KR20190086182A - Biosensor for detecting cortisol using resistance switching and hysteresis change, method for preparing thereof and application thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 저항 스위칭 및 이력현상의 변화를 이용한 코티솔 검출용 바이오센서, 이의 제조방법 및 응용에 관한 것이다.The present invention relates to a biosensor for cortisol detection using a change in resistance switching and hysteresis, a manufacturing method and an application thereof.
코티솔(cortisol)은 콩팥의 부신 피질에서 분비되는 스트레스 호르몬이다. 코티솔은 인체내 내분비축의 가장 중심에 있으며 당, 지방 및 단백질대사, 미네랄 균형, 면역균형 등을 조절하는 역할을 담당한다. 이러한 코티솔의 역할로 짐작할 수 있듯이 코티솔의 온전한 하루주기 리듬 및 적절한 수치의 유지는 건강과 밀접한 관련이 있다. 종래의 코티솔을 측정하는 방법은 고속 액체 크로마토그래피 법(HPLC, High Performance Liquid Chromatography), 형광측정법(fluorometric assay), 역상 크로마토그래피(reverse phase chromatography) 등이 있다. HPLC는 다양한 유기 화합물의 분리나 정량을 위한 대표적인 방법으로서, HPLC는 충전제를 밀어 넣은 컬럼(고정相)에 물이나 유기용매등의 액체(이동相)를 흘리면서, 이동상에 샘플을 혼합해 고정상을 통과시키는 것으로 샘플의 성분 분리를 실시해, 자외 및 가시 흡광이나 형광등의 검출기로 분석하는 장치이다. 형광측정법은 미량의 형광성 물질을 검출, 측정하는 방법이다. HPLC로의 분리는, 이동상과 고정상의 극성에 차이가 필요한데, 이동상의 극성이 높고, 고정상의 극성이 낮은 경우를 역상 크로마토그래피라고 부른다. 그러나 이러한 고속 액체 크로마토그래피 법(HPLC), 형광측정법, 역상 크로마토그래피법은 모두 분석 시간이 많이 걸리고 가격이 비싼 단점이 있다.Cortisol (cortisol) is a hormone secreted from the adrenal cortex of the kidney. The cortisol is at the center of the endocrine axis in the body and plays a role in controlling sugar, fat and protein metabolism, mineral balance, and immune balance. As can be seen from the role of cortisol, the complete rhythm of the cortisol and maintenance of adequate levels is closely related to health. Conventional methods for measuring cortisol include high performance liquid chromatography (HPLC), fluorometric assay, and reverse phase chromatography. HPLC is a typical method for separation and quantification of various organic compounds. HPLC is a method of mixing a sample in a mobile phase with a liquid (mobile phase) such as water or an organic solvent through a column (stationary phase) To separate the components of the sample and to analyze them with a detector of ultraviolet, visible light or fluorescent lamp. Fluorescence measurement is a method of detecting and measuring a trace amount of fluorescent material. Separation by HPLC requires a difference in polarity between the mobile phase and the stationary phase. When the polarity of the mobile phase is high and the polarity of the stationary phase is low, this is called reverse phase chromatography. However, such high-performance liquid chromatography (HPLC), fluorescence measurement, and reverse phase chromatography all require a long analysis time and are expensive.
한편, 저항변화소자(resistive switching device)는 강한 전기장이나 유전체(dielectric)의 저항이 두 가지 상태로 변하는 것을 이용한 기술이다. 기존의 저항 변화 소자에 대한 연구는 산화물 (ZnOx etc.) 절연층을 이용하여 연구 진행 중이나, 바이오 물질을 기반으로 한 소자에 대한 연구는 부족하다. 또한 절연체 증착 과정은 물리적으로 증착하는 진공 열 증착방법, 스퍼터링 방법과 화학적인 증착 (PECVD etc.) 방법들이 있는데 이러한 공정은 까다롭고, 복잡하고, 추가적인 공정들을 요구함에 따라 바이오 물질을 증착시키기에는 바이오 물질이 온도와 압력에 민감 할뿐더러, 고가의 장비들이 필요하다는 문제점이 있다.On the other hand, a resistive switching device is a technology using a change in a strong electric field or a resistance of a dielectric in two states. Research on existing resistance-changing devices is under way using oxide (ZnOx etc.) insulating layer, but research on devices based on biomaterials is insufficient. In addition, the insulator deposition process includes a vacuum thermal deposition method, a sputtering method, and a chemical vapor deposition (PECVD etc.) method in which physical deposition is performed. Since these processes require complicated, complicated, and additional processes, The material is sensitive to temperature and pressure, and expensive equipment is required.
또한, 현재까지 스트레스 호르몬인 코티솔을 센싱하는데 저항변화 특성을 이용한 기술은 전무한 상태이다.Also, to date, there has been no technology using resistance change characteristics to sense the stress hormone cortisol.
따라서, 기존의 복잡한 공정이 아닌 간단한 용액공정으로 제조될 수 있는 바이오 물질을 이용한 소자이며 차세대 생체 삽입 소자에서도 적용 가능하다는 점과 뉴로모픽 메모리 분야에서 적용 가능하고, 강한 전기장이나 전류에 의해 유전체(dielectric)의 저항이 두 가지 상태로 변하는 것을 이용하는 저항변화소자(resistive switching device)의 작동원리를 이용하여 코티솔을 검출하는 바이오센서에 관한 기술의 개발이 요구되고 있다.Therefore, it can be applied to next-generation biocompatible devices and biomolecule memory devices that can be manufactured by a simple solution process rather than a conventional complicated process. there is a demand for development of a technology related to a biosensor that detects cortisol using the principle of operation of a resistive switching device that utilizes the fact that the resistance of a dielectric is changed into two states.
본 발명의 목적은 저항변화소자 작동원리를 이용한 코티솔 검출용 바이오센서 및 상기 바이오센서를 이용하여 코티솔을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a biosensor for cortisol detection using the principle of operation of a resistance-variable element and a method for detecting cortisol using the biosensor.
상기 과제를 해결하기 위해 본 발명은, 기판; 기판 상에 형성된 전극 패턴; 및 상기 전극 패턴 사이에 형성되며, 전기전도성을 갖는 입자상 물질이 분산된 구조의 신축성 단백질층을 포함하며, 상기 입자상 물질은 코티솔 특이적 항체가 결합된 구조인 코티솔 검출용 바이오센서를 제공한다.According to an aspect of the present invention, An electrode pattern formed on a substrate; And a stretchable protein layer formed between the electrode patterns and having a structure in which particulate matter having electrical conductivity is dispersed, wherein the particulate material is a structure having a cortisol-specific antibody bound thereto.
또한, 본 발명은 상기 바이오센서를 이용한 코티솔 센싱 방법으로서, 신축성 단백질층과 시료를 접촉하고 그에 따른 저항변화에 따른 이력현상을 측정하여 코티솔 유무를 검출하는 단계를 포함하는 코티솔 센싱 방법을 제공한다.The present invention also provides a cortisol sensing method using the biosensor, comprising the steps of contacting a sample with a stretchable protein layer and measuring the hysteresis of the cortisol according to the change in resistance, thereby detecting cortisol presence or absence.
본 발명에 따른 코티솔 검출용 바이오센서는 매우 간단한 공정으로 바이오 물질 기반의 저항변화소자를 제조할 수 있으며, 실제 센서 적용 시에 사람의 침을 이용한 코티솔 수치 농도 측정도 가능하고, 고가의 장비를 필요로 하지 않기 때문에 경제적인 관점에서도 효율적이다.The biosensor for detecting cortisol according to the present invention can manufacture a resistance-changing device based on a biomaterial using a very simple process, and can measure the concentration of cortisol using human needles at the time of actual sensor application, It is efficient from an economical point of view.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 코티솔 검출용 바이오센서의 개략도이다.
도 2 및 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 바이오센서의 드레인 전류(drain current)와 드레인 전압(drain voltage)의 관계를 분석한 그래프이다.1 is a schematic view of a biosensor for detecting cortisol produced according to an embodiment of the present invention.
FIG. 2 and FIG. 3 are graphs showing a relationship between a drain current and a drain voltage of the biosensor manufactured according to an embodiment of the present invention.
본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다.While the invention is susceptible to various modifications and alternative forms, specific embodiments thereof are shown by way of example in the drawings and will herein be described in detail.
그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.It should be understood, however, that the invention is not intended to be limited to the particular embodiments, but includes all modifications, equivalents, and alternatives falling within the spirit and scope of the invention. DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings.
제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용할 수 있지만, 구성요소들은 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.The terms first, second, etc. may be used to describe various elements, but the elements should not be limited by terms. Terms are used only for the purpose of distinguishing one component from another.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. The terminology used in this application is used only to describe a specific embodiment and is not intended to limit the invention. The singular expressions include plural expressions unless the context clearly dictates otherwise.
본 발명에서, "포함한다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.In the present invention, the terms "comprising" or "having ", and the like, specify that the presence of a feature, a number, a step, an operation, an element, a component, But do not preclude the presence or addition of one or more other features, integers, steps, operations, elements, components, or combinations thereof.
따라서, 본 명세서에 기재된 실시예에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일 실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형 예들이 있을 수 있다.Therefore, the configurations shown in the embodiments described herein are merely the most preferred embodiments of the present invention and are not intended to represent all of the technical ideas of the present invention. Therefore, various equivalents And variations.
또한, 본 발명에서 첨부된 도면은 설명의 편의를 위하여 확대 또는 축소하여 도시된 것으로 이해되어야 한다.It is to be understood that both the foregoing general description and the following detailed description are exemplary and explanatory and are intended to provide further explanation of the invention as claimed.
본 발명은 ITO (indium tin oxide) 기판에 평형한 전극 패턴을 형성 시킨 후 두 전극 패턴 사이에 간단한 인큐베이션 방법을 사용하여 코티솔 특이적 항체가 결합된 입자상 물질이 분산된 구조의 신축성 단백질층을 형성하고, 측정하고자 하는 타겟, 목표물질이며 항원인 코티솔(Cortisol)을 인큐베이션(incubation) 함으로써 저항 스위칭 특성의 변화를 이용하여 코티솔을 검출하는 방법을 제공할 수 있다.The present invention forms an electrode pattern balanced on an indium tin oxide (ITO) substrate, forms a stretchable protein layer in which particulate matter bound with a cortisol-specific antibody is dispersed using a simple incubation method between two electrode patterns , A method for detecting cortisol using a change in resistance switching characteristic by incubating a target to be measured and a target substance and cortisol as an antigen can be provided.
이하, 본 발명에 따른 코티솔 검출용 바이오센서를 상세하게 설명하기로 한다.Hereinafter, a biosensor for cortisol detection according to the present invention will be described in detail.
본 발명에 따른 코티솔 검출용 바이오 센서는 기판; 기판 상에 형성된 전극 패턴; 및 상기 전극 패턴 사이에 형성되며, 전기전도성을 갖는 입자상 물질이 분산된 구조의 신축성 단백질층을 포함하며, 상기 입자상 물질은 코티솔 특이적 항체가 결합된 구조이다.A biosensor for cortisol detection according to the present invention comprises: a substrate; An electrode pattern formed on a substrate; And a stretchable protein layer formed between the electrode patterns and having a structure in which particulate matter having electrical conductivity is dispersed, wherein the particulate material is a structure having a cortisol-specific antibody bound thereto.
상기 코티솔 검출용 바이오센서는, 저항 스위칭(변화) 소자의 작동 원리를 이용한 것이다. 저항 스위칭 소자는 저항스위칭(resistive switching) 현상에 의하여 저항 값이 급격한 변화를 일으켜 측정되는 I-V 그래프에서 이력현상(hysteresis)를 나타낼 수 있으며, 이력현상의 차이가 클수록 ON/OFF 비율로 표시되는 디지털 메모리 소자로서의 역할을 기대할 수 있다. 혹은, 저항 스위칭 소자는 상기 이력현상을 바탕으로 이전의 전압 스윕(sweep)경험(이전의 스트레스 경험)을 기억하는, 인간의 뇌에 있는 신경세포의 역할을 따라하는 뉴로모픽 소자(neuromorphic device)로 작동이 가능하다. 저항 스위칭 소자는 전기화학적 소자가 아닌바, 전기화학적 작동원리가 적용되는 것이 아니며, 전극 사이에 있는 절연체나 반도체 물질의 물리적 저항 변화 현상에 기한하는 것이다. 상기 코티솔 검출용 바이오센서는 이러한 저항 스위칭 소자의 원리를 이용한 것으로, 저항 측정을 위하여 전압 스윕(sweep)을 실시할 때, 소자의 저항의 변화로 인한 이력현상(hysteresis)의 변화 또는 차이를 이용하여, 코티솔을 검출하는 것을 특징으로 한다. 이러한 이력현상은 신축성 단백질에, 검지물질인 코티솔 항체(프루브 분자)가 결합하는 경우에 크게 증대되어 변화(hysteresis 크기 혹은 넓이의 변화)를 일으키며, 검출하고자하는 코티솔의 결합시에 또 저항변화와 더불어 이력현상 변화(hysteresis 크기 혹은 넓이의 변화)를 다시 일으키게 되는 바, 이러한 원리로 코티솔을 검출한다.The cortisol detection biosensor utilizes the operation principle of the resistance switching element. The resistance switching element can exhibit hysteresis in an IV graph measured by causing a rapid change in resistance value due to resistive switching phenomenon, and a hysteresis can be detected in a digital memory A role as a device can be expected. Alternatively, the resistive switching element may be a neuromorphic device that follows the role of neurons in the human brain, which remembers the previous voltage sweep experience (previous stress experience) based on the hysteresis phenomenon, . The resistance switching device is not an electrochemical device, but is based on the phenomenon of change in the physical resistance of the insulator or semiconductor material between the electrodes, not the electrochemical operating principle. The biosensor for cortisol detection utilizes the principle of the resistance switching element. When a voltage sweep is performed for resistance measurement, the biosensor for cortisol detection uses a change or a difference in hysteresis due to a change in resistance of the element , And cortisol. This hysteresis phenomenon is greatly increased when a stretch protein binds to a cortisol antibody (probe molecule) as a detection substance and causes a change (hysteresis size or width change). When the cortisol to be detected is bound, This causes the hysteresis change (hysteresis size or width change) to be detected, and this principle detects cortisol.
상기 신축성 단백질은 하기 구조 1로 나타낼 수 있다. The stretch protein may be represented by
[구조 1][Structure 1]
[Val-Pro-Gly-Xaa-Gly]n[Val-Pro-Gly-Xaa-Gly] n
구조 1에서, Xaa는 Pro를 제외한 단백질이고, n은 1 이상의 정수이다.In
상기 전기전도성을 갖는 입자상 물질은 외부로부터 주입되는 타겟 분자와 반응하는 프로브 분자를 포함하고,Wherein the particulate material having electrical conductivity comprises a probe molecule that reacts with a target molecule injected from the outside,
상기 프로브 분자는 코티솔에 특이적 결합을 하는 항체로서, N-(3-다이메틸아미노프로필)-N′-에틸카보다이이미드 또는 N-하이드록시숙신이미드 둘 중 하나 이상을 포함할 수 있다. The probe molecule is an antibody that specifically binds to cortisol and may include at least one of N- (3-dimethylaminopropyl) -N'-ethylcarbodiimide or N-hydroxysuccinimide.
상기 신축성 단백질층은 0.3 내지 2.5nm 의 두께로 형성될 수 있다.The stretchable protein layer may be formed to a thickness of 0.3 to 2.5 nm.
상기 기판 상에 형성된 전극 패턴은 동일한 평면 상에 소스 전극과 드레인 전극이 형성된 수평적 구조로 이루어진 것일 수 있다.The electrode pattern formed on the substrate may have a horizontal structure in which a source electrode and a drain electrode are formed on the same plane.
상기 바이오센서의 소스 전극과 드레인 전극은 0.01 내지 5㎛의 이격 거리를 유지할 수 있다. 소스 전극과 드레인 전극의 이격 거리가 상기 범위일 경우 프로브 분자와 타겟 분자의 결합 유무에 따른 저항 변화 및 저항 변화에 따른 이력현상의 변화를 감지하는 정확도가 향상되는 이점이 있다. The source electrode and the drain electrode of the biosensor can maintain a distance of 0.01 to 5 mu m. When the distance between the source electrode and the drain electrode is within the above range, there is an advantage in that the accuracy of detecting a resistance change depending on the presence or absence of a probe molecule and a hysteresis change due to a resistance change is improved.
상기 프로브 분자는 코티솔에 특이적 결합을 하는 항체일 수 있다.The probe molecule may be an antibody that specifically binds cortisol.
상기 프로브 분자는 N-(3-다이메틸아미노프로필)-N′-에틸카보다이이미드 (N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide) 또는 N-하이드록시숙신이미드 (N-Hydroxysuccinimide) 둘 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 또한 상기 프로브 분자는 상기 N-(3-다이메틸아미노프로필)-N′-에틸카보다이이미드와 N-하이드록시숙신이미드가 커플링된 구조일 수 있다.Wherein the probe molecule is selected from the group consisting of N- (3-Dimethylaminopropyl) -N'-ethylcarbodiimide or N-Hydroxysuccinimide ≪ / RTI > The probe molecule may be a structure in which the N- (3-dimethylaminopropyl) -N'-ethylcarbodiimide and N-hydroxysuccinimide are coupled.
상기 바이오센서는 두 개의 전극만이 센서에 사용(two terminal electrode)될 수 있다. 또한 상기 바이오센서는 동일한 평면 상에 소스 전극과 드레인 전극이 형성된 수평적 구조로 이루어질 수 있다.In the biosensor, only two electrodes may be used for the sensor (two terminal electrodes). The biosensor may have a horizontal structure in which a source electrode and a drain electrode are formed on the same plane.
상기 바이오센서는, 상기 전기전도성을 갖는 입자상 물질에 결합된 프로브 분자에 타겟 분자인 코티솔이 결합할 때 발생하는 저항 변화에 따른 이력현상의 변화에 의해 코티솔을 검출하는 것을 특징으로 하는, 저항스위칭 및 이력현상의 변화를 이용하는 것일 수 있다. 즉 상기 바이오센서는 단순히 전기전도도 또는 저항의 크기 차이를 센싱하는 것이 아니라, 저항 측정을 위하여 전압 스윕(sweep)을 실시할 때, 소자의 저항의 변화로 인한 이력현상(hysteresis)의 변화 또는 차이를 이용하여, 코티솔을 검출할 수 있다.Wherein the biosensor detects cortisol by a change in hysteresis according to a change in resistance caused when the target molecule, cortisol, binds to the probe molecule bound to the particulate matter having electroconductivity, It may be to use a change in the hysteresis phenomenon. That is, the biosensor does not simply sense the electrical conductivity or the magnitude of the resistance, but rather, when performing a voltage sweep for resistance measurement, a change or a difference in hysteresis due to a change in resistance of the device Can be used to detect cortisol.
이하, 상기 코티솔 검출용 바이오센서의 제조방법을 설명한다. Hereinafter, a method of manufacturing the cortisol detection biosensor will be described.
본 발명에 따른 코티솔 검출용 바이오센서의 제조방법은,A method of manufacturing a biosensor for detecting cortisol according to the present invention comprises:
신축성 단백질을 합성하는 단계; 유전자 재조합 기술을 이용하여 대장균에서 상기 신축성 단백질을 대량생산하고 분리정제하는 단계; 금 나노 (5 nm gold particle)입자를 디티오비스-N-숙신이미딜 프로피오네이트 (dithiobis-N-succinimidyl propionate, DTSP)를 이용하여 코티솔 특이적항체 (cortisol monoclonal antibody)를 결합시키는 단계; 상기 신축성 단백질을 합성하는 단계에서 얻은 합성체와 코티솔 특이적 항체가 코팅된 금 나노 (5nm gold particle)입자를 용액 상에서 혼합하여 혼합액을 제조하는 단계; 노광공정 (photo lithography)을 이용하여 평형한 ITO 전극(source & drain) 패턴 형성 시키는 단계; 상기 혼합액을 인큐베이션 방법을 통하여 활성채널(active channel)을 증착하는 단계; 및 상기 인큐베이션(incubation)된 채널 위에 코티솔을 인큐베이션 하는 단계를 포함한다.Synthesizing a stretch protein; Mass-producing and separating and purifying the stretch protein in Escherichia coli using a recombinant technology; Binding 5 nm gold particle particles to a cortisol monoclonal antibody using dithiobis-N-succinimidyl propionate (DTSP); Preparing a mixture by mixing the composite obtained in the step of synthesizing the elastic protein and gold nanoparticles (5 nm gold particle) coated with a cortisol-specific antibody in a solution; Forming a balanced ITO electrode (source & drain) pattern using photo lithography; Depositing an active channel on the mixed solution through an incubation method; And incubating cortisol on the incubated channel.
상기 인큐베이션은 25℃에서 10 내지 30분간 수행할 수 있다.The incubation can be carried out at 25 DEG C for 10 to 30 minutes.
상기 신축성 단백질은 하기 구조 1로 나타내는 것일 수 있다.The stretch protein may be represented by
[구조 1][Structure 1]
[Val-Pro-Gly-Xaa-Gly]n[Val-Pro-Gly-Xaa-Gly] n
구조 1에서, Xaa는 Pro를 제외한 단백질이고, n은 1 이상의 정수이다.In
이하, 본 발명에 따른 코티솔 센싱 방법을 설명한다.Hereinafter, a cortisol sensing method according to the present invention will be described.
본 발명에 따른 코티솔 센싱 방법은 상기 코티솔 검출용 바이오센서를 이용한 코티솔 센싱 방법으로서, 신축성 단백질층과 시료를 접촉하고 그에 따른 저항변화에 따른 이력현상을 측정하여 코티솔 유무를 검출하는 단계를 포함한다.A cortisol sensing method according to the present invention includes a step of contacting a sample with a stretchable protein layer and measuring a hysteresis according to a resistance change to detect presence or absence of cortisol.
상기 코티솔 센싱 방법은 신축성 단백질층과 시료를 접촉하고 그에 따른 저항변화를 산출하여 코티솔 유무를 검출하는 단계 이전에, 신축성 단백질층과 시료를 접촉하지 않았을 때 센서의 저항변화에 따른 이력현상을 측정하는 단계를 포함한다.The cortisol sensing method measures the hysteresis of the sensor when the elasticity protein layer and the sample are not in contact with each other before the step of detecting the presence or absence of cortisol by calculating the resistance change by contacting the sample with the elastic protein layer .
또한, 신축성 단백질층과 시료를 접촉하지 않았을 때 센서의 저항변화에 따른 이력현상과 신축성 단백질층과 시료를 접촉하였을 때 그에 따른 저항변화에 따른 이력현상의 차이를 비교하여 코티솔의 검출유무를 결정하는 단계를 포함한다.The presence or absence of cortisol is determined by comparing the hysteresis caused by the resistance change of the sensor when the elastic protein layer is not in contact with the sample and the hysteresis caused by the resistance change when the sample is contacted with the elastic protein layer .
상기 센싱 방법은 프로브 분자와 타겟 분자의 결합 유무에 따라 발생하는 저항 변화와 이력현상의 변화를 감지하는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 한다. 즉 단순히 저항의 크기가 변화하는 것을 의미하는 것만이 아니라, 저항 측정을 위하여 전압 스윕(sweep)을 실시할 때, 소자의 저항의 변화로 인한 이력현상(hysteresis)의 변화 또는 차이를 의미한다. 이러한 이력현상은 신축성 단백질층에, 검지물질인 코티솔 항체(프루브 분자)가 결합하는 경우에 크게 증대되어 변화(hysteresis 크기 혹은 넓이의 변화)를 일으키며, 검출하고자 하는 코티솔의 결합시에 또 저항변화와 더불어 이력현상 변화(hysteresis 크기 혹은 넓이의 변화)를 다시 일으키게 되는 바, 이러한 원리로 코티솔을 검출하는 것을 특징으로 한다. 이러한 센싱 방법은 커패시터(capacitor) 타입의 바이오센서와 같이 금속 나노입자가 결합되어야만 얻어지는 I-V 이력현상과 다르고, 화학저항(chemiresistor) 바이오센서의 측정 방법처럼 타겟 물질의 변화에 따른 저항 변화로만 측정하는 것이 아니고, 저항 스위칭 현상에 따른 이력현상의 변화를 측정하여 코티솔을 검출하는 것이다.The sensing method is performed by a method of detecting a resistance change and a hysteresis change depending on the presence or absence of a probe molecule and a target molecule. This means not only that the magnitude of the resistance changes but also a change or difference in the hysteresis due to a change in the resistance of the device when a voltage sweep is performed for resistance measurement. These hysteresis phenomena are greatly increased when the stretch protein layer is bound to the cortisol antibody (probe molecule) as a detection substance, causing a change (change in hysteresis size or width), and when the cortisol to be detected is bound, In addition, the hysteresis phenomenon (change in hysteresis size or extent) is caused to occur again, and this principle is characterized by detecting cortisol. This sensing method is different from the IV hysteresis phenomenon that is obtained only when a metal nanoparticle is combined with a capacitor type biosensor and is measured only by a resistance change due to a change of a target material such as a method of measuring a biosensor of a chemical resistance , But the cortisol is detected by measuring the change in hysteresis due to the resistance switching phenomenon.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 상기 내용을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위가 하기 제시된 내용에 의해 제한되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples and Experimental Examples. However, the scope of the present invention is not limited by the following description.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 유전자 재조합 기술을 이용하여 대장균에서 합성한 단백질인 [Val-Pro-Gly-Xaa-Gly]n 합성체를 코티솔에 특이적 결합을 하는 항체인 C-mab (cortisol-monoclonal antibody)을 결합한 금 나노입자와 용액상에서 혼합한 혼합액을 ITO (indium tin oxide) 전극이 평행한 형태로 패턴 된 유리기판 위에 간단한 인큐베이션 방법을 사용하여 필름을 형성한 뒤, 측정하고자 하는 타겟, 목표물질이며 항원인 코티솔(Cortisol)을 인큐베이션(incubation) 함으로써 저항 스위칭 특성의 변화를 이용하여 코티솔을 검출하는 방법을 제공할 수 있다.According to one embodiment of the present invention, a compound [Val-Pro-Gly-Xaa-Gly] n, which is a protein synthesized in Escherichia coli using a recombinant technology, is reacted with an antibody cortisol -monoclonal antibody) was mixed with the gold nanoparticles in solution to form a film on a glass substrate patterned in the shape of an ITO (indium tin oxide) electrode using a simple incubation method, It is possible to provide a method for detecting cortisol using a change in resistance switching characteristic by incubating a target substance and an antigen cortisol (Cortisol).
도 1을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서(100)는 기판(110), 전극(소스 전극 및 드레인 전극, 120), 신축성 단백질층(130) 및 프로브 분자(140)으로 구성된다. 신축성 단백질층(130)은 금속-절연체-금속(metal-insulator-metal, MIM)의 스태킹(stacking) 구조가 아닌 평행한 전극 구조(lateral electrode)를 가지고 있다. 또한 신축성 단백질층(130)은 전압이 인가되면 빠르게 전하를 이동시킬 수 있고, 민감도에서 우수하며, 다른 물질이 결합되었을 때 저항 상태가 바뀜으로써 저항 스위칭 특성을 나타낼 수 있다.1, a
실시예: 저항 변화를 이용한 코티솔 검출용 바이오센서의 제조 및 이를 이용한 코티솔 검출Example: Fabrication of a biosensor for cortisol detection using resistance change and cortisol detection using the same
유리기판 위에 노광공정(photolithography)을 이용하여 평행하게 ITO 전극(소스 전극 및 드레인 전극)을 제조하였다. ITO 유리 기판은 면 저항이 10 Ω/sq 이며, ITO 두께는 185±20 nm의 두께를 가진 소다 라임 유리(soda lime glass) 기판이다. 전체적인 기판의 크기는 5cm X 5cm 이며 두께가 0.7T(mm)인 기판을 사용하였다. 이 기판을 이용하여 노광공정과 에칭 공정을 통해 소스와 드레인 (source & drain)전극을 평행한 상태로 제조하였다. 이 때 소스 전극과 드레인 전극의 이격거리는 3㎛로 제조하였다. ITO electrodes (source electrode and drain electrode) were prepared in parallel on a glass substrate using photolithography. The ITO glass substrate is a soda lime glass substrate having a surface resistance of 10 Ω / sq and an ITO thickness of 185 ± 20 nm. The overall substrate size was 5 cm x 5 cm and the substrate thickness was 0.7 T (mm). Using this substrate, the source and drain electrodes were formed in a parallel state through an exposure process and an etching process. At this time, the distance between the source electrode and the drain electrode was 3 mu m.
신축성 단백질인 [Val-Pro-Gly-Xaa-Gly]n 합성체는 유전자 재조합 기술을 이용하여 대장균에서 상기 신축성 단백질을 대량생산하고 분리정제하여 제조하여 준비하였다. 금 나노 (5nm gold particle)입자를 디티오비스-N-숙신이미딜 프로피오네이트(dithiobis-N-succinimidyl propionate, DTSP)를 이용하여 코티솔 특이적 항체(cortisol monoclonal antibody)인 C-mab (cortisol-monoclonal antibody)를 결합시키킨 후 상기 [Val-Pro-Gly-Xaa-Gly]n 합성체와 용액 상에서 혼합하여 혼합액을 제조하였다. 상기 혼합액은 25℃에서 10 내지 30분간 인큐베이션 하여 활성 채널로 증착하였다. 제조된 센서의 저항스위칭 특성을 측정한 다음, C-mab이 커플링된 센서에 코티솔 샘플을 가하여 25℃에서 30분간 인큐베이션한 후 저항 스위칭 특성을 측정하고, 양자의 저항 상태(저항 변화 및 이력현상의 변화)를 비교하는 방법으로 코티솔을 검출하였다.The [Val-Pro-Gly-Xaa-Gly] n synthase, which is a stretch protein, was prepared by mass-producing, isolating and purifying the above-mentioned stretch protein in E. coli using a gene recombination technique. Gold nanoparticles (5 nm gold particles) were coated with cortisol monoclonal antibody C-mab (cortisol-monoclonal antibody) using dithiobis-N-succinimidyl propionate (DTSP) Antibodies were combined and mixed with the [Val-Pro-Gly-Xaa-Gly] n complex in the solution to prepare a mixed solution. The mixed solution was incubated at 25 DEG C for 10 to 30 minutes to deposit an active channel. After measuring the resistance switching characteristics of the manufactured sensor, a cortisol sample was added to the C-mab-coupled sensor and incubated at 25 ° C for 30 minutes. Then, the resistance switching characteristics were measured, and the resistance state (resistance change and hysteresis Of cortisol were compared with each other.
실험예: 저항변화특성 분석Experimental Example: Analysis of resistance change characteristics
실시예에 따라 제조된 바이오센서의, 코티솔 결합 유무에 따른 저항변화특성을 분석하여 도 2 및 3에 나타내었다. 도 2 및 도 3에 나타내는 바와 같이, 바이오센서의 저항변화 측정을 위한 신축성 단백질 층은 코티솔 호르몬 검지 항체 프로브가 커플링 (1%ELP @5%nm Au NPs conjugated c-Mab)되어있으며, 코티솔 검지 항체에 코티솔 호르몬이 결합되어 있지 않은 경우와 코티솔 검지 항체에 코티솔이 결합되는 경우(1ng/ml cortisol, 10ng/ml cortisol, 100ng/ml cortisol, 1000ng/ml cortisol) 의 이력현상이 프루브 분자가 존재할 때 저항 변화가 확연히 변화되어 차이점을 나타냈다. 이러한 차이점이 코티솔 센싱의 근간이 되는 것이다. 또한, 코티솔 농도를 다르게 하였을 때(1ng/ml cortisol, 10ng/ml cortisol, 100ng/ml cortisol, 1000ng/ml cortisol), 이력현상의 차이가 확연히 나타나는 것으로 확인되었는 바, 이는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 바이오센서가 여러 농도에서 작동이 잘 된다는 것을 나타내며, 다양한 코티솔 기준 농도 센싱의 근간으로, 사람의 타액 속에 포함된 코티솔 호르몬 수치를 확인 할 수 있다는 것을 나타낸다.The resistance change characteristics of the biosensor manufactured according to the embodiment according to the presence or absence of cortisol binding are analyzed and shown in FIGS. 2 and 3. As shown in FIG. 2 and FIG. 3, the elastic protein layer for the resistance change measurement of the biosensor is coupled with cortisol hormone detection antibody probe (1% ELP @ 5% nm Au NPs conjugated c-Mab) Hysteresis in the absence of cortisol hormone binding to the antibody and cortisol binding to cortisol antibody (1 ng / ml cortisol, 10 ng / ml cortisol, 100 ng / ml cortisol, 1000 ng / ml cortisol) The resistance change was significantly changed and showed the difference. This difference is the basis of cortisol sensing. In addition, when the cortisol concentration was different (1 ng / ml cortisol, 10 ng / ml cortisol, 100 ng / ml cortisol, and 1000 ng / ml cortisol), it was confirmed that the hysteresis was significantly different. Indicates that the biosensor thus manufactured can operate at various concentrations and that the cortisol hormone levels contained in the saliva of humans can be confirmed based on various cortisol standard concentration sensing.
100: 코티솔 검출용 바이오센서
110: 기판
120: 전극
130: 신축성 단백질층
140: 프로브 분자100: Biosensor for cortisol detection
110: substrate
120: Electrode
130: stretch protein layer
140: probe molecule
Claims (9)
기판 상에 형성된 전극 패턴; 및
상기 전극 패턴 사이에 형성되며, 전기전도성을 갖는 입자상 물질이 분산된 구조의 신축성 단백질층을 포함하며,
상기 입자상 물질은 코티솔 특이적 항체가 결합된 구조인 코티솔 검출용 바이오센서.
Board;
An electrode pattern formed on a substrate; And
A stretchable protein layer formed between the electrode patterns and having a structure in which particulate matter having electrical conductivity is dispersed,
Wherein the particulate matter is a structure in which a cortisol-specific antibody is bound.
상기 신축성 단백질은 하기 구조 1로 나타내는 것을 특징으로 하는 코티솔 검출용 바이오센서:
[구조 1]
[Val-Pro-Gly-Xaa-Gly]n
구조 1에서, Xaa는 Pro를 제외한 단백질이고, n은 1 이상의 정수임.
The method according to claim 1,
The biosensor for cortisol detection is characterized in that the stretch protein is represented by the following structure 1:
[Structure 1]
[Val-Pro-Gly-Xaa-Gly] n
In Structure 1, Xaa is a protein other than Pro, and n is an integer of 1 or more.
상기 전기전도성을 갖는 입자상 물질은 외부로부터 주입되는 타겟 분자와 반응하는 프로브 분자를 포함하고,
상기 프로브 분자는 코티솔에 특이적 결합을 하는 항체로서, N-(3-다이메틸아미노프로필)-N′-에틸카보다이이미드 또는 N-하이드록시숙신이미드 둘 중 하나 이상을 포함하는 코티솔 검출용 바이오센서.
The method according to claim 1,
Wherein the particulate material having electrical conductivity comprises a probe molecule that reacts with a target molecule injected from the outside,
Wherein the probe molecule is an antibody that specifically binds to cortisol and is selected from the group consisting of N- (3-dimethylaminopropyl) -N'-ethylcarbodiimide or N-hydroxysuccinimide for cortisol detection Biosensor.
상기 전기전도성을 갖는 입자상 물질에 결합된 프로브 분자에 타겟 분자인 코티솔이 결합할 때 발생하는 저항 변화에 따른 이력현상의 변화에 의해 코티솔을 검출하는 것을 특징으로 하는, 저항스위칭 및 이력현상의 변화를 이용한 코티솔 검출용 바이오센서.
The method of claim 3,
Characterized in that the cortisol is detected by a change in hysteresis according to a resistance change caused when a target molecule, cortisol, binds to a probe molecule bound to the particulate substance having electric conductivity, Biosensor for cortisol detection.
상기 신축성 단백질층은 0.3 내지 2.5nm 의 두께로 형성된 것을 특징으로 하는 코티솔 검출용 바이오센서.
The method according to claim 1,
Wherein the stretchable protein layer is formed to a thickness of 0.3 to 2.5 nm.
기판 상에 형성된 전극 패턴은 동일한 평면 상에 소스 전극과 드레인 전극이 형성된 수평적 구조로 이루어진 것을 특징으로 하는 코티솔 검출용 바이오센서.
The method according to claim 1,
Wherein the electrode pattern formed on the substrate has a horizontal structure in which a source electrode and a drain electrode are formed on the same plane.
신축성 단백질층과 시료를 접촉하고 그에 따른 저항변화에 따른 이력현상을 측정하여 코티솔 유무를 검출하는 단계를 포함하는 코티솔 센싱 방법.
A cortisol sensing method using the biosensor according to claim 1,
Contacting the sample with a stretchable protein layer and measuring hysteresis according to the resistance change to detect presence or absence of cortisol.
신축성 단백질층과 시료를 접촉하고 그에 따른 저항변화를 산출하여 코티솔 유무를 검출하는 단계 이전에, 신축성 단백질층과 시료를 접촉하지 않았을 때 센서의 저항변화에 따른 이력현상을 측정하는 단계를 포함하는 코티솔 센싱 방법.
8. The method of claim 7,
Measuring a hysteresis with respect to a change in resistance of the sensor when the sample is not in contact with the stretchable protein layer, before the step of detecting the presence or absence of cortisol by calculating the resistance change by contacting the sample with the elastic protein layer, Sensing method.
신축성 단백질층과 시료를 접촉하지 않았을 때 센서의 저항변화에 따른 이력현상과 신축성 단백질층과 시료를 접촉하였을 때 그에 따른 저항변화에 따른 이력현상의 차이를 비교하여 코티솔의 검출유무를 결정하는 단계를 포함하는 코티솔 센싱 방법.9. The method of claim 8,
The step of determining the presence or absence of cortisol by comparing the hysteresis according to the resistance change of the sensor when the elastic protein layer and the sample are not in contact with the difference of the hysteresis according to the resistance change when the sample is contacted with the elastic protein layer Gt; cortisol < / RTI >
Priority Applications (1)
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| KR1020180004400A KR102083485B1 (en) | 2018-01-12 | 2018-01-12 | Biosensor for detecting cortisol using resistance switching and hysteresis change, method for preparing thereof and application thereof |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020180004400A KR102083485B1 (en) | 2018-01-12 | 2018-01-12 | Biosensor for detecting cortisol using resistance switching and hysteresis change, method for preparing thereof and application thereof |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111678950A (en) * | 2020-06-09 | 2020-09-18 | 中国电子科技集团公司第四十九研究所 | Sensor for detecting cortisol in sweat |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20140019547A (en) | 2012-08-06 | 2014-02-17 | 주식회사 피코팜 | A mesurement method of stress by figuring stress |
| KR20170029950A (en) * | 2015-09-08 | 2017-03-16 | 명지대학교 산학협력단 | Resistance switchable composite material having cortisol conjugated nanoparticle and memory device using the same |
| KR101766659B1 (en) * | 2016-06-30 | 2017-08-09 | 명지대학교 산학협력단 | Biosensor for detecting cortisol using resistance switching and hysteresis change, method for preparing thereof and application thereof |
-
2018
- 2018-01-12 KR KR1020180004400A patent/KR102083485B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20140019547A (en) | 2012-08-06 | 2014-02-17 | 주식회사 피코팜 | A mesurement method of stress by figuring stress |
| KR20170029950A (en) * | 2015-09-08 | 2017-03-16 | 명지대학교 산학협력단 | Resistance switchable composite material having cortisol conjugated nanoparticle and memory device using the same |
| KR101766659B1 (en) * | 2016-06-30 | 2017-08-09 | 명지대학교 산학협력단 | Biosensor for detecting cortisol using resistance switching and hysteresis change, method for preparing thereof and application thereof |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Biotechnology and Bioprocess Engineering, vol.14, pp.662-667 (2009) 1부.* * |
| 한국생물공학회 학술대회, p.576 (2016.10) 1부.* * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111678950A (en) * | 2020-06-09 | 2020-09-18 | 中国电子科技集团公司第四十九研究所 | Sensor for detecting cortisol in sweat |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR102083485B1 (en) | 2020-03-02 |
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