KR20190073206A - Cosmetic composition for skin care comprising fusion protein with Tβ4 - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to a cosmetic composition for skin care comprising a fusion protein with thymosin beta 4 (Tβ4). More specifically, the present invention relates to a fusion protein in which Tβ4 is bound to a peptide for promoting skin permeation, a cosmetic composition for skin care comprising the fusion protein, a cosmetic composition for hair loss prevention, and a quasi-drug composition comprising the fusion protein.

Description

티모신 베타 4의 융합 단백질을 포함하는 피부개선용 화장료 조성물 {Cosmetic composition for skin care comprising fusion protein with Tβ4}[0001] The present invention relates to a cosmetic composition for skin care comprising a fusion protein of Tymosin beta 4,

본 발명은 티모신 베타 4(Tβ4)의 융합 단백질을 포함하는 피부개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 피부투과 촉진용 펩타이드에 Tβ4가 결합된 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 포함하는 피부개선용 화장료 조성물, 탈모개선용 화장료 조성물 및 상기 융합 단백질을 포함하는 의약외품 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a cosmetic composition for skin improvement comprising a fusion protein of thymosin beta 4 (T? 4). More specifically, the present invention relates to a skin permeation enhancing peptide composition comprising a fusion protein in which T? 4 is bound to a peptide for skin permeation promotion, A cosmetic composition for improving skin, a cosmetic composition for improving hair loss, and a quasi-drug composition containing the fusion protein.

피부를 통과하는 약물은 사용의 편리성에 의해서 진통패치, 금연패치, 임신 조절제 등에서 사용되고 있고, 피부를 통하여 체순환계(systemic circulation)에 전달하려는 목적을 가진다. 이와 함께 아토피 치료제, 미백, 주름 개선용 화장품 등 피부자체의 기관에 전달하려는 목적을 가지는 경우도 있다. 이런 편리성과 기능성을 가지는 목표에도 불구하고 피부의 구조상 약물의 전달의 어려움을 가지는데, 이는 피부의 구조를 보면 이해할 수 있다. 약 10~15 층의 각질세포(corneocyte)로 이루어진 피부의 각질층은, 케라틴이 풍부한 각질세포로 이루어져 있는 브릭(brick) 구조와, 이러한 각질세포 사이를 세라마이드(ceramide), 지방산(fatty acid), 또는 왁스(wax) 등과 같은 지질이 채운 모르타르(mortar) 구조로 이루어져 있으며, 약 10~45um 정도의 두께를 이루고 있다. 이러한 구조는 내부의 수분의 손실을 막고 외부로부터의 침입을 막는 역할을 한다. 따라서, 그 역할에 충실하게 물질 투과성이 아주 낮은데, 500Da 이하의 저분자 구조 성분들만 확산 방식에 의해서 피부 내로 전달된다(Exp. Dermatol., 2000, 9, 165-9.). 이는 모르타르 구조의 세포 내 지질층이나, 지질층 사이의 수용성 구조를 통해서 이루어지고, 물질 투과성은 약물의 성질에 따라 크게 좌우된다(Current Drug Delivery, 2005, 2, 23-3). 또한 피부표면을 직접 통과하는 방식 이외에 피부의 땀샘, 모공, 피지선 등의 구조를 이용하여 전달되기도 한다.Drugs that pass through the skin are used in analgesic patches, smoking cessation patches, pregnancy regulators, and the like due to their ease of use and have the purpose of delivering them to the systemic circulation through the skin. At the same time, it may have the purpose of delivering it to the skin's own organs such as atopic treatments, whitening, and cosmetics for improving wrinkles. Despite the goal of having such convenience and functionality, it is difficult to deliver drugs due to the structure of the skin, which can be understood by looking at the structure of the skin. The stratum corneum of the skin, which is composed of about 10-15 layers of corneocytes, has a brick structure composed of keratin-rich keratinocytes, and a ceramide, a fatty acid, It has a mortar structure filled with lipids such as wax and has a thickness of about 10 to 45 um. This structure prevents internal moisture loss and prevents external intrusion. Thus, the material permeability is very low in accordance with its role. Only low-molecular-weight components below 500 Da are delivered into the skin by the diffusion method (Exp. Dermatol., 2000, 9, 165-9). This is done through the water-soluble structure between the lipid layer in the cell and the lipid layer in the mortar structure, and the substance permeability is highly dependent on the nature of the drug (Current Drug Delivery, 2005, 2, 23-3). In addition to passing directly through the surface of the skin, it can also be delivered using structures such as sweat glands, pores, and sebaceous glands of the skin.

이러한 이유로, 분자의 크기나 성질에 관계없이 피부를 투과할 수 있고, 피부의 전체에 고르게 전달할 수 있는 방법을 개발하려는 연구가 활발히 진행되었다.For this reason, research has been actively conducted to develop a method that can permeate the skin regardless of the size or nature of the molecule, and can evenly transmit the whole skin.

예를 들어, 미국등록특허 제7,659,252호에는 피부질환의 치료 및 약학적 활성제제의 피부투과 촉진에 사용될 수 있는 피부투과성 펩타이드가 개시되어 있다. 상기 펩타이드는 우수한 피부 투과도를 나타낼 뿐만 아니라 다른 약물의 경피전달용 담체로서도 사용될 수 있다는 장점이 있으나, 피부를 투과한 다음에는 체내의 순환시스템을 통해 소모되기 때문에, 피부를 표적으로 하는 약물의 경우에는 별다른 효과를 발휘하지 못한다는 단점이 있었다.For example, U.S. Patent No. 7,659,252 discloses skin permeable peptides that can be used to treat skin diseases and promote skin penetration of pharmaceutical active agents. The peptide not only exhibits excellent skin permeability but also can be used as a carrier for transdermal delivery of other drugs. However, since the peptide is consumed through the circulatory system in the body after permeating through the skin, in the case of a drug targeting the skin It has a disadvantage that it can not exert any significant effect.

이러한 단점은 콜라겐 합성, 내피세포 성장 또는 히알루론산 생성을 촉진하여 주름 개선 효과를 나타내는 다양한 유효성분이 정상적으로 피부를 통해 흡수되지 못하는 것이 주된 원인으로 알려져 있기 때문에, 상기 유효성분의 흡수를 촉진시키는 방법을 개발하려는 연구가 활발히 진행되었다. 예를 들어, 한국등록특허 제1054519호에는 천연 인간 성장호르몬들과 비교하여 안정성 및 피부 투과도가 우수한 인간 성장호르몬-유래 펩타이드 및 이를 포함하는 조성물이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1104223호에는 인간 IL-10의 기능과 동일한 기능을 하며 천연 IL-10과 비교하여 안정성 및 피부투과도가 매우 우수한 IL-10-유래 펩타이드 및 이를 포함하는 조성물이 개시되어 있으나, 이들 펩타이드는 그 자체로 기능성을 나타낼 뿐, 다른 약물의 전달용 담체로서 사용할 수 없다는 단점이 있었다. 이러한 단점은 피부투과성이 우수하는 특성만으로는 약물의 전달에 사용할 수 없다는 것을 암시하는 것으로 분석되었으므로, 피부투과성이 우수할 뿐만 아니라 피부 잔류성을 향상시키는 두가지 특성을 포함하는 새로운 물질의 개발이 요구되었으나, 아직까지는 별다른 연구결과가 보고되지 않고 있는 실정이다.This disadvantage is known as a cause of promoting collagen synthesis, endothelial cell growth or hyaluronic acid production, and various effective ingredients showing wrinkle-reducing effects are not normally absorbed through the skin. Therefore, a method for promoting absorption of the active ingredient has been developed Research was actively pursued. For example, Korean Patent Registration No. 1054519 discloses a human growth hormone-derived peptide and a composition containing the human growth hormone-derived peptide, which are superior in stability and skin permeability to natural human growth hormone. In Korean Patent No. 1104223, 10-derived peptides having the same functions as those of natural IL-10 and having excellent stability and skin permeability as compared with natural IL-10, and compositions comprising the same. However, these peptides are merely functional, It can not be used as a delivery carrier for other drugs. This disadvantage has been analyzed as suggesting that the property of excellent skin permeability can not be used for drug delivery. Therefore, it has been required to develop a new substance including two properties that not only have excellent skin permeability but also improve skin retention, There is no report on the research results.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 피부투과성이 우수할 뿐만 아니라 피부잔류성이 우수한 두 가지 특성을 포함하는 새로운 물질을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 약물의 경피전달용 담체로서 사용될 수 있으면서도 피부에 오래 잔류할 수 있는 피부투과 촉진용 펩타이드를 개발하였으며, 상기 피부투과 촉진용 펩타이드에 Tβ4를 융합시킨 융합 단백질이 피부투과성이 우수할 뿐만 아니라 피부잔류성을 향상시키는 특성을 모두 나타냄을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.Under these circumstances, the inventors of the present invention have made extensive efforts to develop a novel substance that has both excellent skin permeability and excellent skin durability. As a result, they have found that they can be used as a carrier for transdermal delivery of drugs, The inventors of the present invention have developed a peptide for promoting skin permeation, and confirmed that the fusion protein obtained by fusing T? 4 to the skin permeation promoting peptide exhibits both skin permeability and skin retention properties.

본 발명의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 피부투과 촉진용 펩타이드가 혈관내피세포 성장인자(Tβ4)에 결합된 융합 단백질을 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a fusion protein in which a peptide for promoting skin permeation, which is composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, is bound to a vascular endothelial growth factor (T? 4).

본 발명의 다른 목적은 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a polynucleotide encoding said fusion protein.

본 발명의 다른 목적은 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a cosmetic composition for improving skin comprising the fusion protein as an active ingredient.

본 발명의 다른 목적은 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 탈모개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a cosmetic composition for improving hair loss comprising the fusion protein as an active ingredient.

본 발명의 다른 목적은 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a quasi-drug composition for skin improvement comprising the fusion protein as an active ingredient.

본 발명의 다른 목적은 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 탈모개선용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a quasi-drug composition for improving hair loss comprising the fusion protein as an active ingredient.

본 발명의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 피부투과 촉진용 펩타이드가 티모신 베타 4(Tβ4)에 결합된 융합 단백질을 제공한다.In one embodiment to achieve the object of the present invention, a peptide for promoting skin permeation comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 provides a fusion protein in which thymosin beta 4 (T? 4) is bound.

본 발명에서 사용된 상기 서열 번호 1의 아미노산 서열은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 다음과 같이 약어로 기재하였다.The amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 used in the present invention is abbreviated as follows according to the IUPAC-IUB nomenclature.

피부투과 촉진용 펩타이드: NGSLNTHLAPIL(서열번호 1)Peptide for promoting skin permeation: NGSLNTHLAPIL (SEQ ID NO: 1)

구체적으로, Asparagine(아스파라긴) Asn N- Glycine(글리신) Gly G- Serine(세린) Ser S- Leucine(류신) Leu L- Asparagine(아스파라긴) Asn N- Threonine(트레오닌) Thr T- Histidine(히스티딘) His H- Leucine(류신) Leu L- Alanine(알라닌) Ala A- Proline(프롤린) Pro P- Isoleucine(이소루신) Ile I- Leucine(류신) Leu L으로 나타낼 수 있다.Asparagine Asn N-Glycine Gly G-Serine Ser S-Leucine Leu L-Asparagine Asn N-Threonine Thre T-Histidine His H-Leucine Leu L-Alanine Ala A-Proline Pro P-Isoleucine Ile I-Leucine Leu L

상기 펩타이드와 결합된 티모신 베타 4(Tβ4)는 피부 투과성이며, 피부 잔류성을 가지는 것으로 사용될 수 있다. Thymosin beta 4 (T? 4) associated with the peptide is skin permeable and can be used to have skin persistence.

본 발명에 있어서, "피부투과 촉진용 펩타이드"란, 분자의 크기나 성질에 관계없이 피부를 투과할 수 있고, 피부의 전체에 고르게 전달할 수 있으며, 피부 투과성 및 피부 잔류성이 우수한 펩타이드를 의미한다.In the present invention, "peptides for promoting skin permeation" means peptides capable of permeating through the skin regardless of the size or nature of the molecules, uniformly transmitting the same throughout the skin, and having excellent skin permeability and skin retention.

본 발명에 있어서, "피부 투과성"이란, 펩타이드가 피부를 투과하여 피부 내부로 침투할 수 있는 능력 또는 성질을 의미하며, 본 발명의 피부투과 촉진용 펩타이드는 다른 펩타이드에 비하여 현저히 우수한 피부투과성을 나타낸다.In the present invention, the term "skin permeability" means the ability or property of the peptide to permeate through the skin to penetrate into the skin, and the peptide for skin permeation promotion of the present invention shows remarkably superior skin permeability than other peptides .

본 발명에 있어서, "피부 잔류성"이란, 피부를 투과한 펩타이드가 피부조직을 통과하여 순환계로 전달되지 않고, 피부 내의 조직에 결합되어 피부 내에서 잔류하는 능력을 의미한다. 피부조직을 표적조직으로 하는 약학적 제제 또는 화장료의 경우에는, 상기 펩타이드와 결합된 성분이 피부조직 또는 피부세포에 장기간 작용할 수 있도록 피부조직에 잔류하는 특성이 우수한 담체를 사용함이 바람직하다. 본 발명의 피부투과 촉진용 펩타이드는 피부투과성뿐만 아니라 피부잔류성이 현저히 우수하므로, 약학적 제제 또는 화장료의 담체로서 사용될 수 있다. In the present invention, "skin persistence" means the ability of the peptides that permeate through the skin to pass through the skin tissue and not to be transmitted to the circulatory system, but to bind to the tissues in the skin and remain in the skin. In the case of pharmaceutical preparations or cosmetics containing the skin tissue as a target tissue, it is preferable to use a carrier having excellent properties to remain in the skin tissue so that the component bound to the peptide can act on the skin tissue or skin cells for a long time. The skin penetration enhancing peptide of the present invention is remarkably excellent in skin permeability as well as skin retention, and thus can be used as a carrier for pharmaceutical preparations or cosmetics.

본 발명의 피부투과 촉진용 펩타이드는 파지 라이브러리와 경피제제의 용출 실험 방법을 조합한 파지 디스플레이 방법을 수행하여 발굴된, 피부 투과성과 피부 잔류성이 우수한 펩타이드를 포함할 수 있고, 구체적으로는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 파지 디스플레이 방법을 통해 피부투과 촉진용 펩타이드로 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 제조하였다(실시예 1).The peptide for skin permeation promotion of the present invention may include a peptide having excellent skin permeability and skin retention derived by performing a phage display method combining a phage library and a dissolution test method of a transdermal preparation, Lt; RTI ID = 0.0 > of: < / RTI > In one embodiment of the present invention, a peptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 was prepared as a skin permeation promoting peptide through a phage display method (Example 1).

본 발명에 있어서, "티모신 베타 4(Thymosin beta 4; Tβ4)"는 흉선의 추출물로 처음 발견되었으며, 43개의 아미노산으로 구성되어 분자량이 5KDa으로 비교적 작은 단백질이며 적혈구를 제외한 거의 모든 세포에 존재한다. 상기 Tβ4는 본래 액틴을 조절하는 단백질로써 G-액틴에 결합하여 액틴의 중합체 합성을 억제하며 내피세포의 분화 및 이동, 신생 혈관 생성을 유도하는 것으로 알려져 있었으나 최근에는 상처치유에 효과적으로 작용하며 심근 세포의 재생에 탁월한 효과를 보이는 것으로 보고되고 있다.In the present invention, "Thymosin beta 4 (T? 4)" was first discovered as an extract of the thymus. It is composed of 43 amino acids and has a molecular weight of 5 KDa and is a relatively small protein and exists in almost all cells except red blood cells . The T? 4 was originally known as a protein that regulates actin and binds to G-actin to inhibit synthesis of actin polymer and induce differentiation, migration and angiogenesis of endothelial cells. In recent years, It has been reported that it exerts excellent effects on regeneration.

본 발명에 있어서, Tβ4는 세포의 분열, 분화 및 이동기작을 조율하는 역할을 하며, 혈관 신생 유도, 표피 세포 증식, 세포 이동 촉진, 미세혈관 수용성 증가 등을 통해 손상된 피부의 재생, 모발의 재생 및 성장을 촉진하는 효능을 나타내는 한, 그의 아미노산 서열은 특별히 제한되지 않는데, 상기 Tβ4의 전체 아미노산 서열을 사용할 수도 있고, 이의 변이된 아미노산 서열을 사용할 수도 있으며, 이의 일부 단편을 사용할 수도 있다. 상기 Tβ4의 구체적인 아미노산 서열 또는 그를 코딩하는 유전자의 염기서열 정보는 NCBI의 GenBank 등 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다. 상기 Tβ4는 구체적으로는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드가 될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, T? 4 plays a role in coordinating the division, differentiation and migration of cells, and regulates the regeneration of damaged skin, regeneration and growth of hair through angiogenesis induction, epidermal cell proliferation, cell migration promotion, , The amino acid sequence thereof is not particularly limited. The entire amino acid sequence of T? 4 may be used, the mutated amino acid sequence thereof may be used, or a fragment thereof may be used. The specific amino acid sequence of T? 4 or the nucleotide sequence information of the gene encoding the T? 4 can be obtained from a known database such as NCBI's GenBank. The T? 4 specifically may be a peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.

또한, Tβ4는 Y유전체와 X 유전체 q.21.3-q.22에 유전자가 위치하고 있으며, 이 두 유전자는 상동유전자로서 44개 아미노산 중 3개만 다를 정도로 서열이 매우 유사하다. 본 발명의 실시예에는 X 유전체 서열을 바탕으로 융합단백질을 제작하였으나, 반드시 X 염색체상의 Tβ4에만 한정되지 않으며, Y 유전체 상의 Tβ4으로도 융합단백질 제작이 가능하다.In addition, Tβ4 is located in the Y and X dielectrics q.21.3-q.22, and these two genes are homologous and very similar in sequence to three of the 44 amino acids. In the example of the present invention, a fusion protein was prepared based on the X genome sequence, but it is not necessarily limited to the T? 4 on the X chromosome.

본 발명에 있어서, "융합 단백질" 이란 상기 피부투과 촉진용 펩타이드가 다른 단백질 또는 펩타이드에 결합되도록 인위적으로 합성된 펩타이드로서, 구체적으로 상기 피부투과 촉진용 펩타이드 및 상기 Tβ4를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로 상기 피부투과 촉진용 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드일 수 있으며, 상기 Tβ4는 서열번호 2로 이루어진 펩타이드 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.In the present invention, "fusion protein" is a peptide artificially synthesized so that the peptide for promoting skin permeation is bound to another protein or peptide. Specifically, the peptide may include the skin permeation promoting peptide and the T? 4. More specifically, the skin permeation promoting peptide may be a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and the T? 4 may be a peptide consisting of SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.

상기 융합 단백질은 이에 포함되는 각 도메인의 야생형의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 펩타이드를 포함할 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 또한, 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 단백질의 열, pH등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 단백질을 포함할 수 있다.The fusion protein may include a peptide having a sequence that differs from a wild-type amino acid sequence of each domain included therein by one or more amino acid residues. Amino acid exchange in peptides that do not globally alter the activity of the molecule is known in the art. The most commonly occurring exchanges involve amino acid residues Ala / Ser, Val / Ile, Asp / Glu, Thr / Ser, Ala / Gly, Ala / Thr, Ser / Asn, Ala / Val, Ser / Gly, Thy / Pro, Lys / Arg, Asp / Asn, Leu / Ile, Leu / Val, Ala / Glu and Asp / Gly. In addition, the protein may include a protein having increased structural stability or increased protein activity due to mutation or modification of the amino acid sequence, such as heat, pH and the like.

상기 융합 단백질 또는 상기 융합 단백질을 구성하는 단백질은 당해 분야에 공지된 화학적 단백질 합성방법으로 제조하거나, 상기 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 PCR(polymerase chain reaction) 에 의해 증폭하거나 공지된 방법으로 합성한 후 발현벡터에 클로닝(cloning)하여 발현시켜서 제조할 수 있다.The fusion protein or the protein constituting the fusion protein may be prepared by a chemical protein synthesis method known in the art, or a gene encoding the fusion protein may be amplified by PCR (polymerase chain reaction) or synthesized by a known method Cloning into an expression vector and expressing it.

본 발명의 융합 단백질은 상기 피부투과 촉진용 펩타이드 및 상기 Tβ4 사이에 링커 펩타이드를 포함할 수 있다. 구체적으로 상기 융합 단백질은 상기 피부투과 촉진용 펩타이드가 상기 Tβ4의 N-말단에 직접적으로 연결될 수도 있고, 링커(Linker)를 통해 융합 연결될 수도 있다.The fusion protein of the present invention may include a linker peptide between the skin permeation promoting peptide and the T? 4. Specifically, the fusion protein may be directly linked to the N-terminal of the T? 4, or may be fusion-linked through a linker.

상기 링커는 구체적으로 글라이신, 알라닌, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 리신, 아르기닌산 등의 아미노산을 사용하여 연결시킬 수 있고, 보다 구체적으로 발린, 루이신, 아스파르트산, 글라이신, 알라닌, 프롤린 등의 아미노산을 여러 개 사용하여 연결시킬 수 있으며, 보다 더 구체적으로 유전자 조작의 용이성을 고려하여 글라이신, 발린, 루이신, 아스파르트산 등의 아미노산을 1개 내지 5개씩 연결하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 피부투과 촉진용 펩타이드의 C-말단과 Tβ4의 N-말단을 2개의 펩타이드(GG)로 구성된 링커를 통해 연결시켜서 융합 단백질을 제조할 수 있다.The linker may be specifically linked with amino acids such as glycine, alanine, leucine, isoleucine, proline, serine, threonine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, lysine and arginic acid, Amino acids such as valine, lysine, aspartic acid, glycine, alanine and proline can be used in combination, and more specifically, amino acids such as glycine, valine, leucine and aspartic acid One to five of them may be connected and used. For example, a fusion protein can be prepared by linking the C-terminal of the skin permeation enhancing peptide and the N-terminal of T? 4 through a linker composed of two peptides (GG).

구체적으로, 본 발명의 융합 단밸질은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.Specifically, the fusion protein of the present invention may be a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, but is not limited thereto.

본 발명의 다른 하나의 양태로서, 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.In another aspect of the present invention, there is provided a polynucleotide encoding the fusion protein.

상기 폴리뉴클레오티드는 상기 융합단백질과 유사한 활성을 가지는 한, 서열번호 3으로 기재되는 염기 서열, 또는 상기 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 더욱 구체적으로는 90% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 95% 이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 코돈 축퇴성(codon degeneracy)에 의해 상기 서열번호 3의 염기 서열로 이루어진 단백질 또는 이와 상동성을 가지는 단백질로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드 역시 포함될 수 있음은 자명하다. 또는 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화하여, 서열번호 3의 염기 서열로 이루어진 단백질의 활성을 가지는 단백질을 암호화하는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.As long as the polynucleotide has an activity similar to that of the fusion protein, the polynucleotide may have a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or a nucleotide sequence having 70% or more, specifically 80% or more, more specifically 90% or more, May comprise, but is not limited to, a polynucleotide encoding a protein that exhibits at least 95%, and most specifically at least 99% homology. Also, it is apparent that a polynucleotide that can be translated into a protein consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or a protein having the same homology can be also included by codon degeneracy. Or a probe that can be prepared from a known gene sequence, for example, a protein having the activity of a protein consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 by hybridizing under stringent conditions with a complementary sequence to all or a part of the nucleotide sequence Encoding sequences may be included without limitation. Specifically, the polynucleotide of the present invention may comprise the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, but is not limited thereto.

상기 "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성이 높은 유전자끼리, 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1XSSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1XSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1XSSC, 0,1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.The term "stringent conditions" means conditions that allow specific hybridization between polynucleotides. These conditions are specifically described in the literature (e.g., J. Sambrook et al., Sangdong). For example, a gene having a homology of at least 80%, specifically at least 90%, more specifically at least 95%, more specifically at least 97%, particularly at least 99% 1XSSC, 0.1% SDS, specifically 60 ° C, 0.1X SSC, 0.1% SDS, or 0.1% SDS, which is a condition for hybridization of genes having lower homology to each other or hybridization of normal hybridization, More specifically, conditions for washing at once, specifically, 2 to 3 times at a salt concentration and a temperature corresponding to 0.1 占 SSC, 0, 1% SDS at 68 占 폚 can be listed.

혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 발명은 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.Hybridization requires that two nucleic acids have a complementary sequence, although mismatches between bases are possible, depending on the severity of hybridization. The term "complementary" is used to describe the relationship between nucleotide bases capable of hybridizing with each other. For example, with respect to DNA, adenosine is complementary to thymine and cytosine is complementary to guanine. Thus, the present invention may also include substantially similar nucleic acid sequences as well as isolated nucleic acid fragments complementary to the entire sequence.

구체적으로, 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60℃, 63℃ 또는 65℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.Specifically, polynucleotides having homology can be detected using hybridization conditions comprising the hybridization step at a Tm value of 55 and using the conditions described above. In addition, the Tm value may be 60 ° C, 63 ° C, or 65 ° C, but is not limited thereto and may be suitably adjusted by those skilled in the art according to the purpose.

폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).Suitable stringency to hybridize polynucleotides depends on the length and complementarity of the polynucleotide and the variables are well known in the art (see Sambrook et al., Supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8).

본 발명에서 용어, "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 모이어티(moiety) 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 가지는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 하나의 모이어티로부터 다른 하나의 모이어티까지의 서열 간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0을 이용하거나, 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.  As used herein, the term "homology" refers to the percentage of identity between two polynucleotide or polypeptide moieties. Means the degree of agreement with a given amino acid sequence or base sequence and can be expressed as a percentage. In the present specification, its homologous sequence having the same or similar activity as a given amino acid sequence or base sequence is referred to as "% homology ". The homology between sequences from one moiety to another may be determined by known techniques. For example, standard software for calculating parameters such as score, identity and similarity, specifically BLAST 2.0, or by sequential hybridization experiments under defined stringent conditions, And the appropriate hybridization conditions to be defined are within the skill of the art and can be determined by methods well known to those skilled in the art (for example, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; FM Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York).

본 발명에서 사용된 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.The term "vector" as used herein refers to a DNA construct containing a nucleotide sequence of a polynucleotide encoding the desired polypeptide operably linked to a suitable regulatory sequence so as to be capable of expressing the polypeptide of interest in the appropriate host . The regulatory sequence may include a promoter capable of initiating transcription, any operator sequence for regulating such transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding site, and a sequence controlling the termination of transcription and translation. The vector may be transcribed into an appropriate host cell and then cloned or functioned independently of the host genome and integrated into the genome itself.

본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC, pPIC, pGAP 벡터 등을 사용할 수 있으며, 대장균, 유산균, 바실러스균 등의 박테리아 및 효모에서 발현되는 벡터 등을 모두 포함할 수 있다. 일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 변이된 폴리뉴클레오티드로 교체시킬 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.The vector used in the present invention is not particularly limited as long as it is replicable in the host cell, and any vector known in the art can be used. Examples of commonly used vectors include plasmids, cosmids, viruses and bacteriophages in their natural or recombinant state. For example, pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A and Charon21A can be used as the phage vector or cosmid vector, and pBR, pUC, pBluescriptII , pGEM-based, pTZ-based, pCL-based, pET-based, and the like. The vector usable in the present invention is not particularly limited, and known expression vectors can be used. Specifically, pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC, pPIC and pGAP vectors can be used and include vectors expressed in bacteria and yeast such as Escherichia coli, can do. For example, a polynucleotide encoding a desired polypeptide in a chromosome can be replaced with a mutated polynucleotide through a vector for intracellular chromosome insertion. The insertion of the polynucleotide into the chromosome can be accomplished by any method known in the art, for example, homologous recombination, but is not limited thereto.

본 발명에서 용어 "형질전환"은 표적 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩타이드가 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌 글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다.The term "transformation" in the present invention means introducing a vector comprising a polynucleotide encoding a target polypeptide into a host cell so that the polynucleotide encoded by the polynucleotide can be expressed in the host cell. Transformed polynucleotides may include all of these, whether inserted into the chromosome of the host cell or located outside the chromosome, provided that the polynucleotide can be expressed in the host cell. For example, electroporation, calcium phosphate (CaPO4) precipitation, calcium chloride (CaCl2) precipitation, microinjection, polyethylene glycol (PEG) method, DEAE-dextran method, cationic liposome method, -DMSO method, and the like. The polynucleotide also includes DNA and RNA encoding the target polypeptide. The polynucleotide may be introduced in any form as far as it is capable of being introduced into a host cell and expressed. For example, the polynucleotide may be introduced into a host cell in the form of an expression cassette, which is a gene construct containing all the elements necessary for its expression. The expression cassette can typically include a promoter operably linked to the polynucleotide, a transcription termination signal, a ribosome binding site, and a translation termination signal. The expression cassette may be in the form of an expression vector capable of self-replication. Also, the polynucleotide may be introduced into the host cell in its own form and operatively linked to the sequence necessary for expression in the host cell, but is not limited thereto.

또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.In addition, the term "operably linked" in the above refers to a functional linkage of the gene sequence to a promoter sequence that initiates and mediates the transcription of the polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention.

본 발명의 다른 하나의 양태로서, 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 화장료 조성물을 제공한다.In another aspect of the present invention, there is provided a cosmetic composition for skin improvement comprising the fusion protein as an active ingredient.

또한, 구체적으로, 본 발명의 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선 또는 피부 탄력 증진용 화장료 조성물을 제공할 수 있다.Specifically, a cosmetic composition for improving skin wrinkles or skin elasticity comprising the fusion protein of the present invention as an active ingredient can be provided.

본 발명에서의 "피부 탄력 증진" 또는 "피부 주름 개선"이란 피부가 쳐지거나 늘어지는 정도를 완화시켜주는 것, 또는 피부에 주름이 생성되는 것을 억제 또는 저해하거나, 이미 생성된 주름을 완화시키는 것이다.In the present invention, "skin elasticity enhancement" or "skin wrinkle improvement" is intended to alleviate the degree to which the skin is stuck or stretched or to inhibit or inhibit the generation of wrinkles on the skin, .

구체적인 일 실시예에 따르면, 본 발명의 피부탄력 및 피부 주름 개선 등의 효과를 확인하기 위하여 융합 단백질이 제대정맥 내피세포 증식에 미치는 효과를 확인하였다. 제대정맥 내피세포에 Tβ4 및 융합 단백질(T-Tβ4)을 첨가하여 배양한 결과, 대조군에 비하여 T-Tβ4도 Tβ4와 동등한 수준의 세포증식효능을 가지고 있음을 확인하였다(표 1).According to a specific embodiment, the effect of the fusion protein on the umbilical vein endothelial cell proliferation was confirmed in order to confirm the effects of the skin elasticity and skin wrinkle improvement of the present invention. As a result of addition of T? 4 and a fusion protein (T-T? 4) to the umbilical vein endothelial cells, T-T? 4 was confirmed to have a cell proliferation level equivalent to T? 4 as compared with the control group (Table 1).

이를 통해, Tβ4에 피부투과 촉진용 펩타이드가 융합되어도 Tβ4의 피부주름 및 탄력 개선 효능을 그대로 가지고 있음을 알 수 있다.As a result, it can be seen that even if the peptide for skin permeation promotion is fused to T? 4, the skin wrinkle and the elasticity improving effect of T? 4 remain intact.

또한, 본 발명의 실시예에서는 상기 Tβ4에 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 피부투과 촉진용 펩타이드를 결합하여 융합 단백질을 제조(서열번호 3)하였으며, 상기 제조된 융합 단백질의 효과를 종래의 Tβ4와 비교한 결과, 피부투과도 및 피부 잔류성이 현저히 향상되고 주름 개선 효과 또한 우수함을 확인하였다(표 3 및 표 4).In addition, in the example of the present invention, a fusion protein (SEQ ID NO: 3) was prepared by binding a peptide for promoting skin permeation containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to T? 4 and the effect of the fusion protein prepared was compared with the conventional T? , It was confirmed that the skin permeability and skin durability were remarkably improved and the wrinkle-reducing effect was also excellent (Table 3 and Table 4).

따라서, 본 발명에서 제공하는 융합 단백질은 Tβ4에 피부투과 촉진용 펩타이드가 결합되어, 손상된 피부 및 모발의 재생을 증가시키는 Tβ4 자체의 효능을 유지하면서도, 피부 투과성과 피부 잔류성을 현저하게 향상시킬 수 있으므로, 화장료 조성물 및 의약외품 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.Accordingly, the fusion protein provided by the present invention can significantly improve skin permeability and skin retention while maintaining the efficacy of T? 4 itself, which increases the regeneration of damaged skin and hair, by binding peptide for promoting skin permeation to T? 4 , A cosmetic composition and a quasi-drug composition.

본 발명의 융합 단백질은 전체 화장료 조성물의 중량 대비 0.0001 내지 50 중량%로 포함될 수 있다. 상기 융합 단백질의 함량이 전체 화장료 조성물의 중량 대비 0.0001 중량% 미만일 경우에는 실질적인 피부개선 효과를 기대하기 어렵고, 50 중량% 이상일 경우에는 제형이 불안정해지는 등의 문제가 발생할 수 있다.The fusion protein of the present invention may be contained in an amount of 0.0001 to 50% by weight based on the weight of the whole cosmetic composition. When the content of the fusion protein is less than 0.0001% by weight of the total cosmetic composition, it is difficult to substantially improve the skin. If the content of the fusion protein is more than 50% by weight, the formulation may become unstable.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 용액, 외용연고, 크림, 폼, 영양화장수, 유연화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린크림, 선오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패치 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The cosmetic composition according to the present invention can be used as a cosmetic composition in the form of a solution, an ointment for external use, a cream, a foam, a nutritional lotion, a softening water, a pack, a soft water, an emulsion, a makeup base, But are not limited to, those selected from the group consisting of emulsions, pastes, gels, lotions, powders, soaps, surfactant-containing cleansing, oils, powder foundations, emulsion foundations, wax foundations, patches and sprays Do not.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In addition, the cosmetic composition of the present invention may further comprise at least one cosmetically acceptable carrier to be incorporated in a general skin cosmetic composition, and examples thereof include oil, water, a surfactant, a moisturizer, A thickener, a chelating agent, a coloring matter, an antiseptic, a flavoring, and the like may be appropriately compounded, but the present invention is not limited thereto.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 제형에 따라 다양하다.The cosmetically acceptable carrier to be contained in the cosmetic composition of the present invention varies depending on the formulations.

본 발명의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있다.When the formulation of the present invention is an ointment, a paste, a cream or a gel, the carrier component may be an animal oil, a vegetable oil, a wax, a paraffin, a starch, a tracer, a cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc, zinc oxide Mixtures of these may be used.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있다.When the formulation of the present invention is a powder or a spray, lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate, polyamide powder or a mixture thereof may be used as the carrier component, Propellants such as fluorohydrocarbons, propane / butane or dimethyl ether.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일이 이용될 수 있으며, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.When the formulation of the present invention is a solution or emulsion, a solvent, a dissolving agent or an emulsifying agent is used as a carrier component, and examples thereof include water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, 1,3-butyl glycol oil may be used, in particular fatty acid esters of cottonseed oil, peanut oil, corn oil, olive oil, castor oil and sesame oil, glycerol aliphatic esters, polyethylene glycols or sorbitan may be used have.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.When the formulation of the present invention is a suspension, a carrier such as water, a liquid diluent such as ethanol or propylene glycol, a suspension such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester, Crystalline cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar or tracant, etc. may be used.

본 발명의 제형이 비누인 경우에는 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알콜, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있다.When the formulation of the present invention is a soap, an alkali metal salt of a fatty acid, a fatty acid hemiester salt, a fatty acid protein hydrolizate, isethionate, a lanolin derivative, an aliphatic alcohol, a vegetable oil, glycerol, .

본 발명의 또 다른 하나의 양태로서, 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 탈모개선용 화장료 조성물을 제공한다.As another embodiment of the present invention, there is provided a cosmetic composition for improving hair loss comprising the fusion protein as an active ingredient.

본 발명에서 사용되는 용어 "탈모개선"은, 유전적인 원인, 호르몬 불균형, 사회생활의 정신적 스트레스, 대기오염 노출, 가공 식품의 섭취 등의 다양한 습관과 환경적 영향으로 인하여 정상적으로 모발이 존재해야 할 부위에 모발이 없는 상태를 개선하고, 탈모가 진행되는 것을 방지하고 털이 나는 것을 의미한다.As used herein, the term "hair loss improvement" refers to the area where hair normally should be present due to various habits and environmental influences such as genetic causes, hormone imbalance, mental stress of social life, exposure to air pollution, To improve hairless state, to prevent hair loss from progressing, and to be hairy.

구체적인 일실시예에 따르면, 본 발명의 융합 단백질을 처리한 피부 모유두 세포(dermal papilla cell)를 배양하여 Cell Counter Kit-8(Dojindo社)를 이용하여 세포증식 양의 차이를 정량 분석한 결과, 대조군에 비하여 T-Tβ4도 Tβ4와 동등한 수준의 세포증식효능을 가지고 있음을 확인하였다(표 2).According to one specific embodiment, the dermal papilla cells treated with the fusion protein of the present invention were cultured, and the difference in the amount of cell proliferation was quantitatively analyzed using Cell Counter Kit-8 (Dojindo) T-T? 4 had a cell proliferation efficiency equivalent to that of T? 4 (Table 2).

이를 통해, Tβ4에 피부투과 촉진용 펩타이드가 융합되어도 Tβ4의 탈모개선 효능을 그대로 가지고 있음을 알 수 있다.As a result, it can be seen that even when the peptide for skin permeation promotion is fused to T? 4, T? 4 has the effect of improving hair loss.

상기 화장료 조성물은 헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어에센스, 헤어로션, 헤어영양로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어크림, 헤어영양크림, 헤어모이스처크림, 헤어맛사지크림, 헤어왁스, 헤어 에어로졸, 헤어팩, 헤어영양팩, 헤어비누, 헤어클렌징폼, 머릿기름, 모발건조제, 모발보존처리제, 모발염색제, 모발용 웨이브제, 모발탈색제, 헤어겔, 헤어글레이즈, 헤어드레싱어, 헤어래커, 헤어모이스처라이저, 헤어무스 또는 헤어스프레이의 제형으로 포함될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. The cosmetic composition may be at least one selected from the group consisting of hair tonic, hair conditioner, hair essence, hair lotion, hair nourishing lotion, hair shampoo, hair conditioner, hair treatment, hair cream, hair nourishing cream, hair moisturizing cream, Hair shampoo, hair shampoo, hair shampoo, hair shampoo, hair shampoo, hair shampoo, hair soap, hair cleansing foam, hair oil, hair drying agent, hair preservative, hair dye, A hair mousse or a hair spray.

구체적으로, 본 발명의 조성물은 모발 또는 두피에 직접 도포 또는 산포하는 등의 방법에 의해 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물이 적용되는 모발이란, 머리의 모근 및 모낭, 머리카락 및 속눈썹과 겉눈썹, 수염, 겨드랑이, 음모, 신체 전반에 모근 및 모낭이 있는 모든 부위를 포함한다.Specifically, the composition of the present invention can be used by a method of directly applying or dispersing the hair or scalp. The hair to which the composition of the present invention is applied includes hair follicles and hair follicles, hair and eyelashes and eyelashes, beard, armpits, pubic hair, hair follicles and hair follicles.

본 발명의 또 다른 하나의 양태로서, 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 의약외품 조성물을 제공한다.As another embodiment of the present invention, there is provided a quasi-drug composition for skin improvement comprising the fusion protein as an active ingredient.

또한, 구체적으로, 본 발명의 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선 또는 피부 탄력 증진용 의약외품 조성물을 제공할 수 있다.Specifically, a quasi-drug composition for improving skin wrinkles or skin elasticity comprising the fusion protein of the present invention as an active ingredient can be provided.

본 발명의 또 다른 하나의 양태로서, 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 탈모개선용 의약외품 조성물을 제공한다.As another embodiment of the present invention, there is provided a quasi-drug composition for improving hair loss comprising the fusion protein as an active ingredient.

상기 용어 융합 단백질, 피부 주름 개선, 피부 탄력 증진 및 탈모개선은 상기에서 설명한 바와 같다. The term fusion protein, skin wrinkle improvement, skin elasticity improvement and hair loss improvement are as described above.

본 발명의 의약외품 조성물에는 상기 성분 외에 필요에 따라 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더욱 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제는 본 발명의 효과를 해하지 않는 한 제한되지 않으며, 예를 들어 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 윤활제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.The quasi-drug composition of the present invention may further contain a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent as necessary in addition to the above components. The pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent is not limited as long as the effect of the present invention is not impaired, and examples thereof include fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, surfactants, lubricants, sweeteners, .

본 발명의 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제의 대표적인 예로는, 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 젤라틴, 글리세린, 아카시아 고무, 알지네이트, 칼슘포스페이트, 칼슘카보네이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 식물성 오일, 주사가능한 에스테르, 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우리지 등을 들 수 있다.Representative examples of the pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent of the present invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, maltitol, starch, gelatin, glycerin, acacia rubber, alginate, calcium phosphate, calcium Methyl cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as sodium carboxymethylcellulose, , Injectable ester, witepsol, macrogol, tween 61, cacao paper, and laurie paper.

또한, 본 발명의 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물을 의약외품으로 사용하는 경우, 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 예컨대, 피부 손상 방어, 탄력 증진, 주름 개선 및 보습 성분을 포함할 수 있을 것이다. 상기 성분 추가 시에는 복합 사용에 따른 피부 안전성, 제형화의 용이성, 유효성분들의 안정성을 고려할 수 있다. 상기 의약외품 조성물은 당업계에 공지된 미백 성분으로서, 코직산(Kojic acid), 알부틴(Arbutin) 등과 같은 티로시나제 효소활성을 억제하는 물질, 하이드로퀴논(Hydroquinone), 비타민-C(L-Ascorbic acid); 당업계에 공지된 피부 탄력, 주름 개선 또는 보습 성분으로서, 레티노산, TGF, 동물 태반 유래의 단백질, 베툴린산 및 클로렐라 추출물; 및 이들의 유도체와 각종 식물 추출물로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 추가 성분은 전체 조성물 중량에 대하여 0.0001 중량% 내지 5 중량%로 포함될 수 있을 것이며, 상기 함량 범위는 피부 안전성, 용이성 등의 요건에 따라 조절될 수 있을 것이다.When the composition containing the fusion protein of the present invention as an active ingredient is used as a quasi-drug, it may further contain one or more active ingredients exhibiting the same or similar functions. For example, it may include skin barrier protection, elasticity enhancement, wrinkle enhancement, and moisturizing ingredients. When the above ingredients are added, skin safety, easiness of formulation, and stability of effective ingredients can be considered according to the combined use. The quasi-drug composition is a whitening ingredient known in the art, and includes a substance inhibiting tyrosinase enzyme activity such as kojic acid and arbutin, hydroquinone, L-ascorbic acid; Retinoic acid, TGF, proteins from animal placenta, betulinic acid and chlorella extract, as skin elasticity, wrinkle or moisturizing ingredients known in the art; And derivatives thereof, and various plant extracts. ≪ Desc / Clms Page number 2 > The additional ingredient may be included in an amount of 0.0001% to 5% by weight based on the total weight of the composition, and the content range may be adjusted according to requirements such as skin safety, ease of use and the like.

본 발명의 의약외품 조성물은 소독 청결제, 샤워폼, 연고액, 물티슈, 코팅제 등을 예시할 수 있으나 이에 제한되는 것이 아니며, 의약외품의 제제화 방법, 용량, 이용방법, 구성성분 등은 기술분야에 공지된 통상의 기술로부터 적절히 선택될 수 있다.The quasi-drug composition of the present invention can be exemplified by a disinfectant cleaner, a shower foam, a softener solution, a wet tissue, a coating agent, and the like. The formulation method, dosage, usage method, And the like.

또한, 본 발명의 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 의약외품 조성물은 개체의 피부에 도포하는 단계를 포함하는, 피부 탄력 증진, 피부 주름 개선용, 또는 탈모개선에 사용될 수 있다. 상기 개체는 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물을 제한 없이 포함한다.In addition, the quasi-drug composition comprising the fusion protein of the present invention as an active ingredient can be used for skin elasticity enhancement, skin wrinkle improvement, or hair loss improvement, including a step of applying to the skin of an individual. The subject includes, without limitation, mammals including rats, livestock, humans, and the like.

본 발명의 융합 단백질은 Tβ4에 피부투과 촉진용 펩타이드가 결합되어, 주름개선 등의 유용한 효과를 나타내는 펩타이드의 능력이 유지 또는 향상되면서도, 동시에 피부투과성과 피부 잔류성을 현저하게 향상시키므로, 피부개선용 화장료 조성물, 탈모개선용 화장료 조성물, 피부개선용 의약외품 조성물 또는 탈모개선용 의약외품 조성물의 유효성분으로서 널리 활용될 수 있을 것이다.The fusion protein of the present invention binds T? 4 with a peptide for promoting skin permeation, thereby maintaining or improving the ability of the peptide to exhibit useful effects such as wrinkle improvement, and at the same time, significantly improving skin permeability and skin retention, A composition for improving hair loss, a quasi-drug composition for skin improvement, or a quasi-drug composition for hair loss improvement.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples and Experimental Examples. However, these examples and experimental examples are intended to illustrate the present invention, and the scope of the present invention is not limited to these examples and experimental examples.

실시예Example 1: 피부투과 촉진용  1: For skin permeation promotion 펩타이드의Of peptide 선별 Selection

피부투과 촉진용 펩타이드를 선별하기 위해서 파지 라이브러리와 경피제제의 용출 실험 방법을 조합한, 파지 디스플레이 방법을 수행하였다.In order to select peptides for skin permeation promotion, a phage display method was performed in which a phage library and a dissolution test method of a transdermal preparation were combined.

먼저, 1% BSA를 포함하는 TBS(50mM Tris pH 7.5, 150mM NaCl) 용액 500μL Ph.D-12 파지 라이브러리 키트(New England Biolab)로부터 유래된 109개의 파지를 가하여 파지용액을 수득하였다.First, 10 9 phages derived from 500 μL Ph.D-12 phage library kit (New England Biolab) solution of TBS (50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl) containing 1% BSA were added to obtain a phage solution.

다음으로, Franz glass cell(Standard 직경 9mm, Receiver 5mL, Permgear)의 상단과 하단 사이에 돼지 피부(0.7mm 두께, Medikinetics)를 장착한 뒤 상단에 상기 파지 용액을 가하고, 16시간 동안 반응시킨 다음, 상기 돼지 피부를 투과하여 하단의 수용부(Receiver)에 도달된 파지를 수득하고, 이를 증폭시켰다.Next, pig skin (0.7 mm thick, Medikinetics) was mounted between the upper and lower ends of a Franz glass cell (standard diameter 9 mm, Receiver 5 mL, Permgear), and the phage solution was added to the upper end thereof. A phage permeating the pig skin and reaching the lower receiver was obtained and amplified.

상기 증폭은 숙주세포로서 E.coli ER2738(New England Biolab)을 이용하여 수행되었다. 구체적으로, 25mL의 LB 배지에 진탕 배양된 대장균 ER2738 균주에 상기 파지용액 5mL를 가하고 4시간 동안 배양하였다. 이어, 상기 배양액을 8,000G로 원심 분리하여 파지분획이 포함된 상층액을 수득하였다. 상기 상층액에 6mL의 침전액(20% PEG6000, 2.5M NaCl)을 처리하여 반응시켜서 파지를 침전시키고, 상기 반응액을 8,000G로 원심 분리하여 파지를 침전시켰으며, 상기 침전물을 TBS 용액에 현탁시켜서 증폭된 파지용액을 수득하였다.The amplification was performed using E. coli ER2738 (New England Biolab) as a host cell. Specifically, 5 mL of the phage solution was added to E. coli ER2738 strain shake cultured in 25 mL of LB medium and cultured for 4 hours. Then, the culture was centrifuged at 8,000 G to obtain a supernatant containing the phage fraction. The supernatant was treated with 6 mL of sediment (20% PEG6000, 2.5M NaCl) and allowed to react to precipitate the phage. The reaction solution was centrifuged at 8,000 G to precipitate the phage. The precipitate was suspended in TBS solution To obtain an amplified phage solution.

이처럼, 돼지 피부에 파지를 가하여 피부를 투과시킨 파지를 수득하고, 이를 증폭시키는 과정을 1회 진행하는 것을 1 Round라고 정의하였으며, 1 Round에서 증폭된 파지를 가지고 다시 2 Round를 진행하여 피부 투과력을 경쟁하는 방식으로 피부 투과력이 좋은 파지를 선별하였고, 총 3 Round를 수행하였다. As described above, it is defined as 1 Round that the process of amplifying the phage obtained by passing the skin through the skin by applying the phage to the pig skin is carried out once, and 2 rounds are carried out again with the phage amplified in the 1 round, In order to compete with each other, phages with good permeability were selected and 3 rounds were performed.

상기 3 Round 수행 결과 최종적으로 얻어진 파지에 포함된 펩타이드의 서열을 확인하기 위하여, 상기 파지를 포함하는 TBS 용액을 대장균 ER2738 균주에 가하여 현탁시키고, 상기 현탁액에 TOP agar를 가하여 혼합한 다음, 상기 혼합물을 LB/X-gal/IPTG 평판배지의 상단에 가하여 고형화시켰다. 그런 다음, 고형화된 배지를 16시간 동안 배양한 후, 청색의 콜로니(colony)를 선별하였다. 상기 선별된 콜로니로부터 유래된 균주를 6시간 동안 배양하고, 이로부터 DNA를 수득하여 파지로부터 유래된 염기서열을 분석함으로써, 돼지 피부를 투과하는 특성을 나타내는 피부투과 촉진용 펩타이드(서열번호 1)를 선별하였다.In order to confirm the sequence of the peptide contained in the phage finally obtained as a result of the 3 round, the TBS solution containing the phage was added to E. coli strain ER2738 to suspend, TOP agar was added to the suspension, LB / X-gal / IPTG plate media. Then, the solidified medium was cultured for 16 hours, and a blue colony was selected. The strain derived from the selected colonies was cultured for 6 hours, DNA was obtained therefrom, and the base sequence derived from the phage was analyzed to obtain a skin permeation promoting peptide (SEQ ID NO: 1) exhibiting the property of penetrating pig skin Respectively.

실시예Example 2:  2: 티모신Thymosin 베타 4( Beta 4 ( Tβ4T? 4 )에 피부투과 촉진용 ) For skin permeation promotion 펩타이드가The peptide 결합된Combined 융합 단백질의 제조 Preparation of fusion protein

상기 실시예 1에서 수득한 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 피부투과 촉진용 펩타이드의 C-말단과 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 티모신 베타 4(Tβ4)의 N-말단이 두 개의 아미노산(GG)으로 구성된 링커를 매개로 연결된 형태의 융합 단백질인 T-Tβ4(서열번호 3)를 생산하였다.The N-terminus of thymosin beta 4 (T? 4) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and the C-terminal of the peptide for skin permeation promotion having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 obtained in Example 1 was replaced with two amino acids ), A fusion protein of T-T? 4 (SEQ ID NO: 3).

구체적으로, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 각각 합성하고, 두 개의 아미노산(GG)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 중심으로 연결시켜서, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제작하였다. 상기 수득한 폴리뉴클레오티드를 pPIC 발현 벡터에 도입하여 발현벡터를 제작하였다.Specifically, a polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 are synthesized, and a nucleotide sequence encoding two amino acids (GG) is linked at the center A polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 was prepared. The obtained polynucleotide was introduced into a pPIC expression vector to prepare an expression vector.

상기 제작된 발현벡터를 Pichia pastoris에 도입하여 형질전환체를 수득하고, 상기 수득한 형질전환체를 배양한 다음, 배양액을 여과하여 피부투과 촉진용 펩타이드-VEGF로 구성된 융합 단백질을 회수 하였다. GPC 컬럼 크로마토그래피에 적용함으로써, 최종적으로 피부투과 촉진용 펩타이드-Tβ4로 구성된 융합 단백질인 T-Tβ4(서열번호 3)를 생산하였다.The prepared expression vector was transformed into Pichia pastoris by introducing the obtained transformants, and the thus obtained culture a transformant, and then, the culture was filtered to recover the fusion protein consisting of a peptide for facilitating skin penetration -VEGF. GPC column chromatography to finally produce T-T? 4 (SEQ ID NO: 3), a fusion protein composed of peptide-T? 4 for skin permeation promotion.

실시예Example 3: 융합 단백질의 효과검증 3: Verification of effect of fusion protein

상기 실시예 2에서 제조한 T-Tβ4의 피부 개선 용도를 확인하기 위하여 하기와 같이 피부 탄력 개선, 피부 주름 개선, 탈모 개선, 피부 투과성 및 피부 잔류성 효과를 확인하는 실험을 수행하였다.In order to confirm the skin improvement application of T-T? 4 prepared in Example 2, experiments were conducted to confirm skin elasticity improvement, skin wrinkle improvement, hair loss improvement, skin permeability and skin residual effect as described below.

실험예Experimental Example 3-1: 내피세포 증식 효능 검정 3-1: Endothelial cell proliferation assay

상기 실시예 2에서 합성된 T-Tβ4를 Tβ4와 비교하여 내피세포 증식에 미치는 효과를 검증하였다.T-T? 4 synthesized in Example 2 was compared with T? 4 to verify the effect on endothelial cell proliferation.

구체적으로, 제대정맥 내피세포(Human Umbilical Vein Endothelial Cell)를 96웰 플레이트에 접종하고 24시간 동안 배양하여 웰(well)당 5,000개의 세포수를 나타내는 배양물을 수득하였다. 상기 배양물을 PBS로 세척 후에 무혈청 M199 배지에서 16시간 배양하였다. 다시 PBS로 세척을 한 후, 100ng/ml의 T-Tβ4 또는 Tβ4가 포함되어 있는 무혈청 M199 배지에서 1일간 배양하였다. 배양물을 수득하고 Cell Counter Kit-8(Dojindo社)를 이용하여 세포증식 량의 차이를 정량 분석하였다. 이때 대조군으로는 T-Tβ4 또는 Tβ4가 포함되지 않은 무혈청 M199 배지에서 배양한 결과물을 사용하였다(표 1).Specifically, a human Umbilical Vein Endothelial Cell was inoculated into a 96-well plate and cultured for 24 hours to obtain a culture showing 5,000 cells per well. The cultures were washed with PBS and then cultured in serum-free M199 medium for 16 hours. After washing with PBS, the cells were cultured in serum-free M199 medium containing 100 ng / ml of T-T? 4 or T? 4 for 1 day. Cultures were obtained and quantified by Cell Counter Kit-8 (Dojindo). As a control, the results of culturing in serum-free M199 medium containing no T-T? 4 or T? 4 were used (Table 1).

내피세포증식에 미치는 융합 단백질의 효과Effects of Fusion Proteins on Endothelial Cell Proliferation 처리단백질Treated protein 증식 수준(%)Growth level (%) 대조군Control group 100 ± 11100 ± 11 Tβ4T? 4 180 ± 8180 ± 8 T-Tβ4T-T? 4 165 ± 17165 ± 17

상기 표 1에 나타난 바와 같이, Tβ4에 피부투과 촉진용 펩타이드가 융합된 T-Tβ4도 Tβ4와 동등한 수준의 세포증식효능을 가지고 있음을 확인하였다.As shown in Table 1, it was confirmed that T-T? 4, in which T? 4 fused with a peptide for promoting skin permeation, had cell proliferation efficiency equivalent to T? 4.

이를 통해, Tβ4에 피부투과 촉진용 펩타이드가 융합되어도 Tβ4의 피부주름 및 탄력 개선 효능을 그대로 가지고 있음을 알 수 있다.As a result, it can be seen that even if the peptide for skin permeation promotion is fused to T? 4, the skin wrinkle and the elasticity improving effect of T? 4 remain intact.

실시예Example 3-2:  3-2: 모낭줄기세포증식Follicular stem cell proliferation 효능 검증 Efficacy verification

상기 실시예 2에서 합성된 T-Tβ4를 Tβ4와 비교하여 피부세포 증식에 미치는 효과를 검증하였다.T-T? 4 synthesized in Example 2 was compared with T? 4 to verify the effect on skin cell proliferation.

구체적으로, 피부 모유두 세포(dermal papilla cell)를 96웰 플레이트에 접종하고 24시간 동안 배양하여 웰(well)당 6,000개의 세포수를 나타내는 배양물을 수득하였다. 상기 배양물을 PBS로 세척 후에 무혈청 DMEM 배지에서 1일간 배양하였다. 다시 PBS로 세척을 한 후, 10ng/ml의 T-Tβ4 또는 Tβ4가 포함되어 있는 무혈청 DMEM 배지에서 1일간 배양하였다. 배양물을 수득하고 Cell Counter Kit-8 (Dojindo社)를 이용하여 세포증식 양의 차이를 정량 분석하였다. 이때 대조군으로는 T-Tβ4 또는 Tβ4가 포함되지 않은 무혈청 DMEM 배지에서 배양한 결과물을 사용하였다(표 2).Specifically, dermal papilla cells were inoculated into 96-well plates and cultured for 24 hours to obtain cultures representing 6,000 cells per well. The cultures were washed with PBS and then cultured in serum-free DMEM medium for 1 day. After washing with PBS, the cells were cultured in serum-free DMEM medium containing 10 ng / ml of T-T? 4 or T? 4 for 1 day. The culture was obtained, and the difference in the amount of cell proliferation was quantitatively analyzed using Cell Counter Kit-8 (Dojindo). Serum cultures in serum-free DMEM medium without T-T? 4 or T? 4 were used as a control (Table 2).

모낭줄기세포증식에 미치는 융합 단백질의 효과Effects of Fusion Proteins on Follicular Stem Cell Proliferation 처리단백질Treated protein 증식 수준(%)Growth level (%) 대조군Control group 100 ± 23 100 ± 23 Tβ4T? 4 260 ± 20 260 ± 20 T-Tβ4T-T? 4 220 ± 16 220 ± 16

상기 표 2에 나타난 바와 같이, Tβ4에 피부투과 촉진용 펩타이드가 융합된 T-Tβ4도 Tβ4와 동등한 수준의 세포증식효능을 가지고 있음을 확인하였다.As shown in Table 2, it was confirmed that T-T? 4, in which T? 4 fused with a skin permeation enhancing peptide, also had cell proliferation efficiency equivalent to T? 4.

이를 통해, Tβ4에 피부투과 촉진용 펩타이드가 융합되어도 Tβ4의 탈모개선 효능을 그대로 가지고 있음을 알 수 있다.As a result, it can be seen that even when the peptide for skin permeation promotion is fused to T? 4, T? 4 has the effect of improving hair loss.

실시예Example 3-3: 피부투과성 검증 3-3: Verification of skin permeability

상기 실시예 2에서 합성된 융합 단백질 T-Tβ4를 Tβ4와 비교하여 피부투과성을 검증하였다.The skin permeability was verified by comparing the fusion protein T-T? 4 synthesized in Example 2 with T? 4.

구체적으로, Franz glass cell(Standard 직경 9mm, Receiver 5ml, Permegear)의 상단과 하단 사이에 돼지 피부(0.7mm 두께, Medikinetics)를 장착하고, 1% BSA와 0.01% 트윈 20을 포함하는 TBS(50mM Tris pH 7.5, 150mM NaCl)를 준비한 다음, 상기 Glass cell의 상단(Donor chamber)에는 TBS를 500㎕ 가하고, 상기 Glass cell의 하단(Receiver chamber)에는 TBS를 5㎖ 가하였다. 이어, 2㎍의 Tβ4 또는 T-Tβ4를 상단에 가하고, 16시간 동안 반응시킨 후, 하단에 존재하는 Tβ4 또는 T-Tβ4의 농도를 ELISA kit(R&D Systems社)를 이용하여 정량분석하고, Tβ4의 함량에 대한 T-Tβ4의 양의 상대적인 함량을 투과량으로 산출하였다(표 3).Specifically, pig skin (0.7 mm thick, Medikinetics) was mounted between the top and bottom of a Franz glass cell (Standard diameter 9 mm, Receiver 5 ml, Permegear), and TBS (50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl) was prepared. To the top of the glass cell, 500 μl of TBS was added to the donor chamber, and 5 ml of TBS was added to the bottom of the glass cell (receiver chamber). Subsequently, 2 μg of Tβ4 or T-Tβ4 was added to the top and allowed to react for 16 hours. The concentration of Tβ4 or T-Tβ4 present at the bottom was quantitatively analyzed using an ELISA kit (R & D Systems) The relative content of the amount of T-T? 4 to the content was calculated as the amount of permeation (Table 3).

융합 단백질의 피부투과성Skin permeability of fusion protein 처리단백질Treated protein 투과량(%)Permeability (%) Tβ4T? 4 100 ± 21100 ± 21 T-Tβ4T-T? 4 310 ± 28310 ± 28

상기 표 3에 나타나 바와 같이, T-Tβ4의 경우 Tβ4보다 피부투과성이 약 3배 증가함을 확인하였다.As shown in Table 3, it was confirmed that the skin permeability of T-T? 4 was about three times higher than that of T? 4.

이를 통해, 본 발명의 융합 단백질을 사용하면 피부투과성이 현저하게 증가함을 알 수 있다.Thus, it can be seen that the skin permeability is remarkably increased when the fusion protein of the present invention is used.

실시예Example 3-4: 피부잔류성 검증 3-4: Verification of skin persistence

상기 실시예 2에서 합성된 융합 단백질 T-Tβ4를 Tβ4와 비교하여 피부잔류성을 검증하였다.The skin persistence was verified by comparing the fusion protein T-T? 4 synthesized in Example 2 with T? 4.

구체적으로, 실시예 3-3에서 실험 후 남은 돼지피부를 회수한 다음, 액체질소 냉동 후 분쇄하였으며, 이에 포함된 Tβ4 또는 T-Tβ4의 함량을 ELISA kit(R&D Systems社)를 이용하여 정량분석하였다. 또한, Tβ4의 함량에 대한 T-Tβ4의 양의 상대적인 함량을 잔류량으로 산출하였다(표 4).Specifically, the pig skin remaining after the experiment in Example 3-3 was recovered, and after liquid nitrogen freezing and pulverization, the content of T? 4 or T-T? 4 contained therein was quantitatively analyzed using an ELISA kit (R & D Systems) . In addition, the relative content of the amount of T-T? 4 to the content of T? 4 was calculated as the residual amount (Table 4).

융합 단백질의 피부잔류성Skin persistence of fusion protein 처리단백질Treated protein 잔류량(%)Residual amount (%) Tβ4T? 4 100 ± 17100 ± 17 T-Tβ4T-T? 4 9,600 ± 4509,600 ± 450

상기 표 4에 나타나 바와 같이, T-Tβ4의 경우 Tβ4보다 피부잔류성이 약 100배 증가함을 확인하였다.As shown in Table 4, it was confirmed that T-T? 4 increased skin retention 100 times more than T? 4.

이를 통해, 본 발명의 융합 단백질을 사용하면 피부잔류성이 현저하게 증가함을 알 수 있다. Thus, it can be seen that skin retention remarkably increases when the fusion protein of the present invention is used.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.From the above description, it will be understood by those skilled in the art that the present invention may be embodied in other specific forms without departing from the spirit or essential characteristics thereof. In this regard, it should be understood that the above-described embodiments are to be considered in all respects as illustrative and not restrictive. The scope of the present invention should be construed as being included in the scope of the present invention without departing from the scope of the present invention as defined by the appended claims.

<110> LG HOUSEHOLD & HEALTH CARE LTD. <120> Cosmetic composition for skin care comprising fusion protein with T beta 4 <130> KPA170153-KR <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptides for skin permeation promotion <400> 1 Asn Gly Ser Leu Asn Thr His Leu Ala Pro Ile Leu 1 5 10 <210> 2 <211> 43 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Human T beta 4 <400> 2 Ser Asp Lys Pro Asp Met Ala Glu Ile Glu Lys Phe Asp Lys Ser Lys 1 5 10 15 Leu Lys Lys Thr Glu Thr Gln Glu Lys Asn Pro Leu Pro Ser Lys Glu 20 25 30 Thr Ile Glu Gln Glu Lys Gln Ala Gly Glu Ser 35 40 <210> 3 <211> 57 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein of T-T beta 4 <400> 3 Asn Gly Ser Leu Asn Thr His Leu Ala Pro Ile Leu Gly Gly Ser Asp 1 5 10 15 Lys Pro Asp Met Ala Glu Ile Glu Lys Phe Asp Lys Ser Lys Leu Lys 20 25 30 Lys Thr Glu Thr Gln Glu Lys Asn Pro Leu Pro Ser Lys Glu Thr Ile 35 40 45 Glu Gln Glu Lys Gln Ala Gly Glu Ser 50 55 <210> 4 <211> 174 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T-T beta 4 <400> 4 aatggttcat tgaacacaca tttggcccca attcttggag gttccgacaa gcctgatatg 60 gcagagattg aaaaattcga caaatctaag ttgaaaaaaa ctgaaaccca agagaagaac 120 cccctgccat ctaaggaaac tatcgagcaa gagaagcagg ctggtgaaag ttaa 174 <110> LG HOUSEHOLD & HEALTH CARE LTD. <120> Cosmetic composition for skin care containing fusion protein with          T beta 4 <130> KPA170153-KR <160> 4 <170> KoPatentin 3.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptides for skin permeation promotion <400> 1 Asn Gly Ser Leu Asn Thr His Leu Ala Pro Ile Leu   1 5 10 <210> 2 <211> 43 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Human T beta 4 <400> 2 Ser Asp Lys Pro Asp Met Ala Glu Ile Glu Lys Phe Asp Lys Ser Lys   1 5 10 15 Leu Lys Lys Thr Glu Thr Gln Glu Lys Asn Pro Leu Pro Ser Lys Glu              20 25 30 Thr Ile Glu Gln Glu Lys Gln Ala Gly Glu Ser          35 40 <210> 3 <211> 57 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein of T-T beta 4 <400> 3 Asn Gly Ser Leu Asn Thr His Leu Ala Pro Ile Leu Gly Gly Ser Asp   1 5 10 15 Lys Pro Asp Met Ala Glu Ile Glu Lys Phe Asp Lys Ser Lys Leu Lys              20 25 30 Lys Thr Glu Thr Gln Glu Lys Asn Pro Leu Pro Ser Lys Glu Thr Ile          35 40 45 Glu Gln Glu Lys Gln Ala Gly Glu Ser      50 55 <210> 4 <211> 174 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T-T beta 4 <400> 4 aatggttcat tgaacacaca tttggcccca attcttggag gttccgacaa gcctgatatg 60 gcagagattg aaaaattcga caaatctaag ttgaaaaaaa ctgaaaccca agagaagaac 120 cccctgccat ctaaggaaac tatcgagcaa gagaagcagg ctggtgaaag ttaa 174

Claims (11)

서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 피부투과 촉진용 펩타이드가 티모신 베타 4(Tβ4)에 결합된 융합 단백질.
A fusion protein comprising a peptide for promoting skin permeation, which is composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, is bound to thymosin beta 4 (T? 4).
제1항에 있어서,
상기 피부투과 촉진용 펩타이드는 Tβ4의 N-말단에 결합된 것인, 융합 단백질.
The method according to claim 1,
Wherein the skin permeation enhancing peptide is bound to the N-terminus of T? 4.
제1항에 있어서, 상기 Tβ4는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 것인, 융합 단백질.
2. The fusion protein of claim 1, wherein said T? 4 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
제1항에 있어서,
상기 융합 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성되는 것인, 융합 단백질.
The method according to claim 1,
Wherein the fusion protein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
제1항에 있어서,
상기 융합 단백질은 Tβ4의 피부 투과성 및 피부 잔류성이 증대된 것인, 융합 단백질.
The method according to claim 1,
Wherein the fusion protein is enhanced in skin permeability and skin retention of T? 4.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
6. A polynucleotide encoding the fusion protein of any one of claims 1 to 5.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 화장료 조성물.
A cosmetic composition for improving skin comprising the fusion protein of any one of claims 1 to 5 as an active ingredient.
제7항에 있어서, 상기 피부개선은 피부 주름 개선 또는 피부 탄력 증진인 것인, 피부개선용 화장료 조성물.
The cosmetic composition for skin improvement according to claim 7, wherein the skin improvement is skin wrinkle improvement or skin elasticity enhancement.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 탈모개선용 화장료 조성물.
A cosmetic composition for improving hair loss, comprising the fusion protein of any one of claims 1 to 5 as an active ingredient.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 의약외품 조성물.
A quasi-drug composition for improving skin comprising the fusion protein of any one of claims 1 to 5 as an active ingredient.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 탈모개선용 의약외품 조성물.
A quasi-drug composition for improving hair loss comprising the fusion protein of any one of claims 1 to 5 as an active ingredient.
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