KR20190021765A - Composition for removing M2 type tumor-associated macrophage including melittin - Google Patents

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KR20190021765A KR1020170106939A KR20170106939A KR20190021765A KR 20190021765 A KR20190021765 A KR 20190021765A KR 1020170106939 A KR1020170106939 A KR 1020170106939A KR 20170106939 A KR20170106939 A KR 20170106939A KR 20190021765 A KR20190021765 A KR 20190021765A
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Abstract

The present invention relates to a composition comprising melittin as an active component for removing M2-type tumor-associated macrophages (TAM). More specifically, the present invention relates to the composition exhibiting an effect of selectively inhibiting only M2-type tumor-associated macrophages among tumor-associated macrophages. The composition according to the present invention only inhibits M2-type tumor-associated macrophages without affecting M1-type tumor-associated macrophages or cancer cells, thereby exhibiting anti-cancer and metastasis inhibitory effects by blocking angiogenesis through control of microenvironment of cancer cells, while reducing side effects of existing anti-cancer effects.

Description

멜리틴을 포함하는 M2형 종양관련 대식세포 제거용 조성물{Composition for removing M2 type tumor-associated macrophage including melittin}The present invention relates to a composition for removing M2 type tumor-associated macrophages including melittin,

본 발명은 멜리틴(melittin)을 유효성분으로 포함하는 M2형 종양관련대식세포(TAM) 제거용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 본 발명의 조성물은 M1형 종양관련 대식세포 및 암세포에는 영향을 주지 않고 M2형 종양관련 대식세포만을 억제하고 암세포의 미세환경의 조절을 통해 혈관신생을 막아 기존 항암효과의 부작용을 감소시키면서 항암 및 암전이 억제효과를 나타내는 조성물에 관한 발명이다.The present invention relates to a composition for removing a type M2 tumor-associated macrophage (TAM) containing melittin as an active ingredient. More particularly, the present invention relates to a composition for removing M1 type tumor-associated macrophages and cancer cells, And inhibiting angiogenesis through regulating the microenvironment of cancer cells, thereby reducing the side effects of the conventional anticancer effect, and exhibiting the anticancer and metastasis suppressing effect.

기존의 항암치료는 암세포를 직접 공격하거나 암세포를 공격하는 체내 면역세포의 활성을 강화시키는 방향으로 연구되어 왔다. 그러나 이러한 항암제는 암세포 외의 다른 정상세포 또한 공격하여 탈모, 오심, 구토등의 많은 부작용을 가져왔고, 면역세포의 과도한 증가로 인한 부가적 반응을 초래한다. 따라서 종양세포 및 면역세포에 직접적인 영향없이 종양세포의 주변 미세환경만을 조절하여 종양세포로의 영양분 공급, 종양세포 주변의 혈관 신생등을 차단하여 항암효과를 갖는 치료제 개발에 박차를 가하고 있다. Conventional chemotherapy has been studied to enhance the activity of the body's immune cells directly attacking cancer cells or attacking cancer cells. However, these anticancer drugs also attack other normal cells other than cancer cells, resulting in many side effects such as hair loss, nausea and vomiting, and result in an additional reaction due to excessive increase of immune cells. Therefore, the present inventors have been accelerating the development of therapeutic agents having anticancer effects by controlling only the surrounding microenvironment of tumor cells without directly affecting tumor cells and immune cells, thereby blocking nutrient supply to tumor cells and angiogenesis around tumor cells.

종양 미세 환경은 악성 세포의 증식 및 생존, 혈관 신생, 전이, 비정상 적응 면역 및 호르몬 및 화학요법제에 대한 반응 감소에 기여하여 치료 목표로 크게 고려되고 있다. 많은 연구에서 종양관련 대식세포(tumor associated macrophage, TAM)가 종양 미세환경의 주요 인자이며 저산소 종양 영역에 산소와 영양소를 공급하여 종양 진행에 필수적인 혈관 신생의 중요한 조절 인자임을 입증했다. 따라서, 암 환자에서 많은 숫자의 종양관련 대식세포가 종양 주변에 존재하면 환자의 예후 및 생존률이 좋지 못한 것으로 보고되고 있다.종양 미세환경에서 종양관련 대식세포의 역할은 여전히 논쟁이 많다.Tumor microenvironment has been considered as a therapeutic goal by contributing to the proliferation and survival of malignant cells, angiogenesis, metastasis, abnormal adaptive immunity, and decreased response to hormone and chemotherapeutic agents. Many studies have demonstrated that tumor associated macrophage (TAM) is a major regulator of tumor microenvironment and that oxygen and nutrients are supplied to hypoxic tumor areas and are important regulators of angiogenesis essential for tumor progression. Thus, the large number of tumor-associated macrophages in cancer patients has been reported to be associated with poor prognosis and survival in patients with tumors. The role of tumor-associated macrophages in tumor microenvironment remains controversial.

종양관련 대식세포는 종양억제 M1 또는 종양지지 M2 대식세포의 두 가지 표현형으로 분류된다. M1-형 종양관련 대식세포는 항원을 제시하는 강력한 능력을 갖고 일반적으로 CD86 및 TNF-α를 제시한다. 대조적으로, M2형 종양관련 대식세포는 항원 제시능력이 낮고 식균 능력이 높다.Tumor-associated macrophages are classified into two phenotypes: tumor suppressor M1 or tumor-bearing M2 macrophages. M1-type tumor-associated macrophages have a potent ability to present antigens and generally present CD86 and TNF-a. In contrast, M2 type tumor-associated macrophages have low antigen presenting ability and high ability to cultivate.

M2형 대식세포는 다양한 세포 외 기질성분, 혈관 신생 및 주화성 인자를 방출함으로써 면역억제, 종양형성 및 혈관형성을 촉진하는 것으로 알려져 있다. M2형 종양관련 대식세포는 CD163, CD204, CD206, IL-10과 같은 일부 마커를 발현함으로써 M1형 종양관련 대식세포와 구별된다. 유방, 난소, 전립선, 폐암 및 피부 흑색종과 같은 대부분의 종양에서 종양 미세환경은 CSF-1, VEGF, CCL2, IL-4, IL-13, TGF-β 및 단핵 세포의 유입을 유도하고 M2와 유사한 표현형으로 분화를 유도할 수 있는 IL-10를 포함한다. 이전의 연구는 캡슐화된 클로드로네이트에 의한 대식세포의 고갈은 종양 조직에서 혈관 신생을 감소시킬 수 있음을 보여주었다. 또한, CSF-1R 및 CCR2 항체를 통한 대식세포의 침윤을 막음으로써 종양-개시 특성을 감소시키고 세포 독성 T림프구의 활성을 증가시킬 수 있다. 따라서 M2형 종양관련 대식세포가 종양미세환경에 다량으로 존재하면 종양의 성장, 분화 및 전이를 활발이 일으키므로 M2형 종양관련 대식세포를 표적으로 하면 종양성장 및 전이를 막는 잠재적 치료로 이어질 수 있다. M2 type macrophages are known to promote immunosuppression, tumor formation and angiogenesis by releasing various extracellular matrix components, angiogenesis and chemotactic factors. M2 type tumor-associated macrophages are distinguished from M1 type tumor-associated macrophages by expressing some markers such as CD163, CD204, CD206, and IL-10. In most tumors such as breast, ovary, prostate, lung cancer and skin melanoma, the tumor microenvironment induces CSF-1, VEGF, CCL2, IL-4, IL-13, TGF- Lt; RTI ID = 0.0 > IL-10 < / RTI > capable of inducing differentiation into a similar phenotype. Previous studies have shown that depletion of macrophages by encapsulated clodronate can reduce angiogenesis in tumor tissues. In addition, by inhibiting macrophage infiltration through CSF-1R and CCR2 antibodies, it is possible to decrease tumor-onset characteristics and increase the activity of cytotoxic T lymphocytes. Therefore, when a large amount of M2 type tumor-associated macrophages is present in the tumor microenvironment, tumor growth, differentiation and metastasis are activated, so targeting M2 type tumor-associated macrophages may lead to potential treatment for inhibiting tumor growth and metastasis .

멜리틴(Melittin)은 꿀벌(Apis mellifera L.)의 봉독의 주요성분이고 26개의 아미노산 잔기를 가진 양친매성 펩타이드이다. 멜리틴은 기공 형성, 융합 및 소포형성과 같은 막-섭동(perturbing) 효과를 갖는다. 멜리틴은 종양 세포에 대한 세포 독성 및 세포 성장을 억제하거나 세포 사멸 및 괴사를 유도하는 능력 때문에 종양-보유 쥐 연구에 사용되어 왔다(Cancer Immunol Immunother. 2004; 53:411-421.). 그러나, 멜리틴은 매우 비특이적인 세포용해 펩타이드이며, 모든 지질막을 공격하고 정상 세포의 막을 파괴하는 오프-타겟 효과를 유발할 수 있다. 한편, 저용량의 멜리틴은 기공 형성을 예방할 수 있다는 연구가 있다. 멜리틴은 p50 및 IκB 키나아제-α와 같은 세포 내 인자를 조절함으로써 대식세포의 염증 활성을 중화할 수 있는 능력을 갖는 것으로 보고되었다. 또한 멜리틴은 LPS와 상호작용하여 LPS에 의해 유발된 대식세포의 활성화 및 염증성 사이토카인 생성을 억제한다는 것이 밝혀졌다(Biochim Biophys Acta. 2007; 1768:3282-3291.). Melittin is a major constituent of bee venom (Apis mellifera L.) and is an amphipathic peptide with 26 amino acid residues. Melitin has membrane-perturbing effects such as pore formation, fusion and vesicle formation. Melitin has been used in tumor-bearing mouse studies because of its ability to inhibit cytotoxicity and cell growth to tumor cells or induce apoptosis and necrosis (Cancer Immunol Immunother. 2004; 53: 411-421.). However, melitin is a very nonspecific cytolytic peptide that can attack all lipid membranes and cause an off-target effect that destroys membranes of normal cells. On the other hand, low-dose melittin has been studied to prevent pore formation. Melitin has been reported to have the ability to neutralize the inflammatory activity of macrophages by modulating intracellular factors such as p50 and IκB kinase-α. It has also been shown that melittin interacts with LPS to inhibit macrophage activation and inflammatory cytokine production induced by LPS (Biochim Biophys Acta. 2007; 1768: 3282-3291).

또한 종래 멜리틴을 이용한 기술로는 멜리틴을 함유하는 동맥경화 치료용 조성물(출원번호: 10-2011-0117789), 멜리틴을 포함하는 섬유아세포-유사-활막세포의 활성을 억제하는 조성물(출원번호: 10-2011-0117788) 등이 알려져 있다.Further, as a conventional technique using melitin, a composition for treating arteriosclerosis containing melitin (Application No. 10-2011-0117789), a composition for inhibiting the activity of fibroblast-like-synovial cells containing melittin No. 10-2011-0117788).

이외에도 멜리틴을 포함하는 봉독의 면역세포와 관련된 기술로는 봉독-ＰＬＡ2를 포함하는 이상 조절 Ｔ 세포 활성 저하 관련 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물(등록번호: 10-149167)이 알려져 있으나, 이는 봉독의 주요성분 중 멜리틴이 아닌 PLA2 성분과 면역세포와의 관련성에 대해 기술하고 있을 뿐이다. 또한 봉독 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈관신생 관련 질환, 폐암 도는 통증의 예방 및 치료용 조성물(등록번호: 10-1146718)이 알려져 봉독을 암과 같은 질환의 치료에 사용할 수 있음이 알려져 있으나, 그 자세한 기전은 알려져 있지 않다.In addition, there is known a pharmaceutical composition (registration number: 10-149167) for treatment or prevention of a disease associated with abnormal control of T cell activity including bee venom-PLA2 as a technique related to immune cells of bee venom including melitin, Among the major components of bee venom, it describes only the relationship between immune cells and non-melitin PLA2 components. In addition, it is known that bee venom can be used for the treatment of diseases such as cancer, in which an angiogenesis-related disease containing bee venom extract as an active ingredient, a composition for preventing and treating lung cancer or pain (registration number: 10-1146718) The exact mechanism is unknown.

따라서, 멜리틴의 종양의 미세환경에서의 대식세포 활성의 조절에 관한 역할은 아직 알려지지 않았다. 따라서 본 발명자들은 멜리틴이 루이스 폐암종(LLC, Lewis lung carcinoma) 마우스 모델에서 M1형 종양관련 대식세포인 CD86+ 종양관련 대식세포 및 암세포에는 영향을 주지 않고 M2형 종양관련 대식세포인 CD206+ 종양관련 대식세포만을 억제하는 것을 확인함으로써 기존 항암제로 인한 부작용을 현저히 감소된 본 발명을 완성하였다.Thus, the role of melittin on the regulation of macrophage activity in the microenvironment of tumors remains unknown. Therefore, the present inventors have found that melitin does not affect CD86 + tumor macrophages and cancer cells, which are M1 type tumor-associated macrophages, in a mouse model of Lewis lung carcinoma (LLC), and that M2 type tumor-associated macrophages CD206 + Confirming that only the relevant macrophages are inhibited, thereby completing the present invention in which adverse effects due to existing anticancer drugs are significantly reduced.

본 발명의 목적은 멜리틴을 유효성분으로 포함하는 종양관련 대식세포(TAM, tumor associated macrophage) 제거용 조성물을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a composition for removing tumor associated macrophage (TAM) comprising melitin as an active ingredient.

본 발명의 다른 목적은 멜리틴 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 종양관련 대식세포 매개 질환의 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the treatment of tumor-associated macrophage-mediated diseases comprising melitin or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.

본 발명의 또 다른 목적은 멜리틴을 유효성분으로 포함하고 시험관내에서 종양관련 대식세포를 제거하는 것인, 종양관련 대식세포 제거 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for removing tumor-associated macrophages, which comprises melitin as an active ingredient and eliminates tumor-associated macrophages in vitro.

상기 과제를 해결하기 위해 본 발명은 하나의 양태로서, 본 발명은 멜리틴을 유효성분으로 포함하는 종양관련 대식세포, 특히 M2형 종양관련 대식세포를 선택적으로 제거하는 제거용 조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 양태로서, 멜리틴 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 종양관련 대식세포 매개 질환의 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 또 다른 양태로서, 멜리틴을 유효성분으로 포함하고 시험관내에서 종양관련 대식세포를 제거하는 것인, 종양관련 대식세포 제거 방법을 제공한다.In order to solve the above-mentioned problems, the present invention provides, as one embodiment, a composition for removing tumor-associated macrophages, in particular, a type M2 tumor-associated macrophage comprising melitin as an active ingredient. In another aspect of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition for treating tumor-associated macrophage-mediated diseases, comprising melitin or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. As another embodiment of the present invention, there is provided a method for removing tumor-associated macrophages, comprising melitin as an active ingredient and removing tumor-associated macrophages in vitro.

이하에서는, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

한편, 본원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없다.On the other hand, each description and embodiment disclosed herein can be applied to each other description and embodiment. That is, all combinations of the various elements disclosed herein are within the scope of the present invention. Further, the scope of the present invention can not be said to be limited by the following detailed description.

또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다. In addition, those of ordinary skill in the art will recognize, or be able to ascertain using no more than routine experimentation, many equivalents to the specific embodiments of the invention described in this application. Further, such equivalents are intended to be included in the present invention.

상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 조성물은 멜리틴이 M1형 종양관련 대식세포 및 암세포에는 영향을 주지 않고 M2형 종양관련 대식세포만을 선텍적으로 억제할 수 있다. 즉, M1형 표현형 마커에는 영향을 주지 않고 M2형 표현형 마커의 유전자 및 단백질 발현만을 억제하여, M1형 종양관련 대식세포 대비 M2형 종양관련 대식세포의 비율(M1/M2)을 높일 수 있다. 또한 본 발명은 암세포의 미세환경의 조절을 통해 혈관신생을 막을 수 있어 기존 항암효과의 부작용을 감소시키면서 항암 및 암전이 억제효과를 나타내는 종양관련 대식세포 억제용 조성물을 제공할 수 있다.본원에 사용되는 용어 "멜리틴(melittin)"은 봉독의 주요성분을 구성하는 펩타이드이다. 상기 본원에 사용되는 용어 "봉독(bee venom; BV)"은 꿀벌(Apis mellifera)의 복부에서 생성되는 산성 및 염기성 분비물의 혼합물로서 무색의 쓴 액체형태를 띠며, 그 주된 성분은 펩타이드인 멜리틴(melittin), 아파민(apamin), 및 비만세포 탈과립화(mast cell degranulating; MCD) 펩타이드 및 효소인 포스포리파아제 A2(phospholipase A2; PLA2) 등이며, 이외 여러 가지 미량의 성분을 포함한다. 따라서 본발명의 멜리틴은 꿀벌(Apis mellifera)의 봉독에서 분리되는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.In order to solve the above problems, the composition of the present invention is capable of sunthemically inhibiting only M2 type tumor-associated macrophages without affecting M1 type tumor-associated macrophages and cancer cells. That is, it is possible to increase the ratio (M1 / M2) of the M2 type tumor-associated macrophages to the M1 type tumor-associated macrophages by inhibiting the gene and protein expression of the M2 type phenotype marker without affecting the M1 type phenotype marker. Also, the present invention can provide a composition for inhibiting tumor-associated macrophages that can inhibit angiogenesis through regulation of the microenvironment of cancer cells, thereby reducing side effects of the conventional anticancer effects and exhibiting anticancer and metastasis suppressing effects. The term " melittin " is a peptide that constitutes a major component of bee venom. As used herein, the term "bee venom (BV)" is a mixture of acidic and basic secretions produced in the abdomen of a bee (Apis mellifera), which is in the form of a colorless bitter liquid, the main component of which is melittin melittin, apamin, and mast cell degranulating (MCD) peptides and phospholipase A2 (phospholipase A2) (PLA2), and various other minor components. Thus, the melitin of the present invention may be isolated from bee venom of the bee (Apis mellifera), but is not limited thereto.

본원에 사용되는 용어 "제거"는 해당 세포를 사멸시키는 것을 의미하며 그 범위에 있어서 완전히 없애는 것 외에 일부만을 없애는 정도도 포함한다.As used herein, the term " ablating " means killing a cell of interest, and includes not only eliminating it in its entirety, but also removing some of it.

본원에 사용되는 용어 "종양관련 대식세포(TAM, Tumor associated tumor)는 암의 성장, 전이 등 전반적인 종양 미세환경과 관련하여 중요한 역할을 담당하는 대식세포로써, 종양 주변에 존재하는 종양관련 대식세포는 종양 세포의 성장, 전이와 밀접하게 관련이 되어 있다. 종양관련 대식세포는 종양억제 M1 또는 종양지지 M2 대식세포의 두 가지 표현형으로 분류된다. M2형 종양관련 대식세포는 암의 성장을 촉진하는 IL-10, TGFβ 및 CCL18과 같은 사이토카인을 생성하고 표면 수용체를 통해 T 세포, NK 세포의 항종양 활성을 억제하는 기능을 한다. 이러한 종양관련 대식세포는 골수(bone marrow). 난황낭(Yolk sac) 또는 골수외조혈(extramedullary hematopoiesis)중 특히 바장에서 발생한 단핵구 및 대식세포에서 분화된 것일 수 있으며, 바람작히게는 골수(bone marrow)에서 분리되는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.As used herein, the term "tumor associated tumor (TAM)" is a macrophage that plays an important role in relation to the overall tumor microenvironment such as the growth and metastasis of cancer, and tumor-associated macrophages present around the tumor Tumor-associated macrophages are classified into two phenotypes: tumor-suppressed M1 or tumor-bearing M2 macrophages, and M2-type tumor-associated macrophages are ILs that promote cancer growth -10, TGFβ, and CCL18, and inhibits the antitumor activity of T cells and NK cells through surface receptors.The tumor-associated macrophages include bone marrow, yolk sac, Or extramedullary hematopoiesis, especially of mononuclear cells and macrophages originating from the pancreas, and those that separate from the bone marrow But it may not be limited.

본 발명의 일 실시예에서, 멜리틴은 종양세포의 세포주기에는 영향을 주지 않으며(실시예 4-2), 멜리틴의 종양성장 억제 효과가 종양관련 대식세포와 밀접한 연관이 있음을 밝혀냈다(실시예 6-2). 본 발명의 또 다른 실시예에서는, M2형 종양관련 대식세포에 선택적으로 결합하여 이를 억제하며(실시예 6-2) M1형 종양관련 대식세포/M2형 종양관련 대식세포의 비율을 낮추는 효과를 확인하였다(실시예 7). 따라서 멜리틴은 종양세포 및 다른 면역세포에는 영향을 주지 않고 M2형 종양관련 대식세포에만 선택적으로 결합하여 종양성장 및 전이를 억제함을 확인할 수 있었다.In one embodiment of the present invention, melitin does not affect the cell cycle of tumor cells (Example 4-2), and the inhibitory effect of melitin on tumor growth is closely related to tumor-associated macrophages Example 6-2). In another embodiment of the present invention, the effect of selectively binding to and inhibiting M2 type tumor-associated macrophages is confirmed (Example 6-2), and the effect of lowering the proportion of M1 type tumor-associated macrophages / M2 type tumor-associated macrophages (Example 7). Therefore, it was confirmed that melitin selectively inhibits tumor growth and metastasis by selectively binding to M2 type tumor-associated macrophages without affecting tumor cells and other immune cells.

본원에 사용되는 용어 "VEGF(vascular endothelial growth factor)"는 혈관형성(vasculogenesis)와 혈관신생(angiogenesis)을 자극하는 신호 단백질로서 혈관내에서 산소부족이 초래될 때 이것을 보충하는 시스템의 한 부분이다. 이 인자의 주기능은 태아발생기시 혈관을 만들고, 손상이 생긴 혈관을 대체할 새로운 혈관을 만드는 것인데 이인자가 과도하게 발현되면 유방암, 외종양 및 난소암 등을 유발하는 것으로 보고된다.As used herein, the term " vascular endothelial growth factor " (VEGF) is a signaling protein that stimulates vasculogenesis and angiogenesis, and is part of a system that replenishes it when oxygen deficiency occurs in the blood vessels. The main function of this factor is to make blood vessels at the time of fetal development and to make new blood vessels to replace the damaged blood vessels. Excessive expression of the infertility causes breast cancer, external tumor and ovarian cancer.

본원에 사용되는 용어"Mrc1/CD205" 는 Mrc1(mannose receptor C 1)에 CD205항체가 결합한 형태이다. 따라서 상기 본원에 사용되는 용어 "Mrc1"은 만노오스 수용체(mannose receptor)의 일종으로 막관통형 세포내섭취 수용체로, 단량체에 존재하여 세포외에는 8개의 C형 렉틴영역의 반복구조를 갖는다. 만노오스 수용체는 주로 성숙한 대식세포에 존재하며 Mrc1의 경우 미생물의 당을 인지하여 식세포작용을 매개한다. 이러한 만노오스 수용체는 공통되는 세포외 도메인 구조를 갖으나 독특한 리간드 결합 성질 및 세포 타입 발현에 있어서 종류가 구분된다.As used herein, the term " Mrc1 / CD205 " is a form in which CD205 antibody binds to Mrc1 (mannose receptor C 1). Thus, the term " Mrc1 " used herein refers to a mannose receptor, a transmembrane intracellular receptor, present in monomers and having a repetitive structure of eight C-type lectin domains outside the cell. The mannose receptor is mainly present in mature macrophages and Mrc1 mediates phagocytosis by recognizing the sugar of the microorganism. These mannose receptors have a common extracellular domain structure, but they are differentiated in terms of their unique ligand binding properties and cell type expression.

본 발명의 일 실시예에서는 골수-유래 대식세포에서 멜리틴이 상기 VEGF 및 Mrc1/CD206와 같은 M2 유전자 발현을 감소 시키고 루이스 폐암종세포에서 Vegf 및 flt1/VEGFR의 M1 유전자 발현은 변화시키지 않으므로 M2 유전자만을 선택적으로 감소시킬 수 있으며 잠재적인 항-혈관생성 효과를 갖는다는 것을 확인하였다. 또한 멜리틴의 처리가 ROS 생산 및 식균 작용과 같은 대식세포의 기능적 특성을 억제하지 않는다는 것을 확인할 수 있었다(실시예 8-6).In one embodiment of the present invention, melittin in the bone marrow-derived macrophages reduces M2 gene expression, such as VEGF and Mrc1 / CD206, and does not alter the expression of the M1 gene of Vegf and flt1 / VEGFR in Lewis lung carcinoma cells, Can be selectively reduced, and has a potential anti-angiogenic effect. It was also confirmed that the treatment with melitin did not inhibit the functional properties of macrophages such as ROS production and phagocytosis (Examples 8-6).

본원에 사용되는 용어 "CD31"은 혈소판 내피세포 접착분자-1(PECAM-1)로도 알려져 있으며 조기 및 성숙한 내피세포, 혈소판 및 대부분의 백혈구 하위 집단에서 높은 수준으로 발현되는 140kDa 의 I 형 내재막 당단백질이다. 내피 세포에서의 발현은 인접한 세포들 사이의 접합부에 집중되어있다. CD31은 골수 내 대식세포/수지상세포 전구체의 주요 개체군에서도 발현된다. CD31은 혈관 신생, 혈소판 기능 및 혈전증과 같은 혈관 생물학에서 다양한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.As used herein, the term " CD31 " is also known as platelet endothelial cell adhesion molecule-1 (PECAM-1) and is a highly expressed form of early- and mature endothelial cells, platelets and most leukocyte subpopulations, It is a protein. Expression in endothelial cells is concentrated at the junction between adjacent cells. CD31 is also expressed in major populations of intramedullary macrophages / dendritic cell precursors. CD31 is known to play a variety of roles in vascular biology such as angiogenesis, platelet function, and thrombosis.

본 발명의 일 실시예에서, 멜리틴을 종양조직에 처리하는 경우 VEGF 및 CD31의 수준을 감소시키는 것을 확인하였다(실시예 9-2). 이는 조직상주 M2형 종양관련 대식세포의 개체군 감소가 혈관 신생을 억제한다는 것으로 시사한다. 따라서, 멜리틴이 종양 미세환경을 조절하여 M2형 종양관련 대식세포 수를 감소시키고, 이는 종양세포 주변의 혈관 신생을 억제하여 항암효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.In one embodiment of the present invention, it has been confirmed that when melitin is treated on tumor tissue, the levels of VEGF and CD31 are reduced (Example 9-2). This suggests that a decrease in the population of tissue-associated M2 type tumor-associated macrophages suppresses angiogenesis. Therefore, it was confirmed that melitin regulates the tumor microenvironment to decrease the number of type II macrophages related to type M2, which inhibits angiogenesis around the tumor cells, thus exhibiting anticancer effects.

본 발명의 봉독 추출물을 포함하는 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가적으로 함유할 수 있다.The composition comprising the bee venom extract of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier.

상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석,스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.Such pharmaceutically acceptable carriers are those conventionally used in the field of manufacture and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, But are not limited to, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methylcellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.

본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19thed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.본 발명의 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.The composition of the present invention may further contain lubricants, wetting agents, sweeteners, flavors, emulsifiers, suspending agents, preservatives, etc. in addition to the above components. Carriers and formulations which allow a suitable pharmaceutical is described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences (19 th ed ., 1995). The compositions of the present invention can be carried out to facilitate self having ordinary skill in the art the instant invention Depending on the method, it may be prepared in unit dose form by formulation with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient, or may be manufactured by inserting it into a multi-dose container. The formulations may be in the form of solutions, suspensions or emulsions in oils or aqueous media, or in the form of excipients, powders, granules, tablets or capsules, and may additionally contain dispersing or stabilizing agents.

본원에 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.The term " administering " as used herein means providing the subject invention with a composition of the invention in any suitable manner.

본 발명의 조성물은 비경구로 투여할 수 있고, 피하 주입 또는 피부를 통한 국소 투여(경피 투여)가 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The composition of the present invention may be administered parenterally, and subcutaneous injection or topical administration through the skin (transdermal administration) is preferable, but not limited thereto.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.본 발명의 조성물의 경구 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.1~10 mg/kg(체중)이 바람직하고, 0.5~1 mg/kg(체중)이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 추가적으로 본 발명의 조성물을 시험관 내에서 종양관련 대식세포를 제거하는 경우, 0.01 μg/ml 내지 5 μg/m가 바람직하고, 0.1 μg/ml 내지 2 μg/ml 가 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The appropriate dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on such factors as formulation method, administration method, age, body weight, sex, pathological condition, food, administration time, route of administration, excretion rate, The oral dose of the composition of the present invention is preferably 0.1 to 10 mg / kg (body weight) per day, more preferably 0.5 to 1 mg / kg (body weight), but is not limited thereto. In addition, when the composition of the present invention is used to remove tumor-associated macrophages in vitro, it is preferably 0.01 μg / ml to 5 μg / m 2, more preferably 0.1 μg / ml to 2 μg / ml, but is not limited thereto.

본원에 사용되는 용어 "개체"는 본 발명의 조성물을 투여하여 각종암 또는 염증 질환의 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간, 원숭이, 개, 염소, 돼지 또는 쥐 등 모든 동물을 의미한다. 본원에 사용되는 용어 "포스포리파아제(phospholipase A2; PLA2)"는 글리세롤을 두번째 탄소위치에서 가수분해하여 지방산을 생성하는 기능을 하는 효소로서, 인지질의 sn-2 아실 결합을 특이적으로 인식하여 가수분해 활성을 촉매하여 아라키돈산과 리소인지질(lysophospholipid)을 방출한다. PLA2는 일반적으로 박테리아, 곤충이나 뱀독뿐만 아니라 포유류의 조직에서도 발견된다.The term " individual " as used herein means any animal such as a human, a monkey, a dog, a goat, a pig or a mouse having a disease in which the symptoms of various cancerous or inflammatory diseases can be improved by administering the composition of the present invention. As used herein, the term " phospholipase A2 (PLA2) " is an enzyme that hydrolyzes glycerol at a second carbon position to produce fatty acids. The enzyme specifically recognizes the sn- Catalyzes the degradative activity to release arachidonic acid and lysophospholipids. PLA2 is commonly found in tissues of mammals as well as bacteria, insects and snakeheads.

본 발명의 일 비교예에서는, 봉독의 유효성분 중 PLA2의 M2형 종양관련 대식세포에 대한 영향을 살펴보았다(비교예 1). PLA2를 처리시 M1 마커인 TNF-α와 iNOS의 mRNA발현은 감소하고 M2 마커인 MMR(만노오즈 수용체) 및 Arg1의 발현을 증가시켜 M2형 종양관련 대식세포의 분화를 촉진함을 확인하였다. 따라서 다른 주요 구성성분인 PLA2는 봉독의 주성분 펩티드 중 하나로서 본 발명의 멜리틴과 정반대 작용을 나타내는 것을 확인하였다.In a comparative example of the present invention, the effect of PLA2 among the active ingredients of bee venom on M2 type tumor-associated macrophages was examined (Comparative Example 1). In the treatment of PLA2, mRNA expression of TNF-α and iNOS, which are M1 markers, decreased and promoted the differentiation of M2 type tumor-associated macrophages by increasing expression of M2 marker, MMR (mannose receptor) and Arg1. Therefore, it was confirmed that PLA2, which is another major constituent, is one of the main component peptides of bee venom and has the opposite action to melitin of the present invention.

본 발명에 멜리틴을 유효성분으로 포함하는 M2형 종양관련대식세포(TAM) 제거용 조성물은 암세포를 직접 죽이지 않고 M1형 종양관련 대식세포에는 영향을 주지 않고 선택적으로 M2형 종양관련 대식세포만에만 결합하여 종영세포의 혈관신생작용을 막아 M2형 종양관련 대식세포와 관련된 질환으로 폐암을 포함한 각종 암치료에 유용하다.In the present invention, a composition for removing a type M2 tumor-associated macrophage (TAM) comprising melitin as an active ingredient does not directly kill cancer cells but selectively inhibits only M2 type tumor-associated macrophages without affecting M1 type tumor-associated macrophages Is associated with M2 type tumor-associated macrophages and is useful for the treatment of various cancers including lung cancer.

도 1은 생체 내에서 멜리틴의 항암효과를 나타낸 것이다. 모든 데이터는 평균±SEM으로 나타내었다(* P <0.05, ** P <0.01). 도 1A는 종양 접종 후 5일째부터 종양-보유 쥐에게 멜리틴 펩타이드(0.5 mg/kg)를 매 3일마다(총 5회) 투여한 후, 대조군(CON)과 멜리틴 처리군(MEL)의 종양 크기를 측정 및 계산한 결과이다(N =그룹 당 5 마리의 동물).
도 1B는 멘텔-콕스(Mantel-Cox) 생존 곡선(N=그룹 당 8 마리)을 나타낸 것이다.
도 1C는 혈액을 수집하고 골수 기능에 대한 매개 변수를 분석한 혈액학적 프로파일링 결과이다.
도 1D는 종양-보유 쥐로부터의 혈액 백혈구에 있는 호중구와 림프구의 퍼센트(왼쪽)를 나타낸 결과이다. 호중구/림프구 비(N/L ratio)는 멜리틴 치료 결과 급성 세포독성이 발생했는지 여부를 확인하는데 사용하였으며(오른쪽).
도 2는 시험관내에서 종양 세포의 세포주기에 대한 멜리틴의 효과를 확인한 것이다. 결과는 평균±SEM으로 나타내었다(* P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001). 도 2A 내지 2B는 세포주기를 PI 염색법에 의해 검출하고 단일 세포를 게이팅한 후 이를 히스토그램으로 나타낸 것이다. 세포주기에 대한 3개의 복제 샘플(replicate)의 대표 수치를 나타냈으며 피크는 G1/G0, S 및 G2/M 단계에 상응한다.
도 3은 종양세포에 멜리틴으로 처리시 선택적으로 종양관련 대식세포가 감소되는 효과를 나타낸 것이다. 모든 값은 평균±SEM으로 나타내었다(** P <0.01, *** P <0.001). 도 3A는 CD4 T 세포(CD3+ CD4+ CD8-), CD8 T 세포(CD3+ CD8+ CD4-), 조절성 T 세포(TREG, CD4+ CD25+ Foxp3+), B 세포(B220), 조절성 B 세포(BREG; B220+CD19+CD25+), 수지상 세포(DC; CD45+ CD11b+ CD11c+) 및 대식세포(MAC; CD45+ F4/80+)를 검출하기 위해 종양-보유 마우스의 비장 세포를 염색하고 비장 세포에서 각 면역 세포의 비율을 유동세포 계수법으로 측정한 결과이다.
도 3B에서 왼쪽은 종양 조직의 종양관련 대식세포(TAM)를 CD11b+F4/80+로 마킹하였고 전체 생존한 게이팅된 세포에서 CD45+세포를 게이팅한 후 이를 윤곽선으로 나타낸 것이다. 오른쪽은 CD45+세포에서 CD11b+F4/80+세포의 퍼센트를 막대그래프(오른쪽)로 나타낸 결과이다.
도 3C는 비장세포의 혼합 집단에서 CD4+, CD8+ 및 CD11b+ 세포에 대한 멜리틴의 결합을 측정한 결과이다.
도 3D는 DMSO 또는 사이토칼라신 D(Cyto D)로 처리한 총 CD11b+ 세포에서 멜리틴+CD11b+세포의 퍼센트를 측정하여 공동-염색이 식균 작용과 관련이 있는지 여부를 확인한 결과이다.
도 3E는 CD11b+ 세포의 멜리틴 결합 서브집단을 게이팅 전략에 따라 F4/80+ 대식세포, CD11c+ 수지상 세포 및 Gr-1+ 호중구로 확인한 결과이다.
도 3F는 멜리틴 결합 대식세포의 서브집단을 CD86+ (M1) 및 CD206+ (M2)로 확인한 결과이다. 모든 플롯은 3개의 복제 샘플로 구성된다.
도 3G는 클로드로네이트 리포좀(Clo) 또는 비히클 리포솜(Con)을 종양 접종 3일전에 복강내 투여한 후, 4일마다 멜리틴 0.5mg/kg을 Clo(Clo + Mel)와 함께 처리하여 치료하고(N=그룹 당 3-4 마리의 동물) 이에 대한 종양 크기를 대식세포 고갈 후에 모니터링한 결과이다.
도 4는 생체 내 종양세포에서 M2형 CD260+ 종양관련 대식세포의 감소로 인한 M1/M2 비율의 향상을 나타낸 것이다. 값은 평균±SEM으로 나타내었다(** P <0.01). 도 4A-B는 종양 세포에 침투한 M1형 종양관련 대식세포를 F4/80+CD86+(상부 패널)로 마킹하고, M2형 종양관련 대식세포를 F4 /80+CD206+(하부 패널)로 마킹한 것을 나타낸 결과이다.
도 4C-D는 비장세포의 F4/80+CD86+ 및 F4/80+ CD206+대식세포를 나타낸 것이다. M1/M2 비율은 F4/80+대식세포에서 CD86+ (M1) 및 CD206+ (M2)세포의 도트 플롯에 기초하여 계산하였다. 모든 플롯은 전체 생존한 게이팅된 세포의 CD45+세포에 게이팅하였다.
도 5는 시험관 내에서 M2형 종양관련 대식세포에서 멜리틴에 의해 CD206 및 VEGF 표현이 조절되는 효과를 나타낸 것이다. 값은 평균이고 오차 막대는 SEM을 나타낸다. * P <0.05, ** P <0.01 및 *** P <0.001은 LPS 또는 IL-4 처리 CON군 및 비 처리군 사이의 유의미한 차이를 나타낸다. #P <0.05, ## P <0.01, ### P <0.001은 멜리틴 처리군과 CON군간의 유의미한 차이를 나타낸다. 데이터는 평균±SEM으로 나타내었다. 도 5A는 골수 유래 대식세포(BMDM)에서 M2 표현형 마커(Vegf, Mrc1/CD206, Il-10 및 Tgf-β) 및 M1 표현형 마커(Tnf-α)의 qPCR 결과이다. 세포를 24시간 동안 LPS 또는 IL-4로 자극하고 PBS 또는 멜리틴의 존재하에 또 다른 24시간 동안 배양하였다. 각 유전자의 접힘 증가는 자극받지 않은 군의 수준에 대해 정상화한 결과이다(비 처리로 색인됨).
도 5B는 멜리틴 처리된 종양 세포로부터의 Vegf 및 flt1/VEGFR1의 상대적 mRNA 수준을 PBS- 처리된 대조군과 비교하고, 결과를 폴드-차이(fold-difference)로 나타낸 결과이다.
도 5C는 TNF-α, IL-10 및 TGF-β 생산을 ELISA를 사용하여 골수-유래 대식세포 배양물의 상청액에서 측정한 결과이다.
도 5D-E는 VEGF 및 CD206 발현은 웨스턴 블랏분석에 의해 측정한 결과이다. β-액틴을 로딩 대조군으로 사용하였고 4-5실험의 대표적인 블롯을 나타내었다. 마킹되지 않은 데이터는 CON군과 비교할 때 유의미한(ns)차이를 나타내지 않았다.
도 6은 대식세포 기능에 대한 멜리틴의 효과를 확인한 것이다. 3개의 복제 샘플에 대한 평균±SEM을 나타내었다(* P <0.05, *** P <0.0001). 도 6A-B는 PBS(CON) 또는 멜리틴(MEL)으로 처리한 자극 받지 않은 세포 (비 처리) 또는 M1-분화된 대식세포의 세포 내 ROS 생성을 H2DCFDA 염색으로 각각 측정한 결과이다.
도 6C는 대조군과 대비하여 멜리틴 또는 사이토칼라신 D(cytoD) 처리된 골수-유래 대식세포의 상대적인 식세포 작용 지수를 내재화된 라텍스-비드 형광 강도를 통해 측정한 결과이다.
도 7은 종양 혈관신생 네트워크에 대한 멜리틴 처리의 효과를 확인한 것이다. 데이터는 평균±SEM으로 나타내었다(** 상응하는 대조군 대비 P <0.01, *** P <0.001, 총 배율, 400X. 스케일 바, 50). 도 7A는 VEGF(적색)를 파라핀 절편화된 종양에서 면역형광 염색으로 시각화한 결과이다. 핵은 DAPI(청색)로 대조 염색하였다.
도 7B는 CD31(녹색)양성 세포를 파라핀 절편화된 종양에서 면역형광 염색으로 시각화한 결과이다. 핵은 DAPI(청색)로 대조 염색하였다.
도 7C는 VEGF의 강도를 image J로 정량화한 결과이다.
도 7D는 CD31 의 강도를 image J로 정량화한 결과이다. 데이터는 평균±SEM으로 나타내었다
도 8은 봉독의 또 다른 성분인 PLA2가 M2형 대식세포의 분화를 유도하는 효과를 나타낸 것이다.Fig. 1 shows antitumor effect of melitin in vivo. All data were expressed as mean ± SEM (* P <0.05, ** P <0.01). FIG. 1A shows the results of the administration of melittin peptide (0.5 mg / kg) every 3 days (5 times in total) to tumor-bearing rats from day 5 after tumor inoculation, Tumor size was measured and calculated (N = 5 animals per group).
Figure 1B shows the Mantel-Cox survival curves (N = 8 per group).
Figure 1C is a hematological profiling result of collecting blood and analyzing parameters for bone marrow function.
Figure 1D shows the percentage (left) of neutrophils and lymphocytes in blood leukocytes from tumor-bearing mice. Neutrophil / lymphocyte ratio (N / L ratio) was used to determine whether acute cytotoxicity occurred as a result of melittin treatment (right).
Figure 2 shows the effect of melitin on the cell cycle of tumor cells in vitro. Results were expressed as mean ± SEM (* P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001). Figures 2A-2B are histograms of cell cycle after detection by PI staining and gating of single cells. Representative replicates of three replicate samples for the cell cycle were shown, with peaks corresponding to G1 / G0, S and G2 / M steps.
Figure 3 shows the effect of selectively reducing tumor-associated macrophages upon treatment with melittin in tumor cells. All values were expressed as mean ± SEM (** P <0.01, *** P <0.001). 3A is a CD4 T cells (CD3 + CD4 + CD8 -) , CD8 T cells (CD3 + CD8 + CD4 -) , regulatory T cells (TREG, CD4 + CD25 + Foxp3 +), B cells (B220), regulatable Spleen cells of tumor-bearing mice to detect B cells (BREG; B220 + CD19 + CD25 + ), dendritic cells (DC; CD45 + CD11b + CD11c + ) and macrophages (MAC; CD45 + F4 / 80 + And the ratio of each immune cell in the splenocytes was measured by flow cytometry.
In Fig. 3B, the tumor-associated macrophage (TAM) of the tumor tissue is marked with CD11b + F4 / 80 + , and the gated CD45 + cells are gated on the entire surviving gated cells and then outlined. Right side is the result shown in a graph (right) bars the percentage of CD11b + F4 / 80 + cells in CD45 + cells.
Figure 3C is the result of measuring the binding of melittin to CD4 + , CD8 + and CD11b + cells in a mixed population of spleen cells.
Figure 3D is by measuring the percentage of melittin + CD11b + cells in a total of CD11b + cells treated with DMSO or Saito collar new D (Cyto D) co-results confirming whether there is a connection with the functional dye is inoculated.
FIG. 3E shows the results of confirming the melittin-binding subpopulation of CD11b + cells by F4 / 80 + macrophages, CD11c + dendritic cells and Gr-1 + neutrophils according to the gating strategy.
Figure 3F shows the results of a subset of melittin-binding macrophages identified as CD86 + (M1) and CD206 + (M2). All plots consist of three replicate samples.
Figure 3G shows that after intraperitoneal administration of clodronate liposomes (Clo) or vehicle liposomes (Con) three days before tumor inoculation, melittin 0.5 mg / kg is treated with Clo (Clo + Mel) every 4 days (N = 3-4 animals per group) were monitored for tumor size after monitoring of macrophage depletion.
Figure 4 shows the enhancement of the M1 / M2 ratio due to the reduction of M2 type CD260 + tumor-associated macrophages in in vivo tumor cells. Values are expressed as mean ± SEM (** P <0.01). FIGS. 4A-B are graphs showing the expression of M1 type tumor-associated macrophages infiltrating tumor cells with F4 / 80 + CD86 + (upper panel) and M2 type tumor-associated macrophages with F4 / 80 + CD206 + .
Figures 4C-D show F4 / 80 + CD86 + and F4 / 80 + CD206 + macrophages of splenocytes. The M1 / M2 ratios were calculated based on the dot plots of CD86 + (M1) and CD206 + (M2) cells in F4 / 80 + macrophages. All plots were gated to CD45 + cells of whole viable gated cells.
FIG. 5 shows the effect of modulation of CD206 and VEGF expression by melitin in type M2 tumor-associated macrophages in vitro. Values are mean and error bars indicate SEM. * P <0.05, ** P <0.01 and *** P <0.001 indicate significant differences between LPS or IL-4 treated CON group and non-treated group. # P < 0.05, ## P < 0.01 and ### P < 0.001 show significant differences between the melitin treated group and the CON group. Data are presented as means ± SEM. Figure 5A shows the qPCR results of M2 phenotypic markers (Vegf, Mrc1 / CD206, Il-10 and Tgf-beta) and the M1 phenotype marker (Tnf-a) in bone marrow derived macrophages (BMDM). Cells were stimulated with LPS or IL-4 for 24 hours and incubated for another 24 hours in the presence of PBS or melitin. Increased folding of each gene is the result of normalization (not indexed) to the level of unstimulated groups.
Figure 5B compares the relative mRNA levels of Vegf and flt1 / VEGFR1 from melitin treated tumor cells with PBS-treated controls and the fold-difference results.
Figure 5C shows the results of TNF- [alpha], IL-10 and TGF- [beta] production in supernatants of bone marrow-derived macrophage cultures using ELISA.
Figures 5D-E show VEGF and CD206 expression as measured by Western blot analysis. beta -actin was used as a loading control and representative blots of 4-5 experiments were shown. Unmarked data did not show a significant (ns) difference when compared to the CON group.
Figure 6 shows the effect of melitin on macrophage function. Mean ± SEM for the three replicate samples (* P <0.05, *** P <0.0001). 6A-B are the results of measurement of intracellular ROS production of unstimulated (untreated) or M1-differentiated macrophages treated with PBS (CON) or melitin (MEL) by H2DCFDA staining, respectively.
FIG. 6C shows the relative phagocytic activity index of melitin or cytochalasin D (cytoD) -treated bone marrow-derived macrophages compared to the control group through internalization of latex-bead fluorescence intensity.
Figure 7 confirms the effect of melitin treatment on tumor angiogenesis networks. Data were expressed as mean ± SEM (** P <0.01, *** P <0.001, total magnification, 400X. Scale bar, 50 relative to the corresponding control). Figure 7A is the result of visualizing VEGF (red) in paraffin-sectioned tumor with immunofluorescent staining. The nuclei were contrasted with DAPI (blue).
Figure 7B shows the result of visualizing CD31 (green) positive cells as immunofluorescent staining in paraffin-sectioned tumors. The nuclei were contrasted with DAPI (blue).
FIG. 7C is a result of quantifying the intensity of VEGF by image J.
7D is a result of quantifying the intensity of CD31 by image J. Data are presented as means ± SEM
Fig. 8 shows the effect of PLA2, another component of bee venom, to induce the differentiation of M2 type macrophages.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the following examples are intended to illustrate the present invention, but the scope of the present invention is not limited thereto.

실시예Example 1. 실험 재료의 준비 1. Preparation of experimental material

1-1. 동물 및 세포1-1. Animals and cells

야생형 C57BL/6 마우스는 SLC Japan Bred. Co. Ltd (Shizuoka, Japan)에서 구입하였다. 본 연구는 경희대학교 동물실험윤리위원회에 의해 승인되었다. 모든 동물은 병원균이 없는 환경에서 12시간의 밝음/어두움 주기로 유지되었으며 음식과 물을 섭취할 수 있도록 하였다.Wild type C57BL / 6 mice are SLC Japan Bred. Co. Ltd. (Shizuoka, Japan). This study was approved by Kyunghee University animal experiment ethics committee. All animals were maintained in a 12-hour light / dark cycle in a pathogen-free environment, allowing food and water to be consumed.

LLC, MLE12, A549 및 H441 세포를 10% 열-불활성화 태아 소혈청(FBS, Welgene), 100 U/ml의 페니실린 및 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신(Invitrogen Life Technologies, Rockville, MD, USA)을 첨가한 배지(LLC, DMEM, MLE12, DMEM/F-12, A549 및 H441, RPMI-1640, Welgene, Gyeongsan, Korea), 에서 배양하였다. 세포가 80% 컨플루언트(confluent)가 될 때까지 2-3 일마다 배양하였다. 모든 실험에서 세포를 95% 습도 및 5% CO2로 37 ℃ 에서 배양하였다.LLC, MLE12, A549 and H441 cells were cultured in RPMI 1640 supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS, Welgene), 100 U / ml penicillin and 100 ug / ml streptomycin (Invitrogen Life Technologies, Rockville, (LLC, DMEM, MLE12, DMEM / F-12, A549 and H441, RPMI-1640, Welgene, Gyeongsan, Korea). Cells were cultured every 2-3 days until they became 80% confluent. In all experiments the cells were incubated at 37 ° C with 95% humidity and 5% CO2.

1-2. 골수 유래 대식세포 준비(1-2. Preparation of bone marrow-derived macrophages BMDMBMDM ))

마우스 골수-유래 대식세포를 생성하기 위해 이전에 기술한대로 세포를 수확하였다. 세포를 10 ng/ml 쥐 재조합 M-CSF (R & D systems, Minneapolis, MN, USA)를 포함한 RPMI-1640 완전 배양 배지에서 7일 동안 배양하였다. 세포가 M0 대식세포로 분화한 뒤, 세포를 6-웰 플레이트(1x106 세포/웰)에 도말하고 100 ng/ml LPS 또는 20 ng/ml 쥐 재조합 IL-4 (R&D 시스템)하에 밤새 배양하여 M1 또는 M2 표현형 대식세포의 분화를 유도하였다 Cells were harvested as previously described to generate mouse bone marrow-derived macrophages. Cells were cultured for 7 days in RPMI-1640 complete culture medium containing 10 ng / ml rat recombinant M-CSF (R & D systems, Minneapolis, MN, USA). After cells were differentiated into M0 macrophages, cells were plated into 6-well plates (1x10 6 cells / well) and incubated overnight with 100 ng / ml LPS or 20 ng / ml rat recombinant IL-4 (R & D system) Or M2 &lt; / RTI &gt; phenotype macrophages

실시예Example 2. 통계적 유의성 평가 방법 2. Statistical significance evaluation method

통계적 유의성은 Prism 5.01 소프트웨어(GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)를 사용하여 단일 비교를 위한 Student 's t-검정 또는 일원분산분석에 잇달아 다중 비교를 위한 Tukey의 post-hoc 검정에 의해 평가되었다.Statistical significance was assessed by Student's t-test or single-variance analysis for single comparisons using Prism 5.01 software (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) followed by Tukey's post-hoc test for multiple comparisons Respectively.

실시예Example 3.  3. 멜리틴의Melittin 종양 성장의 억제 및  Inhibition of tumor growth and 생존률Survival rate 증가-in  Increase-in vivovivo

3-1.3-1. 혈액세포Blood cell 프로파일 검사 Profile Inspection

혈액을 마취하에 마우스의 안와후방 신경총에서 수집하였다. 혈액을 EDTA와 즉시 혼합하고 제조업체 설명서에 따라 Hemavet 950 auto-sampler (Drew scientific, Waterbury, CT, USA)로 분석하였다. 백혈구, 적혈구 및 혈소판의 매개 변수를 측정하여 퍼센트로 나타내었다.Blood was collected from the orbital posterior plexus of the mouse under anesthesia. Blood was immediately mixed with EDTA and analyzed with a Hemavet 950 auto-sampler (Drew scientific, Waterbury, CT, USA) according to the manufacturer's instructions. The parameters of white blood cells, red blood cells and platelets were measured and expressed as percentages.

3-2. 실험 결과3-2. Experiment result

멜리틴의 종양성장 억제 효과를 확인하기 위해 암세포를 C57BL/6 쥐에게 피하주사하고 0.5mg/kg의 멜리틴 펩타이드 또는 PBS를 복강내 주사로 2일마다 투여하였다. 대조군의 암 성장률은 빨랐지만 멜리틴 처리군의 암 성장은 늦었다To confirm the inhibitory effect of melittin on tumor growth, cancer cells were subcutaneously injected into C57BL / 6 mice and administered with 0.5 mg / kg melittin peptide or PBS every 2 days by intraperitoneal injection. The cancer growth rate in the control group was fast, but cancer growth in the melitin treated group was delayed

투여 13일 후, 멜리틴 처리군의 암 성장은 대조군에 비해 40%정도로 현저하게 감소되었고 15일에 대략 45%정도로 억제되었다(도 1A). 게다가, 멜리틴 처리군은 Mantel-Cox분석에 따라 대조군(PBS 처리군)에 비해 현저하게 생존기간이 연장되는 효과를 확인하였다. 따라서 멜리틴은 암성장을 지연시켜 기존 세포의 생존기간을 연장시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.After 13 days of administration, cancer growth in the melitin treated group was significantly reduced by about 40% compared to the control group, and was suppressed to about 45% on the 15th day (FIG. 1A). In addition, the melitin treatment group showed remarkably prolonged survival time as compared with the control group (PBS treatment group) according to Mantel-Cox analysis. Therefore, it was confirmed that melitin can delay cancer growth and prolong the survival time of existing cells.

쥐의 몸무게는 0-18일까지 2-3일마다 측정되었다. 대조군 및 멜리틴 처리군에서 체중감소는 없었다(0일째 대조군: 22.44±0.37 및 18일째 대조군: 23.6±0.30; 0일째 멜리틴 처리군: 22.84±0.36 및 18일째 멜리틴 처리군: 24.72±0.45).Rats were weighed every 2-3 days until 0-18 days. There was no weight loss in the control and melitin treated groups (0 day control: 22.44 +/- 0.37, 18 day control: 23.6 +/- 0.30, 0 day melittin treated group: 22.84 +/- 0.36, and 18 day melittin treated group: 24.72 +/- 0.45) .

멜리틴의 골수기능에 대한 부작용을 확인하기 위해, 혈액상 프로파일링(hematological profiling)을 수행하였다. 혈액은 마취 중 안와후방의 신경총(retro-orbital plexus)를 통해 수집하였다. 0.5mg/kg 또는 1mg/kg 멜리틴 처리는 혈액학적 인자(WBC, RBC, Hgb, HCT, MCV 및 MCH)에 중요한 변화를 가져오지 않았다(도 1C). 게다가 중성구, 림프구 및 중성구-림프구 비율(N/L ratio)의 유의미한 변화를 가져오지 않아 멜리틴이 급성 세포독성 손상을 발생시키지 않음을 시사하였다(도 1D).Hematological profiling was performed to confirm the side effects of melitin on bone marrow function. Blood was collected via retro-orbital plexus during anesthesia. Treatment with 0.5 mg / kg or 1 mg / kg melittin did not cause significant changes in hematological parameters (WBC, RBC, Hgb, HCT, MCV and MCH) (FIG. Moreover, it did not lead to a significant change in neutrophil, lymphocyte and neutrophil-lymphocyte ratio (N / L ratio), suggesting that melitin does not cause acute cytotoxic damage (FIG. 1D).

실시예Example 4.  4. 멜리틴의Melittin 암세포에 대한 직접사멸효과 여부 확인-in vitro Determination of direct killing effect on cancer cells -In vitro

4-1. 세포 주기분석4-1. Cell cycle analysis

간단히 말하면, 세포를 5x105/웰의 밀도로 6-웰 플레이트에 도말하고 PBS 또는 멜리틴 0.1, 0.5, 1, 2μg/ml로 24시간 동안 배양하였다. 세포를 수집하고 PBS로 두번 세척한 후 70% 미리 냉각된 에탄올로 고정시키고 -20℃ 에서 밤새 보관하였다. 세포를 세척하고 0.1% Triton X-100 및 RNase 20 ㎍/ml를 함유하는 PBS 500 ㎕에 재현탁시켰다. 다음으로 50μg/ml의 프로피디움 요오드화물(PI)을 첨가하였다. 염색된 세포는 37℃에서 20분 동안 배양한 후 FACS Calibur 유세포분석기(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)로 검출하였다. 데이터는 Flow Jo 소프트웨어 (Treestar, Inc., San Carlos, CA, USA)에 의해 분석되었다.Briefly, cells were plated on 6-well plates at a density of 5x10 5 / well and cultured for 24 hours with PBS or melittin 0.1, 0.5, 1, 2 μg / ml. Cells were collected, washed twice with PBS, fixed with 70% precooled ethanol and stored at -20 ° C overnight. The cells were washed and resuspended in 500 [mu] l PBS containing 0.1% Triton X-100 and 20 [mu] g / ml RNase. Then 50 μg / ml propidium iodide (PI) was added. The stained cells were incubated at 37 ° C for 20 minutes and then detected with a FACS Calibur flow cytometer (Becton Dickinson, San Jose, Calif., USA). Data were analyzed by Flow Jo software (Treestar, Inc., San Carlos, Calif., USA).

4-2. 세포분리 및 유동세포 계수 분석4-2. Cell Separation and Flow Cytometric Analysis

종양을 얇은 조각으로 깎고 37℃에서 1시간 동안 예열된 DMEM(Welgene)하에 DNase I (1 U/ml; Roche, Indianapolis, trypsin-EDTA (Gibco))에서 가볍게 교반하여 조직을 해리시켰다. 조직을 기계적으로 100μm 나일론 메쉬 스트레이너에서 해리시킨 다음, 단일 세포를 40μm 나일론 메쉬 스트레이너에 통과시키고, 40μm 나일론 메쉬 스트레이너로 비장을 기계적으로 해리시켰다. RBC를 1X파밀리스(Pharmlyse) 완충액에서 5분 동안 용해시켰다.Tumors were shaved and shaken in DNase I (1 U / ml; Roche, Indianapolis, Indianapolis, trypsin-EDTA (Gibco)) under DMEM (Welgene) preheated for 1 h at 37 ° C to dissociate the tissue. The tissue was mechanically dissociated in a 100 μm nylon mesh strainer, then the single cells were passed through a 40 μm nylon mesh strainer and mechanically dissociated from the spleen with a 40 μm nylon mesh strainer. RBCs were lysed in 1X Pharmlyse buffer for 5 minutes.

세포는 형광 태그 항체로 염색되었다. 모든 데이터는 FACS Calibur 유세포분석기에 의해 검출되고 FlowJo 소프트웨어로 분석하였다. CD45-FITC, CD3-FITC, CD4-PE, CD4-FITC, CD8-APC, CD11b-APC, CD11c-PE, CD25 (CD12-FITC) -PE, CD25-APC, B220-FITC, CD19-PE, CD86-APC. Foxp3-Alexa Fluor647은 BD bioscience에서 구입하였고 F4/80-PE 및 CD206-APC는 Biolegend(San Diego, CA, USA)에서 구입하였다.Cells were stained with a fluorescent tag antibody. All data was detected by a FACS Calibur flow cytometer and analyzed by FlowJo software. (CD12-FITC) -PE, CD25-APC, B220-FITC, CD19-PE, CD86-FITC, CD3-FITC, CD4-PE, CD4-FITC, CD8-APC, CD11b-APC, CD11c- -APC. Foxp3-Alexa Fluor 647 was purchased from BD bioscience and F4 / 80-PE and CD206-APC were purchased from Biolegend (San Diego, CA, USA).

4-3. 실험결과4-3. Experiment result

PI-염색된 폐암세포는 유동세포 계수법에 의해 멜리틴이 암세포의 세포주기에 미치는 영향을 확인하였다. 각각 단계에서 퍼센트의 변화는 없었다(도 2) 이 결과는 0.1-2μg/mL의 멜리틴은 종양세포의 세포주기에 영향을 미치지 않음을 보여준다. 따라서 암세포에 대해 직접적인 사멸효과를 보이지 않음을 확인할 수 있다. The effect of melitin on the cell cycle of cancer cells was confirmed by flow cytometry in PI-stained lung cancer cells. There was no change in percent in each step (Fig. 2). The results show that 0.1-2 μg / mL of melittin does not affect the cell cycle of tumor cells. Therefore, it can be confirmed that there is no direct killing effect on cancer cells.

실시예Example 5.  5. 멜리틴Melitin 처리가 종양 미세환경의  Treatment of tumor microenvironment 대식세포수에On the number of macrophages 미치는 영향-in vivo Impact-in vivo

5-1. 종양세포 5-1. Tumor cell 챌린지challenge

종양 모델을 생성하기 위해 루이스 폐암종세포를 Matrigel matrix(Corning, NY, USA)와 혼합하였다. 수컷 C57BL/6 야생형 마우스(6-8 주령)에게 마우스 당 5x104 세포를 오른쪽 옆구리에 피하 접종하였다. 종양 주입 5일 후, 3일마다(총 5 회)에 걸쳐 재조합 멜리틴(GenScript Corporation, Piscataway, NJ, USA)을 복강 내 투여하였다. 종양 주입 3일전에 클로드로네이트 리포좀(첫번째 용량은 마우스 당 200 μl, 유지 용량은 4일마다 복강내로 100 μl)에 의한 대식세포 결핍을 실시하였다. 클로드로네이트 리포좀 과 대조군 리포좀은 FormuMax(Sunnyvale, CA, USA)에서 구입하였다. 종양 크기는 2개의 반대 직경(부피=길이×폭×폭/2)을 측정하여 2-3일마다 모니터링하였다. 종양 크기가 체중의 5%를 초과하는 경우, 마우스를 다음 실험 세트를 위해 희생시켰다. 그런 다음 종양과 비장을 수술적으로 제거하였다.Lewis lung carcinoma cells were mixed with Matrigel matrix (Corning, NY, USA) to generate tumor models. Male C57BL / 6 wild-type mice (6-8 weeks old) were inoculated subcutaneously in the right flank with 5x10 4 cells per mouse. Five days after tumor injection, recombinant melittin (GenScript Corporation, Piscataway, NJ, USA) was intraperitoneally administered every 3 days (total 5 times). Three days before tumor injection, macrophage depletion with clodronate liposomes (200 μl per mouse in the first dose and 100 μl in the abdominal cavity every 4 days) was performed. Claudeonate liposomes and control liposomes were purchased from FormuMax (Sunnyvale, CA, USA). Tumor size was monitored every two to three days by measuring two opposite diameters (volume = length x width x width / 2). If the tumor size exceeds 5% of body weight, the mice were sacrificed for the next set of experiments. The tumor and spleen were then surgically removed.

5-2. 실험결과5-2. Experiment result

멜리틴 처리로 면역세포의 수 변화가 발생하는지 시험하였다. 면역세포의 스크리닝은 암에 걸린 쥐의 비장세포로부터 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, B 세포, 수지상 세포 및 대식세포에 대해 유동세포 계수법을 실시하였다. 유동세포 계수법은 실시예 3-2와 동일한 방법으로 수행하였다.The number of immune cells was examined by melittin treatment. Immunocyte screening was performed by flow cytometry on CD4 + T cells, CD8 + T cells, B cells, dendritic cells and macrophages from spleen cells of cancer-challenged mice. The flow cell count method was performed in the same manner as in Example 3-2.

멜리틴은 오로지 CD45+F480+ 대식세포만을 현저하게 감소시켰다(대조군의 경우, 9.05±대비 멜리틴 처리군의 경우, 5.10±0.42). 조절 T 세포의 수도 조금 감소하였지만 유의마한 변화는 아니였다. 대조군과 멜리틴 처리군에서 전체 비장세포로부터 다른 면역세포의 퍼센트 변화는 없었다(도 3A). Melitin significantly reduced only CD45 + F480 + macrophages (9.05 + in contrast to 5.10 + 0.42 in the melittin treated group). The number of regulatory T cells was slightly decreased but not significant. There was no change in the percentage of other immune cells from total splenocytes in the control and melitin treated groups (Fig. 3A).

멜리틴의 종양주변 대식세포(TAM)에 대한 효과를 확인하였다. 멜리틴 처리시, CD45+ 종양 침윤 백혈구에서 CD11b+F4/80+ 대식세포의 퍼센트는 현저하게 감소하였다(대조군의 경우, 63.25±5.34 대비 멜리틴의 경우, 38.70±0.79)(도 3B). 멜리틴의 종양관련 대식세포를 조절하는 역할이 종양 성장 억제와 연관되어 있는지 확인하기 위해서 대식세포를 클로드로네이트 리포좀으로 고갈시켰다. 예상대로, 클로드로네이트에 의한 대식세포의 고갈은 대조군 대비 현저하게 종양 성장을 감소시켰다. 멜리틴을 클로드로네이트와 함께 처리시 추가적으로 종양성장을 억제하지 않았는데 이는 멜리틴의 종앙 억제 효과가 종양관련 대식세포와 밀접하게 연관되어 있음을 보여준다(도 3G). 따라서 멜리틴이 여러 면역세포(CD4+, CD8+, B세포 등) 중에서도 종양관련 대식세포에만 특이적으로 작용하고, 이들의 수를 조절하여 종양 성장 억제효과를 나타냄을 확인하였다.The effect of melittin on tumor macrophages (TAM) was confirmed. Upon treatment with melitin, the percentage of CD11b + F4 / 80 + macrophages in CD45 + tumor infiltrating leukocytes was significantly reduced (in the case of melittin versus 63.25 ± 5.34 versus 38.70 ± 0.79 in the control group, FIG. 3B). Macrophages were depleted of the macrophage into the clodronate liposomes to confirm that the role of melitin in regulating tumor-associated macrophages was associated with tumor growth inhibition. As expected, the depletion of macrophages by claudonate significantly reduced tumor growth compared to the control. Treatment of melitin with claudonate did not further inhibit tumor growth, indicating that the anti-tumor effect of melittin is closely associated with tumor-associated macrophages (Fig. 3G). Therefore, it was confirmed that melitin acts specifically on tumor - associated macrophages in several immune cells (CD4 +, CD8 +, B cells, etc.

실시예Example 6.  6. 멜리틴Melitin 펩타이드의Of peptide M2형 종양관련 대식세포에 대한 선택성 확인-in vitro Identification of selectivity for M2 type tumor-associated macrophages-in vitro

6-1. 6-1. 멜리틴Melitin 결합 연구 Bonding study

로다민-결합 멜리틴 펩타이드는 GenScript(Piscataway, NJ, USA)에서 구입하였다. 비장 세포를 0.5μg/ml의 로다민 결합 멜리틴이 들어있는 6웰 배양 플레이트에 도말하였다. 1시간 후, 세포를 수확하고 결합되지 않은 펩타이드를 2회 세척하였다. 세포를 4℃에서 1시간 동안 APC-결합된 항체로 염색하여 멜리틴이 CD4+및 CD8+ T세포 및 CD11b+ 단핵구에 결합하는 것을 확인하였다.Rhodamine-conjugated melittin peptides were purchased from GenScript (Piscataway, NJ, USA). The spleen cells were plated on a 6 well culture plate containing 0.5 [mu] g / ml rhodamine-bound melittin. After 1 hour, the cells were harvested and unbound peptides were washed twice. Cells were stained with APC-conjugated antibodies for 1 hour at 4 ° C to confirm that melittin binds to CD4 + and CD8 + T cells and CD11b + monocytes.

CD11b+세포에 멜리틴의 결합이 식세포 작용과 관련이 있는지를 확인하기 위해 37 ℃ 배양기에서 1시간 동안 10 nM 사이토카라신 D 또는 비히클(DMSO)로 비장 세포를 전처리하였다. 다음으로, 상기 세포를 로다민-결합된 펩타이드와 함께 항온 배양하고 전술 한 바와 같이 CD11b-APC 항체로 염색하였다.Splenocytes were pretreated with 10 nM cytokarasin D or vehicle (DMSO) for 1 hour at 37 ° C in an incubator to determine whether the binding of melitin to CD11b + cells was related to phagocytosis. Next, the cells were incubated with the rhodamine-bound peptide and stained with CD11b-APC antibody as described above.

비장세포, 대식세포, 수지상 세포 및 호중성구에서 CD11b+ 서브집단에 멜리틴의 결합을 관찰하기 위해, 항-마우스 F4/80-FITC, CD11c-APCcy7 및 Gr1-PEcy7(e-bioscience)으로 조사하였다. 아넥신-V를 죽은 세포를 구별하기 위해 데이터 수집에 앞서 시료에 첨가하였다. M2형 종양관련 대식세포의 M1은 CD86-PEcy7(e-bioscience) 또는 CD206-PercpCy5.5(Biolegend)로 염색되었다. 세포는 FACS Calibur 또는 FACS CantoII에서 검출되었다.Mouse F4 / 80-FITC, CD11c-APCcy7 and Gr1-PEcy7 (e-bioscience) in order to observe the binding of melitin to CD11b + subpopulations in splenocytes, macrophages, dendritic cells and neutrophils . Annexin-V was added to the samples prior to data collection to distinguish dead cells. M1 of M2 type tumor-associated macrophages was stained with CD86-PEcy7 (e-bioscience) or CD206-PercpCy5.5 (Biolegend). Cells were detected in FACS Calibur or FACS CantoII.

6-2. 실험결과6-2. Experiment result

결합 테스트는 멜리틴이 선택적으로 CD11b+대식세포에 결합할 수 있는지를 결정하기 위해 수행되었다. 비장세포는 로다민-결합된 멜리틴 펩타이드와 함께 배양하고 CD4, CD8 및 CD11b 항체로 염색하였다. 멜리틴 결합은 대략 CD11b+ 세포에서 16%로 나타났으며, CD4+ 또는 CD8+ 세포에서는 1%로 확인되었다(도 3C). CD11b+세포안에서 펩타이드의 검출이 식세포작용과 관련되어 있음을 확인하기 위해, 비장세포에 멜리틴 처리 전에 10 nM 사이토칼라신 D(Cyto D), 액틴 중합 억제제를 전처리하여 식세포작용을 억제하였다. 전체 CD11b+세포 집단에서 멜리틴+CD11b+이중 양성 세포의 양이 DMSO 대조군 및 Cyto D처리군에서 차이가 없었다. 따라서 멜리틴은 CD11b+세포에 친화성이 있으며 이 친화성은 식세포작용과는 관련이 없음을 확인할 수 있었다.Binding tests were performed to determine if melittin could selectively bind to CD11b + macrophages. Splenocytes were incubated with rhodamine-conjugated melittin peptide and stained with CD4, CD8 and CD11b antibodies. Melitin binding was approximately 16% in CD11b + cells and 1% in CD4 + or CD8 + cells (Fig. 3C). To confirm that peptide detection in CD11b + cells is associated with phagocytic action, spleen cells were pretreated with 10 nM cytochalasin D (Cyto D) and actin polymerization inhibitor prior to melittin treatment to inhibit phagocytosis. The amount of melitin + CD11b + double positive cells in the entire CD11b + cell population was not different between the DMSO control group and the CytoD treatment group. Therefore, it was confirmed that melittin had affinity for CD11b + cells and this affinity was not related to phagocytosis.

다음으로, 우리는 대식세포, DC 및 호중구에 대해 F4/80, CD11c 및 Gr-1을 각각 염색하여 CD11b+세포의 멜리틴 결합 서브집단을 조사하였다. 멜리틴은 우선적으로 대식세포에 결합(아넥신-V-CD11b+멜리틴+ 세포에서 67.70±2.96)하는 반면, DC(24.44±0.56) 및 호중성구(36.36±0.95)에 대해서는 낮은 결합을 나타냈다(도 3E). 더 나아가 우리는 멜리틴이 M2형 종양관련 대식세포에 우선적으로 결합한다는 것을 확인하였다. 멜리틴이 결합된 대식세포의 표현형을 확인하기 위해 M1형은 CD86으로 마킹하고 M2형은 CD206으로 마킹하였다. F4/80+ 세포에서 멜리틴 및 CD206 이중 양성 집단(9.15±1.05)은 멜리틴+CD86+집단(3.27±0.39)의 퍼센트 보다 현저하게 높았다(도 3F). 따라서 멜리틴은 식세포작용과는 관련없이 종양관련 대식세포에 친화성을 갖으며, 특히 M2형 종양관련 대식세포에 특이적으로 결합함을 확인할 수 있었다.Next, we examined the melittin-binding subpopulation of CD11b + cells by staining F4 / 80, CD11c, and Gr-1, respectively, for macrophages, DCs, and neutrophils. Melitin showed preferential binding to macrophages (Annexin-V-CD11b + melittin + cells 67.70 ± 2.96) while DC (24.44 ± 0.56) and acute neutrophils (36.36 ± 0.95) 3E). Furthermore, we have confirmed that melittin binds preferentially to type M2 tumor-associated macrophages. To identify the phenotype of melittin-associated macrophages, type M1 was labeled with CD86 and type M2 was labeled with CD206. The melitin and CD206 double positive population (9.15 +/- 1.05) in F4 / 80 + cells was significantly higher than the percent of melittin + CD86 + population (3.27 +/- 0.39) (Fig. 3F). Thus, melittin has an affinity for tumor-associated macrophages regardless of phagocytosis, and specifically binds specifically to M2-type tumor-associated macrophages.

실시예Example 7.  7. 멜리틴의Melittin M1/M2형 비율에 미치는 영향 Impact on M1 / M2 ratio

비록 M1형 및 M2형 종양관련 대식세포가 종양 조직내에 존재하지만, 종양형성 촉진 종양관련 대식세포는 M2형 표현형으로 여겨진다. 몇몇 연구는 M1/M2비율이 높으면 인간 암모델에서 생존률이 향상됨을 밝혔다. 비록 CD45+세포에서 F4/80+CD86+수가 증가되진 않지만, CD45+세포에서 F4/80+CD206+의 퍼센트는 대조군(19.90±1.49)로부터 멜리틴 처리군(9.53±0.63)까지 현저하게 감소하였다(도 4A 및 4B). 놀랍게도, 비장세포에서 M1 또는 M2 형 대식세포의 수준은 멜리틴 처리에 의해 변화하지 않았다(도 4C 및 도 4B). 그 결과 종양세포의 M1/M2 비율은 멜리틴 처리군에서 현저하게 증가하였다(M1/M2 = 0.65 대조군 vs. M1/M2 = 1.55 멜리틴 주사군)(도 4B, 오른 패널). 그러나 비장에서 비율(대략 3.9)은 변화하지 않고 유지되었다(도 4D, 오른 패널). 이러한 결과를 통해 멜리틴이 치료적 지표로써 특이적으로 M2형 종양관련 대식세포를 감소시키고 M1형 또는 비장에 남아있는 다른 대식세포에 영향을 주지 않으면서 상당하게 M1/M2비율을 증가시킬 수 있음을 확인할 수 있었다Although M1 and M2 tumor-associated macrophages are present in tumor tissues, tumor-associated tumor-associated macrophages are considered to be the M2 phenotype. Several studies have shown that higher M1 / M2 ratios improve survival in human cancer models. Although the CD45 + cells, F4 / 80 + CD86 + can not doejin increase, F4 / 80 +% of CD206 + in CD45 + cells was markedly reduced by from the control group (19.90 ± 1.49) melittin treated group (9.53 ± 0.63) (Figs. 4A and 4B). Surprisingly, levels of M1 or M2 type macrophages in splenocytes were not altered by melitin treatment (Fig. 4C and Fig. 4B). As a result, the M1 / M2 ratio of the tumor cells was significantly increased in the melitin treated group (M1 / M2 = 0.65 control vs. M1 / M2 = 1.55 melittin injected group) (Fig. However, the ratio in the spleen (approximately 3.9) remained unchanged (Fig. 4D, right panel). These results indicate that melittin can significantly reduce the type M2 tumor-associated macrophages as a therapeutic index and increase the M1 / M2 ratio significantly without affecting other macrophages that remain in the M1 or spleen I could see

실시예Example 8.  8. 멜리틴의Melittin M2형 종양관련 대식세포에 미치는 영향 Effects on M2 type tumor-associated macrophages

8-1. 정량 실시간 8-1. Quantitative real time PCRPCR

전체 RNA를 추출하고 멜리틴 또는 PBS로 처리한 1×106 루이스 폐암종 세포 또는 골수 유래 대식세포로부터 cDNA로 역전사시켰다. 정량적 실시간 PCR은 이전 보고서에 따라 수행되었다. 데이터는 실험 유전자에 대해 2-ΔΔσ 로 표현되고, GAPDH로 표준화되었으며, LPS 또는 IL-4 미-처리 대조군에 비해 배수 변화로서 나타내었다. 다음의 프라이머를 사용하였다: Gapdh(for: ACCCAGAAGACTGTGGATGG; rev: CACATTGGGGGTAGGAACAC), Tnf-α(for: TTCTG TCTACTGAACTTCGGGGTGATCGGTCC; rev: GTAT GAGATAGCAAATCGGCTGACGGTGTGGG), Mrc1/CD206(for: AGTGGCAGGTGGCTTATG; rev: GGTT CAGGAGTTGTTGTG), Il-10(for: ATAACTGCAC CCACTTCCCA; rev: TCATTTCCGATAAGGCTTGG), Tgf-β(for: GAAGGCAGAGTTCAGGGTCTT; rev: GGTTCCTGTCTTTGTGGTGAA), Vegf(for: GGAGA TCCTTCGAGGAGCACTT; rev: GGCGATTTAGCAG CAGATATAAGAA], Flt1/VEGFR1(for: ACATTGGTGGTGGCTGACTCTC; rev: CCTCTCCTT CGGCTGGCATC).Total RNA was extracted and reverse transcribed to cDNA from the 1 × 10 6 Lewis lung carcinoma cells or bone marrow-derived macrophages treated with melittin, or PBS. Quantitative real time PCR was performed according to the previous report. Data were expressed as 2-ΔΔσ for the experimental gene, normalized to GAPDH, and expressed as a multiple change over LPS or IL-4 untreated control. Was used the following primers: Gapdh (for: ACCCAGAAGACTGTGGATGG; rev: CACATTGGGGGTAGGAACAC), Tnf-α (for: TTCTG TCTACTGAACTTCGGGGTGATCGGTCC; rev: GTAT GAGATAGCAAATCGGCTGACGGTGTGGG), Mrc1 / CD206 (for: AGTGGCAGGTGGCTTATG; rev: GGTT CAGGAGTTGTTGTG), Il-10 (for: ATAACTGCAC CCACTTCCCA; rev: TCATTTCCGATAAGGCTTGG), Tgf-β (for: GAAGGCAGAGTTCAGGGTCTT; rev: GGTTCCTGTCTTTGTGGTGAA), Vegf (for: GGAGA TCCTTCGAGGAGCACTT; rev: GGCGATTTAGCAG CAGATATAAGAA], Flt1 / VEGFR1 (for: ACATTGGTGGTGGCTGACTCTC; rev: CCTCTCCTT CGGCTGGCATC) .

8-2. 8-2. 웨스턴Western 블랏Blat 분석 analysis

총 단백질은 멜리틴 또는 PBS 처리-골수-유래 대식세포에서 RIPA 완충액을 사용하여 추출하고 Bio-Rad분석으로 정량하였다. 20μg의 단백질을 8% SDS 트리스-글리신 겔에서 분리하고 니트로 셀룰로스 세포막(Invitrogen)으로 옮겼다. 다음 항체 및 희석 인자를 사용하였다: VEGF 염소 다클론항체 (sc-1836, 1:1000, Santa Cruz), 액틴 염소 다클론항체(sc-1616, 1:1000, Santa Cruz), 토끼 항-쥐 CD206 (MCA2235GA 1:200, AbD serotec), HRP에 접합된 항-염소 IgG(SA007, 1:1000, GenDEPOT) 및 HRP에 결합된 항-래트 IgG(405405, 1:1000, Biolegend). ECL 용액(GE healthcare)을 사용하여 단백질 밴드를 시각화하고 Image J 소프트웨어로 측정하였다. 단백질의 강도는 액틴의 강도 이상으로 표준화되었다.Total protein was extracted with melittin or PBS-treated bone marrow-derived macrophages using RIPA buffer and quantitated by Bio-Rad analysis. Twenty micrograms of protein were separated on 8% SDS tris-glycine gel and transferred to nitrocellulose membrane (Invitrogen). The following antibodies and diluents were used: VEGF goat polyclonal antibody (sc-1836, 1: 1000, Santa Cruz), actin goat polyclonal antibody (sc-1616, 1: 1000, Santa Cruz), rabbit anti- Anti-goat IgG conjugated to HRP (SA007, 1: 1000, GenDEPOT) and anti-rat IgG conjugated to HRP (405405, 1: 1000, Biolegend). Protein bands were visualized using ECL solution (GE healthcare) and measured with Image J software. The intensity of the protein was normalized above the actin intensity.

8-3. 8-3. 세포내Intracellular 활성산소( Active oxygen ROSROS ) 확인) Confirm

골수-유래 대식세포를 24-웰 플레이트에 도말하였고 멜리틴 또는 PBS로 24시간 동안 처리하였다. 세포에 5μM C2',7'-디클로로디하이드로플루오레세린 디아세테이트(H2DCFDA; 분자 프로브)를 넣고 37℃에서 30분 동안 배양하였다. H2DCFDA 함유 배지를 제거하고 세포를 예열된 PBS로 2회 세척하였다. 세포를 채취한 후, ROS 생산 수준을 유동세포 계수법을 이용하여 즉시 분석하였다.Bone marrow-derived macrophages were plated on 24-well plates and treated with melittin or PBS for 24 hours. The cells were incubated at 37 ° C for 30 minutes with 5 μM C2 ', 7'-dichlorodehydrofluorescein diacetate (H2DCFDA; molecular probe). The H2DCFDA-containing medium was removed and the cells were washed twice with pre-warmed PBS. After harvesting the cells, the level of ROS production was immediately analyzed using flow cytometry.

8-4. 식세포 작용 검정(assay)8-4. Phagocytosis assay

세포를 96-검정 웰 플레이트에 도말하고 전술 한 바와 같이 처리하였다. 세포를 라텍스 비드-FITC(Sigma-Aldrich)를 처리하기 전에 사이토칼라신 D를 포함하거나 포함하지 않은 상태로 30분 동안 전처리하였다. 2시간 배양 후 PBS로 3회 세척하여 외부 입자를 제거하였다. 내재화된 비드의 형광을 형광 플레이트 리더(Fluorskan Ascent FL)에서 485nm의 여기 및 트리판 블루로 퀸칭(quenching)한 후 527nm의 방출을 사용하여 측정하였다.Cells were plated on 96-well plate and processed as described above. Cells were pretreated with or without cytokalase D for 30 min prior to treatment with latex bead-FITC (Sigma-Aldrich). After incubation for 2 hours, external particles were removed by washing with PBS three times. The fluorescence of the internalized beads was quenched at 485 nm excitation and tree blue in a fluorescent plate reader (Fluorskan Ascent FL) and then measured using emission at 527 nm.

8-5. ELISA8-5. ELISA

배양 배지에서의 사이토카인분비는 공급자가 권장하는 절차에 따라 ELISA 키트를 사용하여 분석하였다. 쥐 IL-10, TNF-α는 BD Biosciences에서 구입하였고, TGF-β는 R&D systems에서 구입하였다. 결과는 전체 단백질 mg당 표준화된 사이토카인의 pg로 표현하였다.The cytokine secretion in the culture medium was analyzed using an ELISA kit according to the procedure recommended by the supplier. Rat IL-10 and TNF-α were purchased from BD Biosciences and TGF-β was purchased from R & D systems. Results are expressed as pg of normalized cytokine per mg of total protein.

8-6. 실험결과8-6. Experiment result

멜리틴이 대식세포 M1/M2 비율을 변화시킬 수 있는지 측정하기 위해, 정량 실시간 PCR을 수행하였다. 골수-유래 대식세포(BMDM)를 LPS 또는 IL-4 에 의해 자극시키고 멜리틴 또는 PBS하에서 배양하였다. 전제 세포 용해물 및 배양 상층액을 mRNA 및 단백질 발현으로 분석하였다. 염증유발 마커의 TNF-α의 유전자/단백질 수준은 LPS 자극에 의해 증가되지만 멜리틴 처리는 M2 관련 혈관생성촉진 마커인 VEGF, CD206, TFG-β 및 IL-10의 발현에 영향을 주지 않았고 IL-4자극 후에 IL-10은 증가하였다. 그러나 M2형 골수-유래 대식세포에서 TGF- β, IL-10 의 유전자/단백질 발현수준은 멜리틴 처리로 변하지 않았다(도 5A, 5B). 두드러지게, 멜리틴 처리-M2형 골수-유래 대식세포는 대조군에 비해 Vegf 및 Mrcl/Cd206에 대해서 상당히 감소된 mRNA 수준을 보였다(도 5A). 멜리틴에 의해 감소된 VEGF 및 CD206 단백질 발현의 수준은 웨스턴 블랏을 통해 추가적으로 확인하였다(도 5D, 5E). 다음으로, 루이스 폐암종 세포에서 Vegf 및 flt1/VFGFR의 mRNA 수준을 검사하였다. mRNA수준은 대조군 및 멜리틴 처리군에서 큰 차이가 없었다(도 5B). 이러한 결과를 통해 멜리틴이 (Mrc1/CD205 및 Vegf)와 같은 M2 유전자 발현만을 감소시키고 루이스 폐암종 세포에서 Vegf 및 flt1/VEGFR와 같은 M1 유전자 발현은 변화시키지 않으므로 M2 유전자 발현 감소를 통해 잠재적인 항-혈관생성 효과를 갖는다는 것을 확인할 수 있었다.Quantitative real time PCR was performed to determine if melittin can alter the macrophage M1 / M2 ratio. Bone marrow-derived macrophages (BMDM) were stimulated with LPS or IL-4 and cultured under melittin or PBS. Total cell lysates and culture supernatants were analyzed by mRNA and protein expression. Although the gene / protein level of TNF-α in inflammatory markers is increased by LPS stimulation, melittin treatment did not affect expression of VEGF, CD206, TFG-β and IL-10, which are M2-related angiogenesis promoting markers, IL-10 increased after 4 stimulation. However, the gene / protein expression levels of TGF-? And IL-10 in M2 type bone marrow-derived macrophages did not change to melitin treatment (Fig. 5A, 5B). Remarkably, melittin-treated M2 type bone marrow-derived macrophages showed significantly reduced mRNA levels for Vegf and Mrcl / Cd206 compared to the control (Fig. 5A). Levels of VEGF and CD206 protein expression reduced by melittin were further confirmed by Western blot (Fig. 5D, 5E). Next, mRNA levels of Vegf and flt1 / VFGFR were examined in Lewis lung carcinoma cells. mRNA levels were not significantly different in the control and melitin treated groups (Fig. 5B). These results suggest that melitin reduces M2 gene expression such as Mrc1 / CD205 and Vegf and does not alter M1 gene expression such as Vegf and flt1 / VEGFR in Lewis lung carcinoma cells, - an effect of angiogenesis.

염증-유발 M1형 종양관련 대식세포는 병원균을 죽이는데 도움이 되는 식균 작용, 내포 작용, 사이토카인분비 및 ROS 생산과 같은 기능적 특성을 갖는 것이 필수적이다. 우리는 M1형 골수-유래 대식세포의 ROS 생산 및 식세포 작용 지수를 측정함으로써 멜리틴이 대식세포 기능에 미치는 영향을 확인하였다. 세포 내 ROS 수준은 멜리틴 처리 골수-유래 대식세포군과 대조 골수-유래 대식세포군에서 차이가 없었다(도 6A 및 6B). 식세포 수용력은 멜리틴 처리에 의해 변하지 않았지만 식세포 작용 지수는 액틴 중합 억제제인 사이토칼라신 D(cytochalasin D)처리 군에서 유의하게 낮았다(도 6C). 이러한 실험결과를 통해 멜리틴 처리가 ROS 생산 및 식균 작용과 같은 대식세포의 기능적 특성을 억제하지 않는다는 것을 확인할 수 있었다. Inflammatory-induced M1 type tumor-associated macrophages are required to have functional properties such as phagocytosis, encapsulation, cytokine secretion and ROS production, which aid in killing pathogens. We have examined the effect of melittin on macrophage function by measuring the ROS production and phagocytosis index of type M1 bone marrow-derived macrophages. Intracellular ROS levels were not different between the melitin treated bone marrow-derived macrophages and the control bone marrow-derived macrophages (FIGS. 6A and 6B). The phagocytic capacity was not changed by the melitin treatment, but the phagocytic action index was significantly lower in the cytochalasin D-treated group as an actin polymerization inhibitor (Fig. 6C). These results indicate that melittin treatment does not inhibit the functional properties of macrophages such as ROS production and phagocytosis.

실시예Example 9. 선택적 CD206 9. Optional CD206 ++ 종양관련 대식세포의 하향조절의 효과 Effect of down-regulation of tumor-associated macrophages

9-1. 조직 준비 및 9-1. Tissue preparation and 면역형광Immunofluorescence 공초점Confocal 현미경 분석 Microscope analysis

접종된 생쥐의 종양을 파라포름알데히드로 하룻밤 고정시키고, 탈수시킨 다음 파라핀에 넣었다. 삽입된 조직의 절편(5μm 두께)을 회전식 마이크로톰에서 절단하고 탈 파라핀화하였다. 슬라이드를 1분 동안 시트르산 삼나트륨 완충액 (pH 6)에서 오토클레이브로 항원을 회수하고, PBS로 세척한 다음, 0.2% 트리톤 X-100을 함유하는 1.5% BSA로 1시간 동안 블로킹하였다. 슬라이드를 항 VEGF 및 항-CD31 일차 항체(1: 200, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)와 4℃에서 밤새 배양하였다.Tumors of the inoculated mice were fixed with paraformaldehyde overnight, dehydrated and then placed in paraffin. Sections (5 μm in thickness) of the inserted tissues were cut in a rotary microtome and deparaffinized. The slides were autoclaved with antigen in trisodium citrate buffer (pH 6) for 1 minute, washed with PBS and then blocked with 1.5% BSA containing 0.2% Triton X-100 for 1 hour. Slides were incubated overnight at 4 ° C with anti-VEGF and anti-CD31 primary antibodies (1: 200, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA).

모든 조직 절편을 1시간 동안 실온에서 배양한 후 alexa-488 또는 alexa-594 접합된 2차 항체 (1:500, Invitrogen)로 시각화하였다. 모든 항체를 0.5% BSA 용액으로 희석하고 습한 챔버에서 배양하였다. 슬라이드를 DAPI 용액으로 고정시키고 레이저 스캐닝 공초점 현미경(Bio-Rad, Richmond, CA, USA)으로 분석하였다. 모든 이미지를 LSM로 캡쳐하였고 총 통합 밀도를 이미지 J 소프트웨어로 측정하였다.All tissue sections were incubated for 1 hour at room temperature and visualized with alexa-488 or alexa-594 conjugated secondary antibody (1: 500, Invitrogen). All antibodies were diluted with 0.5% BSA solution and incubated in a humid chamber. Slides were fixed in DAPI solution and analyzed by laser scanning confocal microscopy (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). All images were captured with LSM and total integrated density was measured with image J software.

9-2. 실험 결과9-2. Experiment result

종양관련 대식세포는 혈관 형성 및 종양 성장을 자극하는 다양한 성장 인자, 혈관형성촉진 인자 및 사이토카인을 분비함으로써 종양 혈관 신생을 촉진한다. 가장 강력한 혈관 신생 단백질로 여겨지는 VEGF는 내피 발아(sprouting)를 자극하여 혈관 신생을 유도할 뿐만 아니라 종양에서 새로운 혈관의 생존을 유지하는 역할을 한다. CD31(PECAM)은 혈관 표지자로 종양 마우스 모델에서 혈관 신생을 탐지하는데 널리 사용되어 왔다. 따라서 우리는 멜리틴의 효과가 혈관 신생 억제에 미치는 영향을 확인하기 위해 VEGF와 CD31의 두 가지 주요 혈관 신생 마커를 사용하였다. 면역형광 염색은 PBS 군(도 7A 및 7B)에 비해 멜리틴 처리 종양 조직에서 VEGF와 CD31의 수준 감소를 나타낸다. 통합 밀도(integrated density)는 image J로 측정하였으며 PBS 대조군과 0.5 mg/kg 및 1 mg/kg 멜리틴 투여군(도 7C 및 7D)간에 유의미한 차이가 있었다. 이것은 조직 상주 M2형 종양관련 대식세포의 개체군의 감소가 혈관 신생의 억제를 초래한다는 것을 시사한다. 따라서, 멜리틴이 종양 미세환경을 조절하여 M2형 종양관련 대식세포 수를 감소시키고, 이는 종양세포 주변의 혈관 신생을 억제하여 항암효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. Tumor-associated macrophages promote tumor angiogenesis by secreting various growth factors, angiogenic promoters and cytokines that stimulate angiogenesis and tumor growth. VEGF, the most potent angiogenic protein, stimulates endothelial sprouting to induce angiogenesis, as well as maintaining the viability of new blood vessels in the tumor. CD31 (PECAM) is a vascular marker and has been widely used to detect angiogenesis in tumor mouse models. We therefore used two major angiogenic markers, VEGF and CD31, to determine the effect of melitin on angiogenesis inhibition. Immunofluorescent staining showed a decreased level of VEGF and CD31 in melittin-treated tumor tissue compared to the PBS group (Figures 7A and 7B). The integrated density was measured in image J and there was a significant difference between the PBS control group and the 0.5 mg / kg and 1 mg / kg melittin treated groups (Figures 7C and 7D). This suggests that a decrease in the population of tissue type M2 tumor-associated macrophages results in inhibition of angiogenesis. Therefore, it was confirmed that melitin regulates the tumor microenvironment to decrease the number of type II macrophages related to type M2, which inhibits angiogenesis around the tumor cells, thus exhibiting anticancer effects.

비교예Comparative Example 1.  One. 봉독의Bee venom 성분 중  Among the ingredients PLA2에On PLA2 의한 M2형 종양관련 대식세포의 효과 Effect of M2 type tumor-associated macrophages

1-1. 세포 준비 및 1-1. Cell preparation and mRNAmRNA 발현양Expression level 분석 analysis

1-1-1. 세포준비1-1-1. Cell preparation

10 % 소태아 혈청 (Welgene, Gyeongsan, Korea), 100 U ml-1 페니실린 및 100 μgml-1 스트렙토 마이신 (Invitrogen Life, Invitrogen Life)을 첨가한 RPMI 1640 배지 (Welgene, Gyeongsan, Korea) Technologies, Rockville, MD, USA)에서 뮤린 BV-2 소교 세포주를 유지하였다. 세포가 80 % 컨플루언트(confluent)가 될 때까지 2-3 일마다 배양하였다. 모든 실험에서 세포를 95% 습도 및 5% CO2로 37℃에서 배양했다. 분화를 위해, 세포를 5 x 105 세포/ml의 밀도로 6-웰 플레이트에 시딩(seeding)하고 다음날 처리하였다. 처리 직전에, 세포를 무-혈청 RPMI 배지로 2회 세척하고, 실험 처리를 포함하는 2 ml의 따뜻한 무-혈청 RPMI 배지를 보충하였다. 세포를 30분 동안 0.1, 1 또는 10 ㎍㎖- 1 bvPLA2로 전처치 한 후, 1 ㎍㎖- 1 의 지질다당류(LPS) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) 또는 20 ng ml- 1 뮤린 재조합 인터루킨)-4 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 각 웰에 첨가하였다. 처리 24 간 후, 세포를 PBS로 2회 헹구고 RNA 추출을 위해 수집 하였다.10% fetal bovine serum (Welgene, Gyeongsan, Korea), 100 U ml -1 penicillin and 100 μgml -1 streptomycin, RPMI 1640 medium was added (Invitrogen Life, Invitrogen Life) ( Welgene, Gyeongsan, Korea) Technologies, Rockville, MD, USA) maintained a murine BV-2 microglial cell line. Cells were cultured every 2-3 days until they became 80% confluent. In all experiments the cells were incubated at 37 ° C with 95% humidity and 5% CO 2 . For differentiation, the cells 5 x 10 5 cells are seeded (seeding) in 6-well plates at a density of / ml and treated the next day. Immediately before treatment, the cells were washed twice with serum-free RPMI medium and supplemented with 2 ml of warm serum-free RPMI medium containing experimental treatment. The cells for 30 minutes, 0.1, 1 or 10 ㎍㎖ - after pretreatment with 1 bvPLA2, 1 ㎍㎖ - lipopolysaccharide of 1 (LPS) (Sigma-Aldrich , St Louis, MO, USA) or 20 ng ml - 1 Murine recombinant interleukin-4 (R & D Systems, Minneapolis, MN, USA) was added to each well. After 24 hours of treatment, cells were rinsed twice with PBS and collected for RNA extraction.

1-1-2. 1-1-2. RNA추출RNA extraction 및 정량적 실시간  And quantitative real-time PCR방법PCR method

Easy-BLUE RNA 추출 키트 (iNtRON Biotechnology, Inc., Seongnam, Korea)를 사용하여 BV-2세포로부터 전체 RAN를 추출하였다. RNA 품질과 농도는 NanoDrop 분광 광도계(NanoDrop Technologies, Inc., ND-1000, Wilmington, DE, USA)를 사용하여 결정하고 RNase가 없는 물에 의해 최저 농도로 표준화하였다. 제조자의 지시에 따라 CycleScript 역전사 효소 및 Random Oligonucleotide Primers (Bioneer, Deajeon, Korea)를 사용하여 RNA를 cDNA로 역전사하였다. 정량적 실시간 PCR을 SensiFAST SYBR No-ROX Kit (Bioline, Taunton, MA, USA) 를 사용하여 수행하고 LightCycler 480 system (Roche Ltd, Basel, Switzerland)으로 분석하였다. PCR 반응은 95℃에서 10초간 변성, 72 ℃에서 10초간 풀림(annealing), 60℃에서 10초간 변성을 55 사이클 반복하여 각 사이클의 마지막에서 형광을 측정하였다. 데이터는 GAPDH로 표준화된 실험 유전자에 대해 2-ΔΔCT로 표현되고 식염수-처리된 대조군에 비해 배수 변화로 나타내었다. 하기의 프라이머를 사용 하였다: TNF-α for: 5′-TTCTGTCTACTGAACTTCGGGGTGATCGGTCC-3′; TNF-α rev: 5′-GTATGAGATAGCAAATCGGCTGACGGTGTGGG-3′; iNOS for: 5′-GGCAGCCTGTGAGACCTTTG-3′; iNOS rev: 5′-CATTGGAA GTGAAGCGTTTCG-3′; Arg1 for: 5′-AGACAGCAGAGGAGGTG AAGAG-3′; Arg1 rev: 5′-CGAAGCAAGCCAAGGTTAAAGC-3′; MMR for: 5′-AGTGGCAGGTGGCTTATG-3′; MMR rev: 5′-GGT TCAGGAGTTGTTGTG-3′; GAPDH for: 5′-ACCCAGAAGACTGT GGATGG-3′; GAPDH rev: 5′-CACATTGGGGGTAGGAACAC-3′All RANs were extracted from BV-2 cells using Easy-BLUE RNA Extraction Kit (iNtRON Biotechnology, Inc., Seongnam, Korea). RNA quality and concentration were determined using a NanoDrop spectrophotometer (NanoDrop Technologies, Inc., ND-1000, Wilmington, DE, USA) and normalized to the lowest concentration by RNase-free water. RNA was reverse transcribed with cDNA using CycleScript reverse transcriptase and Random Oligonucleotide Primers (Bioneer, Deajeon, Korea) according to the manufacturer's instructions. Quantitative real-time PCR was performed using the SensiFAST SYBR No-ROX Kit (Bioline, Taunton, Mass., USA) and analyzed with a LightCycler 480 system (Roche Ltd, Basel, Switzerland). The PCR was carried out by denaturing at 95 ° C for 10 seconds, annealing at 72 ° C for 10 seconds, denaturing at 60 ° C for 10 seconds, and fluorescence at the end of each cycle. Data were expressed as 2-ΔΔCT for the experimental genes normalized to GAPDH and expressed as a multiple of change compared to the saline-treated control. The following primers were used: TNF-α for: 5'-TTCTGTCTACTGAACTTCGGGGTGATCGGTCC-3 '; TNF-a rev: 5'-GTATGAGATAGCAAATCGGCTGACGGTGTGGG-3 '; iNOS for: 5'-GGCAGCCTGTGAGACCTTTG-3 '; iNOS rev: 5'-CATTGGAA GTGAAGCGTTTCG-3 '; Arg1 for: 5'-AGACAGCAGAGGAGGTG AAGAG-3 '; Arg1 rev: 5'-CGAAGCAAGCCAAGGTTAAAGC-3 '; MMR for: 5'-AGTGGCAGGTGGCTTATG-3 '; MMR rev: 5'-GGT TCAGGAGTTGTTGTG-3 '; GAPDH for: 5'-ACCCAGAAGACTGT GGATGG-3 '; GAPDH rev: 5'-CACATTGGGGGTAGGAACAC-3 '

1-2. 실험결과1-2. Experiment result

우리는 M1 유도 조건 (LPS) 또는 M2 유도 조건 (IL-4)에 노출시 유전자 발현을 정량화함으로써 소뇌 세포의 M1/M2 양극화에 대한 bvPLA2의 효과를 시험하였다. 종양괴사인자 알파 (TNF-α)와 유도성 산화질소 합성효소 (iNOS)는 M1 표현형 마커로 작용하는 반면, 대식세포 만노즈 수용체 (MMR, CD206) 및 아르기나제-1 (Arg1)은 M2 마커로 작용한다. TNF-α와 iNOS의 mRNA (messenger RNA)는 세포가 LPS에 노출되었을 때 비히클 대조군에 비해 유의하게 증가했다(도 8). bvPLA2는 LPS 노출 동안 용량 의존적 방식으로 BV-2 세포의 M1 표현형에 대한 분화를 효과적으로 차단했음을 나타낸다. IL-4 노출 동안 M1 마커에서 변화가 관찰되지 않았다. MMR은 약간 증가하였고, Arg1은 IL-4에 의해서 비히클 대조군에 비해 유의하게 증가 하였다. 세포가 IL-4에 노출되었을 때 bvPLA2 처리시 두 mRNA 수치가 모두 유의하게 증가했다. LPS 노출 동안 M2 마커에는 유의미한 차이가 없었다. 종합하면, 이들 결과는 bvPLA2가 M2 소교세포의 분화를 촉진한다는 것을 보여준다. 따라서 다른 주요 구성성분인 PLA2는 오히려 M2형 종양관련 대식세포로의 분화를 촉진시키며 멜리틴만이 선택적으로 M2형 종양관련 대식세포를 억제하여 종양 미세환경을 조절할 수 있고, 이를 통해 종양의 성장 및 전이를 억제하여 항암효과를 나타낼 수 있음을 확인할 수 있었다.We examined the effect of bvPLA2 on M1 / M2 polarization of cerebellar cells by quantifying gene expression upon exposure to M1 inducing conditions (LPS) or M2 inducing conditions (IL-4). Tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha) and inducible nitric oxide synthase (iNOS) act as M1 phenotypic markers while macrophage nodule receptors (MMR, CD206) and arginase- Lt; / RTI &gt; TNF-α and iNOS mRNA (messenger RNA) were significantly increased when cells were exposed to LPS compared to vehicle control (FIG. 8). bvPLA2 effectively blocked the differentiation to the M1 phenotype of BV-2 cells in a dose-dependent manner during LPS exposure. No changes were observed in the M1 marker during IL-4 exposure. MMR was slightly increased, and Arg1 was significantly increased by IL-4 compared to the vehicle control. When cells were exposed to IL-4, both mRNA levels were significantly increased during bvPLA2 treatment. There was no significant difference in M2 marker during LPS exposure. Taken together, these results show that bvPLA2 promotes the differentiation of M2 microglia. Therefore, PLA2, another major constituent, promotes differentiation into M2 type tumor-associated macrophages, and melittin selectively modulates M2 type tumor-associated macrophages to regulate the tumor microenvironment, Inhibition of metastasis and anticancer effects.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.From the above description, it will be understood by those skilled in the art that the present invention may be embodied in other specific forms without departing from the spirit or essential characteristics thereof. In this regard, it should be understood that the above-described embodiments are to be considered in all respects as illustrative and not restrictive. The scope of the present invention should be construed as being included in the scope of the present invention without departing from the scope of the present invention as defined by the appended claims.

Claims (13)

멜리틴을 유효성분으로 포함하는 종양관련 대식세포(TAM, tumor associated macrophage) 제거용 조성물.
A composition for removing tumor associated macrophage (TAM) comprising melitin as an active ingredient.
제1항에 있어서, 상기 종양관련 대식세포는 M2형 종양관련 대식세포인, 종양관련 대식세포 제거용 조성물.
The composition of claim 1, wherein the tumor-associated macrophage is a M2 type tumor-associated macrophage.
제2항에 있어서, 상기 종양관련 제거용 조성물은 M1형 종양관련 대식세포 대비 M2형 종양관련 대식세포의 비율(M1/M2)을 높이는 것인, 종양관련 대식세포 제거용 조성물.
The composition according to claim 2, wherein the composition for tumor-related removal enhances the ratio (M1 / M2) of M2 type tumor-associated macrophages to M1 type tumor-associated macrophages.
제2항에 있어서, 상기 종양관련 대식세포 제거용 조성물은 M2형 골수 유래 대식세포에서 M2 표현형 마커의 유전자 및 단백질 발현을 억제하는 것인, 종양관련 대식세포 제거용 조성물.
3. The composition according to claim 2, wherein the composition for removing tumor-associated macrophages suppresses gene expression and protein expression of the M2 phenotype marker in M2-type bone marrow-derived macrophages.
제4항에 있어서, 상기 M2 표현형 마커는 Vegf(vascular endothelial growth factor), Mrc1/CD206(mannose receptor C type 1)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 종양관련 대식세포 제거용 조성물.
5. The composition according to claim 4, wherein the M2 phenotype marker is any one selected from the group consisting of vascular endothelial growth factor (VEGF) and Mrc1 / CD206 (mannose receptor C type 1).
제1항에 있어서, 상기 종양관련 대식세포 제거용 조성물은 종양세포에서 혈관신생의 마커 수준을 감소시키는 것인, 종양관련 대식세포 제거용 조성물.
2. The composition of claim 1, wherein said composition for removing tumor-associated macrophages reduces the level of angiogenesis in tumor cells.
제6항에 있어서, 상기 혈관신생의 마커는 VEGF 또는 CD31인 것인, 종양관련 대식세포 제거용 조성물.
7. The composition of claim 6, wherein the marker of angiogenesis is VEGF or CD31.
멜리틴 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 종양관련 대식세포 매개 질환의 치료용 약학적 조성물.
A pharmaceutical composition for treating tumor-associated macrophage-mediated diseases, comprising melitin or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
제9항에 있어서, 상기 멜리틴의 양은 0.5mg/kg 내지 1mg/kg의 용량으로 투여되는 것인, 종양관련 대식세포 매개 질환의 치료용 약학적 조성물.
The pharmaceutical composition according to claim 9, wherein the amount of melittin is administered in a dose of 0.5 mg / kg to 1 mg / kg.
제8항에 있어서, 상기 질환은 루이스 폐암 또는 염증질환인 것인, 약학적 조성물.
9. The pharmaceutical composition according to claim 8, wherein the disease is Lewis's lung cancer or inflammatory disease.
멜리틴을 처리하여 시험관의 종양관련 대식세포에 처리하는 단계를 포함하는, 종양관련 대식세포 제거 방법.
Treating melitin to tumor-associated macrophages of the test tube.
제11항에 있어서, 상기 투여되는 멜리틴의 농도는 0.1μg/ml 내지 2μg/ml인 것인, 종양관련 대식세포 제거 방법.
12. The method of claim 11, wherein the concentration of melittin administered is from 0.1 μg / ml to 2 μg / ml.
제11항에 있어서, 상기 종양관련 대식세포는 M2형 종양관련 대식세포인, 종양관련 대식세포 제거 방법.



12. The method of claim 11, wherein the tumor-associated macrophage is a M2 type tumor-associated macrophage.



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