KR20190025180A - 동물 건강 모니터링을 위한 장내세균분석 적용방법 - Google Patents

동물 건강 모니터링을 위한 장내세균분석 적용방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 동물의 건강 모니터링을 위한 장내세균분석 시스템 및 방법에 관한 것으로, 상세하게는 메타지노믹스 분석을 통하여 동물의 장내세균 분석 결과 및 그를 토대로 한 건강에 관한 조언을 제시할 수 있는 장내세균 분석 시스템 및 그를 이용한 장내세균 분석 방법에 관한 것이다.

Description

동물 건강 모니터링을 위한 장내세균분석 적용방법{APPLICATION METHOD OF GUT MICROBIOME ANALYSIS FOR ANIMAL HEALTH MONITORING}
본 발명은 동물의 건강 모니터링을 위한 장내세균분석 시스템 및 방법에 관한 것으로, 상세하게는 동물 장내세균을 분석하고 그 결과를 토대로 동물의 건강상태에 관한 정보를 제공하는 장내세균분석 시스템 및 방법에 관한 것이다.
선사시대 이래로 인간과 함께 생활을 공유하여 온 동물은 여러 가지 목적으로 사육되고 있다. 반려동물(Companion Animal)은 사람과 더불어 사는 동물을 말하며, 동물이 인간에게 주는 여러 혜택을 존중하여 애완동물을 사람의 장난감이 아니라는 뜻에서 반려동물로 개칭하여 통용되고 있다. 농협경제연구소의 보고에 따르면 2012년 기준 전체가구의 16%(320만가구)가 440만 마리의 개를, 3.4%(68만가구)가 116만마리의 고양이를 사육하고 있는 것으로 조사된 바 있다. 인구구조의 고령화와 독신가구의 증가, 스트레스가 만연한 사회적 분위기 등의 요인과, 반려동물에 대한 가족구성원, 동반자, 파트너로서의 의식변화 등으로 인해 반려동물을 사육하는 가구 수는 기하급수적으로 늘고 있으며, 이에 따라, 반려동물의 분양, 사육, 관리를 위한 동물병원, 반려동물 용품의 제조 및 판매업자, 동물용 카페, 미용업자, 호텔 등 관련 시장 또한 지속적으로 성장하고 있다.
반려동물에 대한 대중의 인식이 더욱 높아지고, 반려동물의 고급화 및 고령화로 인해 반려동물의 건강 관리에 대한 관심이 높아지면서 지속적인 건강 관리가 가능하고 반려동물에 대한 의료행위가 체계적으로 이루어질 수 있는 새로운 시스템에 대한 수요가 증가하고 있다. 종래 사육중인 애완동물의 건강관리를 위하여는 동물병원에 직접 출두하여 애완동물의 건강검진을 받는 방법이 있으나, 외출이 번거롭고 검진비가 고가이며 기록된 검진 내역을 병원에서 보관하므로 접근이 어렵다는 문제가 있다. 반려동물의 건강관리를 위해 일상적인 관리가 필요한 내용들에 대해서는 알려져 있으나, 말을 못하고 표현을 잘 하지 못하는 반려동물의 특징을 극복하기 위하여 건강위험 여부에 대해 시의 적절하게 판단하고, 신속하게 대응할 수 있는 객관적 기준이 현재는 존재하지 않으며, 반려동물의 건강상태를 통합적으로 평가하고 구체적인 실천 대안을 제시할 수 있는 솔루션 또한 존재하지 않는 상태이다.
동물의 상태형성에 있어 급이는 중요한 요소로 작용한다. 올바른 급이는 애완동물을 건강하고 상태가 좋도록 하는데, 영양적 가치를 제공하는 것 이외에도 장내세균총(gut microflora) 평형에 영향을 주고, 관련된 위장 장애를 유발하거나 예방할 수 있다. 예를 들면, 종종 개과 및 고양이과의 위장 장애는 세균성 과잉생장 및 병원성 세균에 의해 생성되는 장독소의 생성과 연관된다. US5968569에 따르면, 장내세균총을 보존하여 포유류의 건강을 증진시키기 위한 프로바이오틱 미생물 함유 사료가 개시되어 있다.
장내세균(intestinal micorbiota)이란 사람 또는 동물의 장 내부에서 살고 있는 세균(bacteria)을 의미한다. 인체를 대상으로 한 장내세균 연구 결과에 따르면, 한 개체 내에 존재하는 장내세균은 100조 개 이상이며, 그 종류만도 400 내지 500종에 이르는 것으로 보고되고 있다. 세균의 무게를 모두 합하면 1 내지 1.5㎏에 달하며, 종류에 따라 원기둥, 공, 스프링 등의 형태를 띠고 있고, 크기는 0.5 내지 5㎛이다. 장내세균은 모체의 영향을 받아 처음 형성되며, 이후로 개체별 식습관에 따라 변형되게 된다.
사람 또는 동물 개체를 숙주로 삼아 기생하고 있는 장내세균은 음식물과 장의 분비액, 점액 등을 영양소로 활용해 각종 대사물질을 만들어 내면서 개체와 공생관계를 이루며 살아가고 있으며, 개체의 항상성과 기능을 유지하는데 필수적인 것으로 알려져 있다. 예를 들면, 장내세균이 인체에서 비만, 당뇨병 및 관련 대사성 질병의 발병에 영향을 미치는 연구결과가 보고되어 있으며, 2011년에는 초파리의 장내에 사는 아세토박터 포모룸(Acetobacter pomorum)이 숙주인 초파리의 인슐린 대사 신호체계에 관여해 초파리의 성장을 돕는 것이 보고된 바 있다.
장내세균은 숙주인 개체에 미치는 영향에 따라 유익균, 유해균 및 중립균으로 구분할 수 있다. 유익균은 장운동을 촉진하여 소화, 배설 및 혈액으로의 영양소 흡수를 도우며, 유해균은 과민성대장증후군과 같은 질환을 유발하고, 중립균은 장내 균종 분포에 따라 장 속에 유익한 균이 많으면 비타민 등을 생산해 우리 몸에 이로운 작용을 하고, 반대로 유해한 균이 많으면 부패 물질을 만들어 우리 몸에 해로운 작용을 하는 양면적 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.
US 5968569 A KR 1020110066018 A
Diabetes Care. 2010 Oct; 33(10): 2277-2284 Science. 2011 Nov 4;334(6056):670-4.
본 발명은 동물 개체의 장내세균 분포를 분석하고 그 분석 결과를 토대로 개체별 장내 건강정보 및 관련 조언을 제공하는 장내세균분석 시스템 및 방법을 제공하는 데 목적이 있다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 장내세균 참조 서열 데이터가 저장된 데이터베이스(100); 및 장내세균 분석 및 보고가 수행되는 서버(200)를 포함하고, 상기 서버(200)는 검사대상의 DNA 서열을 추출한 데이터를 분석하는 분석부(210); 상기 분석부(210)로부터 검사대상의 장내세균 서열 데이터를 생성하는 생성부(220); 상기 데이터베이스(100)에 저장된 장내세균 참조 서열 데이터와 상기 생성부(220)에서 생성된 장내세균 서열 데이터를 비교하는 비교부(230): 및 상기 비교부(230)로부터 장내에 분포된 장내세균 분석 결과를 보고하는 보고부(240)를 포함하는 동물 건강 모니터링을 위한 장내세균 분석 시스템이 제공된다.
또한, 상기 데이터베이스(100)에는 상기 서버(200)에서 생성되는 검사대상의 장내세균 서열 데이터 및 장내세균 분석 결과가 주기적으로 저장될 수 있다.
또한, 상기 서버(200)는 상기 장내 세균 참조 서열 데이터와 상기 검사대상의 장내 세균 서열 데이터의 OTU 개수를 계산하고 이를 희박화 곡선(Rarefaction curve)으로 나타낼 수 있다.
또한, 상기 서버(200)는 개체에 미치는 영향을 고려하여 장내세균을 유익성에 따라 분류하고 각 분류를 이용하여 건강상태에 관한 의견을 제시하며, 장내세균 중 락토코쿠스(Lactococcus), 류코노스톡(Leuconostoc), 페디오코커스(Pediococcus),엔트로코커스(Enterococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 베일로넬라(Veilonella), 에스체리시아(Escherichia), 유박테리움(Eubacterium), 슈도모나스(Pseudomonas), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 헬리코박터(Helicobacter), 캄필로박터(Campylobacter), 어시니아(Yersinia) 및 리스테리아(Listeria)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나에 대한 분석내용을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 개체의 대변에서 DNA를 추출하는 DNA추출 단계(S10); 상기 DNA추출 단계(S10)에서 추출된 DNA로부터 차세대 시퀀싱(Next Generation Sequencing) 방법을 통해 DNA 서열 데이터를 생산하는 서열 데이터화 단계(S20); 상기 서열 데이터화 단계(S20)에서 생산된 DNA 서열 데이터를 분석하여 개체의 장내세균 서열 데이터를 생성하는 장내세균 분포 분석 단계(S30); 데이터베이스에 저장된 장내세균 참조 서열 데이터와 상기 장내세균 분포 분석 단계(S30)에서 분석된 개체의 장내세균 서열 데이터를 비교하는 장내세균 분포 비교 단계(S40); 및 상기 장내세균 분포 비교 단계(S40)의 비교 결과를 이용하여 개체의 장내에 분포된 장내세균 분석 결과를 보고하는 분석결과보고 단계(S50)를 포함하는 동물 건강 모니터링을 위한 장내 세균 분석 방법이 제공된다.
또한, 상기 DNA추출 단계(S10)는 Proteinase K를 이용하여 숙주의 세포를 파쇄하고 숙주의 핵산을 제거하는 단계(S11); 계면활성제를 이용하여 세균의 세포를 파쇄하는 단계(S12); 에탄올을 이용하여 세균의 DNA를 멤브레인에 흡착시키는 단계(S13); 멤브레인에 흡착된 세균의 DNA를 버퍼 용액을 이용하여 세척하는 오염물의 제거 단계(S14); 및 버퍼 용액을 이용하여 세균의 핵산을 추출하는 세균 핵산의 추출 단계(S15)를 포함할 수 있다.
또한, 상기 장내세균 분포 분석 단계(S30)는 서열 데이터를 어셈블리(Assembly) 하는 어셈블리 단계(S31); 시퀀싱 퀄리티(Quality)를 도출하여 일부 서열을 제거하는 노이즈제거 단계(S32); 중복된 서열을 제거하는 중복제거 단계(S33); 어셈블리 되지 않는 서열을 제거하는 필터링 단계(S34); 키메라 서열 및 세균외 서열을 제거하는 불필요서열제거 단계(S35); 및 서열들끼리 클러스터링 하는 클러스터링 단계(S36)를 포함할 수 있다.
또한, 개체의 장내세균 서열 데이터 및 상기 개체의 장내세균 분석 결과를 데이터베이스에 주기적으로 축적하고 관리함으로써 개인의 라이프로그를 기록하고 추적할 수 있는 추적관리 단계(S60)를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 장내세균 분석 시스템 및 방법은 동물 개체의 장내세균의 분포를 분석하고 분석 결과를 토대로 동물의 장내 건강 정보 및 그에 관한 조언을 제공할 수 있다.
또한, 잦은 동물병원의 방문 없이도 동물의 건강 상태를 확인하고 건강 상태 개선을 위한 관리를 위한 조언을 제공할 수 있다.
또한, 동물 개체의 장내세균 서열 데이터 및 장내세균 분석 결과를 데이터베이스에 주기적으로 축적하고 관리하여 동물 개체의 라이프 로그를 기록하고 추적함으로써 각종 질병 치료와 건강관리에 활용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 장내세균분석 시스템의 구성도이고,
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 장내세균분석 방법의 순서도이고,
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 장내세균분석 방법의 장내세균 분포 분석 단계를 세분화한 순서도이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 구체적인 실시예를 상세히 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 첨부된 특허청구범위를 제한하는 것이 아니며, 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 실시예에 대한 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다. 아울러 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 구성 또는 기능에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략한다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 또한, 명세서에 기재된 "...부" 등의 용어는 적어도 하나의 기능이나 동작을 처리하는 단위를 의미하며, 이는 하드웨어나 소프트웨어 또는 이들의 결합으로 구현될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 장내세균분석 시스템의 구성도이다.
도 1을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 장내세균분석 시스템은 데이터베이스(100) 및 서버(200)를 포함하여 구성된다.
상기 데이터베이스(100)는 제 1저장부(110)를 포함하여 구성된다. 필요에 따라, 제 2저장부(120) 및 제 3저장부(130)를 더 포함하여 구성될 수 있다.
상기 제 1저장부(110)에는 정상 상태인 개체의 장내세균 참조 서열 데이터가 저장된다. 상기 정상 상태는 질환이 없는 건강한 상태를 의미한다. 건강한 동물 개체에 대하여 장내세균을 채집하고 이를 분석함으로써 정상 상태인 동물의 장내세균 참조 서열 데이터를 확보할 수 있다. 상기 정상 상태인 개체의 장내세균 참조 서열 데이터는 장내세균 분석시 참조할 수 있는 기준으로 이용될 수 있다.
상기 제 2저장부(120)에는 검사대상 개체의 장내세균 서열 데이터가 저장된다. 건강상태를 확인하고자 하는 대상 개체에 대하여 장내세균을 채집하고 이를 분석함으로써 검사대상 개체의 장내세균 참조 서열 데이터를 확보할 수 있다.
상기 제 3저장부(130)에는 검사대상 개체의 장내세균 분석 결과가 저장된다. 상기 검사대상 개체의 장내세균 분석 결과는 상기 제 1저장부(110) 및 제 2 저장부(120)에 저장되는 데이터를 상기 서버(200)에서 비교분석하여 얻어진다.
상기 서버(200)는 DNA 서열을 추출한 데이터를 분석하여, 검사대상 개체의 장내세균 서열 데이터를 생성하고, 상기 데이터베이스(100)에 저장된 장내세균 참조 서열 데이터와 검사대상 개체의 장내세균 서열 데이터를 비교하여, 검사대상 개체의 장내에 분포된 장내세균 분석 결과를 보고한다. 분석된 검사대상 개체의 장내세균 서열 데이터 및 장내세균 분석 결과는 상기 데이터베이스(100)에 주기적으로 저장될 수 있다. 상기 서버(200)는 분석 또는 보고를 위한 작업이 수행되는 플랫폼으로, 필요에 따라 외부 어플리케이션 또는 프로그램과 연동할 수 있다.
상기 서버(200)는 분석부(210), 생성부(220), 비교부(230) 및 보고부(240)를 포함한다.
상기 분석부(210)에서 검사대상 개체의 DNA 서열을 추출한 데이터의 분석이 수행된다. 검사대상 개체의 대변에서 추출된 DNA로부터 DNA 서열 데이터를 생산하고 그를 분석할 수 있다.
상기 생성부(220)에서는 상기 분석부(210)로부터 검사대상 개체의 장내세균 서열 데이터가 생성된다. 상기 분석부(210)의 분석결과로부터 검사대상 개체의 장내세균 서열 데이터를 생성할 수 있으며, 생성된 장내세균 서열 데이터는 상기 데이터베이스(100)의 제 2저장부(120)에 저장된다. 상기 생성부(220)에서 검사대상 개체의 장내세균 서열 데이터는 차세대 시퀀싱(Next Generation Sequencing) 법을 통해 생성될 수 있다. 메타지노믹스를 이용하여 장내세균 분포 분석이 수행되며, 이를 위하여, 비교분석되는 서열 데이터는 필터링 후 클러스터링 될 수 있다.
상기 비교부(230)에서 상기 데이터베이스(100)에 저장된 장내세균 참조 서열 데이터와 검사대상 개체의 장내세균 서열 데이터의 비교가 수행된다. 상기 장내세균 참조 서열 데이터와 상기 검사대상 개체의 장내세균 서열 데이터의 OTU 개수를 계산하고 이를 희박화 곡선(Rarefaction curve)으로 나타내어 장내세균의 다양성에 관한 정보를 수득하기 위한 분석을 수행할 수 있다. 희박화 곡선(Rarefaction curve)은 세균의 개수를 추정하여 세균종의 다양성을 확인할 수 있는 방법으로, 서로 다른 개수의 종으로 구성된 군집을 비교하면 종의 다양성이 높은 군집의 곡선은 빠르게 수렴하고, 종의 다양성이 낮은 군집의 곡선은 느리게 수렴하여 종 다양성에 관한 정보를 제공한다.
상기 보고부(240)에서는 상기 비교부(230)로부터 받은 분석결과를 이용하여 장내에 분포된 장내세균 분석 결과의 보고가 수행된다. 상기 데이터베이스(100)에 저장된 장내세균 참조 서열 데이터와 개인의 장내세균 서열 데이터를 비교한 후, 이를 바탕으로 장내에 분포된 장내세균에 대하여 숙주가 되는 개체에 미치는 영향을 고려하여 유익성에 따라 유익균, 중립균 및 유해균으로 분류하고 각 분류를 이용하여 장내세균 분석 결과를 보고할 수 있다.
상기 장내세균 분석 결과의 보고는 유익균에 대한 장내세균 분석 결과, 중립균에 대한 장내세균 분석 결과 및 유해균에 대한 장내세균 분석 결과를 종합적으로 고려하여 의뢰인의 건강에 관한 의견을 제시할 수 있다. 상세하게는, 유익균, 중립균 및 유해균 각각에 대하여 카테고리를 구분하여 세균의 종류 및 분포를 분석한 후 이를 그래프로 가시화하고 검사대상 개체의 건강상태에 대한 의견을 제시할 수 있다. 상기 유익균으로는 예를 들면, 비피도박테륨(Bifidobacterium), 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코쿠스(Lactococcus), 류코노스톡(Leuconostoc) 및 페디오코커스(Pediococcus)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 이용할 수 있고, 상기 중립균으로는 예를 들면, 엔트로코커스(Enterococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 베일로넬라(Veilonella), 박테로이데스(Bacteroides), 에스체리시아(Escherichia) 및 유박테리움(Eubacterium)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 이용할 수 있고, 상기 유해균으로는 예를 들면, 클로스트리듐(Clostridium), 슈도모나스(Pseudomonas), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 헬리코박터(Helicobacter), 캄필로박터(Campylobacter), 어시니아(Yersinia) 및 리스테리아(Listeria)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 이용할 수 있다. 이용가능한 유익균, 중립균 및 유해균은 검사대상 개체의 종에 따라 달라질 수 있다.
필요에 따라, 분석한 장내세균에 관한 정보를 제공할 수 있다. 상기 분석한 장내세균에 관한 정보는 기존 연구 결과를 인용하여 제공할 수 있으며, 예를 들면 논문을 인용할 수 있다.
상기 서버(200)의 상기 생성부(220) 및 상기 비교부(230)에서 생성 또는 분석된 데이터는 상기 데이터베이스(100)에 주기적으로 저장되어 관리될 수 있다. 이를 통하여, 검사대상 개체별로 라이프로그를 기록하고 추적할 수 있으며, 이는 개체별로 각종 질병의 치료 및 건강관리에 필요한 기초자료로 활용할 수 있다.
본 발명의 장내세균 분석 시스템의 적용대상은 동물이라면 특별히 한정되지 않으며, 포유류 또는 가금류일 수 있다. 바람직하게는 포유류인 것이 좋다. 예를 들면, 개 또는 고양이인 것이 좋다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 장내세균분석 시스템을 이용하여 수행되는 장내세균분석 방법의 순서도이다.
도 2를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 장내세균분석 방법은 DNA추출 단계(S10), 서열 데이터화 단계(S20), 장내세균 분포 분석 단계(S30), 장내세균 분포 비교 단계(S40) 및 분석결과 보고 단계(S50)를 포함한다.
상기 DNA추출 단계(S10)는 검사대상 개체의 대변을 시료로 하여 그로부터 장내세균의 DNA를 추출하기 위해 수행된다. 본 단계(S10)는 Proteinase K를 이용하여 숙주의 세포를 파쇄하고 숙주의 핵산을 제거하는 단계(S11); 계면활성제를 이용하여 세균의 세포를 파쇄하는 단계(S12); 에탄올을 이용하여 세균의 DNA를 멤브레인에 흡착시키는 단계(S13); 멤브레인에 흡착된 세균의 DNA를 버퍼 용액을 이용하여 세척하는 오염물의 제거 단계(S14); 및 버퍼 용액을 이용하여 세균의 핵산을 추출하는 세균 핵산의 추출 단계(S15)를 포함하여 수행될 수 있다. DNA 추출시간을 단축시키기 위하여, 공지된 분리 키트(kit)를 사용하여 수행될 수 있다.
상기 숙주의 핵산을 제거하는 단계(S11)는 장내세균의 숙주가 되는 동물 세포와 세균 세포 사이의 구조적 차이를 이용하여 동물 세포만을 선택적으로 파쇄하기 위하여 수행될 수 있다. 본 단계(S11)에서 Proteinase K를 처리하여 숙주 세포를 파쇄(lysis)하고 단백질을 제거하고 Benonaze를 사용하여 동물 세포의 핵산을 분해할 수 있다.
상기 세균의 세포를 파쇄하는 단계(S12)는 세균 세포의 세포벽을 파괴하여 세균 세포내 DNA를 용출시키기 위해 수행될 수 있으며, 비드가 들어 있는 병원체 파쇄 튜브와 계면활성제를 포함하는 파쇄 버퍼 용액(Buffer ATL)을 이용해 세균의 세포를 파쇄하여 수행될 수 있다.
상기 세균의 DNA를 멤브레인에 흡착시키는 단계(S13)는 세균의 세포를 파쇄하는 단계(S12)에서 세포 밖으로 용출된 DNA가 실리카 멤브레인 컬럼에 잘 결합할 수 있게 하기 위하여 수행될 수 있다. 에탄올을 처리하여 수행될 수 있으며, 이를 통하여 세균의 핵산성분을 실리카 멤브레인에 흡착시킬 수 있다.
상기 오염물의 제거 단계(S14)에서는 실리카 멤브레인에 흡착된 세균의 핵산을 워시버퍼(wash buffer)를 이용해 세척함으로써 남아 있는 오염물을 완전히 제거하고 장내세균의 DNA만을 얻을 수 있다. 상기 워시버퍼는 공지된 것을 사용할 수 있으며, 예를 들면 구아니디늄 클로라이드(Guanidinium Chloride)가 포함된 버퍼를 이용하여 단백질 성분을 변성시켜 제거하고 70%(v/v) 에탄올이 포함된 버퍼를 이용하여 염 성분을 제거함으로써 DNA를 정제하여 수득할 수 있다.
상기 세균 핵산의 추출 단계(S15)는 실리카 membrane에 흡착된 DNA를 추출하기 위하여 수행될 수 있다. DNA 용출 버퍼를 이용할 수 있으며, 추출하기 전에 상기 DNA 용출 버퍼를 20 내지 40℃에서 3 내지 10분 동안 둠으로써 DNA 수율을 향상시킬 수 있다. 처리하는 DNA 용출 버퍼의 양은 50 내지 200㎕ 일 수 있으며, 농축된 샘플을 얻기 위하여 50 내지 60㎕으로 처리되는 것이 바람직하다. 추출한 핵산은 2 내지 8℃에서 24시간 보관할 수 있고, 24시간 이상 보관해야 할 때는 -15 내지 -30℃의 온도에서 보관하는 것이 좋다.
상기 서열 데이터화 단계(S20)는 전 단계(S10)에서 추출된 장내세균의 DNA로부터 DNA 서열 데이터를 생산하여 DNA 서열을 데이터화하기 위하여 수행된다.
본 단계(S20)는 차세대 시퀀싱 방법을 통하여 수행될 수 있다. 바람직하게는, Illumina Solexa의 Genome Analyzer를 이용하여 수행될 수 있다. 출력 파일 포맷은 FASTA 또는 FASTQ 일 수 있다. FASTA 파일 포맷은 “>” 뒤에 시퀀싱 read의 이름을 적고, 염기서열 값을 나열하는 방식으로 구성되고, FASTQ 파일 포맷은 “@” 뒤에 read의 이름과 quality 값을 적어주는 방식이다. quality 값은 Sanger score를 사용하며, -10log10(p/(1-p))로 계산하고, p는 base call한 것이 잘못될 확률을 나타낸다.
Illumina Solexa의 Genome Analyzer를 이용하여 수행되는 상기 서열 데이터화 단계(S20)는, Illumina Experiment Manager를 사용하여 각 플레이트에 샘플 플레이트를 만들고 그를 이용하여 샘플 시트를 만드는 단계; MiSeq System Guide에 따라 시약 카트리지를 수조에서 해동시키는 단계; 샘플 시트, 플로우 셀, 시약 카트리지, PR2 병 및 빈 폐기물 병이 MiSeq에 로드되고 실행이 시작되는 단계; 및 실행이 완료되면 fastq 파일이 하드 디스크 드라이브로 전송되는 단계를 포함하여 이루어질 수 있다. 상기 샘플 시트는 실행을 위해 MiSeq에서 사용하는 일련의 실행 매개 변수 및 색인 구성표 역할을 하며, 플래시 드라이브를 통해 MiSeq으로 전송될 수 있다. MiSeq 실행은 500사이클 실행에 약 44시간이 소요될 수 있으며, Illumina Sequence Analysis Viewer를 사용하여 모니터링 될 수 있다.
상기 장내세균 분포 분석 단계(S30)에서는 이전 단계(S20)에서 생산된 DNA 서열 데이터를 분석하여, 비교분석을 수행하기 위한 서열 데이터로서 검사대상 개체의 장내세균 서열 데이터가 생성된다.
본 단계(S30)는 샘플에 포함된 유전체들(메타지놈)로부터 직접 유전적 분석을 수행하는 메타지노믹스 연구 방법을 활용하여 수행될 수 있다. 메타지노믹스는 자연 환경에서 존재하는 미생물들을 실험실에서 배양 가능하거나 혹은 가능하지 않거나 상관없이 환경에서 직접적으로 유전물질을 추출하여 어떤 것들이 존재하는지 또는 그들이 어떤 역할을 하는지 분석하기 위한 연구 분야로, 기존의 전통적 미생물 생태학의 한계를 뛰어 넘는 접근법이다. 메타지노믹스는 분류하는 기준에 따라 여러 가지로 나뉠 수 있지만 흔히 시행되고 있는 일반적인 접근 방법에 따라 나누자면 단일 유전자 접근법(single gene approach, target gene approach)과 훌 지놈 샷건 시퀀싱 접근법(whole genome shotgun sequencing)으로 나눌 수 있다. 단일 유전자 접근법은 환경 샘플로부터 추출한 16S rRNA(small subunit of the ribosomal RNA)와 같은 특정 유전자를 활용 미생물의 다양성 및 분포를 연구하기 위한 것으로서, 454 파이로시퀀싱(Pyrosequencing) 플랫폼을 사용할 수 있다. 훌 지놈 샷건 시퀀싱을 통한 접근법은 미생물이 환경 내에서 어떤 역할을 하는지 알아보기 위한 접근법으로 일루미나(Illumina) 사의 차세대 시퀀서를 이용할 수 있다. 일루미나의 플랫폼은 454 파이로시퀀싱 플랫폼에 에 비해 서열의 길이는 짧지만 적은 비용으로 훨씬 더 많은 서열 데이터를 생산할 수 있기 때문에 많은 유전자의 서열을 생산해 내야 하는 샷건 시퀀싱 방법에 더 적합하다. 본 발명에서 샘플에 포함된 유전체들의 분석 수행을 위한 분석방법으로는 훌 지놈 샷건 시퀀싱 접근법이 선택되는 것이 바람직하다.
상세하게는, 본 단계(S30)는 어셈블리 단계(S31), 노이즈제거 단계(S32), 중복제거 단계(S33), 필터링 단계(S34), 불필요서열제거 단계(S35) 및 클러스터링 단계(S36)를 포함하여 수행될 수 있다. 이는 도 3에 도시하였다.
상기 어셈블리 단계(S31)에서는 Paired-end data를 하나의 contig로 어셈블리(Assembly)가 수행된다. 상기 어셈블리란 차세대 시퀀싱(Next Generation Sequencing) 방법을 이용하여 얻어낸 다량의 짧은 염기서열 리드들을 연결하여 더 긴 길이의 서열로 이어붙이는 과정을 뜻한다. 상기 다량의 짧은 염기서열 리드들은 약 100~500 염기쌍 정도의 길이일 수 있다.
상기 노이즈제거 단계(S32)에서는 시퀀싱 퀄리티(Quality)가 미리 설정된 수준보다 낮은 서열들을 제거하는 작업이 수행된다. 설정 수준은 분석시간을 저감하면서도 분석의 정확성을 향상시키기 위한 측면에서 분석자에 의해 조절될 수 있으며, (Q=20) 내지 (Q=30)단위인 것이 바람직하다.
상기 중복제거 단계(S33)에서는 중복된 서열 및 그로 인하여 생성된 서열 어셈블리의 제거가 이루어진다. 중복 서열은 서열의 증폭 단계에서 특정 위치의 서열이 반복적으로 증폭됨으로써 발생하며, 이로 인하여 잘못된 서열 어셈블리가 생성되어 분석의 정확성 및 신뢰성을 저하시키게 되므로 그 제거가 필요하다.
상기 필터링 단계(S34)에서는 어셈블리 되지 않는 서열의 필터링 및 제거가 이루어진다. 이 단계(S34)는 설정한 수준에 이르지 못하는 서열을 제거하고, paired-end 시퀀싱 데이터 중 forward 또는 reverse 서열이 없는 데이터를 제거함으로써 서열 어셈블 리가 되지 않은 데이터를 제거하기 위해 수행될 수 있다.
상기 불필요서열제거 단계(S35)에서는 서로 다른 종의 DNA가 합쳐져 만들어진 키메라 서열 및 세균외 서열의 제거가 이루어진다. 키메라 서열은 서로 다른 종의 DNA 서열임에도 불구하고 유사서열이 존재하기 때문에 서로 다른 종의 서열이 같은 종의 서열로 인식되어 어셈블 된 경우 생성될 수 있다. 데이터베이스로부터 VSEARCH 알고리즘을 이용하여 키메라 서열의 검색을 수행하고 어셈블 된 서열로부터 제거할 수 있다. 또한, 본 단계(S35)에서는 세균 이외의 진핵생물의 서열을 제거하여 세균 이외의 서열이 분석시에 검색되지 않도록 한다. 이를 통하여, 분석의 정확성 및 신뢰성를 향상시킬 수 있다.
상기 클러스터링 단계(S36)에서는 미리 설정된 수준 이내로 유사한 서열들 끼리 클러스터링이 수행된다. 상기 단계들(S32 내지 S35)을 통해 정제된 서열을 이용해 클러스터링을 수행하여 OTU를 생성할 수 있으며, 이때 이용하는 유사도 수치는 80 내지 99%일 수 있다. 바람직하게는, 유사도 수치는 90 내지 95%일 수 있다. 보다 바람직하게는 93%일 수 있다.
상기 장내세균 분포 비교 단계(S40)는 데이터베이스(100)에 저장된 장내세균 참조 서열 데이터와 상기 장내세균분포분석 단계(S30)에서 분석된 개체의 장내세균 서열 데이터를 비교하여 수행된다. 상기 장내세균 참조 서열 데이터는 질환이 없는 건강한 동물 개체에 대하여 장내세균의 채집 및 분석을 수행하여 얻을 수 있으며, 검사대상 개체의 장내세균 분석시 참조할 수 있는 기준으로 이용될 수 있다.
상기 데이터베이스(100)에 저장된 장내세균 참조 서열 데이터와 상기 장내세균분포분석 단계(S30)에서 분석된 개인의 장내세균 서열 데이터의 OTU 개수를 계산하고 이를 희박화 곡선(Rarefaction curve)로 나타내어 분석이 수행될 수 있다. 본 단계(S40)에서 분석은 16s rDNA(16S ribosomal DNA)를 이용하여 수행될 수 있다.
상기 분석결과 보고 단계(S50)는 상기 장내세균분포비교 단계(S40)에서 도출된 비교분석 결과를 이용하여 검사대상 개체의 장내에 분포된 장내세균 분석 결과를 보고한다.
상세하게는, 검사대상 개체의 장내에 분포된 장내세균에 대하여 유익균, 중립균 및 유해균으로 분류하고 유익균에 대한 장내세균 분석 결과, 중립균에 대한 장내세균 분석 결과 및 유해균에 대한 장내세균 분석 결과를 종합적으로 고려하여 의뢰인의 건강에 관한 의견을 제시할 수 있다. 또한, 분석한 장내세균에 관한 정보는 기존 연구 결과를 인용하여 제공할 수 있다.
필요에 따라, 본 발명의 장내세균 분석 방법은 상기 분석결과 보고 단계(S50) 이후에, 개체의 장내세균 서열 데이터 및 상기 개체의 장내세균 분석 결과를 데이터베이스에 주기적으로 축적하고 관리함으로써 개인의 라이프로그를 기록하고 추적할 수 있는 추적관리 단계(S60)를 더 포함할 수 있다.
상기 추적관리 단계(S60)은 개체별 라이프 로그를 도출하고 각종 질병 치료 및 건강관리에 필요한 기초자료로 활용할 수 있도록 하기 위하여 수행될 수 있다.
100 : 데이터베이스
110 : 제 1저장부
120 : 제 2저장부
130 : 제 3저장부
200 : 서버
210 : 분석부
220 : 생성부
230 : 비교부
240 : 보고부

Claims (8)

  1. 장내세균 참조 서열 데이터가 저장된 데이터베이스(100); 및
    장내세균 분석 및 보고가 수행되는 서버(200)를 포함하고,
    상기 서버(200)는
    검사대상의 DNA 서열을 추출한 데이터를 분석하는 분석부(210);
    상기 분석부(210)로부터 검사대상의 장내세균 서열 데이터를 생성하는 생성부(220);
    상기 데이터베이스(100)에 저장된 장내세균 참조 서열 데이터와 상기 생성부(220)에서 생성된 장내세균 서열 데이터를 비교하는 비교부(230): 및
    상기 비교부(230)로부터 장내에 분포된 장내세균 분석 결과를 보고하는 보고부(240)를 포함하는 동물 건강 모니터링을 위한 장내세균 분석 시스템.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 데이터베이스(100)에는 상기 서버(200)에서 생성되는 검사대상의 장내세균 서열 데이터 및 장내세균 분석 결과가 주기적으로 저장되는 것을 특징으로 하는 동물 건강 모니터링을 위한 장내세균 분석 시스템.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 서버(200)는 상기 장내 세균 참조 서열 데이터와 상기 검사대상의 장내 세균 서열 데이터의 OTU 개수를 계산하고 이를 희박화 곡선(Rarefaction curve)으로 나타내는 것을 특징으로 하는 동물 건강 모니터링을 위한 장내세균 분석 시스템.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 서버(200)는 개체에 미치는 영향을 고려하여 장내세균을 유익성에 따라 분류하고 각 분류를 이용하여 건강상태에 관한 의견을 제시하며, 장내세균 중 락토코쿠스(Lactococcus), 류코노스톡(Leuconostoc), 페디오코커스(Pediococcus),엔트로코커스(Enterococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 베일로넬라(Veilonella), 에스체리시아(Escherichia), 유박테리움(Eubacterium), 슈도모나스(Pseudomonas), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 헬리코박터(Helicobacter), 캄필로박터(Campylobacter), 어시니아(Yersinia) 및 리스테리아(Listeria)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나에 대한 분석내용을 포함하는 것을 특징으로 하는 동물 건강 모니터링을 위한 장내세균 분석 시스템.
  5. 개체의 대변에서 DNA를 추출하는 DNA추출 단계(S10);
    상기 DNA추출 단계(S10)에서 추출된 DNA로부터 차세대 시퀀싱(Next Generation Sequencing) 방법을 통해 DNA 서열 데이터를 생산하는 서열 데이터화 단계(S20);
    상기 서열 데이터화 단계(S20)에서 생산된 DNA 서열 데이터를 분석하여 개체의 장내세균 서열 데이터를 생성하는 장내세균 분포 분석 단계(S30);
    데이터베이스에 저장된 장내세균 참조 서열 데이터와 상기 장내세균 분포 분석 단계(S30)에서 분석된 개체의 장내세균 서열 데이터를 비교하는 장내세균 분포 비교 단계(S40); 및
    상기 장내세균 분포 비교 단계(S40)의 비교 결과를 이용하여 개체의 장내에 분포된 장내세균 분석 결과를 보고하는 분석결과보고 단계(S50)를 포함하는 동물 건강 모니터링을 위한 장내 세균 분석 방법.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 DNA추출 단계(S10)는
    Proteinase K를 이용하여 숙주의 세포를 파쇄하고 숙주의 핵산을 제거하는 단계(S11);
    계면활성제를 이용하여 세균의 세포를 파쇄하는 단계(S12);
    에탄올을 이용하여 세균의 DNA를 멤브레인에 흡착시키는 단계(S13);
    멤브레인에 흡착된 세균의 DNA를 버퍼 용액을 이용하여 세척하는 오염물의 제거 단계(S14); 및
    버퍼 용액을 이용하여 세균의 핵산을 추출하는 세균 핵산의 추출 단계(S15)를 포함하는 것을 특징으로 하는 동물 건강 모니터링을 위한 장내 세균 분석 방법.
  7. 제 5항에 있어서,
    상기 장내세균 분포 분석 단계(S30)는
    서열 데이터를 어셈블리(Assembly) 하는 어셈블리 단계(S31);
    시퀀싱 퀄리티(Quality)를 도출하여 일부 서열을 제거하는 노이즈제거 단계(S32);
    중복된 서열을 제거하는 중복제거 단계(S33);
    어셈블리 되지 않는 서열을 제거하는 필터링 단계(S34);
    키메라 서열 및 세균외 서열을 제거하는 불필요서열제거 단계(S35); 및
    서열들끼리 클러스터링 하는 클러스터링 단계(S36)를 포함하는 것을 특징으로 하는 동물 건강 모니터링을 위한 장내 세균 분석 방법.
  8. 제 5항에 있어서,
    개체의 장내세균 서열 데이터 및 상기 개체의 장내세균 분석 결과를 데이터베이스에 주기적으로 축적하고 관리함으로써 개인의 라이프로그를 기록하고 추적할 수 있는 추적관리 단계(S60)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 동물 건강 모니터링을 위한 장내 세균 분석 방법.
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