KR20190005684A - Method for manufacturing transitional hybrid cells using hyposonic environment - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to a method for manufacturing metastatic hybrid cells using a hypoxic environment. The method for manufacturing the metastatic hybrid cells of the present invention involves the fusion of cancer cells with macrophages by creating the hypoxic environment, one of the features of microenvironment of tumor tissues, in a culture medium where the fusion of cancer cells and macrophages takes place by using cobaltic chloride (CoCl _2). According to the invention, a high fusion efficiency, high cell survival rate and metastatic potential can be secured just by creating the hypoxic environment using cobaltic chloride.

Description

저산소 환경을 이용한 전이암 하이브리드 세포의 제조방법{METHOD FOR MANUFACTURING TRANSITIONAL HYBRID CELLS USING HYPOSONIC ENVIRONMENT}TECHNICAL FIELD [0001] The present invention relates to a method for producing a transgastric hybrid cell using a hypoxic environment,

본 발명은 저산소 환경을 이용한 전이암 하이브리드 세포의 제조방법에 관한 것으로, 좀 더 구체적으로 암세포와 대식세포를 융합하는 단계에서 암세포의 생체 내 미세 환경의 특징 중 하나인 저산소환경을 조성하여 암세포와 대식세포를 융합하여 두 세포 간 융합효율을 획기적으로 높이고, 융합된 하이브리드 세포의 전이성을 모니터링하여 전이암의 특성을 관찰할 수 있는 저산소 환경을 이용한 전이암 하이브리드 세포의 제조방법에 관한 것이다.More particularly, the present invention relates to a method for producing a transgenic hybrid cell using a hypoxic environment, and more particularly, to a method for producing a transgenic hybridoma cell using a hypoxic environment, wherein a cancer cell and a macrophage are fused with each other, The present invention relates to a method for preparing a transgastric hybrid cell using a hypoxic environment capable of observing the characteristics of metastatic cancer by monitoring the metastasis of fused hybrid cells.

현재 밝혀진 암에 의한 사망 중 약 90 %의 원인으로 지목되는 것은 암의 전이이다(Nature Reviews Cancer 6, 449-458). 전이암은 암세포가 처음 발생한 부위에서 떨어져 나와 주위의 혈관이나 림프관으로 침투해 그곳을 통해 이동하여 체내의 다른 부위에 새로운 종양을 형성하는 것이다(Science Vol. 341, Issue 6151, pp. 1186-1188). 이렇게 이동성을 얻어 전이되는 암세포의 생성 이유나 메커니즘은 아직 완전히 밝혀지지 않았으며, 그 원인에 대한 다양한 이론들이 존재한다.It is cancer metastasis that is attributed to about 90% of cancer deaths currently identified (Nature Reviews Cancer 6, 449-458). Metastatic cancer is a cancer that has spread from the site where the cancer cells first developed and penetrates into the surrounding blood vessels or lymph vessels to move through them to form new tumors in other parts of the body (Science Vol. 341, Issue 6151, pp. 1186-1188) . The reason and mechanism of the generation of metastatic cancer cells have not yet been fully clarified, and there are various theories about their causes.

가장 활발히 연구되고 있는 이론 중 하나는 EMT(epithelial to mesenchymal transition), MET(mesenchymal to epithelial transition) 이론이다. 종양 상피세포(epithelial cell)가 유전자 돌연변이에 의해 간엽세포(mesenchymal cell)의 형질을 획득한 세포로 변한다(EMT)는 이론이다(Nat Rev. 2002;2:442-54, J Clin Invest. 2009;119:1417-9). 간엽세포의 형질을 갖게 된 상피세포는 세포 간 결합이 약화되어 본래 있던 위치에서 떨어져 나와 혈관으로 이동하게 된다. 그 후 혈관을 통해 이동하던 세포가 다시 자신의 상피적 특성을 획득하여(MET) 원발 부위에서 멀리 떨어진 2차 부위에 정착하여 종양을 증식시키게 되는 것이 전이의 과정이라고 주장하는 것이다. 그러나 EMT 과정과 MET 과정에 대한 유전자 돌연변이대한 설명 및 이를 증명하는 연구결과는 매우 부족한 현실이다. 또한 실제 종양조직에서는 이런 EMT 세포를 확인하기 어렵다(J Pathol. 2009;219:275-6). One of the most actively studied theories is the EMT (epithelial to mesenchymal transition) and MET (mesenchymal to epithelial transition) theory. It is the theory that epithelial cells change into mesenchymal cells (EMT) by gene mutation (Nat Rev 2002; 2: 442-54, J Clin Invest. 2009; 119: 1417-9). The epithelial cells, which have trait of the mesenchymal cells, weaken the intercellular junction and move away from the original position to the blood vessels. It is then claimed that the cells that migrate through the blood vessels acquire their epithelial characteristics again (MET) and colonize the secondary site far away from the primary site to proliferate the tumor. However, the description of gene mutations in the EMT process and the MET process and the results of the studies demonstrating this are very scarce. It is also difficult to identify these EMT cells in actual tumor tissues (J Pathol. 2009; 219: 275-6).

또 다른 이론은 암 줄기세포(CSCs : Cancer stem cells)이다. 본 이론의 특징은 종양 조직 내에 종양의 생성, 성장 및 이동 등에서 줄기세포의 기능을 하는 암줄기세포가 존재한다는 이론으로 다양한 약물치료에도 종양이 다시 재발하는 현상을 설명하기 위해 제시된 이론으로, 종양 조직 내에 줄기세포가 돌연변이에 의해 종양세포로 변형된 것으로 일반적인 줄기세포의 특징, 즉 빠른 증식력과 분화력 및 이동성 등을 가지며 이를 통해 성장, 전이 등의 핵심적인 기능을 담당하는 세포군이 따로 존재한다는 이론이다. 그러나 전이하는 능력과 연관된 다양한 연구에서 암줄기세포의 존재가 확인되는 연구보고가 있음에도 불구하고, 실제 연구에서 암줄기세포를 이용한 전신 전이의 유발은 잘 이루어지지 않는 것을 볼 수 있다(Int J Cancer. 2008;123:73-84).Another theory is cancer stem cells (CSCs). This theory is based on the theory that cancer stem cells that function as stem cells in tumor tissue formation, growth and migration are present, and this theory is presented to explain the recurrence of tumors in various drug treatments. It is a theory that stem cells are transformed into tumor cells by mutation, and that they have the characteristics of general stem cells such as rapid proliferation, differentiation and mobility, and there is a cell group that plays a key role of growth and metastasis. However, in a variety of studies involving metastatic ability, there is a report that confirms the existence of cancer stem cells, but in fact, it can be seen that the induction of systemic metastasis using cancer stem cells is not performed well (Int J Cancer 2008; 123: 73-84).

위의 두 가지 이론 이외에 최근 주목받고 있는 이론으로 종양세포에 대한 대식세포의 작용에 관련된 것이 있다. 대식세포는 암세포에서도 일반적으로 항암 면역 반응을 담당하지만, 암이 있는 환경에서 오히려 종양의 성장을 촉진하는 대식세포도 존재한다. 이렇게 종양 주변에 있는 대식세포를 종양관련 대식세포(Tumor-Associated Macrophage, TAM)이라고 부르는데, 종양의 성장을 촉진하거나, 신생혈관 생성을 증진시켜 암세포가 전이를 쉽게 할 수 있는 환경을 형성하기도 하며 직접 주변의 암세포에 융합하여 혈관 침투와 이동을 도와 암세포의 전이를 유도하기도 한다(Cell. 2010;141(1)39-51, Curr Opin Immunol. 2010;22(2)231-7, Nature Reviews Immunol. 2015, 15:7386). 즉 이러한 종양 주변에 침윤된 대식세포와의 상호작용에 의해 주변 종양조직이 변형되어 전이성을 획득한다는 이론이다. 이와 관련된 다양한 연구보고에서는 주로 대식세포와 종양세포간의 상호작용에 의해 종양조직의 유전적 변형이 유도되는 과정에 초점이 맞추어져 연구되고 있다.In addition to the above two theories, there is a recent focus on the action of macrophages on tumor cells. Macrophages generally undergo cancer-mediated immune responses in cancer cells, but there are also macrophages that promote tumor growth in cancerous environments. Macrophages around the tumor are called Tumor-Associated Macrophage (TAM), which promotes tumor growth or promotes neovascularization to form an environment in which cancer cells can easily metastasize, 2010, 22 (2) 231-7, Nature Reviews Immunol. ≪ RTI ID = 0.0 > 231-7, < / RTI > 2015, 15: 7386). In other words, it is the theory that the surrounding tumor tissue is transformed by the interaction with macrophages infiltrated around these tumors to obtain metastasis. Several studies have focused on the process by which the genetic modification of tumor tissue is induced by interaction between macrophages and tumor cells.

대식세포와 종양간의 관련된 연구로 또 하나 주목할 만한 것은 대식세포와 종양세포간의 융합을 통해 전이성을 획득하며 이를 통해 새로운 형질의 암이 생성된다는 연구가 보고되고 있다. 실제로 흑색 종 세포를 주입한 쥐 동물모델의 체내에서 골수유래 대식세포와 흑색 종 세포가 자연적으로 융합하여 전신 전이가 발생한 연구 결과가 존재한다(Nat Rev Cancer. 2008;8(5):377-86). 주로 이런 TAM 세포의 활동이 활발하게 일어나는 암세포 주변의 미세 환경은 1) pH가 정상 세포 주위보다 낮고, 2) 저산소 상태이며 3) 암세포와 대식세포들에서 분비되는 CSF-1, IL-3, IL-6 등 다양한 성장인자들과, CCL-2, IFN-γ 등의 사이토카인들이 존재하고 있다(Trends Cell Biol. 2014, 24(8):472-8, Cell. 2010, 2;141(1):39-51. Adv Drug Deliv Rev. 2016, pii: S0169-409X(16) 30232-0.).Another study of macrophage-to-tumor studies has shown that metastasis is obtained through the fusion between macrophages and tumor cells, resulting in cancer of a new trait. In fact, there are studies that have shown that systemic metastasis occurs by the natural fusion of bone marrow-derived macrophages and melanoma cells in the rat animal model injected with melanoma cells (Nat Rev Cancer 2008; 8 (5): 377-86 ). 1) IL-3, IL-3, and IL-3 secreted from cancer cells and macrophages; 3) IL-3 and IL-3 secreted by cancer cells and macrophages; -6, and cytokines such as CCL-2 and IFN-γ are present (Trends Cell Biol. 2014, 24 (8): 472-8, Cell. 2010, : 39-51, Adv Drug Deliv Rev. 2016, pii: S0169-409X (16) 30232-0.).

하지만 위와 같은 대식세포-종양 세포 간 융합 방법의 개발에 관한 다양한 시도들의 경우 실험적인 in vitro 방법의 경우 세포에 물리적, 화학적 충격 등으로 인해 세포 생존율이 매우 낮고 또한 그 성공확률이 5% 미만으로 매우 낮은 경우이거나 in vivo 실험의 경우 외부에서 주입한 암세포가 체내에서 자연적으로 대식세포와의 융합이 이루어진 것으로, 그 과정으로 실험적으로 재현하는 것이 불가능하며 이를 연구에 활용하는 것 역시 불가능 하다. 이러한 예시로는 다음과 같은 것이 있다. 인공적으로 동물 세포를 융합하여 하이브리드 세포를 만드는 방법은 여러 가지가 있다. 센다이 바이러스를 이용하는 방법(J Virol. 1973 Oct; 12(4): 937-939, ANTICANCER RESEARCH. 2016; 36:3827-3832)은 바이러스가 세포 표면에 융합하여 자신의 유전물질을 숙주 세포에 주입하는 성질에서 착안하여, 자외선 조사 등을 통해 증식 능력을 없애고 불활성화 시킨 센다이 바이러스를 통해 세포막 융합 기능만 이용하는 방법으로, 세포 융합에 관한 연구 초반에 많이 사용되었던 방법이다. 이 방법은 다른 방법들에 비해 실험 방법이 복잡하고 그에 비해 융합 성공률은 10% 이하로 낮다는 문제점이 있다(Methods in enzymology, 1993, vol. 221, pp 26-28).However, in the case of various attempts to develop the above-mentioned macrophage-tumor cell fusion method, the experimental in vitro method has a very low cell survival rate due to the physical and chemical impact of the cells, and the probability of success is less than 5% In the case of low or in vivo experiments, exogenously injected cancer cells naturally fused with macrophages in the body, and it is impossible to reproduce them experimentally and it is also impossible to use them for research. These examples include the following. There are many ways to make hybrid cells artificially by fusing animal cells. A method of using Sendai virus (J Virol. 1973 Oct; 12 (4): 937-939, ANTICANCER RESEARCH. 2016; 36: 3827-3832) discloses that the virus fuses to the cell surface and injects its genetic material into host cells It is a method widely used at the early stage of the study of cell fusion, focusing on the nature and using only the cell membrane fusion function through the Sendai virus, which is inactivated and inactivated by the ultraviolet irradiation. This method has the problem that the experimental method is more complicated than the other methods and the fusion success rate is as low as 10% or less (Methods in Enzymology, 1993, vol. 221, pp 26-28).

폴리에틸렌 글리콜을 사용하는 방법(Somatic Cell Genetics May 1976, Volume 2, Issue 3, pp 271-280, Sci Rep. 2017, 24;7:46544)은 자세한 작용 기전이 아직 밝혀지지 않았지만, 세포와 세포 사이의 접촉을 증가시키는 기능을 갖고 있는 폴리에틸렌 글리콜의 사용 방법이 간단하여, 현재 세포 융합 실험에서 가장 널리 사용되고 있다. 그러나 이 방법은 세포 독성이 높고, 세포 융합 성공률은 25% 이하로 낮다는 문제점이 있다(Methods in Molecular Biology, 2006, pp 59-66, Stem Cell Rev. 2 (4): 341-349, European Journal of Clinical Investigation (2002) 32, 207-217, Stem Cell Research. 2017, 19:7681).Although detailed mechanisms of action have not been elucidated yet, it is believed that the use of polyethylene glycol (Somatic Cell Genetics May 1976, Volume 2, Issue 3, pp 271-280, Sci. Rep. The use of polyethylene glycol, which has the ability to increase contact, is simple and is currently the most widely used in cell fusion experiments. However, this method has a problem that cytotoxicity is high and the cell fusion success rate is as low as 25% or less (Methods in Molecular Biology, 2006, pp 59-66, Stem Cell Rev. 2 (4): 341-349, European Journal of Clinical Investigation (2002) 32, 207-217, Stem Cell Research. 2017, 19: 7681).

또 전기 융합 방법은 세포에 전기 자극을 주어 세포막을 약화시켜 두 세포를 융합시키는 방법으로, 작업 시간이 짧고 융합 성공률이 약 60 ~ 70 % 정도로 비교적 높지만, 비교적 높은 비용이 발생하고, 실험 절차가 복잡하며, 아직까지 융합에 최적화된 실험 방법이 정립되지 않았다는 단점이 있다(Bioelectrochemistry. 2013. 89: 34-41). 이를 개선하기 위한 노력이 지속되고 있지만(한국 공개특허공보 제10-2013-0037469호, 제10-2016-0045287호), 실제 세포 실험에 사용되기까지는 시간이 더 필요할 것으로 보인다.In addition, the electrofusion method is a method of fusing two cells by weakening the cell membrane by applying electrical stimulation to the cells. The operation time is short and the fusion success rate is relatively high, about 60 to 70%, but relatively high cost is incurred, And yet there is a disadvantage that no optimized method for fusion has been established (Bioelectrochemistry. 2013. 89: 34-41). Although efforts to improve this are continuing (Korean Patent Laid-Open Publication No. 10-2013-0037469, No. 10-2016-0045287), it takes more time to be used for actual cell experiments.

위와 같은 방법들을 사용하지 않고 단순히 두 종류의 세포를 함께 배양하여 자연적으로 융합이 되도록 하는 실험법 또한 많이 이용되고 있지만 이 역시 융합성공률은 현저히 낮다(Int. J. Mol. Sci. 2016, 17(6):826).In addition, the fusion success rate is remarkably low (Int. J. Mol. Sci., 2016, 17 (6)). : 826).

또한 이렇게 여러 가지 방법들이 존재하지만 대부분 낮은 효율의 문제뿐만 아니라, 자연적인 융합법 외에는 세포에 자극을 주는 방법들이기 때문에 세포의 생장에 영향을 준다는 문제점도 존재한다.In addition, there are various methods, but most of them have a problem of affecting cell growth as well as low efficiency problems, as well as methods of stimulating cells other than natural fusion methods.

이런 문제점들을 극복하고 높은 효율로 암세포와 대식세포를 인공적으로 융합할 수 있다면, 이 융합세포를 이용하여 체외(in vitro) 실험이 가능해지기 때문에 전이암의 메커니즘에 관한 다양한 연구에 도움이 될 것이다. 뿐만 아니라 현재의 전이암 동물 모델은 일반 암세포를 동물 혈관을 통해 주입하거나, 암 조직을 직접 동물에 이식하는 방법을 사용하기 때문에 성공률에 한계가 있으나, 융합을 통해 전이성을 획득한 세포를 주입한다면 전이암 동물 모델의 제작 성공률의 증가도 기대해볼 수 있을 것이다. 임상 실험에 들어가기 전 꼭 필요한 동물 실험을 위한 전이암 동물 모델이 부족한 현실이기 때문에(Nat Rev. 2011; 11:135-41) 아직 그 메커니즘이 완전히 밝혀지지 않은 전이암의 보다 전문적이고 다양한 연구를 위해서도 적절한 동물 모델의 개발이 절실하다. If we can overcome these problems and artificially fuse cancer cells and macrophages with high efficiency, it will be useful for various studies on the mechanism of metastatic cancer because the in vitro experiments can be performed using these fusion cells. In addition, current transitional cancer animal models have limitations in success rates because they inject ordinary cancer cells through animal vasculature or directly transfer the cancer tissues to animals. However, if cells that acquire metastatic cells are injected through fusion, The success rate of production of animal models of cancer can be expected to increase. (Nat Rev. 2011; 11: 135-41) for more specialized and diverse studies of metastatic cancers whose mechanisms have yet to be fully elucidated Development of appropriate animal models is urgent.

최근 실험적으로, 저산소 챔버를 이용하여 저산소 환경을 조성한 후 유방암 세포와 대식세포를 융합시킨 연구가 보고 되었으나, 저산소 챔버를 이용하여 저산소 환경을 조성하면 일반적인 공동배양(Co-culture)보다 뛰어난 융합 성공률을 보여준다는 내용이지만, 실제 챔버를 이용한 연구결과는 ‘융합 효율이 기존의 공동배양보다 약 두 배 정도 높다’라고 언급하고 있지만, 최종 융합 성공률은 전체 실험에 활용한 세포 중, 1%가 되지 않는다. (FASEB J, 2015, 29(9)4036-45). 1% 미만의 성공률로 융합이 되었다는 것은 자연 환경에서 관찰되는 융합 비율과 비교해서 저산소 챔버에 의해 융합이 효율적으로 증가 혹은 개선되었다고 보기 어렵다. 따라서 이러한 대식세포-종양세포 간 융합 방법을 활용한 전이암 연구에 있어서의 가장 큰 장애물은 융합 성공률이라고 말할 수 있다(Nat Rev Cancer. 2008;8(5):377-86). Recent studies have shown that hypoxic chambers are used to create a hypoxic environment, and then breast cancer cells and macrophages are fused. However, when hypoxic chambers are used for hypoxic chambers, However, the final fusion success rate is not 1% of the total cells used in the experiment, although the research results using the actual chamber refer to 'the fusion efficiency is about twice as high as the conventional co-culture'. (FASEB J, 2015, 29 (9) 4036-45). Convergence at a success rate of less than 1% is unlikely to improve or improve fusion efficiently by the hypoxic chamber compared to the fusion rate observed in the natural environment. Thus, the most important obstacle in the study of metastatic cancer using the macrophage-tumor cell fusion method is the fusion success rate (Nat Rev Cancer. 2008; 8 (5): 377-86).

한국 등록특허공보 제10-0363587호(공고일 2002년 12월 06일)Korean Patent Registration No. 10-0363587 (Published on December 06, 2002) 한국 공개특허공보 제10-2014-0135101호(공개일 2014년 11월 25일)Korean Patent Laid-Open Publication No. 10-2014-0135101 (published on November 25, 2014) 한국 공개특허공보 제10-2013-0093091호(공개일 2016년 04월 26일)Korean Patent Publication No. 10-2013-0093091 (published April 26, 2016) 한국 공개특허공보 제10-2014-0084043호(공개일 2014년 07월 04일)Korean Patent Publication No. 10-2014-0084043 (published on July 04, 2014)

J. M. Pawelek & A. K. Chakraborty, "Opinion : Fusion of tumour cells with bone marrow-derived cells : a unifying explanation for metastasis" Nature Reviews Cancer Volume 8, 377-386 (May 2008)J. M. Pawelek & A. K. Chakraborty, "Opinion: Fusion of Tumor Cells with Bone Marrow-Derived Cells: A Unifying Explication for Metastasis", Nature Reviews Cancer Volume 8, 377-386 (May 2008)

본 발명의 목적은 암세포와 대식세포를 융합하는 과정에서 암세포의 생체 내 미세 환경의 특징 중 하나인 저산소환경을 조성하여 암세포와 대식세포를 융합함으로써 세포 사멸율이 낮고, 융합 효율이 높은 저산소 환경을 이용한 전이암 하이브리드 세포의 제조방법을 제공하는데 목적이 있다.It is an object of the present invention to provide a hypoxic environment which is one of the characteristics of microenvironment of cancer cells in the process of fusing cancer cells and macrophages, thereby fusing cancer cells and macrophages, thereby lowering the cell death rate, The present invention provides a method for producing a hybridoma cell.

상기 목적들을 달성하기 위한, 본 발명의 전이암 하이브리드 세포의 제조 방법은, 암세포와 대식세포를 융합하여 전이성을 갖는 전이암 하이브리드 세포의 제조 방법에 있어서, 상기 암세포와 상기 대식세포가 융합되는 배양 배지를 상기 암세포의 생체 내 미세 환경의 특징 중 하나인 저산소 환경으로 조성하여 상기 암세포와 상기 대식세포를 융합하되, 상기 저산소 환경은, 상기 배양 배지에 염화코발트(CoCl2)를 처리하는 것을 특징으로 한다. In order to accomplish the above objects, the present invention provides a method for producing a transitional cancer hybrid cell, which comprises fusing cancer cells and macrophages to produce a metastatic hybrid cell having metastasis, comprising the steps of: Wherein the cancer cell is cultured in a hypoxic environment, which is one of the characteristics of the in vivo microenvironment of the cancer cell, and the cancer cell is fused with the macrophage, wherein the hypoxic environment is treated with cobalt chloride (CoCl 2 ) .

상술한 바와 같이, 본 발명의 전이암 하이브리드 세포의 제조 방법은 염화코발트(CoCl2)를 이용하여 암세포의 생장 환경 중 하나인 저산소 환경을 조성하고 암세포와 대식세포를 융합하여 전이성을 가진 하이브리드 세포를 제작함으로써, 별도의 물리적인 외부 자극을 가하지 않고 제조가 가능하며 기존의 세포 융합에 사용된 다양한 방법들의 한계점에 해당하는 융합 효율이 극히 낮은 것과 비교하여 그 융합 효율이 90%에 달하여 그 효과가 현저하다.As described above, the method for producing the transitional cancer hybrid cell of the present invention uses a cobalt chloride (CoCl 2 ) to form a hypoxic environment, which is one of cancer cell growth environments, and to hybridize cancer cells and macrophages with the metastatic hybrid cells The fusion efficiency is 90% compared to the extremely low fusion efficiency corresponding to the limit of the various methods used in the conventional cell fusion, and the effect is remarkable Do.

또 본 발명의 전이암 하이브리드 세포의 제조 방법은 세포 사멸 율이 낮아서 융합세포의 수득 율이 매우 높으며, 세포의 종에 제한 없이 적용이 가능하기 때문에 인간 세포를 포함하여 다양한 세포에서 전이암의 메커니즘 규명에 필요한 다양한 실험이 가능하며, 다양한 동물에서 전이암 모델을 만드는 것과 같은 산업적 활용성이 매우 크다.In addition, the method for producing a transitional cancer hybrid cell of the present invention has a low rate of cell death and a high yield of fused cells, and can be applied to any kind of cell without any limitation. Therefore, the mechanism of the metastatic cancer in various cells including human cells And it is very useful for industrial applications such as making a transitional cancer model in various animals.

또한 본 발명을 통해 만들어진 세포를 동물 모델에 적용하면 암의 전이에 관한 연구는 물론이고 하나의 동물 모델에서 다양한 부위의 암 연구도 가능한 다목적 동물 암 모델의 개발이 가능하다.In addition, when cells prepared by the present invention are applied to an animal model, it is possible to develop a multi-purpose animal cancer model capable of studying cancer in various areas in one animal model as well as in cancer metastasis.

뿐만 아니라, 본 발명에 의해 제작된 전이성 하이브리드 세포는 전이암의 다양한 체외 실험이 가능하며, 전이성을 가진 하이브리드 세포를 직접 동물에 주입하는 방식을 사용하면 보다 높은 성공률의 전이암 동물 모델 제작도 기대할 수 있다.In addition, the inventive transgenic hybrid cells produced by the present invention can be used for various in vitro experiments of metastatic cancer. If a method of directly injecting hybrid cells having metastasis into an animal is used, a higher success rate of transgenic animal models can be expected have.

도 1은 본 발명에 따른 암세포와 대식세포의 세포 융합을 통해 전이성을 획득한 전이암 하이브리드 세포를 제조하는 수순을 도시한 흐름도;
도 2는 본 발명에 따른 세포 융합 시, 육안으로 모니터링이 용이하도록 형광 염색 공정이 추가된 암세포와 대식세포의 세포 융합을 통해 전이성을 획득한 전이암 하이브리드 세포의 제조하는 수순을 도시한 흐름도;
도 3은 본 발명의 실시 (예)에 따른 암세포와 대식세포의 세포 융합을 통해 전이성을 획득한 전이암 하이브리드 세포를 제조 및 모니터링 수순을 도시한 흐름도;
도 4는 본 발명의 실시 (예)에 따른 CoCl2를 사용하였을 때 Hepa1c1c7 세포의 생존율을 MTT assay를 이용하여 측정한 결과를 나타내는 도표;
도 5a는 도 3의 실시 (예)에 따른 배양 배지에서 아무것도 처리하지 않고 쥐의 간암세포(Hepa1c1c7)와 대식세포(RAW264.7)를 함께 배양한 플레이트를 나타내는 사진;
도 5b는 저산소 챔버를 이용하여 저산소 환경을 조성한 배지에서 동일 세포를 함께 배양한 상태를 나타내는 플레이트의 사진;
도 5c는 염화코발트(CoCl2)를 이용하여 저산소 환경을 조성한 배지에서 동일 세포를 함께 배양한 상태를 나타내는 플레이트의 사진;
도 5d는 도 5a 내지 5c의 융합 성공률을 정량적으로 나타낸 그래프;
도 6은 도 3의 실시 (예)에 따른 세포 융합 방법을 다양한 종류의 암세포-인간 폐암세포(A-549), 쥐 폐암세포(LA-4), 쥐 신장세포(RAG)-에 적용하여 대식세포와 융합한 전이성 하이브리드 세포의 형광 사진;
도 7a 내지 도 7c는 도 3의 실시 (예)에 따른 세포 융합 방법을 사용하여 암세포(Hepa1c1c7)와 대식세포(RAW264.7)가 융합되는 초기 단계의 전이성 하이브리드 세포를 투과 전자 현미경(SEM)으로 본 사진들;
도 8a 내지 도 8c는 도 3의 실시 (예)에 따른 세포 융합 방법을 사용하여 만들어진 암세포, 대식세포 및 하이브리드 세포 각각의 Epithelial 단백질 표지자인 EpCam을 형광염색(red)을 통해 보여주는 사진들;
도 9a 내지 도 9c는 도 3의 실시 (예)에 따른 세포 융합 방법을 사용하여 만들어진 암세포, 대식세포 및 하이브리드 세포 각각의 Mesenchymal 단백질 표지자인 Fibronectin을 형광염색(red)을 통해 보여주는 사진들;
도 10a 및 도 10b는 도 8a 및 도 9a에 나타나는 암세포의 이동을 보여주는 광학 사진들;
도 11a 및 도 11b는 도 8c 및 도 9c에 나타나는 하이브리드 세포의 이동성을 보여주는 광학 사진들;
도 12는 도 10a 내지 도 11b에 나타나는 세포의 이동성을 정량적으로 나타낸 그래프; 그리고
도 13은 본 발명의 방법을 사용하여 다양한 종류의 암세포와 대식세포를 융합하였을 때 융합 효율을 자연적으로 융합하였을 때의 효율과 비교하여 정량적으로 나타낸 그래프이다.FIG. 1 is a flow chart showing a procedure for producing a metastatic cancer hybrid cell in which metastasis is obtained through cell fusion of cancer cells and macrophages according to the present invention;
FIG. 2 is a flow chart showing a procedure for producing a transitional cancer hybrid cell obtained by metastasis through cell fusion of cancer cells and macrophages to which a fluorescent dyeing process is added to facilitate visual monitoring during cell fusion according to the present invention;
FIG. 3 is a flow chart showing a procedure for producing and monitoring metastatic cancer hybrid cells obtained by metastasis through cell fusion of cancer cells and macrophages according to the embodiment of the present invention (example); FIG.
FIG. 4 is a chart showing the results of measurement of the survival rate of Hepa1c1c7 cells using CoCl 2 according to the embodiment of the present invention using MTT assay; FIG.
5A is a photograph showing a plate in which hepatocellular carcinoma cells (Hepa1c1c7) and macrophages (RAW264.7) were co-cultured in the culture medium according to the embodiment of Fig. 3 without any treatment;
FIG. 5B is a photograph of a plate showing the same cells cultured together in a hypoxic environment using a hypoxic chamber; FIG.
FIG. 5C is a photograph of a plate showing the same cells cultured in a medium in which hypoxic environment is formed using cobalt chloride (CoCl 2 );
FIG. 5D is a graph quantitatively showing the fusion success rates of FIGS. 5A to 5C; FIG.
FIG. 6 is a graph showing the results obtained by applying the cell fusion method according to the embodiment of FIG. 3 to various kinds of cancer cell-human lung cancer cells (A-549), rat lung cancer cells (LA-4) and rat kidney cells (RAG) Fluorescence of metastatic hybrid cells fused with phagocytes;
FIGS. 7A to 7C are schematic diagrams showing the results of an initial stage of metastatic hybrid cells in which cancer cells (Hepa1c1c7) and macrophages (RAW264.7) are fused using a cell fusion method according to the embodiment of FIG. 3 (Transmission Electron Microscope These pictures;
8A to 8C are photographs showing the epithelial protein marker EpCam of cancer cells, macrophages and hybrid cells prepared using the cell fusion method according to the embodiment (example of FIG. 3) through fluorescent staining (red);
FIGS. 9A to 9C are photographs showing fluorescence staining (red) of Fibronectin, which is a Mesenchymal protein marker of each of cancer cells, macrophages and hybrid cells prepared using the cell fusion method according to the embodiment (example of FIG. 3);
FIGS. 10A and 10B are optical photographs showing the movement of cancer cells shown in FIGS. 8A and 9A;
FIGS. 11A and 11B are optical photographs showing the mobility of the hybrid cells shown in FIGS. 8C and 9C;
FIG. 12 is a graph quantitatively showing cell mobility shown in FIGS. 10A to 11B; FIG. And
FIG. 13 is a graph showing quantitative comparison with the efficiency when the fusion efficiency is naturally fused when various types of cancer cells and macrophages are fused using the method of the present invention.

이하, 상기 목적 외에 본 발명의 다른 목적 및 특징들은 첨부 도면을 참조한 실시예에 대한 설명을 통하여 명백히 드러나게 될 것이다.Hereinafter, other objects and features of the present invention will be apparent from the following description of embodiments with reference to the accompanying drawings.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가진 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.Unless defined otherwise, all terms used herein, including technical or scientific terms, have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Terms such as those defined in commonly used dictionaries should be interpreted as having a meaning consistent with the meaning in the context of the relevant art and are to be interpreted in an ideal or overly formal sense unless explicitly defined in the present application Do not.

이하 첨부된 도 1 내지 도 13을 참조하여 본 발명의 실시 (예)를 상세히 설명한다.Hereinafter, embodiments (examples) of the present invention will be described in detail with reference to FIGS. 1 to 13 attached hereto.

도 1은 본 발명에 따른 암세포와 대식세포의 세포 융합을 통해 전이성을 획득한 전이암 하이브리드 세포를 제조하는 수순을 도시한 흐름도이고, 도 4는 본 발명의 실시 (예)에 따른 CoCl2를 사용하였을 때 Hepa1c1c7 세포(쥐의 간암세포)의 생존율을 MTT assay를 이용하여 측정한 결과를 나타내는 도표이다.FIG. 1 is a flow chart showing a procedure for producing a metastatic cancer hybrid cell obtained by metastasis through the cell fusion of cancer cells and macrophages according to the present invention. FIG. 4 is a graph showing the results obtained by using CoCl 2 (Survival rate) of Hepa1c1c7 cells (mouse hepatocarcinoma cells) by MTT assay.

도 1을 참조하면, 본 발명의 전이암 하이브리드 세포 제조 수순은 먼저, 단계 S100에서 전이암 하이브리드 세포를 제조하기 전에 암세포를 이용하여 전이암 하이브리드 세포의 생장 환경을 결정한다.Referring to FIG. 1, the transfected cancer hybrid cell preparation of the present invention first determines the growth environment of the transgastric hybrid cell using the cancer cell before the preparation of the transgastric hybrid cell in step S100.

즉, 전이암 하이브리드 세포의 생장 환경을 생체 내 암의 미세 환경의 특징 중 하나인 저산소 환경으로 조성하기 위하여, 암세포를 이용하여 저산소 환경 조건을 결정한다.That is, hypoxic environmental conditions are determined using cancer cells to form a hypoxic environment, which is one of the characteristics of the microenvironment of cancer cells, in the growth environment of metastatic cancer hybrid cells.

이 실시 (예)에서는 사전 실험 예를 들어, 도 4에 도시된 바와 같이, MTT assay(세포 독성도 조사)을 통해 세포 배양 중 암세포의 생장에 영향을 받지 않도록 염화코발트(CoCl2)의 농도를 조절하여 암세포 예를 들어, Hepa1c1c7 세포의 생존율을 측정한 후, 특정 농도를 결정하여 전이암 하이브리드 세포의 생장 환경을 결정한다. 예컨대, Hepa1c1c7 세포의 생존율을 80 % 이상을 조건으로 하는 경우, 염화코발트(CoCl2)의 농도는 약 125 μM 이하의 범위에서 결정된다.In this embodiment, as shown in FIG. 4, the concentration of cobalt chloride (CoCl 2 ) is adjusted so as not to be affected by the growth of cancer cells during cell culture through MTT assay (cytotoxicity survey) After measuring the survival rate of cancer cells, for example, Hepa1c1c7 cells, a specific concentration is determined to determine the growth environment of the transgene hybrid cells. For example, when the survival rate of Hepa1c1c7 cells is 80% or more, the concentration of cobalt chloride (CoCl 2 ) is determined within a range of about 125 μM or less.

이 후, 단계 S120에서 염화코발트(CoCl2)를 이용하여 저산소 환경이 조성된 배양 배지에서 대식세포가 충분히 분화하여 암세포에 작용할 수 있도록 일정 기간 예컨대, 2일 동안 배양한다. 그 결과, 단계 S130에서 세포 융합을 통해 전이성을 획득한 전이암 하이브리드 세포가 생장된다.Thereafter, in step S120, cobalt chloride (CoCl 2 ) is used to culture the cultured medium for a predetermined period of time, for example, 2 days so that the macrophages can sufficiently differentiate and act on the cancer cells. As a result, in step S130, metastatic cancer hybrid cells that have acquired metastasis through cell fusion are grown.

이러한 본 발명에서는 상술한 단계(S100 ~ S130)들의 과정 이외에 물리적인 외부 자극을 가하지 않고, 융합 세포를 제조함으로써, 높은 융합 효율과 높은 세포 생존율을 보이는 융합 방법을 제공할 수 있다.According to the present invention, a fusion method showing a high fusion efficiency and a high cell survival rate can be provided by preparing a fusion cell without physical external stimulation other than the process of steps S100 to S130 described above.

염화코발트(CoCl2)는 Hypoxia-inducible factor(HIF)-1α를 안정화시키는 물질로 잘 알려져 있다. 이 HIF-1α는 암세포의 신생혈관 생성에 관여하는 VEGF의 발현을 촉진시키는 역할을 하는데, 암세포의 미세 환경에서 신생혈관의 생성은 암세포가 원발 부위를 벗어나 체내의 다른 부위로 이동이 가능하게 하는 가장 중요한 활동이라고 할 수 있다.Cobalt chloride (CoCl 2 ) is well known as a stabilizer of Hypoxia-inducible factor (HIF) -1α. This HIF-1α plays a role in promoting the expression of VEGF involved in the neovascularization of cancer cells. In the microenvironment of cancer cells, the formation of neovascularization is a phenomenon in which cancer cells migrate from the primary site to other sites in the body It is an important activity.

따라서 이와 같은 본 발명의 전이암 하이브리드 세포의 제조 방법은 별도의 물리적인 외부 자극을 가하지 않고, TAM 대식세포의 활동과 암세포의 HIF-1α의 활동이 보다 활발할 수 있는 저산소 환경을 조성하여 하이브리드 세포를 제작함으로써, 높은 융합효율과 높은 세포 생존율 및 전이 능력을 얻을 수 있으며, 세포의 종에 제한 없이 적용이 가능하기 때문에 다양한 세포에서 전이암의 메커니즘 규명에 필요한 체외 실험이 가능하다. 또한 이제까지 세포의 융합 방법으로 사용되어온 여러 가지 방법들에 비해 뛰어난 효율을 바탕으로 산업적인 활용을 가능하게 할 수 있다.Therefore, the method of the present invention for producing transitional cancer hybrid cells does not require any external physical stimulation, but rather creates a hypoxic environment in which TAM macrophage activity and HIF-1α activity of cancer cells are more active, Can produce high fusion efficiency, high cell survival rate and metastatic ability, and can be applied to any kind of cell. Therefore, it is possible to perform an in vitro experiment for identifying the mechanism of metastatic cancer in various cells. In addition, it can be used industrially with excellent efficiency compared to various methods which have been used as fusion methods of cells so far.

도 2는 본 발명에 따른 세포 융합 시, 육안으로 모니터링이 용이하도록 형광 염색 공정이 추가된 암세포와 대식세포의 세포 융합을 통해 전이성을 획득한 전이암 하이브리드 세포의 제조하는 수순을 도시한 흐름도이다.FIG. 2 is a flow chart showing a procedure for manufacturing a transitional cancer hybrid cell in which metastatic cells are obtained through cell fusion of cancer cells and macrophages to which a fluorescent staining process is added to facilitate visual monitoring during cell fusion according to the present invention.

도 2를 참조하면, 이 제조 수순은 세포 융합 시, 육안으로 모니터링이 용이하도록 하기 위하여, 도 1의 제조 방법에 암세포와 대식세포 각각에 서로 다른 색상의 형광 물질을 주입 처리하는 형광 염색 단계(S160)가 추가되며, 다른 단계들은 도 1의 것과 동일하게 처리된다.Referring to FIG. 2, in order to facilitate visual observation during cell fusion, a fluorescent dyeing step S160 (see FIG. 2) for injecting fluorescent materials of different colors into cancer cells and macrophages, respectively, ), And the other steps are processed in the same manner as in Fig.

즉, 이 제조 수순은 단계 S150에서 전이암 하이브리드 세포를 제조하기 전에 도 4에 도시된 바와 같이, MTT assay을 통해 세포 배양 중 암세포의 생장에 영향을 받지 않도록 염화코발트(CoCl2)의 농도를 조절하여 전이암 하이브리드 세포의 생장 환경을 결정한다.That is, as shown in FIG. 4, before the transfected cancer hybrid cells are prepared in step S150, the production procedure is controlled by adjusting the concentration of cobalt chloride (CoCl 2 ) so as not to be affected by the growth of cancer cells during cell culture through MTT assay To determine the growth environment of the metastatic cancer hybrid cells.

단계 S160에서 암세포와 대식세포 각각에 서로 다른 형광색을 띄는 나노 입자를 주입 처리한다. 이를 위해 세포 융합에 들어가기 전에, 암세포는 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate : FITC) 형광의 나노 입자를 주입하고, 대식세포는 로다민 이소티오시아네이트(rhodamine isothiocyanate : RITC) 형광의 나노 입자를 주입한다. 이 실시 (예)에서 FITC 나노 입자는 주식회사 바이테리얼즈 사(Biterials Co., Ltd)의 제품명 NEO-STEM TMSF50를 주입하고, RITC 나노 입자는 바이테리얼즈 사(Biterials Co., Ltd)의 제품명 NEO-STEM TMSR50를 주입한다. 따라서 융합에 성공한 세포는 암세포의 녹색 형광과 대식세포의 빨간색 형광이 합쳐져 주황색 빛을 띠므로 형광 현미경을 통하여 세포 융합을 바로 확인할 수 있다.In step S160, nanoparticles having different fluorescence colors are injected into cancer cells and macrophages, respectively. For this purpose, the cancer cells are injected with fluorescein isothiocyanate (FITC) fluorescence nanoparticles and the macrophages are injected with rhodamine isothiocyanate (RITC) fluorescence nanoparticles . In this embodiment, the FITC nanoparticles are injected with the product name NEO-STEM TMSF50 of Biterials Co., Ltd., and the RITC nanoparticles are injected into the bipolar plate of Biterials Co., Ltd The product name NEO-STEM TMSR50 is injected. Therefore, the cells that have successfully fused with each other can be identified directly by fluorescence microscopy since the green fluorescence of the cancer cells and the red fluorescence of the macrophages are combined to give an orange light.

단계 S180에서 염화코발트(CoCl)를 이용하여 저산소 환경이 조성된 배양 배지에서 대식세포가 충분히 분화하여 암세포에 작용할 수 있도록 일정 기간 예컨대, 2일 동안 배양한다. 그 결과, 단계 S190에서 세포 융합을 통해 전이성을 획득한 전이암 하이브리드 세포가 생장된다.In step S180, cobalt chloride (CoCl 2) is cultured for a predetermined period of time, for example, for 2 days so that macrophages can sufficiently differentiate and act on cancer cells in a hypoxic environment-conditioned culture medium. As a result, in step S190, metastatic cancer hybrid cells that have acquired metastasis through cell fusion are grown.

이러한 본 발명에서는 상술한 단계(S150 ~ S190)들의 과정이외에 물리적인 외부 자극을 가하지 않고, 융합 세포를 제조함으로써, 높은 융합 효율과 높은 세포 생존율을 보이는 융합 방법을 제공할 수 있다.According to the present invention, a fusion method showing a high fusion efficiency and a high cell survival rate can be provided by producing a fusion cell without physical external stimulation other than the above-mentioned steps S150 to S190.

본 발명에서 사용되는 대식세포는 동물종의 혈관에서 추출한 단구세포를 분화시킨 세포이거나 동물 종 유래의 대식세포 세포 주이다. 대식세포 세포 주는 예를 들어, RAW264.7, MV-4-11, 3D4/2, J774A.1, KG-1, NR8383[AgC11x3A, NR8383.1], DH82, IC-21, 3D4/31, MH-S, C8-B4, AMJ2-C11, Fcwf-4[Fcwf], MD, 23 ScCr[10ScNCr/23], SC, 3D4/21, I-13.35, H36.12j[Pixie 12j], RAW 309 Cr.1, P388D1[P388 D1], AMJ2-C8, H36.12e[Pixie 12e], H36.12a[Pixie 12a], PMJ2-PC, PMJ2-R, H36.12b[Pixie 12b], H36.12d[Pixie 12d], I-11.15, 42TA, KG-1a, C8-S, C8-D30 등의 세포주들로 구성되는 군에서 선택된다.The macrophages used in the present invention are cells differentiated from monocytes extracted from blood vessels of animal species or macrophage cells derived from animal species. The macrophage cell line is, for example, RAW264.7, MV-4-11, 3D4 / 2, J774A.1, KG-1, NR8383 [AgC11x3A, NR8383.1], DH82, IC- -S, C8-B4, AMJ2-C11, Fcwf-4 [Fcwf], MD, 23 ScCr [10ScNCr / 23], SC, 3D4 / 21, I-13.35, H36.12j [Pixie 12j], RAW 309 Cr. 1, P388D1 [P388D1], AMJ2-C8, H36.12e [Pixie 12e], H36.12a [Pixie 12a], PMJ2-PC, PMJ2-R, H36.12b [Pixie 12b], H36.12d [Pixie 12d ], I-11.15, 42TA, KG-1a, C8-S, C8-D30 and the like.

또 본 발명에서 사용되는 암세포는 위암(Gastric cancer), 간암(Liver cancer), 폐암(Lung cancer), 유방암(Breast cancer), 난소암(Ovarian cancer), 기관지암(bronchial cancer), 구강암(Oral cavity cancer), 후두암(Larynx cancer), 췌장암(Pancreatic cancer), 대장암(Colorectal cancer), 방광암(Bladder cancer), 결장암(Colon cancer), 자궁경부암(Uterine cervical cancer), 전립선암(Prostate cancer), 신장암(Kidney cancer), 피부암(Skin cancer), 갑상선암(Thyroid cancer), 뇌암(Brain cancer) 세포 등으로 이루어지는 군에서 선택된 암세포이거나 이들 세포에서 유래된 세포주이다.The cancer cells used in the present invention may be used for the treatment and / or prophylaxis of gastric cancer, liver cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, bronchial cancer, cancer, larynx cancer, pancreatic cancer, colorectal cancer, bladder cancer, colon cancer, uterine cervical cancer, prostate cancer, kidney Cancer cells selected from the group consisting of Kidney cancer, Skin cancer, Thyroid cancer, Brain cancer cells and the like.

위암에서 유래된 세포 주는 예를 들어, KATOIII, NCI-N87, SNU-16, SNU-5, AGS, SNU-1 세포 주들로 구성되는 군에서 선택되는 세포이다.Cells derived from gastric cancer are cells selected from the group consisting of, for example, KATOIII, NCI-N87, SNU-16, SNU-5, AGS and SNU-1 cell lines.

간암에서 유래된 세포 주는 예를 들어, SNU-475, C3A, SNU-449, PLC/PRF/5, SNU-387, SK-HEP-1, SNU-423, H-4-II-E, H4-II-E-C3, McA-RH8994, MH1C1, N1-S1, Hepa-1c1c7, Hepa 1-6 세포 주들로 구성되는 군에서 선택되는 세포이다.HU4-II-E, H4-II-E, HU4-II-E, and HU4- II-E-C3, McA-RH8994, MH1C1, N1-S1, Hepa-1c1c7, Hepa 1-6 cell lines.

폐암에서 유래된 세포 주는 예를 들어, NCI-H2126, NCI-H1299, NCI-H1437, NCI-H1563, NCI-H1573, NCI-H1975, NCI-H661, KLN 205, LL/2, DMS 114, NCI-H460[H460], SW 1271, LA4 세포 주들로 구성되는 군에서 선택되는 세포이다.NCI-H1573, NCI-H1975, NCI-H661, KLN205, LL / 2, DMS114, NCI-H1273, NCI- H460 [H460], SW 1271, LA4 cell lines.

유방암에서 유래된 세포 주는 예를 들어, BT-549, Hs 578T, MDA-MB-134-VI, MDA-MB-175-VII, MDA-MB-361, MDA-MB-231, MDA-MB-436, MDA-MB-157, MDA-MB-415, MDA-MB-453, MDA-MB-468, HCC1569, HCC1599, HCC38, HCC70, HCC1806, HCC1187, HCC1395, HCC202, HCC1419, HCC1428, HCC1937, HCC1143, HCC1500, HCC1954, HCC2157, HCC2218, MCF7, SK-BR-3, T-47D, ZR-75-1, ZR-75-30, DU4475, UACC-812, UACC-893, UACC-3199, UACC-3133, UACC-1179, UACC-732, UACC-2087, BT-20, AU565, BT-474, BT-549, CAMA-1, Eph4 1424.2, EpH4 1424.1, EMT6, EpH4 1424, Eph4 1424.2, C127I, JC 세포 주들로 구성되는 군에서 선택되는 세포이다.MB-231, MDA-MB-436, MDA-MB-361, MDA-MB- MDA-MB-415, MDA-MB-463, HCC1569, HCC1599, HCC38, HCC70, HCC1806, HCC1187, HCC1395, , HCC1954, HCC2157, HCC2218, MCF7, SK-BR-3, T-47D, ZR-75-1, ZR-75-30, DU4475, UACC-812, UACC-893, UACC- Consisting of Euclidean-1179, UACC-732, UACC-2087, BT-20, AU565, BT-474, BT-549, CAMA-1, Eph4 1424.2, EpH4 1424.1, EMT6, EpH4 1424, Eph4 1424.2, C127I, Is a cell selected from the group consisting of.

난소암에서 유래된 세포 주는 예를 들어, PA-1, Caov-3, SW 626, SK-OV-3, SK-LMS-1, HT-3, ME-180, MES-SA, SK-UT-1, KLE, AN3 CA, UACC-1598, MES-OV, UWB1.289, TOV-112D, OV-90, TOV-21G, HEY-T30 세포 주들로 구성되는 군에서 선택되는 세포이다.SK-OV-3, SK-LMS-1, HT-3, ME-180, MES-SA, SK-UT- 1, KLE, AN3 CA, UACC-1598, MES-OV, UWB1.289, TOV-112D, OV-90, TOV-21G and HEY-T30 cell lines.

구강암에서 유래된 세포 주는 예를 들어, SCC-15, SCC-25, SCC-9, UPCI:SCC090, UPCI:SCC152, A-253 세포 주들로 구성되는 군에서 선택되는 세포이다.Cells derived from oral cancer are cells selected from the group consisting of, for example, SCC-15, SCC-25, SCC-9, UPCI: SCC090, UPCI: SCC152, A-253 cell lines.

자궁경부암에서 유래된 세포 주는 예를 들어, Ca-Ski, DoTc2 4510, SiHa, C-33 A, MES-SA, SK-UT-1, AN3 CA, RL95-2 세포 주들로 구성되는 군에서 선택되는 세포이다.The cell line derived from cervical cancer is selected from the group consisting of, for example, Ca-Ski, DoTc2 4510, SiHa, C-33A, MES-SA, SK-UT-1, AN3CA, RL95-2 cell lines It is a cell.

전립선암에서 유래된 세포 주는 예를 들어, PNEC30, TRAMP-C1, VCaP, MyC-CaP 세포 주들로 구성되는 군에서 선택되는 세포이다.The cell line derived from prostate cancer is, for example, a cell selected from the group consisting of PNEC30, TRAMP-C1, VCaP, MyC-CaP cell lines.

신장암에서 유래된 세포 주는 예를 들어, RAG, Renca, Caki-1, Caki-2, A-498 세포 주들로 구성되는 군에서 선택되는 세포이다.Cell lines derived from kidney cancer are for example selected from the group consisting of RAG, Renca, Caki-1, Caki-2, A-498 cell lines.

피부암에서 유래된 세포 주는 예를 들어, Lo Ren, DU4475, A-375, RPMI-7951, WM-115, SK-MEL-1, SK-MEL-3, SK-MEL-24, G-361 세포 주들로 구성되는 군에서 선택되는 세포이다.SK-MEL-3, SK-MEL-24, and G-361 cell lines, such as, for example, Lo Ren, DU4475, A-375, RPMI-7951, WM-115, SK-MEL- ≪ / RTI >

갑상선암에서 유래된 세포 주는 예를 들어, TT 세포 주들로 구성되는 군에서 선택되는 세포이다.A cell line derived from a thyroid carcinoma is, for example, a cell selected from the group consisting of TT cell lines.

뇌암에서 유래된 세포 주는 예를 들어, A172, SW1088, H4, U118-MG, U87-MG, PFSK-1, Daoy, NB41A3 세포 주들로 구성되는 군에서 선택되는 세포이다.Cells derived from brain cancer are cells selected from the group consisting of, for example, A172, SW1088, H4, U118-MG, U87-MG, PFSK-1, Daoy and NB41A3 cell lines.

후두암에서 유래된 세포 주는 예를 들어, FaDu, Detroit 562 세포 주들로 구성되는 군에서 선택되는 세포이다.A cell line derived from laryngeal cancer is a cell selected from the group consisting of, for example, FaDu, Detroit 562 cell lines.

췌장암에서 유래된 세포 주는 예를 들어, Capan-2, Panc 10.05, CFPAC-1, HPAF-II, SW 1990, BxPC-3, AsPC-1, UACC-462, PANC-1, MIA PaCa-2, SU.86.86, AR42J, Panc 03.27, LTPA, Hs 766T, Panc 08.13, Panc 02.03, Panc 04.03, Panc 05.04, Panc 02.13 세포 주들로 구성되는 군에서 선택되는 세포이다.Pancreatic cancer-derived cell lines can be obtained from, for example, Capan-2, Panc 10.05, CFPAC-1, HPAF-II, SW 1990, BxPC-3, AsPC-1, UACC-462, PANC-1, MIA PaCa- .86.86, AR42J, Panc 03.27, LTPA, Hs 766T, Panc 08.13, Panc 02.03, Panc 04.03, Panc 05.04, Panc 02.13 cell lines.

대장암에서 유래된 세포 주는 예를 들어, SNU-C1, SK-CO-1, SW1116, SW948, T84, LS123, LoVo, SW837, SW48, RKO, COLO 205, SW1417, LS411N, NCI-H508, HT-29, CT26.WT, Hs 675.T, LS 174T, LS123, COLO 320DM, SW620, SW480, DLD-1, HCT116, HCT-15 세포 주들로 구성되는 군에서 선택되는 세포이다.For example, a cell line derived from a colon cancer may be SNU-C1, SK-CO-1, SW1116, SW948, T84, LS123, LoVo, SW837, SW48, RKO, COLO 205, SW1417, LS411N, NCI- 29, CT26.WT, Hs 675.T, LS 174T, LS123, COLO 320DM, SW620, SW480, DLD-1, HCT116 and HCT-15 cell lines.

방광암에서 유래된 세포 주는 예를 들어, 5637, HT-1197, HT-1376, RT4, SW 780, T-24, TCCSUP, UM-UC-3, NBT-II, J82, SCaBER 세포 주들로 구성되는 군에서 선택되는 세포이다.Cell lines derived from bladder cancer include, for example, cells consisting of 5637, HT-1197, HT-1376, RT4, SW780, T-24, TCCSUP, UM-UC-3, NBT- Lt; / RTI > cells.

그리고 결장암에서 유래된 세포 주는 예를 들어, SNU-C1, SK-CO-1, SW1116, SW948, T84, LS123, LoVo, SW837, SW48, RKO, COLO 205, SW1417, LS411N, NCI-H508, HT-29, CT26.WT, CMT-93 세포 주들로 구성되는 군에서 선택되는 세포이다.The cell lines derived from the colon cancer are, for example, SNU-C1, SK-CO-1, SW1116, SW948, T84, LS123, LoVo, SW837, SW48, RKO, COLO 205, SW1417, LS411N, NCI- 29, CT26.WT, and CMT-93 cell lines.

계속해서 본 발명의 실시 (예)에 따른 전이암 하이브리드 세포를 제조 및 모니터링 방법을 도 3 내지 도 13을 이용하여 상세히 설명한다.Next, a method of manufacturing and monitoring a transitional cancer hybrid cell according to an embodiment (Example) of the present invention will be described in detail with reference to FIG. 3 to FIG.

도 3은 본 발명의 실시 (예)에 따른 암세포와 대식세포의 세포 융합을 통해 전이성을 획득한 전이암 하이브리드 세포를 제조 및 모니터링 수순을 도시한 흐름도이고, 도 5a는 도 3의 실시 (예)에 따른 배양 배지에서 아무것도 처리하지 않고 쥐의 간암세포(Hepa1c1c7)와 대식세포(RAW264.7)를 함께 배양한 플레이트를 나타내는 사진이고, 도 5b는 저산소 챔버를 이용하여 저산소 환경을 조성한 배지에서 동일 세포를 함께 배양한 상태를 나타내는 플레이트의 사진이며, 도 5c는 염화코발트(CoCl2)를 이용하여 저산소 환경을 조성한 배지에서 동일 세포를 함께 배양한 상태를 나타내는 플레이트의 사진이고, 도 5d는 도 5a 내지 5c에서의 세포들의 융합성공률을 정량적으로 나타낸 그래프이다. 또한 도 6 내지 도 12는 본 발명의 실시 (예)에 따른 전이성을 획득한 전이암 하이브리드 세포를 모니터링한 결과를 나타내는 도면들이며, 그리고 도 13은 본 발명의 방법을 사용하여 다양한 종류의 암세포와 대식세포를 융합하였을 때 융합 효율을 정량적으로 나타낸 그래프이다.FIG. 3 is a flowchart showing a procedure for manufacturing and monitoring a transitional cancer hybrid cell in which metastasis is obtained through cell fusion of cancer cells and macrophages according to the embodiment of the present invention (example). FIG. (Hepa1c1c7) and macrophages (RAW264.7) without any treatment in the culture medium according to the present invention, and FIG. 5b is a photograph showing a plate in which a hypoxic chamber is used to culture the same cells FIG. 5C is a photograph of a plate showing a state in which the same cells are cultured together in a medium in which hypoxic environment is established using cobalt chloride (CoCl 2 ), FIG. 5c. ≪ / RTI > FIGS. 6 to 12 are views showing the results of monitoring the metastatic cancer hybrid cells obtained according to the embodiment of the present invention (Example), and FIG. 13 are graphs showing the results of monitoring the metastatic cancer cells using various methods of cancer cells This is a graph quantitatively showing the fusion efficiency when phagocytes are fused.

먼저 도 3을 참조하면, 본 발명의 전이암 하이브리드 세포는 단계 S200에서 암세포를 이용하여 융합 세포를 제조하기 전에 MTT assay을 통해 세포 배양 중 암세포의 생장에 영향을 받지 않도록 저산소 환경 조건을 결정하기 위하여 염화코발트(CoCl2)의 농도를 조절하여 전이암 하이브리드 세포의 생장 환경을 결정한다.First, referring to FIG. 3, the transitional cancer hybrid cells of the present invention can be used to determine hypoxic environmental conditions so as not to be affected by growth of cancer cells during cell culture through MTT assay before preparing fused cells using cancer cells in step S200 The concentration of cobalt chloride (CoCl 2 ) is controlled to determine the growth environment of the transgene hybrid cells.

융합 실험이 들어가기 전, 세포의 생장에 큰 영향을 주지 않는 CoCl2의 농도를 찾기 위한 MTT assay를 진행한다. 이 실시 (예)에서는 다양한 농도의 CoCl2를 처리한 Hepa1c1c7 세포를 96-웰 마이크로타이터 플레이트(96-well microtitre plates)에 1 X 104의 양으로 37 ℃, 5% CO2의 항온 배양기에서 24시간 동안 배양시킨 후 MTT assay를 진행한다. 이 때, MTT assay의 결과가 도 4에 도시되어있다. 이 실험 결과를 바탕으로 융합 실험에서는 세포의 생존율이 80 % 이상인 농도(100 mM 이하)를 사용하였다.Prior to the fusion experiment, MTT assay is performed to find the concentration of CoCl 2 that does not significantly affect cell growth. In this example, Hepa1c1c7 cells treated with various concentrations of CoCl 2 were inoculated into 96-well microtiter plates in an amount of 1 × 10 4 in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator After incubation for 24 hours, MTT assay is performed. The result of the MTT assay is shown in FIG. Based on the results of this experiment, the cell viability was 80% or less (100 mM or less) in the fusion experiment.

이 후 제조 방법은 융합 세포의 전이 능력과 이동성을 모니터링하거나, 융합 세포의 융합 효율을 모니터링하기 위하여 제조 과정이 나누어진다. 즉, 융합 세포의 전이 능력과 이동성을 모니터링하기 위하여, 단계 S210에서는 세포 융합에 이용하는 배양 배지를 단계 S200에서 결정된 조건에 맞추어 염화코발트(COCl2)를 처리하여 배양 배지를 저산소 상태로 조성한 후 세포를 일정 기간 예컨대, 2일 동안 배양한다. 이 실시 (예)에서는 암세포로 쥐의 간에서 유래한 Hepa-1c1c7 세포 주를 사용하고, 대식세포로 Raw264.7 세포 주를 사용한다. 각 세포는 1% 페니실린/스트렙토마이신과 10% 우태혈청을 함유하고 있는 MEM, DMEM 배지에서 배양시킨다.Subsequently, the production process is divided into monitoring the transfer ability and mobility of the fusion cell, or monitoring the fusion efficiency of the fusion cell. That is, in order to monitor the transfer ability and mobility of the fusion cell, in step S210, the culture medium used for cell fusion is treated with cobalt chloride (COCl 2 ) according to the conditions determined in step S200, For a certain period of time, for example, for 2 days. In this embodiment (Example), hepatocyte-derived Hepa-1c1c7 cell line is used as a cancer cell and Raw264.7 cell line is used as a macrophage. Each cell is cultured in DMEM medium containing 1% penicillin / streptomycin and 10% fetal calf serum.

이 상태로 단계 S220에서 배지의 교환 없이 37 ℃, 5% CO2의 항온 배양기에서 2일 동안 세포 융합을 진행한다. 그 결과, 세포 융합을 통해 전이성을 획득한 전이암 하이브리드 세포가 만들어진다. 이 때, 융합된 하이브리드 세포를 투과 전자 현미경을 통해 확인한 결과가 도 7a 내지 도 7c에 도시되어 있다.In this state, cell fusion is carried out in a constant temperature incubator at 37 ° C and 5% CO 2 for 2 days without exchanging the medium in step S220. As a result, a metastatic cancer hybrid cell is obtained through cell fusion. At this time, the results of confirmation of the fused hybrid cells through a transmission electron microscope are shown in Figs. 7A to 7C.

이어서 단계 S230에서 융합 세포의 전이 능력 및 이동성을 확인한다. 이 실시 (예)에서는 융합 세포의 전이 능력을 모니터링하기 위하여, 융합이 완료된 세포들을 12-웰 플레이트에 1.5 X 105의 양으로 37℃, 5% CO2의 항온 배양기에서 24시간 동안 배양시킨 후, 면역 세포 화학(Immunocytochemistry : ICC)법을 이용하여 전이능력을 확인한다. 이 때, 사용한 항체는 Epithelial 단백질 표지자로 알려진 EpCaM(Abcam, Cambridge, UK)과, Mesenchymal 단백질 표지자로 알려진 Fibronectin(Abcam, Cambridge, UK)이다. 도 8a 내지 도 9c는 이의 결과를 나타낸 사진들이다.Then, in step S230, the transfer ability and mobility of the fusion cell are confirmed. After this conduct (e) the culture in order to monitor the transfer capability of the fused cells, in an amount of 1.5 X 10 5 cells, the fusion is complete, the 12-well plate in 37 ℃, constant temperature incubator of 5% CO 2 for 24 hours , And Immunocytochemistry (ICC). The antibodies used were EpCaM (Abcam, Cambridge, UK), known as an epithelial protein marker, and Fibronectin (Abcam, Cambridge, UK), also known as a Mesenchymal protein marker. 8A to 9C are photographs showing the results thereof.

그리고 융합 세포의 이동성을 모니터링하기 위하여, 융합이 완료된 세포들을 12-웰 플레이트에 1.5 X 105의 양으로 37℃, 5% CO2의 항온 배양기에서 24시간 동안 배양시킨 후, 도 10a 내지 도 11b에 도시된 바와 같이, 세포가 가득 찬 플레이트의 가운데 부분을 10μl의 피펫 팁(pipet tip)으로 선(점선으로 표시됨)을 그어 빈 공간을 만들어준 후, 다시 24시간 동안 배양시키는 Wound healing assay를 수행하여 세포의 이동성을 확인한다.In order to monitor the mobility of the fused cells, the fused cells were cultured in a 12-well plate in an amount of 1.5 × 10 5 in a constant temperature incubator at 37 ° C., 5% CO 2 for 24 hours, , The center of the plate filled with cells was lined with a pipette tip (indicated by a dotted line) in a 10 μl volume, and then a Wound healing assay was performed in which the cells were cultured again for 24 hours To confirm cell mobility.

다시 도3에서 융합 세포의 융합 효율을 모니터링하기 위하여, 단계 S240에서 세포 융합에 이용하는 배양 배지를 단계 S210과 동일한 조건으로 조성한 후, 세포를 일정 기간 예컨대, 2일 동안 배양하고, 암세포와 대식세포 각각에 서로 다른 형광색의 나노 입자를 주입하여 형광 염색을 처리한다. 이 실시 (예)에서는 암세포로 쥐의 간에서 유래한 Hepa-1c1c7 세포주를 사용하고, 대식세포로 Raw264.7 세포 주를 사용한다. 각 세포는 1% 페니실린/스트렙토마이신과 10% 우태혈청을 함유하고 있는 MEM, DMEM 배지에서 배양시킨다. 이때, 이후 세포 융합을 확인하기 위하여 형광염색을 함께 진행한다. 암세포인 Hepa-1c1c7는 FITC 나노 입자를, Raw264.7은 RITC 나노 입자를 각각 배양 배지에 넣어준 후, 100 mm 조직 배양 플레이트에 1 X 106개의 양으로 37℃, 5% CO2의 항온 배양기에서 하루 동안 배양시킨다.3, in step S240, the culture medium used for cell fusion is cultured under the same conditions as in step S210. Then, the cells are cultured for a predetermined period of time, for example, for 2 days, and then the cancer cells and macrophages To treat the fluorescent dye by injecting different fluorescent nanoparticles. In this embodiment (Example), hepatocyte-derived Hepa-1c1c7 cell line is used as a cancer cell and Raw264.7 cell line is used as a macrophage. Each cell is cultured in DMEM medium containing 1% penicillin / streptomycin and 10% fetal calf serum. At this time, fluorescence staining is performed in order to confirm cell fusion. Hepa-1c1c7, a cancer cell, and Raw264.7, a RITC nanoparticle, were each inoculated into a 100-mm tissue culture plate in an amount of 1 × 10 6 in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator Lt; / RTI > for one day.

이 실시 (예)에서는 FITC로 형광 표지한 암세포와 RITC로 형광 표지한 대식세포를 하나의 플레이트에 배양시킨다. 이 때, 배양 배지는 저산소 상태를 만들어주기 위해 염화코발트(CoCl2)를 처리한다. 이 상태로 단계 S250에서 배지의 교환 없이 37 ℃, 5% CO2의 항온 배양기에서 2일 동안 세포 융합을 진행한다.In this embodiment (example), cancer cells fluorescently labeled with FITC and macrophages labeled with RITC are cultured on one plate. At this time, the culture medium is treated with cobalt chloride (CoCl 2 ) to produce a hypoxic state. In this state, cell fusion is carried out in a constant temperature incubator at 37 ° C and 5% CO 2 for 2 days without exchanging the medium in step S250.

단계 S260에서 융합 세포의 융합 효율을 확인한다. 이 실시 (예)에서는 2일 동안 동일한 배양 배지에서 세포 융합이 진행된 세포들을 Trypsin-EDTA를 이용하여 플레이트 바닥에서 떼어낸 후, 6-웰 플레이트(6-well plates)에 3 X 105의 양으로 37℃, 5% CO2의 항온 배양기에서 24시간 동안 배양시킨 후 세포 융합을 확인한다. 이 때, 형광 현미경을 통해 확인해본 결과, 융합이 되지 않은 암세포는 도 5a 및 도 5b, 도 5c에 도시된 바와 같이, 초록색으로 나타나고, 대식세포는 빨간색으로, 그리고 융합에 성공한 세포는 두 형광 물질이 합쳐져 주황색으로 나타난다.In step S260, the fusion efficiency of the fusion cell is confirmed. In this example, cells that had undergone cell fusion in the same culture medium for 2 days were removed from the bottom of the plate using Trypsin-EDTA, and the cells were seeded in 6-well plates in an amount of 3 × 10 5 After incubation in a constant temperature incubator at 37 ° C, 5% CO 2 for 24 hours, cell fusion is confirmed. At this time, as a result of checking with a fluorescence microscope, unfused cancer cells appeared green as shown in Figs. 5A, 5B and 5C, macrophages turned red, and cells successfully fused with two fluorescent substances Are combined and appear orange.

즉, 도 5a를 참조하면, 이 실시 (예)에서 쥐의 간암세포는 Hepa1c1c7 세포 주를 사용하고, 대식세포는 RAW264.7 세포 주를 사용한다. 이 때, 간암세포와 대식세포를 함께 배양하기 위해 아무런 처리도 하지 않는다. 또 세포 융합을 확인하기 위하여 간암세포와 대식세포 각각에 서로 다른 색상의 형광을 갖는 나노 입자 즉, 간암세포에는 FITC 나노 입자를, 대식세포에는 RITC 나노 입자를 주입하여 염색을 진행한다. 그 결과, 간암세포는 초록색으로 나타나고, 대식세포는 빨간색으로 나타난다.That is, referring to FIG. 5A, in this embodiment (Example), hepatocarcinoma cells of the mouse use Hepa1c1c7 cell line and macrophages use RAW264.7 cell line. At this time, no treatment is performed to cultivate liver cancer cells and macrophages together. In order to confirm the cell fusion, nanoparticles having different colors of fluorescence in liver cancer cells and macrophages, that is, FITC nanoparticles are implanted into liver cancer cells and RITC nanoparticles are injected into macrophages. As a result, liver cancer cells appear green, and macrophages appear red.

도 5b를 참조하면, 이 실시 (예)에서 배양 배지를 암세포의 생장 환경의 특징 중 하나인 저산소 환경으로 조성하기 위하여 저산소 챔버(2% O2, 5% CO2, and 93% N2)를 사용한다. 또한 도 5c를 참조하면, 염화코발트(CoCl2)를 처리하여 저산소 환경을 조성한다. 이러한 환경 조건에서 간암세포와 대식세포를 일정 기간 동안 배양한 결과, 융합에 성공한 세포는 두 형광 물질이 합쳐져서 주황색으로 나타난다.5B, a hypoxic chamber (2% O 2 , 5% CO 2 , and 93% N 2 ) was added to the culture medium to form a hypoxic environment, which is one of the characteristics of the growth environment of the cancer cells, use. Referring also to FIG. 5C, cobalt chloride (CoCl 2 ) is treated to create a hypoxic environment. Under these environmental conditions, liver cancer cells and macrophages were incubated for a certain period of time.

도 5d는 도 5a 내지 5c의 결과를 정량적으로 나타낸 그래프이다. 융합되지 않은 암세포를 포함한 전체 암세포 수(녹색, 주황색 형광)에 대비하여 융합이 성공하여 주황색으로 보이는 세포들의 수의 비율을 보여준다.FIG. 5D is a graph quantitatively showing the results of FIGS. 5A to 5C. FIG. It shows the ratio of the number of cells that appear to be orange to be fused successfully against the total number of cancer cells (green, orange fluorescence) including unfused cancer cells.

도 6은 도 3의 실시 (예)에 따른 세포 융합 방법을 다양한 세포에 적용하여 인간 폐암세포(A-549)및 쥐 폐암세포(LA-4), 쥐 신장세포(RAG)와 대식세포를 융합한 전이성 하이브리드 세포의 형광 사진이다.FIG. 6 is a graph showing the results obtained by applying the cell fusion method according to the embodiment shown in FIG. 3 to various cells to determine whether fusion of human lung cancer cells (A-549), rat lung cancer cells (LA-4), rat kidney cells (RAG) It is a fluorescence photograph of one metastatic hybrid cell.

도 13을 참조하면, 도 5 내지 6의 실시 (예)에서 볼 수 있는 다양한 세포에서의 융합 효율을 정량적으로 측정하였다. 실험에 사용된 세포는 간암(Hepa-1c1c7), 폐암(LA4, A549), 신장암(RAG)의 세포주이다. 각각의 세포를 도 5와 동일한 조건으로 대식세포와 융합한 후, 융합되지 않은 암세포를 포함한 전체 암세포(녹색, 주황색) 대비, 융합에 성공한 암세포(주황색)의 비율을 보여준다. Referring to FIG. 13, fusion efficiencies in various cells, as seen in the examples of FIGS. 5 to 6, were quantitatively measured. Cells used in the experiments are hepatoma (Hepa-1c1c7), lung cancer (LA4, A549), kidney cancer (RAG). Each of the cells was fused with macrophages under the same conditions as in FIG. 5, and the ratio of cancer cells (orange) successfully fused to the total cancer cells (green, orange) containing unfused cancer cells.

계속해서 도 8a 내지 도 8c는 도 3의 실시 (예)에 따른 세포 융합 방법을 사용하여 만들어진 암세포, 대식세포 및 하이브리드 세포 각각을 Epithelial 단백질 표지자인 EpCam을 형광염색(red)을 통해 보여주는 사진들이고, 도 9a 내지 도 9c는 도 3의 실시 (예)에 따른 세포 융합 방법을 사용하여 만들어진 암세포, 대식세포 및 하이브리드 세포 각각을 Mesenchymal 단백질 표지자인 Fibronectin을 형광염색(red)을 통해 보여주는 사진들이다.8A to 8C are photographs showing each of cancer cells, macrophages and hybrid cells prepared using the cell fusion method according to the embodiment (Example) of FIG. 3 through fluorescent dye (red) as an epithelial protein marker, FIGS. 9A to 9C are photographs showing each of cancer cells, macrophages and hybrid cells prepared using the cell fusion method according to the embodiment (example of FIG. 3) through fluorescence staining (red) of the Mesenchymal protein marker, Fibronectin.

도 8a 내지 도 9c를 참조하면, 이 사진들은 본 발명의 융합 방법에 의해 제조된 하이브리드 세포의 Fibronectin과 EpCam을 형광염색(red)을 통해 보여줌으로써 융합 세포의 전이성을 보여준다.Referring to FIGS. 8A to 9C, these photographs show the metastasis of fused cells by showing the hybrid cells Fibronectin and EpCam produced by the fusion method of the present invention through fluorescent staining (red).

전이성을 갖는 세포는 epithelial 성질은 약하고 mesenchymal 성질이 강하다. 따라서 전이성을 가진 융합세포는 Epithelial 단백질 표지자인 EpCam은 발현이 적고 Mecenchymal 단백질 표지자인 Fibronectin의 발현양은 많다.Metastatic cells have weak epithelial properties and strong mesenchymal properties. Therefore, in the fusion cell with metastasis, EpCam, which is an epithelial protein marker, is less expressed and the expression amount of Fibronectin, which is a marker of Mecenchymal protein, is high.

도 10a 및 도 10b는 도 8a 및 도 9a에 나타나는 암세포(Hepa1c1c7)의 이동을 보여주는 광학 사진들이고, 도 11a 및 도 11b는 도 8c 및 도 9c에 나타나는 하이브리드 세포의 이동성을 보여주는 광학 사진들이며, 그리고 도 12는 도 10a 내지 도 11b에 나타나는 세포의 이동 정도를 그래프로 정량한 도면이다.Figs. 10A and 10B are optical photographs showing the movement of the cancer cells (Hepa1c1c7) shown in Figs. 8A and 9A, Figs. 11A and 11B are optical photographs showing the mobility of the hybrid cells shown in Figs. 8C and 9C, 12 is a graph graphically showing the degree of cell migration shown in Figs. 10A to 11B.

도 10a 내지 도 11b를 참조하면, 이 사진들은 암세포, 대식세포 및 하이브리드 세포들 각각의 이동성을 비교하기 위한 것으로, 도 3의 단계 S230에서와 같이, 암세포, 대식세포 및 하이브리드 세포들 각각이 가득 찬 플레이트의 가운데 부분을 10μl의 피펫 팁(pipet tip)으로 선(점선으로 표시됨)을 그어 빈 공간을 만들어준 후, 다시 24시간 동안 배양시키는 Wound healing assay를 수행하여 세포의 이동성을 확인한다.Referring to FIGS. 10A and 11B, these photographs are for comparing the mobility of cancer cells, macrophages, and hybrid cells, respectively. As shown in step S230 of FIG. 3, each of cancer cells, macrophages and hybrid cells is full Plate the middle portion of the plate with a pipette tip (indicated by a dotted line) with a 10 μl pipette tip to make a void, and then conduct a Wound Healing Assay for 24 hours.

그 결과, 도 12에 도시된 바와 같이, 본 발명의 하이브리드 세포는 암세포와 비교했을 때, 플레이트의 빈 공간으로 더 많이 이동한 것을 확인할 수 있다.As a result, as shown in FIG. 12, it can be seen that the hybrid cells of the present invention migrate more to the empty space of the plate as compared with cancer cells.

이상에서, 본 발명에 따른 저산소 환경을 이용한 전이암 하이브리드 세포의 제조방법에 대한 구성 및 작용을 상세한 설명과 도면에 따라 도시하였지만, 이는 실시 (예)를 들어 설명한 것에 불과하며, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변화 및 변경이 가능하다.Although the construction and operation of the method for producing the transitional cancer hybrid cell using the hypoxic environment according to the present invention have been described in detail and with reference to the drawings, the present invention has been described by way of examples only, Various changes and modifications can be made without departing from the scope of the present invention.

따라서, 본 발명의 사상은 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 아니 되며, 후술하는 특허청구범위뿐 아니라 이 특허청구범위와 균등하거나 등가적변형이 있는 모든 것들은 본 발명 사상의 범주에 속한다고 할 것이다.Accordingly, the spirit of the present invention should not be construed as being limited to the embodiments described, and all of the equivalents or equivalents of the claims, as well as the following claims, belong to the scope of the present invention .

Claims (3)

암세포와 대식세포를 융합하여 전이성을 갖는 전이암 하이브리드 세포의 제조 방법에 있어서:
상기 암세포와 상기 대식세포가 융합되는 배양 배지를 상기 암세포의 생체 내 미세 환경의 특징 중 하나인 저산소 환경으로 조성하여 상기 암세포와 상기 대식세포를 융합하되;
상기 저산소 환경은,
상기 배양 배지에 염화코발트(CoCl2)를 처리하는 것을 특징으로 하는 저산소 환경을 이용한 전이암 하이브리드 세포의 제조방법.A method for producing a transgene hybrid cell having metastasis by fusing cancer cells and macrophages, comprising:
Forming a culture medium in which the cancer cells and the macrophages are fused into a hypoxic environment that is one of the characteristics of the microenvironment of the cancer cells, thereby fusing the cancer cells and the macrophages;
In the hypoxic environment,
Wherein the culture medium is treated with cobalt chloride (CoCl 2 ). 제 1항에 있어서,
대식세포는 동물종의 혈관에서 추출한 단구세포를 분화시킨 세포이거나 동물종 유래의 대식세포 세포주인 것을 특징으로 하는 세포이고;
암세포는 위암 (Gastric cancer), 간암 (Liver cancer), 폐암 (Lung cancer), 유방암 (Breast cancer), 난소암 (Ovarian cancer), 기관지암 (bronchial cancer), 구강암 (Oral cavity cancer), 후두암 (Larynx cancer), 췌장암 (Pancreatic cancer), 대장암 (Colorectal cancer), 방광암 (Bladder cancer), 결장암 (Colon cancer), 자궁경부암 (Uterine cervical cancer), 전립선암 (Prostate cancer), 신장암 (Kidney cancer), 피부암 (Skin cancer), 갑상선암 (Thyroid cancer), 뇌암 (Brain cancer) 세포로 이루어지는 군에서 선택된 암세포이거나 이들 세포에서 유래된 세포주인 것을 특징으로 하는 저산소 환경을 이용한 전이암 하이브리드 세포의 제조방법.The method according to claim 1,
Wherein the macrophage is a cell differentiated into monocytes extracted from blood vessels of an animal species or a macrophage cell line derived from an animal species;
Cancer cells can be classified into gastric cancer, liver cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, bronchial cancer, oral cavity cancer, larynx cancer, cancer, prostate cancer, pancreatic cancer, colorectal cancer, bladder cancer, colon cancer, uterine cervical cancer, prostate cancer, kidney cancer, Wherein the cancer cell is a cancer cell selected from the group consisting of skin cancer, thyroid cancer and brain cancer cells or a cell line derived therefrom. 제 1항에 있어서, 상기 염화코발트(CoCl2)를 처리하는 것은,
Hepa1c1c7 세포의 생존율을 80 % 이상의 조건으로 하는 경우, 염화코발트(CoCl2)의 125 μM 이하의 농도로 처리되는 것을 특징으로 하는 저산소 환경을 이용한 전이암 하이브리드 세포의 제조방법.

The method of claim 1, wherein treating the cobalt chloride (CoCl 2 )
Wherein the cells are treated at a concentration of 125 μM or less of cobalt chloride (CoCl 2 ) when the survival rate of the Hepa1c1c7 cells is 80% or more.

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