KR20190011941A - Method for quantifying foot-and-mouth disease virus particles using High Performance Liquid Chromatography - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 고속액체크로마토그래피를 이용한 구제역바이러스 입자 정량 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for quantifying foot-and-mouth disease virus particles using high-performance liquid chromatography.
구제역(foot-and-mouth disease)은 우제류의 동물에서 바이러스 감염으로 고열, 수포 등의 증상을 나타내며 어린 가축에서는 폐사를 일으키는 국내 제 1종 법정 가축전염병이다. 국내에서는 2000년 이후로 8회 발생하였으며 2010-2011년 발생 시에는 무려 약 3조원의 직접적인 경제적 피해를 초래하기도 하였다. Foot-and-mouth disease is a domestic infectious disease of domestic livestock that causes symptoms such as high fever and blisters in domestic animals and viral infection in domestic animals. In Korea, it has occurred 8 times since 2000, and when it occurred in 2010-2011, it caused about 3 trillion won direct economic damage.
구제역바이러스(foot-and-mouth disease virus)는 총 4개의 단백질(VP1, VP2, VP3, VP4)로 구성되어 있다. 바이러스가 세포에서 증식할 때 생성되는 상기 4개의 단백질들이 1개씩 모여서 단일체(protomer)를 형성했다가 단일체 5개가 모여서 펜타머(pentamer)를 형성한다. 그 후, 펜타머 12개가 모여서 완전한 형태의 구제역바이러스 입자를 형성하고, 원심 분리의 밀도 및 침강 계수가 146S이므로, 완전 입자 형태를 146S로 부르기도 한다. 또한, 완전한 형태의 구제역바이러스가 고열이나 낮은 pH 등에 의해서 펜타머로 분해가 되면 이를 분해 입자라고도 하며, 원심분리의 밀도가 12S이므로 분해 입자 형태를 12S로 부르기도 한다. 구제역 바이러스의 분해산물인 상기 펜타머의 경우에는 완전한 형태에 비해서 면역원성이 훨씬 낮아진다는 것이 보고된 바 있어, 구제역 백신을 제조하는 단계 혹은 완제품 단계에서 구제역바이러스의 입자 형태에 대한 분석기법 확립이 필요한 상황이다. The foot-and-mouth disease virus consists of a total of four proteins (VP1, VP2, VP3, VP4). When the virus grows in the cells, the four proteins that are generated by one of the four proteins form a protomer, and five monomers are assembled to form a pentamer. Thereafter, 12 pentamers were collected to form the complete foot-and-mouth disease virus particle, and the density and sedimentation coefficient of the centrifugation were 146S, so that the complete particle form is also referred to as 146S. In addition, when a complete form of foot-and-mouth disease virus is decomposed into pentamer due to high temperature or low pH, it is also referred to as degrading particle, and since the density of centrifugation is 12S, the decomposed particle form is also referred to as 12S. It has been reported that the pentamer, which is a degradation product of foot-and-mouth disease virus, has much lower immunogenicity than the complete form, and it is necessary to establish a method for analyzing the particle type of foot-and-mouth disease virus in the step of producing foot- It is a situation.
현재 여러 백신 제조사에서는 구제역바이러스 완전입자(146S)의 측정을 위해서 수크로즈 밀도구배를 이용한 초고속원심분리법을 사용하고 있으나 이를 위해서는 원심분리 튜브에서 밀도구배를 준비한 다음에 2시간 이상의 초고속원심분리를 실시한 후, 다시 흡광도를 별도로 측정하여 피크를 나타내는 분획에 대한 면적을 측정하여 계산해야 하는 실정이다. 이에 많은 시간이 소요되고 초고속원심분리기의 동시적용 가능 시료수 제약 때문에 한번에 6개까지 밖에 검사할 수 없는 단점이 있다. 따라서 구제역 백신 생산공정 단계별로 손쉽게 구제역바이러스의 완전입자를 측정할 수 있는 기법의 개발이 절실한 상황이다.Currently, several vaccine manufacturers use ultracentrifugation centrifugation using a sucrose density gradient for the measurement of foot-and-mouth disease virus whole particles (146S). To do this, a density gradient is prepared in a centrifuge tube, followed by ultra- , The absorbance is measured separately and the area for the fraction showing the peak is measured and calculated. It takes a lot of time, and there is a disadvantage that only six centrifuges can be tested at a time because of the number of simultaneous application of the centrifugal separator. Therefore, it is urgent to develop a technique that can measure the whole particles of foot-and-mouth disease virus easily by foot step of foot-and-mouth disease vaccine production process.
이에, 본 발명자들은 구제역바이러스의 입자를 정량하기 위한 방법을 예의연구하였다. 그 결과, 구제역바이러스 완전입자의 크기가 일반 단백질보다 훨씬 큰 특징을 기반으로 하여 분자 크기별로 분획이 가능한 장비로서 고속액체크로마토그래피 및 겔 컬럼을 적용하여 용이하게 구제역바이러스를 정량할 수 있는 방법을 구축하였으며, 이에 의해 구제역바이러스의 완전입자 또는 분해입자를 구분할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다. Therefore, the present inventors have made intensive studies on a method for quantifying foot-and-mouth disease virus particles. As a result, based on the feature that the size of foot-and-mouth disease virus whole particle is much larger than that of general protein, it can be fractionated by molecular size and it can be easily applied to high-speed liquid chromatography and gel column to quantify foot-and-mouth disease virus Thereby confirming that the whole or degraded particles of foot-and-mouth disease virus can be distinguished. Thus, the present invention has been completed.
따라서, 본 발명의 목적은 구제역 바이러스(foot-and-mouth disease virus, FMDV) 입자의 정량 방법을 제공하는 데 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for quantifying foot-and-mouth disease virus (FMDV) particles.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 구제역 바이러스(foot-and-mouth disease virus, FMDV) 입자의 정량 방법을 제공한다:According to one aspect of the present invention, the present invention provides a method for quantifying foot-and-mouth disease virus (FMDV) particles comprising the steps of:
(a) 바이러스 샘플을 수득하는 단계; 및(a) obtaining a virus sample; And
(b) 상기 (a) 단계의 샘플을 고속액체크로마토그래피 시스템에 적용하여 고속액체크로마토그래피 프로파일을 수득하는 단계.(b) applying the sample of step (a) to a high performance liquid chromatography system to obtain a high performance liquid chromatography profile.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 구제역 바이러스 입자는 완전 입자 형태(146S) 또는 분해 입자 형태(12S)이고, 가장 바람직하게는 완전 입자 형태(146S)이다.According to a preferred embodiment of the present invention, the foot-and Mouth virus particle is a complete particle form (146S) or a degraded particle form (12S), and most preferably a complete particle form (146S).
본 발명의 특징은 고속액체크로마토그래피를 이용하여 구제역바이러스 입자를 정량한다는 데 있다.A feature of the present invention is to quantify foot-and-mouth disease virus particles using high-performance liquid chromatography.
본 발명에 있어서, 상기 "구제역 바이러스 입자"는 원심분리의 침강계수에 따라 각 146S로 명명한다. 상기 "완전입자"는 구제역 바이러스의 총 4개의 단백질(VP1, VP2, VP3, VP4)이 1개씩 모여 단일체(protomer)를 형성하고, 단일체 5개가 모여서 펜타머(pentamer)를 형성한 후, 펜타머 12개가 모인 것을 의미한다 In the present invention, the "foot-and-mouth virus particle" is referred to as 146S according to the sedimentation coefficient of centrifugation. The above-mentioned "whole particle" means that a total of four proteins (VP1, VP2, VP3 and VP4) of foot-and-mouth disease virus are gathered one by one to form a protomer and five monomers are combined to form a pentamer, It means 12 gathered
상기 크로마토그래피에서 사용하는 컬럼은, 146S 완전입자를 정량하는 데 이용할 수 있는 한, 당업계에 공지된 임의의 컬럼을 이용할 수 있다.The column used in the chromatography may be any column known in the art as long as it can be used to quantify 146S whole particles.
상기 고속액체크로마토그래피 칼럼의 크기는 10 내지 200 nm 범위이고, 바람직하게는 45 nm이다.The size of the high performance liquid chromatography column is in the range of 10 to 200 nm, preferably 45 nm.
즉, 본 발명의 방법은 분자량 크기를 이용한 겔 컬럼으로서 한 가지를 사용하였지만 구제역 바이러스의 입자를 판별하기 위한 목적을 달성하기 위해서라면 겔 컬럼의 종류는 제한되지 않는다.That is, although the method of the present invention uses one kind of gel column using the molecular weight size, the kind of the gel column is not limited in order to achieve the purpose of discriminating the particles of foot-and-mouth disease virus.
보다 구체적으로, 본 발명은 겔 컬럼(TSKgel G4000SWXL, 7.8mm ID x 300mm L, pore size 45nm)을 사용할 수 있으며, 검사시료는 0.22um 필터를 거쳐서 100ul를 컬럼에 주입하고 이때 유속은 0.6ml/min, 이동 상은 50mM 인산염 완충용액을 사용하는 방법으로서 구제역바이러스의 완전입자를 확인할 수 있으며 동시에 열처리 등에 의해서 완전입자의 파쇄 여부도 판별할 수 있다. More specifically, the present invention can use a gel column (TSKgel G4000SW XL , 7.8 mm ID x 300 mm L, pore size 45 nm), and 100 ul of the test sample is injected through a 0.22 um filter into the column at a flow rate of 0.6 ml / min, and the mobile phase is a method using a 50 mM phosphate buffer solution to confirm the complete particle of foot-and-mouth disease virus. At the same time, it is also possible to determine whether the whole particle is broken by heat treatment or the like.
본 발명에서 TSKgel G4000SWXL(7.8mm ID x 300mm L, pore size 45nm)로서 TOSOH bioscience사 제품을 사용하였으나, 이에 제한되지 않는다. In the present invention, TSKgel G4000SW XL (7.8 mm ID x 300 mm L, pore size 45 nm) was used, but is not limited to, TOSOH bioscience.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 구제역바이러스의 혈청형은 O, A, C, SAT-1, SAT-2, SAT-3 및 Asia-1으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상의 혈청형이고, 가장 바람직하게는 O 형이다. According to a preferred embodiment of the present invention, the serotype of foot-and-mouth disease virus is at least one serotype selected from the group consisting of O, A, C, SAT-1, SAT-2, SAT-3 and Asia- It is preferably O-form.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 구제역바이러스는 국내 분리 구제역 바이러스이며, 상기 분리주는 진천주 또는 보은주이며, 바람직하게는 진천주이다.According to a preferred embodiment of the present invention, the foot-and-mouth disease virus is a domestic isolated foot-and-mouth disease virus, and the isolate is Jincheon or Boeunju, preferably Jincheon.
본 발명에 있어서, 상기 "구제역 바이러스의 혈청형"은 7개의 혈청형이 존재하며, 구제역 바이러스는 복제 과정에서 3D 폴리머라아제가 유전자 교정(3D pol gene proofreading) 및 복제 후 수리 활성이 결여되어 있기 때문에 항원 변이성이 높아 상기 혈청형이 존재한다.In the present invention, the "serotype of foot-and-mouth disease virus" has 7 serotypes, and foot-and-mouth disease virus has 3D pol gene proofreading and lack of repair activity after replication in the course of replication Therefore, the above serotype is present due to high antigenic variability.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 상기 고속액체크로마토그래피를 TSKgel G4000SWXL상에서 실시한다.According to a preferred embodiment of the present invention, the present invention is carried out on the TSKgel G4000SW XL by the high performance liquid chromatography.
즉, 특정 크로마토그래피 지지체가 특정 바이러스 입자의 분리를 위해 매우 놀랄만한 성질을 나타내는 것으로 알려져 있다. 이러한 성질로 인해 사전 처리없이 매우 높은 감도와 선택성으로 샘플로부터 바이러스 입자를 정량할 수 있다. 이러한 지지체의 사용은 부수적으로 뜻밖에도 크로마토그래피에 의해 완전 입자 형태의 구제역 바이러스를 분리하여 동정하는 단순하고도 빠른 정량 분석 방법을 제공할 수 있다.That is, it is known that certain chromatographic supports exhibit very surprising properties for the separation of specific viral particles. This property allows viral particles to be quantitated from the sample with very high sensitivity and selectivity without pretreatment. The use of such a support can, incidentally and unexpectedly, provide a simple and rapid quantitative analysis method for isolating and identifying the FMD virus in the form of whole particles by chromatography.
상기 완전입자의 계산되거나 측정된 분자 질량 및 샘플 제조 동안 적용된 희석 계수는 샘플 ml당 ㎍으로서 표시된, 샘플 내 완전 입자의 농도 계산, 즉, 정량을 가능하게 한다.The calculated or measured molecular mass of the whole particle and the dilution factor applied during sample preparation enable the calculation, i.e., quantification, of the complete particle in the sample, expressed as μg per ml of sample.
일 구현예에서, 완전 입자를 계산하기 위한 공식은 하기에 제공된다:In one embodiment, the formula for calculating the complete particle is provided below:
Y=305.62X-239.35Y = 305.62X-239.35
(Y: HPLC 그래프 곡선아래면적(mAU*s), X: HPLC에 적용한 시료의 완전 입자 함량(ug))(Y: area under the HPLC graph curve (mAU * s), X: total particle content (ug) of the sample applied to HPLC)
본 발명의 일 구체예에서, 완전 입자의 정량은 완전 입자의 피크 면적에 기초된다. 본 발명의 적용가능성은 구제역바이러스 진천주가 포함되지만 진천주의 정량 분석 이용에만 한정되지 않는다. 본 발명은 또한, 진천주를 포함한 상이한 종류의 국내주 아류형의 정량에 대해 적용가능하다.In one embodiment of the invention, the determination of the total particle is based on the peak area of the complete particle. Applicability of the present invention includes foot-and-mouth disease virus strain but is not limited to use of vaccine quantitative analysis. The present invention is also applicable to the quantification of different types of domestic major subtypes, including Jincheon.
본 발명의 구제역바이러스 입자 정량화 방법은 기존의 수크로즈 밀도구배 방식과 비교하여 보다 짧은 시간에 손쉽게 완전입자(146S)를 정량할 수 있어서 구제역 백신생산 공정단계에서 완전입자의 함량을 수시로 측정할 수 있기 때문에 효율적인 백신 품질관리에 기여할 것이며 분해 입자와의 상대적 비율도 측정이 가능하므로 외부요인에 불안정한 구제역바이러스에 대한 안정화제 탐색에도 적용하여 양질의 구제역 백신생산에 유용하게 이용할 수 있다. The method for quantifying foot-and-mouth disease virus particles according to the present invention can easily measure the total particle (146S) in a shorter time as compared with the conventional sucrose density gradient method, Therefore, it will contribute to the efficient quality control of vaccine and the relative ratio with degraded particles can be measured. Therefore, it can be applied to the search for stabilizer for foot-and-mouth disease virus which is unstable to external factors and can be useful for production of high-quality foot and mouth vaccine.
도 1a는 메리알 O형 구제역 백신에서 클로로포름으로 추출한 항원에 대해서 수크로즈 밀도구배 초고속원심분리방법으로 순수하게 정제한 다음에 고속액체크로마토그래피로 구제역바이러스 완전입자(146S)와 분해입자(완전입자를 56도에서 30분간 열처리)를 분리한 도이다.
도 1b 및 도 1c는 각각 O형 진천주와 아시아 1형 샤미르(Shamir)주를 부유세포에서 배양한 후에 수크로즈 밀도구배 초고속원심분리방법으로 순수하게 정제한 다음에 고속액체크로마토그래피로 구제역바이러스 완전입자(146S)와 분해입자(완전입자를 56℃에서 30분간 열처리)를 분리한 도이다.
도 2a는 메리알 O형 구제역 백신에서 클로로포름으로 추출한 항원에 대해서 2진 희석하여 수크로즈 밀도구배 초고속원심분리방법으로 순수하게 정제한 다음에 고속액체크로마토그래피로 곡선아래 면적값을 통해서 구제역바이러스 농도별 크로마토그램 면적값을 산출한 도이다.
도 2b는 메리알 O형 구제역 백신에서 클로로포름으로 추출한 항원에 대해서 단계희석하여 수크로즈 밀도구배 초고속원심분리방법에 의한 흡광도로 산출한 구제역바이러스 완전입자 함량과 고속액체크로마토그래피에서 산출한 곡선아래 면적값 간의 상관관계를 나타낸 도이다.FIG. 1 (a) is a graph showing the results of immunoassay in which the antigen extracted with chloroform in a mariar O-type foot-and mouth vaccine vaccine was purely purified by ultracentrifugation with a sucrose density gradient ultracentrifuge method, followed by high performance liquid chromatography, Heat treatment at 56 degrees for 30 minutes).
1B and 1C show the results obtained by culturing O-type Jincheon strain and Asian type 1 Shamir strain in suspension cells, respectively, and purifying them by ultracentrifugation with sucrose density gradient ultra-high speed centrifugation method, followed by high performance liquid chromatography, (146S) and decomposed particles (heat treatment at 50 占 폚 for 30 minutes).
FIG. 2A shows the results of binary dilution of an antigen extracted with chloroform in a mariar O type FMD vaccine, purifying it by ultracentrifugation with sucrose density gradient ultracentrifugation method, followed by high performance liquid chromatography And calculating a chromatogram area value.
FIG. 2B is a graph showing the results of the stepwise dilution of the antigen extracted with chloroform in the mariar O-type foot-and mouth disease vaccine and calculating the absorbance of the FMDV by the ultracentrifugation with sucrose density gradient ultracentrifuge and the area under the curve calculated by high performance liquid chromatography FIG.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.It will be apparent to those skilled in the art that various modifications and variations can be made in the present invention without departing from the spirit or scope of the invention as defined by the appended claims. It will be obvious to you.
실시예 1. 구제역바이러스 완전입자와 열처리에 의한 분해산물 판별 방법Example 1. Method for discriminating degradation products by foot-and-mouth disease virus whole particles and heat treatment
본 발명자들은 구제역바이러스 완전입자를 확보하고자 BHK21 세포를 배양하고 플라스크에 단층 형성이 확인되면, 구제역바이러스 (O형 국내 진천주 GenBank No. KX162590, 아시아1형 Shamir주 GenBank No. JF739177)를 0.01 MOI(Muliplicity of Infection) 농도로 세포에 접종하였다. 이 후, 세포변성효과(Cytopathic effect; CPE)가 90% 이상 관찰되었을 때 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 상기 바이러스 상층액에 불활화제로서 3% 바이너리에틸렌이민(Binaryethyleneimine)을 첨가하여 37에서 24시간동안 불활화하고 중화제(1N Sodium thiosulfate)로 BEI를 중화하였다. 폴리에틸렌글리콜 6000을 7.5% 처리한 후에 고속원심분리(10000g x 30분)하여 펠렛을 수확하였고 이를 완충용액으로 현탁하여 초고속원심분리(110,000g x 4시간)를 실시한 다음, 펠렛에 50mM Tris 완충용액을 1 ml 넣고 냉장 온도에서 16시간동안 방치한 다음에 현탁하여 미리 만들어놓은 수크로즈 밀도구배 튜브에 넣고서 초고속원심분리(110,000g x 4시간)를 실시하였다. 원심분리 튜브의 아랫부분부터 1 ml씩 분획을 회수하여 259nm에서의 흡광도를 확인하여 146S 형태의 존재를 확인하였다. When the BHK21 cells were cultured in order to obtain the foot-and-mouth disease virus whole particles, the foot-and-mouth disease virus (O-type domestic jinchu strain GenBank No. KX162590, Asian type 1 Shamir strain GenBank No. JF739177) Muliplicity of Infection). Thereafter, when the cytopathic effect (CPE) was observed at 90% or more, the supernatant was recovered by centrifugation. 3% Binary ethyleneimine was added as an inactivating agent to the virus supernatant, and the cells were inactivated at 37 for 24 hours and the BEI was neutralized with 1N sodium thiosulfate. The pellet was harvested by high-speed centrifugation (10,000 g × 30 min) after 7.5% treatment of polyethylene glycol 6000, suspended in buffer solution and subjected to ultra-high-speed centrifugation (110,000 g × 4 hours). 50 mM Tris buffer solution ml, left at a refrigeration temperature for 16 hours, suspended in a sucrose density gradient tube, and subjected to ultrafast centrifugation (110,000
또한, 메리알 백신(O 3039 + O1 Manisa)에서 항원을 추출하기 위하여 상업용 백신에 클로로포름을 동량으로 혼합하고 4도에서 15분간 교반한 다음, 5000g 에서 5분간 원심분리를 하여 수용성 분획을 획득하였다. 여기에서 다시 초고속원심분리(110000g x 4시간)를 실시하여 펠렛을 획득한 후에 다시 50mM Tris 완충용액을 1 ml 넣고 냉장온도에서 16시간동안 방치한 다음에 현탁하여 미리 만들어놓은 수크로즈 밀도구배 튜브에 넣고서 초고속원심분리(110000g x 4시간)를 실시하였다. 원심분리 튜브의 아랫부분부터 1 ml씩 분획을 회수하여 259nm에서의 흡광도를 확인하여 146S 형태의 존재를 확인하였다.In order to extract the antigen from Maryall's vaccine (O 3039 + O1 Manisa), the same amount of chloroform was mixed with the commercial vaccine, and the mixture was stirred at 4 ° C for 15 minutes and then centrifuged at 5000g for 5 minutes to obtain a water-soluble fraction. The pellet was again subjected to ultra-high-speed centrifugation (110000
또한, 구제역바이러스 입자가 56도에서 1시간 가열할 경우에는 분해된다는 기존 보고에 따라서 상기에서 획득한 구제역바이러스 완전입자에 열처리(56℃, 1 시간)하여 분해산물을 획득하였다. In addition, according to the previous reports that the foot-and-mouth disease virus particles were decomposed when heated at 56 ° C for 1 hour, the foot-and-mouth disease virus particles obtained above were heat-treated (56 ° C, 1 hour) to obtain degradation products.
상기에서 획득한 완전입자와 분해산물을 고속액체크로마토그래피법으로 겔 컬럼에 적용한 결과를 도 1a 내지 1c에 나타내었다.The results of application of the above-obtained complete particles and degradation products to gel columns by high performance liquid chromatography are shown in Figs. 1A to 1C.
도 1a 내지 1c에 나타낸 바와 같이, O형 및 Asia 1형 구제역바이러스의 완전입자는13분에서 피크분획이 확인된 반면에 열처리하여 획득한 분해산물에서는 18분에서 피크분획이 확인되었다.As shown in Figs. 1A to 1C, peak fractions were observed at 13 minutes for the whole particles of O type and Asia 1 type FMD virus, while peak fractions were observed at 18 minutes for degradation products obtained by heat treatment.
실시예 2. 구제역바이러스 완전입자 함량에 따른 크로마토그램 면적비교 Example 2. Chromatogram area comparison according to the total particle content of foot-and-mouth disease virus
상기 메리알 백신에서 획득한 구제역바이러스 완전입자를 완충용액으로 단계희석한 다음에 본 발명의 고속액체크로마토그래피법을 적용하여 해당분획의 피크 면적 변화를 비교하였다.After the foot-and-mouth disease virus whole particles obtained from the Maryall vaccine were stepwise diluted with a buffer solution, the peak area change of the fractions was compared by applying the high performance liquid chromatography method of the present invention.
구체적으로 상기에서 획득한 메리알 백신을 Tris 완충용액으로 2진희석한 다음에 수크로즈 밀도구배 튜브에 넣고서 초고속원심분리(110,000g x 4시간)를 실시하였고 완전입자 분획을 회수하여 본 발명의 고속액체크로마토그래피법을 적용한 다음, 구제역바이러스 완전입자 분획의 피크 면적 변화를 관찰하였고 그 결과를 도 2에 나타내었다.Specifically, the Maryall vaccine obtained above was binary diluted with Tris buffer, and then put into a sucrose density gradient tube to perform ultrahigh-speed centrifugation (110,000
도 2a에 나타낸 바와 같이, 구제역바이러스의 완전입자의 농도가 높아질수록 해당분획의 피크 면적값이 비례적으로 높아졌음을 확인할 수 있었고 또한, 도 2b에서와 같이 수크로즈 밀도구배 초고속원심분리 후에 분획별로 흡광도를 측정한 결과와 본 발명의 고속액체크로마토그래피법으로 면적값 간의 상관관계 r2값이 99.75%로 아주 높게 나타났기 때문에 본 발명의 고속액체크로마토그래피법을 적용하면 구제역바이러스의 완전입자 함량을 정량적으로 측정할 수 있음을 확인하였다. As shown in FIG. 2A, it was confirmed that the peak area value of the fractions was increased proportionally as the concentration of whole particles of the foot-and-mouth disease virus was increased. Also, as shown in FIG. 2B, after the sucrose density gradient ultra- Since the correlation r 2 value between the result of measurement of the absorbance and the area value by the high-performance liquid chromatography of the present invention is very high as 99.75%, when the high-performance liquid chromatography method of the present invention is applied, the total particle content of foot- As shown in Fig.
Claims (5)
(a) 바이러스 샘플을 수득하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계의 샘플을 고속액체크로마토그래피 시스템에 적용하여 고속액체크로마토그래피 프로파일을 수득하는 단계.
A method for quantifying foot-and-mouth disease virus (FMDV) particles comprising the steps of:
(a) obtaining a virus sample; And
(b) applying the sample of step (a) to a high performance liquid chromatography system to obtain a high performance liquid chromatography profile.
상기 구제역 바이러스 입자는 완전 입자 형태(146S) 또는 분해 입자 형태(12S)인 것을 특징으로 하는 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the foot-and-mouth disease virus particle is a complete particle form (146S) or a degraded particle form (12S).
The method according to claim 1, wherein said foot-and-mouth disease virus (FMDV) is a domestic isolate.
4. The method according to claim 3, wherein the serotype of foot-and-mouth disease virus is at least one serotype selected from the group consisting of O, A, Asia 1, C, SAT 1, SAT 2 and SAT 3.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020170094662A KR20190011941A (en) | 2017-07-26 | 2017-07-26 | Method for quantifying foot-and-mouth disease virus particles using High Performance Liquid Chromatography |
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| KR20190011941A true KR20190011941A (en) | 2019-02-08 |
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ID=65365240
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| KR (1) | KR20190011941A (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109142727A (en) * | 2018-10-10 | 2019-01-04 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | A kind of the visualization quick detection kit and its application of O-shaped antibodies against foot-and-mouth disease virus |
| KR20200131560A (en) * | 2019-05-14 | 2020-11-24 | 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장) | Novel Method for producing foot-and-mouth disease vaccine antigen |
-
2017
- 2017-07-26 KR KR1020170094662A patent/KR20190011941A/en unknown
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