KR20190090754A

KR20190090754A - Pharmaceutical composition for preventing or treating muscle diseases comprising mitochondria

Info

Publication number: KR20190090754A
Application number: KR1020190090797A
Authority: KR
Inventors: 최용수; 윤창구; 김미진; 황정욱
Original assignee: 주식회사 파이안바이오테크놀로지
Priority date: 2016-11-30
Filing date: 2019-07-26
Publication date: 2019-08-02
Also published as: KR20180062387A; KR20210096052A

Abstract

The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating muscle disorders. More specifically, the present invention relates to the pharmaceutical composition for preventing or treating muscle disorders comprising mitochondria as an active component. The pharmaceutical composition of the present invention includes foreign mitochondria or cells comprising foreign mitochondria, thereby enhancing mitochondrial activities of cells administered with the same. Accordingly, the pharmaceutical composition, according to the present invention, can be effectively used for fundamental prevention or treatment of muscular diseases caused by degradation of mitochondrial functions.

Description

Pharmaceutical composition for preventing or treating myopathy including mitochondria {PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING MUSCLE DISEASES COMPRISING MITOCHONDRIA}

본 발명은 근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이며, 보다 상세하게는 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating myopathy, and more particularly, to a pharmaceutical composition for preventing or treating myopathy including mitochondria as an active ingredient.

미토콘드리아는 에너지 공급원으로서 아데노신 트라이포스페이트(adenosine triphosphate: ATP) 합성 및 조절에 관여하는 진핵세포의 생존에 필수적인 세포 소기관이다. 미토콘드리아는 생체 내 다양한 대사 경로, 예를 들어, 세포 신호처리, 세포 분화, 세포 사멸뿐만 아니라 세포 주기 및 세포 성장의 제어와 연관이 있다.Mitochondria are cell organelles essential for the survival of eukaryotic cells involved in the synthesis and regulation of adenosine triphosphate (ATP) as a source of energy. Mitochondria are associated with a variety of metabolic pathways in vivo, such as cell signaling, cell differentiation, cell death, as well as control of cell cycle and cell growth.

따라서, 미토콘드리아가 손상되면 다양한 질병이 유발될 수 있는데, 대부분의 공지된 미토콘드리아 장애는 미토콘드리아 DNA에서 발생하는 유전성 또는 후천성 돌연변이에 기인한다.Thus, damage to the mitochondria can lead to a variety of diseases, most known mitochondrial disorders are due to inherited or acquired mutations in mitochondrial DNA.

예를 들어, 미토콘드리아 막전위 이상으로 인한 팽윤, 활성산소종, 자유라디칼 등에 의한 산화적 스트레스, 미토콘드리아의 에너지 생성을 위한 산화적 인산화 기능의 결함 등에 의해 미토콘드리아의 기능이 변형될 수 있다.For example, the function of the mitochondria may be modified by swelling due to abnormal mitochondrial membrane potential, oxidative stress caused by free radical species, free radicals, and the like, defects in oxidative phosphorylation for energy generation of the mitochondria, and the like.

구체적으로, 미토콘드리아의 기능이상은 다발성경화증, 뇌척수염, 뇌신경근염, 말초신경변증, 라이증후군, 알퍼증후군, MELAS, 편두통, 정신병, 우울증, 발작과 치매, 중풍성 에피소드, 시신경위축, 시신경병증, 망막색소변성, 백내장, 고알도스테론혈증, 부갑상선기능저하증, 근육질환, 미오글로빈뇨, 근육긴장저해, 근육통, 운동내성저하, 세뇨관증, 신부전, 간부전, 간기능부전, 간비대, 철적혈구빈혈, 호중성백혈구 감소증, 저혈소판증, 설사, 융모위축, 다발성구토, 연하곤란, 변비, 감각신경난청, 간질, 정신지체, 간질, 알츠하이머, 파킨슨, 헌팅턴 질환 등의 다양한 질병에 직접 또는 간접적인 원인이 되는 것으로 알려져 있다(Schapira AH et al., Lancet., 1;368(9529):70-82, 2006 및 Pieczenik et al., Exp . Mol . Pathol ., 83(1):84-92, 2007).Specifically, the dysfunction of mitochondria is multiple sclerosis, encephalomyelitis, cerebral myositis, peripheral neuropathy, lyre syndrome, alper syndrome, MELAS, migraine, psychosis, depression, seizures and dementia, palsy episodes, optic nerve atrophy, optic neuropathy, retinal pigmentation Degeneration, cataracts, hyperaldosteronemia, parathyroidism, myopathy, myoglobinuria, myotonia, myalgia, motor tolerance, tubulopathy, renal failure, hepatic insufficiency, hepatic insufficiency, hepatomegaly, iron cell anemia, neutropenia Hypothyroidism, diarrhea, vomiting, multiple vomiting, dysphagia, constipation, sensorineural hearing loss, epilepsy, mental retardation, epilepsy, Alzheimer's, Parkinson's, Huntington's disease (Schapira AH et al ., Lancet., 1; 368 (9529): 70-82, 2006 and Pieczenik et al ., Exp . Mol . Pathol ., 83 (1): 84-92, 2007).

특히, 근육은 고에너지 수준을 필요로 하여 미토콘드리아를 상대적으로 다량 함유하고 있는 조직으로, 미토콘드리아의 기능 저하에 따라 근육에서 다소 빠르게 병증이 진행될 수 있다. 예를 들어, 미토콘드리아성 근육 질환으로 MELAS 증후군, MERRF 증후군, Kearns-Sayre 증후군, 근병증, 뇌근육병증, 근무력증, 중증 근무력증, 근위축성 측삭 경화증, 근육퇴행위축, 근위축증, 근긴장저하, 근력약화, 근경직증 등이 있다. In particular, the muscle is a tissue that contains a relatively large amount of mitochondria requiring high energy levels, the disease can progress somewhat faster in the muscle as the function of the mitochondria decreases. For example, mitochondrial muscle diseases include MELAS syndrome, MERRF syndrome, Kearns-Sayre syndrome, myopathy, cerebral myopathy, myasthenia gravis, myasthenia gravis, muscular dystrophy, muscular dystrophy, muscular dystrophy, muscular dystrophy, muscular weakness, muscular dystrophy Etc.

이러한 미토콘드리아 질환을 치료하기 위하여, 미토콘드리아를 보호하거나 미토콘드리아의 기능장애를 회복하는데 사용될 수 있는 물질 또는 이러한 물질을 효율적으로 표적 전달할 수 있는 방법 등에 대한 연구가 진행되고 있으나, 치료범위가 다소 제한적이거나 부작용이 발생하는 문제가 있는 등 아직은 획기적인 치료법이 개발되지 않은 실정이다.In order to treat such mitochondrial diseases, research is being conducted on substances that can be used to protect mitochondria or to restore dysfunction of mitochondria, or methods that can efficiently deliver such substances, but the scope of treatment is somewhat limited or side effects There is no problem yet to develop a breakthrough treatment.

본 발명은 근질환을 치료하기 위한 약학 조성물 및 이를 이용한 근질환을 치료하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.It is an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for treating myopathy and a method for treating myopathy using the same.

상기 과제를 해결하기 위하여,In order to solve the above problems,

본 발명은 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.The present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating myopathy comprising mitochondria as an active ingredient.

또한, 본 발명은 외래 미토콘드리아가 도입된 세포를 유효성분으로 포함하는 근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating myopathy comprising the cells into which foreign mitochondria are introduced as an active ingredient.

나아가, 본 발명은 상기 약학 조성물을 동물의 환부에 투여하는 단계를 포함하는 근질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.Furthermore, the present invention provides a method for preventing or treating muscle disease, comprising administering the pharmaceutical composition to an affected part of an animal.

본 발명의 약학 조성물은 외래 미토콘드리아 또는 외래 미토콘드리아를 포함하는 세포를 유효성분으로 포함한다. 이를 투여받는 개체의 미토콘드리아 활성이 향상되므로, 본 발명에 따른 약학 조성물은 미토콘드리아 기능저하와 관련하여 발병하는 근질환에 대한 근본적인 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention comprises a foreign mitochondria or a cell containing a foreign mitochondria as an active ingredient. Since the mitochondrial activity of the subject to be administered is improved, the pharmaceutical composition according to the present invention can be usefully used for the fundamental prevention or treatment of myopathies occurring in connection with mitochondrial hypofunction.

도 1은 덱사메타손을 투여하여 근위축을 유도한 래트의 체중 변화를 나타낸 도면이다.
도 2는 래트 골격근 유래 세포 내 미토콘드리아를 형광 염색한 사진이다. 이때, 사용된 표지자(Mitotracker CMXRos Red)는 미토콘드리아의 막 전위에 의존적으로 축적되는 시료이다.
도 3은 미토콘드리아 기능이 손상된 근육세포에 외래 미토콘드리아를 전달한 후, 세포의 증식능력을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 미토콘드리아 기능이 손상된 근육세포에 외래 미토콘드리아를 전달한 후, 세포의 ATP 합성 능력을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 근위축을 유도한 근육세포에 외래 미토콘드리아를 전달한 후, 세포 내 미토콘드리아의 막 전위를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 근위축을 유도한 근육세포에 외래 미토콘드리아를 전달한 후, 미토콘드리아 유래 활성산소를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 근위축을 유도한 근육세포에 외래 미토콘드리아를 전달한 후, 세포 내 미토콘드리아 생합성 능력을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8a는 근위축을 유도한 근육세포에 외래 미토콘드리아를 전달한 후, 세포의 AMPK 활성을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8b는 근위축을 유도한 근육세포에 외래 미토콘드리아를 전달한 후, 세포의 FoxO 단백질 축적 양을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 근위축을 유도한 근육세포에 외래 미토콘드리아를 전달한 후, 근위축 마커인 MuRF-1의 발현량을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10은 근위축을 유도한 래트에 외래 미토콘드리아를 전달한 후, 가자미근의 무게 변화를 나타낸 도면이다.
도 11a는 근위축을 유도한 래트에 외래 미토콘드리아를 전달한 후, 미토콘드리아 생합성과 관련된 단백질인 PGC-1의 발현량을 웨스턴 블랏을 통해 확인한 도면이다.
도 11b는 근위축을 유도한 래트에 외래 미토콘드리아를 전달한 후, 미토콘드리아 생합성과 관련된 단백질인 PGC-1의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 12a는 근위축을 유도한 래트에 외래 미토콘드리아를 전달한 후, 근위축 마커인 MuRF-1의 발현량을 웨스턴 블랏을 통해 확인한 도면이다.
도 12b는 근위축을 유도한 래트에 외래 미토콘드리아를 전달한 후, 근위축 마커인 MuRF-1의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 13은 외래 미토콘드리아 이식에 따른 근 섬유의 재생과정을 조직학적으로 확인한 사진이다.1 is a diagram showing the weight change of rats induced by muscular atrophy by administering dexamethasone.
2 is a photograph of fluorescent staining of mitochondria in rat skeletal muscle-derived cells. At this time, the marker used (Mitotracker CMXRos Red) is a sample accumulated depending on the membrane potential of the mitochondria.
Figure 3 is a diagram showing the results of analyzing the proliferation capacity of the cells after delivering the foreign mitochondria to the muscle cells damaged mitochondria function.
4 is a diagram showing the results of analyzing the ATP synthesis ability of the cells after delivery of foreign mitochondria to muscle cells in which mitochondrial function is impaired.
5 is a diagram showing the results of analyzing the membrane potential of the intracellular mitochondria after delivery of foreign mitochondria to muscle cells induced muscle contraction.
6 is a diagram showing the results of analysis of mitochondrial-derived free radicals after delivery of foreign mitochondria to muscle cells that induced muscle atrophy.
7 is a diagram showing the results of analysis of intracellular mitochondrial biosynthesis ability after delivery of foreign mitochondria to muscle cells induced muscle contraction.
Figure 8a is a diagram showing the results of analyzing the AMPK activity of the cells after delivery of foreign mitochondria to muscle cells induced muscle atrophy.
Figure 8b is a diagram showing the result of analyzing the amount of FoxO protein accumulation of cells after delivery of foreign mitochondria to muscle cells induced muscle contraction.
9 is a diagram showing the results of analyzing the expression level of MuRF-1, which is a muscle atrophy marker, after delivery of foreign mitochondria to muscle cells that induced muscle atrophy.
10 is a diagram showing the weight change of the soleus muscle after delivery of the foreign mitochondria to the rat induced muscle atrophy.
Figure 11a is a diagram confirming the expression level of PGC-1, a protein associated with mitochondrial biosynthesis after Western blot after delivery of foreign mitochondria to rats induced muscle atrophy.
11B is a graph showing the expression level of PGC-1, a protein associated with mitochondrial biosynthesis, after delivery of foreign mitochondria to rats that induced muscle atrophy.
12a is a diagram confirming the expression level of MuRF-1, which is a muscle atrophy marker, by Western blot after delivery of foreign mitochondria to rats that induced muscle atrophy.
12B is a graph showing the expression level of MuRF-1, which is a muscle atrophy marker, after delivery of foreign mitochondria to rats that induced muscle atrophy.
Figure 13 is a histological picture confirming the process of regeneration of muscle fibers following foreign mitochondria transplantation.

이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명하도록 한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명의 일 측면은 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.One aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating myopathy, including mitochondria as an active ingredient.

본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한,　"유효성분"은　단독으로 활성을 나타내거나 또는 그 자체로는 활성이 없는 보조제(담체)와 함께 활성을 나타내는 성분을 지칭한다.Unless stated otherwise in the present specification, “active ingredient” refers to an ingredient that is active alone or in combination with an adjuvant (carrier) which is inactive.

상기 미토콘드리아는 포유동물로부터 수득된 것일 수 있으며, 인간으로부터 수득된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 미토콘드리아는 세포 또는 조직으로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 세포는 체세포, 생식세포, 줄기세포 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 예를 들어, 상기 미토콘드리아는 체세포, 생식세포 또는 줄기세포로부터 수득된 것일 수 있다. 또한, 상기 미토콘드리아는 미토콘드리아의 생물학적 활성이 정상인 세포로부터 수득된 정상적인 미토콘드리아일 수 있다. 또한, 상기 미토콘드리아는 체외에서 배양된 것일 수 있다. The mitochondria may be obtained from a mammal, or may be obtained from a human. Specifically, the mitochondria may be isolated from cells or tissues. The cell may be any one selected from the group consisting of somatic cells, germ cells, stem cells, and combinations thereof. For example, the mitochondria may be obtained from somatic cells, germ cells or stem cells. In addition, the mitochondria may be normal mitochondria obtained from cells in which the biological activity of the mitochondria is normal. In addition, the mitochondria may be cultured in vitro.

구체적으로, 상기 체세포는 근육세포, 간세포, 신경세포, 섬유아세포, 상피세포, 지방세포, 골세포, 백혈구, 림프구, 혈소판, 점막세포 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 바람직하게는, 미토콘드리아 활성이 뛰어난 근육세포 또는 간세포로부터 수득된 것일 수 있다. Specifically, the somatic cells may be any one selected from the group consisting of muscle cells, hepatocytes, neurons, fibroblasts, epithelial cells, adipocytes, bone cells, white blood cells, lymphocytes, platelets, mucosal cells, and combinations thereof. Preferably, it may be obtained from muscle cells or hepatocytes excellent in mitochondrial activity.

또한, 상기 생식세포는 감수분열과 체세포 분열을 하는 세포로서 정자 또는 난자일 수 있다. In addition, the germ cells may be sperm or ovum as cells that undergo meiosis and somatic division.

또한, 상기 줄기세포는 중간엽줄기세포, 성체줄기세포, 역분화줄기세포, 배아줄기세포, 골수줄기세포, 신경줄기세포, 윤부줄기세포 및 조직 유래 줄기세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 이때, 상기 중간엽줄기세포는 탯줄, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로부터 수득된 것일 수 있다.In addition, the stem cells may be any one selected from the group consisting of mesenchymal stem cells, adult stem cells, dedifferentiated stem cells, embryonic stem cells, bone marrow stem cells, neural stem cells, limbal stem cells and tissue-derived stem cells. . At this time, the mesenchymal stem cells may be obtained from any one selected from the group consisting of umbilical cord, umbilical cord blood, bone marrow, fat, muscle, nerves, skin, amniotic membrane and placenta.

한편, 상기 미토콘드리아를 특정 세포로부터 분리하는 경우에는, 예를 들어, 특정 버퍼 용액을 사용하거나 전위차 및 자기장을 이용하는 등 공지된 다양한 방법을 통해 미토콘드리아를 분리할 수 있다.On the other hand, when the mitochondria are separated from specific cells, for example, the mitochondria may be separated by various known methods, such as using a specific buffer solution or using a potential difference and a magnetic field.

상기 미토콘드리아 분리는 미토콘드리아 활성 유지 측면에서, 세포를 파쇄하고 원심분리하여 수득할 수 있다. 일 구체예로, 세포를 배양하고, 이러한 세포를 포함하는 약학 조성물을 제1차 원심분리하여 펠렛을 생성하는 단계, 상기 펠렛을 버퍼 용액에 재현탁시키고, 균질화하는 단계, 상기 균질화된 용액을 제2차 원심분리하여 상청액을 제조하는 단계 및 상기 상청액을 제3차 원심분리하여 미토콘드리아를 정제하는 단계로 수행될 수 있다. 이때, 제2차 원심분리가 수행되는 시간은 제1차 및 제3차 원심분리가 수행되는 시간보다 짧도록 조절되는 것이 세포 활성 유지 면에서 바람직하며, 제1차 원심분리에서 제3차 원심분리로 갈수록 속도를 높일 수 있다.The mitochondrial isolation can be obtained by disrupting and centrifuging the cells in terms of maintaining mitochondrial activity. In one embodiment, culturing the cells, and firstly centrifuging the pharmaceutical composition comprising such cells to produce pellets, resuspending the pellets in a buffer solution, homogenizing, and removing the homogenized solution. Preparing a supernatant by secondary centrifugation and purifying the mitochondria by performing a third centrifugation of the supernatant. In this case, it is preferable that the time for performing the second centrifugation is controlled to be shorter than the time for performing the first and third centrifugation, in terms of maintaining cell activity, and the third centrifugation in the first centrifugation. You can speed up as you go.

구체적으로, 상기 제1차 내지 제3차 원심분리는 0 내지 10℃의 온도, 바람직하게는 3 내지 5℃의 온도에서 수행될 수 있다. 또한, 상기 원심분리가 수행되는 시간은 1 내지 50분 동안 수행될 수 있으며, 원심분리 횟수 및 샘플의 함량 등에 따라 적절히 조정될 수 있다. Specifically, the first to third centrifugal separation may be performed at a temperature of 0 to 10 ℃, preferably at a temperature of 3 to 5 ℃. In addition, the centrifugation time may be performed for 1 to 50 minutes, and may be appropriately adjusted according to the number of centrifugation and the content of the sample.

아울러, 상기 제1차 원심분리는 100 내지 1,000×g, 또는 200 내지 700×g, 또는 300 내지 450×g의 속도로 수행될 수 있다. 또한, 상기 제2차 원심분리는 1 내지 2,000×g, 또는 25 내지 1,800×g, 또는 500 내지 1,600×g의 속도로 수행될 수 있다. 또한, 상기 제3차 원심분리는 100 내지 20,000×g, 또는 500 내지 18,000×g, 또는 800 내지 15,000×g의 속도로 수행될 수 있다.In addition, the first centrifugation may be performed at a rate of 100 to 1,000 × g, or 200 to 700 × g, or 300 to 450 × g. In addition, the second centrifugation may be performed at a speed of 1 to 2,000 × g, or 25 to 1,800 × g, or 500 to 1,600 × g. In addition, the third centrifugation may be performed at a rate of 100 to 20,000 × g, or 500 to 18,000 × g, or 800 to 15,000 × g.

또한, 상기 약학 조성물이 유효하게 적용될 수 있는 근질환은 미토콘드리아 기능이상을 포함하는 질환일 수 있다. 예를 들어, 근질환은 MELAS 증후군, MERRF 증후군, Kearns-Sayre 증후군, 근병증, 뇌근육병증, 근무력증, 중증 근무력증, 근위축성 측삭 경화증, 근육퇴행위축, 근위축증, 근긴장저하, 근력약화, 근경직증일 수 있으며, 미토콘드리아 기능 저하로 인해 발생하는 근육 세포 장애를 모두 포함할 수 있다.In addition, the muscle disease to which the pharmaceutical composition can be effectively applied may be a disease including mitochondrial dysfunction. For example, myopathy can be MELAS syndrome, MERRF syndrome, Kearns-Sayre syndrome, myopathy, cerebral myopathy, myasthenia gravis, myasthenia gravis, muscular dystrophy, muscular dystrophy, muscular atrophy, myotonia, muscle weakness, myopathy This may include all muscle cell disorders resulting from mitochondrial deterioration.

즉, 본 발명의 약학 조성물은 세포 활성이 유지되는 미토콘드리아를 유효성분으로 포함함으로써, 상기 약학 조성물이 적용되는 세포의 미토콘드리아 활성을 향상시켜 미토콘드리아성 병증이 개선될 수 있다.That is, the pharmaceutical composition of the present invention may include mitochondria in which cell activity is maintained as an active ingredient, thereby improving mitochondrial activity of the cells to which the pharmaceutical composition is applied, thereby improving mitochondrial disease.

또한, 상기 약학 조성물에 대하여, 미토콘드리아는 0.1 내지 500 ㎍/㎖, 0.2 내지 450 ㎍/㎖ 또는 0.5 내지 400 ㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있다. 상기 범위로 미토콘드리아를 포함함으로써, 투여 시 미토콘드리아 용량 조절이 용이하고, 환부의 근육 병증 개선 정도가 보다 향상될 수 있다. In addition, for the pharmaceutical composition, mitochondria may be included at a concentration of 0.1 to 500 μg / ml, 0.2 to 450 μg / ml or 0.5 to 400 μg / ml. By including the mitochondria in the above range, it is easy to adjust the dose of mitochondria during administration, the degree of improvement of myopathy of the affected area can be further improved.

특히, 본 발명에 따른 상기 약학 조성물은, 미토콘드리아를 전달받을 세포를 기준으로 세포 1x10⁵ 개당 미토콘드리아를 0.005 내지 50 ㎍ 또는 0.05 내지 25 ㎍로 투여될 수 있도록 미토콘드리아를 포함할 수 있다. 즉, 상기 약학 조성물이 투여될 세포 또는 근질환이 유발된 환부의 세포의 개수를 기준으로 상기 범위의 함량으로 미토콘드리아가 투여되는 것이 세포 활성 측면에서 가장 바람직하다. 또한, 상기 약학 조성물은 1회 투여시 1 내지 80 ㎕, 10 내지 70 ㎕, 또는 40 내지 60 ㎕의 용량으로 투여될 수 있다.In particular, the pharmaceutical composition according to the present invention may include mitochondria such that 0.005 to 50 μg or 0.05 to 25 μg of mitochondria per 1 × 10 ⁵ cells may be administered based on the cells to receive the mitochondria. That is, it is most preferable in view of cell activity that mitochondria is administered in an amount within the above range based on the number of cells to which the pharmaceutical composition is to be administered or the cells of the disease-induced lesion. In addition, the pharmaceutical composition may be administered in a dose of 1 to 80 μl, 10 to 70 μl, or 40 to 60 μl in a single dose.

또한, 본 발명의 다른 측면은 외래 미토콘드리아가 도입된 세포를 유효성분으로 포함하는 근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 외래 미토콘드리아란 상기 미토콘드리아가 도입되는 세포를 제외한 별개의 세포로부터 유래된 미토콘드리아를 지칭한다. 상기 외래 미토콘드리아 및 이를 분리하는 방법에 대한 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.In addition, another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating myopathy comprising the cells into which foreign mitochondria are introduced as an active ingredient. The foreign mitochondria refers to mitochondria derived from separate cells except for the cells into which the mitochondria are introduced. Details of the foreign mitochondria and a method for separating the same are as described above.

또한, 상기 세포는 외래 미토콘드리아를 세포질 내에 포함하고 있는 세포로서, 세포 활성이 유지되는 정상세포일 수 있다. 또한, 상기 세포는 근육세포 또는 줄기세포인 것이 바람직하다. 이때, 상기 근육세포는 근육조직에서 분리한 세포일 수 있고, 분리한 세포를 추가적으로 배양하여 수득한 세포일 수 있다. 또한, 상기 줄기세포는 중간엽줄기세포, 성체줄기세포, 역분화줄기세포, 배아줄기세포, 골수줄기세포, 신경줄기세포, 윤부줄기세포 및 조직 유래 줄기세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 이때, 상기 중간엽줄기세포는 탯줄, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로부터 수득된 것일 수 있다.In addition, the cell is a cell containing foreign mitochondria in the cytoplasm, it may be a normal cell in which cell activity is maintained. In addition, the cells are preferably muscle cells or stem cells. In this case, the muscle cell may be a cell separated from the muscle tissue, it may be a cell obtained by additionally culture the separated cells. In addition, the stem cells may be any one selected from the group consisting of mesenchymal stem cells, adult stem cells, dedifferentiated stem cells, embryonic stem cells, bone marrow stem cells, neural stem cells, limbal stem cells and tissue-derived stem cells. . At this time, the mesenchymal stem cells may be obtained from any one selected from the group consisting of umbilical cord, umbilical cord blood, bone marrow, fat, muscle, nerves, skin, amniotic membrane and placenta.

또한, 상기 외래 미토콘드리아가 도입된 세포와 상기 외래 미토콘드리아를 제공한 세포는 동종 세포 또는 이종 세포일 수 있다. 또한, 상기 외래 미토콘드리아가 도입된 세포와 상기 외래 미토콘드리아를 제공한 세포는 동일한 개체 또는 다른 개체로부터 수득된 것일 수 있다.In addition, the foreign mitochondria-introduced cells and the foreign mitochondria-providing cells may be homologous or heterologous. In addition, the cells into which the foreign mitochondria are introduced and the cells providing the foreign mitochondria may be obtained from the same individual or another individual.

한편, 상기 외래 미토콘드리아와 이를 전달받을 세포가 혼합된 약학 조성물을 원심분리하여, 상기 외래 미토콘드리아를 세포 내로 전달시킬 수 있다. 또한, 상기 원심분리는 0 내지 40℃, 20 내지 38℃, 또는 30 내지 37℃의 온도에서 수행될 수 있다. 또한, 0.5 내지 20분, 1 내지 15분, 또는 3 내지 7분 동안 수행될 수 있다. 또한, 1 내지 2,400×g, 25 내지 1,800×g, 또는 200 내지 700×g으로 수행될 수 있다.Meanwhile, the foreign mitochondria and the pharmaceutical composition in which the cells to be delivered are mixed may be centrifuged to deliver the foreign mitochondria into the cells. In addition, the centrifugation may be carried out at a temperature of 0 to 40 ℃, 20 to 38 ℃, or 30 to 37 ℃. It may also be performed for 0.5 to 20 minutes, 1 to 15 minutes, or 3 to 7 minutes. It may also be performed at 1 to 2,400 × g, 25 to 1,800 × g, or 200 to 700 × g.

상기 조건으로 세포와 외래 미토콘드리아에 함께 원심력을 가해줌으로써, 세포에 다른 손상이 발생하지 않으면서도 높은 효율로 외래 미토콘드리아를 세포로 전달할 수 있다. By applying centrifugal force to the cells and the foreign mitochondria under the above conditions, the foreign mitochondria can be delivered to the cells with high efficiency without causing any damage to the cells.

또한, 상기 약학 조성물은 하단으로 갈수록 점진적으로 직경이 좁아지는 시험관 내에서 원심분리되는 것이 세포와 미토콘드리아에 가해지는 원심력 및 접촉 효율 측면에서 보다 효율적일 수 있다. 상기 원심분리는 동일한 조건으로 1회 내지 3회 추가로 수행될 수 있다.In addition, the pharmaceutical composition may be more efficient in terms of the centrifugal force and contact efficiency applied to the cells and the mitochondria to be centrifuged in a test tube gradually narrowing toward the bottom. The centrifugation may be further performed once to three times under the same conditions.

아울러, 상기 원심분리를 수행하기 전에, 상기 약학 조성물을 인큐베이션을 하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 인큐베이션은 0 내지 40℃, 20 내지 38℃, 또는 30 내지 37℃의 온도에서 수행될 수 있다. 또한, 0.1 내지 4시간, 0.5 내지 3.8시간 또는 0.8 내지 3.5시간 동안 수행될 수 있다. 또한, 인큐베이션은 세포에 미토콘드리아가 전달된 후에 소정의 시간 동안 수행될 수 있다. 또한, 인큐베이션 시간은 세포의 종류 및 미토콘드리아의 양에 따라 적절히 선택될 수 있다.In addition, before performing the centrifugation, the pharmaceutical composition may further comprise the step of incubating. The incubation may be carried out at a temperature of 0 to 40 ℃, 20 to 38 ℃, or 30 to 37 ℃. It may also be performed for 0.1 to 4 hours, 0.5 to 3.8 hours or 0.8 to 3.5 hours. Incubation may also be performed for a predetermined time after the mitochondria is delivered to the cells. Incubation time may also be appropriately selected depending on the type of cell and the amount of mitochondria.

아울러, 상기 약학 조성물에 계면활성제를 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다. 계면활성제는 세포의 세포막 투과성을 증진시키기 위해 사용되며, 첨가 시점은 세포와 미토콘드리아를 혼합하기 전, 혼합시점 또는 혼합 후에 첨가될 수 있다. 또한, 계면활성제를 세포에 첨가한 후 세포의 세포막 투과성을 높이기 위해 일정 시간 세포를 방치할 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물에 PF-68(Pluronic F-68)을 첨가하는 단계를 포함할 수 있다.In addition, the method may further include adding a surfactant to the pharmaceutical composition. Surfactants are used to enhance cell membrane permeability of the cells, and the addition point may be added before or after mixing the cells and the mitochondria. In addition, after the surfactant is added to the cells, the cells may be left for a certain time to increase the cell membrane permeability. Specifically, it may include the step of adding PF-68 (Pluronic F-68) to the pharmaceutical composition.

구체적으로, 상기 계면활성제는 PF-68과 같은 비이온성 계면활성제인 것이 바람직하며, 폴록사머(poloxamers) 즉, 폴리옥시에틸렌의 두 개의 친수성 사슬에 의해 옆으로 배치된 폴리옥시프로필렌의 중심 소수성 사슬로 구성된 삼블록 공중합체일 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물에서 계면활성제의 농도는 1 내지 100 ㎍/㎖, 3 내지 80 mg/㎖ 또는 5 내지 40 ㎍/㎖ 일 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 30 ㎍/㎖이다. Specifically, the surfactant is preferably a nonionic surfactant such as PF-68, and is a central hydrophobic chain of poloxamers, that is, polyoxypropylene which is laterally disposed by two hydrophilic chains of polyoxyethylene. It may be a triblock copolymer constructed. In addition, the concentration of the surfactant in the pharmaceutical composition may be 1 to 100 μg / ml, 3 to 80 mg / ml or 5 to 40 μg / ml, preferably 10 to 30 μg / ml.

또한, 상기 약학 조성물에 포함되는 세포는, 10⁵개 세포당 0.1 내지 500 ㎍, 0.2 내지 450 ㎍ 또는 0.5 내지 400 ㎍의 미토콘드리아가 도입된 것일 수 있다. 상기 약학 조성물은 이와 같은 함량으로 외래 미토콘드리아가 전달된 세포를 포함함으로써 투여시 근육 병증 환부의 세포 기능이 개선될 수 있다.In addition, the cells included in the pharmaceutical composition, 0.1 to 500 μg, 0.2 to 450 μg or 0.5 to 400 μg of mitochondria may be introduced per 10 ⁵ cells. The pharmaceutical composition may include cells in which foreign mitochondria is delivered at such a content, thereby improving cellular function of the myopathy lesion.

또한, 미토콘드리아를 전달받은 세포를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물의 경우, 투여량은 2x10³ 내지 2x10⁷ 세포 수/㎏(체중), 보다 바람직하게는 1x10⁴ 내지 1x10⁷ 세포 수/㎏(체중)이 될 수 있다. 상기 범위 내의 농도로 외래 미토콘드리아가 주입된 세포를 함유하는 것이 투여 용량 조절 및 근육 병증 개선 측면에서 효율적이다.In addition, in the case of the pharmaceutical composition comprising the cells receiving the mitochondria as an active ingredient, the dosage is 2x10 ³ to 2x10 ⁷ cells / kg (body weight), more preferably 1x10 ⁴ to 1x10 ⁷ cells / kg (body weight) This can be Containing cells infused with foreign mitochondria at concentrations within this range is efficient in terms of dose administration and improving myopathy.

또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 미토콘드리아성 근육 질환 또는 질병에 걸릴 수 있거나, 그러한 질환 또는 질병을 앓고 있는 인간 또는 다른 포유동물에 대하여 투여될 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 환부에 직접적으로 투여될 수 있는 주사제일 수 있고, 바람직하게는 근육주사용 제제일 수 있다.In addition, the pharmaceutical compositions according to the invention may suffer from mitochondrial muscle diseases or diseases, or may be administered to humans or other mammals suffering from such diseases or diseases. In addition, the pharmaceutical composition may be an injection that can be directly administered to the affected area, and preferably may be an intramuscular formulation.

따라서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 주사제 처방의 유통에 따른 제품 안정성을 확보하기 위하여, 주사제로 사용 가능한 산수용액 또는 인산염 등의 완충용액을 사용하여 pH를 조절함으로써, 물리적으로나 화학적으로 매우 안정한 주사제로 제조될 수 있다.Therefore, the pharmaceutical composition according to the present invention is a physically and chemically very stable injection by adjusting the pH using a buffer solution such as an acid solution or phosphate, which can be used as an injection, to ensure product stability according to the distribution of the injection formulation. Can be prepared.

구체적으로, 본 발명의 약학 조성물은 주사용수를 포함할 수 있다. 상기 주사용수는 고형주사제의 용해나 수용성 주사제를 희석하기 위하여 만들어진 증류수로서, 글루코스 주사, 자일리톨 주사, D-만니톨 주사, 프룩토스 주사, 생리식염수, 덱스트란 40 주사, 덱스트란 70 주사, 아미노산 주사, 링거액, 락트산-링거액 또는 pH 3.5 내지 7.5 범위의 인산염 완충용액 또는 인산이수소나트륨-구연산 완충용액 등 일 수 있다.Specifically, the pharmaceutical composition of the present invention may include water for injection. The water for injection is distilled water prepared for dissolving the solid injection or diluting the water-soluble injection, including glucose injection, xylitol injection, D-mannitol injection, fructose injection, saline solution, 40 dextran injections, 70 dextran injections, amino acid injections, Ringer's solution, lactic acid-Ringer's solution or phosphate buffer in the range of pH 3.5 to 7.5 or sodium dihydrogen phosphate-citrate buffer.

또한, 본 발명의 약학 조성물은 안정화제 또는 용해보조제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 안정화제는 나트륨 피로설파이트(sodium pyrosulfite) 또는 에틸렌 디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid)일 수 있고, 용해보조제는 염산, 아세트산, 수산화나트륨, 탄산수소나트륨, 탄산나트륨 또는 수산화칼륨일 수 있다. In addition, the pharmaceutical composition of the present invention may include a stabilizer or dissolution aid. For example, the stabilizer may be sodium pyrosulfite or ethylenediaminetetraacetic acid, and the dissolution aid may be hydrochloric acid, acetic acid, sodium hydroxide, sodium bicarbonate, sodium carbonate or potassium hydroxide.

또한, 본 발명은 전술한 약학 조성물을 개체의 환부에 직접적으로 투여하는 단계를 포함하는 근질환의 예방 또는 치료 방법을 제공할 수 있다. 여기서 개체는 포유동물일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다.In addition, the present invention may provide a method for preventing or treating muscle diseases, comprising directly administering the aforementioned pharmaceutical composition to the affected part of the subject. The subject here can be a mammal, preferably a human.

이를 통해, 본 발명에 따른 약학 조성물은 근육 질환이 발생한 환부에 직접적으로 정상적인 활성을 갖는 외래 미토콘드리아를 공급할 수 있어, 미토콘드리아 기능이 저하된 세포의 활성을 증가시키거나 미토콘드리아 기능 이상 세포 재생에 유용하며, 미토콘드리아 이상 근육 질환의 치료 또는 예방에 이용될 수 있다.Through this, the pharmaceutical composition according to the present invention can supply the foreign mitochondria having normal activity directly to the affected area with muscle disease, thereby increasing the activity of cells with reduced mitochondrial function or useful for mitochondrial dysfunction cell regeneration. It can be used for the treatment or prevention of mitochondrial abnormal muscle disease.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in order to facilitate understanding of the present invention. However, the following examples are provided only for the purpose of easier understanding of the present invention, and the present invention is not limited by the following examples.

실시예 1. 근위축 유발 동물모델 확립과 무게 변화 측정 Example 1. Establishment of a muscular atrophy-induced animal model and measurement of weight change

실험동물은 5주령 SD-래트 암컷을 오리엔트 바이오(Orient Bio., Ltd., Seoul, Kors)로부터 구매하였다. 구입한 래트는 차의과학대학교 실험동물센터의 청정구역에서 적응기간을 거친 후 실험을 진행하였다. 적응기간 동안 래트가 지내는 환경은 12시간 간격으로 낮과 밤이 조성되고, 23±2℃의 실내온도 및 40 내지 60 %의 습도가 유지되었다. 이러한 적응기간을 7일 거친 후 실험에 투입되었다.Experimental animals were purchased from Orient Bio., Ltd., Seoul, Kors, 5 week old SD-rat females. The purchased rats were subjected to the experiment after the acclimation period in the clean area of the experimental animal center of the Cha Medical University. During the acclimatization period, the rat's environment was day and night at 12-hour intervals, with a room temperature of 23 ± 2 ° C and a humidity of 40 to 60%. After seven days of adaptation, they were put into the experiment.

근위축을 유도하기 위해, 덱사메타손을 5일간 5 ㎎/㎏ 농도로 5일간 복강 내에 투여하였다. 매일 간격으로 동물 무게를 확인하였고, 덱사메타손 투여 5일에는 정상군 대비 덱사메타손 투여 군의 무게가 30 % 가량 감소하는 것을 확인하였다(도 1).To induce muscular atrophy, dexamethasone was administered intraperitoneally for 5 days at a concentration of 5 mg / kg for 5 days. Animal weight was checked at daily intervals, and the dexamethasone administered group was reduced by 30% compared to the normal group on the 5th day of dexamethasone administration (FIG. 1).

실시예 2. 이식을 위한 미토콘드리아 준비Example 2. Mitochondria Preparation for Transplantation

미토콘드리아의 공여 세포는 실험 동물의 종과 동일한 래트 골격근 유래 세포주인(CRL1458, ATCC, Manassas, VA, USA)를 배양하고, 상기 세포들을 빨간색을 띄는 미토콘드리아 특이적 표지자(Mitotracker CMXRos Red)로 염색시켰다. Donor cells of mitochondria were cultured in the same rat skeletal muscle-derived cell line (CRL1458, ATCC, Manassas, VA, USA) as the species of the experimental animals, and the cells were stained with a red mitochondrial specific marker (Mitotracker CMXRos Red).

미토콘드리아를 추출하기 위하여, 혈구계산기를 이용하여 세포수를 측정하여 2x10⁷ cells/㎖ 정도의 세포를 회수하였다. 이후 상기 세포주를 약 4℃의 온도에서 10분 동안 350×g의 속도로 제1차 원심분리를 수행하였고, 이때 얻어진 펠렛을 회수하여 버퍼 용액에 재현탁시켜 균질화시켰다. 상기 펠렛을 포함하는 약학 조성물을 약 4℃의 온도에서 3분 동안 1,100×g의 속도로 제2차 원심분리시켜 상청액을 수득하였다. 이후, 상기 상청액을 약 4℃의 온도에서 15분 동안 12,000×g의 속도로 제3차 원심분리시켜 세포주로부터 미토콘드리아를 분리하였다.In order to extract the mitochondria, a cell count was measured using a hemocytometer to recover cells of about 2 × 10 ⁷ cells / ml. The cell line was then subjected to a first centrifugation at a rate of 350 × g for 10 minutes at a temperature of about 4 ° C., and the pellets obtained were recovered and resuspended in a buffer solution for homogenization. The pharmaceutical composition comprising the pellet was secondly centrifuged at a rate of 1,100 × g for 3 minutes at a temperature of about 4 ° C. to obtain a supernatant. The supernatant was then centrifuged at a rate of 12,000 × g for 15 minutes at a temperature of about 4 ° C. to separate the mitochondria from the cell line.

분리된 미토콘드리아를 확인하기 위하여, 분리 수행 전 빨간색 형광으로 표지된 세포 내 미토콘드리아를 형광현미경으로 촬영하여 도 2에 나타내었고, 분리된 미토콘드리아를 확인하였다. 특히, 이때 사용된 표지자(Mitotracker CMXRos Red)는 미토콘드리아의 막 전위에 의존적으로 축적되는 시료로서, 분리된 미토콘드리아의 생존력을 보여준다(도 2).In order to identify the separated mitochondria, the mitochondria in cells labeled with red fluorescence were photographed by fluorescence microscopy before the separation was performed, and the mitochondria were identified in FIG. 2. In particular, the marker used (Mitotracker CMXRos Red) is a sample that accumulates depending on the membrane potential of the mitochondria, showing the viability of the separated mitochondria (Fig. 2).

실시예 3. 미토콘드리아를 전달받은 세포의 증식 능력 평가Example 3 Evaluation of Proliferative Capacity of Cells Received Mitochondria

일반적으로 세포관련 실험에 많이 사용되어온 래트 골격근 유래 세포주인 L6 세포를 대조군(control)으로 사용하였다. 또한, L6 세포에 미토콘드리아 ATP합성 억제제(올리고마이신, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 처리하여 미토콘드리아 기능을 인위적으로 억제시켰다. 그 후, WRL-68 간세포(CRL1458, ATCC)로부터 추출한 건강한 미토콘드리아를 1x10⁵ 개의 세포에 대하여 농도 별(0.05, 0.5, 5 ㎍)로 전달한 뒤, 24-웰-플레이트(24-well-plate)에 접종(seeding)시켜 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 배양시켰다. In general, L6 cells, a rat skeletal muscle-derived cell line, which have been widely used in cell-related experiments, were used as a control. In addition, L6 cells were treated with mitochondrial ATP synthesis inhibitors (oligomycin, Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo., USA) to artificially inhibit mitochondrial function. Thereafter, healthy mitochondria extracted from WRL-68 hepatocytes (CRL1458, ATCC) were delivered by concentration (0.05, 0.5, 5 μg) for 1 × 10 ⁵ cells, and then in a 24-well-plate. Seeds were incubated in a 37 ° C. CO ₂ incubator.

세포의 증식 능력을 비교하기 위해 Colorimetric Cyto X™ Cell Viability Assay Kit (LPS solution, Daejeon, Korea)를 사용하였다. 배양 후 24, 48시간에 각각의 샘플에 실험 키트에 포함된 반응용액을 섞어준 뒤, 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 2시간 동안 반응 시켰다. 그 후, 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.Colorimetric Cyto X ™ Cell Viability Assay Kit (LPS solution, Daejeon, Korea) was used to compare the proliferation capacity of the cells. 24, 48 hours after the incubation, each sample was mixed with the reaction solution contained in the test kit, and reacted for 2 hours in a 37 ℃ CO ₂ incubator. Then, absorbance was measured at 450 nm wavelength.

도 3에 나타난 바와 같이, 미토콘드리아 기능이 억제된 세포군에 비하여, 미토콘드리아를 전달한 세포주의 흡광도가 증가한 것을 확인하였다. 이때, 흡광도의 증가는 시료의 생존세포수가 증가하면서 미토콘드리아의 탈수소효소(mitochondrial dehydrogenase)의 활성이 증가하였음을 의미하는 것으로, 원심분리를 통한 미토콘드리아 전달을 통해 세포의 증식 능력이 향상된 것을 확인하였다.As shown in FIG. 3, it was confirmed that the absorbance of the cell line that delivered the mitochondria was increased compared to the cell group whose mitochondrial function was suppressed. In this case, the increase in absorbance means that the activity of mitochondrial dehydrogenase was increased while the number of viable cells in the sample was increased. It was confirmed that the cell proliferation ability was improved through the delivery of mitochondria through centrifugation.

실시예 4. 미토콘드리아를 전달받은 세포의 ATP 합성 능력 평가Example 4 Evaluation of ATP Synthesis Ability of Cells Received Mitochondria

실시예 3.과 동일한 방법으로 ATP 합성 억제제에 의해 미토콘드리아 기능을 손상시킨 뒤 외래 미토콘드리아를 전달받은 세포를 배양 후 24, 48시간에 각각 수득하였다.Cells receiving foreign mitochondria after impairing mitochondrial function by ATP synthesis inhibitors in the same manner as in Example 3 were obtained at 24 and 48 hours after incubation, respectively.

각 시료 내에 ATP 양을 측정하기 위해 ATP bioluminescent somatic cell assay kit(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 사용하였다. 준비된 시료에 ATP 방출(releasing) 용액을 첨가하여 상온에서 20초 동안 반응시켜 시료로부터 ATP를 방출시켰다. 그 후, 시료에 ATP assay mix 용액을 첨가하여 상온에서 10분 동안 반응시켜 루미노미터(Luminometer) 장비를 이용하여 ATP의 양을 측정하였다. 각 시료의 ATP의 양은 ATP 표준곡선(standard curve)으로부터 산출할 수 있다. ATP bioluminescent somatic cell assay kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo., USA) was used to measure the amount of ATP in each sample. ATP releasing solution was added to the prepared sample to react at room temperature for 20 seconds to release ATP from the sample. Thereafter, the ATP assay mix solution was added to the sample and reacted at room temperature for 10 minutes to measure the amount of ATP using a luminometer device. The amount of ATP in each sample can be calculated from the ATP standard curve.

도 4에 나타난 바와 같이, 시료 내의 단백질 안의 존재하는 ATP 양을 계산하여 대조군에 대비한 ATP 양의 변화를 분석한 결과, 미토콘드리아 기능이 억제된 세포에 비하여, 외래 미토콘드리아를 전달받은 세포의 ATP 합성 능력이 증가된 것을 확인하였다.As shown in Figure 4, by calculating the amount of ATP present in the protein in the sample to analyze the change in the amount of ATP compared to the control group, compared with the cells in which mitochondrial function is suppressed, the ability of ATP synthesis of the cells receiving foreign mitochondria It was confirmed that this increased.

이러한 결과를 통해, 세포의 미토콘드리아 기능이 손상된 경우, 해당 세포로 건강한 미토콘드리아를 전달하여 줌으로써 이러한 손상이 회복되는 것을 확인하였다.Through these results, it was confirmed that when the mitochondrial function of the cell is impaired, such damage is recovered by delivering healthy mitochondria to the cell.

실시예Example 5. 5. 근위축을Muscular dystrophy 유도한 Induced 근육세포에서In muscle cells 외래 미토콘드리아 전달 후 세포의 막 전위 평가 Evaluation of Membrane Potential of Cells After Foreign Mitochondrial Delivery

실제, 미토콘드리아 기능 저하를 동반하는 근위축의 치료 효능 평가를 위하여, 래트 골격근 유래 세포주인 L6에 근위축 유도제(덱사메타손, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 이용하여 근위축을 유도하였다. 그 후, WRL-68 간세포로부터 추출한 건강한 미토콘드리아(Intact MT)와 미토콘드리아 ATP 합성 억제제를 처리하여 미토콘드리아 기능이 손상시킨 동일 세포로부터 추출한 손상된 미토콘드리아(Damaged MT)를 각각 확보하였다. 근위축을 유도한 근육세포에 미토콘드리아를 1x10⁵ 개의 세포에 대하여 농도 별(0.05, 0.5, 5 ㎍)로 전달하고 24-웰-플레이트에 접종시켜 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 배양시켰다. Indeed, in order to evaluate the therapeutic efficacy of muscle atrophy accompanied by mitochondrial dysfunction, muscle atrophy was induced using L6, a rat skeletal muscle-derived cell line (dexamethasone, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). . Thereafter, healthy mitochondria extracted from WRL-68 hepatocytes (Intact MT) and mitochondrial ATP synthesis inhibitors were treated to obtain damaged mitochondria (Damaged MT) extracted from the same cells with impaired mitochondrial function. Mitochondria were delivered to muscle cells that induced muscle atrophy by concentration (0.05, 0.5, 5 μg) for 1 × 10 ⁵ cells and inoculated in 24-well-plates and incubated in a 37 ° C. CO ₂ incubator.

배양 48시간 뒤, 각 시료 내에 미토콘드리아 막 전위를 측정하기 위하여 JC-1 염료를 사용하였다. 시료는 JC-1 염료와 반응 시킨 뒤, 막 전위의 변화에 따라 다른 스펙트럼을 가지는 성질을 이용하여 흡광도를 측정하였다. After 48 hours of incubation, JC-1 dye was used to measure mitochondrial membrane potential in each sample. After the sample was reacted with the JC-1 dye, the absorbance was measured using a property having a different spectrum according to the change of the membrane potential.

저농도에서는 모노머(monomer)로 존재하며 녹색 형광을 띄고, 높은 농도에서는 염료가 응집(J-aggregate)되어 빨간색 형광을 나타내는 바, 미토콘드리아의 막 전위는 빨간색 흡광도에 대한 녹색 흡광도의 비율로 계산하여 분석하였다.At low concentrations, it is present as a monomer and has green fluorescence, and at high concentrations, dyes are aggregated (J-aggregated) to show red fluorescence. The membrane potential of mitochondria was calculated by calculating the ratio of green absorbance to red absorbance. .

도 5에 나타난 바와 같이, 근위축이 유도되어 미토콘드리아의 막 전위가 변화한 세포에 비하여, 외래 미토콘드리아를 전달받은 세포의 막 전위가 약 12 내지 22 % 회복되는 것을 확인하였다. 특히 손상된 미토콘드리아를 전달받은 그룹과 비교하였을 때, 유의미한 효과를 나타내었다.As shown in FIG. 5, it was confirmed that the membrane potential of the cells receiving the foreign mitochondria was restored by about 12 to 22% compared to the cells in which the muscle atrophy was induced and the membrane potential of the mitochondria was changed. Especially when compared to the group receiving the damaged mitochondria showed a significant effect.

이러한 결과는 외부의 미토콘드리아 전달을 통해 세포의 활성화를 의미하는 바, 외래 미토콘드리아를 전달받음으로써 세포의 ATP 생성 능력이 증가될 수 있음을 확인하였다.These results indicate that activation of cells through external mitochondrial delivery, and confirmed that the ability of ATP production of the cell can be increased by receiving the foreign mitochondria.

실시예Example 6. 6. 근위축을Muscular dystrophy 유도한 Induced 근육세포에서In muscle cells 외래 미토콘드리아 전달 후 미토콘드리아 유래 활성산소 평가 Evaluation of Mitochondrial-Free Active Oxygen After Foreign Mitochondrial Delivery

근위축으로 유도된 근육세포 내의 미토콘드리아 내 활성산소에 대하여 평가하기 위해, 실시예 5.와 동일한 방법으로 각각의 미토콘드리아를 전달 후, 배양 48시간 뒤에 활성산소를 평가하였다. In order to evaluate the mitochondrial free radicals in the muscle cells induced by muscle atrophy, the free radicals were evaluated 48 hours after the incubation of each mitochondria in the same manner as in Example 5.

미토콘드리아 유래 활성 산소를 분석을 위해 MitoSOX red 염료(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하였다. 세포는 완충용액을 이용하여 세척해주고, MitoSOX red 염료를 배지에 섞어 세포에 첨가하고 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 20분간 반응시켰다. 반응 후 세포는 완충액을 이용하여 세척 후, 웰(well) 안의 세포가 접종된 커버슬라이드를 회수하여 슬라이드에 얹어 형광현미경으로 관찰하였다. 손상으로 인해 미토콘드리아 내 활성산소가 증가하였을 때 레드(red) 형광 시그널이 증가하며, 각 시료의 형광 밀도는 분석프로그램으로 분석하였다.MitoSOX red dye (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) was used for the analysis of mitochondrial-derived active oxygen. Cells were washed with a buffer solution, MitoSOX red dye was added to the medium mixed with the medium and reacted for 20 minutes in a 37 ℃ CO ₂ incubator. After the reaction, the cells were washed with a buffer solution, and then the cover slides inoculated with the cells in the wells were recovered, placed on a slide, and observed with a fluorescence microscope. When the free radicals in the mitochondria increased due to damage, the red fluorescence signal increased, and the fluorescence density of each sample was analyzed by an analysis program.

도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 방법으로 근위축이 유도되어 미토콘드리아의 유래 활성산소가 증가한 세포에 비하여, 미토콘드리아를 전달받은 세포군은 미토콘드리아를 전달받지 않은 세포군에 비하여 활성산소가 월등히 줄어든 것을 확인하였다. 특히 이는 손상된 미토콘드리아를 전달받은 그룹과 비교하였을 때, 유의미한 효과를 나타내었다.As shown in FIG. 6, compared to cells in which mitochondrial-derived free radicals are increased by muscle atrophy induced by the method according to the present invention, the cell group receiving mitochondria is confirmed to have significantly reduced free radicals compared to the cell group not receiving mitochondria. It was. In particular, it showed a significant effect when compared to the group receiving the damaged mitochondria.

이러한 결과로부터 외래 미토콘드리아 전달이 전달 받은 세포의 미토콘드리아의 ATP 합성과 활성산소 생성의 균형에 영향을 미치는 것을 확인하였다.From these results, it was confirmed that foreign mitochondrial delivery affects the balance of mitochondrial ATP synthesis and free radical production in the delivered cells.

실시예Example 7. 7. 근위축을Muscular dystrophy 유도한 Induced 근육세포에서In muscle cells 외래 미토콘드리아 전달 후 After delivery of foreign mitochondria 미토콘드리아의생합성Biosynthesis of Mitochondria 능력 평가 Ability assessment

단백질 내의 PGC-1(Peroxisome proliferator-activated receptor Gamma Coactivator-1) 발현을 비교하여 세포 내에 미토콘드리아 생합성의 활성을 비교하였다. 이를 위하여, 실시예 5.와 동일한 방법으로 각각의 미토콘드리아를 근위축이 유도된 세포 내로 전달하였다. 배양 48시간 뒤에 세포를 수합하고, 단백질을 추출하였다. 각 시료의 추출된 단백질 내의 변화는 PGC-1 항체(Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, Cat no: sc-13067)를 이용하여 웨스턴 블랏(Western blot)을 통해 분석하였다. The expression of mitochondrial biosynthesis in cells was compared by comparing the expression of PGC-1 (Peroxisome proliferator-activated receptor Gamma Coactivator-1) in proteins. To this end, in the same manner as in Example 5, each mitochondria was delivered into cells with muscle atrophy induced. After 48 hours of culture, the cells were harvested and the proteins were extracted. Changes in the extracted protein of each sample were analyzed by Western blot using PGC-1 antibody (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, Cat no: sc-13067).

미토콘드리아 기능이 정상 수준에서는 미토콘드리아 생합성이 활성화되어, PGC-1의 발현이 높게 나타나지만, 미토콘드리아 기능이 손상된 수준에서는 이러한 PGC-1의 발현이 저하됨으로써 미토콘드리아 생합성이 감소되는 것을 의미한다. Mitochondrial biosynthesis is activated at the normal level, mitochondrial biosynthesis is activated, the expression of PGC-1 is high, but at the level of mitochondrial function impaired mitochondrial biosynthesis is reduced by this expression of PGC-1.

도 7에 나타난 바와 같이, 근위축이 유도되어 미토콘드리아의 생합성 활성이 저하된 세포에 비하여, 외래 미토콘드리아를 전달받은 세포의 미토콘드리아 생합성 능력이 정상 세포와 유사한 수준으로 향상된 것을 확인하였다. 특히, 이는 손상된 미토콘드리아를 전달받은 그룹과 비교하였을 때, 유의미한 효과를 나타내었다. As shown in FIG. 7, it was confirmed that mitochondrial biosynthetic ability of cells receiving foreign mitochondria was improved to a level similar to that of normal cells, compared to cells in which muscle atrophy was induced to decrease the biosynthetic activity of mitochondria. In particular, it showed a significant effect when compared to the group receiving the damaged mitochondria.

이러한 결과로부터, 외래 미토콘드리아 전달을 통해 미토콘드리아 생합성을 활성화시킬 수 있으며, 이에 따라 세포 내 미토콘드리아의 기능이 개선되는 것을 확인하였다.From these results, it was confirmed that mitochondrial biosynthesis can be activated through foreign mitochondrial delivery, thereby improving the function of intracellular mitochondria.

실시예Example 8. 8. 근위축을Muscular dystrophy 유도한 Induced 근육세포에서In muscle cells 외래 미토콘드리아 전달 후 세포의 AMPK 활성화 및 FoxO 축적 양 평가 Evaluation of Cell AMPK Activation and FoxO Accumulation Level After Ambulatory Mitochondrial Delivery

단백질 내의 AMPK 활성화와 FoxO 축적 양을 비교하여 세포 내의 미토콘드리아 기능 변화에 따른 수준을 비교하였다. 이를 위하여, 실시예 5.와 동일한 방법으로 각각의 미토콘드리아를 근위축이 유도된 세포 내로 전달하였다. 배양 48시간 뒤에 세포를 수합하고, 단백질을 추출하였다. 각 시료의 추출된 단백질 내의 변화는 AMPKα 항체(Cell Signaling Technology, Beverly, MA, #2535), Phospho-AMPKα 항체(Cell Signaling Technology, Beverly, MA, #2532) 및 FoxO3α 항체(Cell Signaling Technology, Beverly, MA, (#2497)를 이용하여 웨스턴 블랏을 통해 분석하였다. AMPK activation and FoxO accumulation in proteins were compared to compare levels of mitochondrial function in cells. To this end, in the same manner as in Example 5, each mitochondria was delivered into cells with muscle atrophy induced. After 48 hours of culture, the cells were harvested and the proteins were extracted. Changes in the extracted protein of each sample were shown by AMPKα antibody (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, # 2535), Phospho-AMPKα antibody (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, # 2532) and FoxO3α antibody (Cell Signaling Technology, Beverly, Analyze via Western blot using MA, (# 2497).

미토콘드리아 기능이 손상되면 세포 내에 ATP의 부족하게 되고, 이로 인해 세포 내 에너지 대사의 센서인 AMPK(Adeno Mono Phosphate Kinase)가 활성화되고, 이러한 신호로 활성화된 FoxO가 핵 내에 FoxO가 축적됨으로써 MuRF-1 또는 MAFbx와 같은 근조직의 위축에 영향을 미치는 중요 유전자(atrogenes)들의 발현을 촉진하여 근위축증을 유발한다. Impairment of mitochondrial function leads to a lack of ATP in the cell, thereby activating Adeno Mono Phosphate Kinase (AMPK), a sensor for intracellular energy metabolism, which results in the accumulation of FoxO in the nucleus, resulting in MuRF-1 or Promotes the expression of important genes (atrogenes) that affect the atrophy of muscle tissue, such as MAFbx, causes muscle atrophy.

도 8a 및 도 8b에 나타난 바와 같이, 미토콘드리아 기능이 억제된 세포에 비하여, 외래 미토콘드리아를 전달받은 세포의 AMPK 활성화와 FoxO 축적 양이 정상 세포와 유사한 수준으로 줄어든 것을 확인하였다. 특히, 이는 손상된 미토콘드리아를 전달받은 그룹과 비교하였을 때, 유의미한 효과를 나타내었다.As shown in FIG. 8A and FIG. 8B, it was confirmed that the amount of AMPK activation and FoxO accumulation in cells that received foreign mitochondria was reduced to a level similar to that of normal cells, compared to cells in which mitochondrial function was suppressed. In particular, it showed a significant effect when compared to the group receiving the damaged mitochondria.

이러한 결과로부터, 외래 미토콘드리아 전달을 통해 세포 내 에너지 센서인 AMPK 의 신호 전달을 억제하고, 그에 따른 FoxO의 활성화를 억제해 줌으로써, 근위축 신호 전달 기전을 억제할 수 있는 것을 확인하였다.From these results, it was confirmed that muscle atrophy signal transduction mechanism can be suppressed by inhibiting signal transduction of AMPK, which is an intracellular energy sensor, and suppressing activation of FoxO according to foreign mitochondrial transduction.

실시예Example 9. 9. 근위축을Muscular dystrophy 유도한 Induced 근육세포에Muscle cells 외래 미토콘드리아 전달 후 After delivery of foreign mitochondria 근위축Muscular dystrophy 마커인 MuRF-1 발현량 평가 Evaluation of MuRF-1 Expression Levels as Markers

단백질 내의 MuRF-1(muscle ring finger-1) 발현을 비교하여 세포 내 전달된 미토콘드리아에 의한 근위축 보호 효능을 비교하였다. 실시예 5.와 동일한 방법으로 각각의 미토콘드리아를 근위축이 유도된 세포 내로 전달하였다. 배양 48시간 뒤에 세포를 수합하고, 단백질을 추출하였다. 각 시료의 추출된 단백질 내의 변화는 MuRF-1 항체(Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, Cat no: sc-27642)를 이용하여 웨스턴 블랏을 통해 분석하였다. The expression of muRF-1 (muscle ring finger-1) in the protein was compared to compare the atrophic protective effect by mitochondria delivered intracellularly. In the same manner as in Example 5, each mitochondria was delivered into cells with muscle atrophy induced. After 48 hours of culture, the cells were harvested and the proteins were extracted. Changes in the extracted protein of each sample were analyzed by Western blot using MuRF-1 antibodies (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, Cat no: sc-27642).

근위축 유도 시 미토콘드리아 기능이 손상되어 도 8b에 나타난 바와 같이, 핵 내에 축적된 FoxO에 의해 근위축 전사인자(예, MuRF-1)가 활성화되어 근위축이 유도된다.Mitochondrial function is impaired upon induction of muscle atrophy, and as shown in FIG. 8B, muscle atrophy transcription factor (eg, MuRF-1) is activated by FoxO accumulated in the nucleus to induce muscle atrophy.

도 9에 나타난 바와 같이, 근위축 유도 군에서 MuRF-1의 발현량의 증가에 비하여, 건강한 외래 미토콘드리아를 전달받은 군에서는 MuRF-1의 발현량이 정상세포와 유사한 수준으로 줄어든 것을 확인하였다. 특히, 이는 손상된 미토콘드리아를 전달받은 그룹과 비교하였을 때, 유의미한 효과를 나타내었다.As shown in Figure 9, compared with the increase in the expression level of MuRF-1 in the muscle atrophy induction group, it was confirmed that the expression level of MuRF-1 in the group receiving healthy foreign mitochondria decreased to a level similar to normal cells. In particular, it showed a significant effect when compared to the group receiving the damaged mitochondria.

이는 근위축이 유도 시 동반되는 미토콘드리아 기능 손상으로 인해 이와 같은 경로(AMPK-FoxO/Atrogene pathway)를 자극함으로써 근 위축 질환을 유도할 수 있다는 이론과 부합하는 내용이며, 실제 본 연구를 통해 건강한 미토콘드리아를 외부에서 전달하여 줌으로써, 이러한 경로를 막아 근 위축 질환으로부터 회복될 수 있음을 확인하였다.This is consistent with the theory that muscle atrophy can be induced by stimulating this pathway (AMPK-FoxO / Atrogene pathway) due to mitochondrial impairment that is accompanied by muscular dystrophy. By delivering from the outside, it was confirmed that this pathway can be prevented and recovered from muscular dystrophy.

실시예 10. 미토콘드리아 이식에 의한 가자미근의 무게 변화 측정Example 10 Measurement of Weight Change of Soleus Muscle by Mitochondrial Implantation

실시예 1.에서 분리한 미토콘드리아는 BCA 어세이를 통해 미토콘드리아 단백질 양을 측정한 뒤, 투여 농도는 저농도(MT low; 0.5 ㎍)와 고농도(MT high; 5 ㎍)로 설정하였다. 이러한 농도는 근위축이 유도된 세포에서 회복 효능을 검증한 유효한 농도 범위로 사용되었다. 준비된 미토콘드리아는 100 ㎕의 식염수에 현탁하여 0.25 mm(31G) × 8 mm(Insulin syringe, BD ULtra-Fine II) 주사기에 넣고 비복근(gastronemius muscle) 사이에 아래와 위로 두 번 주사하였다. 근위축 유발군은 동일한 용량의 0.9%(v/v) 식염수를 주사하였다. The mitochondria isolated in Example 1 were measured for mitochondrial protein by BCA assay, and then the administration concentrations were set to low concentration (MT low; 0.5 μg) and high concentration (MT high; 5 μg). These concentrations were used as valid concentration ranges to verify recovery efficacy in muscle-induced atrophy induced cells. The prepared mitochondria was suspended in 100 μl saline and placed in a 0.25 mm (31 G) × 8 mm (Insulin syringe, BD ULtra-Fine II) syringe, and injected twice between the gastronemius muscles. The muscular dystrophy group was injected with the same dose of 0.9% (v / v) saline.

미토콘드리아 이식 후 1, 7, 14일째에 부검을 실시하였다. 각 실험군 별로 몸무게와 가자미근의 무게를 측정하고, 측정된 무게를 기준으로 몸무게에 대비하여 가자미근 무게 변화를 분석하였다. An autopsy was performed 1, 7 and 14 days after mitochondrial transplantation. For each experimental group, the weight and the weight of the sole of the sole were measured and analyzed for the weight change of the sole of the sole against the weight based on the measured weight.

그 결과, 근위축 유발 동물에 식염수를 투여한 경우, 정상생활을 한 그룹보다 가자미근의 무게가 약 2배 정도 감소하였다. 미토콘드리아 이식 후 1일째부터 무게의 변화가 회복됨을 확인할 수 있었으며, 전달된 MT의 농도에 의존적으로 가자미근의 무게가 증가함을 확인하였다. 덱사메타손 처리 이후 14일째에는 근위축 그룹의 경우도 자연회복 되는 것을 확인하였다. 또한, 미토콘드리아의 이식을 통해 가자미근의 무게가 정상군보다도 증가하였음을 확인하였다(도 10).As a result, when saline was administered to the muscle atrophy-induced animals, the weight of the soleus muscle was reduced by about twice as much as the normal group. From day 1 after mitochondria transplantation, it was confirmed that the weight change was recovered, and the weight of the soleus muscle was increased depending on the concentration of MT delivered. On day 14 after dexamethasone treatment, the muscle atrophy group was also found to recover naturally. In addition, it was confirmed that the weight of the soleus muscle was increased by the mitochondria transplantation than the normal group (FIG. 10).

실시예Example 11. 미토콘드리아 이식에 의한 미토콘드리아 생합성 단백질 발현 확인 11. Confirmation of Mitochondrial Biosynthetic Protein Expression by Mitochondrial Transplantation

미토콘드리아 이식 후 1, 7, 14일째에 수합한 가자미근으로부터 미토콘드리아 생합성의 합성을 비교하기 위해 PGC-1의 단백질 양을 웨스턴 블롯을 통해 확인하였다. 근위축이 유도된 후의 1일째에서는 근위축으로 인한 PGC-1의 발현량이 감소하였다. 반면, 미토콘드리아 전달군에서는 이식 농도에 의존적으로 PGC-1의 발현량이 회복됨을 확인하였다. 그에 반해 자연회복 단계인 7, 14일째의 근위축 유도군에서는 PGC-1의 발현량이 정상군과 유사하게 회복되는 것을 확인하였다(도 11a 및 도 11b).The protein amount of PGC-1 was confirmed by Western blot to compare the synthesis of mitochondrial biosynthesis from the flounder muscle collected at 1, 7, 14 days after mitochondrial transplantation. On day 1 after muscle atrophy was induced, the expression level of PGC-1 due to muscle atrophy decreased. On the other hand, the mitochondrial delivery group was confirmed that the expression level of PGC-1 recovered depending on the transplant concentration. On the contrary, in the muscle atrophy induction group of the natural recovery stage 7, day 14, the expression level of PGC-1 was confirmed to recover similarly to the normal group (FIGS. 11A and 11B).

즉, 근위축 유도로 인한 미토콘드리아 생합성의 저해를 확인하였고, 외래 미토콘드리아 이식 후 조직 내 미토콘드리아의 PGC-1의 발현량이 증가됨을 확인하였다. 따라서, 이러한 결과를 통해 외래 미토콘드리아 이식함으로써 조직 내 미토콘드리아 생합성의 활성을 증가시킬 수 있음을 확인하였다. In other words, inhibition of mitochondrial biosynthesis due to muscle atrophy induction was confirmed, and the expression level of mitochondrial PGC-1 in tissues was increased after foreign mitochondrial transplantation. Therefore, these results confirm that the mitochondrial biosynthesis activity in the tissue can be increased by the foreign mitochondria transplantation.

실시예 12. 미토콘드리아 이식에 의한 근위축 관련 단백질 발현 Example 12. Atrophy-Related Protein Expression by Mitochondrial Transplantation

미토콘드리아 이식 후 1, 7, 14일째에 수합한 가자미근으로부터 근위축 특이 마커인 MuRF-1의 단백질 발현량을 웨스턴 블롯을 통해 확인하였다. 근위축이 유도된 후의 7일째에서는 근위축 유도로 인한 MuRf-1의 발현량이 증가함을 확인하였다. 반면, 미토콘드리아 전달군에서는 이식 농도에 의존적으로 MuRF-1의 발현 억제를 확인하였다. 또한, 14일째의 근위축 유도군에서도 MuRF-1의 발현이 나타나지 않음은 근위축으로부터 자연회복이 되는 시점을 의미한다(도 12a 및 12b).The amount of protein expression of MuRF-1, which is a muscle atrophy specific marker, from the soleus muscle collected at 1, 7, 14 days after the mitochondrial transplantation was confirmed by Western blot. On day 7 after induction of atrophy, it was confirmed that the expression level of MuRf-1 due to induction of atrophy increased. On the other hand, the mitochondrial delivery group confirmed the inhibition of MuRF-1 expression depending on the transplant concentration. In addition, the expression of MuRF-1 does not appear even in the muscle atrophy induction group on the 14th day means a time point at which the natural recovery from the muscle atrophy (Figs. 12A and 12B).

즉, 근위축 유도된 근육 내 MuRF-1의 발현을 확인하였고, 이는 7일째까지 지속되었다. 반면, 외래 미토콘드리아 이식 후 MuRF-1의 발현을 억제되는 것을 확인하였다. 따라서, 이러한 결과를 통해 외래 미토콘드리아를 이식함으로써 근위축을 회복시킬 수 있음을 확인하였다.That is, the expression of MuRF-1 in muscle atrophy induced muscle was confirmed, which lasted until day 7. On the other hand, it was confirmed that the expression of MuRF-1 after foreign mitochondrial transplantation is suppressed. Thus, these results confirmed that the muscle atrophy can be restored by transplanting the foreign mitochondria.

실시예 13. 미토콘드리아 이식에 의한 근 섬유 재생의 조직학적 분석 Example 13. Histological Analysis of Muscle Fiber Regeneration by Mitochondrial Implantation

근위축 유발 후 외래 미토콘드리아 이식을 통해 근위축의 치료 효과를 조직학적으로 분석하였다. H&E 염색 결과, 근위축 유발 그룹에서는 7일째까지 근섬유의 크기가 작아지고 근 내막(endomysium)이 정상군에 비해 넓게 퍼져있는 것을 확인하였다. 한편, 외래 미토콘드리아를 이식한 그룹에서는 근 섬유의 크기가 증가하고 밀도도 높게 나타났다. 14일째에는 근위축 유도군은 근 섬유의 크기와 근내막이 정상군과 유사해진 것으로 보아 자연회복 되는 것을 확인하였다(도 13).After the induction of muscle atrophy, the therapeutic effect of muscle atrophy was analyzed by foreign mitochondrial transplantation. As a result of H & E staining, the muscle atrophy-induced group showed that the size of myofascial fiber was decreased until 7 days, and the myometrium was spread more widely than the normal group. On the other hand, in the group transplanted with foreign mitochondria, the size of muscle fibers increased and the density was high. On the 14th day, the muscle atrophy induction group was confirmed that the size of the muscle fibers and the endometrium were similar to the normal group, thereby recovering naturally (FIG. 13).

이러한 결과를 통해 근위축 유도로 인한 손상된 근육에 외래 미토콘드리아를 이식함으로써 근 재생을 촉진시킬 수 있음을 확인하였다. These results confirmed that the transplantation of foreign mitochondria into the damaged muscles induced by muscle atrophy can promote muscle regeneration.

이상, 본 발명의 일 실시예에 대하여 설명하였으나, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서, 구성 요소의 부가, 변경, 삭제 또는 추가 등에 의해 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있을 것이며, 이 또한 본 발명의 권리범위 내에 포함된다고 할 것이다.It will be apparent to those skilled in the art that various modifications and variations can be made in the present invention without departing from the spirit of the invention as set forth in the appended claims. The present invention can be variously modified and changed by those skilled in the art, and it is also within the scope of the present invention.

Claims

Including foreign cells introduced into the mitochondria as an active ingredient,
Pharmaceutical composition for preventing or treating myopathy.

The method of claim 1,
The cells are muscle cells or stem cells,
Pharmaceutical composition for preventing or treating myopathy.

3. The method of claim 2,
The stem cells are any one selected from the group consisting of mesenchymal stem cells, adult stem cells, dedifferentiated stem cells, embryonic stem cells, bone marrow stem cells, neural stem cells, limbal stem cells, tissue-derived stem cells and combinations thereof That,
Pharmaceutical composition for preventing or treating myopathy.

The method of claim 3,
The mesenchymal stem cells are obtained from any one selected from the group consisting of umbilical cord, cord blood, bone marrow, fat, muscle, nerve, skin, amniotic membrane, placenta, and combinations thereof,
Pharmaceutical composition for preventing or treating myopathy.

The method of claim 1,
Centrifugation of the cells and the foreign mitochondria mixture to deliver the foreign mitochondria into the cells,
Pharmaceutical composition for preventing or treating myopathy.

The method of claim 1,
The pharmaceutical composition comprises cells into which 0.1 to 500 μg of mitochondria are introduced per 10 ⁵ cells,
Pharmaceutical composition for preventing or treating myopathy.

The method of claim 1,
The muscle disease may be MELAS syndrome, MERRF syndrome, Kearns-Sayre syndrome, myopathy, cerebral myopathy, myasthenia gravis, myasthenia gravis, muscular dystrophy, muscular dystrophy, muscular atrophy or myopathy,
Pharmaceutical composition for preventing or treating myopathy.

A method comprising administering a pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 7 to a mammal other than a human,
Method of preventing or treating myopathy.