KR20180133576A - 내동성 소독제 조성물 및 이를 이용한 질병의 예방 및 전파 방지 방법 - Google Patents

내동성 소독제 조성물 및 이를 이용한 질병의 예방 및 전파 방지 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 내동성 소독제 조성물 및 이를 이용한 질병의 예방 및 전파 방지 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 이염화이소시아닐산나트륨 (Sodium dichloroisocyanurate)을 유효성분으로 포함하는 내동성 소독제 조성물 및 이를 이용한 세균 또는 바이러스의 소독 방법에 관한 것이다. 본 발명의 내동성 소독제 조성물은 수송 및 관리가 편하고, 경제적이고 친환경적이며, 조성물의 빙점을 -10 내지 -20℃로 저감시킴으로써, 동절기 영하의 온도에서도 얼지 않아 소독제를 동절기 야외에서도 사용할 수 있는 효과가 있다.

Description

내동성 소독제 조성물 및 이를 이용한 질병의 예방 및 전파 방지 방법 {Anti-freezing disinfectant composite and method for preventing disease and spread using the same}
본 발명은 내동성 소독제 조성물 및 이를 이용하여 세균 및 바이러스를 사멸시켜 질병을 예방하거나 전파를 방지하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 이염화이소시아닐산나트륨 (Sodium dichloroisocyanurate)를 포함하는 내동성 소독제 및 이를 유효농도로 사용하는 방법에 관한 것이다.
최근 축산업 분야에서 문제되고 있는 병원체는 조류인플루엔자 바이러스, 구제역 바이러스, 돼지콜레라 바이러스, 살모넬라균, 연쇄상구균 등이다. 특히, 주로 닭과 칠면조 등 가금류에 많은 해를 입히는 조류인플루엔자 바이러스는, 병원성 (病原性)에 따라 고 (高) 병원성ㆍ약 (弱) 병원성ㆍ비 (非) 병원성 3종류로 구분되며, 이 가운데 고병원성은 국제수역사무국 (OIE)에서 리스트 A등급으로, 한국에서는 제1종 가축전염병으로 분류하고 있다. 감염은 조류의 분비물을 직접 접촉할 때 주로 일어나며, 비말 (飛沫)ㆍ물, 사람의 발, 사료차, 기구, 장비, 알 겉면에 묻은 분변 등에 의해서도 전파된다. 조류독감이 발생하면 전세계 대부분의 국가에서는 전량 도살 처분하며, 발생국가에서는 양계산물을 수출할 수 없게 된다. 따라서 조류인플루엔자 바이러스는 축산업의 발전을 해하는 주역이라고 할 수 있다. 또한, 구제역은 가축이 구제역 바이러스에 감염되었을 때 발생하게 되는 것으로, 2000년 우리나라, 일본에서도 발생한 바 있고, 2001년부터 영국 등 세계적으로 발생되고 있다. 상기 구제역으로 인해 동물의 생산성 저하로 인한 경제적 피해 때문에 구제역을 국제무역상 규제대상 질병으로 꼽고 있으며, 국제수역사무국 (OIE)에서 A급으로 분류한 15종의 질병 중에서도 첫째가는 악성전염병으로서 일단 구제역이 발생하면차단 방역 이외에는 현재로서는 특별한 방법이 없는 실정이다. 축산업의 발전을 위해서는, 상기 나열한 병원체 외에도 각종 질병의 원인균이 되는 병원균 및 바이러스의 사멸을 위한 높은 살균력과 축사 소독뿐 아니라 축체, 음수 소독 등을 자유로이 할 수 있는 안전한 광범위 소독제의 개발이 필요하다.
가정이나 산업현장에서 각종 물품이나 공기를 살균하거나, 각종 질병의 원인균이 되는 병원균 및 바이러스의 사멸을 위해 소독제가 사용되고 있다. 이러한 소독제에 사용되는 성분들은 주로 염소계 화합물들로, 염소계 화합물의 경우 우수한 소독력을 가지고 있어 가정용 및 산업용으로 다양하게 사용되고 있다. 염소계 살균 소독제는 흔히 락스라고 알려진 차아염소산나트륨 (NaOCl)이나, 이산화염소 (ClO2), 염소 가스 (Cl2), 차아염소산 (HOCl), 차아염소산 이온 (OCl-) 등의 형태로 살균에 이용되고 있다.
한편, 동절기에 발생하는 인수 공통의 고 병원성 전염병의 방역을 실외에서 실시할 경우 소독제의 결빙으로 인하여 방역에 막대한 차질을 가져왔다. 또한, 2010년 1월과 11월부터 2011년 1월 현재까지 혹한기에 경기도 포천, 연천, 파주 및 경북 안동, 영주를 시작으로 강원 평창과 충청 천안에 이르기까지 전국적으로 발생한 구제역과 같은 경우 차단 방역을 실시할 경우에서도 소독제의 결빙으로 소독제의 분무 방역의 어려움이 나타나고 있다. 즉, 종래의 일반 소독제를 사용할 경우에는 빙점이 높아 평균 -5 ℃ 내외에서는 소독제의 결빙으로 인해 방역을 실시할 수 없게 되므로 부득이 생석회 (과립형, 분말형)로 대체 사용하고 있으며, 또한 낮은 기온에서 소독제를 분무할 경우 방역 효과가 현저히 감소하는 현상이 발생하는 문제점이 있다.
따라서, 염화이소시아닐산나트륨 (NaDCC), 탄산나트륨 (Na2CO3), 이산화염소 (ClO2), 아디핀산 (Adipic acid) 등 고도의 소독력과 생분해성이 확인된 성분을 조합, 최적의 제조방법 확립 및 공정화하여 원거리 수송이 용이하며 저온에서 소독효과를 가지는 소독제 개발이 필요하다. 특히 기타 소독제의 경우 불안정하여 폭발의 위험 등이 존재할 수 있으나 염화이소시아닐산나트륨의 경우 안전하게 농가에서 사용할 수 있다. 각종 급성 바이러스성 가축 전염병이 겨울철 낮은 외기온도에 더 활발히 전파되므로, 항결빙능 염화이소시아닐산나트륨 소독제 개발 시 낮은 외기온도의 겨울을 장기간 갖는 국가에 많은 수요가 있을 것으로 판단된다. 혹한기에도 발생할 수 있는 구제역 및 고병원성 전염병의 예비 방역 및 차단 방역 시 소독제의 결빙으로 인한 방역 장애의 해소가 시급하다.
본 발명의 목적은 이염화이소시아닐산나트륨을 유효성분으로 포함하는, 내동성 소독제 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 내동성 소독제 조성물을 이용하여 세균 또는 바이러스를 소독하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에서는 이염화이소시아닐산나트륨을 유효성분으로 포함하는, 내동성 소독제 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명에서는 내동성 소독제 조성물을 이용하여 세균 또는 바이러스를 소독하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 이염화이소시아닐산나트륨 (Sodium dichloroisocyanurate)를 유효성분으로 포함하는 부동제 조성물은 수송 및 관리가 편하고, 경제적이고 친환경적이며, 에톡시계 부동화합물을 포함하여 염소계 화합물의 빙점을 -10 내지 -20℃로 저감시킴으로써 동절기 영하의 온도에서도 얼지 않아 염소계 소독제를 동절기에 야외에서 사용할 수 있는 효과가 있다.
본 발명은 이염화이소시아닐산나트륨을 유효성분으로 포함하는, 내동성 소독제 조성물에 관한 것이다. 이염화이소시아닐산나트륨 (NaDCC)은 차아염소산 보다 약 100배의 효력을 나타내는 성분으로, 100% 생분해되어 잔류되지 않아 환경에 악영향을 끼치지 않으며 발포성 산제로서 탄산나트륨과의 상승작용으로 더 한층 소독효과를 증진시킨다고 알려져 있다.
상기 이염화이소시아닐산나트륨은 조성물 총 100중량부에 대하여 0.1 내지 37.5 중량부로 포함된 것일 수 있다. 유기물에서 0.1미만일 경우 소독 효과가 없을 수 있으며, 37.5를 초과할 경우 경제성이 떨어 질 수 있다.
상기 내동성 소독제 조성물은 소듐에톡사이드, 아디핀산, 탄산수소나트륨 및 탄산나트륨으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상을 더 포함하는 것일 수 있다.
소듐에톡사이드는 고체 상태의 염으로 존재하여 수송 및 관리가 편리하며, 내동 효과가 우수하여 겨울철 동결 방지를 위한 내동제 물질로 사용될 수 있다. 또한, 비용이 저렴하면서도 염화칼슘과 달리, 환경을 훼손하는 염소이온을 배출하지 않아 친환경적으로 유리하다. 아디핀산, 탄산수소나트륨 및 탄산나트륨은 고도의 소독력을 가진다.
상기 내동성 소독제 조성물은 빙점이 -10 내지 -20℃인 것일 수 있다. 바람직하게는 -13 내지 -17℃인 것일 수 있다. 이에 따라 혹한기 외기가 -15℃에 달하는 경우에도 내동성 소독제 조성물을 이용하여 소독할 수 있다.
상기 내동성 소독제 조성물은 세균 또는 바이러스 소독에 사용되는 것일 수 있다.
상기 세균은 살모넬라균 및 아포형성혐기성세균으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
상기 바이러스는 조류 인플루엔자, 뉴캐슬 바이러스, 돼지 유행성 설사 바이러스, 돼지 생식기호흡기증후군 바이러스 및 구제역 바이러스로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
또한, 본 발명은 내동성 소독제 조성물을 이용하여 세균 또는 바이러스를 소독하는 방법에 관한 것이다.
상기 세균은 살모넬라균 및 아포형성혐기성세균으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
상기 바이러스는 조류 인플루엔자, 뉴캐슬 바이러스, 돼지 유행성 설사 바이러스, 돼지 생식기호흡기증후군 바이러스 및 구제역 바이러스로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
상기 소독은 -20 내지 4℃에서 이루어지는 것일 수 있다.
실시예
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
재료
내동성 소독제 재료
이염화이소시아닐산나트륨 (Sodium dichloroisocyanurate, sigma, 96%), 아디핀산 (Adipic acid, sigma, 99%), 탄산수소나트륨 (Sodium bicarbonate, sigma 99.5~100.5%), 탄산나트륨 (Sodium carbonate, Wako, 99.8%), 에톡시계 부동화합물 (sodium ethoxide 대정화금, 96%)
세균 및 바이러스
살모넬라균 (Salmonella typhimurium), 아포형성 혐기성 세균 (Clostridium perfringens), 조류 인플루엔자 (Avian influenza virus H9N2), 뉴캐슬 바이러스 (Newcastle diAaA virus LsSota), 돼지 유행성설사 바이러스 (Porcine Epidemic Diarrhea virus PEDV 11.29), 돼지 생식기호흡기증후군 바이러스 (Porcine reproductive and respiratory syndrome LMY strain)
시험계
조류 인플루엔자 바이러스를 병원체로 사용하는 경우에는 조류인플루엔자 바이러스 부재 발육란을 시험계로 사용하였다. 뉴캐슬 바이러스를 병원체로 사용하는 경우에는 뉴캐슬 바이러스 부재 발육란을 시험계로 사용하였다. 돼지 유행성설사 바이러스를 병원체로 사용하는 경우에는 베로 세포 (Vero cell, KCLB 10081)를 시험계로 사용하였다. 돼지 생식기호흡기증후군 바이러스를 병원체로 사용하는 경우에는 MARC-145 세포를 시험계로 사용하였다.
배양배지 및 배양조건
살모넬라균은 영양배지 (nutrient broth), 37℃에서 배양하였다.
아포형성 혐기성 세균은 타이오글라이콜산염 액체 배지 (NIH thioglycollate broth)에서 37℃, 혐기성 조건으로 배양하였다.
돼지 유행성설사 바이러스의 경우 37℃, 5% 이산화탄소 하에서 세포는 α-최소필수배지 (α-MEM), 항생-항진균 (antibiotic-antimycotic) 및 5% 비동화 소태아 혈청 (Heat inactivated FBS)을 포함하는 배지에서 배양하고, 바이러스 접종은 α-최소필수배지 (α-MEM), 항생-항진균, 3% 트립토스 인산염 배지 (tryptose phosphate broth), 0.02% 효모 추출물 (Yeast extract) 및 2μg 트립신/ml (1:250)을 포함하는 배지에서 하였다.
돼지 생식기호흡기 증후군 바이러스는 37℃, 5% 이산화탄소 하에서 둘베코 최소배지 (DMEM), 항생-항진균, 10% 소태아 혈청 (FBS) 및 5% 비필수적 아미노산 용액 최소배지 (MEM NEAA)를 포함하는 배지에서 배양하였다.
희석액
다음과 같은 희석액을 준비하여 사용하였다.
경수는 증류수 1리터에 염화칼슘 (CaCl2) 0.305g 및 염화마그네슘 (MgCl2·6H2O) 0.139g (w/v)를 첨가하여 준비하였다.
세균에 대한 유기물 희석액으로는 20% (w/v) 효모 추출액 (Yeast extract)을 경수로 만들어 고압 멸균하고, 사용시 경수로 희석하여 5% 희석액을 제조한 뒤, 1N 수산화나트륨으로 pH 7.0으로 맞추어 사용하였다.
바이러스에 대한 유기물 희석액으로는 5% (w/v) 소태아 혈청 (FBS)을 사용하였다.
균 희석액
표준시험법을 사용하는 경우, 바이러스 희석액으로는 X1 인산 완충 생리 식염수(Phosphate-buffered saline)를 증류수에 녹인 후 고압멸균기를 이용하여 121℃에서 15분간 멸균하여 준비하였다.
중화배지
표준시험법을 사용하는 경우, 살모넬라균에 대해서는 비동화 말혈청 5%가 함유된 영양 배지 (Nutrient broth)를 사용하였다. 아포형성 혐기성 세균에 대해서는 비동화 말혈청 5%가 함유된 영양배지 (NIH thioglycollate broth)를 사용하였다. 조류 인플루엔자 및 뉴캐슬 바이러스에 대해서는 비동화 소태아 혈청 10%가 함유된 인산 완충 생리 식염수를 사용하였다. 돼지 유행성설사 바이러스에 대해서는 비동화 소태아 혈청 10%가 함유된 α-최소필수배지(α-MEM, 항생-항진균제 포함)를, 돼지 생식기호흡기 증후군 바이러스에 대해서는 비동화 소태아 혈청 10%가 함유된 둘베코 최소배지 (DMEM, 항생-항진균제 포함)를 사용하였다.
제조예 1. 세균 배양
계대 중의 세균을 배지에 심어 22~26시간 동안 배양한 세균을 사용하였다. 사용 직전까지 37℃를 유지시켰으며, 사용세균의 농도는 ml당 108CFU (집락 형성 단위, Colony forming unit) 이상으로 하였다.
제조예 2. 경수 조건용 소독제 희석
제조예 2-1.
경수 조건에 사용할 소독제는 경수로 50배 희석하고, 4℃로 보관하였다가 사용하였다.
제조예 2-2 내지 2-9 는 상기 제조예　2-1에서 각각 100, 150, 200, 250, 500, 1000, 2000 및 3000배 희석하여 준비한 것이다.
제조예 3. 유기물 조건용 소독제 희석
제조예 3-1.
유기물 조건에 사용할 소독제는 상기 재료의 유기물로 20배 희석하고, 4℃로 보관하였다가 사용하였다.
제조예 3-2 내지 3-10 은 상기 제조예　3-1에서 각각 30, 50, 60, 70, 80, 100, 150, 200, 250배 희석하여 준비한 것이다.
제조예 4. 돼지 유행성 설사 바이러스액 제조
베로 세포 (vero cell)을 2×105cell/ml이 되도록 하여 96 웰 플레이트 (well plate)에 200μl씩 분주하여 37℃, 5% 이산화탄소하에 배양기에서 배양하였다.
T25 플라스크에 베로 세포를 배양하고, 모노레이어가 형성되면 돼지 유행성 설사 바이러스 (105~107TCID50/ml)를 접종하여, 37℃, 5% 이산화탄소하에 배양기에서 90분 동안 배양하였다. 이때 15분마다 골고루 분포하도록 조심스럽게 흔들어주었다. 바이러스 접종 후 접종액을 제거하였고, 바이러스 접종배지를 첨가하여 세포변성효과 (Cytopathogenic effect, CPE)가 발생할 때까지 배양하였다. 세포변성 후 동결, 해동 과정을 3회 반복하고 70℃에 보관하였다. 이후 사용직전까지 단시간 동안 얼음물에 보관하였다.
제조예 5. 돼지 생식기호흡기증후군 바이러스액 제조
MARC-145 세포를 2×105cell/ml이 되도록 하여 96 웰 플레이트 (well plate)에 200μl씩 분주하여 37℃, 5% 이산화탄소하에 배양기에서 배양하였다.
T25 플라스크에 MARC-145 세포를 배양하고, 모노레이어가 형성되면 돼지 생식기호흡기증후군 바이러스 (105~107TCID50/ml)를 접종하여, 37℃, 5% 이산화탄소하에 배양기에서 90분 동안 배양하였다. 이때 15분마다 골고루 분포하도록 조심스럽게 흔들어주었다. 바이러스 접종 후 접종액을 제거하였고, 바이러스 접종배지를 첨가하여 세포변성효과 (Cytopathogenic effect, CPE)가 발생할 때까지 배양하였다. 세포변성 후 동결, 해동 과정을 3회 반복하고 70℃에 보관하였다. 이후 사용직전까지 단시간 동안 얼음물에 보관하였다.
제조예 6. 구제역 바이러스액 제조 및 소독제 희석
양 신장 세포를 L-글루타민, 탄산수소나트륨, 비필수 아미노산, 피루브산나트륨, 소태아혈청 및 항생제가 첨가된 이글 최소 필수 배지 (EMEM)에서 3×105cell/ml이 되도록 하여 6 웰플레이트에 분주하여 37℃, 5% 이산화탄소하에 배양기에서 배양하였다.
계대 배양하여 바이러스 역가가 107. 0TCID50/ml 이상이 확인된 구제역 바이러스 (O1BFS)를 사용직전까지 단시간 동안 4℃에 보관하였다.
유기물 조건용 소독제 희석은 증류수 1 L에 염화칼슘 0.304g, 염화마그네슘 0.139g(w/v) 및 소태아 혈청 1%를 포함시켜 사용하였다.
실시예 1. 내동성 소독제 조성물
이염화이소시아닐산나트륨 (Sodium dichloroisocyanurate) 375g, 아디핀산 (Adipic acid) 168.75g, 탄산수소나트륨 (Sodium bicarbonate) 62.5g, 탄산나트륨 (Sodium carbonate) 18.75g 및 소듐에톡사이드 (Sodium ethoxide) 375g을 혼합하여 고체상의 내동성 소독제 조성물을 준비하였다. 이후 제조예 2 또는 3의 방법으로 혼합, 희석하여 사용하였다.
실험예 1. 표준 시험법 (액상 시험법)
실험예 1-1. 살모넬라균에 대한 소독제 효력시험 (4℃ 조건)
상기 제조예 1에 따라 준비한 살모넬라균 4ml씩을 온도가 4℃인 상기 준비한 경수 96ml 및 세균에 대한 유기물 희석액 96ml에 각각 혼합하였다. 혼합한 균 희석액들에서 2.5ml를 온도가 4℃인 상기 제조예 2 및 3에 따라 제조한 소독제 희석액 2.5ml와 혼합하였다. 4℃에서 5분 또는 30분간 반응시켰으며, 30분 반응시키는 경우에는 10분마다 교반해주었다. 상기 혼합물의 반응이 끝난 즉시 1ml를 꺼내어 37℃의 상기 중화배지 9ml에 넣고 혼합하였다. 중화액을 각 소독제 희석 단계별로 0.1ml씩 5개의 영양배지 시험관에 접종하였다. 37℃ 배양기에서 48시간 배양하였다. 세균이 증식하였는지 판정하기 위하여 육안으로 확인하였다. 3회 반복 실험하고 아래 비교예 1과 대조하여 5개의 동일 소독제 희석배수의 영양배지에서 4개 이상 증식이 되지 않는 최종 소독희석 단계를 유효 희석배수로 판정하였다.
실험예 1-2. 살모넬라균에 대한 소독제 효력시험 (-20℃ 조건)
상기 실험예 1-1과 동일한 방법, 동일한 양으로 4℃에서 세균, 경수 및 세균에 대한 유기물 희석액 각각에 혼합하였다. 이후, 혼합물을 2.5ml씩 튜브에 분주하여 -20℃에서 얼렸다. 얼린 균 희석액들에 상기 제조예 2 및 3에서 제조한 소독제 희석액 2.5ml를 넣고 혼합하였다. -20℃에서 5분 또는 30분간 반응시켰다. 상기 혼합물의 반응이 끝난 즉시 37℃의 상기 중화배지 45ml를 소독제 반응 시험관 (5ml)에 넣고 녹였다. 중화액을 각 소독제 희석 단계별로 0.1ml씩 5개의 영양배지 시험관에 접종하였다. 37℃ 배양기에서 48시간 배양하였다. 세균이 증식하였는지 판정하기 위하여 육안으로 확인하였다. 3회 반복 실험하고 비교예 1과 대조하여 5개의 동일 소독제 희석배수의 영양배지에서 4개 이상 증식이 되지 않는 최종 소독희석 단계를 유효 희석배수로 판정하였다.
실험예 1-3. 아포형성 혐기성 세균에 대한 소독제 효력시험 (4℃ 조건)
상기 제조예 1에 따라 준비한 아포형성 혐기성 세균을 사용한 것 외에는 상기 실험예 1-1과 동일한 방법, 동일한 양으로 세균과 소독제 희석액의 혼합물을 준비하였다. 상기 혼합물의 반응이 끝난 즉시 1ml를 꺼내어 37℃의 상기 중화배지 9ml에 넣고 혼합하였다. 중화액을 상기 실험예 1-1과 같은 방법으로 처리, 배양하고 육안으로 확인하였다. 3회 반복 실험하고 비교예 2와 대조하여 5개의 동일 소독제 희석배수의 영양배지에서 4개 이상 증식이 되지 않는 최종 소독희석 단계를 유효 희석배수로 판정하였다.
실험예 1-4. 아포형성 혐기성 세균에 대한 소독제 효력시험 (-20℃ 조건)
상기 제조예 1에 따라 준비한 아포형성 혐기성 세균을 사용한 것 외에는 상기 실험예 1-2와 동일한 방법, 동일한 양으로 세균과 소독제 희석액의 혼합물을 준비하였다. 상기 혼합물의 반응이 끝난 즉시 37℃의 상기 중화배지 45ml를 소독제 반응 시험관 (5ml)에 넣고 녹였다. 중화액을 상기 실험예 1-2와 같은 방법으로 처리, 배양하고 육안으로 확인하였다.　비교예 2-2와 대조하여 5개의 동일 소독제 희석배수의 영양배지에서 4개 이상 증식이 되지 않는 최종 소독희석 단계를 유효 희석배수로 판정하였다.
실험예 1-5. 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 소독제 효력시험 (4℃ 조건)
냉동 보관된 조류 인플루엔자 바이러스 (105~107EID50/ml)를 녹인 후 사용 직전까지 단시간 동안 얼음물에 보관하였다. 4℃의 바이러스액 1.0ml를 경수 및 바이러스에 대한 희석액 각 19ml와 혼합하였다. 혼합한 바이러스액들에서 2.5ml를 온도가 4℃인 상기 제조예 2 및 3에서 제조한 소독제 희석액 2.5ml와 혼합하였다. 4℃에서 5분 또는 30분간 반응시켰으며, 30분 반응시키는 경우에는 10분마다 교반해주었다. 상기 혼합물의 반응이 끝난 즉시 1ml를 꺼내어 37℃의 상기 중화배지 1ml에 넣고 혼합하였다. 중화액을 인산 완충 생리 식염수를 사용하여 원액, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 및 10-5배로 희석하고, 희석 배수당 5개의 9~10일 발육란에 0.2ml 씩 요막강 내로 접종하였다. 접종 후 37℃에서 5일 동안 배양하고, 매일 검란을 실시하였으며, 접종 24시간 이내에 죽은 발육란은 사고사로 간주, 제외하고 평가하였다. 접종 24시간 후부터 5일 이내에 죽은 접종란은 모두 4℃에 보관하였다. 접종 5일 후까지 살아남은 모든 발육란과 4℃에 보관된 죽은 접종란으로부터 요막강액을 각각 채취하고, 1% 닭 적혈구를 사용한 혈구응집반응을 실시하여 바이러스의 존재 유무 및 바이러스 역가를 최종 판정하였다. 비교예 3과 비교하여 병원체 (용균반점형성단위, pfu)가 104이상의 감소가 확인 된 경우 효력이 있는 것으로 판정하여, 이를 유효 희석배수로 하였다.
실험예 1-6. 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 소독제 효력시험 (-20℃ 조건)
냉동 보관된 조류 인플루엔자 바이러스 (105~107EID50/ml)를 녹인 후 사용 직전까지 단시간 동안 얼음물에 보관하였다. 4℃의 바이러스액 1.0ml를 경수 및 바이러스에 대한 희석액 각 19ml와 혼합하였다. 혼합한 바이러스액들을 분주하여 -20℃에서 얼렸다. 얼린 바이러스 희석액 2.5ml에 온도가 4℃인 상기 제조예 2 및 3에서 제조한 소독제 희석액 2.5ml를 혼합하였다. 4℃에서 5분 또는 30분간 반응시켰다. 상기 혼합물의 반응이 끝난 즉시 37℃의 상기 중화배지 45ml를 소독제 반응 시험관 (5ml)에 넣고 녹였다. 중화액을 실험예 1-5와 같은 방법으로 시험하고 평가 및 판정하였다.
실험예 1-7. 뉴캐슬 바이러스에 대한 소독제 효력시험 (4℃ 조건)
냉동 보관된 뉴캐슬 바이러스 (105~107EID50/ml)를 녹인 후 사용 직전까지 단시간 동안 얼음물에 보관하였다. 4℃의 바이러스액 1.0ml를 경수 및 바이러스에 대한 희석액 각 19ml와 혼합하였다. 혼합한 바이러스액들에서 2.5ml를 온도가 4℃인 상기 제조예 2 및 3에서 제조한 소독제 희석액 2.5ml와 혼합하였다. 4℃에서 5분 또는 30분간 반응시켰으며, 30분 반응시키는 경우에는 10분마다 교반해주었다. 상기 혼합물의 반응이 끝난 즉시 1ml를 꺼내어 37℃의 상기 중화배지 1ml에 넣고 혼합하였다. 중화액을 실험예 1-5와 같은 방법으로 시험하고 평가하였고, 비교예 4와 비교하여 병원체가 104이상의 감소가 확인된 경우 효력이 있는 것으로 판정하여, 이를 유효 희석배수로 하였다.
실험예 1-8. 뉴캐슬 바이러스에 대한 소독제 효력시험 (-20℃ 조건)
냉동 보관된 뉴캐슬 바이러스 (105~107EID50/ml)를 녹인 후 사용 직전까지 단시간 동안 얼음물에 보관하였다. 4℃의 바이러스액 1.0ml를 경수 및 바이러스에 대한 희석액 각 19ml와 혼합하였다. 혼합한 바이러스액들을 -20℃에서 얼렸다. 얼린 바이러스 희석액 2.5ml에 온도가 4℃인 상기 제조예 2 및 3에서 제조한 소독제 희석액 2.5ml를 혼합하였다. 4℃에서 5분 또는 30분간 반응시켰다. 상기 혼합물의 반응이 끝난 즉시 1ml를 꺼내어 37℃의 상기 중화배지 1ml에 넣고 혼합하였다. 중화액을 실험예 1-7과 같은 방법으로 시험하고 평가 및 판정하였다.
실험예 1-9. 돼지 유행성 설사 바이러스에 대한 소독제 효력시험 (4℃ 조건)
상기 제조예 4의 방법으로 돼지 유행성 설사 바이러스를 준비하였다. 4℃의 바이러스액 1.0ml를 경수 및 바이러스에 대한 희석액 각 19ml와 혼합하였다. 혼합한 바이러스액들에서 2.5ml를 온도가 4℃인 상기 제조예 2 및 3에서 제조한 소독제 희석액 2.5ml와 혼합하였다. 4℃에서 5분 또는 30분간 반응시켰으며, 30분 반응시키는 경우에는 10분마다 교반해주었다. 상기 혼합물의 반응이 끝난 즉시 1ml를 꺼내어 37℃의 상기 중화배지 1ml에 넣고 혼합하였다. 중화액을 바이러스 접종배지를 사용하여 원액, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5배로 희석하고, 각 희석 배수당 8 웰 (well)의 모노레이어 (80~90%)가 형성된 베로 세포에 100μl씩 접종하였다. 접종 후 37℃, 5% 이산화탄소하에 배양기에서 5일 동안 배양하면서 매일 세포 변성효과(CPE) 발생 여부를 관찰하였다. 비교예 2-5와 비교하여 병원체 (용균반점형성단위, pfu)가 104이상의 감소가 확인된 경우 효력이 있는 것으로 판정하여, 이를 유효 희석배수로 하였다.
실험예 1-10. 돼지 유행성 설사 바이러스에 대한 소독제 효력시험 (-20℃ 조건)
상기 제조예 4의 방법으로 돼지 유행성 설사 바이러스를 준비하였다. 4℃의 바이러스액 1.0ml를 경수 및 바이러스에 대한 희석액 각 19ml와 혼합하였다. 혼합한 바이러스액을 -20℃에서 얼렸다. 혼합한 바이러스액들에서 2.5ml를 온도가 4℃인 상기 제조예 2 및 3에서 제조한 소독제 희석액 2.5ml와 혼합하였다. 4℃에서 5분 또는 30분간 반응시켰다. 상기 혼합물의 반응이 끝난 즉시 1ml를 꺼내어 37℃의 상기 중화배지 1ml에 넣고 혼합하였다. 중화액을 상기 실험예 1-9의 방법으로 접종하고, 관찰 및 판정하였다.
실험예 1-11. 돼지 생식기호흡기증후군 바이러스에 대한 소독제 효력시험 (4℃ 조건)
상기 제조예 5의 방법으로 돼지 생식기호흡기증후군 바이러스를 준비하였다. 4℃의 바이러스액 1.0ml를 경수 및 바이러스에 대한 희석액 각 19ml와 혼합하였다. 혼합한 바이러스액들에서 2.5ml를 온도가 4℃인 상기 제조예 2 및 3에서 제조한 소독제 희석액 2.5ml와 혼합하였다. 4℃에서 5분 또는 30분간 반응시켰으며, 30분 반응시키는 경우에는 10분마다 교반해주었다. 상기 혼합물의 반응이 끝난 즉시 1ml를 꺼내어 37℃의 상기 중화배지 1ml에 넣고 혼합하였다. 중화액을 바이러스 접종배지를 사용하여 원액, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 및 10-5배로 희석하고, 각 희석 배수당 8 웰 (well)의 모노레이어 (80~90%)가 형성된 MARC-145 세포에 100μl씩 접종하였다. 접종 후 37℃, 5% 이산화탄소하에 배양기에서 5일 동안 배양하면서 매일 세포 변성효과(CPE) 발생 여부를 관찰하였다. 비교예 6과 비교하여 병원체 (용균반점형성단위, pfu)가 104이상의 감소가 확인 된 경우 효력이 있는 것으로 판정하여, 이를 유효 희석배수로 하였다.
실험예 1-12. 돼지 생식기호흡기증후군 바이러스에 대한 소독제 효력시험 (-20℃ 조건)
상기 제조예 5의 방법으로 돼지 생식기호흡기증후군 바이러스를 준비하였다. 4℃의 바이러스액 1.0ml를 경수 및 바이러스에 대한 희석액 각 19ml와 혼합하였다. 혼합한 바이러스액들을 -20℃에서 얼렸다. 혼합한 바이러스액 2.5ml를 온도가 4℃인 상기 제조예 2 및 3에서 제조한 소독제 희석액 2.5ml와 혼합하였다. 4℃에서 5분 또는 30분간 반응시켰다. 상기 혼합물의 반응이 끝난 즉시 1ml를 꺼내어 37℃의 상기 중화배지 1ml에 넣고 혼합하였다. 중화액을 상기 실험예 1-11의 방법으로 접종하고, 관찰 및 판정하였다.
실험예 1-13. 구제역 바이러스에 대한 소독제 효력시험 (4℃ 조건)
상기 제조예 6의 방법으로 구제역 바이러스를 준비하였다. 4℃의 바이러스액 1.8ml를 제조예 6에서 제조한 유기물 조건용 희석액 0.2ml에 넣고 혼합하였다. 혼합한 바이러스액을 4℃에서 5분 또는 30분간 반응시켰으며, 반응이 끝나기 직전에 혼합물을 잘 혼합해주었다. 상기 혼합물의 반응이 끝난 즉시 0.05ml를 4℃의 중화배지 (항생제 2% 및 소태아 혈청 5%가 함유된 이글 최소 필수 배지) 5ml에 넣고 혼합하였다. 중화액을 10-2, 10-3, 10-4 및 10-5배로 희석하고, 음성대조군 (증류수 접종), 양성대조군 (수산화나트륨 1%)을 포함한 각 희석배수당 최종 혼합물 0.2ml를 세포단층이 형성된 6 웰플레이트에 3회 반복 접종하였다. 37℃ 5% 이산화탄소 하에서 1시간 동안 배양하고 8 내지 10분마다 잘 흔들어주었다. 접종 1시간 후 1% 메틸셀룰로오스를 함유한 배지 2.5ml를 첨가하고 37℃ 5% 이산화탄소 습윤 조건 하에서 2일간 추가 배양하였다. 이후, 0.01~0.05% 시트르산으로 세포를 세척하고 아미도블랙으로 염색한 뒤 용균반점형성단위 (Plague forming unit, PFU)값을 산출하였다. 비교예 7과 비교하여 병원체 (용균반점형성단위, pfu)가 104이상의 감소가 확인 된 경우 효력이 있는 것으로 판정하여, 이를 유효 희석배수로 하였다.
비교예 1. 살모넬라균의 소독제 효력시험 처리구 대조군
상기 실험예 1-1 및 1-2에 대한 대조군으로, 병원체 대조군은 경수 조건에서 소독제 없이 실험하고, 중화반응 및 증식단계에서 역가가 ml당 2×105CFU 이상인 것을 사용하였다.
비교예 2. 아포형성 혐기성 세균의 소독제 효력시험 처리구 대조군
상기 실험예 1-3 및 1-4에 대한 대조군으로, 병원체 대조군은 경수 조건에서 소독제 없이 실험하고, 중화반응 및 증식단계에서 역가가 ml당 2×105CFU 이상인 것을 사용하였다.
비교예 3. 조류 인플루엔자의 소독제 효력시험 처리구 대조군
상기 실험예 1-5 및 1-6에 대한 대조군으로, 병원체 대조군은 경수 조건에서 소독제 없이 실험하고, 중화반응 및 증식단계에서 역가가 ml당 2×105EID50/ml 이상인 것을 사용하였다.
비교예 4. 뉴캐슬 바이러스의 소독제 효력시험 처리구 대조군
상기 실험예 1-7 및 1-8에 대한 대조군으로, 병원체 대조군은 경수 조건에서 소독제 없이 실험하고, 중화반응 및 증식단계에서 역가가 ml당 2×105EID50/ml 이상인 것을 사용하였다.
비교예 5. 돼지 유행성 설사 바이러스의 소독제 효력시험 처리구 대조군
상기 실험예 1-9 및 2-10에 대한 대조군으로, 병원체 대조군은 경수 조건에서 소독제 없이 실험하고, 중화반응 및 증식단계에서 역가가 ml당 2×105TCID50/ml 이상인 것을 사용하였다.
비교예 6. 돼지 생식기호흡기증후군 바이러스의 소독제 효력시험 처리구 대조군
상기 실험예 2-11 및 2-12에 대한 대조군으로, 병원체 대조군은 경수 조건에서 소독제 없이 실험하고, 중화반응 및 증식단계에서 역가가 ml당 2×105TCID50/ml 이상인 것을 사용하였다.
비교예 7. 구제역 바이러스의 소독제 효력시험 처리구 대조군
상기 실험예 2-13에 대한 대조군으로, 병원체 대조군은 유기물 조건에서 소독제 없이 실험하고, 중화반응 및 증식단계에서 역가가 ml당 2×105TCID50/ml 이상인 것을 사용하였다.
소독제 효력시험 결과 분석
상기 실험예 1-1, 1-3, 1-5, 1-7, 1-9. 1-11, 1-13 중에서 반응시간이 5분인 경우의 내동 소독제 병원체별 유효희석 배수를 아래 표 1에 나타내었다. 소독제 희석액을 최종 균체와 1:1로 섞어서 사용하였으므로, 아래 표에 기재된 실제 유효희석 배수는 제조예 2 및 3에 기재된 희석배수의 2배인 것이다. 괄호 안의 배수는 검역원 고시에서 지정하는 희석 배수인 시험 희석 배수의 80%를 나타낸다.
유효희석 배수를 "미만"으로 기재한 경우에는 해당 유효희석 배수 이상인 경우에서는 소독 효과가 없었음을 나타내었다. 유효희석 배수를 "초과"로 기재한 경우는 해당희석 배수를 초과하는 경우에는 소독의 효과가 있을 수도 있으나 내동의 효과가 떨어짐을 의미한다.
병원체 종류 희석 조건 내동성 소독제 유효희석 배수
살모넬라균
(Salmonella typhimurium)		 유기물 100배 미만 (40)
경수 400배 초과 (160)
아포형성 혐기성 세균
(Clostridium perfringens)		 유기물 140배 미만 (56)
경수 200배 초과 (80)
조류 인플루엔자
(Avian influenza virus H9N2)		 유기물 400배 초과 (160)
경수 400배 초과 (160)
뉴캐슬 바이러스
(Newcastle diAaA virus LsSota)		 유기물 400배 초과 (160)
경수 400배 초과 (160)
돼지 유행성 설사 바이러스
(Porcine Epidemic Diarrhea virus PEVDV 11.29)		 유기물 400배 초과 (160)
경수 500배 초과 (200)
돼지 생식기호흡기증후군 바이러스
(Porcine reproductive and respiratory syndrome LMY strain)		 유기물 400배 초과 (160)
경수 500배 초과 (200)
구제역 (Foot and mouth disease) 유기물 100배 초과 (40)
상기 실험예 1-1, 1-3, 1-5, 1-7, 1-9. 1-11, 1-13 중에서 반응시간이 30분인 경우의 내동 소독제 병원체별 유효희석 배수를 아래 표 2에 나타내었다.
병원체 종류 희석 조건 내동성 소독제 유효희석 배수
살모넬라균
(Salmonella typhimurium)		 유기물 40배 미만 (16)
경수 6000배 미만 (2400)
아포형성 혐기성 세균
(Clostridium perfringens)		 유기물 120배 미만 (48)
경수 4000배 초과 (1600)
조류 인플루엔자
(Avian influenza virus H9N2)		 유기물 400배 초과 (160)
경수 400배 초과 (160)
뉴캐슬 바이러스
(Newcastle diAaA virus LsSota)		 유기물 400배 초과 (160)
경수 400배 초과 (160)
돼지 유행성 설사 바이러스
(Porcine Epidemic Diarrhea virus PEVDV 11.29)		 유기물 500배 초과 (200)
경수 500배 초과 (200)
돼지 생식기호흡기증후군 바이러스
(Porcine reproductive and respiratory syndrome LMY strain)		 유기물 500배 초과 (200)
경수 500배 초과 (200)
구제역 (Foot and mouth disease) 유기물 200배 초과 (80)
상기 실험예 1-2, 1-4, 1-6, 1-8, 1-10. 1-12 중에서 반응시간이 5분인 경우의 내동 소독제 병원체별 유효희석 배수를 아래 표 3에 나타내었다.
병원체 종류 희석 조건 내동성 소독제 유효희석 배수
살모넬라균
(Salmonella typhimurium)		 유기물 60배 초과 (24)
경수 200배 초과 (80)
아포형성 혐기성 세균
(Clostridium perfringens)		 유기물 100배 초과 (40)
경수 200배 초과 (80)
조류 인플루엔자
(Avian influenza virus H9N2)		 유기물 400배 초과 (160)
경수 400배 초과 (160)
뉴캐슬 바이러스
(Newcastle diAaA virus LsSota)		 유기물 400배 초과 (160)
경수 400배 초과 (160)
돼지 유행성 설사 바이러스
(Porcine Epidemic Diarrhea virus PEVDV 11.29)		 유기물 400배 초과 (160)
경수 500배 초과 (200)
돼지 생식기호흡기증후군 바이러스
(Porcine reproductive and respiratory syndrome LMY strain)		 유기물 400배 초과 (160)
경수 500배 초과 (200)
상기 실험예 1-2, 1-4, 1-6, 1-8, 1-10. 1-12 중에서 반응시간이 30분인 경우의 내동 소독제 병원체별 유효희석 배수를 아래 표 4에 나타내었다.
병원체 종류 희석 조건 내동성 소독제 유효희석 배수
살모넬라균
(Salmonella typhimurium)		 유기물 60배 초과 (24)
경수 200배 초과 (80)
아포형성 혐기성 세균
(Clostridium perfringens)		 유기물 100배 초과 (40)
경수 200배 초과 (80)
조류 인플루엔자
(Avian influenza virus H9N2)		 유기물 400배 초과 (160)
경수 400배 초과 (160)
뉴캐슬 바이러스
(Newcastle diAaA virus LsSota)		 유기물 400배 초과 (160)
경수 400배 초과 (160)
돼지 유행성 설사 바이러스
(Porcine Epidemic Diarrhea virus PEVDV 11.29)		 유기물 400배 초과 (160)
경수 500배 초과 (200)
돼지 생식기호흡기증후군 바이러스
(Porcine reproductive and respiratory syndrome LMY strain)		 유기물 400배 초과 (160)
경수 500배 초과 (200)
내동성 소독제 부동 효과
상기 실시예 1의 내동성 소독제 조성물을 제조예 2-2에 따라 100배 희석하여 온도별 부동성을 확인하였다. 소듐 에톡사이드 (SE)를 다양한 농도로 희석한 경우와 비교하여 아래 표 5에 나타내었다.
-10 ℃ -15 ℃ -20 ℃
SE 1% 2시간 완전부동 1.5시간 부분부동
2시간 동결		 0.5시간 부분부동
1시간 동결
SE 0.5% 2시간 완전부동 1시간 부분부동
1.5시간 동결		 0.5시간 부분부동
1시간 동결
SE 0.4% 2시간 완전부동 1시간 부분부동
1.5시간 동결		 0.5시간 부분부동
1시간 동결
SE 0.3% 2시간 완전부동 1시간 부분부동
1.5시간 동결		 0.5시간 동결
SE 0.2% 2시간 완전부동 0.5시간 동결 0.5시간 동결
SE 0.1% 2시간 완전부동 0.5시간 동결 0.5시간 동결
실시예 1
(SE 0.375%)		 3시간 완전부동 1.5시간 동결 1.0시간 동결
이상과 같이 실시예를 통하여 본 발명을 설명하였다. 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 상술한 실시예들은 모든 면에 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해되어야 한다. 본 발명의 범위는 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (11)

  1. 이염화이소시아닐산나트륨을 유효성분으로 포함하는, 내동성 소독제 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 이염화이소시아닐산나트륨은 조성물 100중량부에 대하여 0.1 내지 37.5 중량부로 포함된 것인, 내동성 소독제 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    소듐에톡사이드, 아디핀산, 탄산수소나트륨 및 탄산나트륨으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상을 더 포함하는 것인, 내동성 소독제 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    빙점이 -10 내지 -20℃인, 내동성 소독제 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    세균 또는 바이러스 소독에 사용되는 것인, 내동성 소독제 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 세균은 살모넬라균 및 아포형성혐기성세균으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 것인, 내동성 소독제 조성물.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 바이러스는 조류 인플루엔자, 뉴캐슬 바이러스, 돼지 유행성설사 바이러스, 돼지 생식기호흡기증후군 바이러스 및 구제역 바이러스로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 것인, 내동성 소독제 조성물.
  8. 제1항에 따른 내동성 소독제 조성물을 이용하는 것인, 세균 또는 바이러스의 소독 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 세균은 살모넬라균 및 아포형성혐기성세균으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 것인, 세균 또는 바이러스의 소독 방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 바이러스는 조류 인플루엔자, 뉴캐슬 바이러스, 돼지 유행성설사 바이러스, 돼지 생식기호흡기증후군 바이러스 및 구제역 바이러스로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 것인, 세균 또는 바이러스의 소독 방법.
  11. 제8항에 있어서,
    소독은 -20 내지 4℃에서 이루어지는 것인, 세균 또는 바이러스의 소독 방법.
KR1020170070506A 2017-06-07 2017-06-07 내동성 소독제 조성물 및 이를 이용한 질병의 예방 및 전파 방지 방법 KR101948738B1 (ko)

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