KR20190086068A - A composition comprising sulfobetainic zwitterionic detergents for tissue penetration of biological molecules and the use thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 포함하는 생물학적 분자의 생체조직침투용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다. TECHNICAL FIELD The present invention relates to a composition for penetrating a biological tissue containing a sulfobetaine-zwitterionic surfactant and a use thereof.
생체 조직 (tissue), 기관 (organ), 또는 이것의 일부를 포함하는 생물학적 시료는 불투명하므로, 3차원 상태에서 그 조직 내부를 일반적인 광학현미경으로 관찰하는 것은 거의 불가능하다. 이에 광학이미징 기술을 이용해 생체 조직을 포함하는 생물학적 시료의 내부를 3차원 (3D) 상태에서 관찰하기 위한 수단으로서 공초점현미경 또는 다광자현미경이 사용되어 왔으나, 사용되는 광원이 생물학적 시료를 통과할 수 있는 깊이는 수백 ㎛에 불과하여 매우 제한된 정보만 얻을 수 있다. 또한, 3차원 구조의 생물학적 시료를 관찰하기 위한 다른 방법으로서 면역염색방법이 이용되고 있다. 또한, 최근에는 면역염색방법과 조직 투명화방법을 함께 적용하여 생물학적 시료를 3차원 상태에서 효율적으로 관찰하고자 하는 방법이 제안된 바 있다. Biological samples containing biological tissue, organs, or parts thereof are opaque, and it is almost impossible to observe the inside of the tissue under a general optical microscope in a three-dimensional state. Therefore, a confocal microscope or a multiphoton microscope has been used as a means for observing the inside of a biological sample including a living tissue by using an optical imaging technique in a three-dimensional (3D) state, but a light source used can pass through a biological sample The depth is only a few hundred micrometers, so that only very limited information can be obtained. Immunostaining methods have also been used as other methods for observing biological samples of a three-dimensional structure. Recently, a method for effectively observing a biological sample in a three-dimensional state by applying the immuno-staining method and the tissue transparency method has been proposed.
면역염색방법은 조직을 고정액으로 고정한 후, 파라핀 또는 폴리머로 포매 (embedding)한 다음, 수 ㎛ 또는 ㎚ 두께로 절편을 만들어 빛이나 전자파가 투과할 수 있도록 한 후, 광학 또는 전자현미경을 이용하여 조직 시료를 이미징 한다. 그러나, 이러한 방법은 전체 조직 또는 두꺼운 조직의 정보를 얻고자 할 때, 수십 ㎛ 두께 이하의 연속적인 절편을 제작해야 하고, 이들 각각을 현미경을 이용하여 이미징 한 후 다시 재구성하는 일련의 번거로운 과정을 필요로 한다. 생체조직 투명화 방법은 이러한 면역염색방법의 한계를 극복할 수 있는 방법의 하나이며, 조직의 물리화학적 특성을 변형시켜 이미징을 얻을 때 사용하는 빛이 흡수, 산란 및 굴절되는 현상을 억제하여 빛이 조직을 투과할 수 있도록 하는 방법이다. 관련하여 다양한 기술이 개발되고 있으며, 예를 들어, 전기영동 방법 기반, 수용액 또는 유기 용매 기반의 투명화 방법이 생물학적 시료의 관찰에 이용되고 있다. 이러한 조직 투명화 방법들은 모두 생물학적 시료의 조직 내 지질을 제거하고, 상기 시료의 굴절보상률을 보정하는 방법으로서, 투명화 과정에서 단백질 변성 등에 의한 DNA, RNA, 또는 단백질 등 생체 조직의 정보가 왜곡되거나 손실되지 않도록 하는 것이 중요하다. Immunostaining is performed by immobilizing the tissue with a fixative and then embedding the tissue with paraffin or polymer. The tissue is then cut to a thickness of several 쨉 m or ㎚ to allow light or electromagnetic waves to pass therethrough, Imaging the sample. However, in order to obtain the information of the entire tissue or the thick tissue, this method requires a series of intermittent cuts of several tens of 탆 thick or less, a series of cumbersome steps of imaging each of them using a microscope and then reconstructing them again . Biological tissue transparency is one of the ways to overcome the limitations of such immuno-staining methods. It modifies the physico-chemical properties of tissues and suppresses absorption, scattering and refraction of light used for imaging, To the surface of the substrate. A variety of techniques have been developed in connection with, for example, an electrophoresis-based, aqueous solution or an organic solvent-based transparency method for the observation of biological samples. All of these tissue transparency methods are methods for removing the lipid in the tissue of a biological sample and correcting the refractive index of the sample. In this case, information on a biological tissue such as DNA, RNA, or protein is distorted or lost It is important to avoid.
한편, 생체조직 또는 기관의 3차원 구조나 분포를 관찰하기 위해 항체 또는 고분자 등을 생물학적 시료에 염색하는 방법은 현재에도 여전히 개발 중에 있다. 일반적으로, 입자는 자연적으로 스스로 불규칙적인 운동을 하고 사방으로 퍼지면서 다른 분자와 섞이는 확산을 통해 이동한다. 특히, 다양한 물질로 구성되고 복잡한 구조를 갖는 생체 조직 내에서 항체 또는 고분자의 확산은 느리기 진행되기 때문에 일정한 볼륨 이상을 지닌 조직 내로 침투하는데 오랜 시간이 걸린다. 따라서 이러한 문제점을 해결하기 위해, 생체 조직 또는 기관과 같은 생물학적 시료를 고정하는 고정제를 소량 사용하거나 수화젤의 구조 간격을 넓게 하는 방법도 적용되고 있다. 또한, 고분자의 신속한 확산을 위해서 조직을 다공성으로 만드는 방법도 제안된 바 있다. 그러나 이러한 방법은 주로 조직을 얼렸다 녹이는 과정을 반복하거나 탈수 및 재수화를 반복해야 하는 번거로움이 있다. 또 다른 방법으로 항체나 고분자 자체의 확산 속도를 빠르게 하기 위해서 고분자가 담긴 용액의 온도를 높이거나, 마이크로파를 이용하는 방법도 개발된 바 있고, 항체나 고분자의 고른 전달을 위해 혈관을 이용하는 방법도 개발된 바 있다. 또한 최근에는 유기 용매를 이용해 염색하는 방법과 회전하는 용액에서 전기장의 외력을 주는 방법, 고분자를 높은 농도로 사용해 농도 구배를 이용하는 방법, 원심력 등을 이용해 고분자에 압력을 주어 조직을 고속으로 투과하는 방법이 개발된 바 있다. 그러나, 전기장을 이용하는 방법은 60 ~ 100 V의 높은 전압 때문에 조직이 훼손이 될 수 있는데, 이는 조직이나 생물학적 시료 내의 구성물이 전하를 갖고 있어 전기장에 따라 움직이기 때문이다. 확률적 전기 수송방법 또한 전기장의 외력과 함께 유체의 흐름을 주기 때문에 유체 속도에 따라서 조직의 손상이 발생할 수 있다. 원심력을 주어 고분자의 이동속도를 늘리는 방법은 조직의 안정성을 보장하지만, 한쪽 방향으로만 흐르는 단점이 있다. 고분자를 높은 농도로 주어서 농도 구배를 하는 방법은 반응 속도를 조절할 수 있는 장점이 있지만, 많은 양의 고분자를 사용해야하기 때문에 경제적으로 비효율적이다. 특히, 이와 같은 방법들은 특별한 사양의 기계 장치가 필요하다는 단점이 있다. 이와 달리 유기 용매를 이용한 방법은 특별한 장치가 필요 없고, 전기적 방법보다 높은 보존성을 보이지만, 한 조직으로 한 번의 염색 밖에 할 수 없는 단점이 있다. 또한, 많은 유기용매들이 그 고유의 특성상 독성 또는 폭발성이 있기 때문에 실험자가 취급하기 어렵다는 문제점도 있다.On the other hand, a method of staining an antibody or a polymer in a biological sample to observe the three-dimensional structure or distribution of a living tissue or an organ is still under development. In general, particles naturally move themselves through diffusions, mixing themselves with other molecules while doing irregular motions and spreading all around. In particular, the diffusion of an antibody or a polymer in a biological tissue composed of various materials and having a complicated structure proceeds slowly, so that it takes a long time to penetrate into a tissue having a certain volume or more. Therefore, in order to solve such a problem, a method of using a small amount of fixing agent for fixing a biological sample such as a biotissue or an organ or a method of widening the structure interval of the hydrogel is also applied. In addition, a method of making a tissue porous for rapid diffusion of a polymer has been proposed. However, this method is mainly troublesome to repeat the process of dissolving and melting the tissues and repeating dehydration and rehydration. Another method has been developed to increase the temperature of the solution containing the polymer or to use microwaves in order to increase the diffusion rate of the antibody or the polymer itself. A method of using the blood vessel for the uniform delivery of the antibody or polymer has also been developed There is a bar. Recently, a method of dyeing using an organic solvent, a method of applying an external force of an electric field in a rotating solution, a method of using a concentration gradient using a high concentration of a polymer, a method of applying pressure to a polymer using centrifugal force, Has been developed. However, the method of using the electric field can damage the tissue due to the high voltage of 60 to 100 V because the constituents in the tissue or biological sample have electric charge and move in accordance with the electric field. The probabilistic electrotransport method also causes fluid flow along with the external force of the electric field, so that tissue damage may occur depending on the fluid velocity. The method of increasing the moving speed of the polymer by applying the centrifugal force ensures the stability of the tissue, but has a drawback that it flows only in one direction. Concentration gradients with a high concentration of polymer have the advantage of controlling the reaction rate, but they are economically inefficient because a large amount of polymer should be used. Particularly, these methods have a disadvantage in that a special specification of a mechanical device is required. On the other hand, the method using an organic solvent does not require a special apparatus and shows a higher preservability than an electrical method, but has a disadvantage that only one dyeing can be performed with one tissue. In addition, there are problems that many organic solvents are toxic or explosive due to their inherent characteristics, making it difficult for an experimenter to handle.
따라서 일정한 볼륨 이상의 생체조직 또는 장기를 포함하는 생물학적 시료를 3차원 상태에서 관찰하기 위해, 이것의 심부로 항체, 항체단편, 단백질, 다당류, RNA 및 DNA를 포함하는 핵산, 펩타이드 및 폴리펩타이드와 같은 생물학적 분자 (biological molecule)를 신속하고 균일하게 침투시켜 상기 시료에 대한 관찰 및 분석 효율을 증진시킬 수 있는 방법이 여전히 요구되고 있는 실정이다. Therefore, in order to observe a biological sample containing a living tissue or organ of a certain volume or more in a three-dimensional state, it is preferable that a biological part such as a nucleic acid, a peptide and a polypeptide including an antibody, an antibody fragment, a protein, a polysaccharide, There is still a need for a method capable of rapidly and uniformly penetrating a biological molecule to improve the observation and analysis efficiency of the sample.
본 발명의 목적은 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 사용하여 생물학적 시료 내로 생물학적 분자를 신속하고 균일하게 침투시키는 방법에 관한 것이다. It is an object of the present invention to provide a method for quickly and uniformly infiltrating biological molecules into a biological sample using a sulfobetaine zwitterionic surfactant.
본 발명의 다른 목적은 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 포함하는 생물학적 분자의 조직침투용 조성물을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a composition for tissue infiltration of biological molecules containing a sulfobetaine zwitterionic surfactant.
본 발명의 또 다른 목적은 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 포함하는 생물학적 시료의 면역화학염색용 조성물을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a composition for immunochemical staining of a biological sample comprising a sulfobetaine zwitterionic surfactant.
본 발명의 또 다른 목적은 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 포함하는 생물학적 시료의 조직투명화 방법을 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide a method for clarifying tissue of a biological sample comprising a sulfobetaine zwitterionic surfactant.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 생체 외로 분리된 조직 (tissue), 기관 (organ) 또는 이것의 일부를 포함하는 생물학적 시료에 처리하는 것을 포함하는, 설포베타인계 쯔비터 이온성 계면활성제를 이용하여 생물학적 분자를 생물학적 시료 내로 침투시키는 방법을 제공한다. In order to achieve the above object, the present invention provides a method for treating a sulfobetaine-zwitterionic surfactant, which comprises treating a biological sample containing tissues, organs or a part thereof, A method for infiltrating a biological molecule into a biological sample using an ionizing surfactant is provided.
본 발명의 이러한 면에 따르면, 본 발명에 따른 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 이용한 생물학적 시료의 조직침투 방법은, (a) 생물학적 시료를 고정시키는 단계; (b) 선택적으로 그리고 필요에 따라, 상기 (a) 단계의 생물학적 시료를 세척하고 고정 용액을 제거하는 단계; (c) 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 상기 생물학적 시료에 처리하는 단계; (d) 상기 (c) 단계의 생물학적 시료를 세척하고 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 제거하는 단계; 및 (e) 상기 (d) 단계의 생물학적 시료에 항체, 항체단편, 단백질, 다당류, RNA 및 DNA를 포함하는 핵산, 펩타이드 및 폴리펩타이드로 구성된 군으로부터 선택된 한 이상인 것인 생물학적 분자를 가하는 단계를 포함한다. 본 발명의 다른 실시예에서, 상기 생물학적 분자는 그 특성에 따라 상기 (c) 단계에서 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제와 함께 처리되거나, (b) 단계 후 (c) 단계 전에 처리 될 수 있다. According to this aspect of the present invention, a method for tissue infiltration of a biological sample using a sulfobetaine zwitterionic surfactant according to the present invention comprises the steps of: (a) immobilizing a biological sample; (b) optionally and optionally washing the biological sample of step (a) and removing the fixative solution; (c) treating the biological sample with a sulfobetaine zwitterionic surfactant; (d) washing the biological sample of step (c) and removing the sulfobetaine zwitterionic surfactant; And (e) adding to the biological sample of step (d) at least one biological molecule selected from the group consisting of nucleic acids, peptides and polypeptides, including antibodies, antibody fragments, proteins, polysaccharides, RNA and DNA do. In another embodiment of the present invention, the biological molecule may be treated with the sulfobetaine zwitterionic surfactant in step (c) or treated prior to step (c) after step (b), depending on its characteristics.
본 발명의 일 실시예에서, 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 상기 생물학적 시료에 처리하는 것은, 상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제에 상기 생물학적 시료를 침지하는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, treating the biological sample with a sulfobetaine zwitterionic surfactant may be by immersing the biological sample in the sulfobetaine zwitterionic surfactant.
또한, 본 발명은 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 포함하는 생물학적 분자의 생체조직 침투용 조성물을 제공한다. The present invention also provides a composition for penetrating a biological tissue containing a sulfobetaine-zwitterionic surfactant.
본 발명의 이러한 면에서, 본 발명의 생체조직 침투용 조성물 및 이를 이용하여 조직을 침투시키는 방법은, 특히 0.1 ㎜ 이상의 두께를 지닌 조직 또는 기관의 심부 내로 생물학적 분자를 신속하고 균일하게 침투시킬 수 있다. In this aspect of the present invention, the composition for penetrating a living tissue of the present invention and the method for infiltrating tissue using the same can rapidly and uniformly infiltrate biological molecules into the deep part of a tissue or an organ having a thickness of 0.1 mm or more .
본 발명에서, 생물학적 분자 (biological molecules)는 생체조직 내로 침투시키고자 하는 화합물, 항체, 항체단편, 단백질, 다당류, RNA 및 DNA를 포함하는 핵산, 펩타이드 및 폴리펩타이드를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니며, 생체조직 내로 전달하고자 하는 임의의 고분자 및 저분자 물질을 모두 포함한다. In the present invention, biological molecules include, but are not limited to, compounds, antibodies, antibody fragments, proteins, polysaccharides, RNA and DNA, nucleic acids, peptides and polypeptides that are intended to penetrate into living tissue , Any polymer and a low molecular weight substance to be transferred into a living tissue.
본 발명에서, 생물학적 시료는 생체 외로 분리된 생체 조직 (tissue), 기관 (organ), 및 세포를 포함하며, 바람직하게는 0.1 ㎜ 이상의 두께를 갖는 생체 조직이나, 이에 제한되는 것은 아니다. In the present invention, the biological sample includes living tissue, an organ, and cells isolated in vitro, preferably a biological tissue having a thickness of 0.1 mm or more, but is not limited thereto.
바람직하게는 그리고 본 발명에 따르면, 본 발명의 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제는 하기 화학식 1로 표시된 것이다.Preferably, and according to the present invention, the sulfobetaine zwitterionic surfactant of the present invention is represented by the following formula (1).
<화학식 1>≪ Formula 1 >
상기 식에서, R은 탄소 원자수 8 ~ 22개의 알킬기 또는 알케닐기이고, 상기 x는 0 ~ 3의 정수이며, 상기 y는 2 ~ 4의 정수이다. Wherein R is an alkyl or alkenyl group having 8 to 22 carbon atoms, x is an integer of 0 to 3, and y is an integer of 2 to 4.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 계면활성제는 Dimethylethylammoniumpropane sulfonate; N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate; Sodium 3,3′-[(1,2-diphenylethene-1,2-diyl)bis(4,1-phenylene)]bis(oxy)bis(propane-1-sulfonate);
3-(4-Heptyl)phenyl-3-hydroxypropyl)dimethylammoniopropanesulfonate; 3-(Decyldimethylammonio)-propanesulfonate; 3-[Dimethyl-(2-hydroxyethyl)ammonio]-1-propanesulfonate; 3-(1-Methylpiperidinio)-1-propanesulfonate; 3-(Triphenylphosphonio)propane-1- sulfonate; 3-(Di-tert-butylphosphonium)propane sulfonate; 3-(N,N- Dimethylpalmitylammonio)propanesulfonate; 3-[N,N-Dimethyl(3- myristoylaminopropyl)ammonio]propanesulfonate; 3-(N,N-In one embodiment of the present invention, the surfactant is selected from the group consisting of Dimethylethylammoniumpropane sulfonate; N-Dodecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate;
Dimethylmyristylammonio)propanesulfonate; 3-(N,N-Dimethyloctadecylammonio)propanesulfonate; 3-([3-Cholamidopropyl]dimethylammonio)-2-hydroxy-1-propanesulfonate; 및 3-[(3- Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.Dimethylmyristylammonio) propanesulfonate; 3- (N, N-Dimethyloctadecylammonio) propanesulfonate; 3 - ([3-Cholamidopropyl] dimethylammonio) -2-hydroxy-1-propanesulfonate; And 3 - [(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate.
본 발명의 일 실시예에서, 생물학적 시료의 조직 내로 생물학적 분자를 침투시키기 위해, 상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 각 계면활성제가 고유의 값으로 갖고 있는 미셀임계농도 (critical micelle concentration) 이상의 농도로 바람직하게는 4 ~ 200시간 동안 상기 생물학적 시료에 처리하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, in order to infiltrate biological molecules into the tissue of a biological sample, the concentration of the sulfobetaine zwitterionic surfactant above the critical micelle concentration at which each surfactant has a unique value To the biological sample for a period of time ranging from 4 to 200 hours, preferably, but not exclusively, to the biological sample.
본 발명의 다른 일 실시예에서, 상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제는 바람직하게는 상기 각 계면활성제의 미셀임계온도 내지 60℃ 이하의 온도에서 처리하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In another embodiment of the present invention, the sulfobetaine zwitterionic surfactant may be treated at a temperature ranging from the micelle critical temperature of each of the surfactants to 60 ° C or less, but is not limited thereto.
본 발명의 다른 일 실시예에서, 상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 생물학적 시료에 처리하는 것이, 10 ~ 500 rpm의 속도를 갖는 롤링바틀 (rolling bottle) 인큐베이터, 10 ~ 500 rpm의 속도를 갖는 진탕기 (shaker) 또는 10 ~ 500 rpm 속도와 30°~ 45°의 기울기를 갖는 락커 (rocker)를 이용하여 수행되는 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, treating the biological sample with the sulfobetaine zwitterionic surfactant is carried out in a rolling bottle incubator at a speed of 10 to 500 rpm, at a speed of 10 to 500 rpm A shaker or a rocker with a speed of 10 to 500 rpm and a slope of 30 to 45 degrees.
본 발명의 또 다른 일 실시예에서, 상기 시료에 침투시키고자 하는 생물학적 분자는 그 특성에 따라, 상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제와 함께 동시에 처리되거나 상기 계면활성제 처리 전 또는 후에 적용될 수 있다. In another embodiment of the present invention, the biological molecule to be penetrated into the sample may be treated simultaneously with the sulfobetaine zwitterionic surfactant or may be applied before or after the surfactant treatment, depending on its characteristics.
본 발명은 또한 설포-베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 이용한 면역조직화학염색 방법 및 설포-베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 유효성분으로 포함하는 면역조직화학염색용 조성물을 제공한다. 유리하게는 그리고 본 발명에 따르면, 본 발명의 면역화학염색용 조성물은, 0.1 ㎜ 이상의 두께를 갖는 생체 조직의 심부를 면역조직화학염색 하는데 이용될 수 있다. The present invention also provides an immunohistochemical staining method using a sulfo-betaine zwitterionic surfactant and a composition for immunohistochemical staining comprising a sulfo-betaine zwitterionic surfactant as an active ingredient. Advantageously and according to the present invention, the composition for immunochemical staining of the present invention can be used for immunohistochemically staining the deep part of a living tissue having a thickness of 0.1 mm or more.
본 발명에서, 면역조직화학염색은 항원과 항체간의 반응을 이용하여 세포나 조직 내에 존재하는 물질을 확인하는 면역염색법이며, 면역염색 또는 면역화학염색과 혼용하여 사용하였다. In the present invention, immunohistochemical staining is an immunohistochemical staining method using a reaction between an antigen and an antibody to identify a substance present in cells or tissues, and used in combination with immunostaining or immunochemical staining.
본 발명의 이러한 면에 따르면, 본 발명의 면역화학염색용 조성물은 상기 화학식 1의 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 유효성분으로 포함하며, 상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제는 Dimethylethylammoniumpropane sulfonate; N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3- ammonio-1-propanesulfonate; Sodium 3,3′-[(1,2-diphenylethene-1,2-diyl)bis(4,1-phenylene)]bis(oxy)bis(propane-1-sulfonate); 3-(4-Heptyl)phenyl- 3-hydroxypropyl)dimethylammoniopropanesulfonate; 3-(Decyldimethylammonio)propanesulfonate; 3-[Dimethyl-(2-hydroxyethyl)ammonio]-1-propanesulfonate; 3-(1-Methylpiperidinio)-1-propanesulfonate; 3-(Triphenylphosphonio)propane-1- sulfonate; 3-(Di-tert-butylphosphonium)propane sulfonate; 3-(N,N- Dimethylpalmitylammonio)propanesulfonate;
3-[N,N-Dimethyl(3- myristoylaminopropyl)ammonio]propanesulfonate; 3-(N,N-According to this aspect of the present invention, the composition for immunochemical staining of the present invention comprises the sulfobetaine zwitterionic surfactant of
Dimethylmyristylammonio)propanesulfonate; 3-(N,N- Dimethyloctadecylammonio)propanesulfonate; 3-([3-Dimethylmyristylammonio) propanesulfonate; 3- (N, N-Dimethyloctadecylammonio) propanesulfonate; 3 - ([3-
Cholamidopropyl]dimethylammonio)-2-hydroxy-1-propanesulfonate; 및 3-[(3- Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.Cholamidopropyl] dimethylammonio) -2-hydroxy-1-propanesulfonate; And 3 - [(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate.
본 발명의 일 실시예는 상기 설포-베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 이용하여 생물학적 시료를 면역화학염색 하는 방법을 제공하며, 이는 다음 단계를 포함한다: (a) 생물학적 시료를 고정시키는 단계; (b) 선택적으로 그리고 필요에 따라, 상기 (a) 단계의 생물학적 시료를 세척하고 고정용액을 제거하는 단계; (c) 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 상기 생물학적 시료에 처리하는 단계; (d) 상기 (c) 단계의 생물학적 시료를 세척하고 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 제거하는 단계; (e) 상기 (d) 단계의 생물학적 시료를 항체와 반응시켜 면역염색 하는 단계; (f) 상기 (e) 단계의 생물학적 시료를 세척하고 반응하지 않은 항체를 제거하는 단계; 및 (g) 상기 면역염색이 완료된 생물학적 시료를 투명화 하는 단계. One embodiment of the present invention provides a method of immunochemically staining a biological sample using the sulfo-betaine zwitterionic surfactant, comprising the steps of: (a) immobilizing a biological sample; (b) optionally and optionally washing the biological sample of step (a) and removing the fixative solution; (c) treating the biological sample with a sulfobetaine zwitterionic surfactant; (d) washing the biological sample of step (c) and removing the sulfobetaine zwitterionic surfactant; (e) immunologically staining the biological sample of step (d) by reacting with the antibody; (f) washing the biological sample of step (e) and removing unreacted antibody; And (g) visualizing the immunologically stained biological sample.
본 발명의 다른 일 실시예에서, 상기 (c) 단계에서의 처리는 설포베 타인계 쯔비터이온성 계면활성제를, 예를 들어, 증류수 또는 PBS (phosphate-buffered saline)를 함유하는 용액에 각 계면활성제가 갖는 고유 미셀임계농도 이상의 농도로 용해시킨 용액으로, 바람직하게는 4 ~ 200시간 동안 생물학적 시료에 처리하는 것일 수 있으나, 이에 제한된 것은 아니다.In another embodiment of the present invention, the treatment in step (c) is performed by treating the sulfobetaine zwitterionic surfactant with a surfactant, for example, in a solution containing distilled water or PBS (phosphate-buffered saline) But is not limited to, treatment with a solution that is dissolved at a concentration higher than the intrinsic micelle critical concentration possessed by the biological sample, preferably for 4 to 200 hours.
본 발명의 다른 일 실시예에 있어서, 상기 처리는 바람직하게는 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제가 갖는 미셀임계온도 내지 60℃의 온도에서 처리하는 것일 수 있으나 이에 제한된 것은 아니다. In another embodiment of the present invention, the treatment is preferably, but not exclusively, a treatment with a sulfobetaine zwitterionic surfactant at a temperature ranging from a micelle critical temperature to 60 ° C.
본 발명의 다른 일 실시예에서, 상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 10 ~ 500 rpm의 속도를 갖는 롤링바틀 (rolling bottle) 인큐베이터, 10 ~ 500 rpm의 속도를 갖는 진탕기 (shaker) 또는 10 ~ 500 rpm 속도와 30°~ 45°의 기울기를 갖는 락커 (rocker)를 이용하여 생물학적 시료에 처리하는 것일 수 있다. In another embodiment of the present invention, the sulfobetaine zwitterionic surfactant is added to a rolling bottle incubator having a speed of 10 to 500 rpm, a shaker at a speed of 10 to 500 rpm, To a biological sample using a rocker with a speed of ~ 500 rpm and a slope of 30 [deg.] To 45 [deg.].
본 발명의 다른 일 실시예에서, 상기 (d) 단계에서 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제의 제거는 상기 계면활성제가 처리된 생물학적 시료를, 예를 들어, 증류수 또는 PBS (phosphate-buffered saline)를 함유한 용액에 첨가하여, 상기 시료에 존재하는 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제의 농도를 미셀임계농도 이하로 낮추는 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the removal of the sulfobetaine zwitterionic surfactant in step (d) may be performed by removing the biological sample treated with the surfactant with, for example, distilled water or PBS (phosphate-buffered saline) To thereby reduce the concentration of the sulfobetaine zwitterionic surfactant present in the sample to a micelle critical concentration or less.
본 발명의 다른 일 실시예에서, 상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제의 제거는 교반기 상에서 30°~ 45°의 기울기 및 10 ~ 500 rpm의 속도를 갖는 기울기 이동 (tilt movement) 이나 용액의 이동을 수행하여 제거하는 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the removal of the sulfobetaine zwitterionic surfactant can be accomplished by the addition of a solvent such as a tilt or a solution having a slope of 30 ° to 45 ° and a speed of 10 to 500 rpm on a stirrer And removing it.
본 발명의 다른 일 실시예에 있어서, 상기 (g) 단계의 투명화 하는 단계는 투명화 용액에 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 각 계면활성제가 갖는 고유 값의 미셀임계농도 이상의 농도로 첨가하여 수행하며, 상기 투명화 하는 단계는 상기 (d) 단계 후 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다.In another embodiment of the present invention, the step (g) is performed by adding a sulfobetaine zwitterionic surfactant to the vitrification solution at a concentration of the micellar critical concentration or more of the eigenvalues of the respective surfactants, , And the transparentizing step may further include a step of processing after step (d).
따라서, 본 발명의 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 포함하는 조성물은, 생체 시료의 광학적 이미징을 위한 전처리용 조성물이며, 면역조직화학염색 및 조직투명화 둘 모두를 위한 조성물이다. Accordingly, the composition comprising the sulfobetaine zwitterionic surfactant of the present invention is a composition for pretreatment for optical imaging of biological samples, and is a composition for both immunohistochemical staining and tissue transparency.
본 발명은 생물학적 시료의 조직침투용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명에 따르면 생물학적 분자를 두꺼운 두께를 갖는 생체조직의 심부까지 신속하고 균일하게 침투시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 생체조직을 포함하는 생물학적 시료의 면역화학염색에 이용될 수 있다. 본 발명의 설포-베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 이용하여 생물학적 시료를 면역화학염색하는 경우, 생물학적 시료에 함유된 막관통단백질만을 선택적으로 제거할 수 있어, 면역염색을 위한 항체나 생체고분자가 분석하고자 하는 생체조직에 효과적으로 신속하게 침투될 수 있고, 시료를 손상 없이 안전하게 보존할 수 있다. 또한, 두꺼운 두께의 시료의 심부까지 염색이 가능하므로, 종래 면역염색화학 방법에 비해 면역염색분석 효율을 현처히 향상시킬 수 있다.The present invention relates to a composition for tissue infiltration of a biological sample. According to the present invention, it is possible to quickly and uniformly infiltrate a biological molecule into a deep part of a living tissue having a thick thickness. Therefore, the composition of the present invention can be used for immunochemical staining of a biological sample containing biological tissue. When the biological sample is immunochemically stained with the sulfo-betaine zwitterionic surfactant of the present invention, only the membrane penetration protein contained in the biological sample can be selectively removed, and thus the antibody or biopolymer for immuno-staining is analyzed It is possible to effectively and quickly penetrate the desired biotissue, and the sample can be safely preserved without being damaged. In addition, since it is possible to dye up to the deep portion of a thick sample, the efficiency of immuno-staining analysis can be improved compared to conventional immuno-staining chemical methods.
도 1은 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 처리하여 생체조직이나 생물학적 시료를 면역화학염색하는 방법에 관한 순서도이다.
도 2는 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 뇌조직 절편 (100 ㎛ 두께)에 수행하였을 때, 보다 더 많은 항체가 투과된 것을 나타낸 것이다.
도 3은 인산염완충용액, 이온성 계면 활성제, 쯔비터이온성 계면활성제를 각 각 뇌조직에 처리한 후, 시간에 따른 조직변형 여부를 관찰한 사진으로서, 쯔비터 이온성 계면활성제를 처리한 경우 생체조직이 변형 없이 그대로 보존된 것을 나타낸다.
도 4는 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 뇌조직 절편에 처리 시, 미 셀임계농도 이상일 경우, 고농도에서도 생체조직이 그대로 보존되고 변형이 일어나 지 않음을 확인한 결과이다.
도 5는 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 종류별로 처리하고 뇌조직 절편을 염색한 결과로서, 공통적으로 항체나 생체고분자 물질이 조직 내로 잘 침투되고 있음을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 이용한 전처리 과정을 포 함한 면역화학염색법으로 전체 뇌조직에 반응시켰을 때, 심부 뇌 (deep brain)까지 항체가 침투한 것을 보여주는 결과이다.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a flow chart of a method for immunochemical staining of biological tissues or biological samples by treating a sulfobetaine zwitterionic surfactant.
Fig. 2 shows that more antibody was permeated when a sulfobetaine zwitterionic surfactant was applied to a brain tissue slice (100 탆 thick).
FIG. 3 is a photograph showing the deformation of tissues with time after treating each brain tissue with a phosphate buffer solution, an ionic surfactant, and a zwitterionic surfactant. When the zwitterionic surfactant is treated, Indicating that the tissue was preserved without modification.
FIG. 4 shows that when the sulfobetaine-zwitterionic surfactant was treated with brain tissue sections, the biological tissue was preserved and deformation was not observed even at a high concentration when the concentration was above the microcell threshold.
FIG. 5 shows the result of confirming that antibody or biopolymer material is well penetrated into tissues as a result of treating the sulfobetaine zwitterionic surfactant by type and staining brain tissue sections.
FIG. 6 shows immunochemical staining, including pretreatment with a sulfobetaine zwitterionic surfactant, showing that the antibody penetrated into the deep brain when reacted to whole brain tissue.
본 발명은 생물학적 시료 전체에 대해 항체, 항체단편, 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질을 포함하는 생물학적 분자를 신속하고 고르게 상기 시료의 심부 내로 침투시키는 방법 및 이를 위한 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 포함하며, 이는 생물학적 시료에 존재하는 단백질-단백질 결합을 유지시키는 반면, 지질간 또는 지질-단백질간의 결합을 약화시키고, 조직 내 세포막에 존재하는 막관통단백질만을 선택적으로 제거할 수 있다. 따라서 분석하고자 하는 조직 내의 항상성 및 항원성은 그대로 유지하면서 막 단백질이나 지질의 변화로 인한 조직의 변형 또는 물러짐이 발생하지 않도록 한다. The present invention relates to a method and a composition for rapidly and evenly infiltrating a biological molecule containing an antibody, an antibody fragment, a peptide, a polypeptide and a protein into the deep part of the sample with respect to the entire biological sample. The composition of the present invention comprises a sulfobetaine zwitterionic surfactant which maintains the protein-protein bond present in the biological sample while it weakens the inter-lipid or lipid-protein bond and inhibits Only the membrane penetration protein can be selectively removed. Therefore, the homeostasis and antigenicity in the tissues to be analyzed are maintained, while the deformation or breakdown of the tissue due to changes in membrane protein or lipid is prevented.
이와 같이, 본 발명의 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제는 분석을 위해 처리하는 생물학적 분자, 예를 들어, 항체, 항체단편, 단백질, 다당류, RNA 및 DNA를 포함하는 핵산, 펩타이드 및 폴리펩타이드가, 분석대상인 생물학적 시료의 단백질이 제거된 막관통단백질 통로를 통해 두꺼운 조직 내 심부까지 신속하고 균일하게 침투할 수 있도록 함으로써, 생물학적 시료의 분석, 예를 들어, 면역화학염색과 같은 분석의 효율을 현저히 증가시키고 분석 시간 또한 효과적으로 단축시킬 수 있다.As described above, the sulfobetaine zwitterionic surfactant of the present invention can be produced by a method in which a nucleic acid, a peptide, By allowing the rapid penetration of the biological sample to be analyzed through the membrane-penetrating protein channel of the biological sample to be rapidly and uniformly penetrated into the deep tissue deep tissue, the analysis of the biological sample, for example, the efficiency of analysis such as immunochemical staining, And the analysis time can also be effectively shortened.
본 발명에서 사용할 수 있는 상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면 활성제는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 사용할 수 있다.The sulfobetaine zwitterionic surfactant usable in the present invention may be a compound represented by the following formula (1).
<화학식 1>≪
상기 식에서, R은 탄소 원자수 8 ~ 22개의 알킬기 또는 알케닐기이고, 상기 x는 0 ~ 3의 정수이며, 상기 y는 2 ~ 4의 정수이다.Wherein R is an alkyl or alkenyl group having 8 to 22 carbon atoms, x is an integer of 0 to 3, and y is an integer of 2 to 4.
구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 상기 설포베타인계 쯔비터이 온성 계면활성제로서 3-(N,N-Dimethylmyristylammonio)propanesulfonate; N- Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate; 3-(N,N-Specifically, in one embodiment of the present invention, 3- ( N , N- dimethylmyristylammonio) propanesulfonate as the sulfobetaine zwitterionic surfactant; N-Dodecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate; 3- (N, N-
Dimethylpalmitylammonio)propanesulfonate; 3-(N,N- Dimethyloctadecylammonio)propanesulfonate; 및 3-[(3- Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate을 사용하였다.Dimethylpalmitylammonio) propanesulfonate; 3- (N, N-Dimethyloctadecylammonio) propanesulfonate; And 3 - [(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate were used.
본 발명에 따른 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 이용한 생물학적 시료의 조직침투 방법은, (a) 생물학적 시료를 고정시키는 단계; (b) 선택적으로 그리고 필요에 따라, 상기 (a) 단계의 생물학적 시료를 세척하고 고정 용액을 제거하는 단계; (c) 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 상기 생물학적 시료에 처리하는 단계; (d) 상기 (c) 단계의 생물학적 시료를 세척하고 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 제거하는 단계; 및 (e) 상기 (d) 단계의 생물학적 시료에 항체, 항체단편, 단백질, 다당류, RNA 및 DNA를 포함하는 핵산, 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 가하는 단계를 포함한다.A method of infiltrating a biological sample using a sulfobetaine zwitterionic surfactant according to the present invention comprises the steps of: (a) immobilizing a biological sample; (b) optionally and optionally washing the biological sample of step (a) and removing the fixative solution; (c) treating the biological sample with a sulfobetaine zwitterionic surfactant; (d) washing the biological sample of step (c) and removing the sulfobetaine zwitterionic surfactant; And (e) adding a nucleic acid, a peptide or a polypeptide comprising an antibody, an antibody fragment, a protein, a polysaccharide, RNA and DNA to the biological sample of step (d).
상기 생물학적 시료의 고정은 분석하고자 하는 개체 유래의 생체 외로 분리된 조직 또는 기관을 알데하이드계 화합물이 함유된 용액에 침지하여 고정시킬 수 있으며, 상기 알데하이드계 화합물로는 이에 제한되지는 않으나, 파라포름알데히드 또는 글루타알데히드를 사용할 수 있다. 또한 상기 시료의 고정은 알데하이드계 화합물이 함유된 용액에 시료를 담근 후, 4℃ ~ 10℃의 온도에서 4시간 ~ 12시간 동안 고정시켜, 상기 시료에 존재하는 항원이 파괴 또는 유출되지 않게 보전하도록 한다. 이후 PBS (phosphate- buffered saline) 용액에 4시간 ~ 12시간 동안 넣어두어 고정 과정에 사용되지 않은 알데하이드계 화합물을 생물학적 시료로부터 제거한다.The immobilization of the biological sample may be performed by immersing the immobilized tissue or organ in vitro derived from the subject to be analyzed in a solution containing an aldehyde compound. The aldehyde compound may be, but not limited to, paraformaldehyde Or glutaraldehyde may be used. In addition, the immobilization of the sample is carried out by immersing the sample in a solution containing an aldehyde-based compound, and then fixing the immobilized sample at 4 ° C to 10 ° C for 4 hours to 12 hours so as to prevent the antigen present in the sample from destroying or leaking do. Subsequently, the solution is placed in a phosphate-buffered saline (PBS) solution for 4 hours to 12 hours to remove unused aldehyde-based compounds from the biological sample.
일반적으로, 고정과정을 거친 생물학적 시료는 시료 내에 지질로 이루어진 복잡한 구조의 존재로 인해 분석시료 또는 염색시료의 침투가 어렵다. 그러나 시료 내에 존재하는 지질을 모두 제거하기 되면 생물학적 시료의 단백질이 손상되거나 조직의 형태가 변형될 수 있어 분석 진행이 어렵다는 문제가 있다. 반면에, 본 발명의 계면활성제는 생물학적 시료에 존재하는 지질과 지질간의 결합 또는 지질-단백질간의 결합을 약화시켜 분석시료 또는 염색시료의 침투가 용이하도록 한다. 따라서, 생물학적 시료의 고정 단계 이후, 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 처리하는 것은 상기 생물학적 시료에 대한 생물학적 분자의 조직 침투성을 현저히 증가시킨다.In general, biological samples that have undergone a fixed process are difficult to penetrate analytical or stained samples due to the presence of complex structures of lipids in the sample. However, if all the lipids present in the sample are removed, the protein of the biological sample may be damaged or the morphology of the tissue may be deformed, which makes the analysis difficult. On the other hand, the surfactant of the present invention weakens the binding between the lipid and the lipid existing in the biological sample or the binding between the lipid and the protein, thereby facilitating the penetration of the analytical sample or the dye sample. Thus, after the immobilization step of the biological sample, treating the sulfobetaine zwitterionic surfactant significantly increases the tissue permeability of the biological molecule to the biological sample.
본 발명에 따른 상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제의 처리는, 증류수 또는 PBS (phosphate-buffered saline) 용액에 사용하고자 하는 상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제의 미셀임계농도 이상으로 첨가한 용액을 사용 할 수 있다. 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 미셀임계농도 미만으로 사용하게 되면 계면활성제에 의해 미셀이 형성되고 표면장력이 저하되는 문제점이 발생할 수 있기 때문에 생물학적 분자의 효과적인 침투를 위해서는 미셀임계농도 이상으로 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 첨가하여 사용하는 것이 바람직하다. The treatment of the sulfobetaine zwitterionic surfactant according to the present invention is carried out by adding a solution of the sulfobetaine zwitterionic surfactant added at a concentration not lower than the micelle concentration of the sulfobetaine zwitterionic surfactant to be used in distilled water or PBS (phosphate-buffered saline) Can be used. When the sulfobetaine surfactant is used at a concentration lower than the micelle threshold concentration, micelles may be formed by the surfactant and the surface tension may be lowered. Therefore, in order to effectively penetrate the biological molecules, It is preferable to use the surfactant in addition to the surfactant.
더욱 바람직하게는 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제가 고유의 값으로 갖고 있는 미셀임계농도 내지 50% (w/v)의 농도로 사용하는 것이 좋다. 이때, 50% (w/v)의 농도를 초과하여 사용하게 되면, 생물학적 시료 내의 항원성이 보존되지 않으며, 시료의 조직이 물러서 분석이 어려운 문제점이 있을 수 있다.More preferably, the sulfobetaine zwitterionic surfactant is used at a concentration of 50% (w / v), which is a critical value of the micelle having an intrinsic value. In this case, if the concentration exceeds 50% (w / v), the antigenicity in the biological sample can not be preserved, and the structure of the sample may be withdrawn and analysis may be difficult.
또한, 생물학적 시료에 더욱 효과적으로 설포베타인계 쯔비터 이온성 계면활성제를 처리하기 위해, 각 계면활성제가 고유값으로 갖고 있는 미셀임계 온도 이상에서 반응시키는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 미셀임계온도인 10℃에서 60℃의 온도 사이에서 반응시킨다. 보다 더 바람직하게는, 10℃ 에서 42℃의 온도에서 반응시킨다. 이때 60℃의 온도를 초과하여 반응시키게 되면, 단백질의 변성이 발생할 수 있는 문제점이 있으므로 상기 온도 범위 내에서 반응시키는 것이 바람직하다. In order to more effectively treat the sulfobetaine zwitterionic surfactant in the biological sample, it is preferable that the surfactant is reacted at a micelle critical temperature or more, which is an intrinsic value of each surfactant, more preferably at a micelle critical temperature of 10 Deg.] C to 60 [deg.] C. More preferably, the reaction is carried out at a temperature of from 10 캜 to 42 캜. In this case, if the reaction is performed at a temperature exceeding 60 캜, denaturation of the protein may occur. Therefore, it is preferable to perform the reaction within the above temperature range.
또한, 상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제가 함유된 용액의 생물학적 시료에 대한 처리는 4 ~ 200시간 동안 처리할 수 있다. 4시간 미만으로 처리하게 되면, 상기 계면활성제가 생물학적 시료에 존재하는 지질 등을 제대로 제거하지 못하는 문제점이 생기며, 200시간을 초과하여 처리하게 되면 상기 생물학적 시료의 형태가 변형될 수 있는 문제점이 생길 수 있다. 따라서 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제의 생물학적 시료에 대한 처리는 크기에 따라 다르며 4 ~ 200시간 동안, 더 바람직하게는 8시간 동안 처리할 수 있다. 물론 처리하고자 하는 생물학적 시료의 종류 및 크기에 따라 상기 처리시간은 더 연장되거나 줄어들 수 있음은 물론이다.In addition, the treatment of the biological sample with the solution containing the sulfobetaine zwitterionic surfactant can be performed for 4 to 200 hours. If the treatment is carried out for less than 4 hours, the surfactant does not properly remove the lipids present in the biological sample. If the treatment exceeds 200 hours, the biological specimen may be deformed have. Thus, the treatment of a biological sample of a sulfobetaine zwitterionic surfactant varies with size and can be processed for 4 to 200 hours, more preferably for 8 hours. Of course, the treatment time may be further extended or reduced depending on the type and size of the biological sample to be treated.
생물학적 시료에 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 처리함에 있어, 0 ~ 500 rpm의 속도를 갖는 롤링바틀 인큐베이터 (rolling bottle incubator), 같은 속도를 갖는 진탕기 배양기 (shaker incubator), 같은 속도와 30°~ 45°의 기울기 이동을 갖는 rocker 등의 교반기가 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이런 방법은 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제가 생물학적 시료 내에 존재하는 막관통단백질을 선택적으로 제거할 때, 각 계면활성제가 갖고 있는 미셀 임계농도와 온도의 분포가 반응하는 용액 안에서 균일하게 하는 효과를 갖는다.To treat the biological samples with a sulfobetaine zwitterionic surfactant, a rolling bottle incubator with a speed of 0 to 500 rpm, a shaker incubator with the same speed, and a 30 ° A stirrer such as a rocker having a tilt movement of about 45 [deg.] May be used, but the present invention is not limited thereto. In this method, when the sulfobetaine-zwitterionic surfactant selectively removes the membrane-penetrating protein present in the biological sample, the effect of homogeneity in the solution in which the micelle critical concentration and temperature distribution of each surfactant are reacted .
다음으로, 생물학적 시료를 세척하고 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 제거하는 단계를 수행한다. 상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제의 제거는 상기 계면활성제가 처리된 생물학적 시료로부터 상기 계면활성제의 농도를 감소 또는 제거하는 것을 의미하는 것으로, 상기 계면활성제가 처리된 생물학적 시료를 증류수 또는 PBS (phosphate-buffered saline) 버퍼에 첨가하여 시료에 존재하는 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제의 농도를 미셀임계농도 이하로 낮추도록 하였다. 또한, 상기 계면활성제의 효과적인 제거를 위해 교반기상에서 30°~ 45°의 기울기 및 10 ~ 500 rpm의 속도로 기울기 이동 (tilt movement) 방법을 통해 생물학적 시료에 처리된 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 임계미셀농도 이하로 낮춰 상기 계면활성제의 활성 또는 작용을 정지시킨다. 다음 과정으로, 생물학적 시료에 항체 등의 생물학적 분자를 가하여 생체조직 내로 생물학적 분자를 침투시킨다. Next, the biological sample is washed and a step of removing the sulfobetaine zwitterionic surfactant is performed. Removal of the sulfobetaine zwitterionic surfactant means reducing or eliminating the concentration of the surfactant from the biological sample treated with the surfactant, wherein the surfactant-treated biological sample is dissolved in distilled water or PBS -buffered saline buffer to reduce the concentration of the sulfobetaine zwitterionic surfactant present in the sample to below the micelle critical concentration. Also, for the effective removal of the surfactant, a sulfobetaine zwitterionic surfactant, which was treated on a biological sample through a tilt movement method at a slope of 30 ° to 45 ° and a speed of 10 to 500 rpm on a stirrer, The concentration of the surfactant is lowered to below the critical micelle concentration to stop the activity or action of the surfactant. In the next step, a biological molecule such as an antibody is added to a biological sample to infiltrate the biological molecule into living tissue.
본 발명의 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 포함하는 조성물은 생물학적 분자를 생체조직에 효과적으로 침투시킬 수 있으므로, 생체조직을 포함하는 생물학적 시료 내의 분석하고자 하는 성분 (항원 또는 물질 등)에 특이적인 항체 또는 염색시료를 첨가하여 반응시킴에 의한 면역화학염색에 이용될 수 있다. 본 발명의 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 포함하는 조성물을 이용하여 생물학적 시료의 면역화학염색을 수행하는 방법은 다음을 포함한다: (a) 생물학적 시료를 고정시키는 단계; (b) 선택적이고 그리고 필요에 따라, 상기 (a) 단계의 생물학적 시료를 세척하고 고정 용액을 제거하는 단계; (c) 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 상기 생물학적 시료에 처리하는 단계; (d) 상기 (c) 단계의 생물학적 시료를 세척하고 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 제거하는 단계; (e) 상기 (d) 단계의 생물학적 시료에 항체, 항체단편, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 가하는 단계; (f) 상기 (e) 단계의 생물학적 시료를 세척하고 반응하지 않은 항체를 제거하는 단계; 및 (g) 상기 면역염색이 완료된 생물학적 시료를 투명화하는 단계. 상기 방법을 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.Since the composition containing the sulfobetaine zwitterionic surfactant of the present invention can effectively penetrate biological tissues into biological tissues, it is possible to provide an antibody specific to a component (antigen or substance) to be analyzed in a biological sample containing biological tissue Or by adding a dye sample to the reaction mixture. Methods of performing immunochemical staining of a biological sample using a composition comprising a sulfobetaine zwitterionic surfactant of the present invention include: (a) immobilizing a biological sample; (b) optionally washing the biological sample of step (a) and removing the fixative solution as needed; (c) treating the biological sample with a sulfobetaine zwitterionic surfactant; (d) washing the biological sample of step (c) and removing the sulfobetaine zwitterionic surfactant; (e) adding an antibody, antibody fragment, peptide, polypeptide or protein to the biological sample of step (d); (f) washing the biological sample of step (e) and removing unreacted antibody; And (g) visualizing the immunologically stained biological sample. The above method will be described in more detail.
상기 생물학적 시료에 항체를 처리하는 경우, 상기 생물학적 시료에 존재하는 항원 특이적인 항체를 첨가할 수 있고, 용이한 검출을 위해 형광물질 등 프로브 (probe)가 결합한 항체를 사용할 수도 있다. 또한, 상기 항체는 희석하여 사용할 수 있으며, 항체 희석을 위한 용매로는 인산염, 붕산나트륨 및 소혈청 알부민이 함유된 완충용액을 사용할 수 있으나,이에 제한되는 것은 아니다. 또한 상기 항체 희석용 완충용액에 추가적으로 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 미셀임계농도 이상의 농도로 첨가하여 사용할 수 있다.When the antibody is treated with the biological sample, an antigen-specific antibody present in the biological sample may be added, and an antibody conjugated with a probe such as a fluorescent substance may be used for easy detection. In addition, the antibody may be used by dilution. As the solvent for diluting the antibody, a buffer solution containing phosphate, sodium borate and bovine serum albumin may be used, but the present invention is not limited thereto. In addition to the buffer solution for diluting the antibody, a sulfobetaine zwitterionic surfactant may be added at a concentration above the micelle critical concentration.
다음 단계로, 상기 면역염색이 완료된 생물학적 시료를 투명화시킨다. 상기 투명화 과정은 염색된 생물학적 시료를 관찰 가능하도록, 조직 깊이를 확보하기 위한 과정으로, 상기 면역화학염색이 완료된 생물학적 시료를 BABB, 3DISCO 등을 포함하는 용매 기반의 투명화 과정을 수행할 수 있고, 또는 SeeDB, ClearT 등을 포함하는 용액에 조직을 넣는 단순 방법을 통한 투명화 과정을 수행할 수 있으며, 또 다른 방법으로 Scale 또는 CUBIC 등을 포함하는 과수화 투명화 방법을 수행할 수 있고, 또는 CLARITY이나 PACT 등을 포함하는 하이드로겔 임베딩 기반의 투명화 방법 등을 사용할 수 있다. 또한 상기 투명화 과정에 사용되는 완충용액에 추가적으로 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 상기 계면활성제의 미셀임계농도 이상의 농도로 첨가하여 사용할 수 있다. 또한 상기 본 발명에 따른 투명화 단계는 생물학적 시료를 항체와 반응시켜 면역염색하는 과정 이전에 수행할 수도 있다. In the next step, the immuno-stained biological sample is made transparent. The transparency process is a process for securing the tissue depth so that the dyed biological sample can be observed. The biological sample that has undergone immunochemical staining can be subjected to a solvent-based inversion process including BABB, 3DISCO, or the like, SeeDB, ClearT, and others. In addition, it is possible to carry out a transparency process by a simple method of putting the tissue into a solution including the solution, SeeDB, ClearT, etc. Alternatively, a hydralization transparency method including Scale or CUBIC can be performed, A hydrogels embedding-based transparency method, etc. In addition to the buffer solution used in the vitrification process, a sulfobetaine zwitterionic surfactant may be added at a concentration above the micelle critical concentration of the surfactant. In addition, the transparency step according to the present invention may be performed before the immunological staining by reacting the biological sample with the antibody.
이와 같이, 본 발명은 상기 본 발명의 설포베타인계 쯔비터이온성 계면 활성제를 유효성분으로 포함하는, 면역화학염색용 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 상기 조성물에는 본 발명의 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제 이외에도 생물학적 시료의 보전성 또는 염색시료 침투성 증진을 위한 별도의 첨가제를 더 포함할 수 있다. Thus, the present invention provides a composition for immunochemical staining comprising the sulfobetaine zwitterionic surfactant of the present invention as an active ingredient. In addition to the sulfobetaine zwitterionic surfactant of the present invention, the composition according to the present invention may further include additional additives for enhancing the integrity of the biological sample or enhancing the permeability of the dye sample.
이상, 본 발명에서 제공하는 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 이용한 생물학적 시료의 면역화학염색 방법은, 생물학적 시료 내에 존재하는 막 관통단백질을 선택적으로 제거할 수 있어 면역화학염색 시, 항체 또는 고분자 물질 등과 같은 분석시약이 상기 생물학적 시료 내로 빠르게 물리적 확산이 될 수 있도록 하여, 신속하게 시료 염색이 가능하며 두꺼운 두께의 시료도 면역화학염색이 가능하다. 특히 70 ㎛ 이상의 두께의 시료 분석도 가능할 뿐만 아니라 수 mm 이상의 두께를 갖는 시료의 분석도 가능하다. 또한, 본 발명에 따른 면역화학 염색방법은 생물학적 시료에 존재하는 항원성을 그대로 유지할 수 있으며, 상기 시료가 물러지는 변형을 발생시키지 않을 뿐만 아니라 안정하고 오랫동안 생물학적 시료를 보존하는 효과가 있다. As described above, the immunochemical staining method of a biological sample using the sulfobetaine zwitterionic surfactant provided in the present invention can selectively remove the membrane-penetrating protein present in a biological sample. Thus, in immunochemical staining, an antibody or a polymer substance And the like can be rapidly diffused into the biological sample, so that the sample can be rapidly dyed and a thick sample can be immunochemically stained. Especially, it is possible to analyze a sample having a thickness of not less than 70 탆, and also to analyze a sample having a thickness of several mm or more. In addition, the immunochemical staining method according to the present invention can maintain the antigenicity of the biological sample as it is, not only does not cause deformation of the sample, but also has the effect of stably and for a long time preserving the biological sample.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It will be apparent to those skilled in the art that these embodiments are merely illustrative of the present invention and that the scope of the present invention is not limited to these embodiments.
실시예Example 1: One: 설포베타인계Sulfobetainate 쯔비터이온성Zwitterion 계면활성제인 SB3-14 (3-( The surfactant SB3-14 (3- ( NN ,, NN -Dimethylmyristylammonio)propanesulfonate)을 이용한 뇌절편 조직의 염색-Dimethylmyristylammonio) propanesulfonate) for staining of brain slices
생쥐의 뇌 (8.2 mm x 12.5 mm x 6.0 mm, mouse brain (P1), 한국뇌연구원)를 4% 파라포름알데하이드 용액에 12시간 동안 4℃에서 두었다. 다음, 정화된 뇌를 PBS (phosphate-buffered saline pH7.4, Thermo Fisher Scientific, USA) 용액에 12시간 동안 넣어 파라포름알데히드를 세척하였다. 고정화된 뇌를 PBS 중 30% sucrose (sucrose, Sigma Aldrich, USA) 용액에 넣어 가라앉을 때까지 두었다. 가라앉은 뇌를 동결시킨 후에 100 ㎛ 두께로 절단하였다. 100 ㎛ 뇌조직 절편을 하기 화학식으로 표시되는 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제중 하나인 SB3-14 (3-(N,N-Dimethylmyristylammonio)propanesulfonate, Sigma Aldrich, USA)를 4%의 농도로 PBS 용액에 첨가하고 4시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 다음, PBS 용액에 12 시간 동안 담가두어 세척하였다. 1차 항체인 Pan Neuronal Marker (0.5mg/mL,EMD Millipore, USA)를 8시간 동안 반응시키고, 이어서 2차 항체인 Alexa flour 594 (0.5mg/mL, Molecular probes, USA)를 2시간 동안 반응시켜 확산방법을 통해 면역 화학 염색을 수행하였다. 각 면역화학염색동안, 항체와 블로킹 용액을 1:300 으로 혼합하였다. 블로킹 용액은 PBS 용액 중 10% BSA (Bovine Serum Albumins, Sigma Aldrich, USA), 0.2% Triton X-100 (Triton X-100, Sigma Aldrich, USA), 0.001% Sodium azide (Sodium azide, Sigma Aldrich, USA)를 포함하였다. 면역염색 후 염색시간과 동일하게 PBS 용액에 넣어두어 반응하지 않은 항체를 제거하였다. 다음, 공초점 현미경 (A1, Nikon, Japan)을 이용해 10 μm 단위로 염색된 뇌조직 절편을 관찰하였다.Mouse brain (8.2 mm x 12.5 mm x 6.0 mm, mouse brain (P1), Korea Brain Research Institute) was placed in 4% paraformaldehyde solution for 12 hours at 4 ° C. Next, the purified brain was washed in PBS (phosphate-buffered saline pH 7.4, Thermo Fisher Scientific, USA) for 12 hours to remove paraformaldehyde. Immobilized brains were placed in 30% sucrose (sucrose, Sigma Aldrich, USA) in PBS until they subsided. The sunken brain was frozen and cut to a thickness of 100 μm. 100 쨉 m brain tissue sections were treated with PBS solution (PBS concentration: 4%) at a concentration of 4%, SB3-14 (3- ( N , N- dimethylmyristylammonio) propanesulfonate, Sigma Aldrich, USA), one of the sulfobetaine zwitterionic surfactants represented by the following formula And reacted at 37 ° C for 4 hours. Then, it was immersed in a PBS solution for 12 hours. (0.5 mg / mL, EMD Millipore, USA) was reacted for 8 hours with a primary antibody, Pan Neuronal Marker (0.5 mg / mL, Molecular Probes, USA) Immunohistochemical staining was performed by diffusion method. During each immunochemical staining, the antibody and blocking solution were mixed at 1: 300. The blocking solution was diluted with 10% BSA (Bovine Serum Albumins, Sigma Aldrich, USA), 0.2% Triton X-100 (Triton X-100, Sigma Aldrich, USA), 0.001% Sodium azide ). After immune staining, unreacted antibodies were removed by placing them in PBS solution at the same time as staining time. Next, brain tissue sections stained with a confocal microscope (A1, Nikon, Japan) were observed in 10 μm increments.
<화학식>≪
비교예Comparative Example 1 One
상기 실시예 1에서 SB3-14를 첨가하지 않은 것을 제외하고는, 동일한 방법으로 면역화학염색을 수행하였다. Immunohistochemical staining was carried out in the same manner except that SB3-14 was not added in Example 1 above.
비교예Comparative Example 2 2
상기 실시예 1에서 SB3-14 대신 유이온 계면활성제인 4% 도데실 황산나트륨 (Sodium Dodecyl Sulfate, Sigma Aldrich, USA)를 처리한 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 분석하였다.The procedure of Example 1 was repeated except that 4% sodium dodecyl sulfate (Sigma Aldrich, USA) was used instead of SB3-14 in Example 1.
실험예Experimental Example 1: One: 설포베타인계Sulfobetainate 쯔비터이온성Zwitterion 계면활성제를 이용한 면역화학염색 분석결과 Immunochemical staining analysis using surfactant
상기 실시예 1, 비교예 1 및 비교예 2의 방법으로 염색된 생쥐의 뇌 조직 절편을 현미경으로 관찰한 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 실시예 1와 비교예 2의 경우 면역염색 신호의 강도가 비교예 1에 비해 더 우수한 발색을 나타내는 것을 확인하였다. 또한, 유의한 신호강도를 보이는 조직의 깊이 또한, 비교예 1은 30 ㎛, 실시예 1은 70 ㎛ 이상임을 알 수 있었고, 뇌조직 절편의 깊이를 Z축 기준으로 볼 때, 실시예 1은 비교예들에 비해 염색된 깊이와 효과가 더 우수한 것이 확인되었다(도 5 참조).As a result of microscopic observation of the brain tissue sections of the mice stained by the method of Example 1, Comparative Example 1 and Comparative Example 2, the intensity of the immunostaining signal in Example 1 and Comparative Example 2, as shown in FIG. 2, Was found to exhibit better coloring as compared with Comparative Example 1. In addition, it was also found that the depth of the tissue showing significant signal intensity was 30 탆 for Comparative Example 1 and 70 탆 or greater for Example 1. When the depth of the brain tissue segment was taken as the Z axis, It was confirmed that the dyed depth and effect were superior to the examples (see Fig. 5).
실시예Example 2: 2: 설포베타인계Sulfobetainate 쯔비터이온성Zwitterion 계면활성제인 SB3-14 (3-( The surfactant SB3-14 (3- ( NN ,, NN -Dimethylmyristylammonio)propanesulfonate) 처리 시간별 뇌조직 염색수행-Dimethylmyristylammonio) propanesulfonate) Treatment of brain tissue by time
100 ㎛ 두께의 생쥐 뇌 조직 절편을 SB3-14를 4% 농도로 하여 37℃의 온도에서 처리하였다. SB3-14 처리 후, 시간별 (1시간, 2시간, 4시간, 8시 간) 뇌조직 절편을 현미경 (SMZ745T, Nikon, Japan)을 이용해 관찰하였다. 계면활성제 처리를 통한 뇌조직 염색법은 상기 실시예 1과 동일하게 수행하되, 처리 시간을 달리하여 관찰하였다. 또한 분석과정에서 동일한 조직을 시간에 따라서 관찰하기 때문에, 시간에 따른 관찰 광학적 특성이 다를 수 있음을 고려하여 비교를 위해 2.5 ㎜ × 2.5 ㎜의 모눈종이 바탕 위에서 관찰하였다.Mouse brain tissue sections of 100 쨉 m thickness were treated with SB3-14 at a concentration of 4% at a temperature of 37 째 C. After SB3-14 treatment, the sections of brain tissue were observed with time (1 hour, 2 hours, 4 hours, 8 hours) using a microscope (SMZ745T, Nikon, Japan). The brain tissue staining method using the surfactant treatment was carried out in the same manner as in Example 1, except that the treatment time was different. In order to compare the observed optical characteristics over time, we observed 2.5 mm x 2.5 mm grid paper for comparison, because the same tissues were observed over time in the analysis process.
비교예Comparative Example 3 3
상기 실시예 2에서 SB3-14를 첨가하지 않은 것을 제외하고는, 동일한 방법으로 면역화학 염색을 수행하였다.Immunohistochemical staining was carried out in the same manner as in Example 2, except that SB3-14 was not added.
비교예Comparative Example 4 4
상기 실시예 2에서 SB3-14 대신 유이온 계면활성제인 4% 도데실 황산 나트륨 (Sodium Dodecyl Sulfate, Sigma Aldrich, USA)를 처리한 것을 제외하고, 실시예 2와 동일한 방법으로 분석하였다.Except that 4% sodium dodecyl sulfate (Sigma Aldrich, USA), which is an ionic surfactant, was used instead of SB3-14 in Example 2. The results are shown in Table 1 below.
실험예Experimental Example 2: 2: 설포베타인계Sulfobetainate 쯔비터이온성Zwitterion 계면활성제 처리 시간에 따른 면역화학염색 분석결과 Immunochemical staining analysis with surfactant treatment time
상기 실시예 2, 비교예 3 및 비교예 4의 방법으로 염색된 뇌조직 절편을 분석하였다. 그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 계면활성제 처리 시간이 경과할수록 실시예 2의 조직 또는 생체시료의 안전성이 다른 비교예들에 비해 우수한 것으로 나타났다. 또한, 투과되어 확인되는 눈금도 계면활성제 처리 시간이 경과되어도 눈금이 변형되지 않고 있다는 것을 볼 때, 분석하고자 하는 조직의 표면이나 두께에 거의 변화가 없다는 것을 알 수 있었다. 반면, 유이온 계면활성제인 SDS를 처리한 군 (비교예 4)의 경우, 점점 조직의 크기가 커지는 것으로 나타났고, 시간이 지날수록 눈금이 왜곡되어 보이는 것으로 나타나, 설포베타인계 쯔비터이온성 계면 활성제가 아닌 다른 계면활성제를 사용할 경우, 조직의 표면과 두께에 변화를 초래 하는 문제점이 생길 수 있음을 확인하였다.The sections of brain tissue stained with the method of Example 2, Comparative Example 3 and Comparative Example 4 were analyzed. As a result, as shown in FIG. 3, the stability of the tissue or biological sample of Example 2 was superior to the other comparative examples as the surfactant treatment time elapsed. In addition, it can be seen that there is almost no change in the surface or thickness of the tissue to be analyzed when it is seen that the scale is not deformed even after the time of the surfactant treatment has elapsed. On the other hand, in the case of the group treated with the oil-ion surfactant SDS (Comparative Example 4), the size of the tissue gradually increased, and as time went by, the scale became distorted, and the sulfobetaine zwitterionic surfactant , It is confirmed that there is a problem in that the surface and the thickness of the tissue are changed when the surfactant other than the surfactant is used.
실시예Example 3: 3: 설포베타인계Sulfobetainate 쯔비터이온성Zwitterion 계면활성제인 SB3-14 (3-( The surfactant SB3-14 (3- ( NN ,, NN -Dimethylmyristylammonio)propanesulfonate)의 처리 농도별 뇌조직 염색수행-Dimethylmyristylammonio) propanesulfonate) in brain tissue
100 ㎛ 뇌조직 절편을 SB3-14를 4시간 동안 37℃에서 처리하여 면역 화학염색을 수행하였다. 상기 SB3-14 계면활성제를 각각 10%, 20% 및 50% 농도로 하여 뇌조직 절편을 염색한 후, 현미경 (SMZ745T, Nikon, Japan)으로 관찰하였다. 분석 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 미셀임계농도를 초과하여 고농도 (50%)로 처리하더라도 조직의 표면이나 투과성에 거의 변화가 없는 것으로 나타났다. 또한, 도 3과 마찬가지로 시간이 지난 후에도 눈금이 변형되지 않고, 눈금에 따른 조직의 크기 또한 변형되지 않았다. 이러한 결과는 본 발명의 설포베타인계 쯔위터이온성 계면활성제를 조직 염색에 사용하는 경우, 생체 조직이나 생물학적 시료에 변화가 유발되지 않고 항원성이 잘 보존되는 것을 뒷받침한다. 100 쨉 m brain tissue sections were treated with SB3-14 at 37 째 C for 4 hours to perform immunochemical staining. Brain tissue sections were stained with SB3-14 surfactant at concentrations of 10%, 20%, and 50%, respectively, and then observed with a microscope (SMZ745T, Nikon, Japan). As a result of the analysis, as shown in FIG. 4, even when treated at a high concentration (50%) in excess of the micelle critical concentration, the surface and permeability of the tissue were almost unchanged. Also, as in Fig. 3, the scale was not deformed even after a lapse of time, and the size of the tissue along the scale was not changed. These results support that when the sulfobetaine-based surfactant of the present invention is used for tissue staining, the antigenicity is well preserved without causing changes in the biotissue or biological sample.
실시예Example 4: 다양한 종류의 4: Various kinds of 설포베타인계Sulfobetainate 쯔비터이온성Zwitterion 계면활성제를 이용한 뇌조직 염색 수행 Perform brain tissue staining using surfactant
100 ㎛ 두께를 가진 생쥐 뇌조직 절편을 다양한 설포베타인계 쯔위터 이온성 계면활성제를 이용하여 4% 농도로 37℃에서 4시간 처리하여 면역화학염색을 수행하였다. 이때 사용한 설포베타인계 쯔위터이온성 계면활성제는 SB3-12 (N- Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate, Sigma aldrich, USA), SB3-16 (3-(N,N-Dimethylpalmitylammonio)propanesulfonate, Sigma aldrich, USA), SB3-18 (3-(N,N-Dimethyloctadecylammonio)propanesulfonate, Sigma aldrich, USA), CHAPS (3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate, Sigma aldrich, USA)을 사용하였다. 상기 계면활성제들을 각각 처리하여 반응이 완료된 후, 세척하고 1차 항체 Pan Neuronal Marker (0.5 ㎎/㎖, EMD Millipore, USA)를 8시 간 동안 처리하여 반응시킨 다음, 2차 항체 Alexa flour 594 (0.5mg/mL, Molecular probes, USA)를 2시간 동안 처리하고 확산 방법을 통해 면역화학 염색을 수행하였 다. 다음 공초점 현미경 (A1, Nikon, Japan)을 이용해 10 ㎛ 단위로 측정하였다. 분석 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 상기 실험에서 사용한 설포베타인계 쯔위터이온성 계면활성제 처리군은 염색의 강도가 우수한 발색을 나타내는 것으로 나타났다. 또한, 유의한 신호의 강도가 보이는 조직의 깊이 또한, 70 ㎛ 이상이 됨을 알 수 있었다.Mouse brain tissue sections with a thickness of 100 쨉 m were treated with various sulfobetaine zwitterionic surfactants at 4% concentration for 4 hours at 37 ° C for immunochemical staining. (N-dodecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate, Sigma aldrich, USA), SB3-16 (3-Cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate, Sigma aldrich, Sigma Aldrich, USA), CHAPS (Sigma Aldrich, USA) , USA) was used. After the reaction was completed, each of the above surfactants was washed and then washed and reacted with a primary antibody Pan Neuronal Marker (0.5 mg / ml, EMD Millipore, USA) for 8 hours, and then reacted with a secondary antibody Alexa flour 594 mg / mL, Molecular probes, USA) for 2 hours and immunochemically stained by diffusion method. The following confocal microscope (A1, Nikon, Japan) was used to measure in 10 μm increments. As a result of the analysis, as shown in FIG. 5, the group treated with the sulfobetaine-based surfactant used in the above experiment exhibited excellent dyeing strength. Also, it was found that the depth of the tissue in which the significant signal intensity is visible is more than 70 μm.
실시예Example 5: 5: 설포베타인계Sulfobetainate 쯔비터이온성Zwitterion 계면활성제인 SB3-14 (3-( The surfactant SB3-14 (3- ( NN ,, NN -Dimethylmyristylammonio)propanesulfonate)을 이용한 뇌조직의 염색-Dimethylmyristylammonio) propanesulfonate) for brain tissue staining
생쥐의 뇌 (8.2 mm x 12.5 mm x 6.0 mm, mouse brain (P1), 한국뇌연구원)를 4% 파라포름알데하이드에 12시간 동안 4℃에서 두었다. 다음 고정화된 뇌를 PBS 용액에 12시간 동안 상온에 넣어 파라포름알데히드를 세척하였다. 고정화 과정을 거친 뇌조직을 SB3-14 (3-(N,N-Dimethylmyristylammonio propanesulfonate, Sigma Aldrich, USA)를 4%의 농도로 포함하는 PBS 용액에 넣고 12시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 이때, 100 rpm의 속도와 37℃ 온도를 갖는 롤링바틀 인큐베이터를 이용하여 상기 뇌조직에 설포베타인계 쯔비터 이온성 계면활성제를 처리하였다. 다음,상기 뇌조직을 PBS 용액에 12시간 동안 담가두고 세척하였다. 30°의 기울기와 100 rpm의 속도의 기울기 운동을 갖는 락커 (rocker) 상에서 세척을 수행 하였다. 이후 뇌조직에 대한 면역항체 염색반응을 위해, Alexa Fluor 488이 결합된 Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody (0.5 ㎖/mg, abcam, USA)를 8시간 동안 자연 확산방법을 통해 적용하여 면역화학염색을 수행하였다. 항체는 상기 실시예 1에서 사용한 블로킹 용액과 1:200으로 혼합하여 사용하였다. 면역염색 후, 염색시간과 동일하게 PBS 용액에 넣어두어 반응하지 않은 항체를 제거하였다. 면역화학염색 반응과 세척은 100 rpm 및 37℃의 온도를 갖는 진탕 배양기에 넣어 처리하였다. 면역염색화학반응이 종료된 뇌조직을 투명화 처리를 하였으며, 투명화는 과수화 투명화 방법을 사용하였다. 50% 수크로스와 25% 우레아를 포함한 PBS 용액에 상온에서 24시간 동안 뇌조직을 넣어두었으며, 뇌조직을 투명화 용액에 넣은 후, 30°의 기울기와 100 rpm 속도의 기울기 운동을 갖는 락커를 이용 하여 수행하였다. 다음, 빛 시트 현미경 (UltraMicroscopeⅡ, LaVision BioTec, German)을 이용해 관찰하였다. 그 결과, 면역염색화학반응에 사용된 Tyrosine Hydroxylase 항체는 뇌조직 표면으로부터 수 mm 떨어진 심부 뇌에 존재하는 도파민성 신경세포까지 염색할 수 있음을 확인하였다 (도 6 참조).Mouse brain (8.2 mm x 12.5 mm x 6.0 mm, mouse brain (P1), Korean Brain Research Institute) was placed in 4% paraformaldehyde for 12 hours at 4 ° C. The immobilized brain was then immersed in PBS solution for 12 hours at room temperature to wash paraformaldehyde. Brain tissues immobilized were immersed in a PBS solution containing 4% SB3-14 (3- ( N , N- dimethylmyristylammonio propanesulfonate, Sigma Aldrich, USA) at a concentration of 4% The brain tissue was treated with a sulfobetaine zwitterionic surfactant using a Rolling Botttle incubator with a speed of rpm and a temperature of 37 ° C. The brain tissue was then immersed in a PBS solution for 12 hours, Tyrosine hydroxylase (Alexa Fluor 488) conjugated anti-tyrosine hydroxylase antibody (0.5 ml / well) was used for immunoblotting of the brain tissues, followed by washing on a rocker with a slope of 100 rpm and a slope of 100 rpm. mg, abcam, USA) was applied for 8 hours through a natural diffusion method to perform immunochemical staining. The antibody was mixed with the blocking solution used in Example 1 at a ratio of 1: 200. After immunostaining, Immunohistochemical staining and washing were carried out in a shaking incubator at a temperature of 100 rpm and 37 ° C. Immunohistochemical staining was performed in the brain tissue The brain tissue was placed in a PBS solution containing 50% sucrose and 25% urea for 24 hours at room temperature, and the brain tissue was placed in a transparent solution. Then, (LaVision BioTec, German). The results showed that the tyrosine hydroxylase used in the immuno-staining chemistry reaction The antibody was found to be able to stain dopaminergic neurons present in the deep brain several millimeters from the surface of the brain tissue (see FIG. 6).
이러한 결과를 통해 본 발명자들은 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 포함하는 조성물이 생물학적 시료 내로 항체 등의 생물학적 분자를 침투시키는데 이용할 경우, 분석대상의 생물학적 시료를 안정적으로 유지할 수 있는 효과를 얻을 수 있는 동시에, 염색시료를 신속하고 균일하게 심부까지 상기 시료 내로 침투시킬 수 있음을 확인하였다. From these results, the present inventors have found that the sulfobetaine Zwitterion When a composition containing a surfactant is used to infiltrate a biological molecule such as an antibody into a biological sample, it is possible to stably maintain the biological sample to be analyzed, and at the same time, the dye sample can be rapidly and uniformly dispersed As shown in Fig.
본 발명에 대하여 상기 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.The present invention has been described with reference to the above embodiments. It will be understood by those skilled in the art that various changes in form and details may be made therein without departing from the spirit and scope of the invention as defined by the appended claims. Therefore, the disclosed embodiments should be considered in an illustrative rather than a restrictive sense. The scope of the present invention is defined by the appended claims rather than by the foregoing description, and all differences within the scope of equivalents thereof should be construed as being included in the present invention.
Claims (25)
(a) 생물학적 시료를 고정용액으로 고정시키고;
(b) 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 상기 (a)의 생물학적 시료에 처리하며;
(c) 상기 (b)의 생물학적 시료에 생물학적 분자를 가하는 것을 포함하고,
상기 생물학적 시료는 생체 외 분리된 조직 (tissues), 기관 (organ) 또는 이것의 일부이며, 상기 생물학적 분자는 항체, 항체단편, 단백질, 다당류, RNA 또는 DNA를 포함하는 핵산, 펩타이드 및 폴리펩타이드로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 것인,
생물학적 분자를 생물학적 시료의 조직 내로 침투시키는 방법.A method of infiltrating a biological molecule into the tissue of a biological sample,
(a) fixing the biological sample with a fixative solution;
(b) treating the biological sample of (a) with a sulfobetaine zwitterionic surfactant;
(c) adding a biological molecule to the biological sample of (b)
The biological sample is an in vitro separated tissues, an organ or a part thereof and the biological molecule is composed of a nucleic acid, a peptide and a polypeptide comprising an antibody, an antibody fragment, a protein, a polysaccharide, RNA or DNA ≪ / RTI >
A method of infiltrating a biological molecule into the tissue of a biological sample.
상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제는 하기 화학식 1로 표시되는 것인, 생물학적 분자를 생물학적 시료의 조직 내로 침투시키는 방법:
<화학식 1>
상기 식에서, R은 탄소 원자수 8 ~ 22개의 알킬기 또는 알케닐기이고, 상기 x 는 0 ~ 3의 정수이며, 상기 y는 2 ~ 4의 정수이다.The method according to claim 1,
Wherein the sulfobetaine zwitterionic surfactant is represented by the following formula (1): a method of infiltrating a biological molecule into a tissue of a biological sample;
≪ Formula 1 >
Wherein R is an alkyl or alkenyl group having 8 to 22 carbon atoms, x is an integer of 0 to 3, and y is an integer of 2 to 4.
상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제는 Dimethylethylammoniumpropane sulfonate; N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-
propanesulfonate; Sodium 3,3′-[(1,2-diphenylethene-1,2-diyl)bis(4,1- phenylene)]bis(oxy)bis(propane-1-sulfonate); 3-(4-Heptyl)phenyl-3- hydroxypropyl)dimethylammoniopropanesulfonate; 3-(Decyldimethylammonio) propanesulfonate; 3-[Dimethyl-(2-hydroxyethyl)ammonio]-1-propanesulfonate; 3-(1-Methylpiperidinio)-1-propanesulfonate; 3-(Triphenylphosphonio)propane-1- sulfonate; 3-(Di-tert-butylphosphonium)propane sulfonate; 3-(N,N- Dimethylpalmitylammonio)propanesulfonate; 3-[N,N-Dimethyl(3- myristoylaminopropyl)ammonio]propanesulfonate; 3-(N,N-
Dimethylmyristylammonio)propanesulfonate; 3-(N,N-Dimethyloctadecylammonio)propanesulfonate; 3-([3-Cholamidopropyl]dimethylammonio)-2-hydroxy-1-propanesulfonate; 및 3-[(3- Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것인, 생물학적 분자를 생물학적 시료의 조직 내로 침투시키는 방법. 3. The method of claim 2,
The sulfobetaine zwitterionic surfactant is selected from the group consisting of dimethylethylammoniumpropane sulfonate; N-Dodecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-
propanesulfonate; Sodium 3,3 '- [(1,2-diphenylethene-1,2-diyl) bis (4,1-phenylene)] bis (oxy) bis (propane-1-sulfonate); 3- (4-Heptyl) phenyl-3-hydroxypropyl) dimethylammoniopropanesulfonate; 3- (Decyldimethylammonio) propanesulfonate; 3- [Dimethyl- (2-hydroxyethyl) ammonio] -1-propanesulfonate; 3- (1-Methylpiperidinio) -1-propanesulfonate; 3- (Triphenylphosphonio) propane-1-sulfonate; 3- (Di-tert-butylphosphonium) propane sulfonate; 3- (N, N-Dimethylpalmitylammonio) propanesulfonate; 3- [N, N-Dimethyl (3-myristoylaminopropyl) ammonio] propanesulfonate; 3- ( N , N -
Dimethylmyristylammonio) propanesulfonate; 3- (N, N-Dimethyloctadecylammonio) propanesulfonate; 3 - ([3-Cholamidopropyl] dimethylammonio) -2-hydroxy-1-propanesulfonate; And 3 - [(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate. 2. A method for infiltrating a biological molecule into a tissue of a biological sample.
상기 (c)의 생물학적 시료에 생물학적 분자를 가하는 것이, (b)의 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 상기 생물학적 시료에 처리하는 것과 동시에 수행되거나 그 이전에 수행되는 것인, 생물학적 분자를 생물학적 시료의 조직 내로 침투시키는 방법. 4. The method according to any one of claims 1 to 3,
Wherein the step of adding a biological molecule to the biological sample of (c) is performed simultaneously with or prior to the treatment of the biological sample with the sulfobetaine zwitterionic surfactant of (b) Into the tissue of the subject.
상기 고정용액은 알데하이드계 화합물을 포함하는 것인, 생물학적 분자를 생물학적 시료의 조직 내로 침투시키는 방법. 4. The method according to any one of claims 1 to 3,
Wherein the fixation solution comprises an aldehyde-based compound.
상기 생물학적 시료는 두께가 0.1 mm 이상인 것인, 생물학적 분자를 생물학적 시료의 조직 내로 침투시키는 방법. 4. The method according to any one of claims 1 to 3,
Wherein the biological sample has a thickness of at least 0.1 mm, wherein the biological molecule is penetrated into the tissue of the biological sample.
상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 각 계면활성제가 고유의 값으로 갖고 있는 미셀임계농도 이상의 농도로 1시간 ~ 200시간 동안 생물학적 시료에 처리하는 것인, 생물학적 분자를 생물학적 시료의 조직 내로 침투시키는 방법.4. The method according to any one of claims 1 to 3,
Treating the biological sample with the sulfobetaine zwitterionic surfactant at a concentration of not less than a critical micelle concentration having an intrinsic value of each surfactant for 1 to 200 hours, Way.
상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 각 계면활성제가 고유의 값으로 갖고 있는 미셀임계농도 이상의 농도로 1시간 ~ 200시간 동안 생물학적 시료에 처리하는 것인, 생물학적 분자를 생물학적 시료의 조직 내로 침투시키는 방법.The method according to claim 6,
Treating the biological sample with the sulfobetaine zwitterionic surfactant at a concentration of not less than a critical micelle concentration having an intrinsic value of each surfactant for 1 to 200 hours, Way.
상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제는 상기 계면활성제의 미셀임계 온도 내지 60℃의 온도에서 처리하는 것인, 생물학적 분자를 생물학적 시료의 조직 내로 침투시키는 방법.4. The method according to any one of claims 1 to 3,
Wherein the sulfobetaine zwitterionic surfactant is treated at a temperature ranging from a micelle critical temperature to 60 캜 of the surfactant.
<화학식 1>
상기 식에서, R은 탄소 원자수 8 ~ 22개의 알킬기 또는 알케닐기이고, 상기 x 는 0 ~ 3의 정수이며, 상기 y는 2 ~ 4의 정수이다.A composition for tissue infiltration of a biological sample composed of a tissue, an organ, or a part thereof in vitro, comprising a sulfobetaine zwitterionic surfactant represented by the following formula (1):
≪ Formula 1 >
Wherein R is an alkyl or alkenyl group having 8 to 22 carbon atoms, x is an integer of 0 to 3, and y is an integer of 2 to 4.
(a) 생물학적 시료를 고정용액으로 고정시키고;
(b) 생물학적 시료를 전기적 또는 화학적 방법으로 투명화 시키고;
(c) 제 10항 또는 제 11항의 조성물을 상기 (b)의 투명화된 생물학적 시료에 처리하고;
(d) 상기 (c)의 생물학적 시료를 항체와 반응시켜 면역염색 하고;
(e) 상기 (d)의 생물학적 시료를 세척하고 반응하지 않은 항체를 제거하는 것을 포함하는,
생물학적 시료의 면역조직화학염색 방법.A method of immunohistochemical staining of a biological sample composed of an ex vivo separated tissue, an organ or a part thereof,
(a) fixing the biological sample with a fixative solution;
(b) making the biological sample transparent by electrical or chemical means;
(c) treating the composition of claim 10 or 11 to the clarified biological sample of (b);
(d) immunologically staining the biological sample of (c) by reacting with the antibody;
(e) washing the biological sample of (d) and removing unreacted antibody.
Immunohistochemical staining of biological samples.
상기 (d)의 생물학적 시료를 항체와 반응시키는 것이, (c)의 제 10항 또는 제 11항의 조성물을 상기 생물학적 시료에 처리하는 것과 동시에 수행되거나 그 이전에 수행되는 것인, 생물학적 시료의 면역조직화학염색 방법. 13. The method of claim 12,
Wherein reacting the biological sample of (d) with the antibody is performed simultaneously with or prior to the treatment of the composition of (10) or (11) with the biological sample, Chemical dyeing method.
상기 고정용액은 알데하이드계 화합물을 포함하는 것인, 생물학적 시료의 면역조직화학염색 방법. 13. The method of claim 12,
Wherein the immobilizing solution comprises an aldehyde-based compound.
상기 생물학적 시료는 두께가 0.1 ㎜ 이상인 것인, 생물학적 시료의 면역조직화학염색 방법. 13. The method of claim 12,
Wherein the biological sample has a thickness of at least 0.1 mm.
상기 (c)에서 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 포함하는 제 10항 또는 제 11항의 조성물을, 증류수 또는 PBS (phosphate-buffered saline)를 함유하는 용액에 상기 계면활성제가 갖는 고유 미셀임계농도 이상의 농도로 용해시킨 용액으로, 1 ~ 200시간 동안 생물학적 시료에 처리하는 것인, 생물학적 시료의 면역조직화학염색 방법.13. The method of claim 12,
The composition according to claim 10 or 11, wherein the composition contains a sulfobetaine zwitterionic surfactant in (c), is dissolved in a solution containing distilled water or PBS (phosphate-buffered saline) at a concentration exceeding the intrinsic micelle threshold concentration To a biological sample for 1 to 200 hours. ≪ RTI ID = 0.0 > A < / RTI > method of immunohistochemical staining of a biological sample.
상기 (c)에서 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 포함하는 제 10항 또는 제 11항의 조성물을, 상기 계면활성제의 미셀임계온도 내지 60℃의 온도에서 처리하는 것인, 생물학적 시료의 면역조직화학염색 방법.13. The method of claim 12,
Wherein the composition of claim 10 or 11 comprising a sulfobetaine zwitterionic surfactant in step (c) is treated at a temperature of from the micelle critical temperature to 60 ° C of the surfactant, Dyeing method.
상기 (b)의 생물학적 시료의 투명화는 조직 내 지질 성분을 제거하거나 굴절률 (Refractive index)을 균질화하는 방법을 포함하는 것인, 생물학적 시료의 면역조직화학염색 방법.13. The method of claim 12,
Wherein the transparency of the biological sample of (b) comprises a method of removing lipid components in the tissue or homogenizing the refractive index.
<화학식 1>
상기 식에서, R은 탄소 원자수 8 ~ 22개의 알킬기 또는 알케닐기이고, 상기 x 는 0 ~ 3의 정수이며, 상기 y는 2 ~ 4의 정수이다.A composition for immunohistochemical staining of a biological sample composed of in vitro separated tissues, organs or parts thereof, comprising a sulfobetaine zwitterionic surfactant represented by the following formula 1:
≪ Formula 1 >
Wherein R is an alkyl or alkenyl group having 8 to 22 carbon atoms, x is an integer of 0 to 3, and y is an integer of 2 to 4.
상기 생물학적 시료는 생체 외 분리된 조직, 기관 또는 이것의 일부이며, 상기 생물학적 분자는 항체, 항체단편, 단백질, 다당류, RNA 또는 DNA를 포함하는 핵산, 펩타이드 및 폴리펩타이드로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 것인,
생물학적 시료의 광학적 이미징을 위한 전처리용 조성물. A composition for pretreatment for optical imaging of a biological sample, comprising the composition of claim 10 or 11, wherein the biological molecule is penetrated into the tissue of the biological sample and the biotissue is made transparent,
Wherein the biological sample is an in vitro isolated tissue or organ or a part thereof and wherein the biological molecule is selected from the group consisting of an antibody, an antibody fragment, a nucleic acid comprising a polysaccharide, RNA or DNA, a peptide and a polypeptide, sign,
A composition for pretreatment for optical imaging of biological samples.
A method for pretreatment of a biological sample with the composition of claim 23 for optical imaging of the biological sample.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| X091 | Application refused [patent] | ||
| AMND | Amendment | ||
| E90F | Notification of reason for final refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| X701 | Decision to grant (after re-examination) | ||
| GRNT | Written decision to grant |