KR20190007695A - Parkinson`s disease animal model using optogenetics and uses thereof - Google Patents
Parkinson`s disease animal model using optogenetics and uses thereof Download PDFInfo
- Publication number
- KR20190007695A KR20190007695A KR1020170089011A KR20170089011A KR20190007695A KR 20190007695 A KR20190007695 A KR 20190007695A KR 1020170089011 A KR1020170089011 A KR 1020170089011A KR 20170089011 A KR20170089011 A KR 20170089011A KR 20190007695 A KR20190007695 A KR 20190007695A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- parkinson
- disease
- animal model
- animal
- light
- Prior art date
Links
- 238000010171 animal model Methods 0.000 title claims abstract description 99
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title description 3
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 claims abstract description 149
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 claims abstract description 72
- 108010050754 Halorhodopsins Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims description 43
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 28
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 27
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 25
- 108091000117 Tyrosine 3-Monooxygenase Proteins 0.000 claims description 25
- 102000048218 Tyrosine 3-monooxygenases Human genes 0.000 claims description 25
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 14
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 claims description 10
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 claims description 9
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 8
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000005021 gait Effects 0.000 claims description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 6
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 claims description 5
- 208000027089 Parkinsonian disease Diseases 0.000 claims description 4
- 206010034010 Parkinsonism Diseases 0.000 claims description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 3
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 claims description 3
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 claims description 3
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 claims description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 3
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 claims description 3
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 abstract description 43
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 abstract description 28
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 11
- 210000003523 substantia nigra Anatomy 0.000 abstract description 9
- 238000004088 simulation Methods 0.000 abstract 2
- DIVDFFZHCJEHGG-UHFFFAOYSA-N oxidopamine Chemical compound NCCC1=CC(O)=C(O)C=C1O DIVDFFZHCJEHGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 31
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 238000009227 behaviour therapy Methods 0.000 description 15
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 15
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 description 12
- 231100000618 neurotoxin Toxicity 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 101710138657 Neurotoxin Proteins 0.000 description 9
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 210000004129 prosencephalon Anatomy 0.000 description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 6
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 5
- 210000005064 dopaminergic neuron Anatomy 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 210000001577 neostriatum Anatomy 0.000 description 4
- PLRACCBDVIHHLZ-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine Chemical compound C1N(C)CCC(C=2C=CC=CC=2)=C1 PLRACCBDVIHHLZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 210000004281 subthalamic nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- IGAZHQIYONOHQN-UHFFFAOYSA-N Alexa Fluor 555 Chemical compound C=12C=CC(=N)C(S(O)(=O)=O)=C2OC2=C(S(O)(=O)=O)C(N)=CC=C2C=1C1=CC=C(C(O)=O)C=C1C(O)=O IGAZHQIYONOHQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108010047357 Luminescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000006830 Luminescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102000010175 Opsin Human genes 0.000 description 2
- 108050001704 Opsin Proteins 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 210000004227 basal ganglia Anatomy 0.000 description 2
- 208000013404 behavioral symptom Diseases 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 208000010877 cognitive disease Diseases 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 2
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 2
- FIKAKWIAUPDISJ-UHFFFAOYSA-L paraquat dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].C1=C[N+](C)=CC=C1C1=CC=[N+](C)C=C1 FIKAKWIAUPDISJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- DNXIKVLOVZVMQF-UHFFFAOYSA-N (3beta,16beta,17alpha,18beta,20alpha)-17-hydroxy-11-methoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]-yohimban-16-carboxylic acid, methyl ester Natural products C1C2CN3CCC(C4=CC=C(OC)C=C4N4)=C4C3CC2C(C(=O)OC)C(O)C1OC(=O)C1=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C1 DNXIKVLOVZVMQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000019901 Anxiety disease Diseases 0.000 description 1
- 206010006100 Bradykinesia Diseases 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000028698 Cognitive impairment Diseases 0.000 description 1
- 241001573498 Compacta Species 0.000 description 1
- 206010012239 Delusion Diseases 0.000 description 1
- 206010012374 Depressed mood Diseases 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 102000006441 Dopamine Plasma Membrane Transport Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010044266 Dopamine Plasma Membrane Transport Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001269524 Dura Species 0.000 description 1
- 206010017577 Gait disturbance Diseases 0.000 description 1
- 208000004547 Hallucinations Diseases 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- 208000006083 Hypokinesia Diseases 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 208000019430 Motor disease Diseases 0.000 description 1
- 208000002740 Muscle Rigidity Diseases 0.000 description 1
- 241000204971 Natronomonas pharaonis Species 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- LCQMZZCPPSWADO-UHFFFAOYSA-N Reserpilin Natural products COC(=O)C1COCC2CN3CCc4c([nH]c5cc(OC)c(OC)cc45)C3CC12 LCQMZZCPPSWADO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QEVHRUUCFGRFIF-SFWBKIHZSA-N Reserpine Natural products O=C(OC)[C@@H]1[C@H](OC)[C@H](OC(=O)c2cc(OC)c(OC)c(OC)c2)C[C@H]2[C@@H]1C[C@H]1N(C2)CCc2c3c([nH]c12)cc(OC)cc3 QEVHRUUCFGRFIF-SFWBKIHZSA-N 0.000 description 1
- 206010071390 Resting tremor Diseases 0.000 description 1
- 206010044565 Tremor Diseases 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 102000009659 Vesicular Monoamine Transport Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010020033 Vesicular Monoamine Transport Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003444 anaesthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036506 anxiety Effects 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 210000003403 autonomic nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 231100000868 delusion Toxicity 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 230000006739 dopaminergic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000003291 dopaminomimetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005553 drilling Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000009207 exercise therapy Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 210000001061 forehead Anatomy 0.000 description 1
- 238000002695 general anesthesia Methods 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 210000005240 left ventricle Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 210000004245 medial forebrain bundle Anatomy 0.000 description 1
- 230000003340 mental effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000001640 nerve ending Anatomy 0.000 description 1
- 208000020470 nervous system symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 231100000189 neurotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002887 neurotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013307 optical fiber Substances 0.000 description 1
- 230000001936 parietal effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 230000001144 postural effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 208000020016 psychiatric disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- BJOIZNZVOZKDIG-MDEJGZGSSA-N reserpine Chemical compound O([C@H]1[C@@H]([C@H]([C@H]2C[C@@H]3C4=C([C]5C=CC(OC)=CC5=N4)CCN3C[C@H]2C1)C(=O)OC)OC)C(=O)C1=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C1 BJOIZNZVOZKDIG-MDEJGZGSSA-N 0.000 description 1
- 229960003147 reserpine Drugs 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 229940069575 rompun Drugs 0.000 description 1
- MDMGHDFNKNZPAU-UHFFFAOYSA-N roserpine Natural products C1C2CN3CCC(C4=CC=C(OC)C=C4N4)=C4C3CC2C(OC(C)=O)C(OC)C1OC(=O)C1=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C1 MDMGHDFNKNZPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- 208000019116 sleep disease Diseases 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000002504 synaptic vesicle Anatomy 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000011277 treatment modality Methods 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001364 upper extremity Anatomy 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- QYEFBJRXKKSABU-UHFFFAOYSA-N xylazine hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 QYEFBJRXKKSABU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
- G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/10—Animals modified by protein administration, for non-therapeutic purpose
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/35—Animals modified by environmental factors, e.g. temperature, O2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
- A01K2267/0318—Animal model for neurodegenerative disease, e.g. non- Alzheimer's
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
- C12N2015/8527—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic for producing animal models, e.g. for tests or diseases
- C12N2015/8536—Animal models for genetic diseases
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Description
본 발명은 뇌 흑질에서의 할로로돕신(halorhodopsine)에 광자극을 주어 활성을 유도한 파킨슨병 동물 모델, 이의 제조 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to an animal model of Parkinson's disease that induces activity by giving a light stimulus to halorhodopsine in brain substantia nigra, a method for its production, and its use.
파킨슨병(Parkinson's disease)은 천천히 진행성으로 나타나는 신경계 퇴행성 질환으로, 아직까지 명확한 발병 원인은 밝혀지지 않았으나 기저핵(basal ganglia)의 구성 요소인 흑질의 치밀부(pars compacta of substantia nigra)에 있는 도파민성 신경세포가 점진적으로 소실되어 나타나는 것으로 알려져 있다. 이러한 파킨슨병은 알츠하이머병(alzheimer's diesease) 다음으로 높은 유병률을 나타내는 신경 퇴행성 질환으로 알려져 있다. 1817년 영국의 제임스 파킨슨이 처음 보고한 이래 산업화 및 고령 사회가 진행되면서 유병률이 높아지고 있다. 미국의 유병률은 60세 이상 인구에서 약 1% 이상으로 알려져 있고, 우리나라의 경우에서도 60세 이상에서 약 1.66%의 유병률을 나타내는 것으로 보고된 바 있다. 현재 전 세계적으로 인구의 고령화가 계속 진행되고 있으므로, 이러한 추세를 감안한다면 파킨슨병 환자의 발생은 지속적으로 증가될 것으로 예상할 수 있다.Parkinson's disease is a slowly progressive neurodegenerative disease that has not yet been elucidated yet, but it has been reported that dopaminergic neurons in the pars compacta of the substantia nigra, a component of the basal ganglia It is known that cells gradually disappear. Such Parkinson's disease is known as a neurodegenerative disease with a higher prevalence next to Alzheimer's diesease. Since the first report of James Parkinson in England in 1817, the prevalence of industrialization and aging society has increased. The prevalence of the United States is known to be more than 1% in the population over 60 years of age, and in Korea, it has been reported to be about 1.66% in those over 60 years of age. Given the current global population aging, this trend can be expected to continue to increase the incidence of Parkinson's patients.
파킨슨병의 임상적 증상은 크게 운동 증상(motor symptom)과 비운동 증상(nonmotor symptom)으로 구분할 수 있다. 운동 증상은 운동완서(bradykinesia), 안정 시 진전(resting tremor), 경직(rigidity), 자세의 불안정(postural instability) 그리고 보행 장애(gait disorder) 등의 증상이며, 비운동 증상은 불안, 우울 기분, 환각이나 망상과 같은 정신 증상, 인지 기능의 장애, 수면 장애, 감각 증상, 자율 신경계 증상 등으로 나눌 수 있다. 이러한 파킨슨병의 다양한 임상증상 중 운동장애는 가장 대표적인 증상이라 할 수 있으며, 이를 통해 환자를 임상적으로 진단한다. Clinical symptoms of Parkinson's disease can be divided into motor and nonmotor symptoms. Exercise symptoms are symptoms such as bradykinesia, resting tremor, rigidity, postural instability, and gait disorder. Non-exercise symptoms are anxiety, depressed mood, Mental symptoms such as hallucinations and delusions, cognitive impairment, sleep disorders, sensory symptoms, and autonomic nervous system symptoms. Among the various clinical symptoms of Parkinson's disease, motor disorders are the most representative symptom and clinically diagnose the patient.
파킨슨병은 일차적으로 약물 치료와 운동 요법 등을 병향하여 치료하며, 약물 치료로도 적절히 치료되지 않아 일상 생활에 지장이 있는 경우는 뇌심부 자극술(deep brain stimulation) 등을 이용한 수술적 치료를 시행한다. 뇌심부 자극술은 수술적 치료방법 중 가장 흔히 이용되는 수술로 뇌심부 특히 시상밑핵(subthalamic nucleus)에 전극을 삽입하여 전기적 자극을 줌으로서 증상을 완화시키는 치료방법이다. 하지만, 이러한 치료방법이 어떠한 기전으로 작용을 하는지에 대해서는 아직 명확하지 않아, 파킨슨병의 발병 기전 및 치료 방법에 대한 연구가 계속되고 있다.Parkinson's disease is treated primarily for medication and exercise therapy, and if the medication is not properly treated, the patient is treated with deep brain stimulation if he or she has difficulty in daily life . Deep brain stimulation is the most commonly used surgical treatment. It is a method of relieving symptoms by inserting electrodes into the deep brain of the brain, especially the subthalamic nucleus, with electrical stimulation. However, it remains unclear as to the mechanism by which such treatment modalities work, and the onset mechanism and treatment methods of Parkinson's disease continue to be studied.
최근, 광유전자(optogenetics) 기술의 발달은 살아있는 신경세포의 활성과 억제를 가능하게 하였고, 특히 파킨슨병 모델 동물실험에서 뇌심부 자극술과 매우 유사한 기전을 가지고 있다. 따라서, 광유전자를 사용하는 기술은 파킨슨병의 치료기전 및 병의 진행 등 아직 명확히 밝혀지지 않은 많은 현상 및 기전을 연구하는 과정에서 시험관 내 모델/ 동물 모델에 적용하여 사용할 수 있는 것으로 보고된 바 있다(비특허문헌 001, 비특허문헌 002, 비특허문헌 003). 관련된 연구로서, 수산화도파민(6-hydroxydopamine, 6-OHDA)을 이용하여 제조한 파킨슨병 백서 모델에 광유전자와 광자극기를 삽입하는 기술에 대하여 보고된 바 있다(비특허문헌 004). 상기 보고에 따르면, 파킨슨병의 치료 효과를 나타낼 수 있는 기전을 확인하는 과정에서 시상하핵의 글루타메이트 신경의 직접적인 저해가 관여할 수 있는 것으로 확인되었다.Recently, the development of optogenetics technology has enabled the activation and inhibition of living neurons, especially in animal models of Parkinson 's disease. Therefore, it has been reported that the technique using the optical gene can be applied to an in vitro model / animal model in the course of studying many phenomena and mechanisms that have not yet been clarified, such as the therapeutic mechanism of Parkinson's disease and disease progression (Non-patent document 001, non-patent document 002, non-patent document 003). As a related study, there has been reported a technique of inserting a light gene and a light stimulator into a Parkinson's disease white paper model using 6-hydroxydopamine (6-OHDA) (Non-Patent Document 004). According to the above report, direct inhibition of the glutamate neurons in the hypothalamus can be involved in confirming the mechanism of the therapeutic effect of Parkinson's disease.
광단백질로서 잘 알려져 있는 할로로돕신(halorhodopsin)은 미생물인 Natronomonas pharaonis로부터 분리된 단백질이다. 할로로돕신을 이용한 파킨슨병 관련 연구로서, 파킨슨병 동물 모델의 시상하핵(subthalamic nucleus, STN)에 감광단백질 발현을 유도하고 광자극을 주었을 때 파킨슨병의 반응 기작이 억제되어 치료 효과를 나타낼 수 있이 보고된 바 있다(비특허문헌 005).Halorhodopsin, a well-known photoprotein, is a protein isolated from the microorganism Natronomonas pharaonis . As a study of Parkinson's disease using halorodoxine, it is suggested that induction of photoprotein expression in the subthalamic nucleus (STN) of an animal model of Parkinson's disease and light stimulation may inhibit the response mechanism of Parkinson's disease (Non-Patent Document 005).
종래 연구에서, 파킨슨병과 관련된 발병 원인 또는 치료제와 같은 연구를 위해 동물 모델을 제조하여 사용하고 있다.In previous studies, animal models have been prepared and used for studies such as causative agents or treatments associated with Parkinson's disease.
파킨슨병 동물 모델은 1957년 Carlsson 등이 신경 독성 약제인 리저르핀(reserpine)을 이용하여 동물 모델을 만들면서 처음 제시되었고, 이후 신경 독소인 수산화도파민(6-hydroxydopamine, 6-OHDA), 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라히드로피리딘(N-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridine, MPTP), 제초제인 파라퀀트(paraquant) 등이 있다.An animal model of Parkinson's disease was first proposed in 1957 by Carlsson et al. Using a neurotoxic agent, reserpine, and then the neurotoxin 6-hydroxydopamine (6-OHDA), 1-methyl N-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) and paraquant herbicide.
이러한 신경 독소 중 6-OHDA은 도파민 신경 세포에 대한 독성 작용을 나타낼 수 있으나, 뇌-혈관 장벽을 통과하지 못하기 때문에 정위고정수술을 통해 흑질 또는 기저핵 같은 목표 지점에 주입하여 파킨슨병의 증상을 유발시킬 수 있다(비특허문헌 006). 6-OHDA를 파킨슨병 동물 모델을 제조하기 위해 사용하는 경우, 동물 모델의 편측에만 주입하여 반대측의 뇌 조직 상태와 비교할 수 있다는 장점을 가지며, 흑질-선조체(nigrostriatal) 시스템의 도파민 신경 세포를 손상시켜, 운동 증상 뿐만 아니라 심리 및 인지 장애와 같은 비운동 증상도 발현시킬 수 있음이 알려져 있다(비특허문헌 007). 또한, 비교적 다루기 쉽고 경제적이며 일관성 있는 결과를 유도할 수 있어 당업계에서 파킨슨병 동물 모델을 사용하기 위해 가장 많이 사용하고 있는 약물이다.Among these neurotoxins, 6-OHDA may exhibit toxic effects on dopaminergic neurons, but because they do not pass through the brain-vascular barrier, they are injected into target sites such as black or basal ganglia via stereotaxic surgery to induce symptoms of Parkinson's disease (Non-Patent Document 006). When 6-OHDA is used to make an animal model of Parkinson's disease, it is injected only on one side of the animal model and is comparable to the state of the brain tissue on the opposite side. It damages the dopaminergic neurons of the nigrostriatal system , As well as motor symptoms, as well as non-motor symptoms such as psychological and cognitive disorders (Non-Patent Document 007). It is also the most commonly used drug in the industry to use Parkinson 's animal models because it is relatively easy to handle, economical and produces consistent results.
MPTP 및 파라퀀트는 뇌-혈관 장벽을 통과할 수 있어 정맥주사를 통해 주입하였을 때 보다 쉽게 동물 모델을 만들 수 있다는 장점이 있다. 특히 MPTP는 파라퀀트에 비해 신경세포에 특이적으로 작용하며, 생체 내에 투여하였을 때 신체 내에서 MPP+로 변환된 후 도파민을 분비하는 뉴런 내에 축적된 뒤 뉴런을 파괴해 파킨슨병을 유도할 수 있는 것으로 알려져 있다(비특허문헌 008).MPTP and paraquat can pass through the brain-vascular barrier, which makes it easier to create an animal model when injected via intravenous injection. In particular, MPTP acts on nerve cells more specifically than paraquat, and when administered in vivo, it converts to MPP + in the body, accumulates in neurons that secrete dopamine, and then destroys neurons to induce Parkinson's disease (Non-Patent Document 008).
그러나 이러한 약물 주입을 통해 파킨슨병 동물 모델을 제조하였을 때에는, 신경 세포의 광범위한 범위에 비가역적인 손상을 유발하여 파킨슨병을 유도하며, 증상의 세기를 조절하면서 파킨슨병을 유도할 수는 없기 때문에 심도 깊게 연구하는 데에 한계를 가진다는 단점이 있다.However, when an animal model of Parkinson's disease is produced through such drug injection, irreversible damage is induced in a wide range of neuronal cells to induce Parkinson's disease, and it is not possible to induce Parkinson's disease by controlling the intensity of symptoms. There are disadvantages in that there is a limit to research.
이에, 본 발명자들은 파킨슨병 관련 연구를 위한 파킨슨병 동물 모델을 개발하기 위해 노력한 결과, 백서의 뇌 흑질에서 할로로돕신의 발현을 유도하고 광자극기를 이식한 동물 모델에서 광자극을 주었을 때, 유의적으로 파킨슨병의 증상을 나타내는 동물 모델로서 제조할 수 있음을 확인하였다. 본 발명의 파킨슨병 동물 모델은 좌뇌 및 우뇌 중 하나에서만 할로로돕신에 대한 광자극을 가했을 때, 신체의 좌측 및 우측에서 각각 정상 및 파킨슨병 증상의 행동 결과를 나타낼 뿐 아니라, 광자극의 세기를 조절하는 것을 통해 증상 세기를 조절할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.Therefore, the present inventors have made efforts to develop an animal model of Parkinson's disease for the study of Parkinson's disease. As a result, when the light stimulus was given in the animal model in which the halothiocyte expression was induced in the brain black matter of the rat, As an animal model showing symptoms of Parkinson's disease. The animal model of Parkinson's disease of the present invention exhibits behavioral symptoms of normal and Parkinson's symptoms on the left and right sides of the body when the light stimulus is applied to only one of the left brain and the right brain, , The present inventors have completed the present invention.
상술한 바와 같이, 파킨슨병은 높은 유병률을 나타내는 퇴행성 신경계 질환으로서 발병 기전 및 치료제 연구에 대한 요구가 계속되고 있지만, 아직까지 완전한 발병 원인 등이 밝혀지지 않아 효과적인 동물 모델의 개발이 요구되고 있다.As described above, Parkinson's disease is a degenerative nervous system disease which shows a high prevalence rate. However, since the cause of the onset of the disease and the study of the therapeutic agent continue to be demanded, the cause of the complete disease has not yet been revealed.
따라서, 본 발명의 목적은 파킨슨병 동물 모델의 제조 방법 및 이로부터 제조된 파킨슨병 동물 모델을 제공하는 것이다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method for producing an animal model of Parkinson's disease and an animal model of Parkinson's disease produced therefrom.
본 발명의 또다른 목적은, 파킨슨병 예방 또는 치료용 후보물질의 스크리닝 방법과 같은, 파킨슨병 관련 연구에 상기 동물 모델을 파킨슨병의 모델로 사용하는 용도를 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a use of the animal model as a model of Parkinson's disease in a study related to Parkinson's disease, such as a method of screening candidate substances for prevention or treatment of Parkinson's disease.
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 하기 i) 내지 iii)의 단계를 포함하는, 파킨슨병 동물 모델의 제조 방법 및 이로 제조된 파킨슨병 동물 모델을 제공한다:In order to achieve the above object, the present invention provides a method for producing an animal model of Parkinson's disease comprising the steps of i) to iii) and an animal model of Parkinson's disease produced thereby:
i) 할로로돕신(halorhoposin) 발현용 벡터를 포함하는 바이러스를 제조하는 단계;i) preparing a virus comprising a vector for expression of halorhoposin;
ii) 상기 단계 i)에서 제조한 바이러스를 동물의 뇌 흑질에 주입하여 할로로돕신의 발현을 유도하는 단계; 및ii) inducing the expression of halorhodopsin by injecting the virus prepared in step i) into the cerebral substantia of an animal; And
iii) 상기 단계 ii)에서 유도한 동물의 뇌 흑질에 광자극기를 이식하는 단계.iii) implanting a light stimulator into the brain of the animal induced in step ii).
본 발명의 바람직한 일실시예에서, iv) 상기 단계 iii)에서 광자극기를 이식한 동물에 광자극을 주는 단계;를 추가로 더 포함할 수 있다.In a preferred embodiment of the present invention, iv) further providing a light stimulus to the animal transplanted with the light stimulator in step iii).
본 발명의 또다른 바람직한 일실시예에서, 상기 단계 iii)의 광자극의 세기는 5 내지 150 ms의 광폭 및 1 내지 100 Hz의 광빈도를 주어 조절할 수 있다.In another preferred embodiment of the present invention, the intensity of the light stimulus in the step iii) may be adjusted by providing a wide range of 5 to 150 ms and a light frequency of 1 to 100 Hz.
본 발명의 또다른 바람직한 일실시예에서, 상기 동물은 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지 및 염소로 이루어진 군에서 선택된 하나일 수 있다.In another preferred embodiment of the present invention, the animal may be selected from the group consisting of a monkey, a dog, a cat, a rabbit, a guinea pig, a rat, a mouse, a cattle, a sheep, a pig and chlorine.
또한, 본 발명은 하기 i) 및 ii)의 단계를 포함하는, 동물 모델을 파킨슨병의 모델로 사용하는 방법을 제공한다:The invention also provides a method of using an animal model as a model of Parkinson's disease, comprising the steps of i) and ii)
i) 본 발명의 파킨슨병 동물 모델에 광자극을 주는 단계; 및i) subjecting a Parkinson's disease animal model of the present invention to optical stimulation; And
ii) 상기 단계 i)에서 광자극을 준 동물 모델의 파킨슨병 증상 수준을 판단하는 단계.ii) determining the symptom level of Parkinson's disease in the animal model subject to light stimulation in step i) above.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 단계 ii)의 파킨슨병 증상 수준은 보행 증상의 이상 수준 확인; 또는 뇌 조직 내 티로신 수산화효소(tyrosine hydroxylase, TH)의 발현 수준 확인을 통해 판단하는 것일 수 있다.In a preferred embodiment of the invention, the Parkinson's disease symptom level of step ii) is determined by identifying abnormal levels of gait symptoms; Or by determining the expression level of tyrosine hydroxylase (TH) in the brain tissue.
또한, 본 발명은 하기 i) 내지 iv)의 단계를 포함하는, 파킨슨병 치료용 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다:The present invention also provides a method for screening candidate substances for the treatment of Parkinson's disease comprising the steps of i) to iv):
i) 파킨슨병 동물 모델에 광자극을 주는 단계;i) providing a light stimulus to an animal model of Parkinson's disease;
ii) 상기 단계 i)에서 광자극을 준 동물 모델에 시험 물질을 처리하는 단계;ii) treating the test substance in the animal model subject to light stimulation in said step i);
iii) 상기 단계 ii)에서 처리한 동물 모델에서 파킨슨병 증상의 수준을 확인하는 단계; 및iii) identifying the level of Parkinsonian symptoms in the animal model treated in step ii); And
iv) 상기 단계 iii)에서 확인한 결과를 대조군과 비교하여, 파킨슨병 증상의 완화를 나타내는 물질을 선별하는 단계.iv) comparing the result obtained in step iii) with that of the control group to select a substance exhibiting relief of Parkinson's disease symptoms.
또한, 본 발명은 하기 i) 내지 iv)의 단계를 포함하는, 파킨슨병 예방용 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다:The present invention also provides a method for screening candidate substances for the prevention of Parkinson's disease comprising the steps of i) to iv):
i) 파킨슨병 동물 모델에 시험 물질을 처리하는 단계;i) treating the test substance in an animal model of Parkinson's disease;
ii) 상기 단계 i)에서 처리한 동물 모델에 광자극을 주는 단계;ii) subjecting the animal model treated in step i) to optical stimulation;
iii) 상기 단계 ii)에서 광자극을 준 동물 모델에서 파킨슨병 증상의 수준을 확인하는 단계; 및iii) identifying the level of Parkinsonian symptoms in the animal model subject to light stimulation in step ii); And
iv) 상기 단계 iii)에서 확인한 결과를 대조군과 비교하여, 파킨슨병 증상의 완화를 나타내는 물질을 선별하는 단계.iv) comparing the result obtained in step iii) with that of the control group to select a substance exhibiting relief of Parkinson's disease symptoms.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 단계 iii)의 파킨슨병 증상 수준은 보행 증상의 이상 수준 확인; 및 뇌 조직 내 티로신 수산화효소의 발현 수준 확인을 통해 판단하는 것일 수 있다.In a preferred embodiment of the present invention, the Parkinson's disease symptom level of step iii) is determined by identifying abnormal levels of gait symptoms; And the level of expression of tyrosine hydroxylase in brain tissue.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 단계 iv)의 대조군은 하기 (a) 내지 (d)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다:In a preferred embodiment of the present invention, the control group of step iv) may be any one or more selected from the group consisting of the following (a) to (d):
(a) 본 발명의 파킨슨병 동물 모델에 광자극을 주지 않은 비자극 대조군;(a) a non-stimulus control in which no light stimulus is given to the Parkinson's disease animal model of the present invention;
(b) 정상 동물 대조군;(b) normal animal control group;
(c) 본 발명의 파킨슨병 동물 모델에 시험 물질을 처리하지 않은 미처리 대조군; 및(c) an untreated control in which the test substance was not treated in the Parkinson's disease animal model of the present invention; And
(d) 할로로돕신 발현을 유도하지 않고 광자극을 준 미발현 대조군.(d) a light-stimulated control group that did not induce halodiposine expression.
따라서, 본 발명은 파킨슨병 관련 연구의 모델로 사용할 수 있는 파킨슨병 동물 모델을 제공한다. 본 발명에 따른 파킨슨병 동물 모델은 뇌 흑질에서 광유전자인 할로로돕신의 발현을 통해 광자극이 주어졌을 때, 활성화된 할로로돕신이 흑질 신경세포를 억제하는 역할을 통해 파킨슨병의 증상을 나타낼 수 있다.Accordingly, the present invention provides an animal model of Parkinson's disease that can be used as a model of Parkinson's disease-related studies. An animal model of Parkinson's disease according to the present invention can exhibit symptoms of Parkinson's disease by acting as a suppressor of the black nerve cells when activated by halothiocin given light stimulus through the expression of the light gene halorhodopsin in the brain black body .
본 발명에서 제조된 파킨슨병 동물 모델은 좌뇌 또는 우뇌 중 한쪽 편측의 흑질에서 할로로돕신의 발현을 유도하고 광자극을 주어 신경 세포의 손상을 유발시킬 수 있어 반대측 뇌는 정상 대조군으로서 사용할 수 있다는 점에서, 동일 개체를 동시에 대조군으로 활용할 수 있어 보다 정확한 연구가 가능하게 한다. 또한, 광자극의 세기를 조절하는 것을 통해 증상의 경중을 조절할 수 있어 다양한 범위의 파킨슨병 증상을 나타내는 동물 모델을 제조할 수 있다. 뿐만 아니라, 종래 비가역적 증상을 유발하는 신경 독소에 비해 본 발명에 따른 파킨슨병 동물 모델에서는 파킨슨병을 가역적으로 유발시킬 수 있어, 파킨슨병의 발병 기전 및 치료제 개발과 같은 다양한 관련 연구의 동물 모델로서 유용하게 사용될 수 있다.The animal model of Parkinson's disease produced in the present invention induces the expression of halorhodopsin in one side of the left brain or right side of the brain and can cause damage to neurons by giving light stimulus so that the opposite brain can be used as a normal control , And the same individual can be used as a control group at the same time, thereby enabling more accurate research. In addition, it is possible to control the severity of symptoms through the regulation of the intensity of the light stimulus to produce an animal model exhibiting a wide range of Parkinsonian symptoms. In addition, it is possible to reversibly induce Parkinson's disease in an animal model of Parkinson's disease according to the present invention compared with a conventional neurotoxin causing irreversible symptoms, and it is an animal model of various related studies such as development of pathogenesis and treatment of Parkinson's disease Can be usefully used.
도 1은 백서의 뇌 흑질에 할로로돕신 유전자를 탑재한 아데노부속바이러스(AAV-hSyn-NpHR-YFP)를 주입하는 사진이다.
도 2는 백서의 뇌 흑질에 광자극기(optic fiber)를 이식하는 과정을 나타내는 사진이다.
도 3은 백서의 뇌 흑질에 할로로돕신 발현을 유도하고 광자극을 준 실험군 및 대조군에서의 행동 검사 측정 결과를 나타낸다:
도 3a는 모든 실험군(n=15)에서의 행동 검사 측정 결과 평균값을 나타내고;
도 3b는 10ms - 5Hz 실험군(n=5)에서의 행동 검사 측정 결과를 나타내며;
도 3c는 10ms - 50Hz 실험군(n=5)에서의 행동 검사 측정 결과를 나타내고;
도 3d는 100ms - 5Hz 실험군(n=5)에서의 행동 검사 측정 결과를 나타내며; 및
도 3e는 할로로돕신 미발현 대조군(n=5)에서의 행동 검사 측정 결과를 나타낸다.
도 4는 백서의 뇌 흑질에 할로로돕신 발현을 유도하고 광자극을 준 실험군 및 대조군에서의 좌측(병변측) 및 우층(정상측)에 대한 상대적 비율을 나타낸다.
도 5는 할로로돕신 발현 실험군 및 6-OHDA 투여 대조군에서의 행동 검사 측정값을 비교한 결과이다.
도 6은 본 발명에서 제조된 파킨슨병 동물 모델의 우뇌(수술부위) 및 좌뇌(정상 부위) 흑질 조직에서 티로신 수산화효소(붉은색) 및 할로로돕신-YFP 단백질(녹색)의 발현 세포를 염색한 결과를 나타낸다: 조직 전체 면적(도 6a), 100 배율(도 3b) 및 400 배율(도 3c) 관찰 결과.
도 7은 본 발명에서 제조된 파킨슨병 동물 모델 및 대조군에서의 뇌 조직에서 티로신 수산화효소 발현 신경세포 수에 대하여, 좌뇌 및 우뇌 간의 비율을 상대적으로 나타낸 결과이다.
도 8은 본 발명에서 제조된 파킨슨병 동물 모델 및 대조군에서의 뇌 조직에서 24 시간 동안 광자극한 직후 및 5일 후의 도파민 신경 세포의 활성을 확인한 결과이다.Fig. 1 is a photograph showing the injection of the adeno-associated virus (AAV-hSyn-NpHR-YFP) carrying the halothloxin gene in the brain of the rat.
FIG. 2 is a photograph showing the process of implanting an optical fiber into the brain black matter of the white paper.
FIG. 3 shows behavioral test results in the experimental group and the control group that induce halorodoxine expression in the brain black matter of the white rats and gave the light stimulus:
FIG. 3A shows the mean value of behavioral test measurements in all experimental groups (n = 15);
Figure 3b shows the results of behavioral test measurements in the 10 ms-5 Hz experimental group (n = 5);
Figure 3c shows the results of behavioral test measurements in the 10 ms-50 Hz experimental group (n = 5);
Figure 3d shows the results of the behavioral test measurements in the 100 ms-5 Hz experimental group (n = 5); And
FIG. 3E shows the results of the behavioral test results in the control group (n = 5) without halothiocin expression.
Fig. 4 shows the relative proportions of left ventricle (lesion side) and right side (normal side) in the experimental group and the control group that induce halorodoxine expression in the brain black matter of the white paper and the light stimulus.
FIG. 5 shows the results of a comparison of the behavioral test readings in the halodip ops expression group and the 6-OHDA control group.
FIG. 6 shows the results of staining of expression cells of tyrosine hydroxylase (red) and halorodoxine-YFP protein (green) in the right brain (surgical site) and left brain (normal area) of the Parkinson's disease model prepared in the present invention (Fig. 6A), 100 magnification (Fig. 3B) and 400 magnification (Fig. 3C) observation results.
FIG. 7 is a graph showing the ratio of left brain and right brain relative to the number of tyrosine hydroxylase-expressing neurons in the brain model of the Parkinson's disease model prepared in the present invention and the control group.
FIG. 8 shows the activity of dopamine neurons immediately after and 24 hours after photon emission in the animal model of Parkinson's disease produced in the present invention and in the brain tissue of the control group.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
상술한 바와 같이, 종래 기술에 따라 신경 독소를 이용하여 제조한 파킨슨병 동물 모델에서는 신경 세포의 광범위한 범위에 비가역적인 손상을 유발하여 파킨슨병을 유도하며, 증상의 세기를 조절하면서 파킨슨병을 유도할 수는 없기 때문에 심도 깊게 연구하는 데에 한계를 가진다는 단점이 있다.As described above, in the animal models of Parkinson's disease produced using neurotoxins according to the prior art, irreversible damage is induced in a wide range of nerve cells to induce Parkinson's disease, and induction of Parkinson's disease There is a limit to the depth of research.
따라서, 본 발명은 하기 단계 i) 내지 iii)를 포함하는, 파킨슨병 동물 모델의 제조 방법을 제공한다:Accordingly, the present invention provides a method of producing an animal model of Parkinson's disease comprising the following steps i) to iii):
i) 할로로돕신(halorhoposin) 발현용 벡터를 포함하는 바이러스를 제조하는 단계;i) preparing a virus comprising a vector for expression of halorhoposin;
ii) 상기 단계 i)에서 제조한 바이러스를 동물의 뇌 흑질에 주입하여 할로로돕신의 발현을 유도하는 단계; 및ii) inducing the expression of halorhodopsin by injecting the virus prepared in step i) into the cerebral substantia of an animal; And
iii) 상기 단계 ii)에서 유도한 동물의 뇌 흑질에 광자극기를 이식하는 단계.iii) implanting a light stimulator into the brain of the animal induced in step ii).
또한, 본 발명은 상기 제조 방법으로 제조된 파킨슨병 동물 모델을 제공한다.In addition, the present invention provides an animal model of Parkinson's disease produced by the above production method.
본 발명의 제조 방법에 있어서, 하기 단계 iv)를 추가로 더 포함할 수 있다: iv) 상기 단계 iii)에서 광자극기를 이식한 동물에 광자극을 주는 단계.In the method of manufacture of the present invention, the method may further comprise the following step iv): iv) applying a light stimulus to the animal transplanted with the light stimulator in step iii).
본 발명의 제조 방법에 있어서, 상기 단계 iii)의 광자극의 세기에 따라 동물 모델에서의 파킨슨병 증상의 수준을 조절할 수 있다. 구체적으로, 광자극의 세기가 높으면 할로로돕신의 활성 수준이 증가하여 도파민 세포의 병변을 높은 수준으로 유도할 수 있어 파킨슨병의 증상 수준이 높아지며, 광자극의 세기가 낮으면 도파민 세포의 병변 수준이 낮아져 파킨슨병 증상 수준이 낮은 동물 모델을 제조할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 광자극은 5 내지 150 ms의 광폭 및 1 내지 100 Hz의 광빈도를 주는 것이 보다 바람직하며, 광폭 및 광빈도를 독립적으로 조절하여 광자극의 세기를 조절하여 파킨슨병의 진행 정도를 조절할 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 광자극은 10 내지 100 ms의 광폭 및 5 내지 50 Hz의 광빈도를 줄 수 있다.In the production method of the present invention, the level of the Parkinson's disease symptoms in the animal model can be controlled according to the intensity of the light stimulus in the step iii). Specifically, when the intensity of the optical stimulus is high, the activity level of halodiprocine is increased to induce a high level of dopamine cell lesion, thereby increasing the symptom level of Parkinson's disease. If the intensity of the optical stimulus is low, To lower animal models of Parkinson's disease symptoms. More specifically, it is more preferable that the optical stimulus imparts a wide width of 5 to 150 ms and a light frequency of 1 to 100 Hz, and independently adjusts the width and the light frequency to adjust the intensity of the optical stimulus, Can be adjusted. Most preferably, the optical stimulus can give a wide bandwidth of 10 to 100 ms and a light frequency of 5 to 50 Hz.
본 발명의 파킨슨병 동물 모델에서는 뇌 흑질에 할로로돕신의 발현을 유도하고, 광자극으로 활성화한다는 점에서 특징을 가진다. 뇌의 흑질은 도파민 세포가 밀집되어 있는 뇌의 심부로서, 광자극으로 인한 할로로돕신의 활성화를 통해 신경 세포 내로 염화이온이 이동하게 되며, 이로 인해 신경 세포의 활성이 억제되는 효과를 나타낼 수 있다. 본 발명의 명세서에서 "신경 세포의 활성"은 신경 세포로부터 도파민이 생성 및 분비되는 것을 가리킬 수 있다. 도파민의 생성 및 분비와 관련하여, 신경 세포에서는 자극을 받으면 세포 내로 칼슘 이온이 이동하게 되며, 이는 신경 세포 말단에서 티로신(tyrosine)이 도파민으로 변환되도록 자극하는 역할을 하여, 생성된 도파민은 소포 모노아민 운반체(vesicular monoamine transporter type 2)의 도움을 받아 연접 소포로 이동하여 신경 말단에서 도파민의 분비가 이루어지게 된다. 이렇게 분비된 도파민은 도파민 전달체를 통해 재흡수되어 다시 이용된다. 따라서, "신경 세포의 활성"을 억제하는 것은 도파민의 분비가 저하되는 것을 나타내어, 파킨슨병의 증상을 유발하는 결과를 나타낼 수 있다.The animal model of Parkinson's disease of the present invention is characterized in that it induces the expression of halorhodopsin in the brain black body and activates it by the light stimulus. The brain of the brain is a deep part of the brain in which the dopamine cells are concentrated. As a result of activation of halothiocin due to the light stimulus, the chloride ions move into the nerve cells, and thus the activity of the neuron can be inhibited. In the present specification, "activity of nerve cells" may indicate the generation and secretion of dopamine from nerve cells. Regarding the production and secretion of dopamine, in the nerve cell, calcium ions migrate into the cell upon stimulation, which acts to stimulate tyrosine to be converted into dopamine at the end of the neuron, With the help of vesicular monoamine transporter type 2, it migrates to synaptic vesicles and secretes dopamine from the nerve endings. This secreted dopamine is reabsorbed through the dopamine transporter and used again. Thus, inhibiting "activity of neuronal cells " indicates that the secretion of dopamine is lowered, and may cause symptoms of Parkinson's disease.
본 발명의 파킨슨병 동물 모델에 있어서, 상기 동물은 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지 및 염소로 이루어진 군에서 선택된 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 사람 이외의 대상 중 당업계에서 파킨슨병을 연구하기 위한 대상 동물로서 사용하는 범위 내에서 제한 없이 선택하여 사용할 수 있다.In the Parkinson's disease animal model of the present invention, the animal is preferably one selected from the group consisting of a monkey, a dog, a cat, a rabbit, a guinea pig, a rat, a mouse, a cow, a sheep, a pig, and chlorine, Among the non-human subjects, there may be used in the art an unlimited number of animals within the scope of use as a subject animal for studying Parkinson's disease.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 할로로돕신 유전자를 탑재한 아데노부속바이러스를 백서의 우뇌 흑질에 주입하고, 광자극기를 이식한 파킨슨병 동물 모델을 제조하였다(도 1 및 도 2).In a specific example of the present invention, the present inventors prepared an animal model of Parkinson's disease (Fig. 1 and Fig. 2) in which adeno-associated virus carrying the halorodopsin gene was injected into the right brain black matter of the white paper and the optical stimulator was implanted.
상기 파킨슨병 동물 모델에 광자극을 주어 파킨슨병을 유발하고, 행동 실험으로 파킨슨병에서 나타나는 보행 증상의 이상 수준을 확인한 결과, 흑질 내 발현된 할로로돕신에 광자극을 준 실험군에서 광자극의 세기와 비례하여 보행 이상의 증상 수준이 증가하는 것을 확인하였다(도 3). 또한, 우뇌에만 할로로돕신 유전자 주입 및 광자극을 주었기 때문에, 좌뇌를 정상 대조군으로 하여 좌측(우뇌)과 우측(좌뇌)을 구분하여 행동 검사를 비교한 결과, 광자극을 주었을 때 우측에 비해 좌측에서 유의적으로 보행 행동의 이상 증상을 나타내었으며 광자극의 세기와 비례하여 그 수준이 증가하는 것을 확인하였다(도 3 및 도 4). 이를 종래 파킨슨병 유도 신경 독소인 6-OHDA와 비교하였을 때, 줄무늬체 또는 안쪽앞뇌다발에 주입한 위치에 따라 차이를 보이는 증상 수준을 나타냄을 확인하였으나, 동일 위치에 독소를 투여하여도 증상 수준이 조절되지 않는 것을 확인하였다(도 5).As a result of the above experiment, it was found that the intensity of light stimulus was increased in the experimental group which was irradiated with halothiocin in the black color, And it was confirmed that the symptom level above the gait increased proportionally (Fig. 3). In addition, since the right hemisphere was injected with halo-doping gene and the light stimulus was given, the left brain (right brain) and the right brain (left brain) were discriminated from each other using the left brain as a normal control. As a result, (Fig. 3 and Fig. 4). As shown in Fig. 3 and Fig. When compared to 6-OHDA, which is a conventional Parkinson's disease-induced neurotoxin, it was confirmed that the symptom level was different according to the position injected into the striatum or inner forebrain bundle. However, even when the toxin was administered at the same position, (Fig. 5).
또한, 본 발명자들은 상기 파킨슨병 동물 모델을 희생하여 수득한 뇌 조직에서 티로신 수산화효소(TH)의 발현 수준을 확인하였다. 그 결과, 할로로돕신 유전자를 주입한 실험군 모두에서 광자극 부위에서 도파민 생성 조절 효소인 TH 발현 세포수가 유의적으로 감소하는 것을 확인하였으나(도 6, 도 7), 광자극의 세기에 따른 유의적인 차이는 나타나지 않는 것으로 확인하였다(표 3).In addition, the present inventors confirmed the expression level of tyrosine hydroxylase (TH) in brain tissue obtained by sacrificing the animal model of Parkinson's disease. As a result, it was confirmed that the number of TH-expressing cells, a dopamine production-regulating enzyme, in the light-stimulated region was significantly decreased in all of the experimental groups injected with the halorodopsin gene (FIGS. 6 and 7) (Table 3).
따라서, 본 발명에서 제조된 파킨슨병 동물 모델은 좌뇌 또는 우뇌 중 한쪽 편측의 흑질에서 할로로돕신의 발현을 유도하고 광자극을 주어 신경 세포의 손상을 유발시킬 수 있어 반대측 뇌는 정상 대조군으로서 사용할 수 있다는 점에서, 동일 개체를 동시에 대조군으로 활용할 수 있어 보다 정확한 연구가 가능하게 한다. 또한, 광자극의 세기를 조절하는 것을 통해 증상의 경중을 조절할 수 있어 다양한 범위의 파킨슨병 증상을 나타내는 동물 모델을 제조할 수 있다. 뿐만 아니라, 종래 비가역적 증상을 유발하는 신경 독소에 비해 본 발명에 따른 파킨슨병 동물 모델에서는 파킨슨병을 가역적으로 유발시킬 수 있어, 파킨슨병의 발병 기전 및 치료제 개발과 같은 다양한 관련 연구의 동물 모델로서 유용하게 사용될 수 있다.Therefore, the animal model of Parkinson's disease produced in the present invention induces the expression of halorhodopsin in one side of the left brain or right side of the brain, and can cause damage to nerve cells by giving light stimulus, so that the opposite brain can be used as a normal control It is possible to use the same individual as a control group at the same time, thereby enabling more accurate research. In addition, it is possible to control the severity of symptoms through the regulation of the intensity of the light stimulus to produce an animal model exhibiting a wide range of Parkinsonian symptoms. In addition, it is possible to reversibly induce Parkinson's disease in an animal model of Parkinson's disease according to the present invention compared with a conventional neurotoxin causing irreversible symptoms, and it is an animal model of various related studies such as development of pathogenesis and treatment of Parkinson's disease Can be usefully used.
또한, 본 발명은 상기 제조 방법으로 제조된 파킨슨병 동물 모델의 용도를 제공한다. 구체적으로, 하기 단계 i) 및 ii)를 포함하는, 동물 모델을 파킨슨병의 모델로 사용하는 방법을 제공한다:In addition, the present invention provides the use of an animal model of Parkinson's disease produced by the above production method. Specifically, there is provided a method of using an animal model as a model of Parkinson's disease, comprising the following steps i) and ii):
i) 본 발명의 파킨슨병 동물 모델에 광자극을 주는 단계; 및i) subjecting a Parkinson's disease animal model of the present invention to optical stimulation; And
ii) 상기 단계 i)에서 광자극을 준 동물 모델의 파킨슨병 증상 수준을 판단하는 단계.ii) determining the symptom level of Parkinson's disease in the animal model subject to light stimulation in step i) above.
본 발명의 동물 모델을 파킨슨병의 모델로 사용하는 방법에 있어서, 상기 단계 ii)의 파킨슨병 증상 수준은 보행 증상의 이상 수준 확인; 또는 뇌 조직 내 티로신 수산화효소(tyrosine hydroxylase, TH)의 발현 수준 확인을 통해 판단할 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 당업계에서 파킨슨병 동물 모델에서 나타나는 증상으로서 판단되는 증상이라면 제한없이 적용될 수 있다. 구체적으로, 상기 보행 증상의 이상은 동물 모델에 준 광자극의 세기에 따라 조절될 수 있으며, 광자극의 세기가 증가할수록 보행 증상의 이상 수준이 증가하고 광자극의 세기가 감소하면 보행 증상의 이상 수준이 감소하는 것이 바람직하다. 상기 뇌 조직 내 TH 발현 수준과 관련하여, 광자극을 준 동물 모델에서 TH 발현 및 TH 양성 세포의 수준이 감소하는 것을 확인하는 것을 통해 파킨슨병이 유발된 것으로 확인할 수 있다.In a method of using the animal model of the present invention as a model of Parkinson's disease, the Parkinson's disease symptom level of step ii) above may be determined by identifying abnormal levels of gait symptoms; Or the expression level of tyrosine hydroxylase (TH) in brain tissue. However, the present invention is not limited thereto and can be applied to any condition that is considered to be a symptom of Parkinson's disease in the art. Specifically, the gait abnormality can be controlled according to the intensity of the quasi-optical stimulus in the animal model. When the intensity of the optical stimulus increases, the gait abnormality level increases, and when the intensity of the optical stimulus decreases, It is desirable that the level is reduced. Regarding the TH expression level in the brain tissue, it can be confirmed that the depression of the levels of TH expression and TH-positive cells in the quasi-animal model with the light stimulus resulted in the induction of Parkinson's disease.
또한, 본 발명은 하기 단계 i) 내지 iv)를 포함하는, 파킨슨병 치료용 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다:The present invention also provides a method for screening candidate substances for the treatment of Parkinson's disease comprising the following steps i) to iv):
i) 본 발명의 파킨슨병 동물 모델에 광자극을 주는 단계;i) subjecting a Parkinson's disease animal model of the present invention to optical stimulation;
ii) 상기 단계 i)에서 광자극을 준 동물 모델에 시험 물질을 처리하는 단계;ii) treating the test substance in the animal model subject to light stimulation in said step i);
iii) 상기 단계 ii)에서 처리한 동물 모델에서 파킨슨병 증상의 수준을 확인하는 단계; 및iii) identifying the level of Parkinsonian symptoms in the animal model treated in step ii); And
iv) 상기 단계 iii)에서 확인한 결과를 대조군과 비교하여, 파킨슨병 증상의 완화를 나타내는 물질을 선별하는 단계.iv) comparing the result obtained in step iii) with that of the control group to select a substance exhibiting relief of Parkinson's disease symptoms.
또한, 본 발명은 하기 단계 i) 내지 iv)를 포함하는, 파킨슨병 예방용 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다:The present invention also provides a method for screening candidate substances for the prevention of Parkinson's disease comprising the following steps i) to iv):
i) 본 발명의 동물 모델에 시험 물질을 처리하는 단계;i) treating the test material in an animal model of the invention;
ii) 상기 단계 i)에서 처리한 동물 모델에 광자극을 주는 단계;ii) subjecting the animal model treated in step i) to optical stimulation;
iii) 상기 단계 ii)에서 광자극을 준 동물 모델에서 파킨슨병 증상의 수준을 확인하는 단계; 및iii) identifying the level of Parkinsonian symptoms in the animal model subject to light stimulation in step ii); And
iv) 상기 단계 iii)에서 확인한 결과를 대조군과 비교하여, 파킨슨병 증상의 완화를 나타내는 물질을 선별하는 단계.iv) comparing the result obtained in step iii) with that of the control group to select a substance exhibiting relief of Parkinson's disease symptoms.
본 발명의 스크리닝 방법에서, 파킨슨병 증상 수준은 보행 증상의 이상 수준 확인; 또는 뇌 조직 내 TH의 발현 수 확인을 통해 판단할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In the screening method of the present invention, the Parkinson's disease symptom level is determined by identifying abnormal levels of gait symptoms; Or by confirming the expression number of TH in the brain tissue, but the present invention is not limited thereto.
본 발명의 스크리닝 방법에서, 대조군은 하기 (a) 내지 (d)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 사용하는 것이 바람직하다:In the screening method of the present invention, it is preferable to use at least one selected from the group consisting of the following (a) to (d) as the control group:
(a) 본 발명의 파킨슨병 동물 모델에 광자극을 주지 않은 비자극 대조군;(a) a non-stimulus control in which no light stimulus is given to the Parkinson's disease animal model of the present invention;
(b) 정상 동물 대조군;(b) normal animal control group;
(c) 본 발명의 파킨슨병 동물 모델에 시험 물질을 처리하지 않은 미처리 대조군; 및(c) an untreated control in which the test substance was not treated in the Parkinson's disease animal model of the present invention; And
(d) 할로로돕신 발현을 유도하지 않고 광자극을 준 미발현 대조군.(d) a light-stimulated control group that did not induce halodiposine expression.
구체적으로, 상기 (a) 비자극 대조군은 할로로돕신 유전자를 주입하였으나 광자극을 주지 않아 유의적인 파킨슨병 증상이 나타나지 않을 것으로 기대되는 대조군을 의미한다. 본 발명의 실시예에서 언급되는 광자극 전의 행동검사 측정 결과와 같이, 할로로돕신 유전자를 주입하였으나 광자극을 주지 않아 파킨슨병 증상을 유의적으로 나타내지 않고 정상 수준을 유지하는 대조군을 의미할 수 있다.Specifically, (a) the non-stimulus control group means a control group in which halodorpocine gene is injected but is not expected to cause significant Parkinson's disease symptoms due to no optical stimulus. As a result of the behavioral test before the photostimulation mentioned in the embodiment of the present invention, it may mean a control group that injects a halodiposine gene but does not give a light stimulus and thus maintains a normal level without showing symptoms of Parkinson's disease.
또한, 상기 (b) 정상 동물 대조군은 할로로돕신의 발현 및 광자극을 주지 않은, 파킨슨병을 유발하지 않아 증상을 나타내지 않고 정상 수준을 유지하는 대조군을 의미할 수 있다. 상기 정상 동물 대조군은 실험군과 동일 환경에서 사육하면서 파킨슨병을 유발하지 않은 개별적인 개체일 수 있으며, 본 발명의 파킨슨병 동물 모델 중에서도 할로로돕신 발현 및 광자극을 유도하지 않은 편측일 수 있다. 다시 말해서, 본 발명의 실시예에서 나타난 바와 같이 우뇌(신체 좌측)에만 광자극이 주어지는 파킨슨병 동물 모델에서는 좌측에서만 파킨슨병 증상을 나타내며, 할로로돕신 발현 및 광자극이 일어나지 않는 좌뇌(신체 우측)에서는 정상 수준의 행동 증상을 유지할 수 있으므로, 동일 개체 내에서 편측에만 할로로돕신 발현 유도 및 광자극을 시행하여 본 발명의 동물 모델에 파킨슨병을 유도하였을 때, 반대쪽 편측은 정상 동물 대조군으로서 사용할 수 있다. 이와 같이 동일 개체에서 병변측을 실험군으로 사용하여 반대측을 정상 대조군으로 사용하는 경우에는, 개체에 따라 달라질 수 있는 배경값이 동일하게 설정된 상태에서 파킨슨병 관련 연구를 진행할 수 있어, 보다 정확한 연구가 가능하다는 점에서 바람직한 효과를 나타낼 수 있다.In addition, (b) the normal animal control group may mean a control group which does not induce halodiodin expression and optical stimulation, does not induce Parkinson's disease, and maintains normal levels without showing symptoms. The normal animal control group may be an individual that does not induce Parkinson's disease while being raised in the same environment as the experimental group, and may be one of the animal models of Parkinson's disease that does not induce halodiphene expression and light stimulation. In other words, as shown in the embodiment of the present invention, a Parkinson's disease model in which a light stimulus is given only to the right brain (left side of the body) exhibits symptoms of Parkinson's disease only in the left side, and in the left brain (right side of the body) in which halo- The opposite side can be used as a normal animal control group when inducing Parkinson's disease in the animal model of the present invention by inducing halodip opsin expression and light stimulation only on one side in the same individual. Thus, when the lesion side of the same subject is used as an experimental group and the opposite side is used as a normal control group, it is possible to carry out studies related to Parkinson's disease in a state in which background values that vary depending on individuals are set to the same, It is possible to exhibit a desirable effect in that
또한, 상기 (c) 본 발명의 파킨슨병 동물 모델에 시험 물질을 처리하지 않은 미처리 대조군은 동일하게 파킨슨병을 유도한 동물 모델에서 시험 물질을 처리하지 않아 파킨슨병 증상을 유지하여 나타내는 대조군을 의미한다. 상기 미처리 대조군과 실험군의 증상 수준을 비교하여, 실험군에서 증상의 회복을 나타낼 수 있도록 하는 시험 물질을 파킨슨병의 예방 또는 치료용 조성물의 후보물질로서 선별할 수 있다.In addition, (c) the untreated control group in which the test substance is not treated in the Parkinson's disease model of the present invention means a control group which maintains symptoms of Parkinson's disease by not treating the test substance in the same animal model in which the Parkinson's disease is induced . A test substance which can compare the symptom levels of the untreated control group and the experimental group to allow recovery of symptoms in the experimental group can be selected as a candidate substance for the composition for preventing or treating Parkinson's disease.
또한, 상기 (d) 할로로돕신 발현을 유도하지 않고 광자극을 준 미발현 대조군은 실험군과 동일 종의 동물의 뇌 흑질에 할로로돕신 유전자를 탑재하지 않은 대조 바이러스를 주입하여 할로로돕신은 발현시키지 않은 상태에서 광자극기를 이식해 광자극만을 준 대조군을 의미한다. 상기 미발현 대조군은 할로로돕신이 발현되지 않은 조건에서 광자극만을 주는 경우의 대조군을 나타냄으로서, 본 발명의 파킨슨병 동물 모델에서 나타나는 파킨슨병의 증상이 광자극에 의한 뇌 흑질의 신경 세포 손상의 결과로서 나타나는 것이 아님을 입증할 수 있다.In contrast, the control group that did not induce halodip opsin expression (d) but did not induce the light stimulation was injected with a control virus not containing the halodiposine gene in the brain of the same species as the experimental group, And a control group that only transplanted with a light stimulus. The non-expression control group represents a control group in which only light stimulation is given under the condition where halothloxin is not expressed. Thus, the symptoms of Parkinson's disease in the animal model of Parkinson's disease of the present invention are as follows: As shown in FIG.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지실을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.These embodiments are for illustrating the present invention only, and it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not construed as being limited by these embodiments.
할로로돕신(halorodopsin) 발현을 통한 파킨슨병 동물 모델의 제작Production of animal model of Parkinson's disease by expression of halorodopsin
본 발명의 파킨슨병 동물 모델을 제작하기 위해, 마우스의 흑질에 할로로돕신이 발현되도록 모델군을 제작하였다.In order to produce the Parkinson's disease animal model of the present invention, a model group was prepared so that halodiprocine was expressed in the black substance of the mouse.
(1) 실험 동물 및 사육 환경(1) Experimental animals and breeding environment
먼저, 실험을 위해 사용한 동물은 250 내지 300 g 체중의 수컷 위스터 백서(wistar rat)를 사용하였으며, 아산생명과학 연구소의 동물 취급 지침에 따르고, 밤낮 주기를 12 시간으로 하여 음식과 물을 자유롭게 제공하는 환경에서 사육하였다.First, the animals used for the experiment were male wistar rats weighing 250 to 300 g, followed by the animal handling guidelines of Asan Life Science Research Institute, .
(2) 할로로돕신 유전자 전달용 벡터 제조(2) Production of vector for transferring halodiposine gene
동물 모델의 뇌 흑질에서 할로로돕신의 유전자를 발현하기 위해서, 아데노부속바이러스 벡터 플라스미드를 제조하였다. pAAV2-CMV(Stratagene, La Jolla, CA)로부터 CMV 프로모터를 제거하고, hSynapsin1 프로모터 서열 및 NpHR-YFP 서열을 삽입하여 할로로돕신 발현용 벡터(pAAV2-hSynapsin1-NpHR-YFP)를 제조하였다. 상기 NpHR-YFP 서열은 Addgene 사의 플라스미드 제품 No. 26775로부터 분리한 서열을 사용하였다. 제조한 발현용 벡터는 아데노바이러스에 삽입하여, 아데노부속바이러스를 제조하였다.Adeno-associated viral vector plasmids were prepared to express the genes of halorhodopsin in the cerebral substantia of animal models. The CMV promoter was removed from pAAV2-CMV (Stratagene, La Jolla, CA), and the hSynapsin1 promoter sequence and the NpHR-YFP sequence were inserted to prepare a vector for expression of haloroprocin (pAAV2-hSynapsin1-NpHR-YFP). The NpHR-YFP sequence is the plasmid product number of Addgene. The sequence isolated from 26775 was used. The expression vectors thus prepared were inserted into adenoviruses to prepare adeno-associated viruses.
대조군 제조를 위해, pAAV2-CMV로부터 CMV 프로모터를 제거하고, hSynapsin1 프로모터 서열 및 YFP 서열만을 삽입하여 대조군용 YFP 발현 벡터를 제조하였다. 제조한 YFP 발현 벡터는 아데노바이러스에 삽입하여 준비하였다.For the control preparation, the CMV promoter was removed from pAAV2-CMV, and only the hSynapsin1 promoter and YFP sequences were inserted to prepare a control YFP expression vector. The prepared YFP expression vector was inserted into adenovirus and prepared.
(3) 할로로돕신 유전자 전달용 벡터의 주입(3) Injection of a vector for transferring a halothloxin gene
수컷 위스터 백서의 복강에 5 mg/kg 럼푼(Rompun; Bayer, Germany)과 35 mg/kg 졸레틸(Zoletil; Virbac,France)을 주입하여 마취시키고 머리를 뇌정위 고정장치에 고정하였다. 고정한 백서 머리의 피부를 절개하여 두개골을 노출시키고 드릴로 두개골을 천공하였다. 그런 다음, 오른쪽 흑질을 목표로 하여 해밀턴 시린지와 자동 미세바늘 펌프를 이용하여 상기 제조한 아데노부속바이러스를 도 1과 같이 정위적인 방법으로 주입하였다. 흑질의 좌표는 정수리점(bregma)으로부터 후방 5.6mm, 측방 2.0 mm, 경막에서 밑으로 7.5 mm 지점으로 결정하였다.Male rats (Rompun; Bayer, Germany) and 35 mg / kg Zoletil (Zoletil; Virbac, France) were anesthetized and the head fixed to the brain fixator by intraperitoneal injection of 5 mg / The skull was exposed by incising the skin of the fixed white paper head and drilling the skull with a drill. Then, the adeno-associated virus prepared above was injected in a stereotactic manner as shown in Fig. 1, using a Hamilton syringe and an automatic micro needle pump with the aim of obtaining a right black color. The coordinates of the black matter were determined to be 5.6 mm posteriorly from the parietal point (bregma), 2.0 mm lateral and 7.5 mm below the dural sac.
할로로돕신 미발현 대조군으로는, 상기 YFP 발현 벡터를 삽입한 아데노바이스를 사용하여 제조하였다. 위와 동일한 방법으로 백서의 오른쪽 흑질에 아데노바이러스를 주입하였다.As a control group with no expression of halodipocine, adenovirus inserted with the YFP expression vector was used. Adenovirus was injected into the right substantia nigra of the white paper in the same manner as above.
(4) 광자극기의 이식(4) Implantation of optical stimulator
아데노부속바이러스를 삽입한 실험군 및 대조군을 대상으로 광자극기(optic fiber)를 이식하였다. 사용한 광자극기는 중심(core) 200㎛, 바깥길이(outer diameter) 245㎛, 개구수(numerical aperture,NA) 0.53, RM3 type 및 flat tip의 형태(제품명: Doric lenses; 제조사: Quebec, Canada)를 이용하였다. 상기 (3) 단계에서 할로로돕신 유전자 전달용 벡터를 주입한 백서에 졸레틴과 럼푼을 섞은 혼합 용액을 복강내로 주입하여 전신 마취하고, 바이러스가 주입된 흑질 깊이에 최적화하도록 위치를 설정하였다. 광자극기를 8.5 ㎜로 자르고, 오른쪽 흑질을 목표로 하여 정위적 삽입관 잡개(stereotactic cannula holder)를 이용하여 광자극기를 삽입한 다음, 고정하기 위해 흑질 주변에 스크류를 심고 치과용 시멘트를 이용하여 단단하게 고정하는 방법을 이용하였다(도 2).Optic fiber was implanted in the experimental group and the control group in which adeno-associated virus was inserted. The optical stimulator used had a core of 200 μm, an outer diameter of 245 μm, a numerical aperture (NA) of 0.53, a shape of RM3 type and flat tip (product name: Doric lenses, manufacturer: Quebec, Canada) Respectively. In step (3), a mixed solution of zoledin and rumun was injected into the abdominal cavity and the anesthetic was performed to optimize the depth of the injected blood. The optical stimulator was cut into 8.5 ㎜ and the optical stimulator was inserted using a stereotactic cannula holder with the aim of right blackness. Then, a screw was placed around the black substance for fixation, (Fig. 2).
(5) 광자극을 통한 할로로돕신의 활성화(5) Activation of halo-dopcine by optical stimulation
바이러스 및 광자극기를 주입한 백서 모델에서 광자극을 주어 할로로돕신을 활성화하였다. 광자극은 광폭(width) 및 광빈도(frequency)를 지표로 하였으며, 백서를 3 군으로 나누어 그룹 1: 광폭 10 ms, 광빈도 5 Hz; 그룹 2: 광폭 10 ms, 광빈도 50 Hz; 및 그룹 3: 광폭 100 ms, 광빈도 5 Hz의 세기로 광자극을 주었다.Hyaluronidase was activated by photostimulation in a white paper model injected with virus and optical stimulator. The optical stimulus was divided into three groups according to the width and light frequency. Group 1: wide 10 ms,
(6) 수산화도파민(6-hydroxydopamin, 6-OHDA)을 이용한 대조군 파킨슨병 모델의 제조(6) Preparation of control Parkinson's disease model using 6-hydroxydopamin (6-OHDA)
할로로돕신 발현을 이용하는 본 발명의 동물 모델과 비교하기 위해, 종래 기술에서 파킨슨병 동물 모델을 제조하기 위해 사용하는 6-OHDA를 주입한 대조군 파킨슨병 모델을 제조하였다. 6-OHDA는 도파민 신경을 선택적으로 파괴할 수 있는 신경 독소로서, 도파민 신경의 주요 경로인 안쪽 앞뇌다발(medial forebrain bundle)에 6-OHDA을 투여하였을 때 일측성 파킨슨병 모델을 유도할 수 있는 것으로 알려져 있다.For comparison with the animal models of the invention using halothloxin expression, a control model of Parkinson's disease was prepared by injecting 6-OHDA, which is used in the prior art to produce animal models of Parkinson's disease. 6-OHDA is a neurotoxin capable of selectively destroying dopaminergic neurons, and 6-OHDA can be induced in the medial forebrain bundle, a major pathway of dopamine neurons, to induce unilateral PDNS It is known.
먼저, 수컷 위스터 백서의 복강에 럼푼과 졸레틸을 주입하여 전신마취하였다. 그런 다음, 8㎍ 6-OHDA를 0.1%의 아스코브르산이 용해된 0.9% 생리식염수에 혼합하여 혼합액을 준비한 후, 전신 마취한 백서의 인 안쪽 앞뇌다발에 혼합액 4㎕를 주입하였다. 오른쪽 안쪽앞뇌다발의 좌표는 정수리점으로부터 후방 2.2 mm, 측방 1.5 mm, 경막에서 밑으로 8.0 mm 지점을 목표로 하여 해밀턴 시린지와 자동 미세바늘 펌프를 이용하여 정위적인 방법으로 주입하였으며, 줄무늬체의 좌표로는 전방 0.5mm, 측방 3mm, 경막에서 밑으로 5.0 mm 지점을 목표로 하여 주입 위치를 설정하였다. 이와 함께, 동일 방법으로 6-OHDA를 줄무늬체(striatum)에 주입한 대조군을 함께 제조하였다.First, rumpun and zoletil were injected into the abdominal cavity of male whister rats and general anesthesia was performed. Then, 8 μg of 6-OHDA was mixed with 0.9% physiological saline dissolved in 0.1% ascorbic acid to prepare a mixed solution, and 4 μl of the mixed solution was injected into the inner forehead bundles of the whole anesthetized white rats. The coordinates of the right anterior forebrain bundle were injected in a stereotaxic manner using a Hamilton syringe and an automatic microneedle pump, aiming at 2.2 mm posteriorly from the crown, 1.5 mm lateral, and 8.0 mm below the dural sac. The injection site was set at 0.5mm in the anterior direction, 3mm in the lateral direction, and 5.0mm in the dura. In addition, a control group in which 6-OHDA was injected into the striatum was prepared in the same manner.
할로로돕신 발현을 통한 파킨슨병 동물 모델에서의 행동 실험을 통한 파킨슨병 유발 확인Behavioral Experiments in Parkinson's Disease Model through the Expression of Halorodoxin Induced Parkinsonism
본 발명의 방법에 따라 제조된 파킨슨병 동물 모델에서 파킨슨병이 유의적으로 유발될 수 있는지 확인하기 위하여 행동 실험을 수행하였다.Behavioral studies were conducted to determine whether Parkinson's disease could be induced significantly in an animal model of Parkinson's disease produced according to the method of the present invention.
먼저, 파킨슨병을 유발하기 전 모든 동물군에 대하여 행동 검사를 위한 연습을 수행하였다. 연습 후, 파킨슨병 유발 전(광자극 전); 광자극 실시 후; 및 희생 전의 시점으로 나누어 총 3 회의 행동 검사를 수행하였다. 6-OHDA 투여 대조군의 경우에는, 파킨슨병 유발 전(6-OHDA 주입 전); 6-OHDA 주입 후; 및 희생 전으로 총 3회 행동 검사를 수행하였다.First, behavioral testing was performed on all animal groups before inducing Parkinson's disease. After exercise, Parkinsonism induction (before light stimulation); After optical stimulation is performed; And the time before sacrifice. In the case of the 6-OHDA control group, before the induction of Parkinson's disease (before 6-OHDA injection); After 6-OHDA injection; And three times before the sacrifice.
행동 검사는 실험 동물을 트레드밀(treadmill) 위에 두어 실시하였다. 실험자가 백서의 뒷다리를 한 손으로 고정하고, 나머지 한 손은 앞다리 한 쪽을 고정하는 동안 고정이 안 된 다른 한 쪽의 앞다리가 트레드밀 위에 접촉하는 숫자를 10 초 단위로 세어 분석하였다. 오른쪽 앞다리와 왼쪽 앞다리를 각각 번갈아가면서 측정하고, 각각 2 회 씩 시행한 다음 평균 값을 내어 결과값으로 사용하였다.Behavioral tests were performed by placing the experimental animals on a treadmill. The experiment was performed by fixing the hind legs of the white paper with one hand and fixing the other one hand to the forelock while counting the number of contact with the other forelock on the treadmill in 10 seconds. The left and right forelimbs were alternately measured, and the results were used as the results.
그 결과, 하기 [표 1] 및 도 2에서 나타난 바와 같이 할로로돕신 발현 실험군에서 광자극 후 파킨슨병이 유발된 것으로 확인하였다(표 1). 이와 비교하였을 때, 할로로돕신 없이 YFP 유전자만을 포함하는 아데노부속바이러스를 주입한 대조군에서는 광자극 전후 및 희생 전 결과에서 병변 쪽의 행동 검사 값이 미세하게 감소하였으나, 유의적인 수준의 감소 경향은 나타내지 않아 파킨슨병이 유발되지 않는 것으로 확인하였다(표 1).As a result, it was confirmed that Parkinson's disease was induced after optical stimulation in the halothloxin expression experimental group as shown in [Table 1] and FIG. 2 (Table 1). In contrast, in the control group injected with adenovirus containing only the YFP gene without halothiopine, the behavioral test value of the lesion was slightly decreased before and after the photostimulation, but the trend was not significantly decreased Parkinson's disease was not induced (Table 1).
뇌 흑질에서 할로로돕신을 발현한 실험군 및 대조군에서, 우뇌의 흑질에서 할로로돕신 발현 및 광자극을 주었으므로, 좌측 다리에서 파킨슨병 증상의 행동 결과가 나온 것으로 확인하였다. 이에, 각각의 실험군 및 대조군에서 좌측 및 우측을 기준으로 하고 좌측의 상대적인 행동 검사 측정값 비율을 구하였다. 그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이 적은 광자극을 준 실험군(10 ms- 5 Hz)에서는 파킨슨병의 증상 수준이 상대적으로 낮은 수준을 나타내는 반면, 보다 강한 광자극을 준 실험군(10 ms - 50 Hz 및 100 ms-5 Hz)에서는 파킨슨병의 증상 수준이 보다 증가하였다(도 4). 이를 통해, 본 발명의 파킨슨병 동물 모델은 광자극의 세기를 조절하는 것을 통해 파킨슨병의 증상 수준을 조절하여 제조될 수 있음을 확인하였다.In the experimental group and the control group expressing halodiprocine in the cerebral substantia nigra, it was confirmed that the result of behavioral symptoms of Parkinson 's disease appeared in the left leg because it gave halodifenacin expression and light stimulation in the right hemisphere. Therefore, the ratio of the left-handed and the right-handed rats was calculated based on the left and right sides of each experimental group and the control group. As a result, as shown in FIG. 4, the symptom level of Parkinson's disease was relatively low in the experimental group (10 ms-5 Hz) with less light stimulus, whereas the experimental group (10 ms-50 Hz And 100 ms-5 Hz), the symptom level of Parkinson's disease was further increased (Fig. 4). Thus, it has been confirmed that the animal model of Parkinson's disease of the present invention can be prepared by controlling the symptom level of Parkinson's disease by controlling the intensity of the light stimulus.
(n=15)Experiment group total average
(n = 15)
실험군
(n=5)10 ms-5 Hz
Experimental group
(n = 5)
실험군
(n=5)10 ms-50 Hz
Experimental group
(n = 5)
실험군
(n=5)100 ms-5 Hz
Experimental group
(n = 5)
대조군
(n=5)Halofenchin expression
Control group
(n = 5)
이와 함께 6-OHDA 투여 대조군의 경우, 신경 독소인 6-OHDA를 주입하기 전후, 및 희생 전에 수행한 보행 검사에서 하기 [표 2]와 같은 결과를 나타내었다. 6-OHDA를 안쪽앞뇌다발에 투여한 대조군의 경우, 투여 후 90% 이상의 도파민 신경 세포가 사멸하여 개체가 사망할 때가지 파킨슨병의 증상이 일정하게 유지될 수 있음이 잘 알려져 있으므로, 희생전 시점에서는 행동 검사를 수행하지 않았다. 이에 비해, 6-OHDA를 줄무늬체에 투여하여 제조된 동물 모델에서는 개체가 사망할 때까지 도파민 신경세포의 사멸이 진행형으로 계속되어 시간의 흐름에 따라 파킨슨병의 증상이 증가할 수 있는 것으로 알려져 있어, 줄무늬체 투여군에서는 6-OHDA 투여 후 및 희생전 단계에서 모두 행동검사를 수행하였다. 신경 독소를 줄무늬체에 주입한 그룹에서는 일부 진행된 파킨슨병의 양상을 보이는 것으로 확인하였으며, 안쪽앞뇌다발에 주입한 그룹에서는 파킨슨병의 양상이 많이 진행된 것으로 확인하였다(표 2). In addition, the results of the 6-OHDA-treated control group were as shown in Table 2 below before and after the injection of the 6-OHDA, which is a neurotoxin, and before the sacrifice. It is well known that the control group in which 6-OHDA is administered to the inner forebrain bundle can maintain the symptoms of Parkinson's disease until the death of 90% or more of dopamine neurons after the administration, No behavioral tests were performed. In contrast, in animal models prepared by administering 6-OHDA to streaks, it is known that dopaminergic neuronal cell death continues to progress until individuals die, and symptoms of Parkinson's disease may increase with time , And behavioral tests were performed in all of the groups after the 6-OHDA administration and before the sacrifice. In the group injected with neurotoxin into the striatum, the pattern of some advanced Parkinson's disease was observed. In the group injected into the inner forebrain bundle, the pattern of Parkinson's disease was found to be advanced (Table 2).
대조군
(n=3)Intramuscular administration
Control group
(n = 3)
투여 대조군
(n=5)Inner forebrain bundle
Control group
(n = 5)
뇌 흑질에서 할로로돕신을 발현시킨 실험군에서의 파킨슨병 행동 검사의 결과값을 6-OHDA 투여 대조군과 비교하였다. 적은 광자극을 준 실험군(10 ms-5 Hz)ms 6-OHDA를 줄무늬체에 주입한 그룹과 비슷한 수준을 나타내었고, 보다 강한 광자극을 준 실험군(10 ms - 50 Hz 및 100 ms-5 Hz)에서는 6-OHDA를 안쪽앞뇌다발에 주입한 그룹과 비슷한 수준의 파킨슨병 증상 수준을 나타내는 것으로 확인하였다(도 5).The results of the Parkinson's behavior test in the experimental group in which halothloxacin was expressed in the cerebral substantia were compared with the 6-OHDA-treated control group. (10 ms-5 Hz) ms 6-OHDA in the experimental group (10 ms-50 Hz and 100 ms-5 Hz, respectively) ) Showed a similar level of Parkinson's disease symptoms as the group injected with 6-OHDA into the inner forebrain bundle (Fig. 5).
할로로돕신 발현을 통한 파킨슨병 동물 모델에서의 티로신 수산화 효소 발현 수준 확인Identification of tyrosine hydroxylase expression levels in animal models of Parkinson's disease through the expression of halodiprocin
파킨슨병에서는 흑질 내 신경세포의 티로신 수산화효소 발현 수준이 감소되어있는 것으로 알려져 있다. 이에, 본 발명자들은 각 동물군의 뇌세포 내 티로신 수산화효소(tyrosine hydroxylase, TH) 발현 수준을 확인하였다.In Parkinson's disease, it is known that the level of tyrosine hydroxylase expression in neurons in the substantia nigra is reduced. Thus, the present inventors confirmed the expression level of tyrosine hydroxylase (TH) in brain cells of each animal group.
구체적으로, <실시예 2>에서 행동 실험을 시행한 후 각각의 실험군 및 대조군 동물을 희생하여 조직검사를 시행하였다. 희생 후, 흑질의 치밀부를 포함한 관상 조직절편(coronal section)을 0.5% 소 혈청 알부민(BSA) PBS를 이용하여 수세 하였다. 면역염색 중 나타날 수 있는 비특이적 반응을 방지하기 위하여, 블로킹용액(BSA, sodium azide, triton X-100 을 포함한 PBS용액)에 조직절편을 담구어 반응시켰다. 이후 각 조직은 마우스 유래 항-TH 효소(1:2000 희석; Sigma 사)를 1차 항체로 하고, 이후 2차 항제로서 알렉사 플루오르 555 거위 유래 항-토끼 IgG 항체(Invitrogen 사)를 사용하여 면역 조직 염색을 수행하였다. 염색 후, 조직 절편은 동일초점현미경을 이용하여 관찰하였다. 관찰 시, 광학현미경 100 배율에서 계수판을 이용하여 TH 항체에 면역 염색된 세포의 수를 계수하여 측정하였다.Specifically, a behavioral test was conducted in Example 2, and histological examination was performed at the sacrifice of each experimental group and control animals. After sacrifice, the coronal section including the dense portion of the black substance was washed with 0.5% bovine serum albumin (BSA) PBS. To prevent nonspecific reactions during immunostaining, tissue sections were immersed in a blocking solution (PBS solution containing BSA, sodium azide, and triton X-100). Each of the tissues was treated with a mouse-derived anti-TH enzyme (1: 2000 dilution; Sigma) as the primary antibody and then with Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG antibody (Invitrogen) Staining was performed. After staining, tissue sections were observed using a synoptic microscope. At the time of observation, the number of cells immunostained with TH antibody was counted using a coefficient plate at a magnification of 100 at an optical microscope.
그 결과, 하기 [표 3], 도 6 및 도 7에서 나타난 바와 같이, 뇌 흑질 내에 할로로돕신 유전자를 주입한 실험군 모두에서 수술 부위(광자극기를 삽입한 부위)에서 도파민 생성 조절 효소인 TH를 발현하는 세포 수가 감소됨을 확인하였으나, 광자극의 세기에 따른 각 군 사이의 유의한 차이가 있는 것으로는 나타나지 않았다(표 3, 도 6 및 도 7). 6-OHDA를 투여한 대조군 역시 TH 발현 세포 수가 감소되는 것을 확인하였다.As a result, as shown in the following Table 3, FIG. 6, and FIG. 7, in all of the experimental groups injected with the halodoracin gene in the cerebral blood, the TH (dopaminergic regulator) , But there was no significant difference between the groups according to the intensity of the light stimulus (Table 3, FIG. 6 and FIG. 7). The control group treated with 6-OHDA also showed a decrease in the number of TH expressing cells.
또한, 24 시간 동안 광자극을 준 실험군의 광자극 직후 도파민 신경세포의 활성을 확인하고, 5일 후 동일 부위의 신경세포 활성을 확인한 결과, 도 8에서 나타난 바와 같이, 광자극 이후 시간이 지남에 따라 신경세포의 활성이 회복되는 것을 확인하였다(도 8). 이를 통해, 본 발명의 파킨슨병 동물 모델은 할로로돕신의 광자극 이후 시간이 지남에 따라 정상 대조군 수준의 도파민 신경세포 활성을 나타내도록 회복되는, 가역적인 파킨슨병 증상이 유도되는 것을 확인하였다.In addition, the activity of the dopamine neuron was observed immediately after the light stimulation in the experimental group that was subjected to the light stimulation for 24 hours, and the activity of the neuron in the same region was confirmed after 5 days. As a result, as shown in FIG. 8, It was confirmed that the activity of the neuron was restored (FIG. 8). Thus, it was confirmed that the Parkinson's disease animal model of the present invention induces reversible Parkinsonism symptoms, which are restored to show dopamine neuronal activity at normal level over time after the light stimulation of halorodoxine.
비율(%)Left / Right
ratio(%)
(n=5)Halo-rhodopsin non-expressing control
(n = 5)
투여 대조군 (n=3)Striatum neurotoxin
Control group (n = 3)
신경독소투여 대조군 (n=5)Inner forebrain bundle
Neurotoxic administration Control group (n = 5)
* 상기 표에서, 좌측 및 우측의 신경세포 개수의 값은 각 실험군 및 대조군에서의 평균값을 나타내며, 좌측/우측의 비율은 각각의 개체에서의 결과값을 대상으로 비율을 계산한 결과이다.In the above table, the values of the number of neurons in the left and right sides are the average values in the experimental group and the control group, and the ratio of the left / right ratio is a result of calculating the ratio of the results in each individual.
Claims (11)
ii) 상기 단계 i)에서 제조한 바이러스를 동물의 뇌 흑질에 주입하여 할로로돕신의 발현을 유도하는 단계; 및
iii) 상기 단계 ii)에서 유도한 동물의 뇌 흑질에 광자극기를 이식하는 단계;를 포함하는, 파킨슨병 동물 모델의 제조 방법.
i) preparing a virus comprising a vector for expression of halorhoposin;
ii) inducing the expression of halorhodopsin by injecting the virus prepared in step i) into the cerebral substantia of an animal; And
iii) transplanting a light stimulator into the cerebral substantia of the animal derived in step ii) above.
3. The method of claim 1, wherein the animal model of Parkinson's disease further comprises: iv) applying a light stimulus to the animal transplanted with the optical stimulator in step iii) ≪ / RTI >
2. The method of claim 1, wherein the intensity of the light stimulus in step iii) is adjusted by applying a wide range of 5 to 150 ms and a light frequency of 1 to 100 Hz.
The method according to claim 1, wherein the animal is one selected from the group consisting of a monkey, a dog, a cat, a rabbit, a guinea pig, a rat, a mouse, a cattle, a sheep, a pig, and chlorine.
An animal model of Parkinson's disease, produced by the method of claim 1.
ii) 상기 단계 i)에서 광자극을 준 동물 모델의 파킨슨병 증상 수준을 판단하는 단계;를 포함하는, 동물 모델을 파킨슨병의 모델로 사용하는 방법.
i) providing a light stimulus to the Parkinson's disease animal model of claim 5; And
ii) determining the symptom level of Parkinson's disease in the animal model that has undergone light stimulation in step i), using the animal model as a model of Parkinson's disease.
7. The method of claim 6, wherein the symptom of Parkinsonism in step ii) Or the expression level of tyrosine hydroxylase (TH) in brain tissue. The method of using an animal model as a model of Parkinson's disease.
ii) 상기 단계 i)에서 광자극을 준 동물 모델에 시험 물질을 처리하는 단계;
iii) 상기 단계 ii)에서 처리한 동물 모델에서 파킨슨병 증상의 수준을 확인하는 단계; 및
iv) 상기 단계 iii)에서 확인한 결과를 대조군과 비교하여, 파킨슨병 증상의 완화를 나타내는 물질을 선별하는 단계;를 포함하는, 파킨슨병 치료 또는 예방용 후보물질의 스크리닝 방법.
i) providing a light stimulus to the Parkinson's disease animal model of claim 5;
ii) treating the test substance in the animal model subject to light stimulation in said step i);
iii) identifying the level of Parkinsonian symptoms in the animal model treated in step ii); And
iv) comparing the result obtained in step iii) with that of the control group to select a substance exhibiting relief of the symptoms of Parkinson's disease.
ii) 상기 단계 i)에서 처리한 동물 모델에 광자극을 주는 단계;
iii) 상기 단계 ii)에서 광자극을 준 동물 모델에서 파킨슨병 증상의 수준을 확인하는 단계; 및
iv) 상기 단계 iii)에서 확인한 결과를 대조군과 비교하여, 파킨슨병 증상의 완화를 나타내는 물질을 선별하는 단계;를 포함하는, 파킨슨병 치료 또는 예방용 후보물질의 스크리닝 방법.
i) treating the test substance in the animal model of claim 5;
ii) subjecting the animal model treated in step i) to optical stimulation;
iii) identifying the level of Parkinsonian symptoms in the animal model subject to light stimulation in step ii); And
iv) comparing the result obtained in step iii) with that of the control group to select a substance exhibiting relief of the symptoms of Parkinson's disease.
10. The method according to claim 8 or 9, wherein the symptom level of Parkinson's disease in step iii) is an abnormal level of gait symptom; And determining the expression level of tyrosine hydroxylase in the brain tissue. ≪ RTI ID = 0.0 > 8. < / RTI >
(a) 제 5항의 파킨슨병 동물 모델에 광자극을 주지 않은 비자극 대조군;
(b) 정상 동물 대조군;
(c) 제 5항의 파킨슨병 동물 모델에 시험 물질을 처리하지 않은 미처리 대조군; 및
(d) 할로로돕신 발현을 유도하지 않고 광자극을 준 미발현 대조군.
The method for screening candidate substances for the treatment or prevention of Parkinson's disease according to claim 8 or 9, wherein the control group of step iv) is any one selected from the group consisting of the following (a) to (d) :
(a) a non-stimulated control group that does not give a light stimulus to the Parkinson's disease animal model of paragraph 5;
(b) normal animal control group;
(c) an untreated control not treated with the test substance in the Parkinson's disease animal model of paragraph 5; And
(d) a light-stimulated control group that did not induce halodiposine expression.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020170089011A KR20190007695A (en) | 2017-07-13 | 2017-07-13 | Parkinson`s disease animal model using optogenetics and uses thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020170089011A KR20190007695A (en) | 2017-07-13 | 2017-07-13 | Parkinson`s disease animal model using optogenetics and uses thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20190007695A true KR20190007695A (en) | 2019-01-23 |
Family
ID=65280231
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020170089011A KR20190007695A (en) | 2017-07-13 | 2017-07-13 | Parkinson`s disease animal model using optogenetics and uses thereof |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20190007695A (en) |
-
2017
- 2017-07-13 KR KR1020170089011A patent/KR20190007695A/en active Search and Examination
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| Blandini F, Armentero MT, Martignoni E. The 6-hydroxydopamine model: news from the past. Parkinsonism Relat Disord 2008; 14 Suppl 2: S124-9. |
| Branchi I, D'Andrea I, Armida M, Cassano T, Pezzola A, Potenza RL, et al. Nonmotor symptoms in Parkinson's disease: investigating early-phase onset of behavioral dysfunction in the 6-hydroxydopamine-lesioned rat model. J Neurosci Res 2008; 86: 2050-61. |
| Cannon JR, Greenamyre JT. Neurotoxic in vivo models of Parkinson`s disease recent advances. Prog Brain Res 2010; 184: 17-33. |
| Chen Y, Xiong M, Zhang SC. Illuminating Parkinson`s therapy with optogenetics. Nat Biotechnol 2015; 33: 149-50. |
| Gradinaru V, Mogri M, Thompson KR, Henderson JM, Deisseroth K. Optical deconstruction of parkinsonian neural circuitry. Science 2009; 324: 354-9. |
| Tonnesen J. Optogenetic cell control in experimental models of neurological disorders. Behav Brain Res 2013; 255: 35-43. |
| USGradinaru, Viviana, et al., Optical deconstruction of parkinsonian neural circuitry., science 324.5925 (2009): 354-359. |
| Yoon HH, Park JH, Kim YH, Min J, Hwang E, Lee CJ, et al. Optogenetic inactivation of the subthalamic nucleus improves forelimb akinesia in a rat model of Parkinson disease. Neurosurgery 2014; 74: 533-40; discussion 40-1. |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Aravanis et al. | An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology | |
| Thompson et al. | Electrical stimuli in the central nervous system microenvironment | |
| Jackman et al. | Cerebellar Purkinje cell activity modulates aggressive behavior | |
| Masini et al. | Targeted activation of midbrain neurons restores locomotor function in mouse models of parkinsonism | |
| Bentley et al. | Optogenetics in epilepsy | |
| Laćan et al. | Modulation of food intake following deep brain stimulation of the ventromedial hypothalamus in the vervet monkey | |
| Klanker et al. | Deep brain stimulation in the lateral orbitofrontal cortex impairs spatial reversal learning | |
| US9089698B2 (en) | Method and apparatus for optogenetic treatment of blindness including retinitis pigmentosa | |
| Moon et al. | Effect of optogenetic modulation on entopeduncular input affects thalamic discharge and behavior in an AAV2-α-synuclein-induced hemiparkinson rat model | |
| US20180360343A1 (en) | Methods for Functional Brain Circuit Analysis | |
| Albert | Light up your life: Optogenetics for depression? | |
| Tian et al. | Optogenetic stimulation of GABAergic neurons in the globus pallidus produces hyperkinesia | |
| Rijkers et al. | Sustained reduction of cerebellar activity in experimental epilepsy | |
| Yoon et al. | Optogenetic inactivation of the entopeduncular nucleus improves forelimb akinesia in a Parkinson's disease model | |
| KR20190007695A (en) | Parkinson`s disease animal model using optogenetics and uses thereof | |
| US20210205636A1 (en) | Neuromodulation techniques | |
| KR20140125659A (en) | Method for treatment of depressive disorder with optogenetic stimulation at left medial prefrontal cortex | |
| WO2020216291A1 (en) | Nervous system disease treatment electric field generation apparatus | |
| AU2017372351B2 (en) | Optogenetic modulation by multi-characteristic opsins for vision restoration and other applications thereof | |
| Ingold et al. | Development of a Utah Optrode Array for Large Scale Optogenetics in Non-Human Primate Cortex: Analysis of Spatial Excitation Pattern Using C-FOS Expression | |
| Trauzettel-Klosinski | Current status of rehabilitation for patients with homonymous field defects | |
| Khalid | Developing a Rat Model of Optogenetic Stimulation of Motor Cortex for Spinal Cord Injury Therapy | |
| Abdullah | Exploratory Study of Deep Brain Stimulation in the Syngap1+/-Mouse Model of Autism Spectrum Disorder Using Electrophysiology | |
| Bell et al. | The Neuroscience of Functional Neurosurgery | |
| KR20230126401A (en) | Method for suppressing trigeminal neuralgia by optogenetic stimulation of ventrolateral periaqueductal gray |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| AMND | Amendment |