KR20190046931A - Mif 억제제 및 이의 사용 방법 - Google Patents

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테드 엠. 도슨
발리나 엘. 도슨
잉페이 왕
혜진 박
준 리우
한징 펭
Tae-In Kim
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더 존스 홉킨스 유니버시티
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Abstract

본원에는 대식세포 이동 억제 인자(MIF) 뉴클레아제 활성을 억제함으로써, 폴리[ADP-리보오스] 폴리머라아제 1(PARP-1) 활성화의 증가로 인한, 파킨슨병과 같은 질병을 치료하는 방법이 제공된다.

Description

MIF 억제제 및 이의 사용 방법
관련 출원
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e)에 따라 2016년 9월 2일에 출원된 미국가출원번호 제62/383,209호의 이익을 주장하며, 이러한 문헌은 전문이 본원에 참고로 포함된다.
보조금 정보(GRANT INFORMATION)
본 발명은 국립 보건원(National Institutes of Health) 보조금 K99/R00 NS078049, DA000266, R01 NS067525, R37 NS067525, 및 NS38377에 따라 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 갖는다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로, 대식세포 이동 억제 인자(macrophage migration inhibitory factor; MIF), 및 더욱 상세하게, 질병의 치료에서의 MIF 억제제의 용도에 관한 것이다.
폴리(ADP-리보오스)(Poly(ADP-ribose); PAR) 폴리머라아제-1(PARP-1)은 DNA 복구(DNA repair)를 촉진시키는, DNA 손상에 의해 활성화된 중요한 핵 효소(nuclear enzyme)이다(1). PARP-1의 과도한 활성화는 파르타나토스(parthanatos)로 명명되는 내재적 카스파아제-독립 세포사 프로그램을 야기시키며(2,3), 이는 뇌졸중 및 심근 경색 후 허혈-재관류 손상, 염증성 손상, 반응성 산소 종-유발 손상, 글루타메이트 흥분성독성 및 신경퇴행성 질병, 예를 들어, 파킨슨병 및 알츠하이머병(2,4,6)을 포함하는, 여러 장기계(organ system)에서 다수의 독성 손상(toxic insult) 후 중요한 역할을 한다(4,5). PARP-1이 중요한 세포사 매개체라는 사상과 일관되게, PARP 억제제 또는 PARP-1의 유전적 결실은 인간 질병의 이러한 및 다른 세포 손상 패러다임 및 모델에 대해 근본적으로 보호적이다(2,4,5,7).
파르타나토스를 기반으로 하는 분자 메커니즘은 미토콘드리아로부터 PAR-의존 아폽토시스-유발 인자(apoptosis-inducing factor; AIF)가 방출되고 세포핵으로 전위되어 20 내지 50 kb 단편으로의 DNA의 단편화를 야기시킨다는 것을 포함한다(2, 8 내지 11). AIF 자체는 분명한 뉴클레아제 활성을 나타내지 않는다(2). 카에노르하브디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans; C. elegans)에서 엔도뉴클레아제 G(EndoG) 동족체인 CED-3 프로테아제 저해제(CPS)-6이 DNA 퇴화를 증진시키기 위해 웜(worm) AIF 동족체(WAH-1)와 협력한다는 것이 시사되었지만(12), EndoG는 포유동물에서 일과성 국소 대뇌 허혈(transient focal cerebral ischemia) 후 PARP-의존 염색질용해(chromatinolysis) 및 세포사에서 중요한 역할을 하지 않는 것으로 보인다(13). 파르타나토스 동안 염색질용해를 담당하는 뉴클레아제는 알려져 있지 않다.
본 발명은 PARP-1 의존성 AIF-관련 뉴클레아제(PARP-1 dependent AIF-associated nuclease; PAAN)로서 대식세포 이동 억제 인자(MIF)의 동정을 기초로 한 것이다.
일 구체예에서, 본 발명은 대상체에서 폴리[ADP-리보오스] 폴리머라아제 1(PARP-1) 활성화의 증가와 관련된 질병을 치료하는 방법을 제공한다. 본 방법은 대상체에 치료학적 유효량의 대식세포 이동 억제 인자(MIF) 뉴클레아제 활성의 억제제를 투여하여, 질병의 증상을 치료하거나 완화시키는 것을 포함한다.
일 양태에서, 질병은 염증성 질병이다. 다른 양태에서, 염증성 질병은 알츠하이머병, 강직성 척추염, 관절염, 골관절염, 류머티스성 관절염, 건선성 관절염, 천식 아테롬성 동맥경화증, 크론병, 대장염, 피부염 게실염, 섬유근육통, 간염, 과민성 대장 증후군, 전신성 홍반성 루푸스, 신장염, 궤양성 대장염 또는 파킨슨병이다.
일 구체예에서, 억제제는 거대고리 라파퓨신 화합물이고, 예를 들어, 하이브리드 거대고리 라파퓨신 라이브러리로부터의 거대고리 라파퓨신 화합물이다.
본 발명은 또한, 예를 들어, 단일 가닥 아민 개질된 MIF 타겟 DNA를 고정시키는 단계; 이후에, 거대고리 라파퓨신 라이브러리로부터의 화합물과 함께 및 이의 없이 MIF를 인큐베이션하는 단계로서, 단일 가닥 아민 개질된 MIF 타겟 DNA가 단일 가닥 아민 개질된 MIF 타겟 DNA에 대해 상보적인 바이오티닐화된 DNA와 하이브리드화되는 단계; 이후에, 스트렙타비딘 효소 컨쥬게이트와 함께, 이후에 기질과 함께 인큐베이션하는 단계로서, 기질이 스트렙타비딘 효소 컨쥬게이트에 의해 작용되는 단계를 포함하는, 대식세포 이동 억제 인자(MIF) 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 라이브러리 화합물을 갖는 MIF의 흡광도는 화합물이 억제제인지 또는 흡광도의 변화를 기초로 하지 않는 지의 여부를 결정하기 위해 라이브러리 화합물 없는 MIF의 흡광도와 비교된다.
도 1. PARP-1 의존성 세포사를 매개하는 중요한 세포사 이펙터로서의 MIF의 동정. (A) PARP-1 의존성 세포사에 관여된 AIF-관련 단백질을 동정하기 위한 전력. (B) MNNG 처리(50 μM, 15분) 후 24시간 후에 HeLa 세포에서 siRNA-기반 PARP-1-의존성 세포 생존력 고처리량 스크리닝. n=8. 실험은 4회의 독립적인 시험으로 반복되었다. (C) MIF의 PD-D/E(X)K 도메인의 개략적 표현. (D) 인간 MIF 및 다른 뉴클레아제의 뉴클레아제 도메인의 정렬. 서열 위에 있는 화살표는 β-가닥을 지시하며, 직사각형은 α-나선(helix)을 나타낸다. 돌연변이된 아미노산 잔기는 화살표 및 숫자로 지시된다(결과 참조). 뉴클레아제 도메인 및 CxxCxxHx(n)C 도메인은 각각 녹색 및 분홍색으로 강조표시된다. (E) MIF 트라이머(pdb:1GD0)(좌측) 및 트라이머에서 MIF PD-D/E(x)K 모티프(우측)의 결정 구조.
도 2. MIF는 게놈 DNA를 절단하는 신규한 뉴클레아제이다. (A) 기질로서 pcDNA를 사용한 시험관내 MIF 뉴클레아제 검정. (B) EDTA(50 mM)를 갖거나 가지지 않는 Mg2+(10 mM) 또는 EDTA(25 mM)를 갖거나 가지지 않는 Ca2+(2 mM)를 함유한 완충제 중에서 기질로서 인간 게놈 DNA를 사용한 시험관내 펄스-필드 겔 전기영동-MIF 뉴클레아제 검정. (C) DPQ(30 μM) 또는 ISO-1(100 μM)로 처리된 또는 이의 없이 처리된 MIF 결핍 HeLa 세포 및 야생형 HeLa 세포에서의 MNNG-유발 DNA 손상의 펄스-필드 겔 전기영동 검정. (D) 기질로서 인간 게놈 DNA를 사용한 MIF WT 및 돌연변이체의 뉴클레아제 검정.
도 3. MIF는 단일 가닥 DNA를 결합하고 절단한다. (A) ChIP-seq에 의해 결정된 MIF DNA 결합 모티프. (B) MIF는 ssDNA에 결합하지만, 이중 가닥 DNA에 결합하지 않으며, 구조 특이성을 갖는다. 상이한 구조 또는 상이한 서열을 갖는 5' 바이오틴-표지된 작은 DNA 기질은 기질의 예시를 위한 EMSA 검정(도 19) 및 서열을 위해 표 1에서 이용되었다. (C) MIF는 구조 특이성을 갖는 스템 루프 ssDNA의 3' 단부에서 홀염기(unpaired base)를 절단한다. 상이한 구조 또는 상이한 서열을 갖는 5' 또는 3' 바이오틴-표지된 작은 DNA 기질은 기질의 예시를 위한 뉴클레아제 검정(도 19 참조) 및 서열을 위한 표 1에서 사용되었다. 실험은 3회 독립적 제조물로부터 정제된 MIF 단백질을 사용하여 4회 반복되었다. (D) MIF는 비-표지된 PS30 및 3F1 기질로부터 3' 홀염기를 절단한다. 래더(Ladder) 1 및 래더 2는 PS30, 및 이의 3' 뉴클레오티드를 하나씩 제거함에 의한 이의 절단 산물을 사용하여 커스톰화되었다(customized). 래더 1은 PS30, PS28, PS26, PS24, PS22 및 PS20을 사용하여 제조되었다. 래더 2는 PS29, PS27, PS25, PS23 및 PS21을 사용하여 제조되었다. (E) 비-표지된 PS30 및 3F1 기질 상의 MIF 절단 부위.
도 4. AIF는 NMDA 처리 후 세포핵에 대한 MIF의 보충(recruitment)을 위해 요구된다. (A) 고정된 GST-MIF WT 및 AIF에 결합한 GST-MIF 변이체의 GST-풀다운 검정(GST-pulldown assay). (B) MIF WT 및 MIF 변이체의 뉴클레아제 활성 및 AIF-결합 활성. (C-D) 생리학적 및 NMDA 처리 조건 하에서 피질 뉴런에서의 MIF 및 AIF의 동시-면역침전. 별표는 IgG를 지시하는 것이다. (E-G) 야생형, AIF 녹다운 및 MIF 녹다운 피질 뉴런에서 NMDA 처리 후의 AIF 및 MIF의 핵 변위. 후핵 분획(postnuclear fraction; PN) 및 핵 분획(N)에서 AIF 및 MIF 신호의 강도는 G에 나타나 있다. (H) WT 및 KO 뉴런에서의 MIF의 발현. (I) NMDA 처리 후 피질 뉴런에서의 Flag-태그화된 MIF 변이체 및 AIF의 동시-면역침전. (J-L) MIF KO 피질 뉴런에서 NMDA 처리 후 AIF 및 외인성 MIF WT 및 MIF 변이체의 핵 변위. 스케일 바(Scale bar), 20 μm. 후핵 분획(PN) 및 핵 분획(N)에서의 AIF 및 MIF 신호의 강도는 L에 나타나 있다. 평균 ± SEM이 나타난다. 실험은 적어도 3회 반복되었다. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, 스튜던트 테스트(Student's t test)(D) 및 일원분산분석(one-way ANOVA)(G,L).
도 5. MIF 뉴클레아제 활성은 시험관내 및 생체내 DNA 손상 및 허혈성 뉴런 세포사에 대해 중요하다. (A) MIF WT, KO 및 MIF WT, E22Q 또는 E22A를 발현시키는 KO 피질 뉴런에서의 NMDA(500 μM, 5분)-유발 세포독성. (B) MIF WT, KO 및 MIF WT, E22Q 또는 E22A를 발현시키는 KO 뉴런에서 comet 검정에 의해 측정된 처리 후 6시간에 NMDA-유발 DNA 손상의 대표적인 이미지. 점선은 헤드(head) 및 테일(tail)의 중심을 지시하는 것이다. 스케일 바, 20 μm. (C) MIF WT, KO 및 MIF WT, E22Q 또는 E22A를 발현시키는 KO 뉴런에서 처리 후 6시간에 NMDA-유발 DNA 손상의 펄스-필드 겔 전기영동 검정. (D) 45분 MCAO 후 24시간에 MIF WT, KO 및 AAV2-MIF WT, E22Q 또는 E22A가 주사된 KO 마우스의 TTC 염색의 대표적인 이미지. (E) 45분 MCAO후 1일 또는 7일에 피질, 선조체 및 반구에서의 경색 부피의 정량화. (F-G) 신경학적 결손(neurological deficit)은 MCAO 수술 후 1일, 3일 또는 7일에 0 내지 5 스케일에서 오픈 필드(open field)에 의해 평가되었다. WT MCAO(n = 29), KO MCAO(n = 20), KO-WT MCAO(n = 23). KO-E22Q MCAO(n = 22), KO-E22A MCAO(n = 19). 평균 ± SEM은 A, E, F, G에서 나타낸다. *P < 0.05 (E,F), ***P < 0.001 (A, E), 일원분산분석. ***P < 0.001 (G), 상이한 시점에서 WT 대 KO, KO-WT 대 KO-E22Q/KO-E22A, 이원분산분석(two-way ANOVA).
도 6. 거대고리 화합물 라이브러리를 사용한 MIF 억제제 스크리닝의 설정(establishment). 절단 검정(cleavage assay)을 기초로 한 MIF 억제제에 대한 거래고리 스크리닝의 개략적 도식. 단일 가닥 아민-개질 올리고뉴클레오티드(MIF 타겟 DNA)는 DNA-BIND 플레이트 상에 고정되고, 억제제와 함께 또는 억제제 없이 MIF 단백질 중에서 인큐베이션되었다. MIF 절단 후에, 단편은 바이오틴-표지된 상보적 올리고뉴클레오티드와 하이브리드화되고 450 nm에서 흡광도를 모니터링함으로써 검출되었다.
도 7. 거대고리 라파퓨신 라이브러리의 개략적 도식.
도 8. MIF 억제제에 대한 스크리닝 결과. 거대고리 라이브러리의 38개 플레이트로부터 MIF 절단의 억제 백분율의 산란 플롯(Scatter plot). 청색 라인은 MIF 없이 인큐베이션된 포지티브 대조군이며, 녹색 라인은 MIF와 함께 인큐베이션된 음성 대조군이다. 오른쪽 그래프는 시험된 화합물의 히스토그램을 나타낸 것이다.
도 9. MIF 억제제에 대한 개개 화합물 스크리닝 결과. MIF 절단의 억제 백분율(X축) 및 MNNG-유발 세포사의 억제(Y축)의 산란 플롯.
도 10. 4개 히트(hit)의 용량-의존성 확인. (A) 4개의 후보물질은 MNNG로 처리된 HeLa 세포에서 세포보호에 대해 평가되었다. 후보물질은 용량-의존성 세포보호를 제공한다. (B) 4개의 후보물질은 TBE 겔에서 절단 검정으로 수행되었다. 후보물질은 MIF에 의한 기질의 절단을 방지할 수 있다.
도 11. 1차 피질 뉴런은 14일 동안 2개 히트와 함께 또는 이의 없이 PFF로 처리되었다. 이미지는 2개의 히트에 의한 PFF-유발 세포사를 도시한 것이다(좌측). 스케일 바, 50 μm. 2개의 히트에 의한 PFF-유발 세포사의 정량화. 바(bar)는 3회 실험으로부터의 평균 ± s.d.를 반영한 것이다. **P<0.005, ***P< 0.001(양측 비쌍체 t-테스트(two-tailed unpaired t-test)).
도 12. EndoG는 PARP-1 의존성 세포사를 위해 요구되지 않는다. (A) SH-SY5Y 세포에서 CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 녹아웃 endoG. EV, 빈 벡터(empty vector). (B) 녹아웃 endoG는 MNNG-유발 세포사에 대해 영향을 미치지 않는다. (C) 녹아웃 endoG는 MNNG 유발 DNA 손상에 대해 영향을 미치지 않는다.
도 13. MIF 녹다운은 MNNG 및 NMDA-유발 세포사로부터 세포를 보호한다. (A) 인간 MIF shRNA1-3 IRES-GFP 렌티바이러스 또는 비-타겟화(non-targeting)(NT) shRNA IRES-GFP 렌티바이러스로 형질도입된 HeLa 세포의 대표적인 이미지. (B) shRNA 형질도입 후 HeLa 세포에서의 MIF 단백질 수준. hMIF shRNA 1, 2 및 3은 HeLa 세포에서 83.3 ± 7.1%, 71.6 ± 3.2%, 및 82.7 ± 6.3% MIF 단백질 감소를 야기시켰다. (C) MNNG(50 μM, 15분)-유발 HeLa 세포사의 정량화. 평균 ± SEM이 나타난다. ***P < 0.001, 대 DMSO 대조군. ###P < 0.001, 대 MNNG 처리된 WT. (D) 마우스 MIF shRNA1-3 IRES-GFP 또는 비-타겟화 (NT) shRNA IRES-GFP 렌티바이러스로 형질도입된 피질 뉴런의 대표적인 이미지. (E) shRNA 형질도입 후 피질 뉴런에서의 MIF 단백질 수준. (F) MIF 녹다운 뉴런에서 NMDA(500 μM, 5분)-유발 뉴런 세포사의 정량화. mMIF shRNA 1, 2 및 3은 피질 뉴런에서 84.5 ± 8.2%, 90.1 ± 7.1%, 및 92.2 ± 3.3% MIF 단백질 감소를 야기시켰다. 평균 ± SEM이 나타난다. ***P < 0.001, 대 CSS 대조군. ###P < 0.001, 대 NMDA 처리된 WT. (G) 피질 뉴런에서 shRNA1 및 3에 대해 내성인 MIF 돌연변이체의 MIF 녹다운 및 과발현의 대표적인 면역블록. (H) shRNA1 및 3에 대해 내성인, MIF 녹다운 피질 뉴런 및 MIF 돌연변이체를 과발현시키는 세포에서 NMDA-유발 뉴런 세포사의 정량화. 평균 ± SEM이 나타난다. ***P < 0.001, 대 CSS 대조군. ###P < 0.001, 대 NMDA 처리된 WT, 일원분산분석. 스케일 바, 100 μm. MIF 신호의 강도는 C, F 및 H에 나타낸다. 실험은 3회의 독립적인 시험으로 반복되었다.
도 14. MIF는 PD-D/E(x)K 뉴클레아제 모티프를 함유한다. (A) 인간, 마우스, 랫트, 원숭이, 돼지, 소, 양, 토끼 및 소렉스(Sorex)로부터의 MIF의 뉴클레아제 도메인의 정렬. (B) 인간, 마우스, 랫트, 원숭이, 돼지, 소, 양, 토끼, 및 소렉스로부터의 MIF의 CxxCxxHx(n)C 도메인의 정렬. (C) PD-D/E(x)K 뉴클레아제에서 활성 부위의 보존된 토폴로지(conserved topology). 문헌[Kosinski et al., (18)]으로부터 변형된 이미지. 알파 나선은 원형으로서 나타내며, 베타 가닥은 삼각형으로서 나타낸다. 베타 가닥의 방향은 평행 또는 역평행으로 나타낸다. (D) MIF 트라이머(pdb:1GD0)의 결정 구조. 각 모노머는 다른 칼라에 의해 지시된다. (E) PD-D/E(x)K 모티프와 유사한 다양한 도메인의 방향을 예시한 MIF 트라이머의 토폴로지. (F) 모노머들 중 2개를 감춤으로써 트라이머(D에서 적색 파선)로부터 유도된 PD-D/E(x)K 도메인을 함유한 MIF 모노머의 결정 구조. (G) MIF 트라이머에서 MIF 모노머의 토폴로지. (H) 예시된 각 모노머는 PD-D/E(x)K 도메인을 갖는다. PD-D/E(x)K 모티프는 하나의 모노머로부터의 2개의 평행한 β-가닥(β4 및 β5) 및 인접한 모노머로부터의 2개의 역평행 가닥β-가닥(β6 및 β7)으로 이루어진다. (I) 이의 뉴클레아제 도메인에서 다양한 도메인의 유사한 방향을 예시한 MIF 트라이머 및 EcoRV에서 MIF 모노머의 토폴로지에서의 유사성의 개략적 다이아그램. 알파 나선은 원형으로서 나타내며, 베타 가닥은 삼각형으로서 나타낸다. (J) EcoRV 모노머의 토폴로지. (K) MIF 트라이머 및 EcoRV 모노머(적색)의 MIF 모노머의 정렬. (L-O) MIF, 및 EcoRI(마젠타색, pdb: 1QC9), EcoRV(밝은 청색, pdb: 1SX8), ExoIII(적색, pdb: 1AK0), 및 PvuII(오렌지색, pdb 1PVU)를 포함하는 다른 널리 공지된 뉴클레아제에서 PD-D/E(x)K 모티프의 정렬. 5개의 모티프 모두는 통상적인 PD-D/E(x)K 모티프 활성 부위에서 관찰된 바와 같이 알파 나선에 대한 베타 시트에서 4개의 베타 가닥의 유사한 방향을 나타낸다.
도 15. MIF는 신규한 뉴클레아제이다. (A) 37℃에서 4시간 동안 10 mM MgCl2를 함유한 트리스-HCl 완충제 pH 7.0에서 인간 게놈 DNA(hgDNA, 200 ng)와 함께 MIF 인큐베이션의 농도-의존성. (B) 37℃에서 10 mM MgCl2를 함유한 트리스-HCl 완충제 pH 7.0에서 hgDNA와 함께 MIF 인큐베이션(4 μM)의 시간 과정. (C) 37℃에서 4시간 동안 명시된 바와 같은 상이한 이온을 갖는 트리스-HCl pH 7.0 완충제에서 hgDNA와 함께 MIF(8 μM) 인큐베이션. (D) 기질로서 인간 게놈 DNA를 사용하여 정제된 단백질(4 μM)과 함께 시험관내 펄스-필드 겔 전기영동-뉴클레아제 검정. (E) 상이한 정제된 MIF 돌연변이체(MIF 아미노산 서열의 예시를 위해 도 1d 참조)는 37℃에서 4시간 동안 10 mM MgCl2를 함유한 트리스-HCl 완충제 pH7.0에서 hgDNA와 함께 인큐베이션되었다. 정제된 MIF WT 단백질 및 MIF 돌연변이체의 쿠마시브 청색 염색이 도시된다(하부 패널). (F) 글루타메이트 잔기는 글루타민, 아스파르테이트 및 알라닌으로 돌연변이화된다. (G) 정제된 MIF WT 단백질 및 MIF 돌연변이체의 쿠마시브 청색 염색. (H) 상이한 정제된 MIF 돌연변이체(돌연변이의 예시를 위한 도 1d 참조)는 37℃에서 4시간 동안 10 mM MgCl2를 함유한 트리스-HCl 완충제 pH 7.0에서 hgDNA와 함께 인큐베이션되었다. 정제된 MIF WT 단백질 및 MIF 돌연변이체의 쿠마시브 청색 염색이 도시된다(하부 패널). 실험은 3회의 독립적인 제조물에서 정제된 MIF 단백질을 사용하여 반복되었다.
도 16. 단백질 접힘 및 효소 활성에 대한 MIF 돌연변이의 효과. (A) MIF 단백질의 옥시도리덕타아제 활성. (B) MIF 단백질의 타우토머라아제 활성. 평균 ± SEM이 B 및 C에서 나타낸다. **P < 0.01, 일원분산분석. (C) MIF 단백질(야생형, E22Q 및 E22A)(실선) 및 단백질 표준물(파선)의 FPLC 프로파일. (D) FPLC로부터의 MIF 분획의 쿠마시브 청색 염색. (E-M) 마그네슘 클로라이드(Mg) 및/또는 아연 클로라이드(Zn)의 존재 또는 부재 하에 정제된 MIF 재조합 단백질의 UV-CD 분석. 실험은 3회의 독립적 제조물로부터 정제된 MIF를 사용하여 3회 반복되었다.
도 17. ChIP-seq에 의한 MIF-DNA 결합의 특징분석. (A) 염색질의 초음파처리된 단편은 DMSO 및 MNNG 처리된 세포에서 ChIP-seq에 대해 100 내지 200 bp의 범위이다. (B) MIF ChIP의 대표적인 면역블롯 이미지. (C) DMSO 또는 MNNG(50 μM) 처리된 세포로부터 제조된 MIF ChIP 샘플 및 DNA 투입을 포함하는 4개의 상이한 라이브러리로부터의 리드(read) 수 및 커버리지(coverage). (D) MNNG 처리된 세포에서 상이한 게놈 영역에 대한 MIF ChIP-피크 분포. 파이 차트는 MIF가 유전자의 프로모터에 결합하는 경향을 나타낸다(약 36%의 ChIP 영역이 프로모터에 존재한다). (E-F) 2개의 상이한 염색체 윈도우 크기에서 도시된 게놈 상에 MIF 농축의 대표적인 IGV 시각화. 위의 2개의 라인은 DMSO 및 MNNG 처리된 세포로부터의 ChIP-seq 데이터의 tdf 파일을 도시한 것이다. 3번째 및 4번째 라인은 DMSO 및 MNNG 처리된 샘플에 대한 베드 파일을 도시한 것이다. 피크는 DMSO 처리된 샘플에서가 아니라, 단지 MNNG 처리된 샘플에서 관찰되었다. 마지막 라인은 hg19 기준 유전자를 나타낸다. (G) 비-P(비 피크 영역), P55101, P66005, P65892, P36229, P46426 및 P62750(피크 영역)과 함께 qPCRdp 의해 확인된 DMSO 및 MNNG 처리된 세포에서의 MIF 염색질 농축.
도 18. MIF는 단일 가닥 DNA에 결합한다. (A) MIF DNA 결합 모티프의 정렬. (B) 그루브/결합 포켓을 나타낸(화살표) MIF 트라이머의 이미지(PDB 기탁 1FIM) 표면(상부 패널). 그루브에서 dsDNA를 갖는 MIF 트라이머의 모델(중간 패널). 중간 패널에서의 우측 이미지는 MIF-ssDNA(PDB 기탁 2RPD) 모델을 갖는 MIF-dsDNA(PDB 기탁 1BNA)의 오버레이(overlay)의 측면도를 도시한 것이다. i-iii, 카툰 이미지는 dsDNA 및 ssDNA에 가까운 잔기 P16 및 D17을 나타낸 것이며, E22는 dsDNA가 아닌 ssDNA에 가깝다. (C) MIF가 Mg2+의 존재 또는 부재 하에서의 이의 단일 가닥 5' 바이오틴-표지된 DNA 결합 모티프(PS30) 또는 표지되지 않은 PS40에 결합함을 나타낸 EMSA. 이의 DNA 기질에 대한 MIF 결합은 MIF 항체에 의해 파괴되며, MIF 돌연변이체 E22A, E22Q, P16A, D17A, D17Q는 이의 DNA 기질에 여전히 결합한다. 실험은 3개의 독립적인 제조물로부터 정제된 MIF 단백질을 사용하여 4회 반복되었다.
도 19. 결합 및 절단 검정에서 사용된 상이한 바이오틴-표지된 DNA 기질의 2차 구조.
도 20. MIF는 구조-특이적 뉴클레아제 활성을 갖는 스템 루프 ssDNA를 절단한다. (A) 기질로서 dsPS100을 사용한 MIF 뉴클레아제 검정. (B) 기질로서 ssPS100 및 이의 상보적인 가닥 ssPS100R을 사용한 MIF 뉴클레아제 검정. (C) MIF(1 내지 4 μM)는 dsPS30, 이의 서열 관련 기질-dsRF 및 관련 없는 기질-dsL3을 사용하여 이중 가닥 DNA에 대한 눈에 띄는 뉴클레아제 활성을 가지지 않는다. (D) MIF(0.5 내지 4 μM)는 농도-의존 방식으로 dsPS30, dsRF, dsL3을 절단하지 못한다. (E) Mg2+는 기질로서 ssPS30을 사용하여 MIF 뉴클레아제 활성을 위해 요구된다. (F-H) MIF(2 μM)는 농도- 및 시간-의존 방식으로 ssPS30을 절단한다.
도 21. MIF는 AIF와 상호작용하고, 세포핵으로 동시 전위한다. (A) 결합 검정에서 사용되는 GST-AIF 절단 단백질의 개략도. (B) 항-MIF 항체를 이용한 웨스턴 블롯에 의해 시각화된 GST 풀-다운 검정(상부 패널). 풀-다운 실험에서 사용되는 GST 융합 AIF 절단 단백질의 쿠마시브 청색 염색(하부 패널). (C) 항-MIF 항체를 이용한 웨스턴 블롯에 의해 시각화된 AIF 돌연변이체의 풀-다운 검정. (D) 글루타티온 비드 상의 GST-MIF 및 이의 변이체는 AIF 단백질을 풀 다운시킴. 실험은 3회의 독립적인 시험으로 반복되었다. (E-G) (E) 면역염색 및 (F-G) 하위세포 분획화에 의해 결정된, HeLa 세포에서 PARP 억제제, DPQ(30 μM)의 존재 또는 부재 하에서 MNNG 처리 후 AIF 및 MIF의 핵 변위. 스케일 바, 20 μm. 실험은 3회의 독립적인 시험으로 반복되었다. ***P < 0.001, 일원분산분석. (H-J) 하위세포 분획화에 의해 결정된, 피질 뉴런에서 PARP 억제제 DPQ 또는 nNOS 억제제 니트로-아르기닌(N-Arg, 100 μM)의 존재 또는 부재 하에서의 NMDA 처리 후 AIF 및 MIF의 핵 변위. MIF 및 AIF 신호의 강도는 I & J에서 나타낸다. 실험은 3회의 독립적인 시험으로 반복되었다. 실험은 3회의 독립적인 시험으로 반복되었다. ***P < 0.001, 일원분산분석.
도 22. MIF 뉴클레아제 활성은 피질 뉴런에서 NMDA-유발 DNA 손상 및 PARP-1 의존성 세포사에 대해 중요하다. (A) MIF WT, KO 및 MIF WT, E22Q 또는 E22A를 발현시키는 렌티바이러스-형질도입 MIF KO 피질 뉴런에서 NMDA-유발 세포독성의 대표적인 이미지. 스케일 바, 200 μm. (B-D) comet 검정에 의해 측정된 처리 후 6시간에 NMDA-유발 DNA 손상의 정량화. (B) 테일 양성 뉴런의 %, (C) 테일 길이 및 (D) 테일에서 DNA의 %.
도 23. MIF는 HeLa 세포에서 MNNG-유발 DNA 손상에 대해 중요하다. (A) WT HeLa 세포, NT shRNA 또는 MIF shRNA 렌티바이러스-형질도입된 HeLa 세포에서 comet 검정에 의해 측정된 MNNG-유발 DNA 손상의 대표적인 이미지. 점선은 헤드 및 테일의 중앙을 지시하는 것이다. 스케일 바, 20 μm. (B-D) 테일 양성 세포의 (B) %의 정량화, (C) 테일 길이의 정량화 및 (D) 테일에서 DNA의 %의 정량화. b-d에서 평균 ± SEM이 나타난다. ***P < 0.001, ###P < 0.001, 일원분산분석. 실험은 3회의 독립적 시험에서 반복되었다.
도 24. MIF 뉴클레아제 활성은 생체내 뇌졸중에서 세포 사멸을 위해 요구된다. (A) 트리판 블루 염료의 뇌실 내(ICV) 주사. (B) 주사 후 79일에 (i) 피질, (ii) 선조체 및 (iii & iv) 해마에서의 AAV2-MIF WT의 발현의 대표적인 면역염색 이미지. 스케일 바, 50 μm. (C) WT(n=16), MIF KO(n=12), MIF KO-WT(n = 11), MIF KO-E22Q(n = 11) 및 MIF KO-E22A(n = 11) 마우스에서 허혈성 영역의 코어에서 측면 두정 피질 위에서 측정된 레이저-도플러 플럭스(Laser-Doppler flux). (D-E) 45분 MCAO 후 1일 또는 7일에 피질, 선조체 및 반구에서의 경색 부피의 정량화. (F) 신경학적 결손은 45분 MCAO 수술 후 1, 3 및 7일에 코너 시험에서 오른쪽 턴(right turn)의 %에 의해 평가되었다. WT MCAO(n = 16), KO MCAO(n = 12), KO-WT MCAO(n = 16). KO-E22Q MCAO(n = 16), KO-E22A MCAO(n = 16). 평균 ± SEM이 나타난다. *P < 0.05, 대 뇌줄중전 대조군, 일원분산분석. (G) AIF(적색) 및 MIF(녹색)의 핵 변위 및 (H) MCAO 수술 후 1일, 3일 또는 7일에 AAV2-MIF WT, E22Q 또는 E22A가 주사된 MIF WT, KO 및 KO 마우스에서 MCAO 후 반음염에서의 펄스 필드 겔 전기영동에 의해 측정된 바와 같이 DNA 단편화. WT MCAO(n = 29), KO MCAO(n = 20), KO-WT MCAO(n = 23). KO-E22Q MCAO(n = 22), KO-E22A MCAO(n = 19). D-F에서 평균 ± SEM이 나타난다. *P < 0.05 (E), ***P < 0.001 (D, F), 대 대조군 또는 기준선, 일원분산분석.
본 발명은 PARP-1 의존성 AIF-관련 뉴클레아제(PAAN)로서 대식세포 이동 억제 인자(MIF)의 동정을 기초로 한 것이다.
본원에서 사용되는 화합물의 "치료학적 유효량"은 질병 또는 장애의 치료에서 사용되는 활성 성분의 양을 정량화하기 위해 의도된다. 이러한 양은 상기 질병 또는 장애를 감소시키거나 제거할 목적을 달성할 것이다. 정확한 투여량 및 투여 빈도는 사용되는 본 발명의 특정 화합물, 치료되는 특정 질환, 치료되는 질환의 중증도, 특정 대상체의 연령, 중량 및 일반적인 신체 조건뿐만 아니라, 당업자에게 널리 공지된 바와 같이 환자가 복용할 수 있는 다른 약제에 의존적이다. 또한, 상기 "치료학적 유효량"은 치료되는 대상체의 반응에 따라 및/또는 본 발명의 화합물을 처방하는 전문의의 평가에 따라 낮아지거나 증가될 수 있다.
본원에서 사용되는 대상체의 "치료하는(treating)" 또는 "치료(treatment)"에 대한 언급은 예방을 포함하는 것으로 의도된다. 용어 "대상체(subject)"는 인간을 포함하는 모든 포유동물을 의미한다. 대상체의 예는 인간, 소, 개, 고양이, 염소, 양, 돼지, 및 토끼를 포함한다. 바람직하게, 대상체는 인간이다.
본 발명의 화합물 이외에, 당업자는 화학치료제, 항염증제, 및 치료 항체를 포함하는 다른 치료 화합물이 본 발명의 화합물로의 치료 이전에, 이와 동시에, 또는 이후에 사용될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 한정하고자 하는 것은 아니지만, 화학치료제는 항대사물질, 예를 들어, 메토트렉세이트, DNA 가교제, 예를 들어, 시스플라틴/카보플라틴; 알킬화제, 예를 들어, 칸부실; 토포이소머라아제 I 억제제, 예를 들어, 닥티노마이신; 미소관 억제제, 예를 들어, 탁솔(파클리탁솔), 등을 포함한다. 다른 화학치료제는 예를 들어, 빈카 알칼로이드; 미토마이신-타입 항생제, 블레오마이신-타입 항생제, 항폴레이트, 콜히친, 데메콜린, 에토포사이드, 탁산, 안트라시클린 항생제, 독소루비신, 다우노루비신, 카르미노마이신, 에피루비신, 이다루비신, 미톡산트론, 4-디메톡시-다우노마이신, 11-데옥시다우노루비신, 13-데옥시다우노루비신, 아드리아마이신-14-벤조에이트, 아드리아마이신-14-옥타노에이트, 아드리아마이신-14-나프탈렌아세테이트, 암사크린, 카르무스틴, 시클로포스파미드, 시타라빈, 에토포사이드, 로바스타틴, 멜팔란, 토페테칸, 옥살라플라틴, 클로람부실, 메트트렉세이트, 로무스틴, 티오구아닌, 아스파라기나아제, 빈블라스틴, 빈데신, 타목시펜, 또는 메클로레타민을 포함한다. 한정하고자 하는 것은 아니지만, 치료 항체는 HER2 단백질에 대한 항체, 예를 들어, 트라스투주맙; 성장 인자 또는 성장 인자 수용체에 대한 항체, 예를 들어, 혈관 내피 성장 인자를 타겟화하는 베바시주맙, 및 표피 성장 인자를 타겟화하는 OSI-774; 인테그린 수용체를 타겟화하는 항체, 예를 들어, 비탁신(Vitaxin)(또한, MEDI-522로서 공지됨), 등을 포함한다. 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기에 적합한 항암제의 부류는 1) 미소관 억제제(예를 들어, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 및 빈데신, 등), 미소관 안정화제(예를 들어, 파클리탁셀[탁솔], 및 도세탁셀, 탁소테레, 등), 및 크로마틴 기능 억제제, 및 토포이소머라아제 억제제를 포함하는 염색질 기능 억제제, 예를 들어, 에피포도필로톡신(예를 들어, 에토포사이드[VP-16], 및 테니포사이드(VM-26], 등), 및 토포이소머라아제 I을 타겟화하는 제제(예를 들어, 캄프토테신 및 이시리노테칸[CPT-11], 등)를 포함하는 알칼로이드; 2) 질소 머스타드(예를 들어, 메클로레타민, 클로람부실, 시클로포스파미드, 이포스파미드, 및 부술판[밀레란], 등), 니트로소우레아(예를 들어, 카르무스틴, 로무스틴, 및 세무스틴, 등), 및 다른 알킬화제(예를 들어, 다카르바진, 하이드록시메틸멜라민, 티오테파, 및 미토사이신, 등)를 포함하는, 공유 DNA-결합제[알킬화제]; 3) 핵산 억제제(예를 들어, 닥티노마이신[악티노마이신 D], 등) 안트라시클린(예를 들어, 다우노루비신[다우노마이신, 및 세루비딘], 독소루비신[아드리아마이신], 및 이다루비신[이다마이신], 등), 안트라센디온(예를 들어, 안트라시클린 유사체, 예를 들어, [미톡산트론], 등), 블레오마이신(블레녹산), 등, 및 플리카마이신(미트라마이신), 등을 포함하는 비공유 DNA-결합제[항종양 항생제]; 4) 항폴레이트(예를 들어, 메토트렉세이트, 폴렉스, 및 멕세이트, 등), 퓨린 항대사물질(예를 들어, 6-머캅토퓨린[6-MP, 푸리네톨], 6-티오구아닌[6-TG], 아자티오프린, 아시클로버, 간시클로버, 클로로데옥시아데노신, 2-클로로데옥시아데노신[CdA], 및 2-데옥시코포르마이신[펜토스타틴], 등), 피리미딘 길항제(예를 들어, 플루오로피리미딘[예를 들어, 5-플루오로우라실(Adrucil), 5-플루오로데옥시우리딘(FdUrd)(플록수리딘)] 등), 및 시토신 아라비노사이드(예를 들어, 시토사르[ara-C] 및 플루다라빈, 등)를 포함하는 항대사물질; 5) L-아스파라기나아제를 포함하는 효소; 6) 글루코코르티코이드를 포함하는 호르몬, 예를 들어, 항에스트로겐(예를 들어, 타목시펜, 등), 비스테로이드성 항안드로겐(예를 들어, 플루타미드, 등), 및 아로마타아제 억제제(예를 들어, 아나스트로졸[Arimidex], 등); 7) 백금 화합물(예를 들어, 시스플라틴 및 카보플라틴, 등); 8) 항암제 약물, 톡신, 및/또는 방사성 핵종, 등과 컨쥬게이션된 모노클로날 항체; 9) 생체반응 조절물질(예를 들어, 인터페론[예를 들어, IFN-알파, 등] 및 인터류킨[예를 들어, IL-2, 등], 등); 10) 입양 면역치료법; 11) 조혈 성장 인자; 12) 종양 세포 분화를 유도하는 제제(예를 들어, 모두-트랜스-레티노산, 등); 13) 유전자 치료법 기술; 14) 안티센스 치료법 기술; 15) 종양 백신; 16) 종양 전이에 대한 치료법(예를 들어, 바티미스타트(Batimistat), 등); 및 17) 혈관신생의 억제제를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
다른 치료제의 예는 하기를 포함한다: 시클로스포린(예를 들어, 시클로스포린 A), CTLA4-Ig, 항체, 예를 들어, ICAM-3, 항-IL-2 수용체(항-Tac), 항-CD45RB, 항-CD2, 항-CD3(OKT-3), 항-CD4, 항-CD80, 항-CD86, CD40과 gp39 간의 상호작용을 차단하는 제제, 예를 들어, CD40 및/또는 gp39에 대해 특이적인 항체(즉, CD154), CD40 및 gp39로부터 작제화된 융합 단백질(CD40Ig 및 CD8 gp39), NF-카파 B 기능의 억제제, 예를 들어, 핵 변위 억제제, 예를 들어, 데옥시스페르구알린(DSG), 콜레스테롤 생합성 억제제, 예를 들어, HMG CoA 환원효소 억제제(로바스타틴 및 심바스타틴), 비스테로이드성 항염증성 약물(NSAID), 예를 들어, 이부프로펜 및 시클로옥시게나아제 억제제, 예를 들어, 로페콕십, 스테로이드, 예를 들어, 프레드니손 또는 덱사메타손, 금 화합물, 항증식제, 예를 들어, 메토트렉세이트, FK506(타크롤리무스, Prograf), 미코페놀레이트 모페틸, 세포독성 약물, 예를 들어, 아자티오퓨린 및 시클로포스파미드, TNF-a 억제제, 예를 들어, 테니다프, 항-TNF 항체 또는 가용성 TNF 수용체, 및 라파마이신(시롤리무스 또는 라파문) 또는 이들의 유도체.
다른 제제는 시토카인, 면역조절제 및 항체와 같은 단백질 치료제를 포함하는 본 발명의 조성물 및 방법과 함께 투여될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "시토카인"은 케모카인, 인터류킨, 림포카인, 모노카인, 콜로니 자극 인자, 및 수용체 관련 단백질, 및 이들의 기능적 단편을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "기능적 단편"은 규정된 기능적 검정을 통해 동정되는 생물학적 기능 또는 활성을 지니는 폴리펩티드 또는 펩티드를 지칭한다.
시토카인은 내피 단핵구 활성화 폴리펩티드 II(EMAP-II), 과립구-대식세포-CSF(GM-CSF), 과립구-CSF(G-CSF), 대식세포-CSF(M-CSF), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, 및 IL-13, 인터페론, 등을 포함하며, 이는 세포 또는 세포 메커니즘에서 특정 생물학적, 형태학적 또는 표현형 변형과 관련이 있다.
폴리(ADP-리보오스) 폴리머라아제-1(PARP-1)의 억제 또는 유전적 결실은 여러 장기계에서 다수의 독성 손상에 대해 근본적으로 보호한다. PARP-1-의존성 세포사를 기초로 하는 분자 메커니즘은 미토콘드리아 아폽토시스-유발 인자(AIF) 방출 및 염색질 분해를 야기시키는 세포핵으로의 전위를 포함한다. AIF가 염색질 분해 및 세포사를 유도하는 방법은 알려져 있지 않다. 본 발명은 Mg2+/Ca2+-의존성 뉴클레아제 활성을 지니는 PARP-1 의존성 AIF-관련 뉴클레아제(PAAN)로서 대식세포 이동 억제 인자(MIF)를 동정한다. AIF는 MIF가 게놈 DNA를 20 내지 50 kb 단편을 절단하는 핵으로 MIF의 보충을 위해 요구된다. 촉매 뉴클레아제 도메인에서 MIF의 고갈, AIF-MIF 상호작용의 파괴, 또는 E22의 Q22로의 돌연변이는 MIF 뉴클레아제 활성을 차단하고, 뉴런 배양물에서 글루타메이트 흥복성독성 및 마우스에서 초점 뇌졸중(focal stroke) 이후에 염색질 분해 및 세포사를 억제한다. MIF의 뉴클레아제 활성의 억제는 과량의 PARP-1 활성화로 인한 질병에 대한 잠재적인 중요한 치료 타겟이다.
MIF는 MNNG 또는 NMDA 흥분성독성에 의해 유도된 PARP-1 의존성 세포사를 위해 요구되는 것으로 사료된다.
종래 연구 결과와 일치하게(13,14), EndoG는 PARP-1 의존성 큰 DNA 단편화 및 MNNG 유발 세포사를 위해 불필요하다(도 12). PARP-1 의존성 AIF 관련 뉴클레아제(PAAN)를 동정하기 위하여, 16K 및 5K 단백질 칩(15)은 재조합 AIF로 프로빙되었다. 가장 강력한 160 AIF 상호작용제는 파르타나토스를 연구하기 위해 잘 특징분석된 방법인, HeLa 세포 배양물에서 MNNG에 의해 유도된 파르타나토스의 개질제를 동정하기 위한 siRNA 기반 스크린으로 발전되었다(2,11,12)ENREF 2(도 1a 및 도 1b). 이러한 AIF 상호작용제는 이의 녹다운이 PARP-1의 녹다운에 대해 균등한 보호를 제공하는 능력 및 이러한 것이 가능한 뉴클레아제 활성과 일치하는 서열 및 구조 동족성을 나타내는 지의 여부를 기초로 하여 추가로 차별되었다. AIF 상호작용제(18)의 녹다운이 PARP-1 녹다운으로서 보호적이라는 것이 확인되었다(도 1b). AIF 상호작용제(18)는 이전에 다양한 동의어(synonym)로 알려져 있으며, 이는 총괄적으로 대식세포 이동 억제 인자(MIF 또는 MMIF)로서 알려져 있다(16,17). 인간 및 마우스 MIF에 대한 3개의 상이한 shRNA 작제물은 MIF의 녹아웃이 HeLa 세포에서의 MNNG 독성 또는 마우스 1차 피질 뉴런에서의 NMDA 흥분성독성에 의해 유도된 파르타나토스에 대해 보호함을 확인하기 위해 사용되었다(도 13a 내지 도 13f). shRNA로부터 오프-타겟 효과를 배제하기 위하여, shRNA 1(RshRNA1) 및 3(RshRNA3)에 대해 내성인 MIF 작제물이 제조되었고, 녹다운에 영향을 받지 않는 것으로 나타났다(도 13g). 이러한 내성 MIF 작제물은 내인성 MIF 녹다운의 셋팅에서 NMDA 흥분성독성을 회복시키는데(도 13h), 이는 MIF가 MNNG 또는 NMDA에 의해 유발된 파르타나토스를 위해 요구됨을 확인한다.
MIF는 여러 뉴클레아제(18 내지 20)에서 발견된 3개의 PD-D/E(X)K 모티프를 함유하고(도 1c 및 도 1d), 포유류 종에 걸쳐 고도로 보존된다(도 14a). 또한, 이는 CxxCxxHx(n)C 아연 핑거 도메인을 함유하며(도 1c, 도 14b), 이는 통상적으로 DNA 손상 반응 단백질에서 발견된다(20). MIF는 트라이머로서 존재하는 것으로 알려져 있다(21 내지 23). MIF 트라이머에서 코어 PD-D/E(X)K 토폴로지 구조는 2α-가닥 다음에 4β-가닥으로 이루어지며(도 1e 및 도 14c 내지 도 14g), 이는 EcoRI, EcoRV, ExoIII 및 PvuII를 포함하는 잘 특징분석된 뉴클레아제의 것과 유사하다(도 14h 내지 도 14o). 이러한 서열 분석 및 3-D 모델링 결과는 MIF가 PD-D/E(X)K 뉴클레아제-유사 수퍼패밀리에 속함을 명시한다(24, 25).
MIF가 뉴클레아제 활성을 갖는 지의 여부를 결정하기 위하여, pcDNA 플라스미드는 재조합 MIF와 함께 인큐베이션되었다. 초나선(supercoiled) pcDNA는 MIF에 의해 개방 원형 형태로 절단되고, 이를 선형 형태로 추가로 절단된다(도 2a). 또한, MIF는 농도 및 시간 의존적 방식으로 인간 게놈 DNA를 절단한다(도 15a 및 도 15b). 10 mM Mg2+, 2 mM Ca2+, 또는 1 mM Mn2+의 첨가는 다른 유사한 뉴클레아제의 시험관내 활성을 위해 요구되는 2가 양이온 농도와 일치하는 MIF 뉴클레아제 활성을 위해 요구된다(도 15c)(26). EDTA는 인간 게놈 DNA에 대한 MIF의 뉴클레아제 활성을 차단한다(도 2b). 2가 양이온의 부재 중에 또는 2 내지 10 μM의 양이온과 함께, MIF는 뉴클레아제 활성을 가지지 않는다(도 15c). 200 μM Zn2+의 첨가는 MIF의 존재 하에서 게놈 DNA를 침전시키는 반면, 2 μM Zn2+는 어떠한 영향도 미치지 않는다. 또한, Na+는 MIF의 뉴클레아제 활성에 영향을 미치지 않는다(도 15c). 중요하게, 펄스-필드 겔 전기영동은, MIF가 인간 게놈 DNA를, MNNG로 처리된 HeLa 세포로부터 정제된 DNA와 유사한 큰 단편으로 절단함을 나타낸다(도 2b, 레인 8). MIF의 shRNA 녹다운은 MNNG 유발 DNA 절단을 방지하며, 이는 3,4-디하이드로-5[4-(1-피페리디닐)부톡시]-1(2H)-이소퀴놀린(DPQ)에 의한 PARP의 효과와 유사하다(도 2c). MIF가 타우토머라아제 활성을 지닌다고 나타났기 때문에, MIF 타우토머라아제 억제제, ISO-1이 시험되었다(27). ISO-1은 MNNG 유발 DNA 손상을 막지 못한다(도 2c). 또한, 타우토머라아제 활성이 부족한(28), MIF P2G 타우토머라아제 돌연변이체가 MIF의 뉴클레아제 활성에 영향을 미치지 않는다(도 15d). 함께 고려된 이러한 데이터는 MIF가 뉴클레아제이고, PARP-1 의존적 DNA 단편화에서 중요한 역할을 함을 나타낸다.
MIF의 뉴클레아제 활성에 대해 중요한 아미노산 잔기를 동정하기 위하여, MIF의 PD-D/E(X)K 도메인 내의 중요한 아스파르테이트, 글루타메이트 및 프롤린 잔기가 돌연변이되었다. 아스파르테이트(E22D)가 아닌, 알라닌(E22A) 또는 글루타민(E22Q)에 의한 글루타메이트 22의 치환은 MIF의 뉴클레아제 활성을 명확하게 억제한다(도 2d, 도 15e 내지 도 15h). 이러한 데이터는 MIF의 제1 α-나선에서 이러한 글루탐산 잔기(E22)가 이의 뉴클레아제 활성을 위해 중요함을 시사하는데, 이는 여러 엑소뉴클레아제-엔도뉴클레아제-포스파타아제(EEP) 도메인 수퍼패밀리 뉴클레아제의 제1 α-나선에서의 이러한 글루탐산이 고도로 보존되고 이러한 것이 뉴클레아제 활성에 대한 활성 부위라는 종래 보고서와 일치한다(24, 25) ENREF 12.
이전 연구는 MIF가 옥시도리덕타아제 및 타우토머라아제 활성 둘 모두를 가짐을 나타낸다(27,29,30). MIF 활성 부위 돌연변이체 E22Q 및 E22A는 MIF의 옥시도리덕타아제 또는 타우토머라아제 활성에 대해 별다른 영향을 미치지 않는데(도 16a 및 도 16b), 이는 MIF 뉴클레아제 활성이 이의 옥시도리덕타아제 및 타우토머라아제 활성에 대해 독립적임을 시사한다. 또한, MIF의 단백질 확인이 단백질 2차 및 3차 구조를 각각 연구하기 위한 일반적인 방법인 원자외선(UV) 원편광 이색성(CD) 및 근 CD분광법에 의해 결정된 바와 같이 E22Q 및 E22A 돌연변이에 의해 영향을 받지 않는다는 것이 확인되었다(도 16c 내지 도 16m). MIF 단백질의 순도는 쿠마시브 청색 염색, FPLC 및 질량분광분석법(MS) 검정(도 15g, 도 16c, 도 16d, 물질 및 방법)에 의해 확인되었다. 우발적인 뉴클레아제 오염은 관찰되지 않았다.
DMSO 또는 MNNG(50 μM, 15분)로 처리된 HeLa 세포에서 DNA에 MIF가 결합하는 지의 여부를 추가로 연구하기 위하여, 염색질 면역침전(ChIP) 검정 이후에 딥 시퀀싱(deep sequencing)이 수행되었다(도 17). MEME-칩을 이용하여, 2개의 부류의 MIF 결합 모티프(도 3a)가 동정되었다. 제1 부류(서열 1 내지 서열 3)는 중첩 서열의 고도로 관련된 패밀리를 나타낸다(도 3a 및 도 18a). 이러한 패밀리의 서열 특징은 30개의 뉴클레오티드로 동정되고 PS30으로 명명된 가장 통계학적으로 유의미한 모티프인, 서열 1에서 가장 잘 포착되었다. 동정된 제2 부류는 폴리(A) 스트레치(stretch)이다.
P16, D17 및 E22는 동일한 PD-D/E(X)K 모티프 내에 존재한다. 3차원 계산 모델링은 MIF 상의 P16 및 D17이 이중 가닥 DNA(dsDNA)에 가까운 반면 E22가 ssDNA에 가까움을 나타내는데, 이는 MIF가 ssDNA 또는 dsDNA 또는 둘 모두에 결합할 수 있음을 나타낸다(도 18b). 단일 가닥 및 이중 가닥 형태의 2개의 부류의 MIF DNA 결합 모티프 모두가 MIF 결합 및 절단 특이성에 대해 시험되었다. ssPS30 서열은 5' 바이오틴 표지와 함께 합성되었고, 전기영동 이동성 변화 검정(EMSA)으로 처리되었다(도 18c). MIF가 바이오틴 표지된 ssPS30에 결합하여 10 mM Mg2+의 존재 하에서 하나의 주요 복합물을 형성한다는 것이 확인되었으며(도 18c), 이는 MIF에 과량의 비표지된 DNA 기질(PS30) 또는 폴리클로날 항체의 첨가에 의해 완전히 파괴된다(도 18c). MIF E22Q, E22A, P16A, P17A 및 P17Q 돌연변이체는 여전히 MIF/ssPS30 복합물을 형성한다(도 18c).
ssPS30이 5' 및 3' 단부에서 홀염기를 갖는 스템-루프 구조를 형성할 가능성을 갖기 때문에, MIF가 서열 또는 구조 특이성을 갖는 ssDNA에 결합하는 지의 여부를 측정하기로 결정되었다. 5' 단부, 3' 단부, 5' 및 3' 단부 둘 모두에서 홀염기를 제거하거나 스템 루프를 제거함에 의한 상이한 구조를 갖는 5' 바이오틴 표지된 ssPS30 및 이의 서열-관련 기질이 EMSA에서 사용되었다(도 3b, 및 도 19). 3' 홀염기(5'bLF)를 완전히 제거하는 것이 DNA/MIF 복합물 형성에 명백한 영향을 미치지 않는다는 것이 확인되었다(도 2e 및 도 19). 반대로, 5' 홀염기(5'bRF)의 제거는 DNA-MIF 결합을 감소시키면서, MIF는 여전히 낮은 효율로 DNA에 결합한다. 유사한 결과는 5' 및 3' 홀염기 둘 모두(5'bSL)를 제거할 때 관찰된다. 이러한 데이터는 MIF가 스템 루프 구조를 갖는 ssDNA에서 5' 홀염기에 주로 결합함을 시사한다. 스템 루프를 가지지 않는 폴리 A 서열(5'bPA30) 스템 루프 구조의 5' 단부에서의 짧은 폴리 A 서열(5'b3F1)이 또한 기질로서 사용되었으며, MIF가 5'bPA30에 결합하지 못하지만 5'b3F1에 명확하게 결합한다는 것이 확인되었으며, 이는 스템 루프가 MIF-ssDNA 결합을 위해 요구됨을 시사하는 것이다(도 3b 및 도 19). PS30 서열-관련 기질 이외에, 스템 루프 유사 구조를 갖는 서열 관련 없는 기질(5'bL3)이 또한 시험되었으며, MIF가 5'bL3에 약하게 결합한다는 것이 확인되었다. 그러나, 이의 결합 효율은 5'bPS30보다 훨씬 더 낮다. 이러한 데이터는, MIF가 스템 루프를 갖는 ssDNA에 우선적으로 결합하고 서열 특이성에 덜 의존적임을 시사한다.
ssDNA 연구와 병행하여, MIF는 PS30, 폴리 A, PS30 서열-관련 기질(5'bPS30, 5'bSL, 5'bLF, 5'bRF, 5'bPA30, 및 5'bPA5E)뿐만 아니라, 관련 없는 서열(PCS 및 5'bL3)을 사용하여 dsDNA에 결합하는 지를 확인하기 위해 시험되었다(도 3b 및 도 19). MIF가 임의의 이러한 이중 가닥 기질에 결합하지 못한다는 것이 확인되었다(도 3b).
MIF가 단일 또는 이중 가닥 DNA를 절단하는 지의 여부를 결정하기 위하여, 35개의 랜덤 뉴클레오티드는 PS30 DNA 결합 모티프의 5' 및 3' 단부 둘 모두에 첨가되었고, PS100로 명명되었으며, ssDNA(ssPS100) 또는 dsDNA(dsPS100)의 절단이 모니터링되었다. MIF는 실질적으로 ssPS100 및 이의 상보성 가닥 ssPS100R을 절단하지만, dsPS100을 절단하지 않는다(도 20a 및 도 20b). ChIP Seq(PS30)로부터 동정된 MIF DNA 결합 모티프는 증가하는 농도의 MIF가 ssPS30을 절단하기 때문에 MIF 절단을 위해 충분하다(도 20c). 그러나, 증가하는 농도(1 내지 4 μM)의 MIF는 dsPS30, 이의 관련된 서열 dsRF뿐만 아니라 이의 관련 없는 서열 dsL3을 절단하는데 실패하였다(도 20c). ssPS30의 MIF 절단은 Mg2+를 필요로 한다(도 20e). MIF E22Q 및 E22A 돌연변이는 ssPS30의 분열을 차단한다(도 20220E). MIF는 12분의 t1/2을 갖는 시간 의존적 방식으로 ssPS30을 절단하며, 이는 2 μM의 Km 및 41.7 nM/분의 Vmax를 갖는 농도 의존적 방식으로 ssPS30을 절단한다(도 20f 내지 도 20h). 이러한 동력학 성질은 EcoRI와 같은 다른 PD-D/E(X)K 뉴클레아제와 유사하다(26,31). 단일 가닥 DNA에 대한 MIF의 선호도는 MIF의 활성 부위에 대한 단일 가닥 DNA 결합의 3차원 모델(도 18b) 및 MIF-DNA 결합 검정(도 3b)와 일치한다.
MIF가 서열 또는 구조 특이적 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 지의 여부를 결정하기 위하여, DNS 기질 ssPS30의 2차 구조를 기반으로 한 일련의 5' 및 3' 바이오틴 표지된 변이체가 합성되었으며, MIF 절단이 시험되었다(도 3c 및 도 19). MIF가 3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는다는 것이 밝혀졌으며, 이는 ssPS30의 3' 단부에서 홀염기를 인식하고 분해하는 것을 선호하는데, 이는 3' 단부에서 바이오틴 변형에 의해 차단된다(도 3c 레인 2 내지 레인 5, 및 도 19, 표 1). MIF의 3' 엑소뉴클레아제 활성은 또한 5'bRF 기질뿐만 아니라 5'b3E 기질을 이용한 절단 검정에 의해 지지된다(도 3c 및 도 19, 표 1). 또한, MIF의 3' 엑소뉴클레아제 활성은 3' 바이오틴-폴리 A(3'bPA30)가 아닌 5' 바이오틴-폴리 A(5'bPA30)를 절단할 수 있게 하는데, 이는 MIF의 3' 엑소뉴클레아제 활성이 2차 구조에 독립적임을 시사하는 것이다(도 3c 및 도 19). MIF는 또한, 구조 특이적 엔도뉴클레아제 활성을 지닌다. 이는 스템 루프에 인접한 3' 단부에서 ssDNA의 짧은 홀염기(5'bPS40, 3'bPS40, 5'b3F1, 3'b3F1 및 5'bL3)뿐만 아니라 스템 루프에 인접한 3' 단부에서 3'-OH/3'-바이오틴(3'bSL 및 3'bLF)을 절단한다(도 3c 및 도 19). 이의 엑소뉴클레아제 활성과는 상반되게, MIF의 엔도뉴클레아제 활성은 3' 단부에서 바이오틴 변형에 의해 차단될 수 없다(3'bSL, 3'bLF, 3'bPS40 및 3'b3F1). 5'bL3은 관련 없는 PS30 서열이지만, 낮은 효율을 갖는 것을 제외하고 MIF에 의해 절단된 유사한 스템 루프 구조를 갖는다(도 3c 및 도 19). 함께 고려하면, 이러한 결과는, MIF가 3' 엑소뉴클레아제 활성 및 엔도뉴클레아제 활성 둘 모두를 가지고 3' 단부에서 스템 루프 ssDNAdml 홀염기를 절단함을 나타낸다.
MIF가 DNA를 절단하고 바이오틴 표지화의 잠재적인 간섭을 피하는 경우를 추가로 연구하기 위하여, 스템 루프의 3' 단부에서 단지 1개의 홀염기를 갖는 비-표지된 PS30 및 3F1이 기질로서 사용되었으며, PS30을 기반으로 한 2개의 상이한 DNA 래더가 커스톰화되었다. 2시간 동안 MIF(2 μM)를 PS30과 함께 인큐베이션함으로써, 20 및 22개의 뉴클레오티드의 2개의 주요 산물이 검출된다(도 3d). 또한, 희미한 고분자량 밴드가 또한 관찰된다. 이러한 고분자량 밴드는 인큐베이션 시간이 1시간인 바이오틴 표지된 PS30 MIF 절단 실험에서 더욱 명확하다(도 3d). 3F1 기질의 MIF 절단은 스템 단지, 루프 구조의 3' 단부에서 1개의 홀염기의 절단과 일치하는 29 nt-밴드를 생성한다(도 3d 및 도 3e). 이러한 데이터는, PS30이 3' 엑소뉴클레아제 활성 및 엔도뉴클레아제 활성 둘 모두를 이용하여 "A23↓T24↓T25↓" 후 MIF에 의해 초기에 절단됨을 시사한다(도 3e 좌측 패널). 이후에, 얻어진 산물은 더욱 안정한 구조를 형성하며(도 3e 우측 패널), MIF는 "G20↓G21↓G22↓" 후 스템 루프 구조의 3' 단부에서 새로운 홀염기에서 절단한다. 함께 고려하면, MIF는 3' 엑소뉴클레아제 활성 및 엔도뉴클레아제 활성 둘 모두를 이용하여 +1 내지 +3 위치에서 스템 루프에 인접한 3' 단부에서 홀염기를 절단한다.
MIF가 AIF 상호작용 단백질임을 확인하기 위하여, GST 풀 다운 실험이 수행되었다. 야생형 GST-AIF는 내인성 MIF를 풀 다운(pull down)하며, 야생형 GST-MIF는 내인성 AIF를 풀 다운한다(도 4a 및 도 21a 내지 도 21d). 이후에, MIF-AIF 결합 도메인이 맵핑되었다. MIF가 aa 567-592에서 AIF에 결합한다는 것이 확인되었다(도 21a 내지 도 21c). 반대로, MIF E22A 돌연변이체는 GST 풀 다운에서 AIF에 대한 결합을 실질적으로 감소시켰으며, E22D 및 E22Q는 여전히 AIF에 결합한다(도 4a 및 도 4b, 및 도 21d). 또한, 다른 PD-D/E(X)K 및 C57A;C60A 돌연변이는 AIF에 여전히 결합한다(도 21d). 이러한 데이터는 MIF E22가 AIF 결합을 위해 중요함을 시사한다. GST 풀 다운 데이터에 따라, AIF는 500 μM NMDA로 처리된 피질 뉴런에서 MIF를 동시-면역침전하지만, 미처리된 배양물에서 겨우 검출 가능하다(도 4c 및 도 4d).
MIF는 HeLa 세포(도 21e) 및 피질 뉴런(도 4e) 둘 모두의 시토솔에 주로 국소화된다. MIF 및 AIF 둘 모두는 세포핵으로 전위하고, HeLa 세포에서의 MNNG 및 피질 뉴런에서의 NMDA에 의한 자극 시에 세포핵 내에 동시-국소화된다. AIF의 녹다운은 세포핵으로의 MIF 전위의 상실을 야기시키지만, MIF의 녹다운은 NMDA 노출 후에 AIF의 세포핵으로의 전위를 방지하지 못한다(도 4e). 핵 및 포스트-핵 분획 내로의 하위세포 분획화는 피질 뉴런 배양물의 NMDA 노출 후 MIF 및 AIF의 세포핵으로의 전위를 확인하며, 그러한 AIF는 MIF 전위를 위해 요구된다(도 4f 및 도 4g). DPQ는 피질 뉴런에서 NMDA 투여 및 HeLa 세포에서의 MNNG 처리 후 핵에서 MIF 및 AIF 둘 모두의 축적을 방지한다(도 21e 내지 도 21j). NMDA 흥분성독성이 질소 옥사이드 생성을 수반한다는 개념과 일치하여, 질소 옥사이드 합성효소 억제제, 니트로-아르기닌(N-Arg)은 세포핵에서 MIF 및 AIF 둘 모두의 축적을 방지한다(도 21h 내지 도 21j).
MIF는 뇌 전반에 걸쳐 널리 분포되며, MIF 녹아웃 마우스는 이전에 기술되었다(도 4h)(32). MIF 녹아웃 마우스로부터의 1차 피질 배양물은 NMDA 투여 후 MIF 핵 축적을 위한 AIF/MIF 결합의 보충을 확인하기 위해 MIF-WT-FLAG, MIF-E22Q-FLAG, 및 MIF-E22A-FLAG를 지닌 렌티바이러스로 형질도입되었다. GST 풀 다운 실험과 일치하여(도 4a), 야생형 MIF 및 E22Q는 AIF와 상호작용하지만, MIF E22A는 AIF에 결합하지 않는다(도 4i). 비-형질도입된 MIF 녹아웃 배양물에서 그리고 MIF-WT-FLAG, MIF-E22Q-FLAG, 및 MIF-E22A-FLAG로 형질도입된 MIF 녹아웃 배양물에서, AIF는 NMDA 투여 후 세포핵에 전위한다(도 4j). MIF 야생형 및 MIF E22Q 둘 모두는 또한, 세포핵에 전위한다. 그러나, AIF 결합 결핍 돌연변이체 MIF E22A는 전위하지 못한다(도 4j). 핵 및 포스트-핵 분획 내로 하위세포 분획화는 면역형광에 의해 이루어진 관찰을 확인한다(도 4k 및 도 4l). 함께 고려하면, 이러한 결과는, AIF와의 MIF의 상호작용이 MIF의 핵 전위를 위해 요구됨을 나타낸다.
MIF의 뉴클레아제 활성 및 AIF-매개 보충이 파르타나토스를 위해 요구되는 지의 여부를 결정하기 위하여, MIF 녹아웃 배양물은 뉴클레아제 결핍 MIF E22Q 돌연변이체 및 AIF 결합 결핍 돌연변이체 MIF E22A 돌연변이체로 형질도입되었다. shRNA 녹다운 실험과 일치하여, MIF 녹다운 피질 배양물은 NMDA 흥분성독성에 대해 내성적이다(도 5a 및 도 22a). 야생형 MIF로의 형질도입은 NMDA 흥분성독성을 완전히 회복시키며, 반대로, MIF E22Q 및 MIF E22A 모두는 NMDA 흥분성독성을 회복시키지 못한다(도 5a 및 도 22a). comet 검정에 의하여, 야생형 피질 뉴런의 NMDA 투여가 실질적인 수의 comet 테일을 갖는 뉴런, 증가된 테일 길이 및 테일에서의 DNA를 야기시키고, MIF 녹아웃 뉴런이 명백한 comet 테일 양성 뉴런을 가지지 않는다는 것이 확인되었다(도 5b 및 도 22b 내지 도 22d). MIF E22Q 또는 MIF E22A가 아닌, 야생형 MIF로의 녹아웃 뉴런의 형질도입은 NMDA 투여 후에 comet 테일을 회복시키고, 테일 길이 및 테일에서의 DNA를 증가시킨다(도 5b 및 도 22b 내지 도 22d). 2개의 상이한 shRNA를 갖는 HeLa 세포에서 MIF의 shRNA 녹다운은 MNNG 투여 후 비-타겟화된 shRNA와 비교하여 comet 테일을 갖는 감소된 세포 수, 감소된 테일 길이 및 테일에서의 DNA를 야기시킨다(도 23a 내지 도 23d). 게놈 DNA의 펄스 필드 겔 전기영동 검정은 NMDA 투여가 MIF 녹아웃 피질 뉴런이 아닌, 야생형 피질 뉴런에서 큰 DNA 단편을 야기시킨다는 것을 확인한다(도 5c). 큰 DNA 단편이 MIF E22Q, 또는 MIF E22A로 형질도입된 MIF 녹아웃 뉴런에서 명백하게 관찰되지 않는다(도 5c). 야생형 MIF로의 녹아웃 뉴런의 형질도입은 NMDA-유발 큰 DNA 단편을 회복시킨다(도 5c). 함께 고려된 이러한 결과는 MIF가 MNNG 또는 NMDA 유발 파르타나토스로 인한 대량 DNA 단편화에서 관여된 주요 뉴클레아제임을 나타낸다.
생체내 파르타나토스로 인한 세포사에서 MIF 뉴클레아제 활성 및 AIF에 대한 MIF 결합의 요건을 평가하기 위하여, MIF 녹아웃 마우스는 신생 마우스의 뇌실내 구역에 주사함으로써 뉴클레아제 결여 MIF E22Q 돌연변이체 및 AIF 결합 결여 돌연변이체 MIF E22A 돌연변이체로 형질도입되었다. 이후에, 2개월령 수컷 마우스는 중대뇌동맥(middle cerebral artery: MCAO)의 45분 일과성 폐색(transient occlusion)으로 처리되었다. 형질도입의 효과는 성숙한 마우스에서 피질, 선조체 및 해마에서 MIF-FLAG에 대해 면역염색함으로써 확인되었다(도 24a 및 도 24b). 허혈성 상해의 유사한 강도에도 불구하고(도 24c), 경색 부피는 야생형 대응물과 비교하여 MIF 녹아웃 마우스의 피질, 선조체 및 반구에서 약 30% 감소된다(도 5d 및 도 5e, 및 도 24d 및 도 24e). 또한, MIF 녹아웃 마우스에서의 신경보호는 적어도 7일 동안 유지된다(도 5e 및도 24e). MIF 녹아웃 마우스에서, MIF E22Q 또는 MIF E22A가 아닌, 야생형 MIF의 발현은 야생형 수준으로 경색 부피를 회복시킨다(도 5d 및 도 5e, 및 도 24d 및 도 24e). 신경행동은 MCAO 후 1일, 3일, 및 7일에 개방 필드 태스크(open field task)에서 자발적 활성에 의해 평가되었다. 경색 데이터와 일치하여, MIF 녹아웃 마우스는 야생형과 비교하여 개선된 신경행동 스코어를 갖는다. 야생형 MIF를 발현시키는 MIF 녹아웃 마우스는 야생형 마우스와 균등한 신경행동 스코어를 가지며, MIF E22Q 또는 MIF E22A의 발현은 MIF 녹아웃 마우스와 크게 차이가 나지 않는다(도 5f 및 도 5g). 3일 및 7일에 걸쳐, MIF 녹아웃 마우스의 신경행동 스코어는 야생형 마우스에 비해 보호된다(도 5f 및 도 5g). 코너 시험 데이터는, 모든 마우스가 MCAO 수술 전에 측면 선호도를 나타내지 않음을 나타낸다. 그러나, 야생형 마우스 및 야생형 MIF를 발현시키는 MIF 녹아웃 마우스는 MCAO 후 1일, 3일 및 7일에 손상되지 않은 측면 쪽으로 전환을 상당히 증가하였는데(도 24f), 이는 이러한 마우스가 더욱 심각한 감각 및 운동 장애를 가짐을 나타낸다. MIF 녹아웃 마우스 및 MIF E22Q 또는 MIF E22A의 발현을 갖는 MIF 녹아웃에서 선호성이 관찰되지 않았다(도 24f). AIF 및 MIF 국소화는 뇌졸중의 반음영 영역에서 공초점 현미경을 통해 시험되었다(도 24g). 피질 뉴런의 관찰과 일치하여, AIF는 MIF 야생형, 녹아웃뿐만 아니라, MIF 야생형, E22Q, 및 E22A가 주사된 MIF 녹아웃 마우스에서 MCAO 후 1일, 3일 및 7일에 핵으로 전위한다(도 24g). MIF 야생형 및 MIF E22Q 둘 모두는 또한, MCAO 후 1일, 3일, 및 7일에 핵으로 전위한다. 그러나, AIF 결합 결여 돌연변이체 MIF E22A는 전위하지 못한다(도 24g). 펄스 필드 겔 전기영동에 의해 평가된 바와 같은 DNA 손상은 MCAO 후 1일, 3일 및 7일에 관찰되며, 3일에 야생형 마우스 또는 야생형 MIF를 발현시키는 MIF KO 마우스에서 가장 심각한 DNA 손상을 나타낸다(도 24h). DNA 손상은 MIF KO 마우스 및 E22Q 또는 E22A MIF를 발현시키는 MIF KO 마우스에서 감소된다(도 24h). 이러한 데이터는 MIF가 AIF 매개 신경독성 및 DNA 분열을 위해 요구되며 AIF가 생체내 MIF 전위를 위해 요구된다는 것을 나타낸다.
본 발명의 주요 발견은 PAAN으로서 MIF의 동정이다. 분자 모델링을 이용하여, MIF 트라이머가 2개의 α-나선 다음의 중심 4개 가닥 혼합 β-시트를 갖는 PD-D/E(X)K 뉴클레아제 수퍼패밀리와 동일한 토폴로지 구조를 함유하는 것이 나타났다(24,25). MIF는 3' 엑소뉴클레아제 및 엔도뉴클레아제 활성 둘 모두를 갖는다. 이는 스템 루프 구조를 갖는 ssDNA의 5' 홀염기에 결합하고, 이의 3' 홀염기를 절단한다. AIF는 MIF와 상호작용하고, MIF가 게놈 DNA를 결합시키고 파르타나토스를 활성화하는 스트레서(stressor)에 의해 유도된 크기와 유사한 큰 단편으로 절단하는 핵에 MIF를 구조한다. MIF의 녹아웃은 PARP-1 의존성 세포사를 활성화시키는 자극에 의해 유도된 DNA 단편화를 상당히 감소시킨다. PD-D/E(X)K 모티프에서 중요한 아미노산 잔기를 돌연변이화하는 것은 MIF의 뉴클레아제 활성을 제거하고, 시험관내 및 생체내 둘 모두에서 파르타나토스로부터 세포를 보호한다. AIF 및 MIF 단백질-단백질 상호작용의 파괴는 시토솔에서 핵으로서의 MIF의 전위를 방지하며, 이는 또한, 시험관내 및 생체내 둘 모두에서 PARP-1 의존성 세포사에 대해 보호한다. MIF의 티올-단백질 옥시도리덕타아제 활성 또는 타우토머라아제 활성은 뉴클레아제로서 이의 작용과 관련이 없다. MIF, MIF 뉴클레아제-결핍 돌연변이체 및 MIF AIF 결합 결핍 돌연변이체 모두의 녹아웃은 경색 부피를 감소시키고, 마우스에서 뇌졸중의 공초점 허혈 모델에서 오래 지속되는 거동 구조를 갖는다. 이에 따라, MIF는 PARP-1의 활성화 및 AIF의 방출로 인해 세포사에서 중요한 PAAN 후에 오랫 동안 추구되었다(2).
PARP와 같이, MIF 뉴클레아제 활성의 억제는 급성 신경 장애를 위한 매력적인 타겟이다. 그러나, 이는 장기간의 PARP 억제가 DNA 손상 반응 및 수리를 손상시킬 수 있는 만성 신경퇴행성 질병에서 PARP 억제에 비해 장점을 가질 수 있다. MIF의 뉴클레아제 활성의 억제는 이러한 가능한 개념을 우회할 수 있고, 다양한 장애에 대한 중요한 치료 기회를 제공할 수 있다.
MIF가 3' 엑소뉴클레아제 활성 및 엔도뉴클레아제 활성 둘 모두 및 뉴클레아제 활성에 대한 이의 우선적 DNA 서열을 갖는다는 것이 확인되었다. 이러한 서열은 DNA-BIND 플레이트 상에 고정되고, 재조합 MIF와 함께 또는 거대고리 화합물 라이브러리로부터의 풀(pool) 없이 인큐베이션되고, 바이오티닐화된 상보적 DNA로 하이브리드화된다. 서열은 분광계에 의해 측정된 비색 변화(colorimetric change)에 의해 검색된다. 풀이 MIF 억제제를 함유하는 경우에, 황색 기질 칼라는 유지될 것이다. MIF가 활성인 경우에, DNA는 절단될 것이며, 칼라가 없어질 것이다(도 6).
거대고리 천연 산물 FK506 및 라파마이신은 중요한 생물학적 활성을 갖는 승인된 면역억제 약물이다. 구조적으로, FK506 및 라파마이신은 유사한 FKBP-결합 도메인을 공유하지만, 이의 이펙터 도메인이 상이하다. FK506 및 라파마이신의 이펙터 도메인의 스위칭은 칼시뉴린으로부터 mTOR로의 타겟의 변화를 제공할 수 있다. 이에 따라, 인간 프로테옴에서 이펙터 도메인을 타겟 단백질로 기능적으로 대체하는 것이 가능하다. 라파퓨린으로 명명되는, 합성 FKBP-결합 도메인 및 테트라-펩티딜 이펙터 도메인을 함유한 새로운 거대고리의 라이브러리가 설계되고, 새로운 단백질을 타겟화하기 위해 생성되었다(도 7). 라이브러리의 스크리닝 시에, MIF의 뉴클레아제 활성을 강력하게 억제하는 여러 히트(hit)가 동정되었다.
하이브리드 거대고리 라이브러리는 15개의 개별 화합물의 풀에서 45,000개의 화합물로 이루어진다. 38개의 플레이트(약 3000 풀)는 스크리닝되었으며, 풀링된 라이브러리의 스크리닝은 절단 검정으로 완료되었다(도 8). 양성 풀에서의 화합물은 절단 검정에서 개별적으로 시험되었고, 파르타나토스를 위한 유도제로서 MNNG로 처리된 HeLa 세포에서 시험관내에서 신경보호 작용에 대해 추가로 평가되었다(도 9). 12개의 양성 후보물질은 초기에 선택되고 용량-반응 DNA 절단 검정 및 MNNG-유발 세포사 검정에서 시험되었으며, 이후에, 4개의 후보물질(C7; 12B3-11, C8; 12B3-11, C11; 17A5-1, C12; 17A5-2)은 최종적으로 선택되었다.
양성 후보물질은 TBE 겔에서 용량-반응 DNA 절단 검정(도 10a) 및 MNNG로 처리된 HeLa 세포에서 신경보호 효과로 진행되었다(도 10b). 또한, 양성 후보물질은 α-시누셀린 사전-형성 피브릴(α-Syn PFF) 신경독성에서 시험되었다. 재조합 미스폴딩된 α-syn PFF의 처리는 시험관내 및 생체내 α-시누클레인의 전염 및 독성의 연구를 가능하게 하는 파킨슨병의 모델 시스템을 제공한다. 1차 피질 배양물은 14일 동안 PFF ± MIF 억제제에 노출되었다. 세포 생존력은 Hoechst/프로피듐 요오다이드 양성 세포의 컴퓨터 보조 세포 카운팅에 의해 결정되었다. 여기에서, C8 및 C12는 PFF-유발 독성에서 가장 큰 보호 효과를 나타내었으며, 2개의 히트는 PFF 독성에서 용량-반응에서 확인되었다(도 11).
물질 및 방법
인간 단백질 칩 고처리량 스크리닝
특수한 니트로셀룰로오스-코팅된 슬라이드(15) 상에 16,000 또는 5,000개의 고도로 정제된 단백질을 스폿팅함으로써 제조된 16K 및 5K 인간 단백질 칩은 4℃에서 1시간 동안 50 mM 트리스-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.3% Tween 20을 함유한 재생 완충제에서 인큐베이션되었다. 실온에서 1시간 동안 5% 비-지방 분유로 차단한 후에, 단백질 칩은 1시간 동안 1% 우유 중에서 정제된 마우스 AIF 단백질(50 nM, NP_036149)과 함께 인큐베이션되었다. 단백질 상호작용은 이후에, 순차적으로 토끼 항-AIF 항체(9, 11) 및 Alexa Fluor® 647 당나귀 항-토끼 IgG, 또는 단지 음성 대조군으로서 Alexa Fluor® 647 당나귀 항-토끼 IgG와 함께 인큐베이션함으로써 결정되었다. 단백질 마이크로어레이는 Cy5 이미지를 이용한 GenePix 4000B Microscanner(Tecan)로 스캐닝하였으며, 각 스폿의 평균 형광이 계산되었다. 상호작용하는 단백질을 동정하기 위한 전술된 동일한 절차가 사용되었다(15).
PARP-1-의존성 세포 생존력에 대한 역트랜스펙션 포맷 siRNA-기반 스크린
인간 단백질 칩 고처리량 스크리닝으로부터 얻어진 AIF-상호작용 단백질을 타겟화하는 On-Target plus™ SMARTpool® siRNA는 Dharmacon으로부터의 96-웰 플레이트에서 커스톰화되었다. 플레이트는 실온에서 30분 동안 DharmaFECT 1 트랜스펙션 시약을 사용하여 재수화되었다. 이후에, HeLa 세포는 1 × 104/웰의 세포 밀도로 플레이트에 시딩되었다. 트랜스펙션 후 48시간 후에, 세포는 15분 동안 MNNG(50 μM) 또는 DMSO로 처리되고, 이후에, 24시간 동안 일반 완전 배지 중에서 인큐베이션되었다. 1 내지 4시간 동안 alamarBlue를 첨가한 후에, 세포 생존력은 여기 파장 570 nm 및 방출 파장 585 nm에서의 형광에 의해 결정되었다. PARP-1 siRNA는 양성 대조군으로서 사용되었으며, 음성 대조군으로서 비-타겟 siRNA가 사용되었다.
뉴클레아제 검정
인간 게놈 DNA(200 ng/반응, Promega), pcDNA(200 ng/반응) 또는 PS30 및 이의 관련된 및 관련 없는 기질(1 μM)은 37℃에서 1시간(pcDNA 및 작은 DNA 기질과 함께) 또는 4시간(인간 게놈 DNA와 함께) 동안, 10 mM MgCl2 및 1 mM DTT 또는 명시된 바와 같은 특정 완충제를 함유한 10 mM 트리스-HCl 완충제(pH 7.0)에서 명시된 바와 같이 0.25 내지 8 μM의 최종 농도의 야생형 MIF 또는 이의 변이체와 함께 인큐베이션되었다. 반응은 10 mM EDTA를 함유한 로딩 완충제 및 얼음 상에서의 인큐베이션으로 종결되었다. 인간 게놈 DNA 샘플은 6 V/cm에서 12시간 동안 1.5초의 초기 스위치 시간 및 3.5초의 최종 스위치 시간과 함께 0.5 X TBE 완충제에서 1.2% 펄스 필드 인증 아가로오스 상에서 바로 분리되었다. pcDNA 샘플은 1% 아가로오스 겔에 의해 결정되었다. 작은 DNA 기질은 15% 또는 25% TBE-우레아 폴리아크릴아미드(PAGE) 겔 또는 20% TBE PAGE 겔 상에서 분리되었다. 이후에, 겔은 0.5 ㎍/ml 에티듐 브로마이드(EtBr)로 염색되고, 이후에, 나일론 막으로 전기영동 전달되었다. 이후에, 바이오틴-표지된 DNA는 Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module(Thermo Scientific)을 이용한 화학발광에 의해 추가로 검출된다.
전기영동 이동성 변화 검정(EMSA)
EMSA 검정은 제조업체 지시에 따라 LightShift Chemiluminescent EMSA 키트(Thermo Scientific)를 이용하여 수행되었다. 간단하게, 정제된 MIF 단백질(2 μM)은 얼음 상에서 30분 동안 10 mM MgCl2를 함유한 결합 완충제에서 바이오틴-표지된 DNA 기질(10 nM)과 함께 인큐베이션되었다. 이후에, 샘플은 6% 지연 폴리아크릴아미드 상에서 분리되었고, 이후에, 나일론 막으로의 전기영동 전달되었다. 이후에, 바이오틴-표지된 DNA는 Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module(Thermo Scientific)을 이용하여 화학발광에 의해 추가로 검출된다.
Comet 검정
Comet 검정은 Trevigen(Gaithersburg, MD)에 의해 제공된 프로토콜에 따라 수행되었다. 간단하게, MNNG 처리를 갖는 또는 이의 없는 HeLa 세포 및 NMDA 처리를 갖는 또는 이의 없는 피질 뉴런은 처리 후 6시간에 얼음-냉각 PBS로 세척되고, 10분 동안 720 g으로의 원심분리에 의해 수확되고, 1 × 105 세포/ml에서 얼음-냉각 PBS(Ca2+ 및 Mg2+ 부재)에서 재-현탁되었다. 세포는 이후에 1:10(v/v)의 비율로 PBS(42℃) 중 1% 저융점 아가로오스와 조합되었으며, 50 ㎕의 세포-아가로오스 혼합물은 CometSlide 상에 바로 피펫팅되고, 부착을 향상시키기 위해 30분 동안 어두운 곳에서 4℃에서 배치되었다. 용해 완충제에서 용해된 후에, 슬라이드는 실온에서 1시간 동안 알칼리 언와인딩 용액(alkali unwinding solution)(200 mM NaOH, pH >13, 1 mM EDTA)에 함침되었다. comet 슬라이드는 수평 전기영동 장비에서 21 볼트에서 30분 동안 1 L의 알칼리 언와인딩 용액과 함께 전달되고 전기영동되었다. 과량의 전기영동 완충제를 배수한 후에, 슬라이드는 dH2O로 2회 세정되고, 이후에, 50분 동안 70% 에탄올로 고정되고, 4℃에서 5분 동안 SYBR Green으로 염색되었다. 세포 이미지는 Zeiss 에피플루오레슨트 현미경(Zeiss epifluorescent microscope; Axiovert 200M)을 이용하여 캡쳐되었으며, 이미지 분석은 CASP 소프트웨어(version 1.2.2)로 수행되었다. 핵의 에지에서 comet 테일의 단부까지의 길이로서 지칭되는 "comet 테일"의 길이는 각 샘플에 대하여 측정되었다.
단백질 발현 및 정제
인간 endoG(NM_004435), 사이클로필린 A(NM_021130), 마우스 AIF(NM_012019), 인간 MIF(NM_002415) cDNA 및 이들의 변이체는 EcoRI 및 XhoI 제한 부위에 의해 글루타티온 S-트랜스퍼라아제(GST)-태그화 pGex-6P-1 벡터(GE Healthcare) 내에 서브클로닝되고, 시퀀싱에 의해 확인되었다. 단백질은 글루타티온 세파로오스에 의해 대장균(Escherichia coli)으로부터 발현되고 정제되었다. GST 태그는 후속하여 뉴클레아제 검정을 위해 단백질 분해 제거되었다. MIF 점 돌연변이체는 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)에 의해 작제화되고, 시퀀싱에 의해 확인되었다. 뉴클레아제 검정에서 사용된 MIF 단백질의 순도는 질량 분광분석법에 의해 추가로 확인되었다. FPLC에 의해 정제된 MIF 단백질은 또한, 뉴클레아제 검정에서 사용되었으며, FPLC MIF와 비-FPLC MIF 단백질 간에 명백한 차이가 관찰되지 않았다. GST 단백질은 뉴클레아제 검정에서 음성 대조군으로서 사용되었다.
중대뇌동맥 폐색(MCAO)
대뇌 허혈은 이전이 기술된 바와 같이 45분의 가역적 MCAO에 의해 유발되었다(33). 성숙한 수컷 MIF KO 마우스(2 내지 4개월령, 20 내지 28 g)는 이소플루란으로 마취되었으며, 체온은 피드백-제어된 가열 시스템에 의해 36.5±0.5℃에서 유지되었다. 정중선의 복부 목(ventral neck) 절개가 이루어졌으며, 일방적 MCAO는 외부 경동맥 스텀프(external carotid artery stump)를 통해 내부 경동맥/뇌척수 동맥 분기로부터 6 내지 8 mm에서 우측 내부 경동맥 내에 7.0 나일론 모노필라멘트를 삽입함으로써 수행되었다. 모조 수술 동물(Sham-operated animal)은 동일한 수술 절차로 수행되었지만, 봉합은 내부 경동맥으로 진행되지 않았다. 재관류 1일, 3일 또는 7일 후에, MIF WT 및 KO 마우스는 PBS로 재관류되었고, 트리페닐 테트라졸륨 클로라이드(TTC)로 염색되었다. 뇌는 4% PFA로 추가로 고정되고, 면역조직화학 염색을 위해 슬라이싱되었다(9, 11, 15, 34).
ChIP-Seq
ChIP-seq는 이전에 기술된 바와 같이 수행되었다(35, 36). 간단하게, HeLa 세포는 먼저 DMSO 또는 MNNG(50 μM, 15분)로 처리되었다. MNNG 처리하고 5시간 후에, 세포는 37℃에서 20분 동안 1% 포름알데하이드로 가교되고, 0.125 M 글리신에서 켄칭되었다. 염색질 추출은 초음파처리 전에 수행되었다. 항-MIF 항체(ab36146, Abcam)가 사용되었으며, DNA는 초음파처리된 세포 용해물로부터 면역침전되었다. 라이브러리는 DNA 샘플 키트와 함께 Illumina의 지시에 따라 제조되었고, 50 bp 단일-단부 리드의 생성과 함께 Illumina HiSeq2000을 이용하여 시퀀싱되었다.
상세한 절차는 하기와 같다. HeLa 세포는 15분 동안 DMSO 또는 MNNG(50 μM)로 처리하고, 추가적인 5시간 동안 새로운 배지에서 배양되었다. 이후에, 세포는 37℃에서 10분 동안 1% 포름알데하이드로 가교되었으며, 반응은 실온에서 20분 동안 0.125 M 글리신에서 켄칭되었다. 염색질은 Cell Signaling Technology로부터의 SimpleChIP® Enzymatic 염색질 IP 키트(Cat# 9003)를 이용하여 추출되었고, Bioruptor Twin(Diagenode)을 이용하여 30초 온(on) 및 30초 오프(off)로 15회 사이클 동안 초음파처리되었다. 전단된 염색질 DNA의 양 및 크기는 DNA 전기영동에 의해 아가로오스 겔 상에서 시험되었다. 10%의 염색질은 유입물로서 유지되었으며, 나머지 염색질은 단백질 G 아가로오스 비드에 대한 직접적인 비특이적 결합을 배제하기 위하여 4℃에서 30분 동안 10 ㎕ 자성 단백질 G 아가로오스 슬러리를 사용하여 희석되고 사전-제거되었다. 사전-제거된 염색질은 4℃에서 자성 단백질 G 아가로오스 슬러리(30 ㎕)의 존재 하에서 항-MIF 항체(3 ㎍/ml, ab36146, Abcam) 또는 대조군(3 ㎍/ml)과 함께 밤새 인큐베이션되었다. 단백질 G 아가로오스 비드를 3회 동안 세척한 후에, 단백질 G 아가로오스/항체 복합물의 절반은 면역침전의 특성을 체크하기 위하여 면역블롯 검정으로 수행되었다. 단백질 G 아가로오스/항체 복합물의 다른 절반은 65℃에서 1% SDS, 0.1M NaHCO3을 함유한 170 ㎕의 용리 완충제에 용해되었다. 염색질 유입물뿐만 아니라 용리물은 37℃에서 30분 동안 1 mg/ml RNase A로 처리되었고, 3 ㎕의 5 M NaCl 및 1 ㎕의 10 mg/ml 프로테이나아제 K를 첨가한 후 65℃에서 4시간 동안 인큐베이션함으로써 역-가교되었다. 최종적으로, 염색질 DNA는 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올을 사용하여 정제되고 에탄올에 의해 침전되었다. ChIP 및 유입물 DNA 라이브러리는 지시에 따라 Illumina's Truseq DNA LT Sample Prep Kit를 이용하여 제조되었다. 최종 산물은 15회 사이클 동안 증폭되었다. 삽입물의 특성 및 크기는 바이오분석기(bioanalyzer)를 이용하여 분석되었다. 시퀀싱은 존스 홉킨스의 차세대 시퀀싱 센터(Next Generation Sequencing Center)에서 50 bp 단일-단부 리드(read)의 생성과 함께 Illumina HiSeq2000을 이용하여 수행되었다. ChIP-seq 미가공 데이터는 GEO 데이터베이스 가입 #: GSE65110으로 기탁되었다.
ChIP-Seq Data 분석
HiSeq2000으로부터의 미가공 데이터는 CASAVA v1.8을 이용하여 FASTQ로 변환되고 역다중화되었다. 리드는은 디폴트 파라미터를 이용한 Bowtie2(v2.0.5)를 이용하여 인간 게놈(hg19)에 대해 맵핑되었다. 변환된 SMA 파일은 디폴트 파라미터를 이용하여 피크 콜링(peak calling)을 위해 MACS(v1.4.1)로 진행되었다. DMSO- 및 MNNG-처리된 라이브러리로부터의 피크는 배스 포멧(bed format)으로 보고되었고, CEO에서 제공된다. DMSO- 및 MNNG-처리된 그룹에서 차별적으로 식별된 피크는 커스톰 R 스크립에 의해 분석되었다. DMSO-처리된 라이브러리가 아닌, 단지 MNNG-처리된 라이브러리에서 식별된 피크에 해당하는 서열은 디폴트 파라미터를 이용한 모티프 발견을 위해 SeSiMCMC_4_36, Chipmunk v4.3+, 및 MEMEchip v4.9.0에 제공되었다.
데이터 전송: CASAVAv1.8 소프트웨어는 미가공 파일을 fastq 파일로 변환시키기 위해 이용되었고, 또한, 레인을 역다중화하였다.
DMSO_MIF: JHUTD01001/JHUTD01001_001_DPAN1/raw
DMSO_Input: JHUTD01001/JHUTD01001_002_Dinput1/raw
MNNG_MIF: JHUTD01001/JHUTD01001_003_MPAN1/raw
MNNG_Input: JHUTD01001/JHUTD01001_004_Minput1/raw
분석: 하기는 분석 단계에 의해 사용되는 파라미터와 함께 분석 단계의 리스트이다. 모든 모티프 발견 소프트웨어는 디폴트 설정(default setting)을 이용하여 수행되었다.
1. 정렬 파이프라인(Alignment pipeline)
a. 단일 SAM 파일을 생성시키는, hg19 게놈에 대한 단편 정렬을 수행하기 위한 디폴트 파라미터를 갖는 Bowtie2-2.0.5
JHUTD01001/JHUTD01001_001_DPAN1/DPan1_hg19_alignment.sam
JHUTD01001/JHUTD01001_002_Dinput1/Dinput1_hg19_alignment.sam
JHUTD01001/JHUTD01001_003_MPAN1/MPan1_hg19_alignment.sam
JHUTD01001/JHUTD01001_004_Minput1/Minput1_hg19_alignment.sam
b. samtools-0.1.18/을 이용하여 SAM 파일을 BAM 파일로 분류 및 변환
JHUTD01001/JHUTD01001_001_DPAN1/DPan1_hg19_alignment.bam
JHUTD01001/JHUTD01001_002_Dinput1/Dinput1_hg19_alignment.bam
JHUTD01001/JHUTD01001_003_MPAN1/MPan1_hg19_alignment.bam
JHUTD01001/JHUTD01001_004_Minput1/Minput1_hg19_alignment.bam
2. 디폴트 파라미터를 이용한 MACS-1.4.1을 이용한 피크 콜
a. 피크 콜
JHUTD01001/JHUTD01001_000_analysis/MACS/ DPan1_vs_Dinput_peaks.bed
JHUTD01001/JHUTD01001_000_analysis/MACS/ MPan1_vs_Minput_peaks.bed
b. 주석이 달린 피크 콜(Annotated peak call)
JHUTD01001/ JHUTD01001_000_analysis/MACS/DPan1_vs_Dinput_annotation.txt
JHUTD01001/ JHUTD01001_000_analysis/MACS/MPan1_vs_Minput_annotation.txt
c. 유전자를 기반으로 한 차등 피크 콜(differential peak call)을 수행하기 위한 커스톰 Rscript
JHUTD01001/JHUTD01001_000_analysis/MACS/intersections.bothsamples.DPan1.MPan1.txt
JHUTD01001/JHUTD01001_000_analysis/MACS/intersectionsDPan1_not_MPan1.txt
JHUTD01001/JHUTD01001_000_analysis/MACS/intersectionsMPan1_not_DPan1.txt
d. 주석이 달린 차등 피크 콜
JHUTD01001/JHUTD01001_000_analysis/MACS/only_DPan1_annotation.txt
JHUTD01001/JHUTD01001_000_analysis/MACS/only_MPan1_annotation.txt
3. IGVtools을 통해 생성된 정렬을 보기 위한 커버리지 트랙(Coverage track)
JHUTD01001/JHUTD01001_000_analysis/coverage_analysis/DPan1.tdf
JHUTD01001/JHUTD01001_000_analysis/coverage_analysis/Dinput1.tdf
JHUTD01001/JHUTD01001_000_analysis/coverage_analysis/MPan1.tdf
JHUTD01001/JHUTD01001_000_analysis/coverage_analysis/Minput1.tdf
4. 모티프는 3개의 상이한 소프트웨어를 이용하여 확인됨
a. SeSiMCMC_4_36
JHUTD01001/JHUTD01001_000_analysis/motif/SeSiMCMC_motif_Dpan1.txt
JHUTD01001/JHUTD01001_000_analysis/motif/SeSiMCMC_DPan1_logo.png
JHUTD01001/JHUTD01001_000_analysis/motif/SeSiMCMC_MPan1_motif.txt
JHUTD01001/JHUTD01001_000_analysis/motif/SeSiMCMC_MPan1_logo.pdf
b. Chipmunk v4.3+
JHUTD01001/JHUTD01001_000_analysis/motif/DPan1_ChiPMunk_motif.txt
JHUTD01001/JHUTD01001_000_analysis/motif/MPan1_ChipMunk_motif.txt
c. MEMEchip v4.9.0
JHUTD01001/JHUTD01001_000_analysis/motif/MEME ChIP_DPan1.webarchive
JHUTD01001/JHUTD01001_000_analysis/motif/MEME ChIP_MPan1.webarchive
JHUTD01001/JHUTD01001_000_analysis/motif/only_MPan1_MEME_ChIP.webarchive
5. 영역 주석, 유전자 중심 주석 및 게놈 특성 부근의 평균 신호 프로파일링에 대한 플롯을 생성시키기 위한 CEAS 소프트웨어
JHUTD01001/JHUTD01001_000_analysis/CEAS/DPan1.pdf
JHUTD01001/JHUTD01001_000_analysis/CEAS/MPan1.pdf
JHUTD01001/JHUTD01001_000_analysis/CEAS/MPan1_only.pdf
MIF-DNA 도킹 방법
DNA 이중 구조(37)(PDB 기탁 1BNA) 및 단일 가닥 DNA 구조(PDB 기탁 2RPD(38))는 Hex-8.0. 단백질-DNA 도킹 프로그램을 이용하여 MIF(PDB 기탁 1FIM (23))의 표면 상에 도킹되었다(39, 40). Hex 프로그램은 단백질과 DNA 간의 접촉을 식별하기 위해 표면 상보성 알고리즘을 이용한다. MIF 표면은 Pymol을 이용하여 생성되었다.
모든 이미지는 pdb 뷰어, Pymol로 나타내고 라벨링되었다. MIF-DNA 도킹된 모델은 HEX 프로그램으로부터 얻어진 것으로 나타낸다.
렌티바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV) 작제화 및 바이러스 형성
마우스 MIF-WT-Flag(NM_010798), MIF-E22Q-Flag 및 MIF-E22A-Flag는 AgeI 및 EcoRI 제한 부위에 의해 렌티바이러스 cFugw 벡터 내로 서브클로닝되었으며, 이의 발현은 인간 유비퀴틴 C(hUBC) 프로모터에 의해 유도되었다. 인간 MIF 및 마우스 MIF shRNA는 웹사이트<http://katahdin.cshl.org/siRNA/RNAi.cgi?type=shRNA>를 이용하여 설계되었다. 프로그램은 shRNAmir를 생성시키기 위해 97 nt 올리고 서열을 제공하였다. PacI SME2 포워드 프라이머 5' CAGAAGGTTAATTAAAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCG 3' 및 NheI SME2 리버스 프라이머 5' CTAAAGTAGCCCCTTGCTAGCCGAGGCAGTAGGCA 3'을 사용함. PCR은 제2 가닥을 생성하기 위해 수행되었으며, PacI 및 NheI 제한 부위는 산물을 pSME2로 클로닝하기 위해 첨가되었으며, 이는 변형된 제한 부위를 갖는 pSM2 벡터에서 빈 shRNAmir 발현 카셋트를 cFUGw 골격 내에 삽입하는 작제물이다. 이러한 벡터는 GFP를 발현시킨다. 렌티바이러스는 3개의 패키징 벡터, 즉 pLP1, pLP2, 및 pVSV-G(1.3:1.5:1:1.5)와 함께 293FT 세포 내에 재조합 cFugw 벡터의 일시적 트랜스펙션에 의해 형성되었다. 바이러스 상청액은 트랜스펙션 후 48시간 및 72시간에 수집되고, 50,000 g에서 2시간 동안 원심분리에 의해 농축되었다.
MIF-WT-Flag, MIF-E22Q-Flag 및 MIF-E22A-Flag는 BamHI 및 EcoRI 제한 부위에 의해 AAV-WPRE-bGH(044 AM/CBA-pI-WPRE-bGH) 벡터 내에 서브클로닝되었으며, 이의 발현은 닭 β-액틴(CBA) 프로모터에 의해 유도되었다. 모든 AAV2 바이러스는 Vector BioLabs에 의해 형성되었다.
MIF 기질, 주형 및 프라이머의 서열
shRNA 작제물 및 점 돌연변이 작제물을 위해 사용되는 MIF 기질, 주형 및 프라이머의 서열은 하기와 같다.
PS100 -
5'ACCTAAATGCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTCTCAGCCTCCCAAGTAGCTGGGATTACAGGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATGAG3';
PS100R -
5'CTCATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACCTGTAATCCCAGCTACTTGGGAGGCTGAGAGTCGAGGCTGATCAGCGAGCTCTAGCATTTAGGT3';
PR30 - 5'CTCAGCCTCCCAAGTAGCTGGGATTACAGG3';
SL - 5'CCTGTAATCCCAAGTAGCTGGGATTACAGG3';
LF - 5'AAAAAAACTCAGCCTCCCAAGTAGCTGGGA3';
RF - 5'TCCCAAGTAGCTGGGATTACAGGAAAAAAA3';
PA30 - 5'AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA3';
3E - 5'CTCAGCCTCCCAAGTAGCTGGGATTACAGG3'; 5'TCCCAGCTACTTGGGAGGCTGAG3';
PS40 - 5'CTCAGCCTCCCAAGTAGCTGGGATTACAGGTAAACTTGGT3';
3F1 - 5'AAAAAAAAAACAAGTAGCTGGGATTACAGG3';
L3 - 5'ACCTAAATGCTAGAGCTCGCTGATCAGCCT3'
hMIFshRNA1 -
TGCTGTTGACAGTGAGCGCTCATCGTAAACACCAACGTGCTAGTGAAGCCACAGATGTAGCACGTTGGTGTTTACGATGAATGCCTACTGCCTCGGA;
hMIFshRNA2 -
TGCTGTTGACAGTGAGCGACGCGCAGAACCGCTCCTACAGTAGTGAAGCCACAGATGTACTGTAGGAGCGGTTCTGCGCGCTGCCTACTGCCTCGGA;
hMIFshRNA3 -
TGCTGTTGACAGTGAGCGAAGGGTCTACATCAACTATTACTAGTGAAGCCACAGATGTAGTAATAGTTGATGTAGACCCTGTGCCTACTGCCTCGGA;
mMIFshRNA1 -
TGCTGTTGACAGTGAGCGCTCATCGTGAACACCAATGTTCTAGTGAAGCCACAGATGTAGAACATTGGTGTTCACGATGAATGCCTACTGCCTCGGA;
mMIFshRNA2 -
TGCTGTTGACAGTGAGCGAGCAGTGCACGTGGTCCCGGACTAGTGAAGCCACAGATGTAGTCCGGGACCACGTGCACTGCGTGCCTACTGCCTCGGA;
mMIFshRNA3 -
TGCTGTTGACAGTGAGCGACGGGTCTACATCAACTATTACTAGTGAAGCCACAGATGTAGTAATAGTTGATGTAGACCCGGTGCCTACTGCCTCGGA;
AIFshRNA1 -
TGCTGTTGACAGTGAGCGCGGAACCGGCTTCCAGCTACAGTAGTGAAGCCACAGATGTACTGTAGCTGGAAGCCGGTTCCTTGCCTACTGCCTCGGA;
WT-mMIF-fw2 - CGGGATCCGCCACCATGCCTATGTTCATCGTGAAC;
WT-mMIF-re - CGGAATTCTCAAGCGAAGGTGGAACCGT;
Rsh1-mMIF-fw - CACCATGCCTATGTTTATTGTCAATACGAACGTACCCCGCGCCTCCGTG;
Rsh1-mMIF-re - CACGGAGGCGCGGGGTACGTTCGTATTGACAATAAACATAGGCATGGTG;
Rsh3-mMIF-fw - GCACATCAGCCCGGACCGCGTGTATATTAATTACTATGACATGAACGCTGCC;
Rsh3-mMIF-re - GGCAGCGTTCATGTCATAGTAATTAATATACACGCGGTCCGGGCTGATGTGC;
hMIF P2G fw - GGGATCCCCGGAATTCggGATGTTCATCGTAAACACC;
hMIF P2G Re - GGTGTTTACGATGAACATCCCGAATTCCGGGGATCCC;
P16A-hMIF-fw - CCTCCGTGGCGGACGGGTTC;
P16A-hMIF-re - GAACCCGTCCGCCACGGAGG;
D17A-hMIF-fw - CGCGCCTCCGTGCCGGCCGGGTTCCTCTCC;
D17A-hMIF-re - GGAGAGGAACCCGGCCGGCACGGAGGCGCG;
D17Q-hMIF-fw - CCGTGCCGCAAGGGTTCCTC;
D17Q-hMIF-re - GAGGAACCCTTGCGGCACGG;
E22A-hMIF-fw - GGGTTCCTCTCCGCGCTCACCCAGCAGCTG;
E22A-hMIF-re - CAGCTGCTGGGTGAGCGCGGAGAGGAACCC;
E22Q-hMIF-fw - GGGTTCCTCTCCCAGCTCACCCAGCAGCTG;
E22Q-hMIF-re - CAGCTGCTGGGTGAGCTGGGAGAGGAACCC;
E22D-hMIF-fw - GGGTTCCTCTCCGACCTCACCCAGCAGCTG;
E22D-hMIF-re - CAGCTGCTGGGTGAGGTCGGAGAGGAACCC;
P44A-hMIF-fw - GTGCACGTGGTCGCGGACCA;
P44A-hMIF-re - CATGAGCTGGTCCGCGACCA;
D45A-hMIF-fw - GCACGTGGTCCCGGCCCAGCTCATGGCCTTC;
D45A-hMIF-re - GAAGGCCATGAGCTGGGCCGGGACCACGTGC;
D45Q-hMIF-fw - GTGGTCCCGCAACAGCTCAT;
D45Q-hMIF-re - CCATGAGCTGTTGCGGGACC;
E55A-hMIF-fw2 - CTTCGGCGGCTCCAGCGCGCCGTGCGCGCTCTG;
E55A-hMIF-re2 - CAGAGCGCGCACGGCGCGCTGGAGCCGCCGAAG;
E55D-hMIF-fw - CTCCAGCCAGCCGTGCGCGC;
E55D-hMIF-re - GCGCGCACGGCTGGCTGGAG;
E86A-hMIF-fw - GGCCTGCTGGCCGCGCGCCTGCGCATCAGC;
E86A-hMIF-re - GCTGATGCGCAGGCGCGCGGCCAGCAGGCC;
R87Q-hMIF-fw - GCTGGCCGAGCAACTGCGCATCAG;
R87Q-hMIF-re - CTGATGCGCAGTTGCTCGGCCAGC;
R89Q-hMIF-fw - CCGAGCGCCTGCAAATCAGC;
R89Q-hMIF-re - GCTGATGCGCAGTTGCTCGG;
P92A-hMIF-fw - GCGCATCAGCGCGGACAGGG;
P92A-hMIF-re - CCCTGTCCGCGCTGATGCGC;
D93A-hMIF-fw2 - CTGCGCATCAGCCCGGCCAGGGTCTACATCAAC;
D93A-hMIF-re2 - GTTGATGTAGACCCTGGCCGGGCTGATGCGCAG;
D93Q-hMIF-fw - CAGCCCGCAAAGGGTCTACA;
D93Q-hMIF-re - TGTAGACCCTTTGCGGGCTG;
D101A-hMIF-fw - CATCAACTATTACGCCATGAACGCGGCC;
D101A-hMIF-re - GGCCGCGTTCATGGCGTAATAGTTGATG;
C57A;C60AhMIFfw - CGGCGGCTCCAGCGAGCCGGCCGCGCTCGCCAGCCTGCACAGCATCGGC;
C57A;C60AhMIFre - GCCGATGCTGTGCAGGCTGGCGAGCGCGGCCGGCTCGCTGGAGCCGCCG;
E22D-mMIF-fw - GAGGGGTTTCTGTCGGACCTCACCCAGCAGCTG;
E22D-mMIF-re - CAGCTGCTGGGTGAGGTCCGACAGAAACCCCTC;
E22Q-mMIF-fw - GAGGGGTTTCTGTCGCAGCTCACCCAGCAGCTG;
E22Q-mMIF-re - CAGCTGCTGGGTGAGCTGCGACAGAAACCCCTC;
AAV2-mMIFfw - CGGATCCGCCACCATGCCTATGTTCATCGTG;
AAV2-mMIFre - CGGAATTCTCACTTGTCGTCGTCGTCCTTGTAGTCAGCGAAGGTGGAACCGT;
hEndoG-fw - CGGAATTCATGCGGGCGCTGCGGGCCGGCCT;
hEndoG-re - CCGCTCGAGTCACTTACTGCCCGCCGTGATG;
hCypA-fw - CGGAATTCATGGTCAACCCCACCGTGTTC;
hCypA-re - CCGCTCGAGTTATTCGAGTTGTCCACAGTCAG
EndoG gRNA1: CCGCCGCCGCCAACCACCGC(TGG)
EndoG gRNA2: GGGCTGGGTGCGGTCGTCGA(GGG)
괄호 안의 세 문자는 PAM 서열을 나타내며, 다른 서열(20 nt)은 타겟 부위이다.
세포 배양물, 트랜스펙션, 렌티바이러스 형질도입, 및 세포독성
HeLa 세포는 10% 우태아혈청(HyClone)이 공급된 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)(Invitrogen)에서 배양되었다. V5-태그 MIF는 Lipofectamine Plus(Invitrogen)으로 트랜스펙션되었다. 피질로부터의 1차 뉴런 배양물은 이전에 기술된 바와 같이(9) 제조되었다. 간단하게, 피질은 해부되었으며, 세포는 0.027% 트립신/염수 용액(Gibco-BRL)에서의 10분 소화 후에 변형 이글 배지(MEM), 20% 말 혈청, 30 mM 글루코오스 및 2 mM L-글루타민에서의 분쇄에 의해 해리되었다. 뉴런은 폴리오르니틴으로 코팅된 15 mm 다중웰 플레이트 상에 또는 폴리오르니트린으로 코팅된 커버슬립 상에 플레이팅되었다. 뉴런은 7% CO2 가습 37℃ 인큐베이터에서 MEM, 10% 말 혈청, 30 mM 글루코오스, 및 2 mM L-글루타민에 유지되었다. 성장 배지는 1주일에 2번 교체되었다. 성숙한 배양물에서, 뉴런은 세포의 총수의 70 내지 90%를 나타내었다. 시험관내 7일 내지 9일(DIV)에, 뉴런은 72시간 동안 MIF-WT-Flag, MIF-E22Q-Flag, 또는 MIF-E22A-Flag[1×109 단위(TU)/ml]를 지닌 렌티바이러스에 의해 감염되었다. 파르타나토스는 HeLa 세포 중 MNNG (Sigma) 또는 뉴런 중 NMDA(Sigma) 중 어느 하나에 의해 유도되었다. HeLa 세포는 15분 동안 MNNG(50 μM)에 노출되었으며, 뉴런(DIV 10 내지 14)은 대조군 염 용액[CSS, 120 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 25 mM 트리스-Cl, 및 20 mM 글루코오스(pH 7.4) 함유]으로 세척되고, 5분 동안 CSS 중 500 μM NMDA 플러스(plus) 10 μM 글리신에 노출되고, 이후에, 고정, 면역세포화학적 염색, 및 공초점 레이저 주사 현미경 전 다양한 시간에 10% 말 혈청, 30 mM 글루코오스, 및 2 mM L-글루타민을 함유한 MEM에 노출되었다. 세포 생존력은 다음날에, 7 μM Hoechst 33342 (Invitrogen)으로 모든 핵의 염색 및 2 μM 프로피듐 요오다이드(Invitrogen)로의 죽은 세포 핵의 염색 후에 편견없는 객관적인 컴퓨터-보조 세포 카운팅에 의해 결정되었다. 전체 및 죽은 세포의 수는 Axiovision 4.6 소프트웨어(Carl Zeiss)로 카운팅되었다. 적어도 6개의 별도의 웰을 이용한 적어도 3개의 별도의 실험은 데이터 포인트 당 카운팅된 최소 15,000 내지 20,000개의 뉴런 또는 세포로 수행되었다. 뉴런 독성 평가를 위하여, 신경교 핵은 뉴런 핵과는 상이한 강도에서 형광을 나타내었고, 게이트 아웃(gate out)되었다. 세포사의 백분율은 배양물의 기계적 자극에 기여하는 세포사를 설명하기 위해 대조군 웰에서 세포사의 백분율과 비교하여 죽은 세포에 대한 살아있는 세포의 비율로서 결정되었다.
풀-다운, 공동면역침전, 및 면역블롯팅
풀-다운 검정을 위하여, GST-태그 MIF 또는 AIF 단백질 고정 글루타티온 세파로오스 비드는 500 ㎍의 HeLa 세포 용해물과 함께 인큐베이션되고, 용해 완충제에서 세척되고, 단백질 로딩 완충제에서 용해되었다. 공동면역침전을 위하여, 1 mg 전체-세포 용해물은 단백질 A/G 세파로오스(Santa Cruz Biotechnology)의 존재 하에서 AIF 항체(1 ㎍/ml)와 함께 밤새 인큐베이션되고, 이후에, 마우스 항-Flag 항체(Clone M1, Sigma), 마우스 항-V5(V8012, Sigma) 또는 염소 항-MIF(ab36146, Abcam)로 면역블롯 분석되었다. 단백질은 변성 SDS-PAGE 상에서 분리되고, 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다. 막은 차단되고, 4℃에서 1차 항체(50 ng/ml; 마우스 항-Flag; 토끼 항-AIF; 또는 염소 항-MIF)와 함께 밤새 인큐베이션되고, 이후에, 실온에서 1시간 동안 호스래디스 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase)(HRP)-컨쥬게이션된 당나귀 항-마우스, 항-토끼 또는 항-염소와 함께 인큐베이션되었다. 세척 후에, 면역 복합물은 SuperSignalWest Pico Chemiluminescent Substrate(Pierce)에 의해 검출되었다.
하위세포 분획
핵 단백질을 제거한 후에 전체 세포 용해물로부터 제조된 분획인, 핵 추출물(N) 및 포스트핵 세포 추출물(postnuclear cell extract: PN)은 저장성(hypotonic) 완충제에서 단리되었다(9, 11). 핵 및 포스트핵 하위세포 분획의 무결성은 히스톤 H3 및 MnSOD 또는 Tom20 면역재활성을 모니터링함으로써 결정되었다(9, 11).
면역세포화학, 면역조직화학, 및 공초점 현미경
면역세포화학을 위하여, 세포는 MNNG 또는 NMDA 처리 후 4시간에 4% 파라포름알데하이드로 고정되고, 0.05% Triton X-100으로 투과되고, PBS 중 3% BSA로 차단되었다. AIF는 당나귀 항-토끼 Cy3 또는 당나귀 항-토끼 647에 의해 시각화되었다. MIF는 당나귀 항-마우스 cy2(2 ㎍/ml), 당나귀 항-염소 Cy2 또는 당나귀 항-염소 647에 의해 시각화되었다. 면역조직화학은 Flag에 대한 항체로 수행되었다. 면역형광 분석은 기술된(9) 바와 같이 LSM710 공초점 레이저 주사 현미경(Carl Zeiss)으로 수행되었다.
FPLC
정제된 재조합 MIF의 천연 상태 및 순도는 Superdex 200 10/300GL 컬럼(GE Healthcare, Life Sciences)을 이용하여 Akta Basic FPLC(Amersham-Pharmacia Limited)에서 공지된 분자량의 천연 마커 단백질의 용리 부피와 분자 질량(kDa) 간의 표준 교정 곡선을 이용하여 결정되었다. 겔 여과 컬럼은 0.5 ml/분의 유량에서 표준 PBS 완충제에서 수행되었다. 하기 분자량 표준물이 사용되었다: 페리틴(440 kDa), 알돌라아제(158 kDa), 콘알부민(75 kDa), 오브알부민(43 kDa), 탄산 탈수효소(29 kDa), 및 리보뉴클레아제(13.7 kDa) 각각(GE Healthcare, Life Sciences). MIF를 함유한 용리된 분획은 단백질의 순도를 체크하기 위하여 12% SDS-PAGE 상에서 분해되고 쿠마시 블루(commassie blue)로 염색되었다.
MIF 단백질 순도에 대한 질량 분광 분석
뉴클레아제 검정을 위해 사용되는 MIF 단백질은 또한, 다른 공지된 뉴클레아제로부터 임의의 가능한 오염을 배제하기 위하여 질량 분광법에 의해 시험되었다. 95% 이하의 신뢰 수준에서 상이한 기준을 이용한 분석은 뉴클레아제의 임의의 희박한 가능성(remote possibility)을 캡쳐하기 위해 수행되었다. 모든 종을 이용한 NCBI 데이터베이스의 분석 및 조사는, 단일 또는 이중-가닥 DNA를 소화할 수 있는 알려지지 않은 뉴클레아제가 뉴클레아제 검정에서 사용된 MIF 단백질에서 검출되었음을 나타낸다.
원편광 이색성(CD) 분광법
CD 분광법은 AVIV 420 CD 분광계(Biomedical Inc., Lakewood, NJ, USA) 상에서 수행되었다. 근-UV CD 스펙트럼은 실온에서 2 mg/ml의 농도의 단백질 샘플과 함께 0.5 cm 경로 길이의 석영 큐벳을 이용하여 240 내지 320 nm에서 기록되었다. 원 UV CD 스펙트럼은 또한 0.2 mg/ml 농도의 단백질 샘플과 함께 0.1 cm 경로 길이의 석영 샌드위치 큐벳을 이용하여 실온에서, 190 내지 260 nm에서 기록되었다(41). 단백질은 마그네슘 클로라이드(5.0 mM) 및/또는 아연 클로라이드(0.2 mM)와 함께 또는 이의 없이 PBS 완충제 중에 현탁되었다. CD 스펙트럼은 0.5 nm 데이터 피치, 1 nm/3초 스캔 속도로부터 얻었으며, 0.5초 반응 시간은 기록을 위해 선택되었다.
옥시도리덕타아제 활성 검정
MIF의 티올-단백질 옥시도리덕타아제 활성은 이전에 기술된 바와 같이 기질로서 인슐린을 사용하여 측정되었다(30). 간단하게, 인슐린 검정은 인슐린의 감소 및 후속 인슐린 β-사슬의 불용화를 기초로 한 것이다. 탁도의 시간-의존적 증가는 이후에, 650 nm에서 분광학적으로 측정된다. 반응은 20 mM 소듐 포스페이트 완충제(pH 7.2) 중에 용해된 5 μM MIF WT, E22A, E22Q, C57A;C60A 또는 및 P2G 돌연변이체, 및 200 mM 환원된 글루타티온(GSH)을 1 mg/ml 인슐린, 100 mM 소듐 포스페이트 완충제(pH 7.2) 및 2 mM EDTA를 함유한 얼음-냉각 반응 혼합물에 첨가함으로써 개시되었다. MIF 인슐린 감소는 동일한 실험에서 대조군 용액(GSH를 함유함)에 대해 측정되었다.
타우토머라아제 활성 검정
타우토머라아제 활성은 이전에 기술된 바와 같이 기질로서 D-도파크롬 타우토머라아제를 사용하여 측정되었다(42). 간단하게, D-도파크롬 메틸 에스테르의 새로운 용액은 실온에서 5분 동안 2 mM L-3,4 디하이드록시페닐알라닌 메틸 에스테르를 4 mM 소듐 퍼옥시데이트와 혼합함으로써 제조되었고, 이후에, 사용 전에 얼음 바로 위에 배치되었다. 효소 반응은 20 ㎕의 도파크롬 메틸 에스테르 기질을 타우토머라아제 검정 완충제(50 mM 포타슘 포스페이트, 1 mM EDTA, pH 6.0)에서 제조된 200 ㎕의 MIF WT, E22A, E22Q, C57A;C60A(최종 농도 5 μM)) 또는 및 P2G 돌연변이체에 첨가함으로써 25℃에서 개시되었다. 활성은 분광광도계를 이용하여 OD 475 nm의 반-연속 감소에 의해 결정되었다.
뇌실 내(ICV) 주사
3 ㎕ AAV2-MIF WT, E22Q 및 E22A(1×1013 GC/ml, Vector BioLabs)는 신생 MIF KO 마우스의 뇌실 내의 양측면 내에 주사되었다(34). MIF 및 이의 변이체의 발현은 8주령 내지 16주령의 연령 동안에 MCAO 수술 후에 면역조직화학에 의해 체크되었다.
신경행동 활성
5분 동안 마우스 케이지에서 동물을 배치시킴으로써 MCAO 후 1일, 3일 및 7일에 자발적 운동 활성이 평가되었다. 케이지에서 마우스의 활성을 기록하기 위해 케이지의 상부 상에 비디오 카메라가 장착되었다. 신경학적 결손은 동물의 치료 및 유전자형에 대해 블라인딩된 관찰자에 의해 0 내지 5의 스케일로 평가되었다(0, 신경학적 결손 없음; 5, 심각한 신경학적 결손). 하기 기준은 결손을 스코어링하기 위해 이용되었다: 0 = 마우스는 정상인 것으로 보이고, 케이지 환경을 살피고, 케이지 내부를 자유롭게 이동하였다; 1 = 마우스는 케이지에서 주춤거리면서 이동하였지만 케이지의 벽을 가끔 터치할 수 있었다, 2 = 마우스는 자세 및 운동 이상을 나타내었고, 케이지의 모든 측면에 접근하지 못하였다, 3 = 마우스는 자세 및 운동 이상을 나타내었고, 케이지의 중앙에서 중간 크기의 원을 만들었다, 4 = 자세 이상을 나타내고 적소에서 매우 작은 원을 만든 마우스, 5 = 마우스는 케이지에서 움직이지 않았고 중앙에 머물렀다. 기록값은 동물의 치료 및 유전자형에 대해 블라인딩된 관찰자에 의해 평가되었다.
피질 및 선조체 손상 둘 모두 후에 감각 및 운동 장애를 평가하기 위해 MCAO 후 1일, 3일 및 7일 후에 코너 시험이 수행되었다. 5분 동안 케이지에서 마우스의 활성을 기록하기 위하여 케이지의 상부 상에 비디오 카메라가 장착되었다. 마우스는 각각이 30°의 각도로 에지로부터 서로 부착된 30 cm × 20 cm × 0.5 mm의 치수를 갖는 2개의 카드보드 사이에 배치되었다. 한번 코너에서, 마우스는 대개 뒤쪽을 향하고, 이후에 왼쪽 또는 오른쪽으로 돈다. 뇌줄중 전에, 마우스는 측면 선호(side preference)를 나타내지 않는다. 뇌졸중 후 감각 및 운동 장애를 갖는 마우스는 손상되지 않은 측면(오른쪽) 쪽으로 돌 것이다. 오른쪽 턴(turn)의 % = 오른쪽 턴/전체 턴×100이 계산되고 비교되었다. 기록값은 동물의 치료 및 유전자형에 대해 블라인딩된 관찰자에 의해 평가되었다.
동물
존스 홉킨스 의료기관은 실험실 동물 관리 인증을 위한 미국 협회(American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care; AAALAC)에 의해 완전히 인증되었다. 본 연구에서 수행된 모든 연구 절차는 동물 복지법 규정 및 보건 서비스(Animal Welfare Act regulations and Public Health Service; PHS) 정책에 따라 존스 홉킨스 의료기관 기관 동물 관리 및 이용 위원회(IACUC)에서 승인되었다. 모든 동물 연구는 블라인드 방식으로 수행되었다. 마우스 유전자형은 K.N에 의해 결정되었다. 뇌졸중 수술은 R.A에 의해 수행되었다. 마우스 유전자형은 뇌졸중 수술, 마우스 거동 시험 및 데이터 분석 후에 해독되었다. 이의 유전자형을 기초로 하여, 마우스는 WT, KO, KO-WT, KO-E22Q 및 KO-E22A로서 그룹핑되었다. 각 그룹 내에서, 마우스는 가짜(sham), 뇌줄중 후 1일, 뇌줄중 후 3일 또는 뇌졸중 후 7일을 포함하는 서브그룹으로 무작위로 배정되었다.
통계학적 분석
달리 명시하지 않는 한, 통계학적 평가는 2개의 그룹들 간의 스튜던트 테스트에 의해 및 일원 분산 분석(one-way analysis of variance: ANOVA)에 의해 수행되었고, 이후에, 여러 그룹 내에서의 GraphPad Prism 소프트웨어를 이용하여 Bonferroni 테스트와 post hoc 비교로 수행되었다. 데이터는 평균 ± SEM이 나타난다. P <0.05는 유의미한 것을 여겨진다. 정량화를 위한 실험은 블라인드 방식으로 수행되었다. 효과를 검출하기 위한 적절한 파워를 보장하기 위하여, 적어도 3회의 독립적인 테스트는 모든 분자 생화학 연구를 위해 수행되었으며, 3가지의 상이한 문자로부터의 적어도 5마리의 마우스는 동물 연구를 위해 사용되었다.
EndoG, MIF 단백질 구조, MIF 돌연변이, MIF 단백질 순도, ChIP 시퀀싱 데이터 및 MIF-AIF 상호작용의 추가적인 분석
EndoG는 PARP-1 의존성 세포사에 대해 불필요하다.
EndoG가 이전에 기술된 바와 같이(13, 14) 파르타나토스에 대해 불필요함을 확인하기 위하여, CRISPR/Cas9 시스템은 인간 SH-SY5Y 세포로부터 endoG를 녹아웃시키도록 사용되었다(도 12a). endoG의 녹아웃이 MNNG 유도 파르타나토스(도 12b) 및 큰 DNA 단편화(도 12c)를 차단하는데 실패하였다는 것이 확인되었으며, EndoG가 파르타나토스를 위해 요망되지 않는다는 것을 확인한다(13, 14).
MIF 단백질 구조의 분석
뉴클레아제의 코어 PD-D/E(X)K 토폴로지 구조는 2-나선 다음에 4β-가닥으로 이루어진다(18). β-가닥 중 2개는 서로 평행하며, 나머지 2개는 역평행하였다(도 14c, 변형된 형태 (18)). MIF의 이전 3-D 결정 구조는 이러한 것이 트라이머로서 존재함을 나타낸다(21-23). MIF의 트라이머 구조는 각 모노머의 β-가닥과 다른 모노머의 상호작용을 가능하게 하여 2개의 α-가닥 다음에 4개의 β-가닥으로 이루어진 PD-D/E(X)K 구조를 야기시킨다(도 1e 및 도 14d 내지 도 14g). β-가닥 중 2개(β-4 및 β-5)는 평행하며, 다른 2개의 가닥(β-6 및 β-7)(인접한 모노머로부터)은 역평행하였다(도 14d 및 도 14g). MIF 트라이머에서 알파 나선에 대한 베타-가닥의 배향을 갖는 PD-D/E(X)K 모티프의 토폴로지 구조는 잘 특징분석된 엔도뉴클레아제인 EcoRV와 매우 유사하다(도 14h 내지 도 14k). 중요하게, MIF의 트라이머 구조를 기초로 한 PD-D/E(X)K 모티프는 EcoRI 및 EcoRV와 같은 타입 II ATP 독립적 제한 엔도뉴클레아제뿐만 아니라, ExoIII과 같은, ExoIII 패밀리 푸린/아피리미딘(AP) 엔도뉴클레아제와 구조적으로 유사하다(도 1e 및 도 14l 내지 도 14n). 또한, MIF는 또한, PvuII 엔도뉴클레아제와 유사한 토폴로지를 가지며, 이의 β-7 가닥운 이의 PD-D/E(x)K 모티프에서 동일한 위치에서 PvuII 엔도뉴클레아제 β-가닥과 유사한 크기를 갖는다(도 14o). 함께 고려된 이러한 3-D 모델링 결과는 MIF가 PD-D/E(X)K 뉴클레아제-유사 수퍼패밀리에 속하다는 것을 나타낸다(24, 25).
MIF의 뉴클레아제 활성에 대해 중요한 중요한 잔기의 동정
MIF의 뉴클레아제 활성에 대해 중요한 아미노산 잔기를 동정하기 위하여, MIF의 PD-D/E(X)K 도메인 내의 중요한 아스파르테이트 및 글루타메이트 잔기는 알라닌으로 돌연변이된다. 글루타메이트 22의 알라닌(E22A)으로의 치환은 MIF의 뉴클레아제 활성을 명확하지만 완전하지 않게 감소시키며, D17A, D45A, E55A, E86A, D93A 및 D101A를 포함하는 다른 아스파르테이트 및 글루타메이트에서의 알라닌 치환은 실질적인 효과를 가지지 않는다(도 15e). MIF의 CxxCxxHx(n)C 아연 핑거 도메인의 C57A;C60A로의 돌연변이는 눈에 띄는 효과를 가지지 않는다(도 15e). MIF E22A가 감소된 뉴클레아제 활성을 갖기 때문에, E22 주변의 추가적인 보존된 돌연변이가 이루어졌다(도 15f 및 도 15g). MIF E22Q가 뉴클레아제 활성을 가지지 않으며(도 2d 및 도 15d 및 도 15h), E22D가 야생형과 균등한 뉴클레아제 활성을 갖는다(도 2d)는 것이 확인되었다. 이러한 데이터는 MIF의 제1 α-나선에서 글루타만산 잔기(E22)가 이의 뉴클레아제 활성에 대해 중요함을 제시하며, 이는 여러 엑소뉴클레아제-엔도뉴클레아제-포스파타아제(EEP) 도메인 수퍼패밀리 뉴클레아제의 제1 α-나선에서 이러한 글루탐산이 고도로 보존되며 이러한 것이 뉴클레아제 활성에 대한 활성 부위이다(24, 25). 3차원 구조 모델링(도 1e)을 기초로 하여, P16A, P44A, R87Q, R89Q, P92A, D45Q, D17Q, E55Q, 및 D93Q를 포함하는 가능한 MIF DNA 결합 부위는 돌연변이되었다(도 15h). P16A 또는 D17Q가 MIF 뉴클레아제 활성을 방지한다는 것이 확인되었다(도 15h). MIF의 서열 정렬 및 3차원 구조 모델링 둘 모두를 기준으로 하여, 데이터는 P16, D17 및 E22가 동일한 PD-D/E(X)K 모티프 내에 있으며 각 단일 잔기의 돌연변이가 MIF 뉴클레아제 활성을 차단하기에 충분함을 나타낸다. 제1 α-나선이 종에 걸쳐 고도로 보존되고 이전에 PD-D/E(X)K 뉴클레아제-유사 수퍼패밀리 뉴클레아제 활성에 대한 활성 부위로서 보고된 사실을 고려하여(24, 25), E22 돌연변이체는 후속 연구에 초점을 맞추었다.
EndoG 및 사이클로필린 A는 PARP-1 의존성 큰 DNA 단편화에서 직접적으로 관련되지 않는다.
EndoG 및 사이클로필린 A는 이전에 AIF 관련 뉴클레아제인 것으로 제시되었다(43-45). 펄스-필드 겔 전기영동은 EndoG가 DNA를, 파르타나토스에서 관찰된 더 큰 DNA 단편화 패턴과 일치하지 않는 작은 단편으로 절단함을 나타낸다(도 15d). 반대로, MIF는 DNA를, MNNG 유도 DNA 단편과 유사한 패턴을 갖는 큰 단편으로 절단한다(도 2b 및 도 15d)(13, 14). 사이클로필린 A 및 AIF는 음성 대조군으로서 제공되는 글루타티온 S-트랜스퍼라아제(GST)와 함께 명백한 뉴클레아제 활성을 갖지 않는다(도 15d).
MIF 뉴클레아제 활성은 이의 옥시도리덕타아제 및 타우토머라아제 활성에 독립적이다.
이전 연구는, MIF가 옥시도리덕타아제 활성 및 타우토머라아제 활성 둘 모두를 가짐을 나타낸다(27, 29, 30). 야생형 및 MIF 돌연변이체의 옥시도리덕타아제 활성은 기질로서 인슐린을 사용하여 측정되었으며, 여기서, 감소된 인슐린은 야생형 MIF의 존재 하에서 650 nm의 광학 밀도 값을 나타낸다(도 16a). E22Q, E22A, C57A;C60A MIF 돌연변이체 및 타우토머라아제 P2G MIF 돌연변이체는 MIF의 옥시도리덕타아제 활성에 대해 눈에 띄는 효과를 가지지 않는다(도 16a). MIF's 타우토머라아제 활성이 또한 측정되었다. E22Q, E22A, C57A;C60A MIF 돌연변이는 MIF의 타우토머라아제 활성에 상당한 영향을 미치지 않으며, P2G MIF 돌연변이체는 MIF의 타우토머라아제 활성을 유의미하게 감소시킨다(도 16b). 함께 고려되는 이러한 결과는 MIF 활성 부위 돌연변이체 E22Q 및 E22A가 MIF의 옥시도리덕타아제 또는 타우토머라아제 활성에 대해 명백한 효과를 가지지 않음을 나타낸다.
정제된 MIF 단백질은 우발적인 뉴클레아제 오염을 가지지 않는다.
재조합 MIF 제조물이 우발적인 뉴클레아제를 함유하지 않음을 확인하기 위하여, FPLC가 수행되었다. FPLC는 트라이머로서 존재하는 MIF와 일치하는 대략 37 kD의 분자량에서 단지 하나의 피크를 나타낸다. MIF E22Q 및 E22A는 또한, 트라이머 구조와 일치하는 37 kD에서 용해하는데, 이는 이러한 돌연변이가 MIF의 형태에 상당한 영향을 미치지 않음을 시사한다(도 16c). 쿠마시브 청색 염색은 FPLC 정제 후 단백질(도 16d)뿐만 아니라 FPLC 정제 없는 단백질(도 15g)에서 단지 단일 밴드를 나타낸다. FPLC 정제를 갖는 및 이의 없는 두 가지 타입의 단백질 모두는 뉴클레아제 검정에서 사용되었으며, 명백한 차이가 관찰되지 않았다. 뉴클레아제 검정에서 사용되는 모든 이러한 재조합 MIF 단백질의 순도는 또한, 2-독립 질량 분광법(MS) 검정에 의해 확인되었다. MS에 의해 동정된 대부분의 펩티드는 MIF이다. 단일 또는 이중 가닥 DNA를 절단할 수 있는 모든 종으로부터의 알려지지 않은 뉴클레아제가 동정되었다. 이에 따라, MIF 제조물은 매우 순수하며, 우발적인 뉴클라아제가 존재하지 않는다.
MIF 단백질 확인은 E22Q, E22A 및 C57A;C60A 돌연변이에 의해 영향을 받지 않는다.
단백질 2차 구조를 연구하기 위한 일반적인 방법인 원자외선(UV) 원편광 이색성(CD) 분광법은, 야생형 MIF가 MIF의 이전에 보고된 결정 구조와 일치하여 α-나선 및 β-시트의 혼합물로 이루어짐을 나타낸다(22). MIF 돌연변이체, E22Q, E22A 및 C57A;C60A는 야생형 MIF와 유사한 CD 스펙트럼을 나타낸 것으로서, 이는 이러한 돌연변이가 MIF의 형태에 유의미하게 영향을 미치지 않음을 시사한다(도 16e). 야생형 MIF 또는 MIF 돌연변이체에 Mg2+의 첨가 시에 유의미한 변화가 관찰되지 않는다(도 16f 내지 도 16i). 그러나, Zn2+의 첨가는 스펙트럼에서 큰 변화를 증진시키는데, 이는 Zn2+ 결합에 대한 야생형 MIF 단백질의 구조의 유의미한 변화를 나타낸다(도 16f). MIF E22Q 및 E22A는 Zn2+의 존재 하에서 야생형 MIF와 유사한 CD 스펙트럼을 나타낸다(도 16g 및 도 16h). 그러나, C57A;C60A 돌연변이체에 Zn2+의 첨가는 CD 스펙트럼에서 변화를 야기하지 않는데, MIF의 CxxCxxHx(n)C 아연 핑거 도메인에서 MIF가 Zn2+를 결합함을 나타낸다(도 16i).
근 UV CD 분광법은 MIF 및 MIF 돌연변이체의 3차 구조를 추가로 분석하기 위해 사용되었다. 정제된 단백질은 근 UV CD 스펙트럼에서 페닐알라닌 및 티로신의 별개의 피크가 존재하지 않기 때문에 적절히 폴딩된 3차 구조를 갖는다(도 16j). MIF 돌연변이체, E22Q, E22A 및 C57A;C60A는 야생형과 유사한 근 UV CD 스펙트럼을 나타내며, 이는 이러한 돌연변이가 MIF의 3차 구조에 유의미하게 영향을 미치지 않음을 시사한다(도 16j 내지 도 16m). 야생형 MIF 또는 MIF 돌연변이체 C57A;C60A에 Mg2+의 첨가는 Mg2+ 결합을 나타내는 3차 구조의 유의미한 변화를 야기시킨다(도 16j 및 도 16m). E22A는 Mg2+의 존재 하에서 최소 변화를 나타내며, E22Q는 근 UV CD 스펙트럼의 유의미한 변화를 나타내지 않으며, 이는 Mg2+가 E22에서 또는 부근에 결합함을 시사하며(도 16k 및 도 16l), 이는 Mg2+가 MIF의 뉴클레아제 활성을 위해 요구되며 E22Q 및 E22A 돌연변이체가 이의 뉴클레아제 활성을 완전히 또는 부분적으로 차달할 수 있다는 본 출원인의 발견과 일치한다. 야생형 MIF 또는 MIF 돌연변이체 E22A 및 E22Q에 Zn2+의 첨가는 Zn2+ 결합을 나타내는 3차 구조에서 유의미한 변화를 야기시키며, MIF C57A;C60A 돌연변이체는 CxxCxxHx(n)C 아연 핑거 도메인에 대한 Zn2+ 결합과 일치하는 유의미한 변화를 나타내지 않는다(도 16j 내지 도 16m).
MIF-DNA 결합 성질의 ChIP 시퀀싱 분석
데이터는 MIF가 뉴클레아제 활성을 가짐을 나타내기 때문에, 다음으로, MIF가 DMSO 또는 MNNG(50 μM, 15분)로 처리된 HeLa 세포에서 DNA에 결합하는 지의 여부가 연구되었다. 처리 후 5시간 후에, 세포는 ChIP 검정을 위해 가교되고 제조되고, 이후에, 딥 시퀀싱되었다. 전단 게놈 DNA의 특성 및 MIF 항체를 이용한 ChIP의 특이성이 시험되고 확인되었다(도 17a 및 도 17b). DMSO-처리 샘플에서 중첩된 피크를 배제한 후에, 전체 맵핑된 리드(mapped read)의 0.1%는 MNNG 처리 후 MIF 피크를 나타낸다(도 17c). MIF는 MNNG 처리 후 프로모터 및 5' UTR 영역에 우선적으로 결합한다(도 17d). 게놈 상의 MIF 농축의 예시적인 IGV 시각화는 2개의 상이한 윈도우 크기(250 kb(도 17e) 및 50 kb(도 17f))에서 나타난다. MIF 피크 간의 평균 거리 간격은 약 15 내지 60 kb이며, 이는 파르타나토스 동안 펄스-겔 전기영동을 통해 관찰된 DNA 단편의 크기와 일치한다. ChIP-qPCR은 MIF가 55101, 66005, 65892, 36229, 46426 및 62750에서 피크 영역에 결합하지만, 이러한 것이 MNNG 처리 후 비-피크 영역에 결합하지 않음을 추가로 확인한다(도 17g).
AIF-MIF 상호작용 맵핑
MIF가 AIF 상화작용 단백질임을 확인하기 위하여, GST 풀 다운 실험이 수행되었다. 야생형 GST-AIF는 내인성 MIF를 풀 다운하며, 야생형 GST-MIF는 내인성 AIF를 풀 다운한다(도 4a 및 도 21a 내지 도 21d). MIF를 결합하는 도메인은 다양한 GST-태그 AIF 도메인을 갖는 GST 풀 다운에 의해 추가로 규정되었다(도 21a). MIF는 GST-C2b AIF(aa 551-590) 및 GST C2e AIF(aa 571-612)에 결합한다(도 21a 및 도 21b). MIF는 GST-C2aAIF, GST-C2cAIF, GST-C2dAIF 또는 GST에 결합하지 않으며, 이는 사용되는 실험 조건에서 GST를 비특이적으로 결합하지 않음을 나타낸다(도 21a 및 도 21b). aa567-592를 폴리알라닌으로 돌연변이시킴(AIFm567-592) 또는 전장으로부터 aa567-592(AIF△567-592)를 제거하는 것은 MIF 및 AIF 결합을 완전히 처분하였으며(도 21c), 이는 MIF가 aa 567-592에서 AIF에 결합함을 시사한다.
MIF의 이전 결정화 연구는 MIF가 PD-D/E(x)K 뉴클레아제와 구조적으로 유사하다는 것을 3-D 모델링을 통해 입증하였다. PD-D/E(X)K 도메인을 함유한 단백질은 뉴클레아제-유사 수퍼패밀리에 속하며(리뷰를 위해 (24, 25) 참조), 이는 MIF가 뉴클레아제라는 추가 증거를 제공한다. 이러한 뉴클레아제 수퍼패밀리는 모든 삶의 계(kingdom of life)로부터 뉴클레아제를 함유한다. 대부분의 이러한 단백질은 원핵 유기체에 속하지만, 이러한 도메인은 다양한 척추동물 뉴클레아제와 함께 함유된다(24, 25). MIF에서 PD-D/E(X)K 도메인은 척추동물에서 고도로 보존된다. MIF의 제1 α-나선에서 글루탐산 잔기(E22)는 이의 뉴크레아제 활성에 대해 중요하며, 이는 여러 엑소뉴클레아제-엔도뉴클레아제-포스파타아제(EEP) 도메인 수퍼패밀리 뉴클레아제의 제1 α-나선에서 이러한 글루탐산이 고도로 보존되며 이러한 것이 뉴클레아제 활성에 대한 활성 부위라는 이전 보고서와 일치한다(24, 25).
코어 PD-D/E(x)K 구조는 2개의 α-나선 다음에 4개의 β-가닥으로 이루어진다. β-가닥들 중 2개는 서로 평행하며, 다른 2개는 역평행하였다(18, 24). 흥미롭게도, 유사 2-폴드 대칭을 갖는 MIF 모노머는, MIF 모노머가 2개의 α-나선 다음에 4개의 β-가닥을 갖기 때문에 코어 PD-D/E(x)K 구조를 함유하지 않으며, 단리된 모노머 내의 β-가닥의 방향은 PD-D/E(x)K 토폴로지의 요건에 적합하지 않다(22). 그러나, 3-폴드 대칭을 갖는, MIF 트라이머를 기초로 한 구조-활성 분석은, 다른 모노머와 각 모노머의 β-가닥의 상호작용이 2개의 β-가닥 다음에 4개의 β-가닥으로 이루어진 MIF PD-D/E(x)K 구조를 야기시킴을 나타낸다(22). β-가닥들 중 2개는 평행하며(β-4 및 β-5), 다른 2개의 가닥(β-6 및 β-7)(인접한 모노머로부터)은 역평행하였다. 이러한 토폴로지는, MIF의 뉴클레아제 활성이 모노머로서 트라이머를 필요로 한다는 사상이 요망되지 않는 토폴로지를 지지하지 않고 트라이머로서 존재하는 MIF와 일치함을 정교하게 지지한다. MIF 트라이머의 이러한 토폴로지는 α-1 나선을 배치시키며, 이는β-가닥 다음에 활성 잔기, 글루타메이트 22를 함유하지만, 이러한 것은 전례가 없는 것이다(18, 24). 예를 들어, EcoRV, 잘 특징분석된 엔도뉴클레아제는 전통적인 PD-D/E(x)K 모티프와 상이하고 MIF와 유사한 알파 나선에 대해 베타-가닥의 배향을 갖는 PD-D/E(x)K 모티프를 갖는다. EcoRV에 대한 MIF의 토폴로지의 유사성은, MIF가 잘 특징분석된 제한 엔도뉴클레아제와 매우 유사함을 시사한다. 실제로, (대개) 코어 α-나선으로부터의 보존된 산성 잔기, 제1 α-나선으로부터의 글루탐산은 종종 MIF에 대해 보고된 것과 유사한 적어도 PD-D/E(x)K 패밀리의 서브세트에서 활성 부위 형성에 기여한다. MIF의 트라이머 구조를 기초로 한 PD-D/E(x)K 모티프는 또한, 뉴클레아제 ExoIII, EcoRI 및 EcoRV와 매우 유사한 구조를 갖는다. 또한, MIF는 PvuII 엔도뉴클레아제와 유사한 토폴로지를 가지며, MIF'의 β-7 가닥은 이의 PD-D/E(x)K 모티프에서 동일한 위치에서 PvuII 엔도뉴클레아제 β-가닥과 유사한 크기를 갖는다(46). 구조 분석을 기초로 하여, MIF는 뉴클레아제로서 분류되어야 한다.
MIF는 다양한 다면 발현 작용을 갖는다. 이는 암 생물학, 면역 반응 및 염증에서 중요한 역할을 할 수 있는 비-전통적으로 분비된 시토카인으로서 기능한다(16, 17). MIF는 또한 세포 스트레스 및 아폽토시스에서 중요한 역할을 한다(47, 48). MIF의 녹아웃은 또한, 국소 허혈에서 신경보호적인 것으로 나타났다(49). 결과는, MIF의 녹아웃이 국소 허혈에 대해 보호함을 확인하고, MIF가 PAAN으로서 이의 기능과 일치하여 AIF 및 이의 뉴클레아제 활성에 대한 이의 결합을 통해 국소 허혈에서 신경 손상에 기여함을 나타낸다. MIF는 또한, 티올-단백질 옥시도리덕타아제 활성 및 타우토머라아제 활성을 갖는다. EMSA 및 ChIP 둘 모두는 MIF가 DNA를 결합함을 나타낸다. MIF가 중첩 서열의 고도로 관련된 패밀리를 결합하지만, 구조-활성 실험은, MIF가 이의 구조를 기준으로 한 ssDNA에 우선적으로 결합하고 서열 특이성에 덜 의존적임을 나타낸다. MIF는 스템 루프 구조를 갖는 ssDNA의 5' 홀염기에 결합하며, 이는 3' 엑소뉴클레아제 활성 및 엔도뉴클레아제 활성 둘 모두를 가지고, 스템 루프 ssDNA의 3' 단부에서 홀염기를 절단한다. 3차원 계산 모델링은 촉매 E22가 ssDNA의 모델링된 결합 도메인에 가깝다는 것을 나타낸다. 여기에 나타낸 바와 같이, MIF의 뉴클레아제 활성은 이의 옥시도리덕타아제 및 타우토머라아제 활성으로부터 명확하게 분리 가능하다.
AIF 관련 뉴클레아제를 동정하기 위한 이전 시도는 초기에 EndoG, 미토콘드리아 기질 단백질에 초점을 두었다(43). C 엘레간스(C. elegans) CPS-6에서, 포유류 EndoG의 동족체는 WAH-1의 (AIF 동족체) 세포사 유도 성질을 위해 요구된다. 그러나, 포유동물에서, EndoG는 PARP-1 의존성 허혈 세포사를 포함하는 세포사의 여러 모델에서 불필요하다(13, 14, 50). 중요하게, 중대뇌동맥 폐색 후에 야생형 대조군과 비교하여 EndoG 녹아웃 마우스에서 균등한 양의 DNA 단편화가 존재하였다(13). 이러한 관찰과 일치하여, endoG의 녹아웃이 MNNG 유도 파라타나토스 및 큰 DNA 단편화를 차단하는데 실패하였다는 것이 확인되었으며, 이는 EndoG가 파르타나토스를 위해 요구되지 않았음을 확인한다(13, 14). 반대로, MIF, MIF 뉴클레아제-결핍 돌연변이체 및 MIF AIF 결합 결핍 돌연변이체는 PARP-1의 활성화 후 시험관내 및 생체내 둘 모두에서의 세포사 및 큰 DNA 단편화를 방지한다. 이에 따라, EndoG는 포유동물에서 PAAN이 아니며, MIF는 이러한 역할을 위한 모든 기준에 적합하다. 최근에, AIF가 사이클로필린 A와 함께 활성 DNA 분해 복합물을 생성하였다는 것이 시사되었지만(45), 이러한 복합물에서 뉴클레아제가 동정되지 않았다.
표 1. 뉴클레아제 검정을 위해 사용된 MIF 기질의 요약(Y:예; N:아니오)
Figure pct00001
본 발명이 상기 예를 참조로 하여 기술되었지만, 변형 및 변경이 본 발명의 사상 및 범위 내에 포함되는 것으로 이해될 것이다. 이에 따라, 본 발명은 단지 하기 청구범위에 의해 제한된다.
참조문헌
본원에서 하기 참조문헌들은 각각 요구되고 도입된다.
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97 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 14 tgctgttgac agtgagcgct catcgtaaac accaacgtgc tagtgaagcc acagatgtag 60 cacgttggtg tttacgatga atgcctactg cctcgga 97 <210> 15 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 15 tgctgttgac agtgagcgac gcgcagaacc gctcctacag tagtgaagcc acagatgtac 60 tgtaggagcg gttctgcgcg ctgcctactg cctcgg 96 <210> 16 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 16 tgctgttgac agtgagcgaa gggtctacat caactattac tagtgaagcc acagatgtag 60 taatagttga tgtagaccct gtgcctactg cctcgga 97 <210> 17 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 17 gctgttgaca gtgagcgctc atcgtgaaca ccaatgttct agtgaagcca cagatgtaga 60 acattggtgt tcacgatgaa tgcctactgc ctcgga 96 <210> 18 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 18 tgctgttgac agtgagcgag cagtgcacgt ggtcccggac tagtgaagcc acagatgtag 60 tccgggacca cgtgcactgc gtgcctactg cctcgga 97 <210> 19 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 19 tgctgttgac agtgagcgac gggtctacat caactattac tagtgaagcc acagatgtag 60 taatagttga tgtagacccg gtgcctactg cctcgga 97 <210> 20 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 20 tgctgttgac agtgagcgcg gaaccggctt ccagctacag tagtgaagcc acagatgtac 60 tgtagctgga agccggttcc ttgcctactg cctcgga 97 <210> 21 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 21 cgggatccgc caccatgcct atgttcatcg tgaac 35 <210> 22 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 22 cggaattctc aagcgaaggt ggaaccgt 28 <210> 23 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 23 caccatgcct atgtttattg tcaatacgaa cgtaccccgc gcctccgtg 49 <210> 24 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 24 cacggaggcg cggggtacgt tcgtattgac aataaacata ggcatggtg 49 <210> 25 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 25 gcacatcagc ccggaccgcg tgtatattaa ttactatgac atgaacgctg cc 52 <210> 26 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 26 ggcagcgttc atgtcatagt aattaatata cacgcggtcc gggctgatgt gc 52 <210> 27 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 27 gggatccccg gaattcggga tgttcatcgt aaacacc 37 <210> 28 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 28 ggtgtttacg atgaacatcc cgaattccgg ggatccc 37 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 29 cctccgtggc ggacgggttc 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 30 gaacccgtcc gccacggagg 20 <210> 31 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 31 cgcgcctccg tgccggccgg gttcctctcc 30 <210> 32 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 32 ggagaggaac ccggccggca cggaggcgcg 30 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 33 ccgtgccgca agggttcctc 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 34 gaggaaccct tgcggcacgg 20 <210> 35 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 35 gggttcctct ccgcgctcac ccagcagctg 30 <210> 36 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 36 cagctgctgg gtgagcgcgg agaggaaccc 30 <210> 37 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 37 gggttcctct cccagctcac ccagcagctg 30 <210> 38 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 38 cagctgctgg gtgagctggg agaggaaccc 30 <210> 39 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 39 gggttcctct ccgacctcac ccagcagctg 30 <210> 40 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 40 cagctgctgg gtgaggtcgg agaggaaccc 30 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 41 gtgcacgtgg tcgcggacca 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 42 catgagctgg tccgcgacca 20 <210> 43 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 43 gcacgtggtc ccggcccagc tcatggcctt c 31 <210> 44 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 44 gaaggccatg agctgggccg ggaccacgtg c 31 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 45 gtggtcccgc aacagctcat 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 46 ccatgagctg ttgcgggacc 20 <210> 47 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 47 cttcggcggc tccagcgcgc cgtgcgcgct ctg 33 <210> 48 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 48 cagagcgcgc acggcgcgct ggagccgccg aag 33 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 49 ctccagccag ccgtgcgcgc 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 50 gcgcgcacgg ctggctggag 20 <210> 51 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 51 ggcctgctgg ccgcgcgcct gcgcatcagc 30 <210> 52 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 52 gctgatgcgc aggcgcgcgg ccagcaggcc 30 <210> 53 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 53 gctggccgag caactgcgca tcag 24 <210> 54 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 54 ctgatgcgca gttgctcggc cagc 24 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 55 ccgagcgcct gcaaatcagc 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 56 gctgatgcgc agttgctcgg 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 57 gcgcatcagc gcggacaggg 20 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 58 ccctgtccgc gctgatgcgc 20 <210> 59 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 59 ctgcgcatca gcccggccag ggtctacatc aac 33 <210> 60 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 60 gttgatgtag accctggccg ggctgatgcg cag 33 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 61 cagcccgcaa agggtctaca 20 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 62 tgtagaccct ttgcgggctg 20 <210> 63 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 63 catcaactat tacgccatga acgcggcc 28 <210> 64 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 64 ggccgcgttc atggcgtaat agttgatg 28 <210> 65 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 65 cggcggctcc agcgagccgg ccgcgctcgc cagcctgcac agcatcggc 49 <210> 66 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 66 gccgatgctg tgcaggctgg cgagcgcggc cggctcgctg gagccgccg 49 <210> 67 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 67 gaggggtttc tgtcggacct cacccagcag ctg 33 <210> 68 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 68 cagctgctgg gtgaggtccg acagaaaccc ctc 33 <210> 69 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 69 gaggggtttc tgtcgcagct cacccagcag ctg 33 <210> 70 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 70 cagctgctgg gtgagctgcg acagaaaccc ctc 33 <210> 71 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 71 cggatccgcc accatgccta tgttcatcgt g 31 <210> 72 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 72 cggaattctc acttgtcgtc gtcgtccttg tagtcagcga aggtggaacc gt 52 <210> 73 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 73 cggaattcat gcgggcgctg cgggccggcc t 31 <210> 74 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 74 ccgctcgagt cacttactgc ccgccgtgat g 31 <210> 75 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 75 cggaattcat ggtcaacccc accgtgttc 29 <210> 76 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 76 ccgctcgagt tattcgagtt gtccacagtc ag 32 <210> 77 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 77 ccgccgccgc caaccaccgc tgg 23 <210> 78 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 78 gggctgggtg cggtcgtcga ggg 23 <210> 79 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 79 ctcagcctcc aaaaaaaaaa ggattacagg 30 <210> 80 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 80 ctcagcctcc caagtagctg aaaaaaaaaa 30 <210> 81 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 81 ctcagccaaa aaaatagctg ggattacagg 30 <210> 82 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 82 ctcagcctcc caaaaaaaag ggattacagg 30 <210> 83 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 83 ctcaaaaaaa caagtagctg ggattacagg 30 <210> 84 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 84 aaaagcctcc caagtagctg ggattacagg 30 <210> 85 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 85 ctcaaaatcc caaaaaaaag ggattacagg 30 <210> 86 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 86 caagtagctg ctcagcctcc ggattacagg 30 <210> 87 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 87 ctcagcctcc ggattacagg caagtagctg 30 <210> 88 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 88 ctcagcctcc caagtaaaag ggattacagg 30 <210> 89 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 89 ctcagcctcc caagtaaatg ggattacagg 30 <210> 90 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 90 ctcagcctcc caagtaaacg ggattacagg 30 <210> 91 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 91 ctcagcctcc caagtagcag ggattacagg 30 <210> 92 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 92 ctcagcctcc cttgtagctg ggattacagg 30 <210> 93 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 93 ctcaaaatcc caagtagctg ggattacagg 30 <210> 94 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 94 ctcaatttcc caagtagctg ggattacagg 30 <210> 95 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 95 aaaaatctca gcctcccaag tagctgggat 30 <210> 96 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 96 tgggattaca ggcgtgagcc accacgccc 29

Claims (7)

  1. 대상체에서 폴리[ADP-리보오스] 폴리머라아제 1(poly [ADP-ribose] polymerase 1; PARP-1) 활성화의 증가에 의해 특징되는 질병을 치료하는 방법으로서,
    상기 대상체에 치료학적 유효량의 대식세포 이동 억제 인자(macrophage migration inhibitory factor; MIF) 뉴클레아제 활성의 억제제를 투여하여, 상기 질병을 치료하는 것을 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 질병이 염증성 질병(inflammatory disease)인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 염증성 질병이 알츠하이머병, 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 관절염(arthritis), 골관절염(osteoarthritis), 류머티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 천식 아테롬성 동맥경화증(asthma atherosclerosis), 크론병(Crohn's disease), 대장염(colitis), 피부염 게실염(dermatitis diverticulitis), 섬유근육통(fibromyalgia), 간염(hepatitis), 과민성 대장 증후군(irritable bowel syndrome), 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematous), 신장염(nephritis), 궤양성 대장염(ulcerative colitis) 및 파킨슨병으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법.
  4. 제3항에 있어서, 질병이 파킨슨병인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 억제제가 거대고리 라파퓨신 라이브러리(macrocyclic rapafucin library)로부터 선택된 방법.
  6. 제5항에 있어서, 억제제가 12B3-11, 17A5-1, 및 17A5-2로 이루어진 군으로부터 선택된 방법.
  7. 대식세포 이동 억제 인자(MIF) 억제제를 스크리닝하는 방법으로서,
    표면 상에 단일 가닥 아민 개질된 MIF 타겟 DNA를 고정시키고;
    MIF를 거대고리 라파퓨신 라이브러리로부터의 화합물과 함께 또는 이의 없이 인큐베이션하고;
    상기 단일 가닥 아민 개질된 MIF 타겟 DNA를 바이오티닐화된 DNA와 하이브리드화하되, 상기 바이오티닐화된 DNA는 상기 단일 가닥 아민 개질된 MIF 타겟 DNA에 대해 상보적이고;
    스트렙타비딘 효소 컨쥬게이트와 함께 이후에 기질과 함께 인큐베이션하되, 기질은 상기 스트렙타비딘 효소 컨쥬게이트에 의해 작용되고;
    상기 거대고리 라파퓨신 라이브러리로부터의 화합물을 갖는 MIF의 흡광도를 상기 거대고리 라파퓨신 라이브러리로부터의 화합물을 갖지 않는 MIF의 흡광도와 비교하고;
    상기 화합물이 흡광도의 변화를 기초로 하여 억제제인지의 여부를 결정하는 것을 포함하는 방법.
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