 달톤, 약 750 달톤, 약 800 달톤, 약 900 달톤, 약 1,000 달톤, 약 1,500 달톤, 약 2,000 달톤, 약 2,200 달톤, 약 2,500 달톤, 약 3,000 달톤, 약 4,000 달톤, 약 4,400 달톤, 약 4,500 달톤, 약 5,000 달톤, 약 5,500 달톤, 약 6,000 달톤, 약 7,000 달톤, 약 7,500 달톤, 약 8,000 달톤, 약 9,000 달톤, 약 10,000 달톤, 약 11,000 달톤, 약 12,000 달톤, 약 13,000 달톤, 약 14,000 달톤, 약 15,000 달톤, 약 20,000 달톤, 약 22,500 달톤, 약 25,000 달톤, 약 30,000 달톤, 약 35,000 달톤, 약 40,000 달톤, 약 45,000 달톤, 약 50,000 달톤, 약 55,000 달톤, 약 60,000 달톤, 약 65,000 달톤, 약 70,000 달톤 및 약 75,000 달톤을 포함한다. 몇몇 구현예들에서, 폴리에틸렌 글리콜 중합체의 중량 평균 분자량은 약 20,000 달톤이다.
상기 기술된 바와 같이, 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 존재할 수 있다. 통상적으로 이러한 염은 약학적으로 허용가능한 산 또는 산 균등물과의 반응에 의해 형성된다. 이와 관련하여 용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 일반적으로 비교적 무독성인, 무기 및 유기 산 부가 염을 지칭할 것이다. 이러한 염은 비히클 투여 또는 투여 형태 제조 절차 중 현장에서 제조될 수 있거나, 또는 본원에 기술된 바와 같은 지속 작용성 인터루킨-2와 적합한 유기 또는 무기 산을 별도로 반응시켜, 이에 따라 형성된 염을 분리함으로써 제조될 수 있다. 대표적인 염들은 브롬화수소산염, 염화수소산염, 황산염, 중황산염, 인산염, 질산염, 아세트산염, 발레르산염, 올레산염, 팔미트산염, 스테아르산염, 라우르산염, 벤조산염, 젖산염, 인산염, 토실산염, 시트르산염, 말레산염, 푸마르산염, 숙신산염, 주석산염, 나프틸산염, 옥실산염, 메실산염, 글루코헵토산염, 락토비오산염 및 라우릴설폰산염 등을 포함한다. (예를 들어, 문헌 [Berge et al. (1977) "Pharmaceutical Salts", J. Pharm . Sci. 66:1-19] 참조). 그러므로 기술된 바와 같은 염은 무기산, 예컨대 염화수소산, 브롬화수소산, 황산, 설팜산, 인산 및 질산 등으로부터 유래할 수 있거나; 유기산, 예컨대 아세트산, 프로피온산, 숙신산, 글리콜산, 스테아르산, 젖산, 말산, 주석산, 시트르산, 아스코르브산, 팔미트산, 말레산, 하이드록시말레산, 페닐아세트산, 글루탐산, 벤조산, 살리실산, 설파닐산, 2-아세톡시벤조산, 푸마르산, 톨루엔설폰산, 메탄설폰산, 에탄 디설폰산, 옥살산 및 이소티온산 등으로부터 제조될 수 있다.
상기 IL-2Rβ 편향 효현제를 참고할 경우, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "IL-2"는 인간 IL-2 활성을 가지는 모이어티를 지칭한다. IL-2의 잔기의 맥락에서, 용어 '잔기'는, 상기 화학식에 나타낸 바와 같이, 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜과 하나 이상의 공유 부착 위치에서 공유 부착이 이루어진 후 남아있는 IL-2 분자의 부분을 의미한다. 비 변형 IL-2가 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜에 부착될 경우, 이 IL-2는, 중합체(들)와의 결합과 연관된 공유 결합이 하나 이상 존재함으로 말미암아 약간 변경됨이 이해될 것이다. 이러한 또 다른 분자에 부착된, 약간 변경된 IL-2의 형태는 IL-2의 "잔기"로 지칭된다.
예를 들어, 국제특허출원공보 WO 2012/065086에 기술된, 서열 번호 1 내지 4 중 임의의 하나에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 단백질은 실질적으로 IL-2 단백질과 상동성인 임의의 단백질 또는 폴리펩타이드이므로, 예시적 IL-2 단백질이다. 이들 서열도 또한 본원에 제공된다. 용어 실질적으로 상동성은, 특정 대상 서열, 예를 들어 돌연변이 서열이 하나 이상의 치환, 결실 또는 부가에 의해 참조 서열과 다르며, 자체의 순수 효과는 기준 서열과 대상 서열 간 부정적인 기능상의 차이를 초래하지 않는 것을 의미한다. 본원의 목적을 위해, 95%보다 큰 상동성, 동등한 생물 활성(그러나 생물 활성의 세기가 반드시 동등할 필요는 없음), 및 동등한 발현 특징을 갖는 서열은 실질적으로 상동성인 것으로 간주된다. 상동성을 결정하기 위하여 성숙한 서열의 절단은 무시되어야 한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "IL-2"는, 예를 들어 위치 배향 돌연변이 유발에 의하여 정교하게 변형되거나, 돌연변이를 통하여 우발적으로 변형된 단백질을 포함한다. 이러한 용어들은 또한 1 내지 6개의 추가 글리코실화 위치를 가지는 유사체, 적어도 하나의 추가 아미노산(여기서 추가 아미노산(들)은 적어도 하나의 글리코실화 위치를 포함함)을 단백질의 카르복시 말단에 가지는 유사체, 그리고 적어도 하나의 글리코실화 위치를 포함하는 아미노산 서열을 가지는 유사체를 포함한다. 본 용어는 천연 모이어티 및 재조합 생산된 모이어티 둘 다를 포함한다. 추가로, IL-2는 인간 기원, 동물 기원 및 식물 기원으로부터 유래할 수 있다. 하나의 예시적이고 바람직한 IL-2는 알데스루킨으로서 지칭되는 재조합 IL-2이다(서열 번호 3).
종래의 접근법들, 예컨대 화합물을 방사능 표지화한 후, 이를 생체 내 투여하고, 이의 제거(clearance)를 판별하는 단계를 포함하는 접근법은, 지속 작용성인 것으로 제안된 화합물인 IL-2Rβ 편향 효현제가 "지속 작용성"인지 여부를 판별하는 데 사용될 수 있다. 본원의 목적을 위해, IL-2Rβ 편향 효현제의 지속 작용성은, 통상적으로 마우스 내에서 평가될 효현제를 투여한 후 다양한 시점에서 림프구 내 STAT5 인산화를 측정하기 위해 유세포 분석을 이용하여 결정된다. 참고로, IL-2에 대한 신호는 약 24시간 경과할 때까지 소멸되지만, 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제에 대한 신호는 그보다 더 긴 기간 동안 지속된다. 예시로서, RSLAIL-2 조성물에 대한 신호는 수 일에 걸쳐 지속된다.
지금부터 본원에 기술된 바와 같이 지속 작용성 효현제의 IL-2Rβ 편향성을 고려하여, 실시예 2는 RSLAIL-2의 예시적 조성물에 대한 수용체 편향성과 관련된 시험관 내 및 생체 내 데이터 둘 다를 제공한다. 실시예 2에 기술된 바와 같이, 마우스 흑색종 종양 모델에 있어서, RSLAIL-2에 대한 CD8/조절 T 세포의 비는 IL-2에 대한 경우와 비교되었을 때 IL2 수용체 알파보다 IL2 수용체 베타가 우선적으로 활성화됨을 뒷받침해준다. 예시적 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제, 예컨대 RSLAIL-2는, 예를 들어 Treg보다 효과기 CD8+ T- 및 NK 세포를 우선적으로 활성화하여 증식시키는 데 유효하다.
게다가 대표적인 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제, 예컨대 RSLAIL-2는 IL-2에 비하여 증가한 종양 노출(tumor exposure), 바람직학게는 유의미하게 증진된 종양 노출, 예컨대 IL-2의 당량에 대해 정규화되었을 때 적어도 50배 증가한 노출, 또는 적어도 100배 증가한 노출, 또는 적어도 200배 증가한 노출, 또는 적어도 300배 증가한 노출, 또는 적어도 400배 증가한 노출, 또는 적어도 500배 증가한 노출을 제공한다. 예시와 같이 마우스 흑색종 종양 모델에 있어서 RSLAIL-2의 항종양 활성은 실시예 3에 기술되어 있다. 이 실시예 3에 기술된 바에 의하면, RSLAIL-2는 (IL-2 당량을 기준으로 정규화되었을 때) IL-2에 비하여 유의미하게 증진된, 예컨대 500배 증진된 종양 노출을 제공하는 것으로 파악되었다.
본원에 기술된 바와 같은 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제의 특징들 중 적어도 한 가지 또는 그 이상을 바탕으로 하였을 때, 본원에는 면역억제성 Treg을 활성화하는 데 관여하는 IL2Rα 서브유닛과 상호작용하는 영역이 마스킹되어 월등한 치료 효능을 달성하는, 지속 작용성 IL-2 화합물을 투여함으로써 암 환자에서 백신화 유도성 T 세포 반응을 선택적으로 증가시키는 데 유효한 방법이 제공된다.
본원에 기술된 방법, 조성물 및 키트에 따라, 본 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제는 IL-2Rβ 활성화량으로 제공된다. 당업자는 얼마나 많은 양의 소정의 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제가 IL-2Rβ에서 임상학적으로 적절한 효현 활성을 제공하기에 충분한지를 결정할 수 있다. 예를 들어, 당업자는 문헌을 참조하고/참조하거나, 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제를 점차적으로 증량하여 투여하여, IL-2Rβ의 임상학적으로 유효한 효현 활성을 제공하는 양 또는 양들을 결정할 수 있다. 대안적으로, 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제의 활성화량은 상기 기술된 생체 내 STAT5 인산화 분석을 이용하여 결정될 수 있고(생체 내 투여 후 결정됨), 여기서 STAT5 인산화를 10% 초과의 NK 세포에서 최고로 유도하기에 충분한 양이 활성화량인 것으로 간주된다.
그러나, 하나 이상의 경우에 있어서, IL-2Rβ 활성화량은 단백질 양으로 표현되는 하기 범위들, 즉 약 0.01 mg/kg 내지 100 mg/kg; 약 0.01 mg/kg 내지 약 75 mg/kg; 약 0.02 mg/kg 내지 약 60 mg/kg; 약 0.03 mg/kg 내지 약 50 mg/kg; 약 0.05 mg/kg 내지 약 40 mg/kg; 약 0.05 mg/kg 내지 약 30 mg/kg; 약 0.05 mg/kg 내지 약 25 mg/kg; 약 0.05 mg/kg 내지 약 15 mg/kg; 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg; 약 0.05 mg/kg 내지 약 5 mg/kg; 약 0.05 mg/kg 내지 약 1 mg/kg 중 하나 이상에 의해 포함되는 양이다. 몇몇 구현예들에서, 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제는 0.7 mg/kg 이하의 용량으로 투여된다. 특정의 예시적 투여량 범위는, 예를 들어 약 0.1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 또는 약 0.2 mg/kg 내지 약 7 mg/kg, 또는 약 0.2 mg/kg 내지 약 0.7 mg/kg 미만을 포함한다.
확인하자면, 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제와 관련한 활성화 정도 및 그 양은 다양하게 변할 수 있으며, 치료적 암 백신의 투여와 함께 이루어질 때 더 유효할 수 있다. 다시 말해서, 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제가 암 백신과 함께 투여되는 한, 그리고 본원에 기술된 방법, 조성물 및 키트가 임상적으로 유의미한 반응을 보일 수 있는 한, IL-2Rβ에서 충분히 긴 기간 동안 단지 최소의 효현제 활성만을 나타내는 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제의 양은 여전히 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제일 수 있다. 몇몇 경우들에서, 항암 백신화가 동반될 때 (예컨대) 상승적 상호작용과 반응으로 말미암아 단지 최소한의 IL-2Rβ 효현제 활성만이 필요할 수 있다.
본원에 기술된 치료 방법은 환자 케어를 관리하는 임상의가 해당 치료 방법이 유효하다고 여기는 동안 지속될 수 있다. 해당 치료 방법이 유효한지를 나타내는 비제한적 매개변수는, 하기의 것들, 즉 (무게 및/또는 부피의 관점에서의) 종양 수축; 개별 종양 콜로니 수의 감소; 종양 제거; 및 비 진행 생존 중 임의의 것 한 가지 이상을 포함한다. 종양 크기 변화는 임의의 적합한 방법, 예컨대 영상화에 의해 측정될 수 있다. 다양한 진단 영상화 방식, 예컨대 컴퓨터 단층촬영(CT 스캔), 이중 에너지 CDT, 양전자 방사 단층촬영 및 MRI가 사용될 수 있다.
백신 및 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제의 실제 용량뿐만 아니라, 본원에 기술된 방법, 조성물 및 키트와 연관된 투여 계획은 대상체의 나이, 체중 및 전반적인 상태뿐만 아니라 치료중인 암의 유형과 진행상태, 건강 케어 전문가의 판단, 그리고 투여될 구체적인 백신 및 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제에 따라 달라질 것이다.
백신 및 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제의 투여 횟수와 스케줄과 관련하여, 당업자는 적당한 횟수를 결정할 수 있을 것이다. 예를 들어 치료 회차 중 임상의는 백신을 1회 투여할지, 아니면 예컨대 수일 또는 수주의 진행과정에 걸쳐 순차 투여할지 중 하나를 결정할 수 있다. 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제는 백신과 동시에 투여되거나, 또는 백신화 이전에 투여되거나, 또는 암 백신 투여 이후에 투여된다. 예를 들어 몇몇 치료 방식에 있어서, 지속 작용성 IL-2Rβ 기반 효현제는 백신을 투여한지 7일 이내에(예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 중 임의의 한 날에) 투여된다. 몇몇 경우들에서, 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제는 백신화 4일 이내에, 예컨대 1, 2, 3 또는 4일 중 임의의 한 날에 투여된다. IL-2Rβ 기반 효현제의 지속 작용성을 바탕으로 하였을 때, 이러한 화합물은 통상적으로 비교적 빈번치 않게(예컨대 3주에 한 번, 2주에 한 번, 8일 내지 10일에 한 번, 매주 한 번 등) 투여된다.
요법의 진행과정과 연관된 예시적 시간 길이는 약 1주; 약 2주; 약 3주; 약 4주; 약 5주; 약 6주; 약 7주; 약 8주; 약 9주; 약 10주; 약 11주; 약 12주; 약 13주; 약 14주; 약 15주; 약 16주; 약 17주; 약 18주; 약 19주; 약 20주; 약 21주; 약 22주; 약 23주; 약 24주; 약 7개월; 약 8개월; 약 9개월; 약 10개월; 약 11개월; 약 12개월; 약 13개월; 약 14개월; 약 15개월; 약 16개월; 약 17개월; 약 18개월; 약 19개월; 약 20개월; 약 21개월; 약 22개월; 약 23개월; 약 24개월; 약 30개월; 약 3년; 약 4년 및 약 5년을 포함한다.
본원에 기술된 치료 방법은, 통상적으로 환자의 케어를 관리하는 임상의가 해당 치료 방법이 유효하다고 여기는 동안(즉, 환자가 해당 치료에 반응하는 동안) 지속된다. 치료 방법이 유효한지를 나타내는 비제한적 매개변수는 하기의 것들, 즉 (무게 및/또는 부피 및/또는 시각적 외관의 관점에서의) 종양의 수축; 개별 종양 콜로니 수의 감소; 종양 제거; 비 진행 생존; (적용 가능하다면) 적합한 종양 마커에 의한 적당한 반응, 증가한 NK(자연 살해) 세포 수, 증가한 T 세포 수, 증가한 기억 T 세포 수, 증가한 중앙 기억 T 세포(central memory T cell) 수, 감소한 조절 T 세포(예컨대, CD4+ Treg, CD25+ Treg 및 FoxP3+ Treg) 수 중 한 가지 이상을 포함할 수 있다.
본원에 제공된 방법은 (여타의 대상체들 중) 암을 앓고 있는 환자를 치료하는 데 유용하다. 예를 들어, 환자는 백신 단독 투여에 반응성일 수 있을 뿐만 아니라, 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제와 백신의 조합에도 반응성일 수 있지만, 조합에 대한 반응성이 더 크다. 추가의 예로서, 환자는 백신 또는 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제 중 어느 하나에 무반응성일 수 있지만, 이것들의 조합에는 반응성이다. 또 다른 예로서, 환자는 백신 또는 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제 중 어느 하나에는 무반응성일 수 있지만, 이것들의 조합에는 반응성이다.
예를 들어 백신 및/또는 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제의 투여는, 통상적으로 주사에 의한다. 기타 다른 투여 방식, 예컨대 폐, 비강, 협측, 직장, 설하 및 경피가 또한 상정된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "비경구"는 피하, 정맥내, 동맥내, 종양내, 림프내, 복강내, 심장내, 척추강내 및 근육내 주사뿐만 아니라 인퓨전 주사를 포함한다. 앞서 기술된 바와 같이, 백신 및 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제는 별도로 투여될 수 있다. 대안적으로 만일 백신 및 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제의 투여가 초기 용량으로서 동시에 이루어지거나, 또는 치료 과정 전체에 걸치거나 또는 투여 계획의 다양한 단계에서 동시에 이루어지고, 백신 및 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제가 주어진 제형 중 서로 양립 가능할 것이 요망되면, 동시 투여는 단일 투여형/제형의 투여(예컨대, 상기 면역학적 성분 둘 다를 함유하는 정맥내 제형의 정맥내 투여)를 통해 달성될 수 있다. 당업자는 경로결정 시험(routing testing)을 통해, 이와 같은 성분 2개가 주어진 제형 중 서로 양립 가능한지를 결정할 수 있다. 예를 들어, 환자에의 투여는 IL-2Rβ 편향 효현제와 희석제를 포함하는 조성물의 주사를 통해 달성될 수 있다. 추가로, 환자에의 투여는 암 백신 및 희석제의 주사를 통해 달성될 수 있다. 게다가 투여는 IL-2Rβb 편향 효현제, 백신 및 희석제를 모두 포함하는 조성물의 주사를 통해 달성될 수 있다. 사용 가능한 희석제에 관하여, 희석제는 주사용 정균수, 수중 5% 덱스트로스, 인산염 완충 식염수, 링거 용액, 젖산처리된 링거 용액, 식염수, 멸균수, 탈이온수 및 이것들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 당업자는 통상의 시험을 통하여 2 개의 주어진 약리학적 성분들이 주어진 제형 중에서 서로 양립 가능할 수 있는지 여부를 확인할 수 있다.
본원에 기술된 치료적 조합, 즉 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제 및 백신은 키트의 형태로 제공될 수 있다. 상기 기술된 바와 같이, 해당 성분들은, 선택적으로 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제와 함께 단일 조성물 중에 포함될 수 있거나, 또는 별도의 용기에 담겨 제공될 수 있으며, 키트는 통상적으로 사용 지침을 포함한다. 약학적으로 허용가능한 부형제로서 적합한 것은, 예를 들어 문헌[Handbook of Pharmaceutical Excipients, 7th ed., Rowe, R.C., Ed., Pharmaceutical Press, 2012]에 기술된 것들을 포함한다. 키트내 성분, 예컨대 백신과 지속 작용성 IL-2Rβ편향 효현제를 포함하는 조성물은 액체 형태 또는 고체 형태 중 어느 하나로 존재할 수 있다. 바람직한 특정 구현예들에서, 백신과 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제 둘 다는 고체 형태로 존재한다. 바람직한 고체 형태는, 예컨대 물 5 중량% 미만, 바람직하게는 물 2 중량% 미만을 함유하는 건조 고체 형태이다. 고체 형태는, 일반적으로 수성 희석제 중에서의 재구성에 적합하다.
본원에 기술된 방법, 키트 및 관련 조성물은 본원에 제공된 방법에 의해 치유 또는 예방될 수 있는 임의의 병태, 예컨대 암을 앓고 있는 환자를 치료하는 데 사용될 수 있다. 암은, 체내 비정상 세포의 제어되지 않는 성장을 특징으로 하는 다양한 질환의 광범위한 군을 지칭하며, 여기서 암 또는 암 조직은 종양을 포함할 수 있다. 예시적 병태는 암, 예컨대 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성 육종, 척삭종, 혈관육종, 내피육종(endotheliosarcoma), 림프관육종, 림프관내피육종(lymphangioendotheliosarcoma), 활막종, 중피종, 유잉(Ewing) 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 췌장암, 뇌암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평세포암, 기저세포암, 선암종, 한선암, 피지선암, 유두모양암, 유두모양 선암종, 낭샘암종, 수질암, 기관지원성암, 신세포암, 간세포암, 담관암, 융모막암종, 정상피종, 배암(embryonal cancer), 빌름(Wilms) 종양, 자궁경부암, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 고환암, 폐암, 소세포 폐암, 뇌암, 방광암, 상피암, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 뇌실막세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청각 신경종, 핍지교종, 뇌수막종, 흑색종, 다발성 골수종, 신경모세포종, 망막모세포종 및 백혈병이다. 몇몇 특정 구현예들에서, 치료될 암은 고형암, 예컨대 유방암, 난소암, 결장암, 전립선암, 골암, 결장직장암, 위암, 림프종, 악성 흑색종, 간암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 췌장암, 갑상샘암, 신장암, 담관의 암, 뇌암, 자궁경부암, 상악동암, 방광암, 식도암, 호지킨 질환 및 부신피질암이다.
본 발명의 방법, 키트 및 조성물은, 예를 들어 대상체의 백신에 대한 반응을 개선함으로써 암 백신의 치료적 효능을 증진시키는 데 유용하다. 증진된 반응은 치료중 임의의 적합한 시점, 즉 치료 1회차 후, 치료 2 내지 3회차 후 등에 임의의 수의 적합한 방법에 의해 평가될 수 있으며, 상기 방법은 종양 수축(부분 반응)(즉 종양 크기 또는 부피의 평가), 종양 소멸, 질환 진행 감소(암이 진행되지 않는 것), 그리고 적당하다면 하나 이상의 종양 시험 마커 분석을 포함한다. 몇몇 경우들에서, 치료 효능에 대한 적응증은, 백신 및 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제에 의한 치료를, (예컨대 거의 동일한 정도의 IL-2 당량을 달성하기 위해 투여된) 상응 비 지속 작용성 IL-2 형태와 함께 투여되는 백신에 의한 치료와 비교하였을 때, 이 두 치료간 50% 최대 종양 성장을 보일 때의 시간상 지연의 측면에서 측정될 수 있다. 인간 환자 또는 적합한 동물 모델, 예컨대 적합한 마우스 암 모델을 대상으로 비교가 수행될 수 있다. 특히 유효한 치료는 50% 최대 종양 성장에서 평가되었을 때 생존을 적어도 5일 또는 적어도 10일 또는 적어도 12일 또는 적어도 15일 또는 적어도 20일 또는 적어도 30일 또는 이 이상까지 연장시킬 것이다.
본원에 제공된 방법, 키트 및 조성물 등은 또한 치료가 진행되고 있는 대상체에서 종양 성장 또는 크기(또는 부피)를 감소시키는 데 유용하다. 본원에 제공된 것과 같은 암 백신 및 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제 치료적 유효량만큼을, 확립된 종양을 가지는 대상체에 투여하는 것에 의한 치료는 하나 이상의 구현예에서 대상체 내 종양 성장 또는 그 크기를 감소시키는 데 유효하다. 예를 들어 몇몇 구현예들에서, 종양 크기를 치료전 종양 크기와 비교하였을 때 약 25% 또는 약 30% 또는 약 40% 또는 약 50% 또는 심지어 약 60% 또는 약 70% 또는 이 이상까지 줄이는데에는 1차 이상의 치료 회차가 유효하다.
또 다른 몇몇 추가의 구현예들에서, 본원에 제공된 방법, 키트 및 조성물 등은 암 치료 진행중인 대상체 내에서 조절 T 세포(Treg)의 축적을 억제하는 데 유효하다. 몇몇 구현예들에서, 본 방법은, 예를 들어 상응하는 암의 암 마우스 모델에서 평가되었을 때, CD4+ Treg, CD25+ Treg 및 FoxP3+ Treg로 구성된 군으로부터 선택되는 조절 T 세포(즉, 상기 세포 유형들 중 임의의 것 하나 이상)의 종양 내 축적을, 비 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제, 예컨대 IL-2 및 백신 투여시 관찰되는 바에 비하여 증가한 정도로 억제하는 데 유효하다. 예를 들어, 백신과 IL-2에 의한 치료시와 비교하였을 때, 대상 Treg는 (Treg 단독, 또는 이 Treg들의 가능한 조합들 중 임의의 하나로서 측정될 때) 1.5배 이상, 또는 2배 이상, 또는 3배 이상, 또는 심지어 4배 이상까지 억제될 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 본 치료는 대상체 내 조절 T 세포(Treg)의 축적을, 비치료 대상체의 경우와 비교하였을 때 적어도 2배 이상, 또는 3배 이상, 또는 심지어 4배 이상, 또는 5배 이상, 또는 6배 이상까지 억제하는 데 유효할 수 있다.
또 다른 몇몇 추가의 구현예들에서, 본원에 제공된 방법, 키트 및 조성물 등은 대상체 내에서 T 세포 및/또는 NK 세포 활성 및/또는 증식을 자극하는 데 유효하다. 몇몇 구현예들에서, 본 방법은, 예를 들어 상응하는 암의 암 마우스 모델을 대상으로 대상체 내 CD8+ T 세포 수의 증가에 대해 평가되었을 때 유효하다. 또 다른 몇몇 기타 구현예들에서, 본 방법은, 예를 들어 상응하는 암의 암 마우스 모델을 대상으로 평가되었을 때, 대상체 내 NK 세포 수를 증가시키는 데 유효하다. 예를 들어, 대상체의 CD8+ T 세포는, 백신 및 비변형 IL-2에 의한 치료시에 비하여 1.5배 이상, 또는 2배 이상, 또는 3배 이상, 또는 심지어 4배 이상까지 증가할 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 본 치료는 비 치료 대상체의 경우와 비교하였을 때, 대상체의 CD8+ T 세포를, 적어도 2배 이상, 또는 3배 이상, 또는 심지어 4배 이상, 또는 5배 이상, 또는 6배 이상까지 증가시키는 데 유효할 수 있다. 유사하게, 대상체의 NK 세포는, 백신 및 비변형 IL-2에 의한 치료시에 비하여 1.5배 이상, 또는 2배 이상, 또는 3배 이상, 또는 심지어 4배 이상까지 증가할 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 본 치료는 대상체의 NK 세포 수를, 비치료 대상체의 경우와 비교하였을 때, 적어도 2배 이상, 또는 3배 이상, 또는 심지어 4배 이상, 또는 5배 이상, 또는 6배 이상까지 증가시키는 데 유효할 수 있다.
실시예를 참조하였을 때, 적어도 실시예 4와 5는 예시적 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제, 예컨대 RSLAIL-2의 투여가 동반되는, 예시적 치료 백신 투여로부터 초래되는 상승효과에 대한 추가의 적응증을 제공한다. 예를 들어, 도 3a 내지 3h 및 도 4의 결과들을 고려하였을 때, RSLAIL-2, 즉 예시적 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제가 백신화 이후에 투여되면, 사용된 마우스 모델에서 종양 성장을 유의미하게 지연시켜, 백신화만 단독으로 행하여졌을 때 또는 고용량 IL-2 또는 저용량 IL-2 중 어느 하나의 투여가 동반되어 백신화가 행하여졌을 때와 비교하였을 때 눈에 띄게 개선된 반응을 달성하는 데 유효하였음이 확인될 수 있다. 도 4를 참조하였을 때, 예를 들어 처리 대략 38일 후 백신화/RSLAIL-2 처리군에서 평균 종양 크기는 대략 25 mm2이었던 반면에, (종양 성장을 늦추는 효능의 관점에서) 가장 가까운 결과를 보인 처리군(백신화/저용량 IL-2 처리군)에서의 평균 종양 크기는 대략 125 mm2이었는데, 이는 거의 5배의 차이가 나는 결과이다. 이러한 결과는, 백신 요법이 동반될 때 IL-2Rαβ 편향 효현제, 예컨대 RSLAIL-2가 치료 반응을 개선하는 월등한 능력을 가진다는 것을 강조한다.
예시적 IL-2Rαβ 편향 효현제인 RSLAIL-2의 투여가 동반되는, 항암 백신화의 현저한 치료적 결과를 추가로 입증함에 있어서, 도 6은 다양한 처리군 각각에 대한 생존률% 플롯을 제공한다. 가장 유의미하게 펩타이드 백신/지속 작용성 IL-2Rαβ 편향 효현제 처리군의 대상체 100%가 약 57일까지 생존하였고, 대략 62일에는 생존률이 50%였으며; 요법에 대한 양성 반응의 관점에서 그 다음으로 가장 가까운 결과를 보인 처리군, 즉 펩타이드 백신/저용량 IL-2 처리군의 경우에는 대략 32일에 100% 생존률이 관찰되었으며, 이로부터 대략 15일 후인 약 48일에는 생존률이 50% 증가했다.
실시예 4 및 5에 기술된 바와 같은 본 치료 방법의 면역자극효과 또는 면역억제효과를 참조하였을 때, RSLAIL-2는 IL-2보다 종양 조직에서 유의미하게 더 크고 안정적인 Pmel-1 반응을 유도하기에 유효함이 확인될 수 있다. 더욱이 종양 미세환경과 유사한 환경에 고용량 IL-2 또는 RSLAIL-2 중 어느 하나의 투여가 동반되는 백신 치료시와 비교하였을 때, RSLAIL-2는 IL-2보다 비장에서 유의미하게 더 크고 안정적인 Pmel-1 반응을 유도하기에 유효하다. RSLAIL-2는 7일에 조절 T 세포(Treg)의 감소를 유효하게 매개하였고, 종양내 Treg의 최소 개수를 적어도 30일까지 더 오래 유지하였다. 치료 과정 동안의 다양한 면역 세포 유형(Treg 및 비 Treg)의 평가를 바탕으로 하였을 때, 펩타이드 백신은 IL-2가 아닌, RSLAIL-2와 조합되었을 때 종양뿐만 아니라 비장에서 더 큰 Pmel 대 Treg의 비를 달성하였다. 적어도 이와 같은 데이터를 바탕으로 하였을 때, 예시적 IL-2Rαβ 편향 효현제인 RSLAIL-2는 IL-2보다 종양 조직 내에 많은 수의 Pmel-1 세포 및 적은 수의 Treg를 더 긴 기간에 걸쳐 안정적으로 유지함에 있어 눈에 띄게 더 우수한 것으로 보인다. 게다가 RSLAIL-2는 Treg가 종양에 축적되는 것을 특이적으로 억제하고, 종양 조직 내 높은 Pmel 대 Treg의 비가 치료 30일까지 유지되도록 촉진한다.
여타의 실시예들 중에서 실시예 6 내지 9는, 신생항원 기반 백신 조성물만이 단독으로 투여될 때에 비하여, 이 조성물을 RSLAIL-2와 조합하여 투여하였을 때가, 백신 암호화 신생항원 다수에 대한 면역 반응뿐만 아니라 백신 암호화 신생항원에 반응성인, 증가한 수만큼의 CD4 T 세포 및 CD8 T 세포에 대한 면역 반응을 제공하는 데 유효함을 기술하고 있다. 게다가 본원에 기술된 조합으로 처리된 마우스 내 종양에는 백신 암호화 신생항원에 반응성인 T 세포가 다량으로 증량되어 있다. 다시 말해서 대표적인 신생항원 기반 백신과 RSLAIL-2의 조합이 유의미한 항종양 효과를 초래하였고, 강력한 신생항원 특이적 면역 반응을 유도하였다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 예시적 AH-1 단일 항원 펩타이드 백신은 RSLAIL-2와 조합하여 투여될 때, AH-1 백신 및 RSLAIL-2 각각이 단독으로 투여될 때에 비하여 종양 성장을 눈에 띄게 지연시켰고 생존률을 개선하였다. 그러므로 RSLAIL-2가 펩타이드 기반 암 백신과 조합될 때, 이 RSLAIL-2는 종양 성장을 지연시키고 생존률을 개선하는 데 유효하였다. 추가로 조합은, 이 조합이 암이 발생한 대상체에 투여될 때 현저한 항 종양 효과를 제공하는 능력에 관한 추가의 증거로서, 종양 조직 내 Pmel-1 세포 수를 늘리고, Treg 수를 줄이는 데 유효하였다.
본 명세서에 언급된 모든 논문, 서적, 특허, 특허 공개 및 기타 다른 간행물은 전체가 참고로 포함된다. 본 명세서의 교시와 참고로 포함된 기술 사이에 불일치가 있는 경우에는, (특히 본 명세서에 첨부된 청구범위에서 사용된 용어에 대해) 본 명세서의 교시 및 정의의 의미가 우선할 것이다. 예를 들어, 참고로 포함된 출원 및 간행물이 동일한 용어를 상이하게 정의하는 경우, 해당 용어의 정의는 정의가 있는 문헌의 교시 내에서 보존될 것이다.
실시예
다음의 실시예는 본원에 제공된 본 발명(들)의 범주를 설명하는 것으로 의도되며 제한하지 않는 것으로 의도된다는 것이 이해되어야 한다. 본 발명의 범주 내의 다른 양태, 이점 및 변형은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 명확할 것이다.
재료 및 방법
알데스루킨의 아미노산 서열(서열 번호 3)과 동일한 아미노산 서열을 가지는 재조합 인간 IL-2를 클로닝 및 발현시키고, 예시적 지속 작용성 IL-2Rαβ 편향 효현제(본원에서 RSLAIL-2라 지칭됨)를 제조하는 데 사용하였다.
"RSLAIL-2"란, PCT 국제특허출원공보 WO 2015/125159의 실시예 1의 절차에 따라 수득 가능한 조성물을 지칭하는 것으로, 총괄적으로는 IL-2의 다중 페길화된 형태를 포함하는 조성물을 지칭하며, 여기서 컨쥬게이트의 형성에 사용된 PEG 시약의 부착은 대상체에의 투여 후 탈락 가능하다.
NOUS-020 신생항원 백신: NOUS-020 구조체는 CT-26 마우스 종양 세포주로부터 유래하는 20개의 비 동의(non-synonymous) 단일 뉴클레오타이드 변이체(SNV)를 함유한다. NOUS-020 백신은 본원에 기술된 마우스 모델 연구에 사용될 CT26 마우스 종양 세포주 유래 신생항원 20개를 암호화하는 MVA 백신 및 대형 유인원 유래 아데노바이러스를 기반으로 한다. NOUS-020 삽입 서열은 도 11에 나타내어져 있다. 각각의 돌연변이를 위하여 아미노산 변화를 야생형 단백질 서열에 포함시키되, 상류 및 하류 둘 다에 신생항원 아미노산(총 길이 25개 아미노산) 중 아미노산 12개를 측접시켰다. 재조합 인공 단백질의 발현을 모니터링할 목적으로, 상이한 신생항원으로부터 유래하는 단백질 단편의 서열을 머리에서 꼬리로 연결시켜 HA 펩타이드 서열과 하류에서 융합된 인공 항원을 형성하였다.
실시예 1
MPEG2-C2- FMOC - 20KD - NHS에 의한 RIL -2의 페길화
1.44 mg/ml로 정제된 rIL-2(106.4 mL)를 첫 번째 용기에 채우고 나서, 53.6 mL의 제형 완충제(10 mM 아세트산 나트륨, pH 4.5, 5% 트레할로스)를 첨가하였다. pH가 4.62로 측정되고, 온도가 21.2℃로 측정되었다. PEG 시약인 C2-PEG2-FMOC-NHS-20K(WO　2006/138572에서 기술한 바와 같이 이용가능)(13.1 g)를 제2 용기 내에 채우고 나서, 73.3 mL의 2 mM HCl을 첨가하였다. 생성된 용액을 손으로 25분 동안 교반시켰다. 붕산나트륨(0.5 M, pH 9.8)을 제1 용기에 첨가하여 pH를 약 9.1로 상승시키고, 이어서 PEG 시약을 함유하는 제2 용기의 내용물을 1분 내지 2분의 기간에 걸쳐 제1 용기에 첨가하였다. 이어서 8.1 mL의 2 mM HCl을 제2 용기에 채움으로써 헹굼 단계를 수행하고, 제1 용기에 상기 내용물을 첨가하였다. 컨쥬게이션 반응에 있어서, 최종 rIL-2 농도는 0.6 mg/mL이고, 붕산나트륨 농도는 120 mM이며, pH는 9.1 +/-0.2이고, 온도는 20℃ 내지 22℃이며, 시약의 활성에 대한 조절 후 PEG 시약 대 rIL-2의 몰 비(치환 수준)는 35:1이었다. 컨쥬게이션 반응을 30분 동안 진행시킨 후, 여기에 2 N 아세트산 75 mL를 첨가하여 (pH를 대략 4까지 강하시켜) 산성화함으로써 ?칭(quenching)하였다. 생성물을 앞서 기술한 바와 같은 이온 교환 크로마토그래피로 정제하여, 주로 4량체, 5량체 및 6량체(이 4, 5 및 6은 r-IL-2에 방출가능하도록 공유 부착된 PEG 시약의 수를 지칭하는 것으로서, 8량체 및 이 이상의 정도로 페길화가 일어난 다량체는 크로마토그래피와 연관된 세정 단계 동안에 제거됨)로 이루어진 조성물을 제공하였다. 이 조성물을 본원에서는 "RSLAIL-2"라 칭한다.
실시예 2
RSLAIL -2의 수용체 편향성 및 면역 요법상의 관련 특성
IL-2 수용체에 대한 결합 친화성 및 면역자극 프로필과 관련된 수용체 편향성: RSLAIL-2의, IL-2Rα 및 IL-2Rβ에 대한 친화성을 표면플라스몬 공명법(Biacore T-100)으로 직접 측정하여, 이를 임상적으로 이용 가능한 IL-2(알데스루킨)의 IL-2Rα 및 IL-2Rβ에 대한 친화성과 비교하였다. EDC/NHS 화학을 이용하여 항인간 항체(Invitrogen)를 CM-5 센서 칩 표면에 커플링(coupling)하였다. 그 다음, 인간 IL-2Rα-Fc 또는 IL-2Rβ-Fc 융합 단백질 어느 하나를 이 표면에 대하여 포착된 리간드로서 사용하였다. RSLAIL-2 및 이의 활성 IL-2 컨쥬게이트 대사체(1-PEG-IL-2 및 2-PEG-IL-2)의 일련의 희석액을 아세트산염 완충제(pH 4.5) 중에 제조하였다(5 mM에서 출발). 이 희석액들을 5분 동안 리간드와 결합하도록 허용하고, 결합된 반응 단위(RU)를, 농도에 대해 플롯화하여 EC50 값을 결정하였다. 각각의 이소폼의, 각각의 IL-2 수용체 서브타입에 대한 친화성을 IL-2의, IL-2 수용체 서브타입에 대한 친화성을 기준으로 하는 배수 변화로서 산정하였다.
RSLAIL-2의 시험관 내 결합 및 활성화 프로필은, 페길화가, 알데스루킨에 비해 IL2 및 IL2Rα 간 상호작용을 방해함을 암시하였으며; 이러한 효과가 생체 내 면역 세포 서브타입의 프로필을 편향시키는지를 확인하기 위한 연구를 수행하였다. RSLAIL-2 또는 IL2 중 어느 하나를 투여한 후 종양 내 CD8 T 세포 및 Treg 세포의 수는, (RSLAIL-2에서처럼) IL2/IL2Rα 계면에서의 IL2와 폴리(에틸렌 글리콜)의 컨쥬게이션으로 말미암아 IL2의 다면발현효과가 변동되었는지에 관한 중요한 척도이다. 의문을 해결하기 위해, 피하 B16F10 마우스 흑색종 종양을 보유하는 마우스를 RSLAIL-2 단일 용량 또는 알데스루킨 5회분 용량으로 처리한 다음, 종양 미세환경 내 면역 세포를 유세포분석으로 정량하였다. 결과들을 도 1a 내지 1g에 나타내었다.
알데스루킨 처리된 마우스의 종양에 있어서, 총 CD8 세포 및 기억 CD8 세포는 증가하였지만(종양 침습 림프구의 백분율로 파악); 이러한 효과는 일시적이었으며, 5일에는 비히클 투여시에 비하여 유의미한 정도에 이르게 되었다. 반대로, RSLAIL-2만이 단독 투여된 후에는 유의미하고(P < 0.05) 지속적인 총 CD8 T 세포 자극 및 기억 CD8 T 세포 자극이 달성되었는데, 이 경우 알데스루킨 처리시에 비하여 (7일에서의) 기억 CD8 T 세포 백분율 및 (7일 및 10일에서의) 총 CD8 T 세포 백분율은 월등히 컸다. RSLAIL-2 처리 및 알데스루킨 처리는 둘 다 처리 개시후 5일 및 7일 경과시에 활성화된 자연 살해(NK) 세포의 증가를 초래하였지만, 이 효과는 10일에 이르기까지 사라졌다. 5일에, 종양 침습 림프구 중 CD4 세포 백분율은 비히클 처리시에 비해 RSLAIL-2 처리시 감소하였다. 10일에, RSLAIL-2는 비히클 및 알데스루킨에 비하여 더 낮은 CD4 세포 백분율을 초래하였다. CD4 세포 집단을, Treg 집단을 정의하는 FoxP3+ 서브세트에 대해 더 분석하였다. RSLAIL-2 투여는 매 시점마다 Treg의 백분율을 감소시켰는데, 이는 PEG 사슬로부터 유래하는 IL2Rα 서브유닛에 대한 접근경로가 감소한 것과 일치하였다. 반대로, 알데스루킨에 의한 Treg 감소는 5일에 유의성을 달성하면서도 보통의 수준이었다. CD8 T 세포의 증가와 Treg의 감소는, 7일이 될 때까지 종양 내 CD8/Treg 비의 상당한 증가를 유도하였다. RSLAIL-2, 알데스루킨 및 비히클 투여시의 CD8/Treg 비는 각각 449, 18 및 4였는데, 이 점은 RSLAIL-2에 대해서 IL2 수용체 알파보다는 IL2 수용체 베타가 우선적으로 활성화됨을 뒷받침해준다.
면역조직화학적 염색을 수행한 결과, CD8 T 세포는 그 수가 증가하였을 뿐만 아니라, 종양 세포 속에 존재하였음을 확인하였다. 이러한 결과는, RSLAIL-2가, 종양 내 Treg의 상응하는 자극을 일으키지 않고도 시험관 내 IL2Rβ 편향 결합 프로필과 일관되게, 비변형 IL-2(알데스루킨)에 의해 보이는 것보다 더 강력한 생체 내 기억 효과기 CD8 T 세포 반응 유도하는 데 유효함을 나타낸다. 다시 말해서, RSLAIL-2는 Treg보다 효과기 CD8+ T 세포 및 NK 세포를 우선적으로 활성화하고 증식시키는 데 유효하다.
실시예 3
RSLAIL -2의 종양 노출
본 연구의 목적은, B16F10 흑색종 세포가 이식된 C57BL/6 마우스에서 RSLAIL-2의 항종양 활성을 알데스루킨의 항종양 활성과 비교하여 평가하는 것이었다.
C57BL/6 마우스의 오른쪽 옆구리에 B16F10 흑색종 세포(동물당 1 × 106개)를 피하 이식하였다. 이식 후 7일에, 종양이 200 mm3으로 측정되면, 동물에 RSLAIL-2(2 mg/kg × 1) 또는 알데스루킨(매일 3 mg/kg × 5)을 투여하였다. 종양을 수집하고(관찰 시간당 n = 4), 프로테아제 억제제(Roche) 및 0.25% 아세트산을 함유하는 얼음 냉각 PBS에서 균질화한 다음, 원심분리하여, 상청액을 수득하였다. 종양 조직 내 RSLAIL-2 수준을 정량하기 위해, 상청액을 37℃에서 밤새 pH 9의 완충제 중에 항온처리하여, IL2로부터 PEG를 방출시켰다. 인간 IL2에 특이적인 샌드위치 ELISA에 의해 IL2를 측정하였다. AUC를 산정하기 위해, 비구획 모델을 사용하여 데이터를 Pheonix WinNonLin에 피팅하였다. 1일에서의 AUC에 5를 곱하여 알데스루킨 처리 후의 AUC를 추산하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 종양 알데스루킨 수준은 급속하게 C max에 도달하였으며, 이후에는 급속하게 감소하여, 매 투여 후 24시간에서의 농도는 4 ng/g 미만이었고, 매일의 AUC는 0.09 ± 0.02 μg/시간/g이 되었다. 반대로, RSLAIL-2는 1회 투여 후 8일까지 종양 내에서 검출될 수 있었는데, 이때 AUC는 30 ± 6.9 μg/시간/g에 이르게 되었다. AUC를 기반으로 하였을 때, RSLAIL-2의 1회 투여는 알데스루킨이 매일 5회 투여되었을 때에 비하여, 심지어 RSLAIL-2가 사용되었을 때에는 7.5배 더 작은 당량의 IL2가 투여되었을 때에 비하여, 67배 더 많은 노출을 유도하였다(매일 3 mg/kg × 5 = 15 mg/kg vs. 2 mg/kg). 그러므로, IL2 당량을 기반으로 노출을 정규화하였을 때, RSLAIL-2는 알데스루킨 처리시보다 500배 증가한 노출을 달성하였다. RSLAIL-2의 컨쥬게이션된 활성 IL-2 형태(2-PEG-IL2 및 1-PEG-IL2 모두)도 또한 정량한 결과, 5일까지는 종양 내에서 검출 가능한 상태였으며, 이때 AUC는 23 ± 4.4 μg/g에 달하였다. 그러므로 컨쥬게이션된 활성 IL2에 대한 노출은 알데스루킨의 경우에 비하여 50배 더 많았는데, 이는 곧 동일 용량의 알데스루킨이 투여되었을 때에 비하여 노출이 380배 증가한 것으로 해석된다. 따라서, 마우스 내 RSLAIL-2의 종양 노출은, 5일 주기 2회차 동안 매일 2회 투여되었던 알데스루킨의 경우와는 비교되게, 9일마다 1회 투여를 허용하였다.
실시예 4
마우스 B16 흑색종 모델내 예시적 백신인 GP100에 대한 반응 개선에 있어서 RSLAIL-2의 효능 평가
마우스 B16 흑색종 모델을 사용하여 RSLAIL-2가 백신화 유도성 종양 특이적 효과기 CD8+ T 세포의 증식 및 기능을 유효하게 촉진할 수 있었는지를 확인하기 위한 연구를 수행하였다. 이 연구에서는 RSLAIL-2 및 비변형 IL-2 둘 다의, 예시적 펩타이드 백신의 치료 효능을 증진시키는 능력을 비교하였다.
부위당 300,000개의 B16 야생형 세포를 접종하고 나서 7일에 연구를 개시하였다. 본 연구에서 처녀 gp100 특이적 TCR 유전자이식 pmel-1 CD8+ T 세포를, 확립된 피하 B16 종양을 보유하는 C57BL/6 마우스에 양자 전달하고 나서, (i) GP-100(당단백 100) 펩타이드 백신(50 μg/마우스), 항 CD40 mAb(50 μg/마우스) 및 TLR-7 효현제, R848(레시퀴모드, 이미다조퀴놀린, 1팩당 5 마리 마우스) 함유 백신 제제 단독, 또는 (ii) RSLAIL-2(IL-2 기준, 0.2 mg/kg)와의 조합, 또는 (iii) 고용량 또는 저용량 중 어느 하나의 경우의 비변형 IL-2(알데스루킨)과의 조합으로 백신화하였다. 그 다음, 8일마다 마우스에 RSLAIL-2 또는 IL-2(고용량)를 1회 투여하였다. 처리군은 다음과 같았다:
처리군
1군 미처리
2군 IL-2 고용량: (0일, 1일 및 2일, 100,000 IU × 5회 투여); 8일마다 본 투여 회차 반복
3군 IL-2 저용량: 매일 62,500 IU/마우스
4군 RSLAIL-2: 단백질 기준, 0.2 mg/kg
5군 GP100 펩타이드/항CD40/TLR-효현제(백신 칵테일 단독)
6군 GP100 펩타이드/항CD40/TLR-효현제 + IL-2 고용량(0일, 1일 및 2일, 100,000 IU × 5회 투여); 8일마다 본 투여 회차(100,000 IU × 5회 투여) 반복
7군 GP100 펩타이드/항CD40/TLR-효현제 + IL-2 저용량(매일 62,500 IU/마우스)
8군 8일마다 GP100 펩타이드/항CD40/TLR-효현제 + RSLAIL-2(0.2 mg/kg)
혈액 중 종양 성장, 생존률 및 T 세포 반응을 모니터링하고, 종양 및 비장 중 효과기 pmel-1 CD8+ T 세포 및 CD4+ Foxp3+ Treg의 편재화를 분석하였다. 5일, 7일, 12일, 15일 및 20일과 처리 과정 내내 T 세포 반응을 측정하였다. 도 3a 내지 3h는, 1군 내지 8군 각각에 대한 처리 과정 중 종양 크기(mm2)를 나타내는 플롯이다. 도 3h에 나타낸 바와 같이, 칵테일로서 제형화된 RSLAIL-2 및 예시적 펩타이드 백신의 조합 처리군은, 다른 처리군의 경우에 비하여 종양 성장을 지연시키는 데 특히 유효하였다. 도 4는, 비교의 편의를 도모하기 위해 연구군 각각에 대한 처리 과정 중 평균 종양 크기(mm2)를 나타내는 그래프이다. 도 4에 나타낸 바와 같이, RSLAIL-2, 즉 예시적 지속 작용성 IL-2Rαβ 편향 효현제는 백신화 이후에 투여될 때, 사용된 마우스 모델 내 종양 성장을 유의미하게 지연시키는 데 유효하였고, 백신화만 단독으로 행하여졌을 때 또는 고용량 IL-2 또는 저용량 IL-2 중 어느 하나의 투여가 동반되어 백신화가 행하여졌을 때에 비하여, 눈에 띄게 개선된 반응을 달성하였다. 도 4를 참조하면, 예를 들어 처리 후 대략 38일에 백신화/RSLAIL-2 처리군에 있어서 평균 종양 크기는 대략 25 mm2이었던 반면에, (종양 성장을 늦추는 효능의 관점에서) 가장 가까운 결과를 나타낸 처리군, 즉 백신화/저용량 IL-2 처리군에 있어서 평균 종양 크기는 대략 125 mm2이었는데, 이는 백신 요법이 동반될 때 RSLAIL-2와 같은 IL-2Rαβ 편향 효현제가 치료 반응을 개선하는 능력이 월등함을 보여주는, 놀라울 정도의 차이였다.
도 5는 gp100 특이적 T 세포 기능과 연관된 플롯으로서, 즉 상기 기술된 다양한 처리군에 대한 처리 과정 중의 (pmel-1의 백분율로 표현되는) IFN-g+ T 세포를 나타내는 플롯이다. 이 플롯은, 90%를 초과하는 안정적이고 지속적인 IGN-g+T 세포(pmel-1) 반응이 GP100/항 CD40/TRL-7 효현제/RSLAIL-2 처리군에 대한 백신화 후 약 40일까지 이어지고; 백신/RSLAIL-2 조합 요법 실시군에서는 다른 처리군에 비하여 IFN-g+ T 세포(pmel-1) 반응이 최고의 백분율에 도달 및 유지되었음을 나타내고 있다. 게다가 백신/RSAIL-2 조합 요법 유도성 IGN-g+T 세포(pmel-1) 반응은 다른 처리군에서보다 더 느리게 감소하였다.
도 6은 처리군 각각에 대한 생존률 %를 나타내는 플롯이다. 처리 과정 중의 종양 크기를 나타내는 플롯들(도 3a 내지 3h 및 도 4)과 일관되게도, 백신/RSLAIL-2 처리군(GRP8)의 생존률은 다른 처리군의 생존률에 비하여 유의미하게 증가하였다. 펩타이드 백신/지속 작용성 IL-2Rαβ 편향 효현제 처리군 대상체의 100%는 약 57일 동안 생존하였고, 대략 62일경에는 생존률이 50%가 되었으며; 요법에 대한 긍정적인 반응을 나타내는 관점에서 그 다음으로 가장 가까운 결과를 나타낸 처리군, 즉 펩타이드 백신/저용량 IL-2 군에서는 대략 32일경까지 생존률 100%가 관찰되었고, 약 48일에는 생존률이 50%가 되었다.
도 7은 처리 과정 동안의 각각의 처리군에 대한 pmel 세포 %(총 CD8+ T 세포의 백분율로 표현)를 나타내는 플롯이다. RSLAIL-2가 GP-100 백신과 조합되면, 펩타이드 백신 요법과 함께 행하여진 고용량 및 저용량 IL-1 처리 둘 다의 경우와 비교되었을 때 눈에 띄게 증가한 pmel-1 반응을 나타내었다.
도 8은 실시예 4에 기술된 연구 군 각각에 대한, 확립된 피하 B16 종양을 보유하는 C57BL/6 마우스에서의 처리 과정 동안의 조절 T 세포, 즉 CD25+Foxp3+ T 세포를 CD4 세포의 백분율로 표현하여 나타내는 플롯이다. 이 플롯으로부터 볼 수 있는 바와 같이, RSLAIL-2 유도성 조절 T 세포의 백분율은 각각의 투여 회차 종료 즈음에 급속하게 감소한다.
RSLAIL-2, 즉 예시적 지속 작용성 IL-2Rαβ 편향 효현제는, 백신화와 함께 처리되었을 때 현저한 상승효과를 나타내어, 백신화만 단독으로 수행되었을 때 또는 비변형(즉, 비 지속 작용성) IL-2의 고용량 처리 방식 또는 저용량 처리 방식 둘 다로서의 투여가 동반되었을 때에 비하여, 종양 성장을 강력하게 억제하였고, 마우스의 생존률을 유의미하게 개선하였다. RSLAIL-2는 종양 내 pmel-1 CD8+ T 세포 수를 더 증가시켰고, 면역억제성 Treg 수는 더 감소시켰다. RSLAIL-2는 30일에 걸친 시간 동안 종양 내 Treg보다 pmel-1 CD8+ T 세포를 높은 비로 안정적으로 유지시키는 데 유효하였다. 매우 강력한 CD8+ T 세포 반응 및 항 종양 활성의 유도에도 불구하고, 육안적 독성(gross toxicity)은 관찰되지 않았다.
실시예 5
마우스 B16 흑색종 모델 내 예시적 백신인 GP100에 대한 반응을 개선함에 있어서 RSLAIL -2의 효능에 관한 심화 평가 - 종양, 비장 및 혈액 중 pmel 및 Treg 분석
상기 실시예 4에 기술된 바와 같이, 마우스 B16 흑색종 모델을 사용함으로써 RSLAIL-2가 예시적 펩타이드 백신과 조합하여 투여될 때, 이 조합이 효과기 CD8+ T 세포 및 Treg의 종양 및 비장에의 편재화에 미치는 영향을 관찰하기 위한 연구를 수행하였다.
본 연구에서 처녀 gp100 특이적 TCR 유전자이식 pmel-1 CD8+ T 세포를, 확립된 피하 B16 종양을 보유하는 C57BL/6 마우스에 양자 전달하고 나서, (i) GP-100, 즉 당단백 100 펩타이드 백신(50 μg/마우스), 항 CD40 mAb(50 μg/마우스) 및 TLR-7 효현제, R848(레시퀴모드, 이미다조퀴놀린, 1팩당 5 마리 마우스) 함유 칵테일 단독, 또는 (ii) RSLAIL-2(IL-2 기준, 0.2 mg/kg)와의 조합, 또는 (iii) 고용량 IL-2(알데스루킨)과의 조합으로 백신화하였다. 그 다음, 8일마다 마우스에 RSLAIL-2 또는 IL-2(고용량)를 1회 투여하였다. 처리군은 다음과 같았다:
처리군
1군 미처리
2군 GP100 펩타이드/항CD40/TLR-효현제 + IL-2 고용량(0일, 1일 및 2일,100,000 IU × 5회 투여); 8일마다 본 투여 회차 반복
3군 8일마다 GP100 펩타이드/항CD40/TLR-효현제 + RSLAIL-2(0.2 mg/kg)
4군 GP100 펩타이드/항CD40/TLR-효현제(백신 칵테일 단독)
종양 세포 및 비장 세포 시료를 수집하고 나서, 처음에 고정 가능 생존능 지시제(fixable viability indicator)로 처리한 다음, 살아있는 면역 세포를 염색하였다. 시료 각각에 대한 살아있는 면역 세포의 총수를 계수하여, 대상 세포 유형에 대한 총 이벤트(total event)를 게이팅(gating)/수집하는 데 사용하였다. 유세포분석기 판독 결과의 요약된 미가공 데이터로부터 1차적 세포 개수를 추론한 다음 분석하였다. 도 9는 5, 7, 10 및 30일 각각에서의 처리군 2, 3 및 4의 종양 1 그램당 Thy1.1+ pmel-1 세포 수를 나타내는 막대 그래프이다. 볼 수 있는 바와 같이, 고용량 IL-2 또는 RSLAIL-2 중 어느 하나의 투여가 동반되는 백신 처리시와 비교하였을 때, RSLAIL-2는 IL-2보다 종양 조직 내에서 유의미하게 더 크고 안정적인 Pmel-1 반응을 유도함에 있어서 유효하였다. 도 10은 5, 7, 10 및 30일 각각에서의 처리군 2, 3 및 4의 비장 1 그램당 Thy1.1+ pmel-1 세포 수를 나타내는 막대 그래프이다. 볼 수 있는 바와 같이, 종양 미세환경과 유사한 환경에서 고용량 IL-2 또는 RSLAIL-2 중 어느 하나의 투여가 동반되는 백신 처리시와 비교하였을 때, RSLAIL-2는 IL-2보다 비장 내에서 유의미하게 더 크고 안정적인 Pmel-1 반응을 유도함에 있어서 유효하였다. 상기 실시예 4에 기술된 결과와 유사하게, 7일에 RSLAIL-2는 종양 내 조절 T 세포(Treg)의 감소를 유효하게 매개하였고, 적어도 30일까지 이어져 종양 내 Treg 최소 개수를 유지하였다. 처리 과정 중 다양한 면역 세포 유형의 평가를 바탕으로 하였을 때(Treg 및 비 Treg), 펩타이드 백신이 IL-2가 아닌 RSLAIL-2와 조합되었을 때, 종양뿐만 아니라 비장 내 더 높은 Pmel 대 Treg 비를 나타내었다. 이 데이터를 종합하여 보았을 때, 예시적 IL-2Rαβ 편향 효현제인 RSLAIL-2는 오랜 기간 동안 종양 조직 내 많은 수의 Pmel-1 세포 및 적은 수의 Treg를 안정적으로 유지함에 있어서 IL-2보다 훨씬 더 우수한 것으로 보인다. 또한 RSLAIL-2는 종양에 Treg가 축적되는 것을 특이적으로 억제하였고, 처리 후 30일까지 종양 조직내 Pmel 대 Treg의 비가 높게 유지되는 것을 촉진하였다.
실시예 6
NOUS -020 GAd 백신의 면역원성
BALB/c 근친교배 마우스에 바이러스 입자(viral particle; vp)를 5 × 108개의 용량으로 1회 근육내 투여하여 면역화한 후 NOUS-020 GAd 백신의 면역원성을 평가하였다. 면역화 후 3주 경과시 비장 세포를 수집한 다음, 암호화된 각각의 신생항원 백신에 상응하는 합성 펩타이드 존재 하에 세포를 자극함으로써 IFN-γ ELISpot으로 시험하였다. 세포를 포함하는 음성 대조군 배양액을, 펩타이드 희석제인 설폭시화디메틸(DMSO)의 존재 하에 배양 배지만으로 자극하였다. 면역 반응(비장세포 백만개당 IFN-γ를 생산하는 T 세포 수)을 관련 도면에 나타내었다. 만일 항원 웰 평균이 15 SFC/106 PBMC를 초과하고, DMSO 웰의 백그라운드 값의 3배를 초과하면, 해당 반응은 양성인 것으로 간주하였다. ELISpot 검정에서 면역원성이었던 신생항원 5개로 이루어진 풀에 의한 세포내 IFN-γ 사이토카인 염색에 의해 T 세포 반응의 품질(CD4 및 CD8)을 분석하였다. 면역 반응(비장세포 백만개당 IFN-γ를 생산하는 T 세포 수)을 도 12a 및 12b에 나타내었다. 볼 수 있는 바와 같이, NOUS-020 GAd 백신은 CD4 T 세포 및 CD8 T 세포를 유도하였다.
실시예 7
NOUS -020 GAd - MVA 백신의 면역원성
NOUS-020 GAd-MVA 백신의 면역원성을 프라이밍-면역증강 연구에서 평가하였다. BALB/c 근친교배 마우스를 GAd(용량: 5 × 108개 바이러스 입자)로 프라이밍한 다음, 4주차에 MVA(107 pfu)로 면역증강하였다. 비장세포를 신생항원 암호화 백신 20개로 이루어진 풀로 IFN-γ ELISpot 자극시켜 면역증강한 후 1주차에 백신 유도성 반응을 분석하였다. 세포를 포함하는 음성 대조군 배양액을, 펩타이드 희석제인 설폭시화디메틸(DMSO)의 존재 하에 배양 배지만으로 자극하였다.
면역 반응(비장세포 백만개당 IFN-γ를 생산하는 T 세포 수)을 도 13b 및 13c에 나타내었다. 만일 항원 웰 평균이 15 SFC/106 PBMC를 초과하고, DMSO 웰의 백그라운드 값의 3배를 초과하면, 해당 반응은 양성인 것으로 간주하였다. ELISpot 검정에서 면역원성이라는 결과가 나온 신생항원 5개로 이루어진 풀에 의한 세포내 IFN-γ 사이토카인 염색에 의해 T 세포 반응의 품질(CD4 및 CD8)을 분석하였다. ELISpot 검정에서 면역원성인 것으로 판명된 신생항원 5개로 이루어진 풀에 의한 세포내 IFN-γ 사이토카인 염색에 의해 T 세포 반응의 품질(CD4 및 CD8)을 분석하였다. 나타낸 바와 같이, 신생항원 백신은 CD4 T 세포 및 CD8 T 세포에 대한 반응을 유도하였다. 도 13a는 CD8 반응 및 CD4 반응을 유도하는 신생항원을 나타내는 구조체의 개략도를 제공한다. 도 13b는 처녀 마우스에서 GAd/MVA 면역화후 측정된 T 세포 반응의, 신생항원 암호화 백신 20개로 이루어진 풀을 대상으로 한 IFN-γ ELISpot에 의한 분석 결과를 제공한다.
실시예 8
마우스 CT26 종양 모델에 있어서 NOUS -020 GAd -CT26 신생항원 백신 및 RSLAIL-2의 조합 처리(초기 치료 환경)
NOUS-020 백신 및 RSLAIL-2의 동시 투여(0일, NOUS-020 GAd 백신 및 RSLAIL-2) 및 순차 투여(0일에는 GAd 투여, 7일에는 RSLAIL-2 투여)에 관한 치료 효능을 BALB/c 마우스 내 CT26 종양 성장으로써 평가하였다.
처리 3일전에 CT26 결장 암종 세포를 BALB/c 마우스에 주입하였다. 이로부터 3일 후(0일), 마우스를 (i) NOUS-020 GAd 백신으로 단독 처리하거나(근육내, 용량 = 5 × 108개 바이러스 입자), (ii) RSLAIL-2로 단독 처리하거나(정맥내, 0.8 mg/kg, q9x3), 또는 NOUS-020 GAd 백신과 RSLAIL-2의 조합을 (iii) 0일에 동시 투여하거나 또는 (iv) 0일에는 NOUS-020 GAd 백신을 투여하고, 7일에는 RSLAIL-2를 투여하는 순차 투여 계획에 따라 처리하였다.
각각의 처리군에 대한 경시적 종양 부피를 기록하였다. 그 결과를 도 14a 내지 14f에 나타내었다. 도 14a는 대조군(미처리군)에 대한 결과를 제공하고; 도 14b는 GAd 백신으로 단독 처리한 마우스 내 CT26 종양의 부피를 나타내며; 도 14c 및 14d는 RSLAIL-2 처리 마우스(0일과 7일에 각각 투여)와, RSLAIL-2 및 GAd 각각을 0일에 동시 투여하거나(도 14e) 순차 투여한(도 14f) 마우스에서의 CT26 종양 부피를 나타낸다.
도면들에서 볼 수 있는 바와 같이, 7일에 RSLAIL-2를 투여하였을 경우, 초기 치료 환경(즉, 종양 덩어리가 크기를 측정할 수 있을 정도로 성장하기 전)에서 NOUS-020 GAd 백신의 효능은 현저하게 개선되었다.
NOUS-020 GAd 백신 및 RSLAIL-2의 조합 투여를 위한 다양한 처리 계획을 더 탐구하기 위해, 처리 간격이 상이하였을 때에 대하여 연구하였다.
BALB/c 마우스를 CT26 종양 세포로 면역공격하고 나서 3일 경과시(0일), 이 마우스에 NOUS-020 GAd 백신(0일, 5 × 108개 바이러스 입자), 또는 NOUS-020 GAd(0일 투여) 및 RSLAIL-2(3, 5 또는 7일에 투여)의 조합을 투여하였다. 다양한 처리군에서 종양 성장을 경시적으로 모니터링하였다. 이하 표 3은, 매 처리 방식에 대한 연구의 종료시 무종양 마우스의 백분율을 나타낸다.
투여 계획 대 완전 반응
처리계획 무종양 마우스 %
(완전 반응 % )
NOUS-020 GAd 6%
NOUS-020 GAd + RSLAIL-2 (3일) 28%
NOUS-020 GAd + RSLAIL-2 (5일) 70%
NOUS-020 GAd + RSLAIL-2 (7일) 80%
표 3의 데이터를 바탕으로 하였을 때, GAd 백신화와 RSAIL-2 단일 용량 투여 간 간격은 상승적 활성에 영향을 미치는 것으로 보인다. 상기 데이터를 바탕으로 하였을 때, RSAIL-2는 백신화 이후 5일을 초과하여 경과하였을 때(예를 들어, 백신화 이후 6일, 또는 7일, 또는 8일, 또는 9일, 또는 10일 또는 그 이상 경과하였을 때) 처음 투여되는 것이 바람직한 것으로 보였다.
실시예 9
마우스 CT26 종양 모델에 있어서 확립된 종양의 NOUS -020 GAd - MVA CT26 신생항원 백신 및 RSLAIL -2에 의한 조합 처리
BALB/c 마우스를 CT26 세포로 면역공격하였다. 1주일 후, 100 mm3의 종양 덩어리를 가지는 마우스를 무작위로 2개의 군, 즉 RSLAIL-2 단독 처리된 제1 군과, NOUS-020 및 RSLAIL-2의 조합이 처리된 제2 군으로 각각 나누었고(0일), 또한 0일에는 5 × 108 개 바이러스 입자를 투여하였으며, 6일에는 0.8 mg/kg만큼을 정맥내 투여하였다. 14일, 22일, 36일, 43일 및 46일에, RSAIL-2를 반복 투여하였다. 28일에는 조합 처리를 받은 군을 MVA로 면역증강하였는데, 이 때 MVA는 107 pfu의 용량으로 근육내 주사하였다. 종양 부피를 경시적으로 모니터링하였다. 그 결과를 도 15a(RSAIL-2만 투여시) 및 도 15b(NOUS-020 및 RSAIL-2 투여시)에 나타내었다. RSLAIL-2가 단독 투여된 군은 44%의 반응률(response rate)을 보였는데, 이 경우 완전 반응 개체는 2마리였고, 부분 반응 개체도 2마리였다(부분 반응 = 종양 수축률이 40%를 초과하되, 종양이 완전히 사라지지는 않는 반응). 이와 반대로, 상기 기술된 바와 같이 NOUS-020 및 RSLAIL-2의 조합이 투여된 군은 처리에 대해 89%의 반응을 보였는데, 이 경우 완전 반응 개체는 4마리였고, 부분 반응 개체도 4마리였다.
이러한 결과들은, 예시적 마우스 신생항원인 NOUS-020 암 백신과 RSLAIL-2의 조합 요법이, 확립된 종양을 가지는 마우스를 치료함에 있어서 유효하였음을 나타낸다.
54일에, NOUS-020 및 RSLAIL-2의 조합 투여군 또는 RSLAIL-2 단독 투여군으로부터 유래한 반응 개체 마우스를 죽였다. 2개의 별도 펩타이드 풀(즉, 면역원성 신생펩타이드 상위 5개로 이루어진 제1풀, 및 나머지 15개의 백신 암호화 신생펩타이드를 함유하는 제2 풀)의 존재하에 자극된 비장 세포를 세포내 IFN-γ 염색하여 항원 특이적 T 세포 반응의 평가를 수행하였다. 그 결과들을 도 16a(RSLAIL-2 단독 투여시) 및 도 16b(NOUS-020 및 RSLAIL-2 투여시)에 나타내었다.
실시예 10
마우스 C26 결장 암종 모델에 있어서 백신화와 조합되어 투여된 RSLAIL -2의 항종양 효과
BALB/c 마우스(군당 5마리 마우스)의 C26 결장 암종 모델을 대상으로 RSLAIL-2 투여와 조합하여 수행된 예시적 단일 항원 펩타이드 백신(AH1 펩타이드) 사용으로 인한 백신화에 대한 항종양 면역 반응을 관찰하기 위한 연구를 수행하였다.
마우스당 1 × 106개의 CT26 야생형 세포를 접종하고 4일 후(0일)에 연구를 개시하였다. 연구군은 하기와 같았다:
1군(미처리);
2군: RSLAIL-2만을 처리, 8일마다 0.8 mg/kg씩 투여;
3군: AH1 백신 제형만을 처리. 백신은 AH1 펩타이드(CT26에서 발현된 gp70(423-431)으로부터 유래하는 면역우세 CD8 에피토프, 아미노산 서열 SPSYVYHQF(Huang, A., et al., Immunology. Proc . Natl . Acad . Sci, USA, 93, 9730-9735 (1996)), 25 μg/마우스), 항 αCD-40 mAB(50 μg/마우스), 및 toll-유사 수용체 7 효현제, 이미퀴모드, 1팩당 5마리 마우스)을 포함하였으며, 5일 및 13일에 투여;
4군: AH1 백신(AH1 펩타이드, gp70(423-431), 25 μg/마우스/항 αCD-40 mAB(50 μg/마우스)/이미퀴모드, 1팩당 5마리 마우스) 및 RSLAIL-2(0.8 mg/kg)를 4일 및 12일에 투여.
종양 부피를 경시적으로 모니터링하였다. 결과들을 도 17a 및 도 17b에 나타내었다. 도면들에 나타낸 바와 같이, AH-1 백신과 RSLAIL-2 둘 다는 단독으로 투여되었을 때 종양 성장을 지연시키긴 하였지만, 이 두 가지가 조합 투여되었을 때에는 유의미한 항 종양 효과가 관찰되었다(생존률 20%).
결과: 결장암 마우스 모델에서, 예시적 AH-1 단일 항원 펩타이드 백신은 RSLAIL-2와 조합하여 투여될 때, AH-1 백신과 RSLAIL-2 각각이 단독으로 투여되었을 때에 비하여, 종양 성장을 현저하게 지연시켰고, 생존률을 개선하였다.
상기 기술된 바와 같이, AH1 펩타이드 백신, RSLAIL-2, 또는 이 둘의 조합 중 어느 하나로 처리된, CT26-종양 처리 마우스의 비장 및 종양 내 종양 CD8+ T 세포 대 Treg의 편재화를 확인하기 위해 별도의 연구를 수행하였다. 7일에 종양 세포 시료 및 비장 세포 시료를 수집하고 나서, 처음에 고정 가능 생존능 지시제로 처리한 다음, 살아있는 면역 세포를 염색하였다. 시료 각각에 대한 살아있는 면역 세포의 총수를 계수하여, 대상 세포 유형에 대한 총 이벤트를 게이팅/수집하는 데 사용하였다. 유세포분석기 판독 결과의 요약된 미가공 데이터로부터 1차적 세포 개수를 추론한 다음, 분석하였다. 결과를 도 18a 및 도 18b에 나타내었다.
결과: 도면에 제공된 바와 같이, RSLAIL-2 투여와 함께 행하여진 백신화는, 비장에서보다 종양 내에서 CD8 T 세포 대 Treg의 유의미하게 더 높은 비를 달성하였다. 그러므로 RSLAIL-2 투여를 백신화와 함께 행하는 것은, 백신화만 행하거나 RSLAIL-2만을 단독 투여하는 것 중 어느 하나에 비하여 종양 조직 내 유의미하게 더 크고 안정적인 Pmel-1 반응을 유도하는 데 유효하였다.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
<110> NEKTAR THERAPEUTICS <120> IMMUNOTHERAPEUTIC TUMOR TREATMENT METHOD <130> SHE0530.PCT <140> PCT/US2017/060911 <141> 2017-11-09 <150> 62/582,852 <151> 2017-11-07 <150> 62/420,442 <151> 2016-11-10 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 153 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu 20 25 30 Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe 50 55 60 Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu 65 70 75 80 Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys 85 90 95 Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile 100 105 110 Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala 115 120 125 Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu 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Val Ala Val Gln Lys Leu Asn Leu Gln Asn Leu 325 330 335 Val Ile Leu Gln Ala Pro Glu Asn Leu Thr Leu Ser Asn Leu Ser Glu 340 345 350 Ser Asp Arg Asn Lys Glu Ser Ser Asp Gln Thr Ser Val Asn Met Asn 355 360 365 Gly Leu Glu Asn Lys Ile Ser Tyr Leu Leu Pro Phe Tyr Pro Pro Asp 370 375 380 Glu Ala Leu Glu Ile Gly Leu Glu Leu Asn Ser Ser Ala Leu Pro Pro 385 390 395 400 Thr Ile Leu Pro Gln Ala Pro Ser Gly Pro Ser Tyr Ala Thr Tyr Leu 405 410 415 Gln Pro Ala Gln Ala Gln Met Leu Thr Pro Lys Pro Leu Arg Arg Asn 420 425 430 Asn Ser Tyr Thr Ser Tyr Ile Met Ala Ile Cys Gly Met Pro Leu Asp 435 440 445 Ser Phe Arg Val Ile Gln Thr Ser Lys Tyr Tyr Met Arg Asp Val Ile 450 455 460 Ala Ile Glu Ser Ala Trp Leu Leu Glu Leu Ala Pro His Ile His Arg 465 470 475 480 Ala Gly Gly Leu Phe Val Ala Asp Ala Ile Gln Val Gly Phe Gly Arg 485 490 495 Ile Gly Lys His Phe Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser 500 505 510 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 6 Ser Pro Ser Tyr Val Tyr His Gln Phe 1 5

Claims (33)

  1. 암이 발병한 대상체에 백신과 IL-2Rβ 활성화량만큼의 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제를 투여하는 단계를 포함하며, 상기 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제는 약 0.7 mg/kg 미만의 용량으로 투여되는, 투여 방법.
  2. 암이 발병한 대상체에 암 백신과 IL-2Rβ 활성화량만큼의 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제를 투여하는 단계를 포함하며, 상기 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제는 0.7 mg/kg 미만의 용량으로 투여되고, 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제의 투여는 백신에 대한 대상체의 반응을 개선하는 데 유효한, 암 백신의 치료적 효능을 증진시키는 방법.
  3. 대상체에 암 치료 유효량만큼의 백신과 IL-2Rβ 활성화량만큼의 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제를 투여하는 단계를 포함하며, 상기 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제는 약 0.7 mg/kg 미만의 용량으로 투여되고, 암 마우스 모델에서 동량의 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제 및 백신을 사용하여 평가되었을 때, 백신과 비 지속 작용성 형태의 IL-2 효현제를 투여하는 것에 비하여 두 치료 각각에 있어서의 50% 최대 종양 성장률 사이의 시간상의 지연을 바탕으로 하였을 때 생존을 적어도 15일까지 연장하여 주는데 유효한, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  4. 암 치료 진행중인 대상체에 암 치료 유효량만큼의 백신과 IL-2Rβ 활성화량만큼의 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제를 투여하는 단계를 포함하며, 암 마우스 모델에서 동량의 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제 및 백신을 사용하여 평가되었을 때, CD4+ Treg, CD25+ Treg, 및 FoxP3+ Treg로 구성된 군으로부터 선택되는 조절 T 세포의 종양내 축적을, 비 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제 및 백신이 투여되었을 때 관찰되는 정도에 비하여 증가한 정도로 억제하는 데 유효한, 암 치료 진행중인 대상체 내 조절 T 세포(Treg)의 축적을 억제하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 백신은 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제와는 별도로 대상체에 투여되는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 백신은 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제를 투여하기 이전에 대상체에 투여되는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 백신 및 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제 둘 다는 치료 1일차에 투여되는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 백신은 치료 1일차에 투여되고, 상기 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제는 치료 1일차 내지 4일차 중 어느 한 날에 투여되는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 인간인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 고형암인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 유방암, 난소암, 결장암, 전립선암, 골암, 결장직장암, 위암, 림프종, 악성 흑색종, 간암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 췌장암, 갑상샘암, 신장암, 담관의 암, 뇌암, 자궁경부암, 상악동암, 방광암, 식도암, 호지킨병 및 부신피질암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 암은 악성 흑색종인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제는 약 0.7 mg/kg 미만 내지 약 0.2 mg/kg 미만의 범위의 용량으로 투여되는 것인 방법.
  14. 제10항에 있어서, 상기 투여는 치료 1회차 이후에 평가되었을 때 고형 종양 크기의 적어도 25% 감소를 달성하는 데 유효한 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제는 폴리에틸렌 글리콜에 방출가능하도록 공유 부착된 알데스루킨을 포함하는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제는 평균 6개의 폴리에틸렌 글리콜 중합체에 방출 가능하도록 공유 부착된 알데스루킨을 포함하는 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 백신은 항원 백신, 전세포 백신, 수지상 세포 백신 및 DNA 백신으로부터 선택되는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 백신은 동종유래 백신인 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 백신은 자가 백신인 방법.
  20. 제17항에 있어서, 상기 백신은 항원 백신인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 항원 백신은 종양 특이적 항원을 포함하는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 종양 특이적 항원은 고환암 항원, 분화 항원 및 범발 과발현 종양 연관 항원으로부터 선택되는 것인 방법.
  23. 제20항에 있어서, 상기 백신은 신생항원을 포함하는 것인 방법.
  24. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 백신은 하나 이상의 아주반트를 포함하는 조성물의 형태로 투여되는 것인 방법.
  25. 암 발병 대상체를 치료하는 데 사용하는 것에 관한 지침과 아울러, 백신 및 IL-2Rβ 활성화량만큼의 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제를 포함하는 키트.
  26. 제25항에 있어서, 상기 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제 및 백신은 대상체에의 투여를 위한 단일 조성물에 포함되는 것인 키트.
  27. 제25항에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함하는 것인 키트.
  28. 제25항에 있어서, 상기 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제 및 백신은 별도의 용기에 담겨 제공되는 것인 키트.
  29. 제28항에 있어서, 상기 백신과 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제를 대상체에 별도로 투여하는 것에 관한 지침이 동반되는 키트.
  30. 제28항에 있어서, 상기 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제 및 백신 둘 다는 고체 형태를 가지는 것인 키트.
  31. 제30항에 있어서, 상기 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제 및 백신은 각각 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물 중에 포함되는 것인 키트.
  32. 제31항에 있어서, 상기 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제를 포함하는 조성물과, 상기 백신을 포함하는 조성물 둘 다는 물을 5 중량% 미만 함유하는 것인 키트.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지속 작용성 IL-2Rβ 편향 효현제와 상기 백신 둘 다는 수성 희석제 중 재구성에 적합한 고체 형태를 가지는 것인 키트.
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