KR20190065687A - DEVELOPMENT OF SINGLEPLEX REAL-TIME PCR KIT FOR RAPID DETECTION OF CLOSTRIDIUM PERFRINGENS USING cpa, cpe TARGET GENE - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to a primer set for detecting Clostridium perfringens. Provided is a primer set for Clostridium perfringens detection comprising a primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.

Description

cpa와 cpe 타겟 유전자를 통해 클로스트리디움 퍼프린젠스를 검출할 수 있는 Singleplex Real-Time PCR 키트 개발{DEVELOPMENT OF SINGLEPLEX REAL-TIME PCR KIT FOR RAPID DETECTION OF CLOSTRIDIUM PERFRINGENS USING cpa, cpe TARGET GENE}[0001] The present invention relates to a single complex real-time PCR kit capable of detecting Clostridium perfringens through cpa and cpe target genes.

본 발명은 클로스트리디움 퍼프린젠스 실시간 검출용 프라이머 세트, 및 이를 이용한 클로스트리디움 퍼프린젠스 실시간 검출방법 및 검출키트에 관한 것이다.The present invention relates to a primer set for real-time detection of Clostridium perfringens, a method for real-time detection of Clostridium perfringens using the same, and a detection kit.

식중독은 식품 섭취로 인하여 인체에 유해한 미생물 또는 유독물질에 의하여 발생하였거나 발생한 것으로 판단되는 감염성 질환 또는 독소형 질환을 의미하는 것으로, 주로 발열, 구역질, 구토, 설사, 복통 등의 증세를 동반한다.Food poisoning refers to an infectious disease or toxic disease that is caused or caused by a microorganism or toxic substance harmful to human body due to food intake, and is accompanied by symptoms such as fever, nausea, vomiting, diarrhea and abdominal pain.

식중독은 미생물학적 식중독 및 화학물질에 의한 식중독으로 분류될 수 있다. 미생물학적 식중독은 세균성 식중독, 바이러스성 식중독, 원충성 식중독으로 분류될 수 있고, 화학물질에 의한 식중독은 자연독 식중독, 화학적 식중독으로 분류될 수 있다.Food poisoning can be classified as microbiological food poisoning and chemical food poisoning. Microbiological food poisoning can be classified into bacterial food poisoning, viral food poisoning, and prototype food poisoning. Chemical poisoning can be classified as natural poisoning or chemical poisoning.

독소형 식중독의 주 원인균인 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens) 균은 그람 양성, 운동성이 없는 혐기성의 아포 형성 간균으로 토양, 하천, 하수, 먼지 등 자연환경, 건강한 사람이나 동물의 장관 내 및 식품 등에 널리 존재하며, 특히 아포는 100℃에서 1시간 이상 가열해도 사멸되지 않는 내열성이다. Clostridium perfringens , a major causative agent of poisonous food poisoning, is a gram-positive, non-motile, anaerobic, apo-forming bacterium that occurs in natural environments such as soil, rivers, sewage, and dust, Food and the like. Especially, apo is heat resistance which is not killed even when heated at 100 ° C for 1 hour or more.

클로스트리디움 퍼프린젠스는 의심되는 음식에서 105 cfu/g 이상의 균이 자라거나 대변 검체에서 106 cfu/g 이상의 세균수가 존재하여 포자를 생산하는 과정 중에 만들어지는 독소(Clostridium perfringens enterotoxin, CPE)를 분비함으로써 식중독을 야기한다. Clostridium perfringens enterotoxin (CPE), which is produced during the process of producing spores by the presence of 10 5 cfu / g or more of bacteria in suspect foods or 10 6 cfu / To cause food poisoning.

한편, 최근 기존의 표준배양법과 병용하여 유전자 기반의 검출법인 PCR법(Polymerase Chain Reaction) 및 실시간(real-time) PCR법 등이 여러 분야에 응용되고 있다.Recently, gene-based detection methods such as PCR (Polymerase Chain Reaction) and real-time PCR have been applied to various fields in combination with existing standard culture methods.

클로스트리디움 퍼프린젠스에 의한 감염 여부 및 식품에서의 오염 여부를 신속히 확인하기 위한 진단 방법으로 중합효소 연쇄반응(PCR)법과 같은 분자 생물학적 방법이 이용되고 있으나, 기존의 실시간 PCR 검출키트는 활성이 낮고, 일부 타겟 유전자는 균주의 존재에도 불구하고 활성이 관찰되지 않는 경우가 빈번하였다.Molecular biological methods such as polymerase chain reaction (PCR) have been used as a diagnostic method for quickly detecting infection by Clostridium perfringens and food contamination, but the existing real-time PCR detection kit is active And some target genes frequently showed no activity even in the presence of the strain.

또한 기존의 실시간 중합효소 연쇄반응 검출키트는 가장 널리 사용되는 실시간 PCR 장비인 ABI 7500 및 Bio-Rad CFX Connect에서 동시에 호환이 되지 않는 문제가 있었다.In addition, existing real-time polymerase chain reaction detection kits are not compatible with ABI 7500 and Bio-Rad CFX Connect, which are the most widely used real-time PCR devices.

본 발명자들은 민감도 및 정확도가 개선된 PCR 검출키트를 개발하고자 예의 노력한 결과, 클로스트리디움 퍼프린젠스의 검출에 최적화된 타겟 유전자를 발굴하고 상기 타겟 유전자에 대한 프라이머 서열을 최적화함으로써 미생물 검출 효율을 현저히 개선하고자 하였다.As a result of intensive efforts to develop a PCR detection kit with improved sensitivity and accuracy, the present inventors have found that the target gene optimized for the detection of Clostridium perfringens is optimized and the primer sequence for the target gene is optimized, .

본 발명의 목적은 민감도 및 정확도가 개선된 클로스트리디움 퍼프린젠스 검출용 키트를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a kit for detecting Clostridial perfringens with improved sensitivity and accuracy.

본 발명의 일 측면에 따르면, cpa 또는 cpe 타겟 유전자에 결합하는 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens) 검출용 프라이머 세트가 제공된다.According to one aspect of the present invention, there is provided a primer set for detecting Clostridium perfringens which binds to a cpa or cpe target gene.

일 실시예에 있어서, 상기 cpa에 결합하는 프라이머 세트는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함할 수 있다.In one embodiment, the primer set binding to cpa may comprise a primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.

일 실시예에 있어서, 상기 cpe에 결합하는 프라이머 세트는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함할 수 있다.In one embodiment, the primer set binding to cpe may comprise a primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and a primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 프라이머 세트를 이용하여 중합효소 연쇄반응(Polymerase chain reaction; PCR)을 수행하는 단계;를 포함하는 클로스트리디움 퍼프린젠스 검출방법이 제공된다.According to another aspect of the present invention, there is provided a method for detecting Clostridium perfringens comprising the step of performing a polymerase chain reaction (PCR) using the primer set.

일 실시예에 있어서, 상기 검출방법은 0.001 내지 100 ng/μL 농도의 타겟 DNA를 검출할 수 있다.In one embodiment, the detection method is capable of detecting a target DNA concentration of 0.001 to 100 ng / μL.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 프라이머 세트, 및 PCR 반응 혼합물을 포함하는 클로스트리디움 퍼프린젠스 검출키트가 제공된다.According to another aspect of the present invention, there is provided a Clostridial perfringance detection kit comprising the primer set and the PCR reaction mixture.

일 실시예에 있어서, 상기 PCR 반응 혼합물은 반응완충액, dNTP 및 DNA 중합효소를 포함할 수 있다.In one embodiment, the PCR reaction mixture may comprise reaction buffer, dNTP, and DNA polymerase.

본 발명의 프라이머 세트는 클로스트리디움 퍼프린젠스의 특정 타겟 유전자와 특이적으로 결합하므로 실시간 PCR 검출법에 있어서 유용하게 활용할 수 있다.Since the primer set of the present invention specifically binds to a specific target gene of Clostridium perfringens, it can be usefully used in real-time PCR detection.

특히, 본 발명의 프라이머 세트는 종래 검출키트와 비교하여 민감성 및 정확도가 현저히 우수하다.In particular, the primer set of the present invention is significantly superior in sensitivity and accuracy to the conventional detection kit.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.It should be understood that the effects of the present invention are not limited to the effects described above, but include all effects that can be deduced from the description of the invention or the composition of the invention set forth in the claims.

도 1은 crosscheck PCR 검증을 통해 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트의 특이성을 평가한 것이다.
도 2 및 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트의 민감도를 평가한 것이다.
도 4 및 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트 및 종래 프라이머 세트의 활성을 비교한 것이다.
도 6 내지 9는 Positive control DNA를 통해 양성 대조군을 설정하고 실험의 정확도를 평가한 것이다.Figure 1 shows the specificity of a primer set according to one embodiment of the present invention through crosscheck PCR verification.
Figures 2 and 3 illustrate the sensitivity of a primer set according to one embodiment of the present invention.
Figures 4 and 5 compare the activity of a primer set and a conventional primer set according to one embodiment of the present invention.
FIGS. 6 to 9 show positive control DNA sets and positive evaluation of the experiment.

이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS Hereinafter, the present invention will be described with reference to the accompanying drawings. The present invention may, however, be embodied in many different forms and should not be construed as limited to the embodiments set forth herein.

어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.When an element is referred to as "comprising ", it means that it can include other elements, not excluding other elements unless specifically stated otherwise.

달리 정의되지 않는 한, 분자 생물학, 미생물학, 단백질 정제, 단백질 공학, 및 DNA 서열 분석 및 당업자의 능력 범위 안에서 재조합 DNA 분야에서 흔히 사용되는 통상적인 기술에 의해 수행될 수 있다. 상기 기술들은 당업자에게 알려져 있고, 많은 표준화된 교재 및 참고저서에 기술되어 있다.Unless otherwise defined, can be performed by molecular biology, microbiology, protein purification, protein engineering, and DNA sequencing and routine techniques commonly used in the art of recombinant DNA within the skill of those skilled in the art. These techniques are known to those skilled in the art and are described in many standardized textbooks and references.

본 명세서에 달리 정의되어 있지 않으면, 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업계에 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 가진다. Unless otherwise defined herein, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art.

본 명세서에 포함되는 용어를 포함하는 다양한 과학적 사전이 잘 알려져 있고, 당업계에서 이용가능하다. 본 명세서에 설명된 것과 유사 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 본원의 실행 또는 시험에 사용되는 것으로 발견되나, 몇몇 방법 및 물질이 설명되어 있다. 당업자가 사용하는 맥락에 따라, 다양하게 사용될 수 있기 때문에, 특정 방법학, 프로토콜 및 시약으로 본 발명이 제한되는 것은 아니다. Various scientific dictionaries, including the terms contained herein, are well known and available in the art. Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein are found to be used in the practice or testing of the present application, some methods and materials have been described. It is not intended that the invention be limited to the particular methodology, protocols, and reagents, as they may be used in various ways in accordance with the context in which those skilled in the art use them.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수형은 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면 복수의 대상을 포함한다. 또한, 달리 지시된 바가 없으면, 핵산은 각각 왼쪽에서 오른쪽, 5'에서 3' 방향으로 씌여지고, 아미노산 서열은 왼쪽에서 오른쪽, 아미노에서 카르복실 방향으로 씌여진다. 이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.As used herein, the singular forms include plural objects unless the context clearly dictates otherwise. Also, unless otherwise indicated, nucleic acids are written from left to right, 5 'to 3', amino acid sequences from left to right, amino to carboxyl. Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본 발명의 일 측면에 따르면, cpa 또는 cpe 유전자에 결합하는 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens) 검출용 프라이머 세트가 제공된다.According to one aspect of the present invention, there is provided a primer set for detecting Clostridium perfringens which binds to cpa or cpe gene.

상기 검출용 프라이머 세트는 클로스트리디움 퍼프린젠스의 cpa 또는 cpe 유전자에 특이적으로 결합하여 클로스트리디움 퍼프린젠스를 효과적으로 검출할 수 있으며, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함할 수 있다.The primer set for detection is capable of specifically detecting Clostridium perfringens by specifically binding to the cpa or cpe gene of Clostridium perfringens and comprises a primer comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a primer comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: And a primer consisting of a nucleotide sequence.

상기 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens)는 편성 혐기성균(산소의 존재 하에서는 거의 생육할 수 없는 세균)이다. 상기 클로스트리디움 퍼프린젠스는 인간 혹은 소, 돼지, 염소 등의 여러 동물에게 심각한 질병을 유발할 수 있는 원인균으로 사람의 가스괴저, 패혈증을 비롯한 각종 감염증을 일으키며, 식품 중에서도 증식하여 식중독을 유발할 수 있다.The Clostridium perfringens is a biodegradable anaerobic bacterium (a bacterium that can hardly grow in the presence of oxygen). The Clostridium perfringens cause a serious disease in various animals such as humans, cattle, pigs, and chlorine. It causes various infectious diseases including gas gangrene and sepsis in humans, and it can multiply in foods and cause food poisoning .

상기 프라이머 세트는 클로스트리디움 퍼프린젠스의 cpa 또는 cpe 유전자에 특이적으로 결합하므로 클로스트리디움 퍼프린젠스에 의해 유발되는 다양한 질환의 초기 진단이나 질환의 발병 가능성 판단에 유용하게 사용될 수 있다.Since the primer set specifically binds to the cpa or cpe gene of Clostridium perfringens, it can be usefully used for the early diagnosis of various diseases caused by Clostridium perfringens and the possibility of disease development.

상기 프라이머(primer)는 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 포함하는 짧은 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능할 수 있다.The primer may be a short nucleic acid sequence including a free 3 'hydroxyl group and form a base pair with a template of the complementary nucleic acid, and a strand copy of the nucleic acid template Can be used as a starting point.

상기 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있으며, 표적 미생물에 존재하는 핵산과 혼성화되어 상기 표적 미생물의 특정 유전자를 증폭하는데 사용될 수 있다.The primer can initiate DNA synthesis in the presence of a reagent for polymerization and a different four nucleoside triphosphate at the appropriate buffer solution and temperature and hybridize with the nucleic acid present in the target microorganism to produce a specific gene of the target microorganism Can be used for amplification.

상기 프라이머는 증폭의 효율을 고려하여 바람직하게는 단일쇄일 수 있으며, 디옥시리보뉴클레오타이드(deoxyribonucleotide)일 수 있다.In consideration of the efficiency of amplification, the primer may preferably be a single-stranded or deoxyribonucleotide.

상기 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.The primers may include naturally occurring dNMPs (i.e., dAMP, dGMP, dCMP and dTMP), modified nucleotides or non-natural nucleotides. In addition, the primers may also include ribonucleotides.

상기 프라이머는 골격 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 펩타이드 핵산(PNA)(M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조 릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.The primers include, but are not limited to, skeletal modified nucleotides such as peptide nucleic acid (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365: 566-568 (1993)), phosphorothioate DNA, phosphorodithioate DNA, DNA, amide-linked DNA, MMI-linked DNA, 2'-O-methyl RNA, alpha-DNA and methylphosphonate DNA, sugar modified nucleotides such as 2'-O-methyl RNA, 2'-fluoro 2'-O-alkyl DNA, 2'-O-allyl DNA, 2'-O-alkynyl DNA, hexose DNA, pyranosyl RNA and anhydrohexitol DNA, and a base Nucleotides with modifications such as C-5 substituted pyrimidines wherein the substituents are fluoro, bromo, chloro, iodo-, methyl-, ethyl-, vinyl-, formyl-, ethytyl-, propynyl 7-deazapurines having C-7 substituents (the substituents are fluoro, bromo, chloro, iodo, -, Methyl-, ethyl-, vinyl -, formyl-, alkynyl-, alkenyl-, thiazolyl-, imidazolyl-, pyridyl-), inosine and diaminopurine.

상기 혼성화는 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다.The hybridization means that two single-stranded nucleic acids form a duplex structure by pairing complementary base sequences.

상기 혼성화는 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하는 경우에도 일어날 수 있다. 상기 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 반응 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 제어될 수 있다.The hybridization may occur in a perfect match between single stranded nucleic acid sequences or in the presence of some mismatching bases. The degree of complementarity required for the hybridization may vary depending on the hybridization reaction conditions, and can be controlled by temperature, in particular.

일반적으로, 상기 혼성화 온도가 높으면 완전한 매치일 경우 혼성화가 일어날 가능성이 높으며, 혼성화 온도가 낮으면 일부 미스매치가 존재하더라도 혼성화가 일어날 수 있다.Generally, if the hybridization temperature is high, hybridization is likely to occur when the hybridization is complete, and hybridization may occur if the hybridization temperature is low, even if some mismatch exists.

상기 프라이머 세트는 표적 미생물의 특징적인 유전자에 혼성화될 수 있으며, 시료 내에 목적하는 미생물이 존재하는 경우 중합효소 연쇄반응에 의해 상기 특징적인 유전자의 염기서열이 중폭되므로 상기 증폭된 산물(amplicon)을 통해 상기 미생물의 존부를 판단할 수 있다.The primer set can be hybridized to a characteristic gene of a target microorganism. When a desired microorganism exists in a sample, the base sequence of the characteristic gene is amplified by a polymerase chain reaction, so that the amplified product The presence or absence of the microorganism can be determined.

상기 중합효소 연쇄반응은 당업계에 공지된 통상의 PCR 기기를 사용하여 일반적인 반응 조건에 따라 수행되거나, 또는 일부 변형되어 수행될 수 있다.The PCR may be performed according to the general reaction conditions using a conventional PCR instrument known in the art, or may be carried out with some modifications.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 프라이머 세트를 이용하여 중합효소 연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)을 수행하는 단계;를 포함하는 클로스트리디움 퍼프린젠스 검출방법이 제공된다.According to another aspect of the present invention, there is provided a method for detecting Clostridium perfringens comprising the step of performing a polymerase chain reaction (PCR) using the primer set.

상기 프라이머 세트는 중합효소 연쇄반응을 통해 표적 미생물을 효과적으로 검출할 수 있다.The primer set can effectively detect a target microorganism through a polymerase chain reaction.

상기 “중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)”은 중합효소를 사용하여 핵산을 연쇄적으로 합성하여 개시 핵산물질을 기하급수적으로 증폭하는 방법으로 당업계에 널리 공지된 방법으로, 특정 핵산의 존재 유무를 확인하는 정성분석 PCR, 특정핵산의 양을 측정하는 정량 PCR 및 PCR 과정을 실시간으로 추적하여 정성 및 정량 분석을 가능하게 하는 실시간 PCR을 모두 포함하는 개념이다. 상기 중합효소 연쇄반응은 당업계에 공지된 통상의 PCR 기기를 사용하여 일반적인 PCR 반응 조건에 따라 수행될 수 있거나 또는 일부 변형하여 실시할 수 있다.The above-mentioned " Polymerase Chain Reaction (PCR) " is a method of exponentially amplifying an initiating nucleic acid material by sequentially synthesizing nucleic acids using a polymerase, and is a method well known in the art. This is a concept that includes both qualitative PCR to check for the presence, quantitative PCR to measure the amount of specific nucleic acid, and real-time PCR, which enables real-time tracking and quantitative analysis. The polymerase chain reaction can be performed according to general PCR reaction conditions using a conventional PCR instrument known in the art, or can be carried out with some modifications.

상기 검출방법은 상기 프라이머 세트를 이용하여 각 미생물의 특정 DNA를 증폭시킨 후, 특정 DNA의 증폭 반응을 확인하는 단계를 통해 수행될 수 있으며, 상기 특정 DNA의 증폭여부를 확인하는 단계는 PCR 반응산물이 전기영동 등을 통하여 예상되는 DNA 산물의 크기와 일치하는지를 확인함으로써 수행될 수 있다.The detection method may be performed by amplifying a specific DNA of each microorganism using the primer set and then confirming the amplification reaction of the specific DNA. Can be carried out by confirming whether or not it is consistent with the expected size of the DNA product through electrophoresis or the like.

상기 "증폭 반응"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응이 당업계에 널리 보고되어 있으며, 중합효소 연쇄반응(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오타이드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CPPCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; APPCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop mediated isothermal amplification; LAMP)를 포함하나, 바람직하게는 실시간(real-time) 중합효소 연쇄반응을 통해 수행할 수 있다.The "amplification reaction" means a reaction for amplifying a nucleic acid molecule. A variety of amplification reactions have been extensively reported in the art and have been widely used in the art and include polymerase chain reaction (US Patent Nos. 4,683,195, 4,683,202 and 4,800,159), reverse transcription-polymerase chain reaction (Sambrook et al., Molecular Cloning. (LCR), Gap-LCR (WO 90/01069), the methods of Laplacet et al. (Spring Harbor Press, 2001), Miller, HI (WO 89/06700) and Davey, ), Repair chain reaction (EP 439,182), transcription-mediated amplification (TMA) (WO 88/10315), self sustained sequence replication (WO 90/06995) , Selective amplification of target polynucleotide sequences (U.S. Patent No. 6,410,276), consensus sequence primed polymerase chain reaction (CPPCR) (U.S. Patent No. 4,437,975), selective amplification of target polynucleotide sequences Arbitrary priming polymerase (US Patent 5,413,909 and 5,861, 245), nucleic acid sequence based amplification (NASBA) (U.S. Patent Nos. 5,130,238, 5,409,818, 5,554,517 No. 6,063,603), strand displacement amplification and loop mediated isothermal amplification. LAMP), but can be carried out through a real-time polymerase chain reaction.

상기 실시간 중합효소 연쇄반응은 지수적인 증폭이 일어나는 초기 시료의 양을 형광물질의 지수적 증가가 탐지되기 시작하는 사이클의 수(Cycle threshold)로 나타내므로 더욱 정확한 정량분석이 가능하며 증폭 반응을 실시간으로 분석할 수 있다.The real-time polymerase chain reaction can quantitatively analyze more accurately the amount of the initial sample in which the exponential amplification occurs and the number of cycles at which the exponential increase of the fluorescent substance starts to be detected (cycle threshold) Can be analyzed.

상기 실시간 중합효소 연쇄반응은 전기 영동하여 영상분석기로 강도를 측정하는 단계가 생략되고 형광 광도계 등과 같은 광학 시스템(optical system) 모듈로서 증폭산물의 증폭 정도를 자동화, 수치화시켜 신속하고 정확하게 핵산 증폭 산물을 분석할 수 있다.The real-time polymerase chain reaction is an optical system module, such as a fluorescence photometer, which omits the step of measuring the intensity with an image analyzer by electrophoresis. The amplification degree of the amplification product is automated and quantified, Can be analyzed.

상기 검출방법에 사용되는 주형 DNA의 시료는 상기 클로스트리디움 퍼프린젠스가 발견될 수 있는 모든 물질, 바람직하게는 식품, 사료 및 가검물일 수 있으며, 바람직하게는 식품에서 수득할 수 있다.The sample of the template DNA used in the above detection method may be any substance, preferably food, feed, and sample, from which the Clostridium perfringens can be found, preferably from food.

상기 주형 DNA는 당업계에서 통상적으로 사용되는 DNA 추출방법을 통해 수득할 수 있으며, 예컨대 알카라인 추출법, 열수추출법, 컬럼 추출법 및 페놀/클로로포름 추출법 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The template DNA can be obtained through a DNA extraction method commonly used in the art and can be, for example, an alkaline extraction method, a hot water extraction method, a column extraction method and a phenol / chloroform extraction method, but is not limited thereto.

상기 검출방법은 0.001 내지 100 ng/μL 농도의 타겟 DNA를 검출할 수 있다.The detection method can detect a target DNA having a concentration of 0.001 to 100 ng / μL.

본 발명자들은 표적 유전자 검출을 위한 프라이머 서열을 최적화하였으며, 상기 프라이머 세트는 민감도가 높아 매우 낮은 수준의 타겟 DNA 예컨대, 0.001 ng/μL 농도의 타겟 DNA도 효과적으로 증폭할 수 있다. 이 때, 최소 검출 농도는 35사이클(cycles) 이전에 검출 가능한지 여부로 판단하였다.The present inventors have optimized the primer sequence for target gene detection, and the primer set is highly sensitive and can effectively amplify target DNA of a very low level, for example, 0.001 ng / μL concentration. At this time, it was judged whether or not the minimum detection concentration was detectable before 35 cycles (cycles).

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 프라이머 세트, 및 PCR 반응 혼합물을 포함하는 클로스트리디움 퍼프린젠스 검출키트가 제공된다.According to another aspect of the present invention, there is provided a Clostridial perfringance detection kit comprising the primer set and the PCR reaction mixture.

상기 PCR 반응 혼합물은 반응완충액, dNTP 및 DNA 중합효소를 포함할 수 있으며, 이 기술분야의 통상의 기술자가 PCR 반응에 이용할 수 있는 시약을 모두 포함할 수 있다.The PCR reaction mixture may include a reaction buffer, a dNTP, and a DNA polymerase, and may include all reagents available to a person skilled in the art for PCR reaction.

이하, 첨부된 도면을 참고하여 본 발명의 실시예에 관하여 상세히 서술하나, 하기 실시예에 의해 본 발명이 제한되지 아니함은 자명하다.Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings, but it should be apparent that the present invention is not limited by the following embodiments.

실시예 : singleplex Real-time PCRExamples: singleplex Real-time PCR

실시간 중합효소 연쇄반응은 주형 DNA(40 ng/㎕) 1㎕, 제1프라이머 세트(서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머) 또는 제2프라이머 세트(서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머), 및 프로브 세트 혼합물 2.65㎕, MG 2X qPCR MasterMix (TaqMan) (MGmed, KOR) 10㎕,, 증류수 6.35㎕를 첨가한 후 최종 20㎕가 되도록 반응액을 조제하였다.The real-time PCR was carried out in the same manner as in Example 1, except that 1 占 퐇 of template DNA (40 ng / 占 퐇), a first primer set (primers of SEQ ID NOs: 1 and 2) or a second primer set (SEQ ID NOs: 3 and 4) 2.65 占 퐇 of the probe set mixture, 10 占 퐇 of MG2X qPCR MasterMix (TaqMan) (MGmed, KOR), and 6.35 占 퐇 of distilled water were added thereto, and the reaction solution was adjusted to a final volume of 20 占 퐇.

PCR 반응은 실시간 유전자 증폭장치 7500FAST(ABI, USA)를 사용하여 50℃에서 3분간 반응시켜 PCR 산물의 오염을 제거하한 후 실시간 PCR 증폭을 수행하였다.The PCR reaction was performed by real-time gene amplification device (7500FAST, ABI, USA) at 50 ° C for 3 minutes to remove contamination of the PCR products and to perform real-time PCR amplification.

증폭 반응은 95℃에서 10분간 예비변성(pre-denaturation)을 실시한 후, 95℃에서 15 초간 변성(denaturation), 60℃에서 1분간 결합(annealing)과 연장(extention)을 40 사이클(cycles) 수행하였다.The amplification reaction was pre-denaturation at 95 ° C for 10 minutes, followed by denaturation at 95 ° C for 15 seconds, annealing at 60 ° C for 1 minute, and extension for 40 cycles Respectively.

주형(template)은 클로스트리디움 퍼프린젠스에서 추출한 Genomic DNA를 사용하였으며, 음성대조군(negative control)은 증류수를 사용하여 교차오염을 확인하였다. Genomic DNA extracted from Clostridium perfringens was used as a template, and negative control was checked for cross contamination using distilled water.

대립유전자 구별 그래프(Allelic discrimination plot)와 PCR 증폭 그래프(PCR amplification plot)는 실시간 중합효소 연쇄반응기 7500의 소프트웨어 프로그램(v. 2.0.6)을 사용하여 확인하였다.Allelic discrimination plots and PCR amplification plots were verified using a software program (v. 2.0.6) of a real-time polymerase chain reaction (PCR) 7500.

실험예 1 : 프라이머의 정확성 평가Experimental Example 1: Evaluation of accuracy of primer

균주에 최적화된 신규 타겟 유전자를 선정하여 보다 더 효율적인 검출이 가능하다. 기존 Singleplex 실시간 PCR 키트의 경우 특정 균주를 타겟으로 설정하였음에도 불구하고 다른 균주도 함께 검출되는 사례가 빈번하였다.More efficient detection is possible by selecting a new target gene optimized for the strain. In the case of the existing Singleplex real-time PCR kit, the detection of other strains was frequently performed even though a specific strain was set as a target.

Crosscheck PCR 검증을 통해 타겟 균주 이외의 균주에 대한 활성이 있는지 확인하였으며, 클로스트리디움 퍼프린젠스에만 상기 프라이머가 특이적으로 검출되는지 시험하였다.Through crosscheck PCR verification, it was confirmed whether there was activity against strains other than the target strain, and it was tested whether only the above primer was specifically detected in Clostridium perfringens.

도 1을 참조하면, 좌측 라인에서 상기 제1프라이머 세트 및 제2프라이머 세트가 특이적으로 균주를 검출하였으며, 우측 라인(-)에서 타겟 균주를 제외한 나머지 15 종의 다른 균주에 대한 활성이 나타나지 않았다.Referring to FIG. 1, in the left line, the first primer set and the second primer set specifically detected strains, and the activity on the other 15 strains except the target strains in the right line (-) was not observed .

상기 결과는 cpa 유전자에 특이적으로 결합하는 제1프라이머 세트 및 cpe 유전자에 특이적으로 결합하는 제2프라이머 세트가 클로스트리디움 퍼프린젠스에 특이적인 활성을 가짐을 시사한다.The result is a first primer set which specifically binds to cpa gene and cpe Suggesting that the second primer set that specifically binds to the gene has an activity specific to Clostridium perfringens.

실험예 2 : 프라이머의 민감도 평가Experimental Example 2: Evaluation of sensitivity of primer

상기 제1프라이머 세트 및 제2프라이머 세트의 민감도를 평가하고자, Serial dilution 실험을 진행하였다. 연속 희석법을 통해, 주형 DNA가 검출되는 수준을 평가하였다.Serial dilution experiments were conducted to evaluate the sensitivity of the first primer set and the second primer set. Through serial dilution, the level at which template DNA was detected was assessed.

도 2 및 3을 참조하면, 상기 상기 제1프라이머 세트 및 제2프라이머 세트는 매우 낮은 농도의 주형 DNA를 검출하였으며, 특히, 극미량(0.001ng/μL)의 DNA 주형을 효과적으로 검출하였다.Referring to FIGS. 2 and 3, the first primer set and the second primer set detected a very low concentration of template DNA, and in particular, effectively detected a trace amount of DNA template (0.001 ng / μL).

실험예 3 : 프라이머의 활성도 평가Experimental Example 3: Evaluation of primer activity

종래 실시간 PCR 키트의 경우 활성이 낮아 장시간 실시간 PCR을 수행하였다. In the case of the conventional real-time PCR kit, the activity was low and real-time PCR was performed for a long time.

상기 제1프라이머 세트 및 제2프라이머 세트의 활성을 평가하고자 타사의 프라이머 세트와 활성도를 비교하였다.The activities of the first primer set and the second primer set were compared with those of other companies to evaluate the activity.

도 4 및 5를 참조하면, 본 발명의 프라이머 세트는 타사의 프라이머 세트와 비교하여 활성도가 월등히 높은 수준으로 평가되었으므로, 더욱 신속하고 정확하게 클로스트리디움 퍼프린젠스를 검출할 수 있다.Referring to FIGS. 4 and 5, since the primer set of the present invention is evaluated to have a much higher level of activity than the other primer sets, Clostridium perfringens can be detected more rapidly and accurately.

또한, Positive control DNA를 통해 양성 대조군을 설정하고 정확하게 실험을 진행할 수 있다. 일반적으로 식품 샘플 안에 존재하는 Pathogen을 검출하기 위해 DNA 정제과정을 거치며, 정제과정에서 DNA가 적절하게 정제되지 않을 수 있으므로 양성 대조군을 설정하여 실험 정확도를 담보할 수 있다.Positive control DNA can also be used to set positive controls and conduct experiments accurately. Generally, DNA is purified to detect pathogen present in a food sample, and since the DNA may not be purified properly during the purification process, a positive control group can be set to ensure the accuracy of the experiment.

도 6 내지 9을 참조하면, 본 발명의 프라이머 세트는 양성 대조군에 대한 높은 활성을 나타내었으며, 특히 실시간 PCR 장비인 ABI 7500 및 Bio-Rad CFX Connect에서 모두 우수한 활성이 확인되었다.Referring to FIGS. 6 to 9, the primer set of the present invention showed high activity for the positive control, and particularly excellent activity was confirmed in the real-time PCR equipment ABI 7500 and Bio-Rad CFX Connect.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.It will be understood by those skilled in the art that the foregoing description of the present invention is for illustrative purposes only and that those of ordinary skill in the art can readily understand that various changes and modifications may be made without departing from the spirit or essential characteristics of the present invention. will be. It is therefore to be understood that the above-described embodiments are illustrative in all aspects and not restrictive. For example, each component described as a single entity may be distributed and implemented, and components described as being distributed may also be implemented in a combined form.

본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.The scope of the present invention is defined by the appended claims, and all changes or modifications derived from the meaning and scope of the claims and their equivalents should be construed as being included within the scope of the present invention.

<110> Kyung Hee University <120> DEVELOPMENT OF SINGLEPLEX REAL-TIME PCR KIT FOR RAPID DETECTION OF CLOSTRIDIUM PERFRINGENS USING cpa, cpe TARGET GENE <130> GKH17P-0112-KR <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cpa <400> 1 ttctatcttg gagaggctat gcactatttt 30 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cpa <400> 2 tttcaaactt aacatgtcct gcgc 24 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cpe <400> 3 aactatagga gaacaaaata caatag 26 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cpe <400> 4 tgcataaacc ttataatata catattc 27 <110> Kyung Hee University <120> DEVELOPMENT OF SINGLEPLEX REAL-TIME PCR KIT FOR RAPID DETECTION          OF CLOSTRIDIUM PERFRINGENS USING cpa, cpe TARGET GENE <130> GKH17P-0112-KR <160> 4 <170> KoPatentin 3.0 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cpa <400> 1 ttctatcttg gagaggctat gcactatttt 30 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cpa <400> 2 tttcaaactt aacatgtcct gcgc 24 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cpe <400> 3 aactatagga gaacaaaata caatag 26 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cpe <400> 4 tgcataaacc ttataatata catattc 27

Claims (7)

cpa 또는 cpe 유전자에 결합하는 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens) 검출용 프라이머 세트.A primer set for detection of Clostridium perfringens which binds to cpa or cpe gene. 제1항에 있어서,
상기 cpa에 결합하는 프라이머 세트는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는 클로스트리디움 퍼프린젠스 검출용 프라이머 세트.The method according to claim 1,
Wherein the primer set binding to cpa comprises a primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2. 2. The primer set for detecting Clostridium perfringens according to claim 1, 제1항에 있어서,
상기 cpe에 결합하는 프라이머 세트는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는 클로스트리디움 퍼프린젠스 검출용 프라이머 세트.The method according to claim 1,
Wherein the primer set binding to cpe comprises a primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and a primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4. 제1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 이용하여 중합효소 연쇄반응(Polymerase chain reaction; PCR)을 수행하는 단계;를 포함하는 클로스트리디움 퍼프린젠스 검출방법.A method for detecting Clostridium perfringens comprising the step of performing a polymerase chain reaction (PCR) using the primer set of any one of claims 1 to 3. 제4항에 있어서,
0.001 내지 100 ng/μL 농도의 타겟 DNA를 검출하는 클로스트리디움 퍼프린젠스 검출방법.5. The method of claim 4,
A Clostridial perfringance detection method for detecting a target DNA having a concentration of 0.001 to 100 ng / μL. 제1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 프라이머 세트, 및 PCR 반응 혼합물을 포함하는 클로스트리디움 퍼프린젠스 검출키트.A Clostridial perfringens detection kit comprising the primer set of any one of claims 1 to 3, and a PCR reaction mixture. 제6항에 있어서,
상기 PCR 반응 혼합물은 반응완충액, dNTP 및 DNA 중합효소를 포함하는 클로스트리디움 퍼프린젠스 검출키트.
The method according to claim 6,
Wherein the PCR reaction mixture comprises a reaction buffer, dNTP, and DNA polymerase, in a Clostridium perfringance detection kit.
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