KR20190008909A - 사료 또는 식품 제품을 위한 박테리아 3-피타아제의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 사료 또는 식품 제품의 제조를 위한 박테리아 3-피타아제의 용도에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 동물에게 공급하기 위한 및 식품 또는 사료 첨가제 제조를 위한 박테리아 3-피타아제의 용도에 관한 것이다.

Description

사료 또는 식품 제품을 위한 박테리아 3-피타아제의 용도

본 발명은 사료 또는 식품 제품의 제조를 위한 박테리아 3-피타아제의 용도에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 동물에게 공급하기 위한 및 식품 또는 사료 첨가제 제조를 위한 박테리아 3-피타아제의 용도에 관한 것이다.

피타아제는 피테이트와 같은 오가노포스페이트 화합물로부터 포스페이트를 제거할 수 있는 효소이다. 다수 유형의 피타아제는 당해 기술 분야에 공지되어 있고, 이들 중 몇몇은 이미 옥수수, 밀 및 대두와 같은 동물 사료 재료 내에 천연으로 존재하는 피테이트의 대사 및 이용을 개선시키기 위해 동물 사료 제품에 첨가제로서 사용된다. 피타아제의 분류는 처음에는 피테이트 분자로부터 포스페이트의 개열 출발 위치에 좌우된다. 3-피타아제는 피테이트 분자의 위치 3 상의 포스페이트로 출발한다. 6-피타아제는 위치 6 상의 포스페이트로 출발한다. 피타아제의 유형에 좌우되어, 다른 위치의 추가 개열이 일어난다.

피타아제의 동물 사료로의 첨가는, 포스페이트가 동물 식이의 중요한 요소이기 때문에, 사료의 천연 피테이트 함량의 더 우수한 대사를 가능하게 하고, 또한 동물의 배설물에서 잔류 인광체(phosphor)의 감소를 야기한다. 동물 배설물 중 높은 인(phosphorous) 함량은 보통 다수의 국가에서 엄격한 제한을 설정했기 때문에 비료로서 이의 사용의 심각한 제한을 야기한다.

불충분한 천연 피테이트 대사 및 비료 중 잔류 인 함량을 특히 증가시키는 것으로 또한 공지된 고가의 합성 인 풍부 사료의 이러한 단점을 극복하기 위해, 피타아제는 이미 동물 사료 제품에 동물의 위 및 소화관에서 피테이트 대사를 증가시키기 위해 도입되어 왔다.

현재 시판되는 이러한 피타아제의 예는 에쉐리키아 콜리(Escherichia coli), 시트로박터 브라키(Citrobacter braakii), 부티아욱셀라 종(Buttiauxella sp .) 및 아스퍼길루스 니거(Aspergillus niger)로부터 유래된다.

이들 피타아제 제품 각각은 적어도 특이적 활성, 용량 요구사항, 반응 시간 및 중간체 화합물을 억제하는 축적에서 제한사항을 갖는다. 이러한 종류의 제품은 첫번째로 목적하는 효과를 성취하기 위해 높은 효소 투입(dosing)을 요구하는 진균성 3-피타아제를 포함하였다. 현재 시판되는, 시판 사료 제품은 박테리아 기원의 6-피타아제를 사용하여 이들 효과를 극복하는 시도를 한다. 그러나, 이들 6-피타아제의 심각한 단점은 중간체 화합물 이노시톨-테트라포스페이트의 축적이고, 이는 효과적인 피테이트 대사를 심각하게 제한한다. 추가로 피테이트 및 이의 중간체, 특히 이노시톨-테트라포스페이트는, Ca^{2 +}, Zn^{2 +} 및 Mg^{2 +}와 같은 이가 이온을 갖는 복합체를 형성한다. 추가로, 당해 기술 분야에 공지된 피타아제 제품 다수는 최대 1.5시간인 동물 위에서 사료의 실제 임계 체류 시간에 대해 충분한 포스페이트 방출을 보장하기 위해 높은 양의 피타아제의 사용을 요구한다.

따라서, 최첨단 기술에서 동물에게 공급할 때 피테이트 대사를 개선시키는 더 높은 효율적인 방식을 제공하는 것이 필요하다. 본 발명의 발명자는 본 발명에 이르러 현재 놀랍게도 이러한 필요성이 박테리아 3-피타아제를 사용하여 보수될 수 있음을 발견하였다.

첫번째 양상 내에서, 따라서, 본 발명은 사료 또는 식품 제품의 제조를 위한 적어도 하나의 박테리아 3-피타아제의 용도를 지시한다. 두번째 양상 내에서, 본 발명은 동물에게 공급하기 위한 적어도 하나의 박테리아 3-피타아제의 용도를 지시한다. 그리고 최종 양상에서 본 발명의 양상은 식품 또는 사료 첨가제 제조를 위한 적어도 하나의 박테리아 3-피타아제의 용도를 지시한다.

본 출원 내에서 용어 "3-피타아제"는 E.C. 3.1.3.8의 분류에 속하는 임의의 피타아제로서 이해되어야 하고, 또한 다음과 같이 언급된다: 1-피타아제; 미오-이노시톨-헥사키스포스페이트 3-포스포하이드롤라제; 피테이트 1-포스파타아제 또는 피테이트 3-포스파타아제.

본 출원 내에서 용어 "박테리아 피타아제"는 박테리아 기원의 임의의 피타아제를 포함하는 것으로 이해하여야 한다. "박테리아 기원"은 임의의 종류의 박테리아 게놈으로부터 단리된 소위 야생형-피타아제와 같은 변형된 또는 비-변형된 형태의 임의의 피타아제, 뿐만 아니라 유전자 변형 또는 유전자 조작 또는 돌연변이 형태와 같은 변형된 피타아제에 관한 것이다.

본 발명에 따른 딕케야(Dickeya) 또는 세라티아(Serratia) 속으로부터의 피타아제가 특히 바람직하고, 여기서, 딕케야 종(Dickeya sp.), 세라티아 종(Serratia sp.), 딕케야 제아(Dickeya zeae), 딕케야 크리산테미(Dickeya chrysanthemi), 딕케야 다단틸(Dickeya dadantii), 딕케야 솔라니(Dickeya solani) 또는 딕케야 파라디시아카(Dickeya paradisiaca)로부터의 피타아제가 가장 바람직하다.

특히 바람직하게는 실시형태 내에서 37℃ 및 pH 5.5에서 0.2 U/mL의 효소 용량을 사용하는 2.7 mmol/L 피테이트의 검정 내에서 35% 무기 포스페이트 방출 후 중간체 생성물 이노시톨-테트라포스페이트의 25% 미만(wt./wt. 유리 포스페이트) 축적을 특징으로 하는 피타아제가 사용된다. 이러한 피타아제는 중간체 생성물 이노시톨-테트라포스페이트의 축적이 동물의 위 내에 사료의 관련 잔류 시간 내에 피테이트의 완전한 포스페이트 방출을 방해하기 때문에 특히 유리하다. 추가로, 중간체 이노시톨-테트라포스페이트의 축적은 이가 이온 이용을 방해한다. 동물 사료 제품을 위해 통상 사용되는 피타아제는 사료 매스(mass)가 추가적 소화를 위해 동물의 위를 떠나기 전에 완전한 인광체 방출을 방해하는 대량의 이러한 중간체 생성물을 축적한다.

중간체 생성물 이노시톨-테트라포스페이트의 25% 미만(wt./wt.) 축적은 추가로 0.2 U/mL의 극저 효소 용량을 시행하여 성취된다. 따라서, 이러한 피타아제는 또한 경제적 이유로 매우 유리하다. 0.2 U/mL의 효소 용량을 사용하는 37℃ 및 pH 5.5에서 2.7 mmol/L 피테이트의 검정 내에 35% 무기 포스페이트 방출 후 중간체 생성물 이노시톨-테트라포스페이트의 20% 미만(wt./wt. 유리 포스페이트) 축적 또는 15% 미만(wt./wt. 유리 포스페이트) 축적 및 가장 바람직하게는 10% 미만(wt./wt. 유리 포스페이트) 축적을 특징으로 하는 피타아제를 사용하는 것이 특히 바람직하다.

추가로 실시형태 내에서, pH 5.5에서 0.21 μg/mL의 효소 농도를 사용한지 1시간 후 2.7 mmol/L 피테이트로부터 적어도 15%의 포스페이트 방출을 특징으로 하는 피타아제가 사용된다. 이들 피타아제의 사용은 동물의 위 내에 사료의 체류 시간이 보통 약 1시간이기 때문에 바람직하다. 따라서, 피타아제는 다수의 인광체가 1시간의 기간 내에 방출되는 것이 바람직하다. 더 많은 포스페이트가 위 체류 시간 내에 방출될 수 있을수록, 더 적은 피타아제가 사료 제품 내에 사용될 수 있다. 이는 추가로 경제적 이점에 기여할 것이다. 이에 의해 0.21 μg/mL의 효소 농도를 사용한지 1시간 후 pH 5.5에서 2.7 mmol/L 피테이트에서부터 적어도 20%의 포스페이트 방출, 심지어 보다 바람직하게는 적어도 25% 또한 특히 바람직하게는 적어도 30%, 또는 적어도 35% 뿐만 아니라 적어도 40% 또는 적어도 45% 및 가장 바람직하게는 적어도 50%의 포스페이트 방출을 특징으로 하는 피타아제를 사용하는 것이 특히 바람직하다.

동물의 위에서 소화 동안 온도가 매우 가변적이기 때문에 37 내지 42℃의 최적 온도를 갖는 피타아제가 특히 바람직한 실시형태 내에 사용되고, 여기서, 35 내지 45℃의 최적 온도가 특히 바람직하고, 30 내지 50℃가 가장 바람직하다. 본 발명의 피타아제가 어류에게 공급하기 위해 사용되는 경우, 1 내지 45℃, 바람직하게는 15 내지 35℃의 최적 온도로 피타아제가 사용된다.

동물의 위 내의 pH가 소정 시점에서 각각의 소비되는 사료 비로 인해 매우 가변적이기 때문에, 특히 바람직한 실시형태 내에서 pH 3.5 내지 4.5, 보다 바람직하게는 pH 3.0 내지 5.0, 및 가장 바람직하게는 pH 2.5 내지 5.5의 범위 내에 최적 pH를 나타내는 피타아제가 사용된다. 또다른 특히 바람직한 범위는 pH 5.0 내지 5.5이다.

추가로 특히 바람직하게는 실시형태 내에서, 서열번호 1에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 바람직하게는 서열번호 1에 대해 적어도 75% 동일성, 추가로 바람직하게는 서열번호 1에 대해 적어도 80% 동일성, 특히 바람직하게는 서열번호 1에 대해 적어도 85% 동일성, 또한 바람직하게는 서열번호 1에 대해 적어도 90% 동일성, 또한 특히 바람직하게는 서열번호 1에 대해 적어도 95% 동일성 및 가장 바람직하게는 서열번호 1에 대해 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 박테리아 3-피타아제를 사용한다. 특히 바람직하게는 박테리아 3-피타아제는 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13 및 서열번호 15이다.

본 출원 내에 사용되는 용어 "사료" 제품은 임의의 종류의 동물, 바람직하게는, 포유류 및 조류, 예를 들면, 이에 제한되는 것은 아니지만, 반추동물, 돼지, 사슴, 가금류에게 공급하기에 적합한 당해 기술 분야의 숙련가들에게 공지된 임의의 제품에 관한 것이고, 뿐만 아니라 어류 또는 해산물로서 일반적으로 언급되는 다른 수생 가축(aquatic livestock)을 포함한다. 비-반추동물 동물, 예를 들면, 가금류, 육계, 조류, 닭, 칠면조, 오리, 거위 및 새; 반추동물, 예를 들면, 소(cows), 소(cattle), 말 및 양; 돼지(pigs), 돼지(swine), 새끼 돼지(piglets), 육성돈(growing pigs) 및 암퇘지; 이에 제한되는 것은 아니지만: 고양이, 개, 설치류, 및 토끼를 포함하는 반려 동물; 이에 제한되는 것은 아니지만, 연어, 송어, 틸라피아, 메기 및 잉어를 포함하는 어류; 및 이에 제한되는 것은 아니지만, 새우 및 왕새우를 포함하는 갑각류를 위한 사료 제품이 특히 바람직하다.

본 출원에 사용된 용어 "식품" 제품은 사람이 소비하기에 적합한 당해 기술 분야의 숙련가들에게 공지된 임의의 제품에 관한 것이다.

본 발명의 사료 또는 식품 제품은 바람직하게는 전분을 함유한다. 전분-함유 사료 성분은 전형적으로 곡류(들), 예를 들면, 하나 이상의 옥수수(corn)(옥수수(maize)), 밀, 보리, 호밀, 쌀, 사탕 수수 및 수수, 및/또는 감자, 카사바 및 고구마와 같은 덩이줄기와 같은 식물성 재료를 포함한다. 식물성 재료는 분쇄될 수 있고, 예를 들면, 습식 또는 건식 분쇄된 곡물(grain), 또는 주정박 고형물(distillers dry grain solids)이다.

본 발명의 사료 또는 식품 제품은 바람직하게는 대두 (바람직하게는 대두 가루), 유채, 팜 커넬, 면실 및 해바라기와 같은 단백질-풍부 사료 성분을 포함한다.

추가로 실시형태 내에서, 사료 또는 식품 제품은 비타민, 미네랄, 유기 산, 프로바이오틱 성분, 유지, 지방, 안료, 성장 인자 및 항미생물제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물을 포함한다.

추가로 실시형태 내에서, 사료 또는 식품 제품은 박테리아 3-피타아제 이외에 적어도 하나의 하나 이상의 효소를 포함하고, 특히 사료의 소화율을 개선시키는 사료 효소, 예를 들면 또다른 피타아제, 아밀라아제 또는 프로테아제, 아미노펩티다아제, 카보하이드라아제, 카복시펩티다아제, 카탈라아제, 셀룰라아제, 키티나아제, 쿠티나아제, 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼라아제, 데옥시리보뉴클레아제, 에스테라아제, 알파-갈락토시다아제, 베타-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 알파-글루코시다아제, 베타-글루코시다아제, 할로퍼옥시다아제, 인버타아제, 락카아제, 리파아제, 만노시다아제, 옥시다아제, 펙틴분해 효소, 펩티-도글루타미나아제, 퍼옥시다아제, 폴리페놀옥시다아제, 단백질가수분해 효소, 리보뉴클레아제, 트랜스글루타미나아제, 또는 자일라나아제를 포함한다. 사료 효소(들)는 박테리아 또는 진균과 같은 미생물로부터 또는 식물 또는 동물로부터 유래될 수 있다.

또다른 바람직한 실시형태 내에서 사료 또는 식품 제품은 과립물, 압축물, 압출물 또는 액체 형태로 존재한다.

본 발명의 또다른 양상은 동물에게 공급하기 위한 박테리아 3-피타아제의 용도에 관한 것이다. 따라서, 박테리아 3-피타아제는 개별적인 제품에 혼입되지 않지만, 동물에게 직접적으로 제공된다.

박테리아 3-피타아제가 직접적으로 동물에게 제공되는 경우, 피타아제는 바람직하게는 압출물 또는 과립물의 형태로, 특히 예를 들면 염을 포함하는, 예를 들면 적어도 60% w/w의 염을 포함하는 코팅을 갖는 코팅된 과립물의 형태로 제공된다. 염은 NaCl, KCl, Na₂SO₄, K₂SO₄ 및 MgSO₄로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 또다른 양상은 식품 또는 사료 첨가제 제조를 위한 박테리아 3-피타아제의 용도에 관한 것이다. 식품 또는 사료 첨가제는 곡물, 옥수수, 건초, 당밀 및 밀짚의 펠릿화되거나 압출된 혼합물과 같은 시판 식품 제품 내에 혼입될 수 있고 건조 또는 액체 형태로 존재할 수 있는 제품이다. 사료 또는 식품 제품의 생산을 위해 사용하기 위한 상기 정의된 3-피타아제가 특히 바람직하다.

본원에 사용된 "액체 형태"는 바람직하게는 완충액, 안정화제, 및 항-미생물제를 또한 포함하는 조성물에 관한 것이고, 심지어 적어도 하나의 추가 효소를 포함할 수 있고, 여기서, 상기 효소는 아밀라아제, 셀룰라아제, 락타아제, 리파아제, 프로테아제, 카탈라아제, 자일라나아제, 베타-글루카나아제, 만나나아제, 아밀라아제, 아미다아제, 에폭사이드 하이드롤라제, 에스테라아제, 포스포리파아제, 트랜스아미나아제, 아민 옥시다아제, 셀로바이오하이드롤라제, 암모니아 리아제, 또는 이의 임의의 조합이다.

본원에 사용된 "건조 형태"는 바람직하게는 다음 성분 중 하나 이상을 또한 포함하는 조성물에 관한 것이다: 담체, 완충액, 안정화제, 결합제, 가소제, 항-미생물제. 특히 바람직하게는 수크로스, 염화나트륨, 소르비톨, 나트륨 시트레이트, 칼륨 소르베이트, 나트륨 벤조에이트, 나트륨 프로피오네이트, 구아 검 및/또는 밀가루를 포함하는 건조 형태이다.

도면 및 실시예
본 발명은 실시예 및 도면에 의해 추가로 하기에 기술된다. 실시예 및 도면은 단지 예시적인 특성을 갖고, 본 발명의 범위를 제한하지 않는다는 것이 강조된다.
도 1은 5.5 및 37℃에서 중간체 생성물 이노시톨-테트라포스페이트의 축적에 관한 본 발명에 따른 박테리아 3-피타아제 및 최첨단 기술 내에 현재 사용되고 있는 동물 사료용 박테리아 6-피타아제 간의 비교를 나타낸다.
도 2는 pH 5.5 및 37℃에서 검정 내에 사용된 동일한 양의 피타아제에 대한 포스페이트 방출에 관련된 본 발명에 따른 박테리아 3-피타아제, 및 또한 동물 사료용으로 사용되는 것으로 최첨단 기술 내에 공지되고 과거에 사용되었던 진균성 3-피타아제의 비교를 나타낸다.
도 3은 pH 5.5 및 37℃에서 중간체 생성물 이노시톨-테트라포스페이트로부터 포스페이트 방출에 관한 본 발명에 따른 박테리아 3-피타아제 및 최첨단 기술 내에 현재 사용되고 있는 동물 사료용 박테리아 6-피타아제의 비교를 나타낸다.
도 4는 pH 5.0 및 40℃에서 중간체 생성물 이노시톨-테트라포스페이트의 축적에 관한 본 발명에 따른 박테리아 3-피타아제와 최첨단 기술 내에 현재 사용되고 있는 동물 사료용 박테리아 6-피타아제 간의 비교를 나타낸다.
도 5는 pH 5.0 및 40℃에서 검정 내에 사용된 동일한 양의 피타아제에 대한 포스페이트 방출에 관련된 본 발명에 따른 박테리아 3-피타아제 및, 또한 동물 사료용으로 사용되는 것으로 최첨단 기술 내에 공지되고 과거에 사용되었던 진균성 3-피타아제의 비교를 나타낸다.
도 6은 pH 5.0 및 40℃에서 중간체 생성물 이노시톨-테트라포스페이트로부터 포스페이트 방출에 관한 본 발명에 따른 박테리아 3-피타아제 및 최첨단 기술 내에 현재 사용되고 있는 동물 사료용 박테리아 6-피타아제의 비교를 나타낸다.

방법

다음 방법을 실시예에서 적용하였다:

최첨단 기술 피타아제

다음 피타아제를 실시예에서 시험하였다:

효소 농도의 측정

서열번호 1 농도를 이의 몰 흡광 계수를 사용하여 UV 흡광도를 통해 측정하였다. 모든 다른 피타아제 용액 및 추출물을 인 하우스(in house) SDS 겔 정량화 방법을 통해 서열번호 1 칼리브레이션 곡선을 사용하여 정량화하였다. 피타아제 샘플을 SDS 겔에 적용하고, 후속적으로 Sypro Ruby(Thermo Fisher: S12000)로 염색하였다. 겔 이미지를 표준 Bio-Rad 겔 문서화 기기(documentation instrument)에서 기록하였다. 이미지 분석을 ImageLab 소프트웨어(Bio-Rad)를 사용하여 수행하였다. 단백질 농도를 동일한 SDS 겔 상 서열번호 1 칼리브레이션 곡선을 사용하여 피타아제 특이적 SDS 겔 대역의 신호 통합으로 측정하였다.

피타아제 활성의 측정

5 μL 효소 용액(100 mmol/L 나트륨 아세테이트 완충액, pH 5.5 중, 0.05% (w/v) Triton X-100)을 95 μL 2,88 mmol/L 나트륨 피테이트(Sigma 68388, lot BCBM4006V)로 100 mmol/L 나트륨 아세테이트 완충액, pH 5.5 중에 37℃에서 15분 동안 배양하였다. 반응을 100 μL 10% (w/v) 트리클로로아세트산을 첨가하여 정지시켰다. 후속적으로, 100 μL의 정지된 효소 반응물을 100 μL 몰리브데이트 시약(1.2% (w/v) 암모늄 몰리브데이트; 4.4% (v/v) 황산, 및 27 mg/mL (w/v) 황산제1철(ferrous sulfate)의 수용액)과 혼합하고, 용액을 15분 동안 실온에서 배양하였다. 700 nm에서 흡광도를 측정하고, 방출된 무기 포스페이트의 양을 무기 포스페이트 표준 용액(0 내지 1.5 mmol/L)을 사용하여 계산하였다. 하나의 단위의 피타아제 활성을 37℃에서 1분당 1 μmol 포스페이트를 방출하는 효소의 양으로서 정의하였다.

시판 피테이트 제제 중 피테이트 함량의 측정

표준 물질 피트산 나트륨 염 하이드레이트(Sigma Art. 68388, lot BCBM4006V)는 피테이트, 나트륨 및 물을 함유한다. 피테이트 함량은 분석 증명서가 이용가능하지 않고, 산 가수분해 및 ICP-OES에 의한 유리 인의 후속적인 측정으로 측정되었다. 200 mg 피테이트 나트륨 염 하이드레이트(Sigma Art. 68388, lot BCBM4006V)를 테플론 관에 칭량하였다. 후속적으로, 1 mL 물, 1 mL 황산 98%, 및 4 mL 과산화수소 용액 30%를 첨가하였다. 관을 뚜껑 및 버스팅 캡(bursting cap)으로 덮고, 300℃에서 1시간 동안 오토클레이브에서 배양하였다. 가수분해물을 정량적으로 50 mL 용적측정 플라스크에 옮기고, 물로 50 mL까지 채웠다. 이 용액을 DIN EN ISO 11885 E22에 따른 ICP-OES에 의해 인 함량에 대해 분석하였다. 피테이트 함량을 중량, 인 함량 및 몰 질량에 의해 계산하였다. 피트산 나트륨 염 하이드레이트 중 유리 피테이트 함량(Sigma Art. 68388, lot BCBM4006V)은 54.7%였다.

HPAEC-UV에 의한 상이한 이노시톨-포스페이트 종의 측정

상이한 이노시톨-포스페이트 종의 측정을 290 nm에서 UV 검출기를 사용하여 포스트 칼럼 유도체화(post column derivatisation)를 사용하는 고성능 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하였다(HPAEC-UV). 크로마토그래피 시스템은 이중 펌프(IC-3000 DP), 이중 칼럼 오븐(ICS-3000 DC), 냉각 오토샘플러(cooled autosampler)(ICS-3000 AS) 및 UV 검출기(ThermoFisher MWD-3000)를 갖는 Dionex ICS-3000이였다. 포스트 칼럼 전달 시스템 대신에, 니팅(knitting)된 반응 코일(4 mm 시스템, 375 μL)을 펌프 시스템 둘 다의 유동을 혼합하기 위해 사용하여 검출 전 유도체화 반응을 수행하였다. 시스템 1을 사용하여 Dionex CarboPac PA100 Guard 칼럼 4 x 50 mm 및 Dionex CarboPac PA100 분석 칼럼 4 x 250 mm를 사용하여 상이한 이노시톨-포스페이트 종을 분리하였다. 구배 용리를 위해, HPLC 등급 물(펌프 시스템 1/커넬(canal) A) 및 0.5 M 염산(펌프 시스템 1/커넬 B)을 1.0 mL/min의 유속에서 사용하였다. 구배 조건은 하기와 같았다: 0 min. 5% B; 0-8 min. 5-10% B; 8 25 min. 10-35% B; 25-35 min. 35-100% B; 35-42 min. 100% B; 42-43 min 100-5% B; 43-55 min 5% B. 펌프 시스템 2는 포스트 칼럼 반응 용액(0.1% Fe(NO₃)₃을 포함하는 0.33 M 과염소산)을 니팅 코일과 결합된 티 커넥터(tee connector)에 0.4 mL/min의 유속으로 제공한다. 주입 용적은 30℃의 칼럼 온도 및 10℃의 오토샘플러 온도에서 약 50 μL였다. 수행 시간은 55 min이였다. 신호를 290 nm에서 검출하고, 수동으로 통합하였다. 표준 스톡 용액을 하기와 같이 제조하였다: 100 mg 피트산 나트륨 염 하이드레이트(Sigma Art. 68388, lot BCBM4006V)를 100 mL 포스페이트 표준 용액 1000 mg/L(Merck Art. 119898) 중에 희석하였다. 수개의 칼리브레이션 수준으로 희석을 물로 수행하여(HPLC 등급) 다음 농도로 되게 하였다: 0.1 mg/mL 피트산 나트륨 염 하이드레이트/포스페이트, 0.2 mg/mL 피트산 나트륨 염 하이드레이트/포스페이트, 0.4 mg/mL 피트산 나트륨 염 하이드레이트/포스페이트, 0.6 mg/mL 피트산 나트륨 염 하이드레이트/포스페이트, 및 0.8 mg/mL 피트산 나트륨 염 하이드레이트/포스페이트.

이노시톨-포스페이트 종의 체류 시간 목록:

실시예

실시예 1 피테이트 분해 패턴의 측정

효소 반응을 2.7 mmol/L 피테이트 용액(Sigma 68388, lot BCBM4006V)을 100 mmol/L 나트륨 아세테이트 완충액, pH 5.5 중 37℃에서 0.2 U/mL의 피타아제를 사용하여 배양하여 수행하였다. 시간 분해 효소 피테이트 분해 데이터를 99℃에서 10분 동안 써모 쉐이커(thermo shaker)에서 즉시 배양을 통해 상이한 온도 포인트에서 효소 반응을 정지시켜 기록하였다. 샘플을 "HPAEC-UV에 의한 상이한 이노시톨-포스페이트 종의 측정" 방법에 따라서 분석하였다. 이노시톨-포스페이트 이성질체(동일한 양의 포스페이트 잔기를 갖는 이노시톨-포스페이트)의 피크 면적을 합계하였다. 후속적으로, 피크 면적을 상이한 이노시톨-포스페이트 종의 포스페이트 잔기의 양에 대한 신호의 정규화에 의해 보정하였다(즉, 피테이트는 무기 포스페이트 중 하나 보다 6배 더 높은 검출기 반응률을 야기하는 6 포스페이트 잔기를 함유한다). 분해 패턴의 비교를 위해, 동일한 양의 포스페이트가 방출된 운동학적 온도 포인트의 데이터를 수집하였다.

결과를 도 1에 나타낸다.

실시예 2 동일한 효소 양의 피타아제에서 포스페이트 방출 데이터의 측정

5 μL의 효소 용액(100 mmol/L 나트륨 아세테이트 완충액, pH 5.5 중, 0.05% (w/v) Triton X-100)을 95 μL 2.88 mmol/L 나트륨 피테이트(Sigma 68388, lot BCBM4006V)와 함께 100 mmol/L 나트륨 아세테이트 완충액, pH 5.5 중에서 37℃에서 1시간 동안 배양한다. 반응에서 최종 효소 농도는 0.21 μg/mL이다. 반응을 100 μL 10% (w/v) 트리클로로아세트산을 첨가하여 정지시킨다. 후속적으로, 정지된 효소 반응물을 1/10 희석하고, 100 μL의 희석물을 100 μL 몰리브데이트 시약(1.2% (w/v) 암모늄 몰리브데이트; 4.4% (v/v) 황산, 및 27 mg/mL (w/v) 황산제1철의 수용액)과 혼합한다. 용액을 15분 동안 실온에서 배양한다. 700 nm에서 흡광도를 측정하고, 방출된 무기 포스페이트의 양을 무기 포스페이트 표준 용액(0 내지 1.5 mmol/L)을 사용하여 계산한다.

결과를 도 2에 나타낸다.

실시예 3 이노시톨-테트라포스페이트로부터 포스페이트 방출의 측정

이노시톨-테트라포스페이트 제제를 2.7 mmol/L 피테이트를 100 mmol/L 나트륨 아세테이트 완충액, pH 5.5 중에서 37℃에서 1시간 동안 0.1 U/mL의 서열번호 17을 사용하여 배양하여 제조하였다. 반응 후, 효소를 95℃에서 30분 동안 배양하여 비활성화하였다. 수득한 2.7 mmol/L 이노시톨-테트라포스페이트 용액을 0.2 U/mL의 최종 피타아제 농도를 사용하여 실시예 2에 따른 효소 반응에서 기질로서 사용하였다.

결과를 도 3에 나타낸다. 도에서 사용된 약어는 다음과 같다: IP6: 이노시톨-헥사포스페이트; IP5: 이노시톨-펜타포스페이트; IP4: 이노시톨-테트라포스페이트; IP3: 이노시톨-트리포스페이트; IP2: 이노시톨-디포스페이트; IP1: 이노시톨-모노포스페이트; Pi: 포스페이트.

실시예 4 피테이트 분해 패턴의 측정

실시예 4를 실시예 1에서와 같이 수행하고, 그러나, pH는 5로 설정하고, 배양 온도는 40℃였다.

결과를 도 4에 나타낸다.

실시예 5 피테이트 분해 패턴의 측정

실시예 2를 실시예 1에서와 같이 수행하고, 그러나, pH는 5로 설정하고, 배양 온도는 40℃였다.

결과를 도 5에 나타낸다.

실시예 6 피테이트 분해 패턴의 측정

실시예 3을 실시예 1에서와 같이 수행하고, 그러나, pH는 5로 설정하고, 배양 온도는 40℃였다.

결과를 도 6에 나타낸다.

SEQUENCE LISTING <110> CLARIANT INTERNATIONAL LTD <120> USE OF BACTERIAL 3-PHYTASE FOR FEED OR FOOD PRODUCTS <130> 2016DE604-WO-PCT <150> EP 16174759.7 <151> 2016-06-16 <160> 24 <170> KopatentIn 1.7 <210> 1 <211> 403 <212> PRT <213> Dickeya zeae <400> 1 Glu Thr Thr Ser Ser Gly Trp Thr Leu Glu Lys Val Val Glu Val Ser 1 5 10 15 Arg His Gly Val Arg Pro Pro Thr Glu Gly Asn Val Lys Thr Ile Gln 20 25 30 Gln Gly Thr Asp Arg Gln Trp Pro Thr Trp Leu Thr His Tyr Gly Glu 35 40 45 Leu Thr Gly His Gly Tyr Ala Ala Ala Val Leu Lys Gly His Tyr Glu 50 55 60 Gly Gln Tyr Leu Arg Gln His Gly Leu Leu Ser Gln Ala Cys Pro Ala 65 70 75 80 Pro Gly Asp Val Phe Val Trp Ala Ser Pro Leu Gln Arg Thr Arg Glu 85 90 95 Thr Ala Met Ala Leu Met Asp Gly Val Phe Pro Gly Cys Gly Val Ala 100 105 110 Ile Gln Gly Pro Glu Asp Glu Asp Asn Asp Pro Leu Phe His Ala Glu 115 120 125 Thr Ala Gly Val Lys Leu Asp Gln Gln Gln Val Lys Ala Asp Leu Gln 130 135 140 Asn Ala Met Gln Asp Lys Ser Ala Ala Gln Ile Gln Ala Gln Trp Gln 145 150 155 160 Pro Ala Ile Asp Arg Leu Lys Gln Ala Val Cys Leu Pro Asp Lys Pro 165 170 175 Cys Pro Ala Phe Ser Thr Pro Trp Glu Val Lys Glu Asn Lys Lys Gly 180 185 190 Asn Ile Ser Leu Arg Gly Pro Gly Ala Leu Ala Asn Met Ala Glu Thr 195 200 205 Ile Arg Leu Ser Tyr Ser Asn Asn Asn Pro Leu Ser Glu Val Ala Phe 210 215 220 Gly His Ala Lys Thr Ala Ala Glu Val Ala Ala Leu Met Pro Leu Leu 225 230 235 240 Thr Ala Asn Tyr Asp Phe Thr Asn Asp Leu Pro Tyr Val Ala Arg Arg 245 250 255 Gly Ala Ser Val Leu Met Asn Gln Ile Ala Leu Ala Leu Asn Thr Gly 260 265 270 His Gln Ala Asp Ala Pro Pro Asp Val Lys Trp Leu Leu Tyr Val Ala 275 280 285 His Asp Thr Asn Ile Ala Lys Leu Arg Thr Met Leu Gly Phe Thr Trp 290 295 300 Gln Met Gly Asp Tyr Pro Arg Gly Asn Ile Pro Pro Ala Gly Ser Leu 305 310 315 320 Ile Phe Glu Arg Trp Arg Asn Gln Gln Ser Gly Gln Arg Val Val Arg 325 330 335 Ile Tyr Phe Gln Ala Gln Ser Leu Asp Gln Ile Arg Gly Leu Thr Ala 340 345 350 Leu Asp Asp Ser His Pro Pro Leu Arg Ser Glu Phe Ser Met Pro Asp 355 360 365 Cys Gln Lys Thr Asp Ile Gly Thr Leu Cys Pro Tyr Asp Ala Val Met 370 375 380 Lys Arg Leu Asn Asp Ala Val Asp Arg Thr Ala Leu Leu Pro Val Arg 385 390 395 400 Tyr Thr Pro <210> 2 <211> 1209 <212> DNA <213> Dickeya zeae <400> 2 gaaaccacgt cgtcaggctg gacgctggaa aaagtggtgg aggtcagtcg ccacggtgtt 60 cgtccaccga ctgaaggtaa tgttaaaacc attcagcaag gcaccgatcg ccaatggccg 120 acctggctga cccattacgg cgaactgacc ggccacggct acgcggcagc ggtgttaaaa 180 gggcactacg aggggcagta cctgcgccag catgggttac tgagtcaggc ttgtccggct 240 cccggcgatg tgttcgtctg ggccagtccg ctacaacgca cacgggaaac cgcgatggcg 300 ctgatggacg gcgtgttccc cggttgtggt gtggcaattc aaggccctga ggatgaagac 360 aacgacccgc tgtttcatgc cgagacggca ggcgtgaagc tcgatcagca acaggtgaaa 420 gccgacctgc aaaacgcgat gcaggacaaa agcgccgcac aaattcaggc gcaatggcaa 480 ccggctatcg atcgtctgaa acaggcggtc tgcctgccgg ataaaccctg cccggcgttc 540 agcaccccct gggaagtgaa agagaataaa aaagggaata tttctctgcg cggccctggg 600 gcgctggcca atatggcgga gaccattcgg ctgtcctaca gcaacaataa tccactcagt 660 gaggtggcct tcggtcatgc taaaaccgcc gcagaagtgg cagcgctgat gccacttctg 720 accgccaatt acgacttcac caacgatctg ccctacgtgg ctcgccgcgg tgcgtcggta 780 ctgatgaacc agatagcgct ggcgctcaac accgggcatc aggctgatgc cccaccagat 840 gtcaaatggc tgctgtatgt ggcgcatgac accaacatcg ccaaactgcg tacgatgctg 900 ggctttacct ggcagatggg cgactatccg cgcggcaata tcccgcccgc aggtagcctt 960 atcttcgaac gctggcgcaa tcagcagtct ggtcagcgtg ttgtgcgtat ctatttccag 1020 gcacaatcgc tggatcagat tcgtgggctg actgcgctgg atgacagcca cccgccgtta 1080 cgcagcgagt tctcgatgcc tgactgtcag aaaaccgata tcggcaccct gtgcccgtat 1140 gacgcggtga tgaagcgcct taacgacgcg gtggaccgta ccgcgctgct gccagtgcgc 1200 tacacgccg 1209 <210> 3 <211> 403 <212> PRT <213> Dickeya dadantii <400> 3 Asp Thr Pro Ser Ser Gly Trp Thr Leu Glu Lys Val Val Glu Val Ser 1 5 10 15 Arg His Gly Val Arg Pro Pro Thr Lys Gly Asn Val Lys Thr Ile Gln 20 25 30 Glu Gly Thr Asp Arg Gln Trp Pro Thr Trp Leu Thr Gln Tyr Gly Glu 35 40 45 Leu Thr Gly His Gly Tyr Ala Ala Ala Val Leu Lys Gly His Tyr Glu 50 55 60 Gly Gln Tyr Leu Arg Gln His Gly Leu Leu Ser Gln Ala Cys Pro Ala 65 70 75 80 Pro Gly Asp Val Phe Val Trp Ala Ser Pro Leu Gln Arg Thr Arg Glu 85 90 95 Thr Ala Met Ala Leu Met Asp Gly Val Phe Pro Gly Cys Gly Val Ala 100 105 110 Val Gln Gly Pro Glu Asp Glu Asp Asn Asp Pro Leu Phe His Ala Glu 115 120 125 Ala Ala Gly Val Lys Leu Asp Gln Gln Gln Val Lys Ala Asp Leu Gln 130 135 140 Asn Ala Met Gln Asp Lys Ser Ala Ala Gln Ile Gln Ala Gln Trp Gln 145 150 155 160 Pro Ala Ile Asp Arg Leu Lys Gln Ala Val Cys Leu Pro Asp Lys Pro 165 170 175 Cys Pro Ala Phe Ser Thr Pro Trp Glu Val Lys Glu Ser Lys Lys Gly 180 185 190 Asn Ile Ser Leu His Gly Pro Glu Ala Leu Ala Asn Ile Ala Glu Thr 195 200 205 Ile Arg Leu Ser Tyr Ser Asn Asn Asn Pro Leu Ser Glu Val Ala Phe 210 215 220 Gly His Ala Lys Thr Ala Ala Glu Val Ala Ala Leu Met Pro Leu Leu 225 230 235 240 Thr Ala Asn Tyr Asp Phe Thr Asn Asp Leu Pro Tyr Met Ala Arg Arg 245 250 255 Gly Ala Ser Val Leu Met Asn Gln Ile Ala Leu Ala Leu Asn Thr Glu 260 265 270 His Gln Ala Asp Val Pro Pro Asp Val Lys Trp Leu Leu Tyr Val Ala 275 280 285 His Asp Thr Asn Ile Ala Lys Leu Arg Thr Met Leu Gly Phe Thr Trp 290 295 300 Gln Met Gly Asp Tyr Pro Arg Gly Asn Ile Pro Pro Ala Gly Ser Leu 305 310 315 320 Ile Phe Glu Arg Trp Arg Asn Gln Gln Ser Gly Gln Arg Leu Val Arg 325 330 335 Ile Tyr Phe Gln Ala Gln Ser Leu Asp Gln Ile Arg Gly Leu Ala Ala 340 345 350 Leu Asp Asp Ser His Pro Pro Leu Arg Ser Glu Phe Ser Met Ala Asp 355 360 365 Cys Gln Lys Thr Asp Val Gly Thr Leu Cys Pro Tyr Asp Ala Val Met 370 375 380 Lys Arg Leu Asn Asp Ala Val Asp Arg Thr Ala Leu Leu Pro Val Arg 385 390 395 400 Tyr Thr Pro <210> 4 <211> 1209 <212> DNA <213> Dickeya dadantii <400> 4 gacaccccgt cgtcaggctg gacgctggaa aaagtggtgg aagtcagtcg ccacggtgtc 60 cgcccgccga cgaaaggcaa tgttaaaacc attcaggaag gcaccgatcg ccagtggccg 120 acctggttga cgcagtacgg cgagctgacc ggtcacggct acgcggcagc agtgttaaaa 180 gggcactacg aggggcagta cctccgtcag catgggttac tgagtcaggc ttgtccggct 240 cccggcgacg tgttcgtctg ggccagtccg ctacaacgca cgcgagaaac tgcaatggcg 300 ctgatggatg gcgtgttccc cggctgtggt gtggcggtac aaggccctga ggatgaagac 360 aacgacccgc tgtttcatgc cgaggcggcg ggcgtgaagc tcgatcagca gcaggtgaaa 420 gccgacctgc aaaacgcgat gcaggacaaa agcgccgcgc aaattcaggc gcaatggcaa 480 ccggctatcg atcgtctgaa acaggcagtc tgcctgccgg ataaaccctg cccggcgttc 540 agtacgccct gggaagtgaa agagagtaaa aaagggaata tttctctgca cggccctgag 600 gcgctggcta acatcgcgga gactatccgg ctgtcctaca gcaacaataa tccgctcagc 660 gaggtggcct tcggtcatgc taaaaccgcc gcagaggtgg cagcgctgat gccacttctg 720 accgccaatt acgatttcac caacgatctg ccctacatgg cacgccgcgg tgcgtcggta 780 ctgatgaacc agatagcgct ggcgctaaac accgagcatc aggctgatgt cccaccagat 840 gtcaaatggc tactgtatgt ggcgcatgac accaacatcg ccaaactgcg tacgatgctg 900 ggctttacct ggcagatggg cgactatccg cgcggcaata tcccgcccgc aggtagcctt 960 atcttcgaac gctggcgcaa tcagcagtct ggtcagcggc tggtgcgtat ctatttccag 1020 gcacaatcgc tggatcagat tcgtgggcta gcggcgctgg atgacagcca cccgccgtta 1080 cgcagcgagt tctcgatggc cgactgccag aaaaccgacg tcggcaccct gtgtccatat 1140 gacgcggtga tgaagcgcct taacgacgcg gtggaccgta ccgcgctgct gccagtgcgc 1200 tatacgccg 1209 <210> 5 <211> 403 <212> PRT <213> Dickeya zeae <400> 5 Glu Thr Thr Ser Ser Gly Trp Thr Leu Glu Lys Val Val Glu Val Ser 1 5 10 15 Arg His Gly Val Arg Pro Pro Thr Glu Gly Asn Val Lys Thr Ile Gln 20 25 30 Gln Gly Thr Asp Arg Gln Trp Pro Ser Trp Leu Thr His Tyr Gly Glu 35 40 45 Leu Thr Gly His Gly Tyr Ala Ala Ala Val Leu Lys Gly His Tyr Glu 50 55 60 Gly Gln Tyr Leu Arg Gln His Gly Leu Leu Ser Gln Ala Cys Pro Ala 65 70 75 80 Pro Gly Asp Val Phe Val Trp Ala Ser Pro Leu Gln Arg Thr Arg Glu 85 90 95 Thr Ala Met Ala Leu Val Asp Gly Val Phe Pro Gly Cys Gly Val Ala 100 105 110 Ile Gln Gly Pro Glu Asp Glu Asp Asn Asp Pro Leu Phe His Ala Glu 115 120 125 Ala Ala Gly Val Lys Leu Asp Gln Gln Gln Val Lys Ala Asp Leu Gln 130 135 140 Asn Ala Met Gln Asp Lys Ser Ala Ala Gln Ile Gln Ala Gln Trp Gln 145 150 155 160 Pro Ala Ile Asp Arg Leu Lys Gln Ala Val Cys Leu Pro Asp Lys Pro 165 170 175 Cys Pro Ala Phe Ser Thr Pro Trp Glu Val Lys Glu Ser Lys Lys Gly 180 185 190 Asn Ile Ser Leu His Gly Pro Glu Val Leu Ala Asn Ile Ala Glu Thr 195 200 205 Ile Arg Leu Ser Tyr Ser Asn Asn Asn Pro Leu Ser Glu Val Ala Phe 210 215 220 Gly His Ala Lys Thr Ala Ala Glu Val Ala Ala Leu Met Pro Leu Leu 225 230 235 240 Thr Ala Asn Tyr Asp Phe Thr Asn Asp Leu Pro Tyr Val Ala Arg Arg 245 250 255 Gly Ala Ser Val Leu Met Asn Gln Ile Ala Leu Ala Leu Asn Thr Glu 260 265 270 His Gln Ala Asp Ala Pro Pro Asp Val Lys Trp Leu Leu Tyr Val Ala 275 280 285 His Asp Thr Asn Ile Ala Lys Leu Arg Thr Met Leu Gly Phe Thr Trp 290 295 300 Gln Met Gly Asp Tyr Pro Arg Gly Asn Ile Pro Pro Ala Gly Ser Leu 305 310 315 320 Ile Phe Glu Arg Trp Arg Asn Gln Gln Ser Gly Gln Arg Val Val Arg 325 330 335 Ile Tyr Phe Gln Ala Gln Ser Leu Asp Gln Ile Arg Gly Leu Thr Ala 340 345 350 Leu Asp Asp Ser His Pro Pro Leu Arg Ser Glu Phe Ser Met Pro Asp 355 360 365 Cys Gln Lys Thr Asp Ile Gly Thr Leu Cys Pro Tyr Asp Ala Val Met 370 375 380 Lys Arg Leu Asn Asn Ala Val Asp Arg Thr Ala Leu Leu Pro Val Arg 385 390 395 400 Tyr Thr Pro <210> 6 <211> 1209 <212> DNA <213> Dickeya zeae <400> 6 gaaaccacgt cgtcaggctg gacgctggaa aaagtggtgg aggtcagtcg ccacggtgtt 60 cgtccgccga ctgaaggcaa tgttaaaacc attcagcaag gcaccgatcg ccagtggcca 120 agctggctga cccattacgg cgaactgacc ggccacggct acgcagcagc ggtgttaaaa 180 gggcactacg aggggcagta cctgcgccag catgggttac tgagtcaggc ttgtccggct 240 cccggcgatg tgttcgtctg ggccagtccg ctgcaacgca cacgggaaac cgcgatggcg 300 ctagtggatg gcgtgttccc cggttgtggt gtggcgattc aaggccctga ggatgaagac 360 aacgacccgc tgtttcatgc cgaggcggca ggcgtgaagc tcgatcagca acaggtgaaa 420 gccgacctgc aaaacgcgat gcaggacaaa agcgccgcac aaattcaggc gcaatggcaa 480 ccggctatcg atcgcctgaa acaggcggtc tgtctgccgg ataaaccctg cccggcgttc 540 agcacgccct gggaagtgaa agagagtaaa aaagggaata tttctctgca cggccctgag 600 gtgctggcta acatcgcaga gactatccgg ctgtcctaca gtaacaataa tccgctcagt 660 gaggtggcct tcggtcatgc taaaactgcc gcagaggtgg cagcactgat gccgcttctg 720 accgccaatt acgatttcac caacgatctg ccctacgtgg cacgccgcgg tgcgtcggta 780 ctgatgaacc agatagcgct ggcactcaac accgagcatc aggctgatgc cccaccagat 840 gtcaaatggc tgctgtatgt ggcgcatgac accaacatcg ccaaactgcg tacgatgctc 900 ggctttacct ggcagatggg cgactatccg cgcggcaata tcccgcccgc aggtagcctt 960 atcttcgaac gctggcgcaa tcaacagtct ggtcagcgcg ttgtgcgtat ctatttccag 1020 gcacaatcgc tggatcagat tcgtgggctg actgcgctgg atgacagcca cccgccgtta 1080 cgcagcgagt tctcgatgcc tgactgtcag aaaaccgata tcggcaccct gtgcccgtat 1140 gacgcagtga tgaagcgcct taacaacgcg gtggaccgta ccgcgctact gccagtgcgc 1200 tatacgccg 1209 <210> 7 <211> 403 <212> PRT <213> Dickeya zeae <400> 7 Asp Thr Pro Ser Ser Gly Trp Thr Leu Glu Lys Val Val Glu Val Ser 1 5 10 15 Arg His Gly Val Arg Pro Pro Thr Lys Gly Asn Val Lys Thr Ile Gln 20 25 30 Glu Gly Thr Asp Arg Gln Trp Pro Thr Trp Leu Thr Gln Tyr Gly Glu 35 40 45 Leu Thr Gly His Gly Tyr Ala Ala Ala Val Leu Lys Gly His Tyr Glu 50 55 60 Gly Gln Tyr Leu Arg Gln His Gly Leu Leu Ser Gln Ala Cys Pro Ala 65 70 75 80 Pro Gly Asp Val Phe Val Trp Ala Ser Pro Leu Gln Arg Thr Arg Glu 85 90 95 Thr Ala Met Ala Leu Met Asp Gly Val Phe Pro Gly Cys Gly Val Ala 100 105 110 Ile Gln Gly Pro Glu Asp Glu Asp Asn Asp Pro Leu Phe His Ala Glu 115 120 125 Thr Ala Gly Val Thr Leu Asp Gln Gln Gln Val Lys Ala Asp Leu Gln 130 135 140 Asn Ala Met Gln Asp Lys Ser Ala Ala Gln Ile Gln Ala Gln Trp Gln 145 150 155 160 Pro Ala Ile Asp Arg Leu Lys Gln Ala Val Cys Leu Pro Asp Lys Pro 165 170 175 Cys Pro Ala Phe Ser Thr Pro Trp Glu Val Lys Glu Ser Lys Lys Gly 180 185 190 Asn Ile Ser Leu His Gly Pro Glu Val Leu Ala Asn Ile Ala Glu Thr 195 200 205 Ile Arg Leu Ser Tyr Ser Asn Asn Asn Pro Leu Ser Glu Val Ala Phe 210 215 220 Gly His Ala Lys Thr Ala Ala Glu Val Ala Ala Leu Met Pro Leu Leu 225 230 235 240 Thr Ala Asn Tyr Asp Phe Thr Asn Asp Leu Pro Tyr Val Ala Arg Arg 245 250 255 Gly Ala Ser Val Leu Met Asn Gln Ile Ala Leu Ala Leu Asn Thr Glu 260 265 270 His Gln Ala Asp Ala Pro Pro Asp Ala Lys Trp Leu Leu Tyr Val Ala 275 280 285 His Asp Thr Asn Ile Ala Lys Leu Arg Thr Met Leu Gly Phe Thr Trp 290 295 300 Gln Met Gly Asp Tyr Pro Arg Gly Asn Ile Pro Pro Ala Gly Ser Leu 305 310 315 320 Ile Phe Glu Arg Trp Arg Asn Gln Gln Ser Gly Gln Arg Val Val Arg 325 330 335 Ile Tyr Phe Gln Ala Gln Ser Leu Asp Gln Ile Arg Gly Leu Ala Ala 340 345 350 Leu Asp Asp Ser His Pro Pro Leu Arg Ser Glu Phe Ser Met Pro Asp 355 360 365 Cys Gln Lys Thr Asp Ile Gly Thr Leu Cys Pro Tyr Asp Ala Val Met 370 375 380 Lys Arg Leu Asn Asp Ala Val Asp Arg Thr Ala Leu Leu Pro Val His 385 390 395 400 Tyr Thr Pro <210> 8 <211> 1209 <212> DNA <213> Dickeya zeae <400> 8 gacaccccgt cgtcaggctg gacgctggaa aaagtggtgg aagtcagtcg ccacggtgtc 60 cgcccgccga cgaaaggcaa tgttaaaacc attcaggaag gcaccgatcg ccagtggccg 120 acctggttga cgcagtacgg cgagctgacc ggtcacggct acgcggcagc ggtgttaaaa 180 gggcactacg aggggcagta cctgcgccag catgggttac tgagtcaggc ttgtccggct 240 cccggcgatg tgttcgtctg ggccagtccg ctacaacgca cgcgggaaac cgcaatggcg 300 ctgatggatg gcgtgttccc cggttgtggt gtggcgattc aaggccctga ggatgaagac 360 aacgacccgc tgtttcatgc cgagacggca ggtgtgacgc tcgatcagca gcaggtgaaa 420 gccgacctgc aaaacgcgat gcaggacaaa agcgccgcgc aaattcaggc gcaatggcaa 480 cccgctatcg atcgtctgaa acaggcagtc tgcctgccgg ataaaccctg cccggcgttc 540 agcacgccct gggaagtgaa agagagtaaa aaagggaata tttcactgca cggccctgag 600 gtgctggcca acatcgcgga gactatccgg ctgtcctaca gcaacaataa tccgctcagc 660 gaggtggcct tcggtcatgc taaaaccgcc gcagaggtgg ctgcgctgat gccacttctg 720 accgccaatt acgatttcac caacgatctg ccctacgtgg cacgccgcgg tgcgtcggta 780 ctgatgaacc agatagcgct ggcactcaac accgagcatc aggctgatgc cccaccagat 840 gccaaatggc tgctgtatgt ggcgcatgac accaacatcg ccaaactgcg tacgatgctg 900 ggctttacct ggcagatggg cgactatccg cgcggcaata tcccgcccgc aggtagcctt 960 atcttcgaac gctggcgcaa tcagcagtct ggtcagcgtg ttgtgcgtat ctatttccag 1020 gcacaatcgc tggatcagat tcgtgggctc gcggcgctgg atgacagcca cccgccgtta 1080 cgcagcgagt tctcgatgcc tgactgtcag aaaaccgata tcggtaccct gtgcccgtat 1140 gacgcggtga tgaagcgcct taacgacgcg gtggaccgta ccgcgctgct gccagtgcac 1200 tatacgccg 1209 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<213> Dickeya dadantii <400> 13 Glu Thr Ala Pro Ser Gly Trp Ala Leu Glu Lys Val Val Glu Ile Ser 1 5 10 15 Arg His Gly Val Arg Pro Pro Thr Glu Gly Asn Val Lys Thr Ile Gln 20 25 30 Glu Gly Thr Gly Arg Asp Trp Pro Thr Trp Leu Thr His Tyr Gly Glu 35 40 45 Leu Thr Gly His Gly Tyr Ala Ala Ala Val Leu Lys Gly Gln Tyr Glu 50 55 60 Gly Gln Tyr Leu Arg Gln His Gly Leu Leu Thr Arg Asn Cys Pro Ala 65 70 75 80 Pro Asp Asp Val Phe Val Trp Ala Ser Pro Leu Gln Arg Thr Gln Glu 85 90 95 Thr Ala Met Ala Leu Met Asp Gly Val Phe Pro Gly Cys Gly Val Val 100 105 110 Ile Arg Gly Pro Glu Ser Glu Asp Asn Asp Pro Leu Phe His Ala Glu 115 120 125 Thr Ala Gly Val Leu Val Asp Gln Glu Gln Val Lys Val Asp Leu Gln 130 135 140 Lys Ala Met Gln Gly Lys Ser Ala Glu Gln Ile Gln Ala Glu Trp Gln 145 150 155 160 Pro Ala Ile Asp Arg Leu Lys Gln Ala Val Cys Leu Pro Asp Lys Pro 165 170 175 Cys Pro Ala Phe Ser Ala Lys Trp Glu Leu Lys Glu Ser Lys Lys Gly 180 185 190 Asn Thr Ser Leu His Gly Pro Glu Ala Leu Ala Asn Met Ala Glu Thr 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atttttatct cttctgattc cgttaacccc gcaatctgca 60 ttcgctcaga gtgagccgga gctgaagctg gaaagtgtgg tgattgtcag tcgtcatggt 120 gtgcgtgctc caaccaaggc cacgcaactg atgcaggatg tcaccccaga cgcatggcca 180 acctggccgg taaaactggg ttggctgaca ccgcgcggtg gtgagctaat cgcctatctc 240 ggacattacc aacgccagcg tctggtagcc gacggattgc tggcgaaaaa gggctgcccg 300 cagtctggtc aggtcgcgat tattgctgat gtcgacgagc gtacccgtaa aacaggcgaa 360 gccttcgccg ccgggctggc acctgactgt gcaataaccg tacataccca ggcagatacg 420 tccagtcccg atccgttatt taatcctcta aaaactggcg tttgccaact ggataacgcg 480 aacgtgactg acgcgatcct cagcagggca ggagggtcaa ttgctgactt taccgggcat 540 cggcaaacgg cgtttcgcga actggaacgg gtgcttaatt ttccgcaatc aaacttgtgc 600 cttaaacgtg agaaacagga cgaaagctgt tcattaacgc aggcattacc atcggaactc 660 aaggtgagcg ccgacaatgt ctcattaacc ggtgcggtaa gcctcgcatc aatgctgacg 720 gagatatttc tcctgcaaca agcacaggga atgccggagc cggggtgggg aaggatcacc 780 gattcacacc agtggaacac cttgctaagt ttgcataacg cgcaatttta tttgctacaa 840 cgcacgccag aggttgcccg cagccgcgcc accccgttat tagatttgat caagacagcg 900 ttgacgcccc atccaccgca aaaacaggcg tatggtgtga cattacccac ttcagtgctg 960 tttatcgccg gacacgatac taatctggca aatctcggcg gcgcactgga gctcaactgg 1020 acgcttcccg gtcagccgga taacacgccg ccaggtggtg aactggtgtt tgaacgctgg 1080 cgtcggctaa gcgataacag ccagtggatt caggtttcgc tggtcttcca gactttacag 1140 cagatgcgtg ataaaacgcc gctgtcatta aatacgccgc ccggagaggt gaaactgacc 1200 ctggcaggat gtgaagagcg aaatgcgcag ggcatgtgtt cgttggcagg ttttacgcaa 1260 atcgtgaatg aagcacgcat accggcgtgc agtttg 1296 <210> 19 <211> 412 <212> PRT <213> Citrobacter braakii <400> 19 Met Glu Glu Gln Asn Gly Met Lys Leu Glu Arg Val Val Ile Val Ser 1 5 10 15 Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Phe Thr Pro Ile Met Lys Asp 20 25 30 Val Thr Pro Asp Gln Trp Pro Gln Trp Asp Val Pro Leu Gly Trp Leu 35 40 45 Thr Pro Arg Gly Gly Glu Leu Val Ser Glu Leu Gly Gln Tyr Gln Arg 50 55 60 Leu Trp Phe Thr Ser Lys Gly Leu Leu Asn Asn Gln Thr Cys Pro Ser 65 70 75 80 Pro Gly Gln Val Ala Val Ile Ala Asp Thr Asp Gln Arg Thr Arg Lys 85 90 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360 aaagctgatc ctctttttaa tccggtaaaa atggggaaat gttcgtttaa cacattgaag 420 gttaaaaacg ctattctgga acgggccgga ggaaatattg aactgtatac ccaacgctat 480 caatcttcat ttcggaccct ggaaaatgtt ttaaatttct cacaatcgga gacatgtaag 540 actacagaaa agtctacgaa atgcacatta ccagaggctt taccgtctga acttaaggta 600 acgcctgaca atgtatcatt acctggtgcc tggagccttt cttccacgct gactgagata 660 tttctgttgc aagaggccca gggaatgcca caggtagcct gggggcgtat tacgggagaa 720 aaagaatgga gagatttgtt aagtctgcat aacgctcagt ttgatctttt gcaaagaact 780 ccagaagttg cccgtagtag agccacacca ttactcgata tgatagacac tacactattg 840 acaaatggtg caacagaaaa caggtatggc ataaaattac ctgtatctct gttgtttatt 900 gctggtcatg ataccaatct tgcaaattta agcggggctt tagatcttaa ctggtcgcta 960 cccggtcaac ccgataatac ccctcctggt ggggagcttg tattcgaaaa gtggaaaaga 1020 accagtgata atacggattg ggttcaggtt tcatttgttt atcagacgct gagagatatg 1080 agggatatac aaccgttgtc gttagaaaaa cctgccggca aagttgattt aaaattaatt 1140 gcatgtgaag agaaaaatat tcagggaatg tgttcgttaa aaagtttttc caggctcatt 1200 aaggaaattc 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Tyr Ile Pro Phe Leu Ala Leu Met Asn Thr Thr Leu Asn Phe Ser 195 200 205 Thr Ser Ala Trp Cys Gln Lys His Ser Ala Asp Lys Ser Cys Asp Leu 210 215 220 Gly Leu Ser Met Pro Ser Lys Leu Ser Ile Lys Asp Asn Gly Asn Lys 225 230 235 240 Val Ala Leu Asp Gly Ala Ile Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile 245 250 255 Phe Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Gln Ala Ala Trp Gly Asn 260 265 270 Ile His Ser Glu Gln Glu Trp Ala Ser Leu Leu Lys Leu His Asn Val 275 280 285 Gln Phe Asp Leu Met Ala Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Arg His Asn Gly 290 295 300 Thr Pro Leu Leu Gln Ala Ile Ser Asn Ala Leu Asn Pro Asn Ala Thr 305 310 315 320 Glu Ser Lys Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Asn Lys Ile Leu Phe Ile 325 330 335 Ala Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Ala Gly Met Leu Asn Met 340 345 350 Arg Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala 355 360 365 Leu Val Phe Glu Arg Leu Ala Asp Lys Ser Gly Lys Gln Tyr Val Ser 370 375 380 Val Ser Met Val Tyr Gln Thr Leu Glu Gln Leu Arg Ser Gln Thr Pro 385 390 395 400 Leu Ser Leu Asn Gln Pro Ala Gly Ser Val Gln Leu Lys Ile Pro Gly 405 410 415 Cys Asn Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Ser Thr Phe Thr 420 425 430 Arg Val Val Ser Gln Ser Val Glu Pro Gly Cys Gln Leu Gln 435 440 445 <210> 22 <211> 1338 <212> DNA <213> Buttiauxella sp. <400> 22 atgacgatct ctgcgtttaa ccgcaaaaaa ctgacgcttc accctggtct gttcgtagca 60 ctgagcgcca tattttcatt aggctctacg gcctatgcca acgacactcc cgcttcaggc 120 taccaggttg agaaagtggt aatactcagc cgccacgggg tgcgagcacc aaccaaaatg 180 acacagacca tgcgcgacgt aacacctaat acctggcccg aatggccagt aaaattgggt 240 tatatcacgc cacgcggtga gcatctgatt agcctgatgg gcgggtttta tcgccagaag 300 tttcaacaac agggcatttt atcgcagggc agttgcccca caccaaactc aatttatgtc 360 tgggcagacg ttgatcagcg cacgcttaaa actggcgaag ctttcctggc agggcttgct 420 ccggaatgtc atttaactat tcaccaccag caggacatca aaaaagccga tccgctgttc 480 catccggtga aagcgggcac ctgttcaatg gataaaactc aggtccaaca ggccgttgaa 540 aaagaagctc aaacccccat tgataatctg aatcagcact atattccctt tctggccttg 600 atgaatacga ccctcaactt 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Ala Val Pro Ala Ser Arg Asn Gln Ser Ser Cys Asp 20 25 30 Thr Val Asp Gln Gly Tyr Gln Cys Phe Ser Glu Thr Ser His Leu Trp 35 40 45 Gly Gln Tyr Ala Pro Phe Phe Ser Leu Ala Asn Glu Ser Val Ile Ser 50 55 60 Pro Glu Val Pro Ala Gly Cys Arg Val Thr Phe Ala Gln Val Leu Ser 65 70 75 80 Arg His Gly Ala Arg Tyr Pro Thr Asp Ser Lys Gly Lys Lys Tyr Ser 85 90 95 Ala Leu Ile Glu Glu Ile Gln Gln Asn Ala Thr Thr Phe Asp Gly Lys 100 105 110 Tyr Ala Phe Leu Lys Thr Tyr Asn Tyr Ser Leu Gly Ala Asp Asp Leu 115 120 125 Thr Pro Phe Gly Glu Gln Glu Leu Val Asn Ser Gly Ile Lys Phe Tyr 130 135 140 Gln Arg Tyr Glu Ser Leu Thr Arg Asn Ile Val Pro Phe Ile Arg Ser 145 150 155 160 Ser Gly Ser Ser Arg Val Ile Ala Ser Gly Lys Lys Phe Ile Glu Gly 165 170 175 Phe Gln Ser Thr Lys Leu Lys Asp Pro Arg Ala Gln Pro Gly Gln Ser 180 185 190 Ser Pro Lys Ile Asp Val Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser Ser Asn Asn 195 200 205 Thr Leu Asp Pro Gly Thr Cys Thr Val Phe Glu Asp Ser Glu Leu Ala 210 215 220 Asp Thr Val Glu Ala Asn Phe Thr Ala Thr Phe Val Pro Ser Ile Arg 225 230 235 240 Gln Arg Leu Glu Asn Asp Leu Ser Gly Val Thr Leu Thr Asp Thr Glu 245 250 255 Val Thr Tyr Leu Met Asp Met Cys Ser Phe Asp Thr Ile Ser Thr Ser 260 265 270 Thr Val Asp Thr Lys Leu Ser Pro Phe Cys Asp Leu Phe Thr His Asp 275 280 285 Glu Trp Ile Asn Tyr Asp Tyr Leu Gln Ser Leu Lys Lys Tyr Tyr Gly 290 295 300 His Gly Ala Gly Asn Pro Leu Gly Pro Thr Gln Gly Val Gly Tyr Ala 305 310 315 320 Asn Glu Leu Ile Ala Arg Leu Thr His Ser Pro Val His Asp Asp Thr 325 330 335 Ser Ser Asn His Thr Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Phe Pro Leu Asn 340 345 350 Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Phe Ser His Asp Asn Gly Ile Ile Ser Ile 355 360 365 Leu Phe Ala Leu Gly Leu Tyr Asn Gly Thr Lys Pro Leu Ser Thr Thr 370 375 380 Thr Val Glu Asn Ile Thr Gln Thr Asp Gly Phe Ser Ser Ala Trp Thr 385 390 395 400 Val Pro Phe Ala Ser Arg Leu Tyr Val Glu Met Met Gln Cys Gln Ala 405 410 415 Glu Gln Glu Pro Leu Val Arg Val Leu Val Asn Asp Arg Val Val Pro 420 425 430 Leu His Gly Cys Pro Val Asp Ala Leu Gly Arg Cys Thr Arg Asp Ser 435 440 445 Phe Val Arg Gly Leu Ser Phe Ala Arg Ser Gly Gly Asp Trp Ala Glu 450 455 460 Cys Phe Ala 465 <210> 24 <211> 1401 <212> DNA <213> Aspergillus niger <400> 24 atgggcgtct ctgctgttct acttcctttg tatctcctgt ctggagtcac ctccggactg 60 gcagtccccg cctcgagaaa tcaatccagt tgcgatacgg tcgatcaggg gtatcaatgc 120 ttctccgaga cttcgcatct ttggggtcaa tacgcaccgt tcttctctct ggcaaacgaa 180 tcggtcatct cccctgaggt gcccgccgga tgcagagtca ctttcgctca ggtcctctcc 240 cgtcatggag cgcggtatcc gaccgactcc aagggcaaga aatactccgc tctcattgag 300 gagatccagc agaacgcgac cacctttgac ggaaaatatg ccttcctgaa gacatacaac 360 tacagcttgg gtgcagatga cctgactccc ttcggagaac aggagctagt caactccggc 420 atcaagttct accagcggta cgaatcgctc acaaggaaca tcgttccatt catccgatcc 480 tctggctcca gccgcgtgat cgcctccggc aagaaattca tcgagggctt ccagagcacc 540 aagctgaagg atcctcgtgc ccagcccggc caatcgtcgc ccaagatcga cgtggtcatt 600 tccgaggcca gctcatccaa caacactctc gacccaggca cctgcactgt cttcgaagac 660 agcgaattgg ccgataccgt cgaagccaat 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Claims (11)

1. 사료 또는 식품 제품의 제조를 위한 적어도 하나의 박테리아 3-피타아제의 용도.
2. 제1항에 있어서, 상기 피타아제가 37℃ 및 pH 5.5에서 0.2 U/mL의 효소 용량(dosage)을 사용하는 2.7 mmol/L 피테이트의 검정 내에서 35% 무기 포스페이트 방출 후 중간체 생성물 이노시톨-테트라포스페이트의 25% 미만(wt./wt. 유리 포스페이트) 축적을 특징으로 하는, 용도.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 피타아제가 0.21 μg/mL의 효소 농도를 사용하여 1시간 후 pH 5.5에서 2.7 mmol/L 피테이트로부터 적어도 15%의 포스페이트 방출을 특징으로 하는, 용도.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피타아제가 딕케야(Dickeya) 또는 세라티아(Serratia) 속으로부터의 피타아제인, 용도.
5. 제4항에 있어서, 상기 피타아제가 딕케야 종(Dickeya sp.), 세라티아 종(Serratia sp.), 딕케야 제아(Dickeya zeae), 딕케야 크리산테미(Dickeya chrysanthemi), 딕케야 다단틸(Dickeya dadantii), 딕케야 솔라니(Dickeya solani) 또는 딕케야 파라디시아카(Dickeya paradisiaca)로부터의 피타아제인, 용도.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피타아제가 서열번호 1에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 나타내는, 용도.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피타아제가 30 내지 65℃의 최적 온도 및/또는 pH 2.5 내지 5.5의 최적 pH를 나타내는, 용도.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사료 또는 식품 제품이 추가로 비타민, 미네랄, 유기 산, 프로바이오틱 성분, 유지, 지방, 안료, 성장 인자, 항미생물제, 셀룰로스, 전분으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물을 포함하는, 용도.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사료 또는 식품 제품이 건조 또는 액체 형태인, 용도.
10. 동물에게 공급하기 위한 박테리아 3- 피타아제의 용도.
11. 식품 또는 사료 첨가제 제조를 위한 박테리아 3- 피타아제의 용도.

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