KR20190010490A - Method for large production of extracellular vesicles with bioreactor-perfusion system and system therefore - Google Patents

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Abstract

The present invention aims to improve or enhance the secretion amount of extracellular endoplasmic reticulum using a cell culture apparatus, provides a method capable of inducing efficient secretion of extracellular endoplasmic reticulum by using a perfusion bioreactor and uses a perfusion culture method. The perfusion culture method according to the present invention has an effect of continuously obtaining a cell-derived material while allowing a cell culture fluid to flow through the cell to help the cell proliferation. In addition, since the cells cultured through the perfusion culture method are continuously subjected to metabolism exchange, the cells proliferate actively and since the formation mechanism of the extracellular endoplasmic reticulum also becomes active, there is an advantage that the extracellular endoplasmic reticulum is efficiently secreted.

Description

관류식 바이오 리엑터를 사용한 세포밖 소포체 분비량 향상 방법 및 이를 위한 시스템{Method for large production of extracellular vesicles with bioreactor-perfusion system and system therefore}TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for enhancing secretion of extracellular vesicles using a perfusion-type bioreactor,

본 발명은 세포 배양 장치를 이용한 세포 유래 세포밖 소포체의 분비량을 향상 혹은 증진시키기 위한 것으로, 좀 더 구체적으로는, 관류식 바이오 리엑터 장치를 사용하여 세포밖 소포체의 효율적인 분비를 유도할 수 있는 방법과 이에 사용되는 관류식 바이오 리엑터 장치 및 시스템에 관한 것이다.The present invention relates to a method for enhancing or enhancing the secretion amount of extracellular endoplasmic reticulum by using a cell culture apparatus, and more particularly, to a method for inducing efficient secretion of extracellular endoplasmic reticulum by using a perfusion type bioreactor device To a perfusion-based bioreactor device and system used therefor.

세포밖 소포체(extracellular vesicles)에는 엑소좀(exosomes) 또는 마이크로베지클(microvesicles) 등이 포함되며, 그 크기는 약 50 ~ 1000 nm 정도이다. 또한, 세포에서 세포막으로부터 자연적으로 유리되고, 세포막의 구조인 인지질 이중막(phospholipid bilayer) 형태를 가지며, mRNA, DNA, 단백질 등의 세포질 내 성분을 함유한다.Extracellular vesicles include exosomes or microvesicles and are about 50-1000 nm in size. It also has a phospholipid bilayer structure, which is naturally released from the cell membrane in the cell, which is the structure of the cell membrane, and contains intracellular components such as mRNA, DNA, and protein.

이러한 세포밖 소포체는 물질대사, 대사물질의 운송, 효소의 저장, 화학 반응 등을 위한 세포의 기본 도구이며, 세포들 사이에서 mRNA, miRNA 또는 단백질 등을 전달함으로써 세포간 신호 전달의 매개 역할을 수행한다. 세포밖 소포체의 경우에는 전달 효율이 높고, 전달하고자 하는 물질이 외부 환경으로부터 잘 보호된다는 장점 때문에 생물학적 실험에서 널리 활용되고 있다. 특히, 줄기세포 유래 세포밖 소포체의 경우에는 질병 치료, 세포 증식, 상처 재생 등에 효과가 있으며, 이외에도 질병 진단이나 약물 전달 등의 연구에도 널리 활용되고 있다.These extracellular endoplasmic reticulum is the basic cell tool for metabolism, transport of metabolites, storage of enzymes, chemical reactions, etc., and mediates intercellular signaling by transferring mRNA, miRNA or protein between cells. do. The extracellular endoplasmic reticulum is widely used in biological experiments because of its high delivery efficiency and the fact that the substance to be delivered is well protected from the external environment. In particular, stem cell-derived extracellular endoplasmic reticulum is effective for disease treatment, cell proliferation and wound regeneration, and is also widely used for disease diagnosis and drug delivery.

그러나 기존의 세포 배양 과정 중에서는 소량의 세포밖 소포체가 얻어지므로, 그 활용성 가능성과 유용성이 떨어지는 단점이 존재한다. 비록 세포 배양액에서 분리되는 세포밖 소포체는 분리 방법에 따라 얻어지는 세포밖 소포체의 양이 변화되지만, 세포 배양액에 존재하는 세포밖 소포체의 양 자체가 적어 효율적인 분리 방법이라도 많은 양의 세포밖 소포체를 얻기 쉽지 않은 문제점이 존재한다. 따라서, 세포 배양시 세포밖 소포체의 양을 증가시키기 위해서는 기존의 세포 배양 방법이 아닌 다른 방식의 세포 배양 방법과 장치 및 시스템이 요구된다.However, since a small amount of extracellular endoplasmic reticulum is obtained in the conventional cell culture process, there is a disadvantage that the applicability and usability are poor. Although the amount of extracellular endoplasmic reticulum that is obtained by the separation method changes in the extracellular endoplasmic reticulum isolated from the cell culture medium, since the amount of the extracellular endoplasmic reticulum present in the cell culture fluid is small, it is easy to obtain a large amount of extracellular endoplasmic reticulum There is a problem. Therefore, in order to increase the amount of the extracellular endoplasmic reticulum in the cell culture, a cell culture method, an apparatus and a system other than the conventional cell culture method are required.

바이오 리엑터(bio-reactor)는 세포 배양에 널리 사용되어 왔으며, 특히 항체 혹은 치료용 단백질을 생산하기 위한 동물 세포의 대량 배양에 많이 사용된다. 배양 접시를 이용한 세포 배양법과 비교하면, 바이오 리엑터에서의 세포 배양은 오랫동안 배양할 수 있다. Bio-reactors have been used extensively in cell culture and are especially used for the mass culture of animal cells to produce antibodies or therapeutic proteins. Compared with the cell culture method using the culture dish, the cell culture in the bioreactor can be cultured for a long time.

배양액이 바이오 리엑터 내에서 지속적으로 흘러감에 따라, 세포는 전단 응력(shear stress)을 받게 된다. 이러한 전단 응력은 세포의 세포 내 신호 전달(signal pathway)과 유전자 발현(gene expression)에 영향을 주게 되고, 이러한 자극들로 인해 세포의 증식, 세포 이동(cell migration), 혹은 DNA 합성 증진 등에 영향을 주게 된다. As the culture fluid continues to flow in the bioreactor, the cells undergo shear stress. These shear stresses affect the cell's signal pathway and gene expression, and these stimuli can affect cell proliferation, cell migration, or DNA synthesis. .

따라서, 본 발명자들은 기존의 배양 접시를 이용한 세포 배양에서의 세포 밖 소포체 생산시 일어날 수 있는 단점을 해소하기 위하여, 바이오 리엑터를 이용한 세포 밖 소포체 생산 방법과 장치 및 시스템을 창안하였으며, 이러한 바이오 리엑터 장치와 최적의 반응기 운전 조건으로 제어함으로써, 기존 배양법에 비해 세포 밖 소포체가 보다 많은 양으로 얻어지는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다. Accordingly, the present inventors have developed a method, an apparatus and a system for producing an extracellular endoplasmic reticulum using a bioreactor in order to overcome the disadvantages that may occur in the production of extracellular endoplasmic reticulum in cell culture using a conventional culture dish, And optimal reactor operating conditions, the present inventors have completed the present invention by confirming that the extracellular endoplasmic reticulum can be obtained in a larger amount than the conventional culture method.

미국 등록특허 제5081035호 (1992년 1월 14일 공개)U. S. Patent No. 5081035 (published Jan. 14, 1992) 미국 공개특허 제2011-0212493호 (2011년 9월 1일 공개)U.S. Published Patent Application No. 2011-0212493 (published on September 1, 2011)

앞서 발명의 배경이 되는 기술에서 살펴본 바와 같이, 기존의 세포 배양 접시를 이용한 세포 배양에서는 소량의 세포밖 소포체가 얻어지므로, 그 유용성 및 활용 가능성이 떨어지며, 세포 배양액에서 분리되는 세포밖 소포체는 분리 방법에 따라 소포체의 양이 변화되기로 하지만, 세포 배양액에 존재하는 세포밖 소포체의 절대량 자체가 적어 아무리 효율적인 분리 방법이라 하더라도 많은 양을 얻기는 쉽지 않다. As described in the Background of the Invention, since the cell culture using the conventional cell culture dish produces a small amount of extracellular endoplasmic reticulum, its usefulness and applicability are inferior. The extracellular endoplasmic reticulum isolated from the cell culture medium is separated , The amount of the endoplasmic reticulum is changed. However, since the absolute amount of the extracellular endoplasmic reticulum present in the cell culture fluid is small, it is not easy to obtain a large amount even though it is an efficient separation method.

본 발명에서는 이러한 종래 기술의 문제점을 해결하고, 세포 배양시 세포밖 소포체의 양을 증가시키기 위해, 바이오 리엑터의 관류식 배양법을 도입하여 세포밖 소포체의 생산량을 증가시켰으며, 다양한 분야에 널리 유용하게 사용되고 있는 세포밖 소포체의 연구에 기여하고자 한다. The present invention solves the problems of the prior art and increases the amount of the extracellular endoplasmic reticulum by introducing a perfusion culture method of the bioreactor to increase the amount of the extracellular endoplasmic reticulum during cell culture, And to contribute to the study of the extracellular endoplasmic reticulum being used.

또한, 바이오 리엑터의 관류식 배양법을 통해 세포밖 소포체의 생산량을 효과적으로 증가시키기 위한 최적의 반응 조건 혹은 반응기 운전 조건을 제공하고자 한다. In addition, we intend to provide optimal reaction conditions or reactor operating conditions for effectively increasing the production of extracellular endoplasmic reticulum through a perfusion culture method of a bioreactor.

앞서 살펴본 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한, 본 발명의 일 실시 형태로, 관류식 바이오 리엑터 장치를 사용한 세포밖 소포체 분비량 향상 방법을 들 수 있는데, 관류식 바이오 리엑터 장치의 내부에 세포를 파종시키는 단계; 세포 배양액 저장소로부터 세포 배양액을 소정의 속도로 연속적으로 공급하는 단계; 및 소정의 시간동안 관류식 바이오 리엑터 장치 내에서 전단응력을 0 초과 0.5 dyne/㎠ 이하로 유지하여 세포를 배양시키는 단계;를 포함한다. In order to solve the above-mentioned problems of the prior art, one embodiment of the present invention is a method for improving the secretion amount of the extracellular endoplasmic reticulum using a perfusion-type bioreactor device. The step of seeding the cells in the perfusion type bioreactor ; Continuously supplying the cell culture liquid from the cell culture liquid reservoir at a predetermined rate; And maintaining the shear stress within the range of more than 0 to 0.5 dyne / cm < 2 > in the perfusion type bioreactor device for a predetermined period of time.

이때 상기 소정 속도는 바람직하게는 0 초과 1L/min 이하일 수 있으며, 더욱 바림직하게는 0 초과 5 ml/min 이하일 수 있다.At this time, the predetermined speed may be preferably more than 0 and less than 1 L / min, more preferably more than 0 and less than 5 ml / min.

또한, 상기 소정 시간은, 1 내지 15일인 것이 바람직하다.It is preferable that the predetermined time is 1 to 15 days.

본 발명의 다른 실시 형태인 관류식 바이오 리엑터 장치는, 세포가 파종되고, 증식되는 공간부가 형성된 하단 본체부; 상기 하단 본체부와 결합되고, 세포 배양액의 주입구와 배출구가 형성된 상단 본체부; 및 상기 하단 본체부와 상단 본체부를 밀착시켜 상기 세포 배양액의 유출을 방지하는 가스킷;을 포함하고, 상기 하단 본체부와 상단 본체부는 나사 결합을 통해 연결될 수 있다.A perfusion type bioreactor device according to another embodiment of the present invention includes: a lower main body portion having a space portion in which cells are sown and multiplied; An upper main body coupled to the lower main body and having an inlet and an outlet for a cell culture liquid; And a gasket which closely contacts the lower main body part and the upper main body part to prevent leakage of the cell culture liquid, and the lower main body part and the upper main body part may be connected through a screw connection.

상기 공간부의 저면 기재(substrate)는, 세포의 부착과 분화를 증진시킬 수 있도록 binding molecule이 코팅된 것이 바람직하고, 상기 공간부의 높이는 100㎛ ~ 10㎜인 것이 바람직하다.Preferably, the bottom substrate of the space part is coated with a binding molecule so as to promote attachment and differentiation of cells, and the height of the space part is preferably 100 μm to 10 mm.

본 발명의 또 다른 실시 형태로, 상기 관류식 바이오 리엑터 장치; 및 세포 배양액 저장소;를 포함하고, 상기 바이오 리엑터 장치와 세포 배양액 저장소는 관을 통해 연통되어, 세포 배양액 저장소에 보관된 세포 배양액은 튜브연동 펌프를 통해 관류식 바이오 리엑터로 공급되는 관류식 바이오 리엑터 시스템을 들 수 있다.In another embodiment of the present invention, the perfusion type bioreactor device; And a cell culture solution reservoir, wherein the bioreactor device and the cell culture solution reservoir are communicated through a tube, and the cell culture solution stored in the cell culture solution reservoir is supplied to a perfusion type bioreactor through a tube peristaltic pump, .

이러한 관류식 바이오 리엑터 시스템에 사용되는 관의 직경은 0.5 ~ 10㎜인 것이 바람직하고, 관류식 바이오 리엑터의 배출구 이후에 세포 배양액의 일부를 채취할 수 있는 취출부가 더 포함될 수 있다.The diameter of the tube used in the perfusion type bioreactor system is preferably 0.5 to 10 mm, and the extraction part capable of collecting a part of the cell culture liquid after the outlet of the perfusion type bioreactor may further be included.

본 발명에서는 이러한 종래의 기술의 문제점을 해결하기 위해, 기존의 다양한 바이오 리엑터들 중에서도 특별히 관류식 배양법(perfusion culture)을 사용하였다. 이러한 관류식 배양법은 바이오 리엑터를 이용한 세포 배양법들 중 하나로, 세포 배양액을 세포에 흘려주어 세포의 증식에 도움을 주면서, 세포로부터 유래된 물질을 지속적으로 얻을 수 있는 효과를 갖는다.In the present invention, a perfusion culture is specifically used among various conventional bio reactors to solve the problems of the prior art. Such a perfusion-type culture method is one of cell culture methods using a bioreactor. It has an effect of continuously obtaining a cell-derived material while allowing the cell culture fluid to flow to the cell to help the cell proliferation.

또한, 이렇게 관류식 배양법을 통해 배양된 세포는 물질대사 교환이 지속적으로 이루어지므로, 세포가 활발하게 증식되며, 이로 인해 세포 밖 소포체의 생성 기작 역시 활발하게 일어나므로, 세포 밖 소포체가 효율적으로 분비된다. In addition, since the cells cultured through the perfusion-type culture method are continuously subjected to the metabolic exchange, the cells are actively proliferated, and thereby, the formation mechanism of the extracellular endoplasmic reticulum is actively generated. Thus, the extracellular endoplasmic reticulum is efficiently secreted .

본 발명에 따른 세포밖 소포체의 분비량 증진을 위한 방법은 세포에 지속적으로 세포 배양액을 공급할 수 있어, 기존의 세포 배양 방법을 통한 세포밖 소포체의 수득률보다 높은 세포밖 소포체의 수득률을 얻을 수 있으며, 세포밖 소포체를 사용하는 다양한 연구에 광범위하게 활용될 수 있다.The method for increasing the secretion amount of the extracellular endoplasmic reticulum according to the present invention can continuously supply the cell culture medium to the cells, and the yield of the extracellular endoplasmic reticulum can be obtained higher than that of the extracellular endoplasmic reticulum through the existing cell culture method, Can be widely used in various studies using outer envelope.

특히 본 발명은, 세포 배양과정 중에서, 세포의 유전자 발현에 영향을 주어 세포 내의 유전자뿐만 아니라 단백질의 발현량도 조절될 수 있다. 세포에 이러한 영향은 세포에서 유래되는 세포밖 소포체가 갖는 유전자량 뿐만 아니라 막단백질 등의 단백질 양에 영향을 준다. 세포밖 소포체를 이용한 약물 전달 기술에 있어서, 세포밖 소포체에 정확한 유전자가 포함되는 것도 중요하지만 그 양 역시 중요하다.In particular, the present invention affects gene expression of a cell during a cell culture process, so that not only a gene in a cell but also an expression amount of a protein can be regulated. This effect on the cell affects not only the gene amount of the cell-derived extracellular endoplasmic reticulum but also the amount of protein such as membrane protein. In drug delivery technology using extracellular endoplasmic reticulum, it is also important that the extracellular endoplasmic reticulum contain the correct gene, but the amount is also important.

본 발명의 방법을 이용하여 분비된 세포밖 소포체는 특정 유전자와 단백질이 다량 포함되도록 조절 가능하기 때문에 약물 전달 기술에 여러 가지 이점을 줄 수 있다. The extracellular endoplasmic reticulum secreted by the method of the present invention can be adjusted to include a large amount of specific genes and proteins, and thus can provide various advantages to drug delivery technology.

도 1은 본 발명의 관류식 배양법에 사용되는 바이오 리엑터의 상단 본체부를 도시한 그림이다.
도 2는, 본 발명의 관류식 배양법에 사용되는 바이오 리엑터의 하단 본체부를 도시한 그림이다.
도 3은 본 발명의 관류식 배양법에 사용되는 바이오 리엑터 시스템을 도식적으로 나타낸 그림이다.
도 4는 본 발명에 다른 방법으로 얻어진 세포밖 소포체(Bioreactor EV)와 기존의 종래의 기술(세포 배양 접시의 배양)로 얻어진 세포밖 소포체(Control EV)에 대해서 wesetern blot 방법을 통해 얻어진 특정 마커의 밴드를 보여주는 사진이다(cell lysate는 세포를 용해한 positive control을 의미).
도 5는 본 발명에 따른 세포밖 소포체(bioreactor)와 기존의 세포 배양 접시를 통해 얻어진 세포밖 소포체(control)의 크기 분포를 측정한 결과이다.
도 6a와 6b는 각각 전단응력의 변화(a) 및 유량의 변화(b)에 따른 본 발명의 세포밖 소포체의 수득량의 변화를 측정한 결과이다.
도 7은 단위 세포당 본 발명에 따른 세포밖 소포체(bioreactor)와 기존의 세포 배양 접시를 통해 얻어진 세포밖 소포체(control)의 분비량 차이를 비교한 결과이다.
도 8은 본 발명에 따른 세포밖 소포체(bioreactor)와 기존의 세포 배양 접시를 통해 얻어진 세포밖 소포체(control) 내 RNA 양을 비교한 결과이다.
도 9는 ionophore 농도에 따른 세포 내 칼슘 농도의 양을 비교한 결과이다.
도 10은 ionophore 농도에 따른 세포밖 소포체의 분비량을 비교한 결과이다.
도 11은 전단응력의 변화에 따른 세포 내 칼슘 농도의 양을 비교한 결과이다.
도 12는 전단응력의 변화에 따른 세포밖 소포체의 분비량을 측정한 결과이다.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a view showing an upper main body portion of a bioreactor used in a perfusion-type culture method of the present invention. FIG.
FIG. 2 is a view showing a lower main body portion of a bioreactor used in the perfusion-type culture method of the present invention. FIG.
FIG. 3 is a diagram schematically showing a bioreactor system used in the perfusion-type culture method of the present invention.
4 is a graph showing the relationship between the extracellular endoplasmic reticulum (Bioreactor EV) obtained by another method according to the present invention and the extracellular endoplasmic reticulum (Control EV) obtained by the existing conventional technique (cell culture dish culture) (Cell lysate is a positive control that dissolves cells).
FIG. 5 shows the results of measurement of the size distribution of the extracellular endoplasmic reticulum (ERC) obtained from the extracellular bioreactor and the conventional cell culture dish according to the present invention.
Figs. 6A and 6B are the results of measuring the change in the gain of the extracellular endoplasmic reticulum of the present invention according to the change (a) of the shear stress and the change (b) of the flow rate, respectively.
FIG. 7 shows the results of comparing the secretion amounts of the extracellular endoplasmic reticulum (ER) according to the present invention per unit cell and the extracellular endoplasmic reticulum (ER) obtained through a conventional cell culture dish.
FIG. 8 shows the results of a comparison between the amount of RNA in the extracellular endoplasmic reticulum obtained through the existing cell culture dish with the bioreactor according to the present invention.
FIG. 9 shows a result of comparing the intracellular calcium concentration with the ionophore concentration.
FIG. 10 shows the results of comparing the secretion amount of extracellular endoplasmic reticulum with ionophore concentration.
11 shows the results of comparing the amounts of intracellular calcium concentrations with changes in shear stress.
12 shows the results of measurement of secretion amount of extracellular endoplasmic reticulum according to the change of shear stress.

이하 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에서 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정하여 해석되어서는 아니 되며, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 한다. Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the drawings. Prior to the description, terms and words used in the present specification and claims should not be construed as limited to ordinary or dictionary meanings and should be construed in accordance with the technical concept of the present invention.

본 명세서 전반에 걸쳐서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. Throughout this specification, when a section is referred to as "including " an element, it is to be understood that this section may include other elements,

각 단계들은 문맥상 명백하게 특정 순서를 기재하지 않는 이상 명기된 순서와 다르게 실시될 수 있다. 즉, 각 단계들은 명기된 순서와 동일하게 실시될 수도 있고 실질적으로 동시에 실시될 수도 있으며 반대의 순서대로 실시될 수도 있다. Each step may be performed differently than the order specified unless explicitly stated in the context of the specific order. That is, each of the steps may be performed in the same order as described, or may be performed substantially concurrently or in the reverse order.

본 발명에 따른 관류식 바이오 리엑터를 사용하여 세포밖 소포체 생산량을 증진시키는 방법은, 관류식 바이오 리엑터 장치의 내부에 세포를 파종시키는 단계; 세포 배양액 저장소로부터 세포 배양액을 소정의 속도로 연속적으로 공급하는 단계; 소정의 시간동안 관류식 바이오 리엑터 장치 내에서 세포를 배양시키는 단계; 및 세포 배양액으로부터 세포밖 소포체를 분리하는 단계;를 포함할 수 있다.The method for enhancing the production of extracellular endoplasmic reticulum by using the peristaltic bioreactor according to the present invention comprises the steps of: seeding cells inside a perfusion type bioreactor; Continuously supplying the cell culture liquid from the cell culture liquid reservoir at a predetermined rate; Culturing the cells in a perfusion-based bioreactor device for a predetermined period of time; And separating the extracellular endoplasmic reticulum from the cell culture.

세포를 파종시키는 단계에서, 바이오 리엑터의 내부 공간부에는 약 100~100,000 cells/㎠의 세포를 파종할 수 있으며, 이러한 세포는 37℃, 50%의 humidity를 유지해 주는 인큐베이터 내에서 미리 자란 것일 수 있다. In the step of seeding the cells, about 100 to 100,000 cells / cm 2 of cells can be sown in the inner space of the bioreactor, and these cells may be pre-grown in an incubator maintaining a humidity of 37% at 50% .

또한, 세포를 배양시키는 단계에서는, 소정의 시간동안 관류식 바이오 리엑터 장치 내에서 전단응력을 0 초과 0.5 dyne/㎠ 이하로 유지하여 세포를 배양시킬 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 세포의 종류에 따라 전단응력의 범위를 달리할 수 있다. 구체적으로, 줄기세포와 달리 보다 강한 전단응력을 견디는 세포를 배양하는 경우 전단응력을 0.5 dyne/㎠ 초과로 유지하여 배양시킬 수 있다. 바람직하게는 전단응력을 0.026 ~ 0.1 dyne/㎠로 유지하여 세포를 배양시킬 수 있으며, 더욱 바람직하게는 전단응력을 0.053 dyne/㎠로 유지하여 세포를 배양시킬 수 있다. 전단응력이 0.026 dyne/㎠ 미만인 경우, 전단응력이 세포에 주는 영향이 미미하여 세포밖 소포체의 생산량이 적으며, 0.1 dyne/㎠을 초과하는 경우, 세포의 성장이 느려지거나, 세포가 죽게 되어 생산되는 세포밖 소포체의 양이 감소하며 질이 좋지 않다.In addition, in the step of culturing the cells, the cells may be cultured by maintaining the shear stress at 0 to 0.5 dyne / cm 2 or less in the perfusion-type bioreactor device for a predetermined period of time, but the present invention is not limited thereto. The range of shear stress can be varied. Specifically, unlike stem cells, when culturing cells capable of enduring stronger shear stress, the shear stress can be maintained at more than 0.5 dyne / cm 2. Preferably, the shear stress can be maintained at 0.026 to 0.1 dyne / cm 2 to cultivate the cells, and more preferably, the shear stress can be maintained at 0.053 dyne / cm 2 to cultivate the cells. If the shear stress is less than 0.026 dyne / cm 2, the effect of the shear stress on the cells is insignificant and the production of the extracellular endoplasmic reticulum is low. If the shear stress is more than 0.1 dyne / cm 2, the cell growth is slowed, The amount of extracellular ER decreases and quality is poor.

상기 소정의 속도는 관류식 바이오 리엑터의 크기에 따라 달라 질 수 있으며, 구체적으로 0 초과 1 L/min 이하 일 수 있고, 바람직하게는 0 초과 5 ml/min 이하일 수 있다. 세포 배양액을 5 ml/min 초과의 속도로 공급하는 경우, 세포에게 지나친 스트레스를 주게 되어 세포밖 소포체의 생산량과 질이 저하 된다.The predetermined rate may vary depending on the size of the perfusion-type bioreactor, and may be specifically greater than 0 and less than or equal to 1 L / min, preferably greater than 0 and less than or equal to 5 ml / min. When the cell culture medium is supplied at a rate exceeding 5 ml / min, excessive stress is given to the cells, and the production and quality of the extracellular endoplasmic reticulum are lowered.

또한, 상기 소정 시간은 배양하는 세포의 종류에 따라 달라 질 수 있다. 구체적으로 1 내지 15일(day)일 수 있으며, 바람직하게는 48 내지 84 시간일 수 있다. 세포 배양시간이 1일 미만인 경우, 세포밖 소포체를 생산할 만큼 세포가 충분히 배양되지 않을 수 있으며, 15일을 초과인 경우, 세포가 지나치게 성숙하여 생산되는 세포밖 소포체의 질이 저하 된다.In addition, the predetermined time may vary depending on the type of cells to be cultured. Specifically, it may be 1 to 15 days (day), preferably 48 to 84 hours. If the cell incubation time is less than 1 day, the cells may not be cultured enough to produce extracellular endoplasmic reticulum. If the period is over 15 days, the cell is over-matured and the quality of the extracellular endoplasmic reticulum is lowered.

본 발명의 관류식 바이오 리엑터는, 세포가 부착되어 증식되는 하단 본체부;와 바이오 리엑터에 세포 배양액을 주입하거나 배출하기 위한 주입구와 배출구를 포함하는 상단 본체부;를 포함할 수 있다.The perfusion type bioreactor according to the present invention may include a lower main body part in which cells are attached and proliferated, and an upper main body part including an inlet and an outlet for injecting or discharging a cell culture liquid into the bioreactor.

또한, 상기 하단 본체부와 상단 본체부는, 주입구와 배출구를 통해 관류식 바이오 리엑터로 공급되거나 배출되는 세포 배양액이 반응기 외부로 유출되는 것을 방지하기 위해서, 상단 본체부와 하단 본체부 사이에 가스킷(gasket) 등과 같은 밀폐 부재를 더 포함할 수 있다.The lower main body and the upper main body are connected to each other by a gasket (not shown) between the upper main body and the lower main body in order to prevent the cell culture liquid supplied or discharged to the perfusion type bioreactor through the injection port and the discharge port from flowing out of the reactor. ), And the like.

이러한 관류식 바이오 리엑터 외에도, 중공사 바이오 리엑터(hollow fiber bioreactor), 막형 바이오 리엑터(membrane bioreactor), 유동상 바이오 리엑터(fluidized bed bioreactor), 평판형 바이오 리엑터(flat plate bioreactor), 회전식 바이오 리엑터(rotary bioreactor) 또는 교반 통 바이오 리엑터(stirred-tank type bioreactor) 등이 본 발명에 사용되어 세포밖 소포체 생산량을 증진시킬 수 있다.In addition to such perfusion type bioreactors, hollow fiber bioreactors, membrane bioreactors, fluidized bed bioreactors, flat plate bioreactors, rotary bioreactors, a bioreactor or a stirred-tank type bioreactor may be used in the present invention to enhance the production of extracellular endoplasmic reticulum.

또한, 관류식 바이오 리엑터의 외부에는, 세포 배양액을 보관하는 세포배양액 저장소;와 이들을 연결하여 주는 관;이 추가로 더 구비될 수 있으며, 세포 배양액 저장소에 보관된 세포 배양액은 튜브연동 펌프를 통해 관류식 바이오 리엑터로 공급된다. In addition, a cell culture fluid reservoir for storing the cell culture fluid and a tube for connecting the cell culture fluid may further be provided outside the perfusion type bioreactor, and the cell culture fluid stored in the cell culture fluid reservoir may be passed through a tube peristaltic pump Type bioreactor.

본 발명에서 사용되는 관류식 바이오 리엑터 시스템에 포함되는 상기 관의 직경은 0.5 ~ 10㎜의 범위를 갖는 것이 바람직한데, 이는 공급되는 세포 배양액의 유속에 영향을 미치기 때문이다. 즉, 관의 직경이 0.5㎜ 보다 작을 경우에는 세포밖 소포체가 손상을 입을 가능성이 있고, 관의 직경이 10㎜ 보다 클 경우에는 본체부로 유입되는 세포 배양액의 속도를 제어하지 못하는 문제점이 존재한다. The diameter of the tube included in the perfusion type bioreactor system used in the present invention is preferably in the range of 0.5 to 10 mm because it affects the flow rate of the supplied cell culture liquid. That is, when the diameter of the tube is smaller than 0.5 mm, there is a possibility that the extracellular endoplasmic reticulum may be damaged, and when the diameter of the tube is larger than 10 mm, the speed of the cell culture fluid flowing into the body can not be controlled.

상기 세포는 포유류의 부착 세포를 사용할 수 있는데, 특별히 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서 언급하고 있는 세포밖 소포체는 세포 유래의 세포막 성분으로 이루어진 나노베지클로 세포의 세포막지질, 세포막단백질, 핵산 및 세포성분 등을 포함하며, 세포밖 소포체로 정의되는 크기인 약 50 ~ 1000nm의 베지클을 의미한다. The cell may be a mammalian adherent cell, but is not limited thereto. The extracellular endoplasmic reticulum referred to in the present invention includes cell membrane lipids, cell membrane proteins, nucleic acids and cell components of nano-beige claw cells composed of cell-derived cell membrane components, and has a size of about 50 to 1000 nm It means Bejjack.

본 발명에 따른 관류식 바이오 리엑터의 상단 본체부와 하단 본체부는 나사 결합을 통해서 연결될 수 있는데, 바람직하게는 손나사로 연결되면서 상단 본체부와 하단 본체부의 사이에 밀폐를 위한 가스킷이 더 포함될 수 있다.The upper body portion and the lower body portion of the perfusion type bio reactor according to the present invention may be connected to each other through a screw connection. Preferably, the gasket may further include a gasket for sealing between the upper body portion and the lower body portion.

또한, 세포 배양액 저장소, 본체부 및 이들을 연결하는 관은 연결 나사를 통해 연결될 수 있으며, 튜브연동 펌프(peristaltic pump)에 의해 배양액 저장소로 부터 공급되는 세포 배양액은 상기 관류식 바이오 리엑터의 내부로 일정 시간 동안 일정 속도로 지속적으로 공급될 수 있다.In addition, the cell culture fluid reservoir, the main body, and the tube connecting them can be connected through a connection screw. The cell culture fluid supplied from the culture fluid reservoir by a peristaltic pump is supplied to the inside of the perfusion type bioreactor for a predetermined time Lt; RTI ID = 0.0 > constant < / RTI >

하단 본체부에는 세포가 파종되고 증식될 수 있는 공간부가 존재하며, 이러한 공간부의 저면에 위치하는 기재는 유리(glass)로 이루어지거나, 유리를 포함할 수 있다.In the lower main body portion, there is a space portion in which cells can be seeded and proliferated, and the substrate located on the bottom surface of the space portion may be made of glass or may include glass.

이러한 공간부에 세포가 파종되기 전에, 상기 공간부의 저면 기재(substrate)는, gelatin, poly-L-lysine 또는 fibronectin 등 과 같은 binding molecule로 코팅되는 것이 바람직한데, 이는 기재(substrate)에 세포가 잘 고정되거나 붙을 수 있도록 하기 위함이다.Before the cells are seeded in such a space, the bottom substrate of the space is preferably coated with a binding molecule such as gelatin, poly-L-lysine or fibronectin, So that they can be fixed or adhered to each other.

이러한 기재(substrate)의 코팅은, 딥 코팅, 스핀 코팅 혹은 스프레이 코팅 등의 방법을 통해서 수행될 수 있는데, 스핀 코팅을 사용하는 것이 바람직한데, 신속하고 균일하게 코팅층을 형성할 수 있기 때문이다.The coating of such a substrate can be carried out by a method such as dip coating, spin coating or spray coating, and it is preferable to use spin coating because a coating layer can be formed quickly and uniformly.

상단 본체부와 하단 본체부 사이에 존재하는 본체부의 내부, 즉 공간부의 높이는 약 100㎛ ~ 10㎜일 수 있으며, 폭은 약 1 mm ~ 110 mm일 수 있다. 이러한 공간부의 높이 및 폭 제어를 통해, 세포주의 종류에 따라 가해지는 전단응력(shear stress)를 조절할 수 있는데, 전단응력으로 인한 세포에 가해지는 스트레스를 제어함으로써, 세포밖 소포체의 생산량을 증가시킬 수 있다.The height of the inside of the body portion, that is, the space portion, existing between the upper body portion and the lower body portion may be about 100 to 10 mm, and the width may be about 1 to 110 mm. By controlling the height and width of the space, it is possible to control the shear stress applied depending on the type of the cell line. By controlling the stress applied to the cell due to shear stress, it is possible to increase the production of extracellular endoplasmic reticulum have.

본 발명의 구현예에 따른 효과로, 배양액을 지속적으로 본체부에 공급하여 세포를 효율적으로 배양할 수 있는 장점을 들 수 있다.Advantageous effects of the embodiment of the present invention are that the cells can be efficiently cultured by continuously supplying the culture medium to the main body part.

이하에서는 본 발명의 기술적 특징을 구체적으로 살펴보기 위해 실시예와 도면을 참조하여 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명의 가장 바람직한 실시예에 불과할 뿐이며 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 발명의 출원 시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다. Hereinafter, the technical features of the present invention will be described in detail with reference to embodiments and drawings. It should be understood, however, that the present invention is not limited to the preferred embodiments of the present invention, and that various equivalents and modifications may be made without departing from the spirit and scope of the present invention. do.

[[ 실시예Example 1] 본 발명에 따른  1] According to the present invention 세포밖Extracellular 소포체의 생산 Production of endoplasmic reticulum

1-1. 본 발명에 따른 1-1. According to the invention 세포밖Extracellular 소포체의 생성 Creation of ER

먼저 본 발명에서 사용되는 관류식 바이오 리엑터는 세포 배양을 시작하기 전에 고압 증기 멸균기를 통해 멸균처리를 하고, 본체부 하단에 붙어 있는 유리면에 젤라틴 코팅을 한다. 세포(100 - 100,000 cells/㎠)를 5㎖의 세포 배양액에 현탁하여 유리면에 파종시킨 뒤 37℃의 온도로 유지되는 인큐베이터에서 약 12 ~ 24시간 동안 배양한다.First, the perfusion type bioreactor used in the present invention is sterilized through a high pressure steam sterilizer before starting cell culture, and gelatin coating is applied to the glass surface attached to the bottom of the body part. Cells (100 - 100,000 cells / cm 2) are suspended in 5 ml of cell culture medium, seeded on a glass surface, and cultured in an incubator maintained at 37 ° C for about 12 to 24 hours.

고압 증기 멸균기를 통해 멸균 처리한 본체부 상단부와 하단부를 나사로 연결하고 세포 배양액을 본체부에 가득 차도록 넣어준다. 세포 배양액 저장소의 관과 본체부를 연결한다. 세포 배양액 저장소에는 세포 배양액을 넣어둔다. 펌프는 세포에 지나친 스트레스(혹은 전단 응력)를 주지 않을 정도의 속도인 약 0.1 ml/min로 고정한 후, 본 장치를 연결하여 관류식 배양을 시작한다. 충분한 배양을 위해 약 48시간 동안 세포배양을 한 후, 본 장치에서 세포 배양액과 세포를 얻는다(도 3 참조).Connect the upper and lower parts of the sterilized main body through a high-pressure steam sterilizer with screws and allow the cell culture fluid to fill the body part. Connect the tube and body of the cell culture reservoir. Cell culture medium is put into cell culture reservoir. The pump is fixed at a rate of about 0.1 ml / min, which does not give excessive stress (or shear stress) to the cells, and then this device is connected to start perfusion culture. For sufficient culture, the cells are cultured for about 48 hours, and cell culture media and cells are obtained in this apparatus (see FIG. 3).

1-2. 1-2. 세포밖Extracellular 소포체의 수득 Obtain an endoplasmic reticulum

본 발명의 관류식 바이오 리엑터 장치 시스템의 취출부를 통해 얻어진 세포 배양액을 원심분리기에 넣고 200 x g-force로 5분, 1000 x g-force로 10분, 3000 x g-force로 20분 작동하여 세포와 세포 파괴물(cell debris)를 제거한 세포 배양액을 얻는다. 60㎖ 용량의 초원심분리 튜브(ultracelntrifuge tube)에 얻은 35㎖ 세포 배양액과 25㎖ PBS를 담는다. 이후 100,000 x g-force에서 2 시간 동안 초원심분리(ultracentrifugation)하였다. The cell culture solution obtained through the extraction part of the perfusion type bioreactor system of the present invention was put into a centrifuge and operated for 5 minutes at 200 x g-force, 10 minutes at 1000 x g-force, and 20 minutes at 3000 x g-force, And cell debris are removed to obtain a cell culture solution. Incubate the obtained 35 mL cell culture medium and 25 mL PBS in a 60 mL ultracentrifuge tube. Followed by ultracentrifugation at 100,000 x g-force for 2 hours.

얻어진 상층액은 버리고, 침전물을 4㎖의 PBS에 풀어 4㎖ 용량의 초원심분리 튜브에 담는다. 다시 100,000 x g-force에서 2시간 동안 초원심분리하였다. 이후 얻어진 상층액을 버리고, 침전물을 수득하였다. The resulting supernatant is discarded, and the precipitate is dissolved in 4 ml of PBS and placed in a 4 ml ultracentrifuge tube. And centrifuged again at 100,000 x g-force for 2 hours. The resulting supernatant was discarded, and a precipitate was obtained.

[[ 실시예Example 2]  2] 세포밖Extracellular 소포체의 분석  Analysis of endoplasmic reticulum

2-1. 2-1. 세포밖Extracellular 소포체의 특성 분석 Characterization of endoplasmic reticulum

실시에 1을 통해 얻어진, 바이오 리엑터에서의 세포 배양으로 분비된 소포체들이 세포밖 소포체 유무를 확인하기 위해 10㎍의 세포밖 소포체를 이용하여 western blot assay로 분석하였다. The endoplasmic reticulum secreted by the cell culture in the bioreactor obtained in Example 1 was analyzed by western blot assay using 10 μg of extracellular ER to confirm the presence of extracellular ER.

도 4의 측정결과의 위쪽의 밴드는 ER(endoplasmic reticulum) marker인 calnexin로, 세포에서만 관찰되고, 세포밖 소포체(bioreactor EV 및 control EV)에서는 관찰되지 않았다. 반면에 아래쪽의 밴드는 세포밖 소포체 마커인 CD 9으로, 세포에서는 나타나지 않고, 세포밖 소포체(bioreactor EV 및 control EV)에서만 관찰되었다. The upper band of the measurement result in Fig. 4 was calnexin, which is an ER (endoplasmic reticulum) marker, and was observed only in the cells, and was not observed in the extracellular endoplasmic reticulum (bioreactor EV and control EV). The lower band, on the other hand, is an extracellular ER marker, CD 9, which is not present in cells but only in extracellular endoplasmic reticulum (bioreactor EV and control EV).

즉, ER(endoplasmic reticulum)의 마커인 calnexin은 세포밖 소포체의 negative marker로, calnexin 항체를 사용하여 실험한 경우에는 세포 배양 접시에서 분비된 소포체(control EV)와 바이오 리엑터에서 분비된 소포체(bioreactor EV)에서 밴드가 확인되지 않았고 세포에서 확인되었다. That is, calnexin, which is a marker of ER (endoplasmic reticulum), is a negative marker of extracellular endoplasmic reticulum. When the calnexin antibody is used, the endoplasmic reticulum secretion (control EV) and the bioreactor ), The band was not identified and was confirmed in the cells.

또한, 세포밖 소포체 마커인 CD9으로 실험한 경우에는, 세포 배양 접시에서 분비된 소포체(control EV)와 바이오 리엑터에서 분비된 소포체(bioreactor EV)에서 밴드가 확인되었고, 세포에서는 확인되지 않았다. In addition, in the case of CD9, which is an extracellular ER marker, bands were observed in the control EV and the bioreactor EV in the cell culture dish, but not in the cells.

이러한 도 4의 관찰 결과를 통해 본 발명의 바이오 리엑터에서 분비된 소포들이 세포밖 소포체인 것을 확인할 수 있었다.As a result of the observation of FIG. 4, it was confirmed that the vesicles secreted from the bioreactor of the present invention were extracellular endoplasmic reticulum.

2-2. 2-2. 세포밖Extracellular 소포체의 수득률 분석 Analysis of the yield of the endoplasmic reticulum

실시예 1에서 얻어진 세포밖 소포체의 크기와 개수를 보다 정확히 측정하기 위해서 1㎍/㎖로 희석하여 NTA(nanoparticle tracking analysis)를 시행하였다. 도 5에서 확인되듯이, 세포 배양 접시에서 분비된 세포밖 소포체의 크기는 평균 135㎚였으며, 바이오 리엑터에서의 세포밖 소포체는 크기가 평균 145㎚으로 세포밖 소포체의 크기 범위에 속하는 것을 알 수 있다.In order to more accurately measure the size and number of extracellular ERs obtained in Example 1, NTA (nanoparticle tracking analysis) was performed by diluting with 1 μg / ml. As shown in FIG. 5, the extracellular endoplasmic reticulum secreted in the cell culture dish was 135 nm in average, and the extracellular endoplasmic reticulum in the bioreactor was 145 nm in average, and it belongs to the size range of the extracellular endoplasmic reticulum .

또한, 도 7에서 확인되듯이, 본 장치에서 생산된 세포밖 소포체의 수(bioreactor)는 세포 배양 접시에서 분비된 세포밖 소포체의 수(control) 보다 약 6배 많이 나오는 것을 알 수 있었다.In addition, as shown in FIG. 7, it was found that the number of extracellular endoplasmic reticulum (ER) produced by the present apparatus was about 6 times larger than the number of extracellular ERs secreted from the cell culture dish.

상기 생산 방법에 따라 제조된 세포 밖 소포체의 수를, 전단 응력을 변화시켜가면서(0 ~ 0.1 dyne/㎠)로 비교한 결과를 도 6a에 정리하였다.The results of comparing the number of extracellular endoplasmic reticulum produced according to the above production method with varying shear stress (0 to 0.1 dyne / cm 2) are summarized in FIG. 6A.

상기 전단 응력은, τ= 6μQ/bh2 으로 계산되었으며(이때, τ는 전단응력, μ는 culture medium의 점도(=9.6×10-4Pa·s)이고, Q는 유량(flow rate, ml/min), b는 공간부의 폭(width, mm), h는 공간부의 높이(height, mm)를 의미한다), 이러한 전단 응력의 변화에 따라 생산되는 세포 밖 소포체의 수는 전단 응력이 0.053 dyne/㎠에서 가장 많이 나오는 것을 확인하였다.The shear stress was calculated as τ = 6 μQ / bh 2 where τ is the shear stress, μ is the viscosity of the culture medium (= 9.6 × 10 -4 Pa · s), Q is the flow rate (ml / the number of extracellular endoplates produced by the change of shear stress is 0.053 dyne / cm 2, and the shear stress is 0.053 dyne / Cm < 2 >.

2-3. 2-3. 세포밖Extracellular 소포체 내 RNA양의 비교 분석 Comparative analysis of the amount of RNA in the endoplasmic reticulum

기존의 세포 배양 접시에서 배양된 세포가 분비하는 세포밖 소포와 본 발명에 따른 바이오 리엑터에서 세포가 분비한 세포밖 소포체의 양을 비교하기 위하여 분비된 소포에 존재하는 RNA 양을 비교하였다. 초원심분리기로 분리된 소포의 막 단백질의 양을 Bradford assay를 통해서 측정하여 소포의 질량을 단백질로 환산하였으며, 이때 10ug의 소포에서 RNA를 분리하였다.The amount of RNA present in secreted vesicles was compared to compare the amount of extracellular vesicles secreted by cultured cells in a conventional cell culture dish and the amount of extracellular vesicles secreted by the bioreactor according to the present invention. The amount of membrane protein in the vesicles separated by ultracentrifuge was measured by Bradford assay, and the mass of the vesicle was converted to protein, which was then separated from the vesicles of 10 ug.

샘플 각각에 0.5㎖의 Trizol(Life Techonologies)을 넣고 5분 동안 소포체막을 용해하였다. 다음으로 0.1㎖의 chloroform 용액을 넣고 잘 섞어준 뒤 약 5분 동안 4℃에 두어 RNA를 다른물질(단백질, DNA)과 층분리를 하였다. 16,100rpm에서 10분 동안 원심분리하여 층을 구분한 후, 분리된 상층액(RNA층)을 따로 옮겨 담고, 같은 부피의 IPA(isopropyl alchol)를 넣어 -20℃에서 20분 동안 RNA를 침전시켰다. RNA를 완벽히 침전시키기 위해 16,100 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 RNA를 침전시키고, 상층액을 제거하였다. 상기 침전물에 75% 에탄올을 넣은 후, 16,100 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 ethanol을 완전히 제거한 다음, 5분 이상 상온에서 건조 시켰다.0.5 ml of Trizol (Life Techonologies) was added to each sample, and the membrane of the endoplasmic reticulum was dissolved for 5 minutes. Next, add 0.1 ml of chloroform solution, mix well, and place it at 4 ° C for about 5 minutes to separate the RNA from other materials (protein, DNA). After separating the layers by centrifugation at 16,100 rpm for 10 minutes, the separated supernatant (RNA layer) was transferred separately, and IPA (isopropyl alchol) of the same volume was added to precipitate RNA at -20 ° C for 20 minutes. RNA was precipitated by centrifugation at 16,100 rpm for 10 minutes to completely precipitate the RNA, and the supernatant was removed. 75% ethanol was added to the precipitate, centrifuged at 16,100 rpm for 10 minutes to completely remove ethanol, and then dried at room temperature for 5 minutes or more.

Nuclease free water를 넣어 상기 건조물을 용해하고, spectrophotometer(Genova)를 이용하여 RNA 양을 측정하였다.Nuclease free water was added to dissolve the dried material, and the amount of RNA was measured using a spectrophotometer (Genova).

도 8에서 확인되듯이, 기존의 방법에서의 세포밖 소포체를 분리하였을때(control)에 비해 바이오 리엑터에서의 세포밖 소포체(bioreactor)에서 RNA양이 약 3배 많은 것을 알 수 있다.As can be seen in FIG. 8, the amount of RNA in the bioreactor of the bioreactor is about three times larger than that of the control when the extracellular endoplasmic reticulum is isolated from the conventional method.

[[ 실시예Example 3] 세포 내 칼슘 농도와  3] The intracellular calcium concentration 세포밖Extracellular 소포체의 분석  Analysis of endoplasmic reticulum

3-1. 세포 내 칼슘 농도와 3-1. Intracellular calcium concentration and 세포밖Extracellular 소포체의 분석 Analysis of endoplasmic reticulum

세포 내 칼슘 농도와 세포 밖 소포체의 생산량의 상관관계를 확인하기 위해 세포 내 칼슘 농도를 증가시키는 ionophore(ion carrier, 세포 내부로 칼슘을 넣어주는 화학 물질)로 이오노마이신(ionomycin)을 처리하여 세포밖 소포체의 생산량을 확인하였다.In order to confirm the correlation between the intracellular calcium concentration and the production of extracellular endoplasmic reticulum, ionomycin is treated with an ionophore (ion carrier) which increases intracellular calcium concentration, The yield of the outer vesicle was confirmed.

구체적으로, 0.5 uM ionophore(ionomycin) 및 1 uM ionophore(ionomycin)을 각각 세포에 처리하여 세포 내 칼슘 이온의 농도 증가를 확인하였다. 칼슘 지시약이 세포 내 칼슘 이온과 반응하여 형광을 띈다는 점을 이용하여 유세포분석기(flow cytometry, FACS)로 세포 내 칼슘 농도를 확인 하였으며, 그 결과를 도 9에 정리하였다. 도 9를 통해 확인되듯이, 세포 내 칼슘 이온의 농도가, 0.5 uM ionophore을 처리한 경우 1.59배, 1 uM ionophore을 처리한 경우 1.86배 증가 하였다.Specifically, 0.5 uM ionophore (ionomycin) and 1 uM ionophore (ionomycin) were administered to each cell to confirm the increase in intracellular calcium ion concentration. Calcium intracellular calcium concentration was confirmed by flow cytometry (FACS) using the fact that the calcium indicator reacts with calcium ions in the cell to generate fluorescence. The results are summarized in FIG. As shown in FIG. 9, intracellular calcium ion concentration was increased by 1.59 times when treated with 0.5 uM ionophore and by 1.86 times when treated with 1 uM ionophore.

ionophore를 처리하지 않은 세포, 0.5 uM ionophore를 처리한 세포 및 1 uM ionophore를 처리한 세포에서 분비된 세포밖 소포체의 양을 비교하기 위해서 ELISA를 사용하여 세포밖 소포체 마커인 CD 9의 양을 측정하였으며, 그 결과를 도 10에 정리하였다. 도 10에서 확인 되듯이, ionophore를 처리하지 않은 세포 보다 ionophore를 처리한 세포에서 세포밖 소포체의 분비량이 더 많은 것을 알 수 있다. 또한, 0.5 uM ionophore을 처리한 경우보다 1 uM ionophore을 처리한 경우가 세포밖 소포체의 분비량이 더 많은 것을 확인 할 수 있다.The amount of CD9, an extracellular endoplasmic reticulum marker, was measured using ELISA to compare the amount of extracellular endoplasmic reticulum isolated from cells not treated with ionophore, cells treated with 0.5 uM ionophore and cells treated with 1 uM ionophore , And the results are summarized in Fig. As can be seen in FIG. 10, the secretion of extracellular endoplasmic reticulum in the ionophore-treated cells is higher than in the non-ionophore-treated cells. In addition, the amount of extracellular ER is higher in the case of treatment with 1 uM ionophore than in case of treatment with 0.5 uM ionophore.

도 9와 도 10의 결과를 통해 세포 내 칼슘 농도가 증가할수록 세포밖 소포체의 분비량 또한 증가하는 것을 알 수 있다.The results of FIGS. 9 and 10 show that as the intracellular calcium concentration increases, the secretion of extracellular endoplasmic reticulum also increases.

3-2. 3-2. 전단응력에Shear stress 따른 세포 내 칼슘 농도 분석 Of intracellular calcium concentration

전단응력에 의해 자극을 받은 세포는 세포 내 칼슘 이온의 분비를 촉진 시킨다. 이는 세포 소기관인 ER(Endoplasmic Reticulum)에 저장하고 있던 칼슘 이온을 세포 기질로 분비하기 때문이다.Cells stimulated by shear stress promote secretion of intracellular calcium ions. This is because the calcium ions stored in the ER (Endoplasmic Reticulum) cell organelle are secreted into the cell matrix.

이를 확인하기 위해, ionophore를 처리하지 않고 실시예 1의 배양 방법에 따라 전단 응력을 0 ~ 0.2 dyne/㎠로 변화시켜가면서 배양된 세포의 세포 내 칼슘 이온의 농도를 측정하였다. 세포 내 칼슘 이온의 농도 측정방법은 실시예 3-1의 측정방법을 사용하였으며, 그 결과를 도 11에 정리하였다. 도 11에서 확인되듯이, 전단응력에 따라 세포 내 칼슘 이온 농도가 증가함을 알 수 있으며, 특히 0.1 dyne/㎠에서 세포 내 칼슘 이온의 농도가 가장 많이 증가한 것을 확인할 수 있다.To confirm this, the intracellular calcium ion concentration of the cultured cells was measured while changing the shear stress to 0 to 0.2 dyne / cm 2 according to the culturing method of Example 1 without treating the ionophore. The concentration of intracellular calcium ions was measured by the measurement method of Example 3-1, and the results are summarized in FIG. As can be seen from FIG. 11, the intracellular calcium ion concentration was increased by the shear stress, and it was confirmed that the intracellular calcium ion concentration was increased most at 0.1 dyne / cm 2.

또한, 상기 전단응력을 0 ~ 0.2 dyne/㎠로 변화시켜가면서 배양된 세포에 분비된 세포밖 소포체의 양을 측정하기 위해 ELISA를 사용하여 세포밖 소포체 마커인 CD 9의 양을 측정하였으며, 그 결과를 도 12에 정리하였다. Further, in order to measure the amount of the extracellular endoplasmic reticulum secreted into the cultured cells while changing the shear stress to 0 to 0.2 dyne / cm 2, the amount of CD 9, an extracellular endoplasmic reticulum marker, was measured using ELISA, Are summarized in Fig.

실시예 3-1의 실험결과를 통해 세포 내 칼슘 이온의 농도가 증가하면 분비되는 세포밖 소포체의 양이 증가함을 알 수 있으며, 도 11의 결과를 통해 전단응력에 따라 세포 내 칼슘 이온의 농도가 증가함을 알 수 있다. 이러한 결과를 통해 전단응력이 세포 내 칼슘 이온 농도의 변화에 영향을 미치며 그에 따라 분비되는 세포밖 소포체의 양을 증가 시킴을 알 수 있다. 특히, 도 12의 결과를 통해 확인 할 수 있듯이, 전단응력이 0.1 dyne/㎠인 경우 세포 내 칼슘 이온의 농도가 가장 높으며 그에 따라 분비되는 세포밖 소포체의 양 또한 가장 높은 것이 확인 되었다.From the results of Example 3-1, it can be seen that the amount of secreted extracellular endoplasmic reticulum is increased when the intracellular calcium ion concentration is increased. According to the result of Fig. 11, the intracellular calcium ion concentration Is increased. These results show that shear stress affects the change of intracellular calcium ion concentration and thus increases the amount of secreted extracellular endoplasmic reticulum. In particular, as can be seen from the results of FIG. 12, when the shear stress was 0.1 dyne / cm 2, the concentration of intracellular calcium ions was the highest, and the amount of the extracellular endoplasmic reticulum secreted was also highest.

ionophore는 유해물질로 분류되는 화학 물질로, 연구용으로는 사용이 가능하지만 진단 및 치료 목적으로는 사용할 수 없다. 반면, 본 발명은 이러한 ionophore를 세포에 처리하지 않고도 세포 내 칼슘 이온 농도를 증가시켜 세포밖 소포체의 분비량을 증가시킬 수 있어, 진단이나 치료 등의 응용분야에 사용하기 적합하다.ionophore is classified as a harmful substance. It can be used for research but it can not be used for diagnostic and therapeutic purposes. On the other hand, the present invention can increase the secretion amount of the extracellular endoplasmic reticulum by increasing the intracellular calcium ion concentration without treating the ionophore with the cell, and thus it is suitable for use in applications such as diagnosis and treatment.

Claims (9)

관류식 바이오 리엑터 장치 시스템을 사용한 세포밖 소포체 분비량 향상 방법에 있어서,
관류식 바이오 리엑터 장치의 내부에 세포를 파종시키는 단계;
세포 배양액 저장소로부터 세포 배양액을 소정의 속도로 연속적으로 공급하는 단계; 및
소정의 시간동안 관류식 바이오 리엑터 장치 내에서 전단응력을 0초과 0.5 dyne/㎠ 이하로 유지하여 세포를 배양시키는 단계;를 포함하고,
상기 관류식 바이오 리엑터 장치 시스템은, 관류식 바이오 리엑터 장치; 및 세포 배양액 저장소;를 포함하며,
상기 바이오 리엑터 장치와 세포 배양액 저장소는 관을 통해 연통되어, 세포 배양액 저장소에 보관된 세포 배양액이 튜브연동 펌프를 통해 관류식 바이오 리엑터로 공급되는, 관류식 바이오 리엑터를 사용한 세포밖 소포체의 분비량 향상 방법.A method for enhancing the secretion of extracellular ER using a perfusion-based bioreactor system,
Seeding cells inside a perfusion-based bioreactor device;
Continuously supplying the cell culture liquid from the cell culture liquid reservoir at a predetermined rate; And
Maintaining the shear stress in the flow-through type bioreactor device at a level of more than 0 and less than 0.5 dyne / cm < 2 > for a predetermined period of time,
The perfusion type bioreactor system comprises: a perfusion type bioreactor device; And a cell culture reservoir,
The bioreactor device and the cell culture reservoir are communicated with each other through a tube and the cell culture fluid stored in the cell culture reservoir is supplied to the perfusion type bioreactor through a tube peristaltic pump to improve the secretion amount of the extracellular endoplasmic reticulum using the perfusion type bioreactor . 제1항에 있어서,
상기 소정 속도는, 0 초과 1 L/min 이하인 것을 특징으로 하는, 관류식 바이오 리엑터를 사용한 세포밖 소포체의 분비량 향상 방법.The method according to claim 1,
Wherein the predetermined rate is more than 0 to 1 L / min or less. 제1항에 있어서,
상기 소정 시간은, 1 내지 15일인 것을 특징으로 하는, 관류식 바이오 리엑터를 사용한 세포밖 소포체의 분비량 향상 방법.The method according to claim 1,
Wherein the predetermined time is 1 to 15 days. 2. The method according to claim 1, wherein the predetermined time is 1 to 15 days. 제1항에 있어서,
상기 관의 직경은 0.5 ~ 10 ㎜인 것을 특징으로 하는, 관류식 바이오 리엑터를 사용한 세포밖 소포체의 분비량 향상 방법.The method according to claim 1,
Wherein the diameter of the tube is 0.5 to 10 mm. ≪ RTI ID = 0.0 > 11. < / RTI > 제1항에 있어서,
상기 관류식 바이오 리엑터 장치는, 세포가 파종되어 증식되는 공간부가 형성된 하단 본체부; 상기 하단 본체부와 결합되어, 세포 배양액의 주입구와 배출구가 형성된 상단 본체부; 및 상기 하단 본체부와 상단 본체부를 밀착시켜 상기 세포 배양액의 유출을 방지하는 가스킷;을 포함하는, 관류식 바이오 리엑터를 사용한 세포밖 소포체의 분비량 향상 방법. The method according to claim 1,
The perfusion type bioreactor device comprises: a lower main body part having a space part in which cells are sown and proliferated; An upper main body coupled to the lower main body and having an inlet and an outlet for a cell culture liquid; And a gasket which closely contacts the lower main body part and the upper main body part to prevent leakage of the cell culture liquid. 제5항에 있어서,
상기 공간부의 저면 기재(substrate)는, 세포의 부착과 분화를 증진시킬 수 있도록 binding molecule이 코팅된, 관류식 바이오 리엑터를 사용한 세포밖 소포체의 분비량 향상 방법.6. The method of claim 5,
The substrate of the space part is coated with a binding molecule so as to promote adhesion and differentiation of cells, and a method for improving secretion of extracellular endoplasmic reticulum using a perfusion-type bioreactor. 제5항에 있어서,
상기 공간부의 높이는, 100㎛ ~ 10㎜인 것을 특징으로 하는, 관류식 바이오 리엑터를 사용한 세포밖 소포체의 분비량 향상 방법.6. The method of claim 5,
Wherein the height of the space portion is 100 탆 to 10 탆. 제1항에 있어서,
상기 관류식 바이오 리엑터 장치 시스템은, 관류식 바이오 리엑터의 배출구 이후에 세포 배양액의 일부를 채취할 수 있는 취출부를 더 포함하는, 관류식 바이오 리액터를 사용한 세포밖 소포체의 분비량 향상 방법.The method according to claim 1,
Wherein the perfusion type bioreactor device system further comprises a take-out part capable of collecting a part of the cell culture liquid after the discharge port of the perfusion type bioreactor. 관류식 바이오 리액터를 사용한 세포밖 소포체의 분비량 향상 방법에 사용되는 관류식 바이오 리엑터 장치 시스템에 있어서,
관류식 바이오 리엑터 장치; 및 세포 배양액 저장소;를 포함하고,
상기 바이오 리엑터 장치와 세포 배양액 저장소는 직경이 0.5 ~ 10 ㎜인 관을 통해 연통되어, 세포 배양액 저장소에 보관된 세포 배양액이 튜브연동 펌프를 통해 관류식 바이오 리엑터로 공급되며,
상기 관류식 바이오 리엑터 장치 내에서 전단응력을 0 초과 0.5 dyne/㎠ 이하로 유지하여 세포를 배양시키고,
상기 관류식 바이오 리엑터 장치는. 세포가 파종되어 증식되는 높이가 100㎛ ~ 10㎜인 공간부가 형성된 하단 본체부; 상기 하단 본체부와 결합되어, 세포 배양액의 주입구와 배출구가 형성된 상단 본체부; 및 상기 하단 본체부와 상단 본체부를 밀착시켜 상기 세포 배양액의 유출을 방지하는 가스킷;을 포함하며,
상기 공간부의 저면 기재(substrate)는, 세포의 부착과 분화를 증진시킬 수 있도록 binding molecule이 코팅된 것을 특징으로 하는, 관류식 바이오 리엑터 장치 시스템.
A perfusion-based bioreactor system for use in a method for enhancing secretion of extracellular endoplasmic reticulum using a perfusion-based bioreactor,
A perfusion type bioreactor device; And a cell culture reservoir,
The bioreactor device and the cell culture reservoir are communicated through a tube having a diameter of 0.5 to 10 mm. The cell culture fluid stored in the cell culture reservoir is supplied to the perfusion type bioreactor through a tube peristaltic pump,
The cells are cultured by maintaining the shear stress in the above-mentioned flow-through type bioreactor device at 0 to 0.5 dyne / cm 2 or less,
The perfusion type bioreactor device comprises: A lower main body portion having a space portion having a height of 100 占 퐉 to 10 mm at which cells are sown and proliferated; An upper main body coupled to the lower main body and having an inlet and an outlet for a cell culture liquid; And a gasket which closely contacts the lower main body part and the upper main body part to prevent leakage of the cell culture liquid,
Wherein the bottom substrate of the space is coated with a binding molecule to enhance cell attachment and differentiation.
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