KR20190023602A - 생식조절인자의 유전적 조작 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 암컷 개체의 선택적 생산을 위한, 유전적으로 조작된 생식조절인자의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 생식발생 유전자(gametogenic gene), 바람직하게는 Y 염색체의 게놈을 인위적으로 변형시키는 방법 및 이의 이용에 관한 것이다.
Description
본 발명은 암컷 개체의 선택적 생산을 위한, 유전적으로 조작된 생식조절인자의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 생식발생 유전자(gametogenic gene), 바람직하게는 Y 염색체의 게놈을 인위적으로 변형시키는 방법 및 이의 이용에 관한 것이다.
큰 DNA 구축물의 합리적(rational) 조작은 현재의 합성 생물학 및 게놈 조작 노력에 대한 주된 도전과제이다. 최근에, 이 도전과제를 다루고 돌연변이가 생성될 수 있는 특이성 및 속도를 증가시키기 위해 다양한 기술들이 개발되었다.
가축은 관습적으로 유성 생식에 의해 생산되며, 종래의 방목 및 사육 관행에 의해, 또는 집약농업 관행에 의해, 농장에서 성적 성숙되고 있으며, 후자는 돼지에 점점 더 일반적이 되고 있다.
종래의 동물 생산 및 유전자조작 동물 생산과정들은 생식력 및 생존력을 강조한다. 가축번식 비효율은 가축 생산에 매우 부정적인 영향을 가진다. 번식 성공을 증가시키기 위해 사용될 수 있는 기술들의 수가 증가함에도 불구하고, 번식 주기가 줄어드는 것이 일반적이다. 클로닝을 포함하는, 정교한 기술들은 공지되어 있지만, 유성 생식보다는 훨씬 덜 효율적이며, 가축의 대량생산에 적합하지 않다.
유전자들이 후대로 전달되는 것을 극대화하기 위해, 때로는 인공수정 또는 배아-이식이 사용될 수 있다. 체세포 핵 전이 또는 크로마틴 전이와 같은 클로닝 기술들은 유성생식과 필적할 수 없는 낮은 효율을 가지며, 유전자조작 동물들의 정기적 생산에 적합하지 않다. 핵-전이 배아 줄기세포(NTESC)라고 불리우는, 배아 줄기세포를 사용한 클로닝은 가축 배아 줄기세포의 유도가 지금까지 성공하지 못했기 때문에, 현재 가축에 가능하지 않다.
유전자조작 가축을 생산하기 위해 유전공학을 사용하면, 원하는 형질을 갖는 가축의 생산이 가속화될 것이다. 전형적인 가축 사육은 주의깊은 유전형질 선택 및 세대번식을 위한 긴 기다림을 포함하는 비싸고, 시간소모적인 방법이다. 주의 깊은 형질 선택에도, 유성번식의 변화는 원하는 형질 조합을 배양하고 소멸시키는데 상당한 도전이 존재한다
본 발명은 일 구체예로서 암컷 개체의 선택적 생산을 위한, 유전적으로 조작된 생식조절인자 및 이의 용도를 제공하고자 한다.
본 발명은 일 구체예로서 인위적으로 조작한 생식발생 유전자 및 이를 포함하는 세포 또는 배아를 제공하고자 한다.
본 발명은 일 구체예로서 암컷 개체의 선택적 생산을 위한, 생식조절인자의 유전적 조작용 조성물 및 이의 이용을 제공하고자 한다.
본 발명은 일 구체예로서, 유전적 조작을 통한 Y 염색체 제거방법 또는 SRY 유전자 넉아웃 또는 넉다운 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 일 구체예로서 유전적 조작을 통한 암컷 개체의 선택적 생산 방법을 제공하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 암컷 개체의 선택적 생산을 위한, 유전적으로 조작된 생식조절인자 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, Y 염색체 또는 Y 염색체 상에 존재하는 생식발생 유전자의 인위적인 조작 또는 변형을 이용하여 암컷 표현형을 가지는 동물을 생산하는 방법 및 이의 이용에 관한 것이다.
본 발명은 특정 목적을 위해 유전적으로 조작된 또는 변형된 생식조절인자(예를 들어, 생식발생 유전자)를 제공한다.
"생식조절인자"는 자손을 생산하거나 임신 능력에 관여하는 인자로서, 유전자, 단백질, 성염색체, 세포 등 생식 조절 메커니즘에 관여하는 모든 구성요소를 총칭하는 용어이다. 예를 들어, 생식조절 메커니즘에서 발현되는 유전자 또는 단백질일 수 있다.
상기 생식조절인자는 성염색체 또는 상기 성염색체 상에 존재하는 생식조절 유전자(gametogenic gene)일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서는 특히, 상기 성염색체는 Y 염색체인 것이 바람직하다.
본 발명의 일 구현예에서는 생식발생 유전자로서 예를 들어, 유전적으로 조작된 또는 변형된, SRY, TENR, ADAMIa, ADAM2, ADAM, 알파4, ATP2B4 유전자, CatSperl, CatSper2, CatSper3, Catsper4,CatSperbeta, CatSper감마, CatSper델타, KCNU1, DNAH8, 클라메긴(Clamegin), 콤플렉신(Complexin)-I, 서톨리(Sertoli) 세포 안드로겐 수용체, Gasz, Ral75, Cibl, Cnot7, Zmyndl5, CKs2, PIWIL4, PIWIL2, 및 Smcp로 구성된 그룹으로부터 선택된 1 이상의 유전자일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서는 생식발생 유전자로서 유전적으로 조작된 또는 변형된 2이상의 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 예로서 유전적으로 조작된 또는 변형된 SRY (sex-determining region Y chromosome)일 수 있다.
상기 핵산서열 내 변형은 하나 이상의 핵산의 결실, 치환, 삽입 또는 역위를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서는, 핵산서열 내 변형은 뉴클레아제 제제에 의해 인위적으로 일으킬 수 있다.
예를 들어, 상기 뉴클레아제 제제는 하기의 뉴클레아제 중 1 이상을 사용할 수 있다.:
(a) 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN);
(b) 전사 활성화 인자 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN);
(c) 메가뉴클레아제; 또는
(d) RNA-가이드 엔도뉴클레아제 (RNA-Guided Endonuclease; RGEN)
일 실시예에서, 상기 핵산서열 내 변형은 RNA-가이드 엔도뉴클레아제 (RNA-Guided Endonuclease; RGEN)에 의해 인위적으로 조작될 수 있다. 대상은 표적 핵산, 유전자, 염색체 또는 단백질일 수 있다.
상기 엔도뉴클레아제는 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 노카르디옵
시스 다손빌레이(Nocardiopsis dassonvillei), 스트렙토마이세스 프리스티네스피랄리스(Streptomyces pristinaespiralis), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토스포랑기움 로세움(Streptosporangium roseum), 스트렙토스포랑기움 로세움(Streptosporangium roseum), 알리사이클로바클루스 아시도칼다리우스(AlicyclobacHlus acidocaldarius), 바실러스 슈도마이코이데스(Bacillus pseudomycoides), 바실러스 셀레니티레두센스(Bacillus selenitireducens), 엑시구오박테리움 시비리쿰(Exiguobacterium sibiricum), 락토바실러스 델브루에키이(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 미크로스킬라 마리나(Microscilla marina), 부르크홀데리아레스 박테리움(Burkholderiales bacterium), 폴라로모나스 나프탈레니보란스(Polaromonas naphthalenivorans), 폴라로모나스 속(Polaromonas sp.), 크로코스파에라 와트소니이(Crocosphaera watsonii), 시아노테세 속(Cyanothece sp.), 마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa), 시네코코커스 속(Synechococcus sp.), 아세토할로비움 아라바티쿰(Acetohalobium arabaticum), 암모니펙스 데겐시이(Ammonifex degensii), 칼디셀룰로시럽토 베시이(Caldicelulosiruptor bescii), 칸디다투스 데술포루디스(Candidatus Desulforudis), 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리듐 디피실레(Clostridium difficile), 피네골디아 마그나(Finegoldia magna), 나트라나에로비우스 써모필러스 (Natranaerobius thermophilus), 펠로토마쿨럼 써모프로피오니쿰(Pelotomaculum thermopropionicum), 아시디티오바실러스 칼두스(Acidithiobacillus caldus), 아시디티오바실러스 페로옥시단스(Acidithiobacillus ferrooxidans), 알로크로마티움 비노숨(Allochromatium vinosum), 마리노박터 속(Marinobacter sp.), 니트로소코커스 할로필러스(Nitrosococcus halophilus), 니트로소코커스 와트소니(Nitrosococcus watsoni), 슈도알테로 모나스 할로플란크티스(Pseudoalteromonas haloplanktis), 크테도노박테르 라세미페르(Ktedonobacter racemifer), 메타노할로비움 에베스티가툼(Methanohalobium evestigatum), 아나베나 바리아빌리스(Anabaena variabilis), 노둘라리아 스푸미게나(Nodularia spumigena), 노스톡 속(Nostoc sp.), 아르트로스피라 맥시마(Arthrospira maxima), 아르트로스피라 플라텐시스(Arthrospira platensis), 아르트로스피라 속(Arthrospira sp.), 링비아속(Lyngbya sp.), 마이크로콜레우스 크토노플라스테스(Microcoleus chthonoplastes), 오실라토리아 속(Oscillatoria sp.), 페트로토가 모빌리스(Petrotoga mobilis), 써모시포 아프리카누스(Thermosipho africanus) 또는 아카리오클로리스 마리나(Acaryochloris marina)로부터 유래될 수 있다. Cas9 패밀리의 추가의 예는 그 전체 내용이 본 명세서에 참조로 포함되는 WO 2014/131833에 기재되어 있다. 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)유래의 Cas9 단백질일 수 있다.
예를 들어, 상기 상기 생식조절인자는 RNA-가이드 엔도뉴클레아제에 의해 유전적으로 조작된 생식조절인자로서,
상기 생식조절인자를 구성하는 핵산서열 내 PAM(proto-spacer-adjacent Motif) 서열 중 또는 이의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 3bp 내지 25bp의 염기 서열 부위 내의
하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실 또는 삽입;
야생형 유전자와 상이한 하나 이상의 뉴클레오타이드로의 치환;
외부 유래의 하나 이상의 뉴클레오타이드 삽입
중 하나 이상의 핵산의 변형
을 포함할 수 있다.
상기 PAM 서열은 Cas 단백질의 유래 미생물에 따라 상이할 수 있다. 구체적인 설명은 이후 기술하기로 한다. 대표적인 예로서, 상기 RNA-가이드 엔도뉴클레아제가 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 유래 Cas9 단백질이고, 상기 PAM 서열이 NGG(N은 A, T, C 또는 G임)인 것을 이용할 수 있다.
상기 핵산의 변형은 염색체 전체 게놈 서열에서 2 이상의 복수 부위에서 일어날 수 있다. 구체적인 실시 형태에서, 적어도 한 부위 이상에서, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 뉴클레오티드가 Y 염색체 핵산서열에서 변화될 수 있다. 이에 의해 Y 염색체는 제거되거나 또는 완전히 그 기능이 소실될 수 있다.
상기 핵산의 변형은 유전자의 프로모터 영역에서 일어날 수 있다.
상기 핵산의 변형은 유전자의 엑손 영역에서 일어날 수 있다.
상기 핵산의 변형은 유전자의 인트론 영역에서 일어날 수 있다.
상기 핵산의 변형은 유전자의 인핸서 영역에서 일어날 수 있다.
또한, 다른 구현예에서, 본 발명은 생식조절인자, 예를 들어, Y 염색체 또는 SRY 유전자의 핵산 서열 중 타겟 서열에 각각 상보적인 결합을 형성할 수 있는 가이드 핵산을 제공한다.
예를 들어, 다양한 군으로부터 선택되는 1이상의 가이드 핵산을 제공할 수 있다:
상기 가이드 핵산은 비제한적으로, 18 내지 25 bp, 18 내지 24 bp, 18 내지 23 bp, 19 내지 23 bp, 19 내지 23 bp, 또는 20 내지 23 bp의 뉴클레오타이드일 수 있다.
또한, 구현예에서, 본 발명은 상기 인위적으로 조작된 생식조절인자 및 이로부터 발현되는 산물 중 1이상을 포함하는, 인위적으로 조작된 세포 또는 배아를 제공할 수 있다.
상기 세포 또는 배아는 핵산서열 내 변형이 일어난 불활성화된 생식조절인자를 포함하고, 수컷 생식을 억제하여 암컷 표현형을 가지는 개체로 발달할 수 있다.
또한, 구현예에서, 본 발명은 생식조절인자를 유전적으로 조작하기 위한 조성물 및 이의 이용을 제공할 수 있다.
일 실시예에서, Y 염색체를 구성하는 핵산 서열 중 1 이상의 부위에 상보적인 결합을 형성할 수 있는 가이드 핵산; 및 RNA-가이드 엔도뉴클레아제 또는 이를 암호화하는 핵산을 포함하는 Y 염색체 제거용 조성물을 제공한다.
다른 실시예에서, SRY 유전자를 구성하는 핵산 서열 중 1 이상의 부위에 상보적인 결합을 형성할 수 있는 가이드 핵산; 및 RNA-가이드 엔도뉴클레아제 또는 이를 암호화하는 핵산을 포함하는 유전자 조작용 조성물을 제공한다.
관련 구성 설명은 상기 기술한 바와 같다.
구현예에서, 본 발명은
Y 염색체 상의 표적 게놈 유전자좌를 포함하는 세포 또는 배아에,
(a) 상기 표적 게놈 유전자좌 부위와 상보적으로 결합할 수 있는 가이드 RNA; 및
(b)RNA-가이드 엔도뉴클레아제 (RNA-Guided Endonuclease; RGEN)을
접촉시키는 단계를 포함하는, Y 염색체를 구성하는 핵산 또는 SRY 유전자의 핵산 서열이 변경된 세포 또는 배아를 제조하는 방법을 제공할 수 있다.
상기 가이드 RNA 및 엔도뉴클레아제는, 각각 핵산 서열의 형태로 1 이상의 벡터에 존재하거나, 또는 가이드 핵산과 에디터 단백질의 결합으로 복합체를 형성하여 존재할 수 있다.
상기 접촉시키는 단계는 생체 내 또는 생체 외에서 수행될 수 있다.
접촉시키는 단계는 전기천공법 (electroporation), 리포좀, 플라스미드, 바이러스벡터, 나노파티클(nanoparticles) 및 PTD (Protein translocation domain) 융합 단백질 방법 중 선택되는 1이상의 방법으로 수행될 수 있다.
바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(AAV), 백시니아바이러스, 폭스바이러스 및 단순포진 바이러스로 구성된 군에서 선택되는 1이상일 수 있다.
구현예에서, 본 발명은 상기 방법에 의해 수컷 생식이 억제된, 암컷 표현형을 가지는 개체를 수득하는 방법 및 그러한 개체를 제공할 수 있다.
상기 개체는 비-인간 영장류, 소, 말, 돼지, 양, 닭, 조류, 토끼, 염소, 개, 고양이 및 어류로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1이상의 동물일 수 있다.
예를 들어, 유전자 조작된 동물들, 예를 들면 생식발생 유전자(gametogenic gene)가 녹아웃(knockout)된 가축동물의 생산에 이용할 수 있다.
유전적으로 조작된 생식조절인자 또는 이에 의해 조작된 동물, 예를 들어 가축 동물의 암컷 개체를 선택적으로 생산하는 용도를 제공한다. 이러한 방법은 국내 축산업에 있어서 중요한 가치를 가지면, 나아가 육종 산업에서 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
정의
"세포", "숙주 세포", "변형 숙주 세포" 등은 특정 대상 세포뿐만 아니라 이런 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 의미한다. 특정 변형은 돌연변이 또는 환경 영향에 의해 후대에서 일어날 수 있기 때문에, 이런 자손은, 사실상, 부모 세포와 동일하지 않을 것이나 본 발명에 사용된 용어와 범위 내에 여전히 포함된다.
핵산에 대해 적용된 용어 "변형된" 또는 "조작된"은 본 발명에서 교환적으로 사용되며, 이는 유전자를 구성하는 핵산서열 내 인위적인 변경을 가한 것을 의미한다. 상기 변경은 하나 이상의 핵산의 결실, 치환, 삽입 또는 역위 등을 포함할 수 있다. 변형된 또는 조작된 핵산 서열은 이들 핵산 또는 이의 발현 생성물의 발현 및/또는 기능적 활성의 변경, 예를 들어, 증가, 촉진, 감소 또는 소실 등의 양태로나타날 수 있다.
특히, 핵산에 대해 적용된 용어 "손상" 및 "파괴"는 본 발명에서 교환적으로 사용되어 핵산 또는 이의 발현 생성물의 발현 및/또는 기능적 활성을 감소 또는 제거하는 임의의 유전자 변형을 의미한다. 예를 들어, 유전자의 파괴는 유전자의 발현 및/또는 상응하는 유전자 생성물(예를 들어, mRNA 및/또는 단백질)의 기능적 활성을 감소 또는 제거하는 임의의 유전자 변형의 범위 내에 포함된다. 유전자 변형은 핵산(예를 들어, 유전자)의 완전 또는 부분 불활성화, 억제, 결실, 방해, 봉쇄 또는 하강 조절을 포함한다. 본 발명의 일 구체예에서는 생식 유전자의 활성 또는 생식 유전자의 발현 생성물의 수준 또는 기능적 활성을 억제하는 임의의 다른 분자의 사용을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
"외인성 핵산"이라는 용어는, 핵산이 세포내 핵산서열과 자연적으로 동일하거나 구별되는 것과 무관하게, 세포 또는 배아에 첨가된 핵산을 의미한다. 핵산 단편이라는 용어는 광범위하며, 염색체, 발현 카셋트, 유전자, DNA, RNA, mRNA 또는 그의 일부를 포함한다. 세포 또는 배아는 예를 들면, 비-인간 척추동물, 비-인간 영장류, 소, 말, 돼지, 양, 닭, 조류, 토끼, 염소, 개, 고양이, 실험실 동물 및 어류로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다.
"생식 세포" 및 "생식 계열"은 서로 교환적으로 사용되며 배우자를 발생시키는 세포를 의미한다. 이런 용어는 원시 생식 세포, 알칼리성 포스파타제에 양성인 세포, 1차 난모 세포, 난원 세포, 정조줄기세포, 정원세포 및 1차 정자 세포를 포함한다.
"비-인간 동물"은 인간을 배제한 동물이며 포유류, 새, 파충류, 양서류 및 물고기와 같은 임의의 척축동물을 포함한다. 적절한 포유류는 설치류, 비-인간 영장류, 말 같은 말과, 양, 염소, 토끼와 같은 토끼목, 개, 고양이, 소, 동물원 동물뿐만 아니라 멸종위기 또는 외래 포유류를 포함한다.
"벡터"는 핵산 서열이 그 내부로 삽입되거나 복제될 수 있는, 예를 들어 플라스미드, 박테리오파지, 식물 바이러스로부터 유래된 핵산 분자, 적절하게는 DNA 분자를 의미한다. 벡터는 통상적으로 하나 이상의 독특한 제한 부위(restriction site)를 함유하고, 표적 세포 또는 조직 또는 그의 자손 세포(progenitor cell) 또는 조직을 포함하는 정의된 숙주 세포에서 자율적으로 복제할 수 있거나, 또는 복제된 서열이 재생가능하도록 정의된 숙주의 게놈에 통합될 수 있다.
"야생형"은 자연적으로 발생하는 서열로부터 분리될 때 그 유전자 또는 유전자 생성물의 특징을 가지는 유전자 또는 유전자 생성물을 의미한다. 야생형 유전자는 집단에서 가장 빈번하게 관찰되며, 따라서 임의적으로 유전자의 "정상" 또는 "야생형" 형태를 나타내는 것이다.
"변형된", "변형체" 또는 "돌연변이체"는 야생형 유전자 또는 유전자 생성물과 비교할 때 서열 및/또는 기능적 특성에 변형을 나타내는 유전자 또는 유전자 생성물을 의미한다.
"단백질", "폴리펩티드", 및 "펩티드"는 암호화 및 비암호화된 아미노산, 및 화학적으로 또는 생화학적으로 변형되거나 유도체화된 아미노산을 비롯하여, 임의의 길이의 아미노산의 폴리머 형태를 포함한다. 상기 용어는 또한 변형된 폴리머, 예컨대 변형된 펩티드 골격을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 이들 용어는 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
"핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 이들의 유사체 또는 변형된 형태를 비롯한 임의의 길이의 뉴클레오티드의 폴리머 형태를 포함한다. 이들은 단일 가닥, 이중 가닥, 및 다중 가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 및 푸린 염기, 피리미딘 염기, 또는 다른 천연, 화학적으로 변형된, 생화학적으로 변형된, 비천연, 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 포함하는 폴리머를 포함한다. 편의상, 핵산 크기는 핵산이 이중 가닥 형태이든지 단일 가닥 형태이든지 간에 bp로 나타낼 수 있다.
핵산의 "상보성"은 하나의 핵산 가닥의 뉴클레오티드 서열이 이의 핵산 염기 그룹의 배향으로 인해, 대향하는 핵산 가닥 상의 다른 서열과 수소 결합을 형성한다는 것을 의미한다. DNA의 상보적 염기는 전형적으로 A와 T, C와 G이다. RNA에서, 이들은 전형적으로 C와 G, U와 A이다.
혼성화는 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능하더라도, 두 핵산이 상보적 서열을 포함하는 것을 요한다. 두 핵산 간의 혼성화에 적합한 조건은 당업계에 주지된 변수인 핵산 길이 및 상보성 정도에 따라 다르다.
"포함하는" 또는 "들 수 있는(~가 포함되는)" 조성물 또는 방법은 구체적으로 열거되지 않은 다른 요소를 포함할 수 있다.
"약"은 표시된 값의 측정 표준 오차(예를 들어, SEM) 내의 값을 포함한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 암컷 개체의 선택적 생산을 위한, 유전적으로 조작된 생식발생 유전자(gametogenic gene)의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 생식발생 유전자(gametogenic gene), 바람직하게는 Y 염색체의 게놈을 인위적으로 변형시키는 방법 및 이의 이용에 관한 것이다.
[게놈적 붙임]
본 발명의 일 구현예는 게놈적 불임 동물의 생산 및 변형에 관한 것이다.
게놈적 불임 동물은 지속적으로 불임이며, 이것은 유전적으로 후대를 생산할 수 없는 것을 의미한다.
"불임"이라는 용어는 그들의 유전자 구성을 갖는 후대를 생산하기 위해 유성 생식을 사용할 수 없는 것을 의미한다. 따라서, 도너 동물의 후대를 생산하는 동물은 다른 동물을 위한 기능적 생식세포를 생성하는데 활발하더라도, 불임이라고 언급된다. 일부 경우, 불임 동물은 인위적인 번식과정에서 제거 및 사용될 수 있는 그들의 생식세포들을 생산하며; 예를 들면 부동성 정자를 생성하는 숙주 동물은 세포질내 정자 주입(ICSI)에 의해 전파될 수 있거나, 또는 숙주 동물은 클로닝에 의해 전파될 수 있다.
구현예들은 동물들을 받는 사용자들이 형질을 갖는 동물들을 유용할 수 없거나, 그들의 봉쇄를 분실하지 않도록 한 성별의 동물만 생산하도록 하는 유전적 변형을 포함한다.
유전적 변형은 생식조절인자를 유전적으로 조작(engineering)하는 것을 포함한다. 기존의 염색체 유전자를 발현될 수 없도록 변경시킴으로써 일어날 수 있거나, 유전자의 전사 또는 해독을 억제할 인자들을 유전적으로 발현함으로써 일어날 수 있다
[생식조절인자]
본 발명의 일 태양은 유전적으로 조작된 생식조절인자에 관한 것이다.
"생식조절인자"는 자손을 생산하거나 임신 능력에 관여하는 인자로서, 유전자, 단백질, 성염색체, 세포 등 생식 조절 메커니즘에 관여하는 모든 구성요소를 총칭하는 용어이다. 예를 들어, 생식조절 메커니즘에서 발현되는 유전자 또는 단백질일 수 있다.
생식조절인자의 변형 또는 파괴는 동물의 임신 능력 또는 자손 생산 능력을 증진시키거나, 또는 감소, 손상, 폐지하여, 불임에 이르게 할 수 있다. 초래된 불임은 수컷 또는 암컷에 존재할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 유전적 및 게놈적 변형 대상은 생식세포일 수 있다.
생식세포라는 용어는 난자 또는 정자의 선조, 전형적으로 종자 세포, 난원 세포, 또는 정조 세포를 의미한다.
본 발명의 일 구체예에서, 유전적 및 게놈적 변형 대상은 생식세포형성과정(gametogenesis) 또는 정자발생과정 (spermatogenesis)을 방해하는 염색체일 수 있다.
염색체는 X 염색체, Y 염색체, 또는 상염색체일 수 있다. 바람직하게는 Y 염색체일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 생식조절인자로서 유전자는 생식세포 형성과정, 구체적으로는 정자형성과정을 위해 선택적인 유전자를 포함한다. 정자의 생식세포의 방해없이 정자형성과정을 불가능하게 하기 위한 모티프는 정자의 운동성, 첨체 융합, 또는 배우자접합을 방해하는 것이다.
일 실시태양에서, 생식조절 유전자는 성 염색체 상에 위치된 유전자이다. 이런 형태의 예시적 예에서, 생식조절 유전자는 Y 염색체 상에 위치된다.
비-제한적인 예는 SRY, TENR, ADAMIa, ADAM2, ADAM, 알파4, ATP2B4 유전자, CatSperl, CatSper2, CatSper3, Catsper4,CatSperbeta, CatSper감마, CatSper델타, KCNU1, DNAH8, 클라메긴(Clamegin), 콤플렉신(Complexin)-I, 서톨리(Sertoli) 세포 안드로겐 수용체, Gasz, Ral75, Cibl, Cnot7, Zmyndl5, CKs2, PIWIL4, PIWIL2, 및 Smcp로 구성된 그룹으로부터 선택된 유전자들을 포함할 수 있다.
유전자 정보는 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있다.
일 구체예에서, 생식조절 유전자는 SRY (sex-determining region Y chromosome) 이다.
SRY은 유태반 포유류의 웅성 성결정의 주요 조절인자이다. 정소결정인자(TDF)로도 알려진 Sry 유전자가 Y 염색체에 존재한다. Sry 는 이의 고이동도군(High Mobility Group; HMG) 도메인을 통해 DNA에 결합하는 전사 인자로 여겨진다. SRY 유전자는 성선을 고환으로 분화하여 남성으로 결정하는 가장 중요한 역할을 하는 유전자이다.
구체적인 실시 형태에서, Sry 단백질의 농도 및/또는 활성은 Sry 단백질의 레벨 및/또는 활성을 저하시키기 위한 변형이 유도되지 않은 대조군 세포에 비해, 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 저하된다.
다른 구체예에서, 생식조절 유전자는 정자 운동성을 방해하기 위해 분열될 수 있는 유전자들일 수 있다. 예를 들어, TENR ADAM1a 및 ADAMS를 포함한다.
다른 구체예에서, 생식조절 유전자는 정자 첨단체 융합 및/또는 수정능획득을 방해하기 위해 분열될 수 있는 유전자들일 수 있다. 예를 들어, ADAM2 및 ADAM3를 포함한다.
다른 구체예에서, 생식조절 유전자는 정자 세포들의 막내에 삽입된 막관통 칼슘 채널 단백질을 제공하는 CATSPER과 유전자들일 수 있다. CatSper과 유전자들은 유성 생식에 의해 새끼를 생산할 수 없는 수컷 동물들을 생산하기 위해 선택적으로 분열될 수 있다.
다른 구체예에서, 생식조절 유전자는 수정능력 관련 Kcnul(NCBI 유전자 ID: 157855, Kcnma3, Slo3, KCa5, KCa5.1, KCNMC1로도 알려져 있음), 편모 운동능 관련 DNAH8 (유전자 ID: 1769, hdhc9로도 알려져 있음)일 수 있다.
다른 구체예에서, 생식조절 유전자는 생식세포 발달에 필수적이고 RNA 의존성 헬리카제를 갖는 RNA 결합 단백질인 Vasa 유전자일 수 있다.
상기 유전자들은 2이상의 조합으로 변형될 수 있다.
다른 구체예에서, 생식조절인자의 조작은 정자활성을 위해 선택적인 유전자를 불활성화시키기 위해 세포 또는 배아에 적용될 수 있다.
일 실시예에서, 세포 또는 배아의 염색체 표적부위에 특이적으로 결합하여, 이중가닥 DNA 파괴를 일으켜서 유전자를 방해하여 생식세포 형성과정을 선택적으로 방해하는 제제를 포함하는 시험관내 세포 또는 배아이며, 상기 제제는 표적화 엔도뉴클레아제 및 재조합효소 융합 단백질로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다.
일 실시예에서, Y 염색체에 게놈 변형을 포함하는 유전자조작 가축동물이며, 상기 변형은 염색체의 1개 이상의 염기들의 삽입, 결실, 또는 치환을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 유전적으로 불임인 수컷 가축동물을 포함하는 유전자조작 동물을 제공할 수 있다.
일 실시예에서, 외인성 유전자에 의해 발현되는 인자는 생식세포 형성과정, 또는 정자형성과정 중 단계를 위해 선택적인 프로모터의 조절 하에 있을 수 있다. 상기 인자는 세포 또는 배아에 지장을 주거나, 또는 치명적이어서, 수컷 생식세포의 발달을 방해하거나 파괴하거나, 암컷 새끼만 생산할 수 있다. 상기 프로모터는 생식세포 형성과정, 정자형성과정 또는 난자형성과정에 특이적인 조직내에서 또는 세포내에서, 예를 들면, 고환, 정세관, 또는 부고환, 또는 난자 형성과정인 경우 난소, 여포, 난모세포, 과립막세포 또는 황체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 조직에서 활성일 수 있다.
다른 구체예에서, 생식조절인자의 변형은
예를 들어, Y 염색체 상의 표적 게놈 유전자좌의 표적화된 변화, Sry 유전자의 표적화된 변화 또는 다른 원하는 폴리뉴클레오티드의 표적화된 변화를 비롯한 대상으로 하는 폴리뉴클레오티드의 표적화된 변화를 포함할 수 있다.
이러한 표적화된 변형은 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실, 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 대상으로 하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 부분의 녹아웃, 대상으로 하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 부분의 녹인, 내인성 핵산 서열의 이종 핵산 서열로의 치환, 또는 그 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 구체적인 실시 형태에서, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 뉴클레오티드가 변화되어 표적화된 게놈 변형을 형성한다
예시적 예에서, 표적 서열은 생식 유전자의 뉴클레오티드 서열에 적어도 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 상동성을 나타낸다.
[유전적 조작 또는 변형]
본 발명의 생식발생 유전자, 면역세포 및 면역시스템에 관여하는 물질의 조작 또는 변형은, 바람직하게는 유전적 조작을 통해 이루어질 수 있다.
상기 유전자 조작은 유전자 발현 조절 과정을 고려하여 이루어질 수 있다.
구현예에서, 전사조절, RNA 가공 조절, RNA 수송 조절, RNA 분해 조절, 번역 조절 또는 단백질 변형 조절 단계에서 각 단계에 적합한 조작수단을 선택하여 이루어질 수 있다.
구현예에서, RNAi (RNA 간섭 or RNA silencing)을 이용하여, small RNA(sRNAs)가 mRNA를 방해하거나 안정성을 저하시키며, 경우에 따라서는 파괴하여 단백질 합성정보가 중간에서 전달되지 못하게 함으로써 유전정보의 발현을 제어할 수 있다. 예시적 예에서, 발현 생성물은 생식 유전자의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 표적 지역을 포함하며 생식 유전자의 발현을 약화 또는 파괴하는 RNA 분자(예를들어, siRNA, shRNA, miRNA, dsRNA 등)이다.
구현예에서, DNA 또는 RNA 분자, 바람직하게는 DNA 분자 내 핵산들 사이의 결합들(bonds)의 가수분해(절단(cleavage))을 촉매화할 수 있는 야생형 또는 변종(variant) 효소를 이용할 수 있다.
예를 들어, 메가뉴클레아제(meganuclease), 징크핑거(Zinc finger) 뉴클레아제, CRISPR/Cas9 (Cas9 단백질), CRISPR-Cpf1(Cpf1 단백질) 및 TALE-뉴클레아제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 뉴클레아제를 이용하여 유전자를 조작하여 유전정보의 발현을 제어할 수 있다.
일 양태에서, 면역세포의 증식, 생존 및/또는 기능에 영향을 미치는 면역조절 유전자의 비 암호 또는 암호 영역의 일부 또는 전부를 타겟팅하여 유전자 조작하는 조성물 및 방법을 제공할 수 있다.
상기 조성물 및 방법은,
구현예에서, 목적하는 면역 시스템의 형성을 위해, 이에 관여하는 면역조절 유전자 중 하나 이상을 조작하거나 변형시킬 수 있다. 이는 유전자를 구성하는 핵산의 변형을 통해 이루어질 수 있다. 조작 결과로서, 넉다운(knock down), 넉아웃(knock out), 넉인(knock in) 형태를 모두 포함한다.
구현예에서, 프로모터 영역, 또는 전사 서열, 예를 들어 인트론 또는 엑손 서열을 타겟으로 할 수 있다. 암호 서열, 예를 들어 암호 영역, 초기 암호 영역은 발현의 변경 및 넉아웃을 위해 표적화될 수 있다.
구현예에서, 핵산 변형은 하나 이상의 뉴클레오타이드, 예컨대, 1 내지 30bp, 1 내지 27bp, 1 내지 25bp, 1 내지 23bp, 1 내지 20bp, 1 내지 15bp, 1 내지 10bp, 1 내지 5bp, 1 내지 3bp, 또는 1bp의 뉴클레오타이드의 치환, 결실, 및/또는 삽입일 수 있다.
구현예에서, 면역조절 유전자 중 하나 이상을 넉아웃하기 위해, 또는 하나 이상의 발현을 제거하기 위해, 또는 하나 이상의 1 개 또는 2 개의 대립유전자를 넉아웃하기 위해, 면역조절 유전자 중 하나 이상에서의 결실 또는 돌연변이를 포함하도록 표적화될 수 있다.
구현예에서, 유전자 넉다운은 원치않는 대립유전자 또는 전사체의 발현을 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
구현예에서, 프로모터, 인핸서, 인트론, 3'UTR, 및/또는 폴리아데닐화 신호의 비 암호 서열을 표적화함으로써 면역 세포 기능에 영향을 미치는 면역조절 유전자를 변경하기 위해 사용될 수 있다.
구현예에서, 상기 유전자 변형은 유전자의 전부 또는 일부 (예컨대, 하나 이상의 뉴클레오타이드)의 결실, 치환, 및/또는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입에 의한 유전자의 활성 조절, 예컨대, 불활성화를 의미하는 것일 수 있다. 상기 유전자 불활성화는 유전자의 발현 억제 또는 발현 감소 (downregulation) 또는 본래의 기능을 상실한 단백질을 코딩하도록 변형된 것을 의미한다. 또한 유전자 조절은 타겟 유전자의 하나 이상의 Exon을 둘러싸고 있는 양쪽 intron 부위를 동시에targeting함으로 인한 Exon 부위의 결실로 인해 얻어지는 단백질의 구조 변형, Dominant negative 형태의 단백질 발현, soluble 형태로 분비되는 경쟁적 저해제발현 등의 결과에 의한 유전자의 기능 변화를 의미하는 것일 수 있다
상기 유전자 변형은 유전자를 불활성화시킴으로써 이 유전자로부터 코딩되는 단백질이 본래의 기능을 갖는 단백질 형태로 발현되지 않도록 하는 것일 수 있다
일 예에서, 상기 유전자 변형은 절단 엔도뉴클레아제를 포함하는 유전체 교정 시스템에 의하여 타겟된 유전자 내의 특정 부위의 단일가닥 또는 이중가닥 절단(cleavage)을 촉매화하여 타겟된 유전자를 불활성화시키는 것일 수 있다.
절단 엔도뉴클레아제에 의하여 촉매되는 핵산 가닥 손상(breaks)은 상동(homologous) 재조합(recombination) 또는 비상동 말단 연결(nonhomologous end joining; NHEJ) 등의 메커니즘들을 통하여 수선될 수 있다. 이 경우, NHEJ 메커니즘이 일어나면, 절단 위치(cleavage site)에서 DNA 서열에 변화가 유발되고, 이에 의하여 유전자가 불활성화될 수 있다.
이 경우, NHEJ 메커니즘이 일어나면, 절단 위치(cleavage site)에서 DNA 서열에 변화가 유발되고, 이에 의하여 유전자가 불활성화될 수 있다. NHEJ을 통한 수선은 짧은 유전자 단편의 치환들, 삽입들 또는 결실을 야기하고, 해당 유전자 넉아웃(knockouts)의 유도에 사용될 수 있다.
상기 유전자의 변형은 다음 중 하나 이상에 의하여 유도된 것일 수 있다:
1) 변형 대상 유전자 (이하, '타겟 유전자')의 전부 또는 일부 결실, 예컨대, 타겟 유전자의 1bp 이상의 뉴클레오타이드, 예컨대, 1 내지 30개, 1 내지 27개, 1 내지 25개, 1 내지 23개, 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 10개, 1 내지 5개, 1 내지 3개, 또는 1개의 뉴클레오타이드의 결실,
2) 타겟 유전자의 1bp 이상의 뉴클레오타이드, 예컨대, 1 내지 30개, 1 내지 27개, 1 내지 25개, 1 내지 23개, 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 10개, 1 내지 5개, 1 내지 3개, 또는 1개의 뉴클레오타이드의 원래(야생형)와 상이한 뉴클레오타이드로의 치환, 및
3) 하나 이상의 뉴클레오타이드, 예컨대, 1 내지 30개, 1 내지 7개, 1 내지 25개, 1 내지 23개, 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 10개, 1 내지 5개, 1 내지 3개, 또는 1개의 뉴클레오타이드 (각각 독립적으로 A, T, C 및 G 중에 서 선택됨)의 타겟 유전자의 임의의 위치에의 삽입.
상기 타겟 유전자의 변형되는 일부 ('타겟 부위')는 상기 유전자 중의 1bp 이상, 3bp 이상, 5bp 이상, 7bp 이상, 10bp 이상, 12bp 이상, 15bp 이상, 17bp 이상, 20bp 이상, 예컨대, 1bp 내지 30bp, 3bp 내지 30bp, 5bp 내지 30bp, 7bp 내지 30bp, 10bp 내지 30bp, 12bp 내지 30bp, 15bp 내지 30bp, 17bp 내지 30bp, 20bp 내지 30bp, 1bp 내지 27bp, 3bp 내지 27bp, 5bp 내지 27bp, 7bp 내지 27bp, 10bp 내지 27bp, 12bp 내지 27bp, 15bp 내지 27bp, 17bp 내지 27bp, 20bp 내지 27bp, 1bp 내지 25bp, 3bp 내지 25bp, 5bp 내지 25bp, 7bp 내지 25bp, 10bp 내지 25bp, 12bp 내지 25bp, 15bp 내지 25bp, 17bp 내지 25bp, 20bp 내지 25bp, 1bp 내지 23bp, 3bp 내지 23bp, 5bp 내지 23bp, 7bp 내지 23bp, 10bp 내지 23bp, 12bp 내지 23bp, 15bp 내지 23bp, 17bp 내지 23bp, 20bp 내지 23bp, 1bp 내지 20bp, 3bp 내지 20bp, 5bp 내지 20bp, 7bp 내지 20bp, 10bp 내지 20bp, 12bp 내지 20bp, 15bp 내지 20bp, 17bp 내지 20bp, 21bp 내지 25bp, 18bp 내지 22bp, 또는 21bp 내지 23bp의 연속하는 염기서열 부위일 수 있다.
상기 유전자 변형이 Cas9 단백질에 의하여 유도되는 경우, 상기 유전자 변형은 각 유전자의 염기서열 중 유래 미생물에 따른 Cas9 단백질 고유의 PAM(proto-spacer-adjacent Motif) 서열의 5' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 17bp 내지 25bp, 20bp 내지 25bp, 17bp 내지 23bp, 20bp 내지 23bp, 17bp 내지 20bp, 21bp 내지 25bp, 18bp 내지 22bp, 또는 21bp 내지 23bp의 염기서열 부위의 절단, 예컨대, 단일가닥 또는 이중가닥 절단, 또는 상기 절단이 수선되는 과정에서 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실 및/또는 삽입일 수 있다.
일 예에서, 상기 Cas9 단백질이 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 것인 경우, 상기 PAM 서열은 5'-NGG-3' (N은 A,T, G, 또는 C임)이다.
다른 예에서, 상기 Cas9 단백질이 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophiles) 유래의 것인 경우, 상기 PAM 서열은 5'-NNAGAAW-3' (N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G이고, W는 A 또는 T임)이다.
다른 예에서, 상기 Cas9 단백질이 네이세리아 메닝기디티스 (Neisseria meningitidis) 유래의 것인 경우, 상기 PAM 서열은 5'-NNNNGATT-3'(N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G임)이다.
다른 예에서, 상기 Cas9 단백질이 스트렙토코커스 아우레우스(Streptocuccus aureus) 유래의 것인 경우, 상기 PAM 서열은 5'-NNGRR(T)-3'(N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G이고, R은 A또는 G이고, (T)는 임의로 포함가능한 서열을 의미함)이다.
다른 예에서, Cpf1 단백질이 사용되는 경우, 상기 PAM 서열은 5'-TTN-3'(N은 A, T, C 또는 G임)이다.
그러므로, 본 발명의 대표적인 구현예에서는,
Y염색체를 구성하는 핵산 서열 중 1 이상의 부위;
Y염색체 상에 존재하는 1이상의 유전자의 핵산 서열 중 1 이상의 부위; 및
SRY 유전자를 구성하는 핵산 서열 중 1 이상의 부위
중 적어도 하나 이상을 타겟 서열 부위, 즉, 핵산 변형이 일어날 수 있는 부위를 유전적으로 변형 또는 조작함으로써, Y 염색체를 제거하거나, SRY 유전자의 기능을 감소 또는 제거한다.
상기 타겟 서열은 2 이상의 부위를 동시에 타겟으로 할 수 있다.
상기 타겟 서열은 2종 이상의 유전자를 동시에 타겟으로 할 수 있다.
동종 유전자 내 2종 이상의 타겟서열 또는 이종 유전자 내 2종 이상의 타겟서열을 동시에 타겟으로 할 수 있다.
일 실시예에서는 1종의 가이드 RNA를 이용하여 Y 염색체를 구성하는 핵산 서열 중 1이상의 부위를 타겟으로 할 수 있다. 이에 의해 Y 염색체를 제거할 수 있다. 이에 의해 Y 염색체의 기능을 감소시키거나 소실시킬 수 있다.
일 실시예에서는 2종 이상의 가이드 RNA를 이용하여 Y 염색체를 구성하는 핵산 서열 중 1이상의 부위를 타겟으로 할 수 있다. 이에 의해 Y 염색체를 제거할 수 있다. 이에 의해 Y 염색체의 기능을 감소시키거나 소실시킬 수 있다.
일 실시예에서는 1종의 가이드 RNA를 이용하여 SRY 유전자를 구성하는 핵산 서열 중 1이상의 부위를 타겟으로 할 수 있다. 이에 의해 SRY 유전자를 넉아웃 또는 넉다운할 수 있다.
일 실시예에서는 2종 이상의 가이드 RNA를 이용하여 SRY 유전자를 구성하는 핵산 서열 중 1이상의 부위를 타겟으로 할 수 있다. 이에 의해 SRY 유전자를 넉아웃 또는 넉다운할 수 있다.
일 구체예에서, Y 염색체의 레벨 및/또는 활성 저하는 Y 염색체를 구성하는핵산서열의 변형, 또는 Y 염색체 상에 존재하는 유전자들의 변형(비암호화 영역, 암호화 영역, 및/또는 인트론 등에서의 유전자 변형) 등에 기인할 수 있다. Y 염색체의 레벨 및/또는 활성 저하는 "Y 염색체의 제거"로 나타날 수도 있다.
이러한 Y 염색체 변형은 뉴클레오티드의 부가, 결실 또는 게놈으로의 치환을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
Y 염색체 핵산서열로의 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입,
Y 염색체 핵산서열로부터의 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실,
Y 염색체 핵산서열에서의 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환,
Y 염색체 핵산서열 또는 이의 부분의 녹아웃,
Y 염색체 핵산서열 또는 이의 부분의 녹인, 내인성 핵산 서열의 이종 핵산 서열로의 치환, 또는
그 조합을 포함한 Y 염색체 핵산서열 변화를 포함할 수 있다.
따라서, 구체적인 실시 형태에서, Y 염색체의 활성은, 생식조절 활성을 가지는 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자 등을 파괴함으로써 저하되거나 제거될 수 있다. 구체적인 실시 형태에서, 적어도 한 부위 이상에서, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 뉴클레오티드가 Y 염색체 핵산서열에서 변화된다. 다양한 방법을 사용하여, 추가의 표적화된 변형을 일으킬 수 있다.
구체적인 실시 형태에서, 다양한 뉴클레아제 제제(예를 들어, Cas9와 조합한 CRISPR gRNA; ZFN; 또는 TALEN) 중 어느 하나를 사용하여 Y 염색체 상의 큰 결실을 발생시키는 방법이 추가로 개시된다.
이러한 Y 염색체 상의 결실은 내인성 핵산 서열의 결실일 수 있다. 결실은 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 150 kb, 약 150 kb 내지 약 200 kb, 약 200 kb 내지 약 300 kb, 약 300 kb 내지 약 400 kb, 약 400 kb 내지 약 500 kb, 약 500 kb 내지 약 600 kb, 약 600 kb 내지 약 700 kb, 약 700 kb 내지 약 800 kb, 약 800 kb 내지 약 900 kb, 약 900 kb 내지 약 1 Mb, 약 500 kb 내지 약 1 Mb, 약 1 Mb 내지 약 1.5 Mb, 약 1.5 Mb 내지 약 2 Mb, 약 2 Mb 내지 약 2.5 Mb, 또는 약 2.5 Mb 내지 약 3 Mb의 범위일 수 있다. 일 실시 형태에서, 결실은 500 kb보다 크다. 또 하나의 실시 형태에서, 결실은 약 500 kb 내지 약 600 kb이다. 구체적인 실시 형태에서, 결실은 약 500 kb이다.
이러한 Y 염색체 상의 결실은 임의의 핵산 서열의 결실일 수 있다. 일 실시 형태에서, 결실은 생식능력/불임과 관련된 유전자를 포함한다. Y 염색체 상의 결실은 다수의 유전자의 결실을 포함할 수 있다. 이러한 방법에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 유전자가 결실될 수 있다. 다른 실시 형태에서, Sry 유전자는 결실의 대상이 된다.
일 구체예에서, SRY 단백질의 레벨 및/또는 활성 저하는 SRY 유전자의 유전자 변형(즉, 조절 영역, 암호화 영역, 및/또는 인트론 등에서의 유전자 변형)에 기인할 수 있다.
이러한 유전자 변형은 뉴클레오티드의 부가, 결실 또는 게놈으로의 치환을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
이러한 유전자 변형은 예를 들어,
SRY 유전자로의 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입,
SRY 유전자로부터의 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실,
SRY 유전자에서의 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환,
SRY 유전자 또는 이의 부분의 녹아웃,
SRY 유전자 또는 이의 부분의 녹인, 내인성 핵산 서열의 이종 핵산 서열로의 치환, 또는
그 조합을 포함한 SRY 유전자 변화를 포함할 수 있다.
따라서, 구체적인 실시 형태에서, SRY 폴리펩티드의 활성은 SRY 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 파괴함으로써 저하되거나 제거될 수 있다. 구체적인 실시 형태에서, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 뉴클레오티드가 SRY 유전자에서 변화된다. 다양한 방법을 사용하여, 추가의 표적화된 유전자 변형을 일으킬 수 있다.
다른 실시 형태에서, SRY 폴리펩티드의 활성 및/또는 레벨은 SRY 폴리펩티드의 레벨 또는 활성을 억제시키는 폴리뉴클레오티드를 세포로 도입함으로써 저하되거나 제거된다. 폴리뉴클레오티드는 직접적으로 SRY 메신저 RNA 의 번역을 저지하거나, 간접적으로 SRY 단백질을 암호화하는 유전자의 전사 또는 번역을 억제하는 폴리펩티드를 암호화함으로써 SRY 폴리펩티드의 발현을 억제할 수 있다. 다른 실시 형태에서, SRY 폴리펩티드의 활성은 SRY 폴리펩티드의 활성을 억제시키는 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 세포로 도입함으로써 저하되거나 제거된다.
또한, 본 발명의 일 구체예에서는 Y 염색체의 레벨 및/또는 활성 저하시키는, 또는 Y 염색체가 제거된 동물 세포를 제공한다.
또한, 본 발명의 일 구체예에서는 SRY 단백질의 레벨 및/또는 활성을 저하시키는 변형을 갖는 동물 세포를 제공한다.
벡터 및 핵산 도입
본 발명의 구현예에서, 상기 유전적 조작 또는 변형을 위해, 예를 들어, 넉아웃, 유전자 불활성화, 또는 특정 유전자의 발현을 얻기 위해, 또는 다른 목적을 위해, 세포에 다양한 핵산들이 도입될 수 있다.
핵산은 예를 들면, cDNA, 게놈 DNA, 합성(예를 들면, 화학합성된) DNA 뿐만 아니라, 자연발생 및 화학변형 핵산들, 예를 들면 합성 염기 또는 교대 백본들을 포함하는 RNA 및 DNA 둘다 의미한다. 핵산 분자는 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있다
일 구체예에서, 표적 핵산서열은 프로모터와 같은 조절영역에 조작가능하게 결합될 수 있다
일 구체예에서, 추가의 조절영역들을 함께 도입할 수 있다. 폴리아세틸화 서열, 해독조절서열들(예를 들면, 내부 리보솜 유입 세그먼트, IRES), 인핸서, 유도성 요소들 또는 인트론들을 포함하며, 여기에 국한되지 않는다.
일 구체예에서, 신호 펩티드 또는 선택가능한 마커들을 인코딩하는 핵산 구조물들이 사용될 수 있다.
일 구체예에서, 외인성 핵산은 폴리펩티드를 인코딩한다. "tag"를 인코딩하는 tag 서열을 포함할 수 있다.
상기 핵산은 다양한 기술들을 사용하여, 임의의 타입의 배아, 태아, 또는 가축 세포들에 도입될 수 있다.
예를 들면 난모세포 또는 난자와 같은 생식 세포, 간세포, 성체 또는 배아 줄기세포, 원시 생식세포, PK-15 세포와 같은 신장 세포, 섬 세포, 베타 세포, 간 세포, 또는 진피 섬유아세포와 같은 섬유아세포에 도입될 수 있다.
비-제한적인 예들은 트랜스포손 시스템, 세포들을 감염시킬 수 있는 재조합 바이러스, 또는 리포솜 또는 세포에 핵산들을 전달할 수 있는, 전기천공법, 미량주사법, 또는 인산칼슘 침전법과 같은 다른 비-바이러스 방법들을 포함한다.
상기 핵산은 벡터에 포함될 수 있다.
벡터는 발현 벡터 또는 벡터 시스템을 의미할 수 있으며, 에피솜, 플라스미드, 또는 심지어 바이러스/파지 DNA 세그먼트와 같은, 게놈 또는 다른 타겟팅되는 DNA 서열로 DNA 삽입을 일으키는 데 필요한 성분들의 셋트이다.
동물에서 유전자 전달을 위해 사용되는 바이러스 벡터를 사용할 수 있다. 또한, 비-바이러스 벡터를 사용할 수 있다.
많은 다른 종류의 벡터들이 알려져 있다. 예를 들면, 플라스미드 및 바이러스 벡터, 예를 들면 레트로바이러스 벡터가 알려져 있다. 포유류 발현 플라스미드는 전형적으로, 복제기원, 적당한 프로모터, 및 선택적인 인핸서, 및 임의의 필수 리보솜 결합부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 도너 및 수용체 부위, 전사종결서열, 및 5'플랭킹 비-전사서열을 가진다. 벡터들의 예들은: 플라스미드(벡터의 다른 타입의 담체일 수도 있음), 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV), 렌티바이러스(예를 들면, 변형된 HIV-1, SIV 또는 FIV), 레트로바이러스(예를 들면, ASV, ALV 또는 MoMLV), 및 트랜스포손(예를 들면, Sleeping Beauty, P-elements, Tol-2, Frog Prince, piggyBac)을 포함한다.
[뉴클레아제 시스템]
본 발명의 대표적인 구현예에서, 생식조절인자의 게놈을 변형시키기 위해 절단 뉴클레아제 시스템 또는 이러한 시스템의 성분을 이용할 수 있다. 뉴클레아제 제제로 총칭힌다. 바람직한 예에서, RNA-가이드 엔도뉴클레아제 (RNA-Guided Endonuclease; RGEN) 시스템을 이용할 수 있다.
CRISPR/Cas 시스템
본 발명의 대표적인 구현예는 CRISPR 관련 뉴클레아제(nuclease) Cas9 및 서열 특이적 가이드(guide) RNA(gRNA)를 비롯한 CRISPR 시스템의 성분을 세포 내로 도입함으로써, 서열-유도된 이중 가닥 절단을 유도하는 CRISPR 시스템의 능력을 이용하여 상기 절단을 유도하는 단계를 포함한다.
CRISPR 관련 뉴클레아제 Cas9 및 서열 특이적 가이드 RNA(gRNA)를 비롯한 CRISPR 시스템의 성분은 하나 이상의 벡터, 예컨대, 플라스미드 상에 코딩된 상태로 세포 내로 도입될 수 있다.
CRISPR/Cas 시스템은 Cas 유전자의 발현 또는 활성 유도에 관여하는 전사물 및 다른 요소를 포함한다. CRISPR/Cas 시스템은 타입 I, 타입 II 또는 타입 III 시스템일 수 있다. 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물은 핵산의 부위 특이적 절단을 위해 CRISPR 복합체(Cas 단백질과 복합체를 형성한 가이드RNA(gRNA)를 포함함)를 이용함으로써 CRISPR/Cas 시스템을 사용한다.
RNA 가이드 엔도뉴클레아제
Cas 단백질은 일반적으로 적어도 하나의 RNA 인식 또는 결합 도메인을 포함한다. 이러한 도메인은 가이드 RNA(gRNA, 이하에 더욱 상세히 기술됨)와 상호작용할 수 있다.
뉴클레아제 도메인은 핵산 절단을 위한 촉매 활성을 갖는다. 절단은 핵산 분자의 공유 결합의 파괴를 포함한다. 절단은 평활 말단 또는 스태거된 말단을 생성할 수 있으며, 단일 가닥 또는 이중 가닥으로 될 수 있다.
Cas 단백질의 예로는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas5e(CasD), Cas6, Cas6e, Cas6f, Cas7, Cas8a1, Cas8a2, Cas8b, Cas8c, Cas9(Csn1 또는 Csx12), Cas10, Casl0d, CasF, CasG, CasH, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1(CasA), Cse2(CasB), Cse3(CasE), Cse4(CasC), Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, Cpf1 및 Cu1966, 및 이들의 상동체 또는 변형된 버전(modified version)을 들 수 있다.
Cas 단백질은 타입 II CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질은 Cas9 단백질이거나, Cas9 단백질로부터 유래될 수 있다.
Cas9 단백질은 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 노카르디옵
시스 다손빌레이(Nocardiopsis dassonvillei), 스트렙토마이세스 프리스티네스피랄리스(Streptomyces pristinaespiralis), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토스포랑기움 로세움(Streptosporangium roseum), 스트렙토스포랑기움 로세움(Streptosporangium roseum), 알리사이클로바클루스 아시도칼다리우스(AlicyclobacHlus acidocaldarius), 바실러스 슈도마이코이데스(Bacillus pseudomycoides), 바실러스 셀레니티레두센스(Bacillus selenitireducens), 엑시구오박테리움 시비리쿰(Exiguobacterium sibiricum), 락토바실러스 델브루에키이(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 미크로스
킬라 마리나(Microscilla marina), 부르크홀데리아레스 박테리움(Burkholderiales bacterium), 폴라로모나스 나프탈레니보란스(Polaromonas naphthalenivorans), 폴라로모나스 속(Polaromonas sp.), 크로코스파에라 와트소니이(Crocosphaera watsonii), 시아노테세 속(Cyanothece sp.), 마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa), 시네코코커스 속(Synechococcus sp.), 아세토할로비움 아라바티쿰(Acetohalobium arabaticum), 암모니펙스 데겐시이(Ammonifex degensii), 칼디셀룰로시럽토 베시이(Caldicelulosiruptor bescii), 칸디다투스 데술포루디스(Candidatus Desulforudis), 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리듐 디피실레(Clostridium difficile), 피네골디아 마그나(Finegoldia magna), 나트라나에로비우스 써모필러스 (Natranaerobius thermophilus), 펠로토마쿨럼 써모프로피오니쿰(Pelotomaculum thermopropionicum), 아시디티오바실러스 칼두스(Acidithiobacillus caldus), 아시디티오바실러스 페로옥시단스(Acidithiobacillus ferrooxidans), 알로크로마티움 비노숨(Allochromatium vinosum), 마리노박터 속(Marinobacter sp.), 니트로소코커스 할로필러스(Nitrosococcus halophilus), 니트로소코커스 와트소니(Nitrosococcus watsoni), 슈도알테로 모나스 할로플란크티스(Pseudoalteromonas haloplanktis), 크테도노박테르 라세미페르(Ktedonobacter racemifer), 메타노할로비움 에베스티가툼(Methanohalobium evestigatum), 아나베나 바리아빌리스(Anabaena variabilis), 노둘라리아 스푸미게나(Nodularia spumigena), 노스톡 속(Nostoc sp.), 아르트로스피라 맥시마(Arthrospira maxima), 아르트로스피라 플라텐시스(Arthrospira platensis), 아르트로스피라 속(Arthrospira sp.), 링비아속(Lyngbya sp.), 마이크로콜레우스 크토노플라스테스(Microcoleus chthonoplastes), 오실라토리아 속(Oscillatoria sp.), 페트로토가 모빌리스(Petrotoga mobilis), 써모시포 아프리카누스(Thermosipho africanus) 또는 아카리오클로리스 마리나(Acaryochloris marina)로부터 유래될 수 있다. Cas9 패밀리의 추가의 예는 그 전체 내용이 본 명세서에 참조로 포함되는 WO 2014/131833에 기재되어 있다. 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)유래의 Cas9 단백질 또는 이의 유도체는 바람직한 효소이다.
Cpf1 단백질은 Parcubacteria bacterium (GWC2011_GWC2_44_17), Lachnospiraceae bacterium (MC2017), Butyrivibrio proteoclasiicus, Peregrinibacteria bacterium (GW2011_GWA_33_10), Acidaminococcus sp. (BV3L6), Porphyromonas macacae, Lachnospiraceae bacterium (ND2006), Porphyromonas crevioricanis, Prevotella disiens, Moraxella bovoculi (237), Smiihella sp. (SC_KO8D17), Leptospira inadai, Lachnospiraceae bacterium (MA2020), Francisella novicida (U112), Candidatus Methanoplasma termitum, Eubacterium eligens 등의 미생물 유래의 것일 수 있으며, 예컨대, Parcubacteria bacterium (GWC2011_GWC2_44_17), Peregrinibacteria bacterium (GW2011_GWA_33_10), Acidaminococcus sp. (BV3L6), Porphyromonas macacae, Lachnospiraceae bacterium (ND2006), Porphyromonas crevioricanis, Prevotella disiens, Moraxella bovoculi (237), Leptospira inadai, Lachnospiraceae bacterium (MA2020), Francisella novicida (U112), Candidatus Methanoplasma termitum, 또는 Eubacterium eligens 유래의 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
Cas 단백질은 야생형 단백질(즉, 천연에서 발생하는 것), 변형된 Cas 단백질(즉, Cas 단백질 변이체) 또는 야생형 또는 변형된 Cas 단백질의 단편일 수 있다. Cas 단백질은 또한 야생형 또는 변형된 Cas 단백질의 활성 변이체 또는 단편일 수 있다. 활성 변이체 또는 단편은 야생형 또는 변형된 Cas 단백질 또는 이의 부분에 대하여, 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 포함할수 있으며, 여기서 활성 변이체는 원하는 절단 부위에서 절단하는 능력을 보유하므로, 닉 유도 또는 이중 가닥절단 유도 활성을 보유한다. 닉 유도 또는 이중 가닥 절단 유도 활성의 측정법은 공지되어 있다.
Cas 단백질은 핵산 결합 친화성, 핵산 결합 특이성 및/또는 효소 활성을 증가시키거나 감소시키도록 변형될 수 있다. Cas 단백질은 또한 단백질의 다른 활성이나 특성, 예를 들어 안정성을 변화시키도록 변형될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질의 하나 이상의 뉴클레아제 도메인을 변형, 결실 또는 불활성화시킬 수 있거나, Cas 단백질을 절단하여 단백질의 기능에 필수적이지 않은 도메인을 제거하거나 Cas 단백질의 활성을 최적화시킬 수 있다.
1개 또는 2개의 뉴클레아제 도메인이 결실되거나 돌연변이되어, 더 이상 기능적이지 않거나 뉴클레아제 활성 저하를 가져올 수 있다.
1개의 뉴클레아제 도메인이 결실되거나 돌연변이되는 경우, 생성된 Cas 단백질(예를 들어, Cas9)은 닉카아제(nickase)로 지칭될 수 있으며, 이중 가닥 DNA 내의 CRISPR RNA 인식 서열에서 단일 가닥 절단을 생성할 수 있다.
2개의 뉴클레아제 도메인이 결실되거나 돌연변이되는 경우, 생성된 Cas 단백질(예를들어, Cas9)은 이중 가닥 DNA의 두 가닥을 절단하는 능력이 저하될 것이다. Cas9를 닉카아제로 전환시키는 돌연변이의 예로는 sp.Cas9의 RuvC 도메인에서의 D10A 또는 H939A 또는 H840A가 있을 수 있다.
Cas 단백질은 또한 융합 단백질일 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질은 절단 도메인, 후성적 변형 도메인, 전사활성화 도메인 또는 전사 억제인자 도메인에 융합될 수 있다. 융합된 도메인 또는 이종 폴리 펩티드는 N 말단, C 말단, 또는 Cas 단백질 내부에 위치할 수 있다.
또한, Cas 단백질은 이종 폴리펩티드에 융합될 수 있다. 이종 펩티드는 예를 들어, 핵을 표적화하기 위한 SV40 NLS와 같은 핵 국재화 시그널 (NLS), 미토콘드리아를 표적화하기 위한 미토콘드리아 국재화 시그널, ER 보류 시그널(retention signal) 등을 포함한다. 이러한 시그널은 N 말단, C 말단 또는 Cas 단백질 내의 어디에도 위치할 수 있다.
Cas 단백질은 또한 세포 투과성 도메인에 연결될 수 있다. 예를 들어, 세포 투과성 도메인은 HIV-1 TAT단백질, 인간 B형 간염 바이러스 유래의 TLM 세포 투과성 모티프, MPG, Pep-1, VP22, 단순 헤르페스 바이러스 유래의 세포 투과성 펩티드, 또는 폴리아르기닌 펩티드 서열로부터 유래될 수 있다.
Cas 단백질은 또한 추적 또는 정제를 용이하게 하기 위한 이종 폴리펩티드, 예를 들어 형광 단백질, 정제 태그 또는 에피토프 태그를 포함할 수 있다.
Cas 단백질은 임의의 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질은 gRNA와 복합체를 형성한 Cas 단백질과 같은 단백질의 형태로 제공될 수 있다. 대안적으로, Cas 단백질은 RNA(예를 들어, 메신저 RNA(mRNA)) 또는 DNA와 같은, Cas 단백질을 암호화하는 핵산의 형태로 제공될 수 있다. 임의로, Cas 단백질을 암호화하는 핵산은 특정 세포 또는 유기체에서 단백질로의 효율적인 번역을 위해 코돈 최적화될 수 있다.
Cas 단백질을 암호화하는 핵산은 세포의 게놈에 안정하게 통합될 수 있으며, 세포에서 활성인 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 대안적으로, Cas 단백질을 암호화하는 핵산은 발현 구축물의 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다.
가이드 RNA(gRNA)
"가이드 RNA" 또는 "gRNA"는 Cas 단백질에 결합하고, 표적 DNA 내의 특정 위치의 Cas 단백질을 표적으로 하는 RNA 분자를 포함한다. 가이드 RNA는 2개의 세그먼트, 즉, "DNA 표적 세그먼트"와 "단백질 결합 세그먼트"를 포함할 수 있다. "세그먼트"는 RNA의 뉴클레오티드의 연속 스트레치와 같은, 분자의 세그먼트, 섹션 또는 영역을 포함한다. 일부 gRNA는 2개의 분리된 RNA 분자, 즉, "활성화(activator)-RNA"인 crRNA와 "표적화(targeter)-RNA"인 tracrRNA를 포함한다. 다른 gRNA는 "단일 분자 gRNA", "단일 가이드 RNA" 또는 "sgRNA"로도 지칭되는 단일 RNA 분자(단일 RNA 폴리뉴클레오티드)이다.
crRNA와 대응하는 tracrRNA는 혼성화하여, gRNA를 형성한다. crRNA는 CRISPR RNA 인식 서열에 혼성화하는 단일 가닥 DNA 표적화 세그먼트를 제공한다.세포 내에서의 변형에 사용된다면, 주어진 crRNA 또는 tracrRNA 분자의 완전 서열은 RNA 분자가 사용될 종류에 특이적이도록 설계될 수 있다.
주어진 gRNA의 DNA 표적화 세그먼트(crRNA)는 표적 DNA의 서열과 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
gRNA의 DNA 표적화 세그먼트는 혼성화를 통해 서열 특이적으로 표적 DNA와 상호 작용한다(즉, 염기쌍 형성). 이와 같이, DNA 표적화 세그먼트의 뉴클레오티드 서열은 달라질 수 있으며, gRNA 및 표적 DNA가 상호 작용할 표적 DNA 내의 위치를 결정한다. 대상 gRNA의 DNA 표적화 세그먼트는 표적 DNA 내의 원하는 서열에 혼성화되도록 변형될 수 있다.
DNA 표적화 세그먼트는 약 12개의 뉴클레오티드 내지 약 100개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 예를들어, DNA 표적화 세그먼트는 약 12개의 뉴클레오티드(nt) 내지 약 80개의 nt, 약 12개의 nt 내지 약 50개의nt, 약 12개의 nt 내지 약 40개의 nt, 약 12개의 nt 내지 약 30개의 nt, 약 12개의 nt 내지 약 25개의 nt, 약 12개의 nt 내지 약 20개의 nt, 또는 약 12개의 nt 내지 약 19개의 nt의 길이를 가질 수 있다.
tracrRNA는 임의의 형태(예를 들어, 전장 tracrRNA 또는 활성 부분 tracrRNA) 및 다양한 길이로 될 수 있다.
표적 DNA 내의 DNA 표적화 서열과 CRISPR RNA 인식 서열 사이의 상보성 비율은 적어도 60%(예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)일 수 있다.
가이드 RNA는 추가의 바람직한 특징, 예를 들어, 변형되거나 조절된 안정성; 세포내 표적화; 형광 표지를 이용한 추적; 단백질 또는 단백질 복합체에 대한 결합 부위 등을 제공하는 변형 또는 서열을 포함할 수 있다.
이러한 변형의 예로는 예를 들어, 5' 캡(예를 들어, 7-메틸구아닐레이트 캡(m7G)); 3' 폴리아데닐화된 테일(즉, 3' 폴리(A) 테일); 리보스위치(riboswitch) 서열(예를 들어, 단백질 및/또는 단백질 복합체에 의한 조절된 안정성 및/또는 조절된 접근성을 고려함); 안정성 제어 서열; dsRNA 이중 나선 구조(즉, 헤어핀)를 형성하는 서열 등을 포함할 수 있다.
가이드 RNA는 임의의 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, gRNA는 2개의 분자(분리된 crRNA 및 tracrRNA) 또는 1개의 분자(sgRNA)로서의 RNA 형태 및 임의로 Cas 단백질과의 복합체 형태로 제공될 수 있다. gRNA는 또한 RNA를 암호화하는 DNA의 형태로 제공될 수 있다. gRNA를 암호화하는 DNA는 단일 RNA 분자(sgRNA) 또는 분리된 RNA 분자(예를 들어, 분리된 crRNA 및 tracrRNA)를 암호화할 수 있다.
gRNA를 암호화하는 DNA는 세포의 게놈에 안정하게 통합될 수 있으며, 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 대안적으로, gRNA를 암호화하는 DNA는 발현 구축물의 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 인간 U6 프로모터를 이용할 수 있다.
핵산의 절단
Cas 단백질은 gRNA의 DNA 표적화 세그먼트가 결합할 표적 DNA에 존재하는 핵산 서열의 내부 또는 외부의 부위에서 핵산을 절단할 수 있다.
"절단 부위"는 Cas 단백질이 단일 가닥 절단 또는 이중 가닥 절단을 일으키는 핵산위치를 포함한다. 예를 들어, CRISPR 복합체 형성은 gRNA의 DNA 표적화 세그먼트가 결합될 표적 DNA 내에 존재하는 핵산 서열 또는 그 부근에(예를 들어, 상기 핵산 서열로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50개 또는 그 이상의 염기쌍 내에) 한 가닥 또는 두 가닥의 절단을 일으킬 수 있다.
절단 부위는 핵산의 한 가닥에만 또는 두 가닥에 있을 수 있다. 절단 부위는 핵산의 두 가닥의 동일한 위치에 있을 수 있거나(평활 말단을 생성함), 각 가닥의 상이한 부위에 있을 수 있다(스태거된 말단을 생성함).
Cas9에 의한 표적 DNA의 부위 특이적 절단은 표적 DNA에서, (i) gRNA와 표적 DNA 사이의 염기쌍 형성 상보성과 (ii) PAM으로 지칭되는 짧은 모티프에 의해 결정되는 위치에서 발생할 수 있다.
PAM(Protospacer adjacent motif)은 CRISPR RNA 인식 서열에 플랭킹될 수 있다. 임의로, CRISPR RNA 인식 서열은 PAM이 플랭킹될 수 있다. 예를 들어, Cas9의 절단 부위는 PAM 서열의 상류 또는 하류에 약 1 내지 약 10개, 또는 약 2 내지 약 5개의 염기쌍(예를 들어, 3개의 염기쌍)으로 될 수 있다.
생식조절인자 조작을 위한 가이드 RNA
본 발명의 일 구체예에서, 생식조절인자의 유전적인 조작을 위한 가이드 RNA 서열이 제공된다. 예를 들어, 상기 서열번호 1 내지 9번의 타겟서열에 상응하는 가이드 RNA 서열이 제공된다.
본 발명의 일 구체예에서, Y 염색체의 유전적인 조작을 위한 가이드 RNA 서열이 제공된다. 예를 들어, 상기 서열번호 1 내지 9번의 타겟서열에 상응하는 가이드 RNA 서열이 제공된다.
본 발명의 일 구체예에서, SRY 유전자의 유전적인 조작을 위한 가이드 RNA 서열이 제공된다. 예를 들어, 상기 서열번호 1 내지 9번의 타겟서열에 상응하는 가이드 RNA 서열이 제공된다.
본 발명의 일 구체예에서, Y 염색체 또는 SRY 유전자의 유전적 조작을 위해 타겟서열에 상응하는 가이드 RNA와 상호작용하는, 예를 들어 복합체를 형성하는 CRISPR 관련 뉴클레아제가 제공된다.
본 발명의 일 구체예에서, Y 염색체 또는 SRY 유전자의 상기 타겟서열 부위에서 인위적인 유전적 조작이 일어난 각 핵산 변형 산물 및 이의 발현 산물이 제공된다.
또한, 일 구체예에서, 본 발명은 Y 염색체 또는 SRY 유전자의 타겟 부위에서의 핵산 변형을 위해 사용되는 '가이드 RNA - CRISPR 관련 뉴클레아제'의 복합체(complex)를 제공한다.
특히, 유전자로부터의 표적 부위와 상보적 결합을 할 수 있는 도메인을 포함하는 gRNA 분자, 예를 들어 단리된 또는 비천연 유래 gRNA 분자 및 이를 암호화하는 DNA를 제공할 수 있다.
또한, 2 개 이상의 gRNA가 표적 핵산에서 2 개 이상의 절단 사건, 예를 들어 이중 가닥 또는 단일 가닥 파손을 위치시키기 위해 사용될 때, 2 개 이상의 절단 사건이 동일 또는 상이한 Cas9 단백질에 의해 생성될 수 있다.
상기 gRNA 는 예를 들어,
Y 염색체 또는 SRY 유전자에서 2이상의 부위를 타겟으로 할 수 있고,
Y 염색체 또는 SRY 유전자 각각에 대하여 2이상의 부위를 타겟으로 할 수 있고,
Y 염색체 또는 SRY 유전자의 이중 가닥 및/또는 단일 가닥 절단을 독립적으로 유도할 수 있고
Y 염색체 또는 SRY 유전자의 절단 부위에 하나 외부 유래 뉴클레오타이드의 삽입을 유도할 수도 있다.
또한, 본 발명의 다른 구체예로서 '가이드 RNA - CRISPR 관련 뉴클레아제'의 복합체(complex)를 구성하는 핵산은
(a) 본 명세서에 개시된 바와 같은 Y 염색체 또는 SRY 유전자에서 타겟 부위 서열에 상보성인 gRNA 분자를 암호화하는 서열; 및
(b) CRISPR 관련 뉴클레아제를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다.
이때, 상기 (a)는 타겟 부위에 따라 2 이상 존재할 수 있고, (b)는 동종 또는 2종 이상의 뉴클레아제를 사용할 수 있다.
구현예에서, 핵산은 Y 염색체 또는 SRY 유전자의 기능 또는 발현을 감소시키거나, 줄이거나 또는 억제하기 위해 넉다운 표적 위치에 충분히 가까운 효소적으로 불활성인 에디터단백질 또는 이의 융합단백질(예를 들어, 전사 리프레서 도메인 융합)을 표적화하도록 구성할 수 있다.
TALEN 시스템
TALEN은 전사 활성인자-유사(TAL) 이펙터 결합 도메인 및 뉴클레아제 도메인을 포함하는 단백질을 의미하며, 그 자체로 기능성인 모노머 TALEN 뿐만 아니라, 다른 모노머 TALEN과의 다이머화를 요구하는 다른 것들을 포함한다.
TALEN은 동일한 부위에서 DNA를 제거하기 위해 함께 작업하도록 조작된 한 TALEN 또는 한쌍의 TALEN들을 의미하도록 사용된다. 함께 작업하는 TALEN은 왼쪽-TALEN 및 오른쪽-TALEN으로 언급될 수 있으며, DNA 또는 TALEN-쌍의 잘쓰는 손(handedness)을 참조한다.
TALEN은 2개의 주요 진핵 DNA 수선 경로들, 비-상동 단부 결합(NHEJ) 및 상동직통 수선에 의해, 불멸의 사람 세포들의 유전자 조작을 유도한다.
일부 구현예에서, TAL 이펙터는 특정 뉴클레오티드 서열에 대하여 다른 단백질 도메인들(예를 들면, 비-뉴클레아제 단백질 도메인)을 타겟팅하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, TAL 이펙터는 제한없이, DNA 20 상호작용 효소(예를 들면, 메틸라제, 토포아이소머라제, 인테그라아제, 트란스포사제 또는 리가아제), 전사 활성인자 또는 억제인자, 또는 히스톤과 같은 다른 단백질들과 상호작용하거나 변형시키는 단백질로부터의 단백질 도메인에 결합될 수 있다. 상기 TAL 이펙터 융합의 적용예는 예를 들면 후생적 조절요소들을 생산 또는 변형시키는 것, DNA내 부위-특이적 삽입, 결실, 또는 수선을 하는 것, 유전자 발현을 조절하는 것, 및 크로마틴 구조를 변경시키는 것을 포함한다.
아연 핑거 뉴클레아제 시스템
아연-핑거 뉴클레아제(ZFN)는 아연 핑거 DNA-결합 도메인을 융합시킴으로써 생성된 인공 제한효소이다. 아연 핑거 도메인은 원하는 DNA 서열들을 타겟팅하기 위해 조작될 수 있으며, 이것은 아연-핑거 뉴클레아제가 복합 게놈내 특별한 서열들을 타겟팅할 수 있게 한다. 내인성 DNA 수선 기계의 잇점을 취하여, 상기 시약들은 고등 유기체의 게놈을 변형시키기 위해 사용될 수 있다. ZFN은 유전자들을 불활성화시키는 방법에 사용될 수 있다.
아연 핑거 DNA-결합 도메인은 약 30개의 아미노산들을 가지며, 안정한 구조로 접힌다. 각 핑거는 DNA 기질내에서 1차적으로 삼중체에 결합한다. 중요한 위치에서의 아미노산 잔기들은 DNA 부위와의 서열-특이적 상호작용의 대부분에 기여한다. 이들 아미노산들은 필수 구조를 보존하기 위해 남은 아미노산들을 유지하면서 변화될 수 있다.
더 긴 DNA 서열들에 결합하는 것은 여러 도메인들을 동시에 결합시킴으로써 이루어진다. 비-특이적 FokI 분열 도메인(N), 전사활성인자 도메인(A), 전사 억제인자 도메인(R) 및 메틸라아제(M)와 같은 다른 작용기들은 ZFP에 융합되어, 각각 ZFN, 아연 핑거 전사 활성인자(ZFA), 아연 핑거 전사 억제인자(ZFR), 및 아연 핑거 메틸라아제(ZFM)를 형성할 수 있다.
유전자조작 동물을 생산하기 위해 아연 핑거 및 아연 핑거 뉴클레아제를 사용하기 위한 물질 및 방법들은 예를 들면, 미국특허 제8,106,255호, 미국특허 제2012/0192298호, 미국특허 2011/0023159, 및 미국특허 제2011/0281306호에 개시되어 있다.
유전자 조작용 조성물
본 발명의 일 구현예에서, 생식조절인자의 유전적 조작 또는 변형용 조성물 및 이의 이용방법을 제공한다.
일 구체예에서, 생식조절인자의 유전적 조작 또는 변형용 조성물은 상기 RNA-가이드 엔도뉴클레아제 (RNA-Guided Endonuclease; RGEN) 시스템의 구성성분을 포함할 수 있다.
예를 들어, 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 핵산 분자와 RNA-가이드 엔도뉴클레아제 (RNA-Guided Endonuclease; RGEN) 또는 이를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 유전체 교정용 조성물을 제공한다.
예를 들어, (i) 가이드 RNA 또는 상기 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 분자, 또는 (ii) 상기 가이드 RNA 또는 상기 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 분자 및 RNA-가이드 엔도뉴클레아제 또는 상기 RNA-가이드 엔도뉴클레아제를 암호화하는 유전자를 포함하는, 생식조절인자 불활성화 조성물을 제공한다.
예를 들어, (i) 가이드 RNA 또는 상기 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 분자,
또는 (ii) 상기 가이드 RNA 또는 상기 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 분자 및 RNA-가이드 엔도뉴클레아제 또는 상기 RNA-가이드 엔도뉴클레아제를 암호화하는 유전자를 포함하는, 암컷 개체의 선택적 생산용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 발현 카세트 형태로 제공될 수 있다.
[비인간 숙주배아 및 동물]
본 발명의 일 구체예에서, 불활성화된 또는 제거된 생식조절인자를 가진 비-인간 숙주 배아를 제공할 수 있다.
일 구체예에서, 비-인간 숙주 배아는 일반적으로 2-세포 단계, 4-세포 단계, 8-세포 단계, 16-세포 단계, 32-세포 단계, 64-세포 단계, 상실배, 또는 배반포를 포함하는 배아일 수 있다.
일 구체예에서, 비-인간 숙주 배아는 상실배 이전 단계, 상실배 단계, 조밀하지 않은 상실배 단계, 조밀한 상실배 단계 및 배반포 단계 배아로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 발생학적 나이 단계 E1, E1.5, E2, E2.5, E3 및 E3.5로부터 선택될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 유전적 조작 또는 변형용 조성물을, 2-세포 단계, 4-세포 단계, 8-세포 단계, 16-세포 단계, 32-세포 단계, 64-세포 단계, 상실배, 또는 배반포인 비-인간 숙주 배아 속에 주입될 수 있다.
일 구체예에서, 생식 관련 유전자는 Y 염색체 상에 위치되며, 1이상의 생식 관련 유전자의 파괴를 가진 비-인간 동물 배아를 생산할 수 있다.
일 구체예에서, SRY 유전자의 1 이상의 부위의 파괴를 가진 비-인간 동물 배아를 생산할 수 있다.
일 구체예에서, 생식 계열에 생식 관련 유전자의 파괴를 포함하는 비-인간 배아를 수득할 수 있고, 이 때, 생식 관련 유전자의 두 대립 형질 유전자는 파괴되고 생식(예를 들어, 정자형성 또는 정자기능)이 억제될 수 있다.
일 구체예에서, Y 염색체가 제거된, 암컷 표현형을 가지는 동물로 발달될 배아를 제조할 수 있다.
일 구체예에서, SRY 유전자가 넉아웃 또는 넉다운된, 암컷 표현형을 가지는 동물로 발달될 배아를 제조할 수 있다.
키메릭 동물
본 발명의 일 구현예에서, 암컷 표현형을 가지는 동물을 생산하기 위해, 상기 배아의 발달에 적합한 조건하에서 배아를 임신시킬 수 있다.
비-인간 배아는 당업계에 공지된 가임신 암컷 속에 이식될 수 있다.
예를 들어, 이식된 비-인간 배아로부터 발달된 키메릭 비-인간 동물은 파괴된 생식 유전자를 가진 내인성 생식 세포 또는 배우자를 포함할 수 있다.
상기 키메릭 비-인간 동물은 교배하여 새끼를 생산할 때, 손상되거나 억제된 생식 능력을 가질 것이어서 새끼를 생산하지 않거나 매우 적은 새끼를 생산할 수 있다.
표준 분석 도구는 정자 또는 새끼의 정체를 테스트하는데 사용될 수 있다. 방법은 시퀀싱, 서든 블롯 분석, SNP 분석, PCR 기술뿐만 아니라 단백질 마커, 코트 컬러 마커, 아이소자임 분석(예를 들어, GPI, 글루코오스 인산염 아이소머라제 아이소자임 분석) 및 당업계에 주지된 표준 방법을 사용하여 줄기 세포에 존재한느 임의의 리포터 유전자 또는 형질전환유전자의 탐지를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일 구체예에서, 유전자조작 동물의 생산방법을 포함하며,
상기 방법은 배아 또는 세포를 타겟팅 뉴클레아제(예를 들면, 메가뉴클레아제, 아연 핑거, TALEN, 안내 RNA, 재조합효소 융합 분자들)를 인코딩하는 mRNA에 노출시키는 단계,
대리모내 세포를 클로닝하거나, 대리모내 배아들을 이식하는 단계를 포함하며, 상기 타겟팅 뉴클레아제는 배아 또는 세포내 표적 염색체 부위에 특이적으로 결합하여 세포 염색체에 변화를 일으키며, 대리모는 표적 염색체 부위에서 유전자조작된 동물을 임신시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예는 상기 설명한 세포 및 동물들을 제공한다.
이들은 비-인간 척추동물, 비-인간 영장류, 소, 말, 돼지, 양, 닭, 조류, 토끼, 염소, 개, 고양이 및 어류로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다. 가축이라는 용어는 식품 또는 생물학적 물질용 물품으로 사육되는 가축동물을 의미한다.
[제조 방법]
본 발명의 일 구체예로서, 유전적으로 조작된 생식조절 관련 인자 및 이를 포함하는 동물을 제조하는 방법을 제공한다.
일 구체예는
RNA-가이드 엔도뉴클레아제 (RNA-Guided Endonuclease; RGEN)에 대한 인식 부위를 포함하는 Y 염색체 상의 표적 게놈 유전자좌를 포함하는 세포 또는 배아에,
(a) 상기 표적 게놈 유전자좌 부위와 상보적으로 결합할 수 있는 가이드 RNA; 및 (b)RNA-가이드 엔도뉴클레아제 (RNA-Guided Endonuclease; RGEN)을
접촉시키는 단계를 포함하는, 표적 핵산, 예를 들어 Y 염색체를 구성하는 핵산 또는 SRY 유전자의 핵산 서열이 변경된 세포 또는 배아를 제조하는 방법일 수 있다.
상기 접촉 방법은 상기 가이드 핵산과 에디터 단백질을 통상적인 방법으로 직접 세포 또는 배아에 도입하는 것일 수 있다.
상기 접촉 방법은 상기 가이드 핵산과 에디터 단백질을 암호화하는 각 DNA 분자를 하나의 벡터 또는 각각 별개의 벡터에 포함된 상태로 세포 또는 배아에 도입하는 것일 수 있다.
상기 접촉 방법은 벡터를 이용하여 이루어질 수 있다. 상기 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다. 상기 바이러스 벡터는 예를 들어, 레트로바이러스, 아데노바이러스계 벡터일 수 있다.
상기 방법은 전기천공법 (electroporation), 리포좀, 바이러스벡터, 나노파티클(nanoparticles) 뿐만 아니라 PTD (Protein translocation domain) 융합 단백질 방법 등 당업계에 공지된 다양한 방법들을 사용하여 세포 또는 배아 내로 전달될 수 있다.
상기 방법은 상이한 핵산서열을 타겟하는 gRNA를 세포 내로 도입하는 단계, 또는 이러한 gRNA를 암호화하는 핵산을 세포 또는 배아 내로 도입하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 방법은 동물 생체 내 또는 생체 외, 예컨대 동물의 체외에서 진행되는 것일 수 있다.
예를 들어, 접촉시키는 단계는 생체 외에서 수행될 수 있고, 접촉된 세포 또는 배아는 접촉시키는 단계 후에 대상체의 신체로 복귀될 수 있다.
상기 방법에 사용되는 세포 또는 배아는, 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류를 포함하는 포유동물에서 유래한 세포 또는 배아일 수 있다.
상기 방법은 세포 또는 배아에 적합한 배지, 예컨대, 혈청 (예컨대, 소 태아 또는 인간 혈청), 인터루킨-2 (IL-2), 인슐린, IFNgammaI1L-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-15, TGF-beta, 및 TNF-alpha 또는 당업자에게 알려진 세포 또는 배아들의 성장을 위한 다른 첨가제들을 포함하는, 증식 및 생존능력(viability)에 필요한 인자들을 포함할 수 있는, 적절한 배지 (예컨대, Minimal Essential Media 또는 RPMI Media 1640 또는, X-vivo-10, -15, -20, (Lonza))에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[용도]
본 발명의 일 구체예는 유전적으로 조작된 생식조절인자 또는 이에 의해 조작된 동물, 예를 들어 가축 동물의 암컷 개체를 선택적으로 생산하는 용도를 제공한다.
비-인간 척추동물, 비-인간 영장류, 소, 말, 돼지, 양, 닭, 조류, 토끼, 염소, 개, 고양이 및 어류로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다.
효율적인 수컷에서 암컷으로의 성전환 방법은 국내 축산업에 있어서 가치가 있다. 예를 들어, 암송아지는 수컷보다 낙농 축산업에 있어서 훨씬 더 가치가 있다. 가금류에 대해서도 마찬가지이다. 번식 목적을 위해서도 많은 암컷을 낳는 것이 바람직하다. 따라서, 본 명세서에 제공된 다양한 방법은 다양한 상업상 중요한 육종 산업에서의 용도가 발견된다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어 자명할 것이다.
유전적 불임 동물들의 유용성 및 그들을 생산하기 위한 용이한 기술들은 유전자조작 동물들 및 종래의 가축의 생산하기 위한 새로운 방법 및 새로운 기회들을 제공한다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어 자명할 것이다.
실시예 1. Cas9 Ribonucleoprotein(RNP) 복합물 준비
1.1 Cas9 단백질
Recombinant Cas9 Protein(Streptococcus pyogenes)의 경우 ToolGen에서 구매하여 사용하였다.
spCas9의 아미노산 서열은 다음과 같다:
MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAE 60
ATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFG 180
NIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSD 240
VDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGN 300
LIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAI 360
LLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYA 420
GYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELH 480
AILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEE 540
VVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFL 600
SGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKI 660
IKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWG 720
RLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSL 780
HEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRER 840
MKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDH 900
IVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNL 960
TKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKS 1020
KLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRK 1080
MIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDF 1140
ATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVA 1200
YSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPK 1260
YSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVE 1320
QHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGA 1380
PAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGGSGPPKKKRKV 1440
YPYDVPDYA*
상기 밑줄친 서열은 HA tag 및 NLS(Nuclear Localization Signal) 서열이다.
1.2 가이드 RNA 스크리닝
CRISPR RGEN Tools (http://www.rgenome.net/) 웹사이트를 이용해 sgRNA를 선별하였다. Y 염색체를 표적하는 서열 중 한 개의 sgRNA로 동시에 가장 많은 수의 절단을 일으킬 수 있는 서열이면서 동시에 Mismatch가 최소한인 서열로 선택하였다.
실시예 2 : Embyro 내 도입
4 주령의 1 세포 단계 배아(one-cell stage embryos) C57BL/6N 암컷 마우스의 미세 주입 및 전기 천공으로, PMSG (5IU, Sigma-Aldrich) 및 hCG 호르몬 (5IU, Sigma-Aldrich)을 48 시간 간격으로 복강 내 주사함으로써 과잉 배란시켰다(superovulated).
이들 생쥐를 11 내지 16 주령의 C57BL/6N 수컷 마우스와 교배시키고 난 수관으로부터 수정된 1 세포 배아를 수집하였다.
난구 세포(Cumulus cells)를, PBS 완충액 중 0.1 % 히알루로니다제(SigmaAldrich)에 노출시킴으로써 배아에서 제거하였다. 미세주입(microinjection)을 위해, guide RNA (Cas9에 대한, 18 μg/μl) 및 재조합 Cas9 (200 NG/μl, ToolGen) 단백질의 복합체를 포함하는 용액을 DEPC-처리된 인젝션 버퍼(0.25 MM EDTA, 10 MM 트리스, pH 7.4)로 희석하고, Nikon ECLIPSE Ti 마이크로 조작기 및 FemtoJet 4i 마이크로 주입기 (Eppendorf)를 이용하여 전핵(pronuclei)에 주입하였다.
1 세포 단계 배아(one-cell stage embryos)의 전기천공을 위해, NEPA 21 electroporator (NEPA GENE Co. Ltd)의 유리 챔버를 재조합 Cas9 (10μg/100μl) 및 guide RNA (for Cas9, 50 μg/100 μl)의 복합체를 포함하는 100 μl opti - MEM (Thermo Fisher Scientific)로 채웠다.
전핵 단계의 배아(pronuclear stage embryos)를 유리 챔버에 넣고 다음과 같은 조건으로 전기천공하였다: poring pulse (voltage, 225 V; length, 1.5 ms; pulse interval,50 ms; number of pulses, 4; d. rate, 10%; polarity, +) and transfer pulse (voltage, 20V; length, 50 ms; pulse interval, 50 ms; number of pulses, 5; d. rate, 40%; polarity,+/-)
배아는 공기 중 5 % CO2로 구성된 습한 대기 중 37 ℃에서 3.5 일 동안 미네랄 오일 하에 D-글루코오스 및 페놀 레드 (Millipore)를 함유한 KSOM+AA의 미세 방울(microdrops)에서 배양되었다. 2 세포 단계 배아(Two-cell stage embryos)는 다음 날에 0.5-dpc 가짜 임신 수양모의 난관으로 옮겨졌다.
실시예 3: Indel 효율 확인
Embryo를 lysis buffer(Quick Extract DNA Extraction Solution, Epicentre)로 용해하여 DNA 분석에 사용하였다.
T7E1 assay (유전체 DNA에서 특정부분 PCR 증폭이후 T7E1 (T7 Endonuclease I)을 37도에서 20분 처리한 후 전기영동)와 targeted deep-sequencing (타겟 서열 부분을 PCR로 증폭한 이후 이를 Deep-sequencing 용 PCR barcode primer 로 재차 PCR 증폭한 후, 이를 DNA 정제kit 를 사용하여 정제한 뒤에 시퀀싱)을 통해서 특정 타겟 부위에서 SpCas9에 의한 교정으로 뉴클레오타이드 서열 변이가 얼마나 발생하였는지를 빈도수 (%)로 산출하였다.
Claims (22)
- 수컷 생식을 억제하고,
핵산서열 내 변형이 일어난 불활성화된 생식조절인자를 포함하는 비-인간 숙주 배아. - 제1항에 있어서, 상기 핵산서열 내 변형은 하나 이상의 핵산의 결실, 치환, 삽입 또는 역위를 포함하는 것을 특징으로 하는 비-인간 숙주 배아.
- 제2항에 있어서, 상기 생식조절인자는 성염색체 또는 상기 성염색체 상에 존재하는 생식조절 유전자(gametogenic gene)인 것을 특징으로 하는 비-인간 숙주 배아.
- 제3항에 있어서, 상기 성염색체는 Y 염색체인 비-인간 숙주 배아.
- 제4항에 있어서, 상기 Y 염색체는 2 이상의 부위의 핵산서열 내 변형으로 인하여 제거되거나 또는 완전히 그 기능이 소실된 것을 특징으로 하는 비-인간 숙주 배아.
- 제5항에 있어서, 상기 생식 유전자는 정자의 생식 또는 형성을 조절하는 비-인간 숙주 배아.
- 제6항에 있어서, 상기 생식 유전자는 SRY, TENR, ADAMIa, ADAM2, ADAM, 알파4, ATP2B4 유전자, CatSperl, CatSper2, CatSper3, Catsper4,CatSperbeta, CatSper감마, CatSper델타, KCNU1, DNAH8, 클라메긴(Clamegin), 콤플렉신(Complexin)-I, 서톨리(Sertoli) 세포 안드로겐 수용체, Gasz, Ral75, Cibl, Cnot7, Zmyndl5, CKs2, PIWIL4, PIWIL2, 및 Smcp로 구성된 그룹으로부터 선택된 1 이상의 유전자인 것을 특징으로 하는 비-인간 숙주 배아.
- 제6항에 있어서, 상기 생식 유전자는 SRY인 것을 특징으로 하는 비-인간 숙주 배아.
- 제1항에 있어서, 상기 핵산서열 내 변형은 뉴클레아제 제제에 의해 인위적으로 일어난 것을 특징으로 하는, 비-인간 숙주 배아.
- 제9항에 있어서, 상기 뉴클레아제 제제는,
(a) 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN);
(b) 전사 활성화 인자 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN);
(c) 메가뉴클레아제; 또는
(d) RNA-가이드 엔도뉴클레아제 (RNA-Guided Endonuclease; RGEN)
인 것을 특징으로 하는, 비-인간 숙주 배아. - 제1항에 있어서, 상기 생식조절인자는 RNA-가이드 엔도뉴클레아제에 의해 유전적으로 조작된 생식조절인자로서,
상기 생식조절인자를 구성하는 핵산서열 내 PAM(proto-spacer-adjacent Motif) 서열 중 또는 이의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 3bp 내지 25bp의 염기 서열 부위 내의
하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실 또는 삽입;
야생형 유전자와 상이한 하나 이상의 뉴클레오타이드로의 치환;
외부 유래의 하나 이상의 뉴클레오타이드 삽입
중 하나 이상의 핵산의 변형
을 포함하는 것을 특징으로 하는 비-인간 숙주 배아. - 제11항에 있어서, 상기 RNA-가이드 엔도뉴클레아제가 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 유래 Cas9 단백질이고, 상기 PAM 서열이 NGG(N은 A, T, C 또는 G임)인 것을 특징으로 하는 비-인간 숙주 배아.
- 서열번호 1 내지 XX번의 타겟 서열에 각각 상보적인 결합을 형성할 수 있는 가이드 핵산 (보완 필요) - 스크리닝한 가이드 RNA 서열
이하의 군으로부터 선택되는 1이상의 가이드 핵산:
Y 염색체 또는 SRY 유전자 핵산 서열 중 타겟 서열에 각각 상보적인 결합을 형성할 수 있는 가이드 핵산 - 제13항에 있어서, 상기 가이드 핵산은 18 내지 23 bp의 뉴클레오타이드인, gRNA 분자.
- Y 염색체를 구성하는 핵산 서열 중 1 이상의 부위에 상보적인 결합을 형성할 수 있는 가이드 핵산; 및
RNA-가이드 엔도뉴클레아제 또는 이를 암호화하는 핵산
을 포함하는 Y 염색체 제거용 조성물 - SRY 유전자를 구성하는 핵산 서열 중 1 이상의 부위에 상보적인 결합을 형성할 수 있는 가이드 핵산; 및
RNA-가이드 엔도뉴클레아제 또는 이를 암호화하는 핵산
을 포함하는 유전자 조작용 조성물 - 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는
스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질, 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophilus) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 아우레우스 (Streptococcus aureus) 유래의 Cas9 단백질, 네이세리아 메닝기디티스 (Neisseria meningitidis)유래의 Cas9 단백질, 및 Cpf1 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물 - Y 염색체 상의 표적 게놈 유전자좌를 포함하는 세포 또는 배아에,
(a) 상기 표적 게놈 유전자좌 부위와 상보적으로 결합할 수 있는 가이드 RNA; 및
(b)RNA-가이드 엔도뉴클레아제 (RNA-Guided Endonuclease; RGEN)을
접촉시키는 단계를 포함하는, Y 염색체를 구성하는 핵산 또는 SRY 유전자의 핵산 서열이 변경된 세포 또는 배아를 제조하는 방법 - 제18항에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 전기천공법 (electroporation), 리포좀, 플라스미드, 바이러스 벡터, 나노파티클(nanoparticles) 및 PTD (Protein translocation domain) 융합 단백질 방법 중 선택되는 1이상의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-연관 바이러스(AAV) 로 구성된 군에서 선택되는 1이상인 것을 특징으로 하는 방법.
- 상기 방법에 의해 수컷 생식이 억제된, 암컷 표현형을 가지는 개체를 수득하는 방법.
- 상기 개체는 비-인간 영장류, 소, 말, 돼지, 양, 닭, 조류, 토끼, 염소, 개, 고양이 및 어류로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1이상의 동물인 것을 특징으로 하는 방법
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| KR20230065551A (ko) | 2021-11-05 | 2023-05-12 | 여민지 | 시나브로 누룩 버블 에센스 |
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