KR20180125934A - Method and apparatus for ultrasensitive quantification of dna biomarker - Google Patents
Method and apparatus for ultrasensitive quantification of dna biomarker Download PDFInfo
- Publication number
- KR20180125934A KR20180125934A KR1020180142621A KR20180142621A KR20180125934A KR 20180125934 A KR20180125934 A KR 20180125934A KR 1020180142621 A KR1020180142621 A KR 1020180142621A KR 20180142621 A KR20180142621 A KR 20180142621A KR 20180125934 A KR20180125934 A KR 20180125934A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- dna
- target dna
- probe
- spot
- target
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
- C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
- C12Q2527/137—Concentration of a component of medium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
- C12Q2565/60—Detection means characterised by use of a special device
- C12Q2565/601—Detection means characterised by use of a special device being a microscope, e.g. atomic force microscopy [AFM]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
본 발명은 DNA 생체표지자의 초민감성 정량 분석 방법 및 장치에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 원자간력 현미경을 이용한 표적 DNA 정량 분석 방법 및 정량 분석 키트를 제공한다.The present invention relates to a method and apparatus for quantitatively analyzing DNA biomarkers, and more specifically, the present invention provides a method and a kit for quantitative analysis of target DNA using an atomic force microscope.
현대 의학에서 원인을 알 수 없는 질병의 유전적 실체와 특성을 찾아내는 것은 정확한 진단을 위한 필수적인 요소가 된다. 특히 분자 진단 기술은 유전자 서열 정보를 기반으로 환자의 DNA와 RNA 시료에서 질병을 일으키는 근원인 돌연변이를 찾아냄으로써, 질병이 심화되기 이전에 질병의 원인을 정확히 진단하고 예후를 추정할 수 있는 중요한 정보들을 제공할 수 있다. 또한 분자 진단법을 통해 유전자의 발현과 기능을 연구하며, 이를 통해 다양한 약물 연구와 생체 표지자(biomarker) 개발에 기초적인 지식을 제공해 주는 중요한 분야로 자리매김을 하고 있다.In modern medicine, finding the genetic substance and characteristics of a disease whose cause is unknown is essential for accurate diagnosis. Particularly, molecular diagnostic technology detects mutations that cause disease in DNA and RNA samples of patients based on gene sequence information, and provides important information to accurately diagnose the cause of the disease and estimate the prognosis before the disease worsens. Can provide. In addition, it studies the expression and function of genes through molecular diagnostics, and through this, it has established itself as an important field that provides basic knowledge for various drug research and biomarker development.
현재 가장 강력한 분자 진단 도구로는 1985년에 처음 보고된 중합 효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)이 있다(Saiki et al. Science 230, 1350-1354 (1985)). PCR은 특정 효소를 사용하여 DNA의 특정 부위를 선택적으로 증폭시킴으로써 찾고자 하는 돌연변이를 며칠 이내로 확인할 수 있다. 특히 DNA의 증폭과 탐색을 동시에 할 수 있도록 고안한 실시간 정량 중합 효소 연쇄 반응(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)은 기존 PCR 방법에 더해 DNA를 증폭하는 과정을 관찰할 수 있도록, 형광물질을 표지함으로써 특정 염기 서열의 존재 유무뿐 아니라 얼마만큼 존재하는지 알 수 있는 정량 분석 방법이다. 이는 표준 물질의 증폭 곡선을 이용하여 미지의 시료량을 유추하는 방법이며 이론적으로는 단일 분자 수준까지 정량이 가능하지만 실제 극미량의 DNA 분석 결과에는 결과 값에 큰 편차가 나타나 분석에 어려움이 있다. 또한, 프라이머 이합체 형성과 같은 증폭 오류로 인해 위양성 결과(false positive)가 생길 수 있고(Hughes et al. Lancet 335, 1037-1038 (1990)), 핵산의 구조 따라 DNA 증폭 효율의 차이가 있으며, 표적 DNA 및 표준 물질의 교정에서 기인하는 오차로 인해 정량의 편차가 발생할 수 있다(Sanders et al. Anal. Bioanal. Chem. 406, 6471-6483 (2014)). Currently, the most powerful molecular diagnostic tool is the polymerase chain reaction (PCR), first reported in 1985 (Saiki et al. Science 230, 1350-1354 (1985)). PCR uses specific enzymes to selectively amplify specific regions of DNA, so that the desired mutation can be identified within a few days. In particular, the real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), designed to simultaneously amplify and search DNA, is used to observe the process of amplifying DNA in addition to the conventional PCR method. By labeling a substance, it is a quantitative analysis method that can determine not only the presence or absence of a specific base sequence, but also how much. This is a method of inferring the amount of an unknown sample by using the amplification curve of a standard substance, and theoretically, it is possible to quantify it to the level of a single molecule. In addition, false positive results may occur due to amplification errors such as primer dimer formation (Hughes et al. Lancet 335, 1037-1038 (1990)), and there is a difference in DNA amplification efficiency depending on the structure of the nucleic acid, and targets Quantitative deviations may occur due to errors resulting from calibration of DNA and standards (Sanders et al. Anal. Bioanal. Chem. 406, 6471-6483 (2014)).
RT-qPCR의 문제를 극복할 수 있는 대안으로 디지털 PCR(digital PCR, d-PCR) 방법이 있다(Sykes et al. Biotechniques 13, 444-449 (1992)). 이 방법은 개별 표적 DNA가 각각의 나노 리터 부피의 미세 구획에 각각 1 개 혹은 0 개의 표적 DNA가 들어가도록 통계적으로 분산, 이들을 병렬적으로 증폭한 후, PCR 증폭 결과가 양성 또는 음성의 값을 가지는 구획의 개수를 계산하여 표적 DNA의 초기 농도를 측정하는 것이다. 이 방법은 표준 물질을 이용하여 증폭 곡선을 얻을 필요가 없으므로 증폭 효율에 따른 오차를 제거할 수 있다(Hindson et al. Nature Methods 10, 1003-1005 (2013)). 하지만 각 구획에 2개 이상의 표적 DNA가 들어가거나 불균일한 구획 부피로 인해 측정 오차가 발생하며 표적 DNA가 극미량일수록 결과에 큰 영향을 미친다는 문제점이 있다(Corbisier et al. Anal. Bioanal. Chem. 407, 1831-1840 (2015)).As an alternative that can overcome the problem of RT-qPCR, there is a digital PCR (d-PCR) method (Sykes et al. Biotechniques 13, 444-449 (1992)). In this method, individual target DNAs are statistically distributed so that 1 or 0 target DNAs each fit into each nanoliter volume micro-compartment, and after amplifying them in parallel, the PCR amplification result has a positive or negative value. By calculating the number of compartments, the initial concentration of the target DNA is measured. Since this method does not need to obtain an amplification curve using a standard material, errors due to amplification efficiency can be eliminated (Hindson et al. Nature
이러한 문제로 인해 최근 PCR 방법 없이 극미량의 표적 DNA를 정확하게 계산할 수 있는 방법이 연구되고 있다. 그 중 하나로 원자간력 현미경(Atomic Force Microscope, AFM)을 이용한 단분자 힘 분광법(single molecule force spectroscopy)이 있다. 원자간력 현미경은 나노미터 수준의 공간 분해능을 가지며, 수 피코뉴튼(picoNewton, pN) 수준으로 캔틸레버(cantilever)와 표면의 상호작용력을 측정할 수 있는 높은 민감도를 가지고 있다. 캔틸레버 말단에 있는 팁(tip)은 수 나노미터의 반지름을 갖고 팁 표면을 화학 처리를 통해 원하는 생체 분자를 도입할 수 있다. 이러한 방법으로 단일 생체 분자 간의(DNA-DNA, DNA-RNA, 항원-항체, 단백질-리간드 등) 상호작용력을 측정하고 이를 통해 생체 물질의 구조, 분포, 동역학 등을 분석할 수 있다(Hinterdorfer et al. Nat. Methods 3, 347-355 (2006)). 특히 나노미터 수준의 간격으로 캔틸레버를 표면에 접촉하여 힘-거리 곡선을 얻어 결합힘(adhesion force), 영의 계수(Young's modulus), 그리고 높이(height)에 관한 정량 이미지를 얻는 힘-지도 방법을 활용하여 프로브 DNA 혹은 항체가 도입된 표면 위에 포집한 표적 DNA 또는 항원의 농도를 측정하는 연구가 많이 진행되고 있다. 미국 특허등록번호 제8,067,169호는 원자간력 현미경과 T자 모양의 캔틸레버를 이용하여 평평한 고체 표면 위에서 짧은 길이의 핵산을 검출하는 방법을 제시하였다. 이 방법은 단일 가닥 프로브 DNA를 고정한 표면 위에 표적 마이크로 RNA를 처리했을 때 형성하는 DNA-RNA 이합체와 단일 가닥 프로브 DNA의 강성(stiffness)이 차이 나는 것을 이용하여 초기 마이크로 RNA의 농도를 측정하는 방법이다. 또한, 미국 특허등록번호 제 7,152,462호는 표면의 위상 이미지와 분자 인지 이미지를 짧은 시간에 동시에 관찰할 수 있는 TREC(topography and recognition imaging)을 제시하였다. 이 방법은 팁에 바이오틴 분자를 부착한 캔틸레버를 이용하여 아비딘이 분포한 표면의 높이 이미지와 바이오틴-아비딘의 분자 인지 이미지를 동시에 얻어 비교함으로써 개별 아비딘 분자의 위치 정확도를 높이고 분자 활성을 측정할 수 있다. Due to this problem, a method capable of accurately calculating a trace amount of target DNA without a PCR method has been recently studied. One of them is single molecule force spectroscopy using an atomic force microscope (AFM). The atomic force microscope has a nanometer-level spatial resolution, and has a high sensitivity that can measure the interaction force between a cantilever and a surface at the level of picoNewton (pN). The tip at the end of the cantilever has a radius of several nanometers, and a desired biomolecule can be introduced through a chemical treatment on the tip surface. In this way, it is possible to measure the interaction force between single biomolecules (DNA-DNA, DNA-RNA, antigen-antibody, protein-ligand, etc.) and analyze the structure, distribution, and kinetics of the biological material through this method (Hinterdorfer et al. Nat.
그러나, 상술한 방법들을 이용하여 정량 분석 장치를 고안하기 위해서는 크게 두 가지 문제가 있다. 먼저 단일 분자의 이미지 크기에 관한 정의 없이 분자 이미지를 얻기 때문에 두 개 이상의 표적 분자가 가까이 인접하여 표면에 분포한 경우 개별 분자 이미지가 겹쳐 그 개수를 구별하지 못해 정량 오류로 이어질 수 있다. 또한 표적 분자 이미지를 얻기 위해서는 수 나노미터에서 수 십 나노미터의 공간 분해능을 유지해야 하므로 표적 분자를 표면에 집약적으로 포집해야 한다. 따라서 표적 분자를 유인하고 특정 영역 내에 포집하기 위해 주로 마이크로어레이 장비로 프로브 분자를 표면에 프린트 하는데, 프로브 스팟 직경이 수 십에서 수 백 마이크론에 이른다. 일반적인 원자간력 현미경을 이용한 정량 이미지의 최대 해상도가 512 × 512 픽셀에 국한되어 있어 마이크로어레이 스팟 전체를 나노미터 스케일로 이미지화 하는 것이 불가능할 뿐만 아니라 힘-거리 곡선의 수집량이 늘어나게 되면 캔틸레버의 내구성에 문제를 일으킬 수 있다. 이러한 이유로 마이크로어레이 스팟의 일부만을 스캔하고, 이를 통해 얻은 분자 이미지를 바탕으로 전체 영역에 분산한 표적 분자의 개수를 유추하는 방법을 사용해 왔다. However, in order to devise a quantitative analysis device using the above-described methods, there are two main problems. First, since a molecular image is obtained without a definition of the image size of a single molecule, if two or more target molecules are closely adjacent and distributed on the surface, the individual molecule images overlap and the number of individual molecules cannot be distinguished, leading to a quantitative error. In addition, in order to obtain an image of a target molecule, a spatial resolution of several nanometers to several tens of nanometers must be maintained, so target molecules must be intensively collected on the surface. Therefore, in order to attract target molecules and capture them within a specific area, probe molecules are printed on the surface mainly with microarray equipment, and the probe spot diameter ranges from several tens to several hundred microns. Since the maximum resolution of quantitative images using a general atomic force microscope is limited to 512 × 512 pixels, it is not possible to image the entire microarray spot at the nanometer scale, and if the collection amount of the force-distance curve increases, the durability of the cantilever is problematic. Can cause. For this reason, a method has been used to scan only a part of the microarray spot and infer the number of target molecules distributed over the entire area based on the molecular images obtained through the scan.
본 발명자들은 극미량의 DNA 분자의 정확한 정량 분석 방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 프로브 분자 스팟을 10 마이크론 이내로 프린트할 수 있다면 분자 이미지를 얻기 위한 나노미터 공간 분해능을 유지하면서 스팟 전체를 스캔할 수 있어 절대 정량이 가능할 뿐만 아니라 표면에 존재하는 단 한 개의 표적 분자도 찾아낼 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.As a result of the present inventors making diligent efforts to develop an accurate quantitative analysis method for a very small amount of DNA molecules, if the probe molecule spot can be printed within 10 microns, the entire spot can be scanned while maintaining the nanometer spatial resolution for obtaining a molecular image. The present invention was completed by confirming that not only absolute quantification is possible, but also only one target molecule present on the surface can be found.
본 발명의 목적은 바디의 말단에 형성된 팁 및 상기 팁의 표면에 표적 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 포함하는 검출 DNA가 고정된 원자간력 현미경용 캔틸레버 및 표적 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 포함하는 프로브 DNA가 고정된 인쇄 기판을 포함하는 표적 DNA 정량 분석 키트를 제공하는 것이다.An object of the present invention is a tip formed at the end of a body and a cantilever for an atomic force microscope in which a detection DNA comprising a nucleotide sequence capable of complementarily binding to a target DNA is fixed on the surface of the tip and complementarily with the target DNA. It is to provide a target DNA quantitative analysis kit including a printed substrate to which probe DNA containing a base sequence capable of binding is immobilized.
또한 본 발명은 인쇄 기판을 준비하는 단계, 상기 인쇄 기판에 10 ~ 900 μm2 면적, 10 ~ 900 nm 깊이의 패턴을 식각하는 단계 및 상기 식각된 패턴에 표적 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 포함하는 프로브 DNA 수용액을 떨어뜨려서 프로브 DNA 스팟을 인쇄하는 단계를 포함하는 표적 DNA 정량 분석용 인쇄 기판의 제조방법을 제공하고자 한다.In addition, the present invention provides a step of preparing a printed substrate, etching a pattern having an area of 10 to 900 μm 2 and a depth of 10 to 900 nm on the printed substrate, and a base capable of complementarily binding to a target DNA to the etched pattern. An object of the present invention is to provide a method of manufacturing a printed substrate for quantitative analysis of target DNA, including the step of printing a probe DNA spot by dropping an aqueous solution of probe DNA containing a sequence.
또한, 본 발명은 (a) 표적 DNA가 포함된 시료를 상기 표적 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 포함하는 프로브 DNA 인쇄 기판에 접촉하여 DNA/DNA 이합체를 형성하는 혼성화 단계, (b) 상기 표적 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 포함하는 검출 DNA가 고정된 원자간력 현미경용 캔틸레버를 상기 DNA/DNA 이합체가 형성된 인쇄 기판에 접촉하여 개별 프로브 DNA 스팟 내 결합힘-지도화를 수행하는 단계 및 (c) 상기 결합힘-지도 상의 결합힘이 관찰되는 스팟에서 상기 프로브 DNA와 표적 DNA의 DNA/DNA 이합체의 존재를 검출하고, 공간적 분포를 분석하는 단계를 포함하는 표적 DNA 정량 분석 방법을 제공하고자 한다.In addition, the present invention (a) a hybridization step of forming a DNA/DNA dimer by contacting a probe DNA printed substrate containing a nucleotide sequence capable of complementarily binding a target DNA to the target DNA, (b ) A cantilever for an atomic force microscope on which detection DNA containing a nucleotide sequence capable of complementarily binding to the target DNA is fixed is brought into contact with the printed substrate on which the DNA/DNA dimer is formed, and the binding force in the individual probe DNA spot-map A target DNA comprising the steps of performing the synthesis and (c) detecting the presence of a DNA/DNA dimer of the probe DNA and the target DNA at the spot where the binding force on the binding force-map is observed, and analyzing the spatial distribution We would like to provide a quantitative analysis method.
본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 바디의 말단에 형성된 팁 및 상기 팁의 표면에 표적 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 포함하는 검출 DNA가 고정된 원자간력 현미경용 캔틸레버 및 표적 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 포함하는 프로브 DNA가 고정된 인쇄 기판을 포함하는 표적 DNA 정량 분석 키트를 제공한다.The present invention is to solve the above-described problem, a tip formed at the end of a body and a cantilever for an atomic force microscope in which a detection DNA including a nucleotide sequence capable of complementarily binding to a target DNA is fixed on the surface of the tip. And it provides a target DNA quantitative analysis kit comprising a printed substrate to which the probe DNA including a base sequence capable of complementarily binding to the target DNA is immobilized.
본 발명에 있어서 상기 프로브 DNA는 기판 위에 지름 100 nm ~ 10 μm의 스팟으로 인쇄된 것일 수 있다. In the present invention, the probe DNA may be printed as a spot having a diameter of 100 nm to 10 μm on a substrate.
본 발명의 상기 프로브 DNA는 3' 말단에 아민기를 포함할 수 있다.The probe DNA of the present invention may include an amine group at the 3'end.
본 발명의 상기 인쇄 기판은 유리, 금속, 플라스틱, 실리콘, 실리케이트, 세라믹, 반도체, 합성 유기 금속, 합성 반도체 및 합금으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상일 수 있다.The printed substrate of the present invention may be at least one selected from the group consisting of glass, metal, plastic, silicon, silicate, ceramic, semiconductor, synthetic organic metal, synthetic semiconductor, and alloy.
본 발명의 상기 검출 DNA는 5' 말단에 아민기를 포함할 수 있다.The detection DNA of the present invention may include an amine group at the 5'end.
본 발명의 상기 키트는 원자간력 현미경을 더 포함할 수 있다.The kit of the present invention may further include an atomic force microscope.
또한, 본 발명은 인쇄 기판을 준비하는 단계, 상기 인쇄 기판에 10 ~ 900 μm2 면적, 10 ~ 900 nm 깊이의 패턴을 식각하는 단계 및 상기 식각된 패턴에 표적 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 포함하는 프로브 DNA 수용액을 떨어뜨려서 프로브 DNA 스팟을 인쇄하는 단계를 포함하는 표적 DNA 정량 분석용 인쇄 기판의 제조방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a step of preparing a printed substrate, etching a pattern having an area of 10 to 900 μm 2 and a depth of 10 to 900 nm on the printed substrate, and complementarily binding the etched pattern with a target DNA. It provides a method of manufacturing a printed substrate for quantitative analysis of target DNA comprising the step of printing a probe DNA spot by dropping an aqueous solution of probe DNA containing a base sequence.
본 발명의 상기 프로브 DNA 인쇄 단계는 기판 위에 프로브 DNA 수용액을 지름 100 nm ~ 10 μm의 스팟으로 인쇄하는 것일 수 있다.The probe DNA printing step of the present invention may be to print an aqueous probe DNA solution onto a substrate in a spot having a diameter of 100 nm to 10 μm.
본 발명의 상기 프로브 DNA는 3' 말단에 아민기를 포함할 수 있다.The probe DNA of the present invention may include an amine group at the 3'end.
본 발명의 상기 인쇄 기판은 유리, 금속, 플라스틱, 실리콘, 실리케이트, 세라믹, 반도체, 합성 유기 금속, 합성 반도체 및 합금으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상일 수 있다.The printed substrate of the present invention may be at least one selected from the group consisting of glass, metal, plastic, silicon, silicate, ceramic, semiconductor, synthetic organic metal, synthetic semiconductor, and alloy.
본 발명의 제조방법은 상기 기판을 식각한 후에 기판 표면에 아민 작용기를 도입하는 단계 및 아민 작용기와 선택적으로 공유 결합하는 링커를 결합시키는 단계를 더 포함할 수 있다. The manufacturing method of the present invention may further include introducing an amine functional group to the surface of the substrate after etching the substrate, and coupling a linker that selectively covalently bonds with the amine functional group.
또한, 본 발명은 (a) 표적 DNA가 포함된 시료를 상기 표적 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 포함하는 프로브 DNA 인쇄 기판에 접촉하여 DNA/DNA 이합체를 형성하는 혼성화 단계, (b) 상기 표적 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 포함하는 검출 DNA가 고정된 원자간력 현미경용 캔틸레버를 상기 DNA/DNA 이합체가 형성된 인쇄 기판에 접촉하여 개별 프로브 DNA 스팟 내 결합힘-지도화를 수행하는 단계 및 (c) 상기 결합힘-지도 상의 결합힘이 관찰되는 스팟에서 상기 프로브 DNA와 표적 DNA의 DNA/DNA 이합체의 존재를 검출하고, 공간적 분포를 분석하는 단계를 포함하는 표적 DNA 정량 분석 방법을 제공한다.In addition, the present invention (a) a hybridization step of forming a DNA/DNA dimer by contacting a probe DNA printed substrate containing a nucleotide sequence capable of complementarily binding a target DNA to the target DNA, (b ) A cantilever for an atomic force microscope on which detection DNA containing a nucleotide sequence capable of complementarily binding to the target DNA is fixed is brought into contact with the printed substrate on which the DNA/DNA dimer is formed, and the binding force in the individual probe DNA spot-map A target DNA comprising the steps of performing the synthesis and (c) detecting the presence of a DNA/DNA dimer of the probe DNA and the target DNA at the spot where the binding force on the binding force-map is observed, and analyzing the spatial distribution Provides a quantitative analysis method.
본 발명에 있어서 상기 표적 DNA가 포함된 시료는 표적 DNA가 10 zM ~ 1 aM 농도로 포함된 것일 수 있다.In the present invention, the sample containing the target DNA may be one containing the target DNA at a concentration of 10 zM to 1 aM.
본 발명의 상기 프로브 DNA 인쇄 기판은 기판 표면에 표적 DNA를 지름 100 nm ~ 10 μm의 스팟으로 형성하여 고정시킨 것일 수 있다.The probe DNA printed substrate of the present invention may be fixed by forming a target DNA into a spot having a diameter of 100 nm to 10 μm on the surface of the substrate.
본 발명의 상기 (b) 단계의 결합힘-지도화 수행 단계는 상기 원자간력 현미경용 캔틸레버가 접촉한 위치에서 상기 검출 DNA와 표적 DNA 사이의 상호작용으로 나타나는 특이적인 힘-거리 곡선을 측정함으로써 수행될 수 있다.The binding force-mapping step of the step (b) of the present invention is performed by measuring a specific force-distance curve that appears as an interaction between the detection DNA and the target DNA at the position where the atomic force microscope cantilever contacts. Can be done.
본 발명의 상기 (c) 단계의 공간적 분포 분석은 시료 내 결합힘이 관찰되는 DNA/DNA 이합체의 개수를 카운팅하여 수행될 수 있다.The spatial distribution analysis in step (c) of the present invention may be performed by counting the number of DNA/DNA dimers in which the binding force in the sample is observed.
또한, 상기 DNA/DNA 이합체의 개수를 카운팅하는 방법은 동일 프로브 DNA 스팟 내에서 연속적으로 복수 개의 결합힘-지도를 얻는 단계, 상기 복수 개의 결합힘-지도를 겹쳤을 때 2 이상의 인접한 픽셀에서 특이적인 결합힘이 관찰되는 클러스터를 분리하는 단계, 상기 분리된 클러스터 중 동일 픽셀에서 2회 이상 반복적으로 특이적인 결합힘이 관찰되는 클러스터를 분리하는 단계 및 상기 복수 개의 픽셀이 겹쳐서 생기는 픽셀 클러스터 중 직경이 단일 표적 DNA 클러스터 직경 이상의 크기를 갖는 클러스터의 개수를 카운팅하는 단계를 포함할 수 있다.In addition, the method of counting the number of DNA/DNA dimers is the step of obtaining a plurality of binding force-maps consecutively within the same probe DNA spot, and when the plurality of binding force-maps are overlapped, specific in two or more adjacent pixels. Separating a cluster in which a bonding force is observed, separating a cluster in which a specific bonding force is repeatedly observed two or more times in the same pixel among the separated clusters, and a pixel cluster generated by overlapping the plurality of pixels having a single diameter It may include counting the number of clusters having a size greater than or equal to the target DNA cluster diameter.
본 발명의 표적 DNA 정량 분석 방법은 상기 (c) 단계 이후에 표적 DNA의 농도를 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다.The method for quantitatively analyzing target DNA of the present invention may further include determining the concentration of the target DNA after step (c).
본 발명의 DNA 정량 분석 방법은 기존의 방법으로 수행하기 어려웠던 극미량의 표적 DNA를 원자간력 현미경의 결합힘-지도화를 이용하여 표적 DNA의 증폭, 변형, 형광 표지 없이 정량 분석할 수 있다는 장점이 있다. 특히, 표적 DNA를 포집하기 위해 생성하는 프로브 DNA 스팟 크기의 최적화를 통해 10개 이하 표적 DNA 분자를 다양한 기질 위에서 정량 분석할 수 있는 방법을 도입하였다. The DNA quantitative analysis method of the present invention has the advantage of being able to quantitatively analyze a trace amount of target DNA, which was difficult to perform with the conventional method, without amplification, modification, or fluorescent labeling of the target DNA using the binding force-mapping of an atomic force microscope. have. In particular, a method capable of quantitatively analyzing 10 or less target DNA molecules on various substrates was introduced by optimizing the size of the probe DNA spot generated to capture the target DNA.
이러한 본 발명의 초고민감도 DNA 분석 방법을 질병의 진단 및 치료 예후 관찰 등에 적용하면 질병의 조기 진단뿐 아니라 수술 및 치료 후 경과를 정확히 모니터링 하는데 활용할 수 있을 것으로 기대된다.When the ultra-sensitive DNA analysis method of the present invention is applied to the diagnosis of disease and observation of the prognosis of treatment, it is expected that it can be used to accurately monitor the progress after surgery and treatment as well as early diagnosis of the disease.
도 1은 본 발명에 따른 AFM을 이용한 표적 DNA의 분석 원리를 나타내는 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 프로브 DNA 스팟 직경에 따른 표적 DNA의 검출 한계를 계산한 모식도이다.
도 3은 (a) 슬라이드 유리의 식각 패턴과 (b) 이 중 특정 사각형의 패턴 위에 프린트 한 프로브 DNA 스팟 이미지이다.
도 4는 (a) 프로브 DNA 스팟 표면에 결합한 표적 DNA가 수용액 상에서 동역학적 운동을 하고 있을 때 캔틸레버 팁에 고정된 검출 DNA가 표적 DNA를 인식하는 모식도, (b) 클러스터 내에서 나타나는 힘-거리 곡선에서 측정한 결합힘 값 및 늘어짐 거리값의 히스토그램, (c) 결합힘-지도에서 나타나는 클러스터의 형태 및 측정 반지름을 나타낸 것이다.
도 5는 동일 프로브 DNA 스팟 위에서 3 개의 연속적인 정량 이미지를 얻은 뒤 이미지 간의 2차원 움직임을 보정한 다음 겹친 이미지를 얻는 과정을 나타낸 것이다. 스팟 표면 전체에서 힘-거리 곡선을 수집하여 (a) 높이, 영의 계수에 관한 정량 이미지 3장을 연속적으로 얻고 (b) 첫 번째와 두 번째 이미지, 두 번째와 세 번째 이미지 간의 위치 차이를 측정하여 (c) 최종적으로 위치 보정하여 3장의 이미지를 겹친 정량 이미지를 얻는다.
도 6은 보정을 통해 겹친 결합힘-지도에서 특이적인 결합힘이 측정되는 위치와 빈도를 나타낸 결과이다. (a) 1 aM 의 표적 DNA 수용액을 처리한 프로브 DNA 스팟에서 연속적으로 얻은 3장의 특이적인 결합힘 검출 지도와 보정을 통해 겹친 결합힘 빈도 수 지도 및 유효 클러스터의 위치(노란색 원으로 표시), (b) 어떠한 표적 DNA도 처리하지 않은 프로브 DNA 스팟에서 얻은 겹친 결합힘 빈도 수 지도 및 해당 조건에서 가장 크게 관찰된 클러스터의 위치(하얀색 사각형으로 표시).
도 7은 10개 이하의 표적 DNA 분자를 정량 분석한 결과이다. (a) 처리한 표적 DNA의 개수와 결합힘-지도에서 측정한 유효 클러스터의 개수의 평균값 과의 선형 관계를 나타낸 그래프, (b) 모든 샘플에서 관찰한 유효 클러스터의 평균 반지름 값 및 히스토그램. 1 is a schematic diagram showing the principle of analysis of target DNA using AFM according to the present invention.
2 is a schematic diagram of calculating a detection limit of a target DNA according to a probe DNA spot diameter according to an embodiment of the present invention.
FIG. 3 is an image of a probe DNA spot printed on (a) an etching pattern of a slide glass and (b) a pattern of a specific square among them.
FIG. 4 is a schematic diagram of (a) a schematic diagram in which the detection DNA immobilized on the cantilever tip recognizes the target DNA when the target DNA bound to the probe DNA spot surface is performing kinetic motion in an aqueous solution, (b) a force-distance curve that appears in the cluster The histogram of the coupling force value and the sag distance value measured in (c) the coupling force-map shows the shape of the cluster and the measurement radius.
5 shows a process of obtaining three consecutive quantitative images on the same probe DNA spot, correcting two-dimensional motion between images, and then obtaining an overlapped image. By collecting force-distance curves over the entire spot surface (a) successively obtaining three quantitative images of height and Young's modulus (b) measuring the positional difference between the first and second images, and the second and third images. (C) Finally, position correction is performed to obtain a quantitative image overlapping three images.
6 is a result showing the location and frequency at which a specific binding force is measured in the overlapped binding force-map through correction. (a) Three specific binding force detection maps sequentially obtained from probe DNA spots treated with 1 aM of target DNA aqueous solution, overlapping binding force frequency number map through correction, and location of effective clusters (indicated by yellow circles), ( b) A map of the frequency of overlapping binding force obtained from a probe DNA spot that has not been treated with any target DNA and the location of the cluster that was most observed under the conditions (indicated by white squares).
7 is a result of quantitative analysis of 10 or less target DNA molecules. (a) A graph showing a linear relationship between the number of processed target DNA and the average value of the number of effective clusters measured on the binding force-map, and (b) the average radius value and histogram of the effective clusters observed in all samples.
이하, 발명의 다양한 실시예에 대해 설명하기로 한다. 본 발명은 다양한 변형을 가할 수 있으며, 여러 가지 실시예를 가질 수 있으며, 하기 특정 실시예들은 단지 설명하기 위한 것이며, 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니다. 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변형물, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.Hereinafter, various embodiments of the invention will be described. Various modifications may be made to the present invention and may have various embodiments, and the following specific examples are for illustrative purposes only, and are not intended to limit the present invention to specific embodiments. It is to be understood as including all modifications, equivalents, and substitutes included in the spirit and scope of the present invention.
본 발명은 바디의 말단에 형성된 팁 및 상기 팁의 표면에 표적 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 포함하는 검출 DNA가 고정된 원자간력 현미경용 캔틸레버 및 표적 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 포함하는 프로브 DNA가 고정된 인쇄 기판을 포함하는 표적 DNA 정량분석 키트를 제공한다.The present invention relates to a cantilever for an atomic force microscope in which a tip formed at the end of the body and a nucleotide sequence capable of complementarily binding to a target DNA on the surface of the tip is fixed, and a cantilever for a target DNA is complementarily bound to the target DNA. It provides a target DNA quantitative analysis kit comprising a printed substrate to which probe DNA containing a possible nucleotide sequence is immobilized.
본 발명의 검출 DNA는 표적 DNA에 상보적으로 결합하는 염기서열을 포함하는 것으로서, 5' 말단에 아민기를 포함할 수 있다.The detection DNA of the present invention includes a nucleotide sequence that complementarily binds to the target DNA, and may include an amine group at the 5'end.
또한, 상기 검출 DNA는 표적 DNA와 프로브 DNA가 DNA/DNA 이합체를 형성한 후 남아 있는 표적 DNA의 단일가닥 일부에 대한 상보적인 염기서열을 포함할 수 있다. 상기 검출 DNA의 염기서열은 표적 DNA의 2차 구조에 영향을 받을 수 있다. 또한 상기 검출 DNA의 염기서열 및 서열의 길이는 표적 DNA와 프로브 DNA 이합체의 녹는점(melting temperature, Tm), 구아닌(guanine) 또는 사이토신(cytosine)의 함량에 영향을 받을 수 있다.In addition, the detection DNA may include a complementary nucleotide sequence for a portion of the single strand of the target DNA remaining after the target DNA and the probe DNA form a DNA/DNA dimer. The base sequence of the detection DNA may be affected by the secondary structure of the target DNA. In addition, the base sequence and length of the detection DNA may be affected by the melting temperature (Tm) of the target DNA and the probe DNA dimer, and the content of guanine or cytosine.
본 발명의 상기 프로브 DNA가 인쇄된 기판은 유리, 금속, 플라스틱, 실리콘, 실리케이트, 세라믹, 반도체, 합성 유기 금속, 합성 반도체 또는 합금에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 기판 표면에 수 십 혹은 수 백 제곱 마이크로미터 면적의 패턴을 나노미터 깊이로 식각한 후, 그 위에 프로브 DNA 스팟을 인쇄하여 만든다. 인쇄 기판의 식각은 10 ~ 900 μm2 면적, 10 ~ 900 nm 깊이로 할 수 있으나, 이에 한정하지 않고 분석 목적에 따라 조절할 수 있다. 이는 광학 현미경을 통해 찾기 어려운 프로브 DNA 스팟 위치를 지정하는 표시로 활용한다.The substrate on which the probe DNA of the present invention is printed may be selected from glass, metal, plastic, silicon, silicate, ceramic, semiconductor, synthetic organic metal, synthetic semiconductor, or alloy, but is not limited thereto. A pattern of several tens or hundreds of square micrometers on the surface of the substrate is etched to a depth of nanometers, and then a probe DNA spot is printed on it. The printed substrate may be etched in an area of 10 to 900 μm 2 and a depth of 10 to 900 nm, but is not limited thereto and may be adjusted according to the purpose of analysis. This is used as a mark to designate the probe DNA spot location that is difficult to find through an optical microscope.
상기와 같이 일정 크기의 패턴이 식각된 기판 위에 프로브 DNA 수용액의 물방울을 떨어트려 스팟 형태로 프로브 DNA가 기판 위에 균일하게 도입하도록 인쇄 한다. 상기 프로브 DNA 스팟의 지름은 100 nm ~ 10 μm 일 수 있으며, 바람직하게는 직경 2 μm 미만일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.Droplets of the aqueous probe DNA solution are dropped on the substrate on which the pattern of a predetermined size has been etched as described above, and the probe DNA is uniformly introduced onto the substrate in the form of spots. The probe DNA spot may have a diameter of 100 nm to 10 μm, preferably less than 2 μm, but is not limited thereto.
본 발명의 프로브 DNA는 3' 말단에 아민기를 포함할 수 있다.The probe DNA of the present invention may include an amine group at the 3'end.
본 발명의 정량 분석 키트는 원자간력 현미경을 더 포함할 수 있다.The quantitative analysis kit of the present invention may further include an atomic force microscope.
본 발명은 또한 인쇄 기판을 준비하는 단계, 상기 인쇄 기판에 10 ~ 900 μm2 면적, 10 ~ 900 nm 깊이의 패턴을 식각하는 단계 및 상기 식각된 패턴에 표적 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 포함하는 프로브 DNA 수용액을 떨어뜨려서 프로브 DNA 스팟을 인쇄하는 단계를 포함하는 표적 DNA 정량 분석용 인쇄 기판의 제조방법을 제공한다.The present invention also provides a step of preparing a printed substrate, etching a pattern having an area of 10 to 900 μm 2 and a depth of 10 to 900 nm on the printed substrate, and a base capable of complementarily binding to a target DNA in the etched pattern. It provides a method of manufacturing a printed substrate for quantitative analysis of target DNA comprising the step of printing a probe DNA spot by dropping an aqueous solution of probe DNA containing a sequence.
본 발명의 제조방법은 상기 기판을 식각한 후에 기판 표면에 아민 작용기를 도입하는 단계 및 아민 작용기와 선택적으로 공유 결합하는 링커를 결합시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 상기 링커로서 DSC (disuccinimidyl carbonate)를 도입하였으나, 이에 한정되지 않는다.The manufacturing method of the present invention may further include introducing an amine functional group to the surface of the substrate after etching the substrate, and coupling a linker that selectively covalently bonds with the amine functional group. In one embodiment of the present invention, DSC (disuccinimidyl carbonate) was introduced as the linker, but the present invention is not limited thereto.
본 발명의 프로브 DNA 인쇄 단계는 기판 위에 프로브 DNA 수용액을 지름 100 nm ~ 10 μm의 스팟으로 인쇄하는 것일 수 있으며, 상기 프로브 기판 위에 용이하게 고정되도록 DNA는 3' 말단에 아민기를 포함할 수 있다.The probe DNA printing step of the present invention may be to print an aqueous solution of probe DNA on a substrate as a spot having a diameter of 100 nm to 10 μm, and the DNA may include an amine group at the 3′ end so as to be easily fixed on the probe substrate.
상기 인쇄 기판은 유리, 금속, 플라스틱, 실리콘, 실리케이트, 세라믹, 반도체, 합성 유기 금속, 합성 반도체 또는 합금으로 이루어진 군에서 1 이상이 선택될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.The printed substrate may be one or more selected from the group consisting of glass, metal, plastic, silicon, silicate, ceramic, semiconductor, synthetic organic metal, synthetic semiconductor, or alloy, but is not limited thereto.
본 발명은 또한, (a) 표적 DNA가 포함된 시료를 상기 표적 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 포함하는 프로브 DNA 인쇄 기판에 접촉하여 DNA/DNA 이합체를 형성하는 혼성화 단계, (b) 상기 표적 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 포함하는 검출 DNA가 고정된 원자간력 현미경용 캔틸레버를 상기 DNA/DNA 이합체가 형성된 인쇄 기판에 접촉하여 개별 프로브 DNA 스팟 내 결합힘-지도화를 수행하는 단계 및 (c) 상기 결합힘-지도 상의 결합힘이 관찰되는 스팟에서 상기 프로브 DNA와 표적 DNA의 DNA/DNA 이합체의 존재를 검출하고, 공간적 분포를 분석하는 단계를 포함하는 표적 DNA 정량 분석 방법을 제공한다.The present invention also provides a hybridization step of (a) forming a DNA/DNA dimer by contacting a probe DNA printed substrate containing a nucleotide sequence capable of complementarily binding a target DNA to the target DNA, (b ) A cantilever for an atomic force microscope on which detection DNA containing a nucleotide sequence capable of complementarily binding to the target DNA is fixed is brought into contact with the printed substrate on which the DNA/DNA dimer is formed, and the binding force in the individual probe DNA spot-map A target DNA comprising the steps of performing the synthesis and (c) detecting the presence of a DNA/DNA dimer of the probe DNA and the target DNA at the spot where the binding force on the binding force-map is observed, and analyzing the spatial distribution Provides a quantitative analysis method.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 원자간력 현미경을 이용한 따른 표적 DNA의 정량 분석 방법을 나타낸 모식도이다.1 is a schematic diagram showing a method of quantitative analysis of a target DNA according to an atomic force microscope according to an embodiment of the present invention.
도 1에 나타난 바와 같이, 프로브 DNA 스팟에 표적 DNA를 접촉시켜 DNA/DNA 혼성화체를 형성한 후, 프로브 DNA 스팟이 인쇄된 전체 영역에 검출 DNA가 고정된 원자간력 현미경용 캔틸레버를 통과시키면서 결합힘-지도화를 수행한다. 원자간력 현미경용 캔틸레버가 프로브 DNA와 표적 DNA 이합체가 형성된 부분을 지날 때 생기는 특이적인 힘-거리 곡선을 얻을 수 있고, 이를 통해 결합힘이 관찰되는 지점에서 표적 DNA의 존재 및 위치를 확인할 수 있다.As shown in FIG. 1, after forming a DNA/DNA hybridization by contacting the target DNA with the probe DNA spot, the detection DNA is fixed to the entire area on which the probe DNA spot is printed while passing through a cantilever for an atomic force microscope. Perform force-mapping. A specific force-distance curve generated when the cantilever for atomic force microscopy passes through the portion where the probe DNA and the target DNA dimer is formed, and through this, the presence and location of the target DNA can be confirmed at the point where the binding force is observed. .
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 프로브 DNA 스팟 직경에 따른 표적 DNA의 검출 한계를 계산한 모식도이다. 2 is a schematic diagram of calculating a detection limit of a target DNA according to a probe DNA spot diameter according to an embodiment of the present invention.
도 2에 나타난 바와 같이, 2 × 2 마이크론 영역을 원자간력 현미경으로 128 × 128 픽셀 해상도로 이미지화 한다면 20 나노미터 미만의 고해상도 이미지화가 가능하기 때문에 개별 표적 DNA를 찾아내기 충분하다. 그러나 종래에는 해당 조건으로 100 마이크론 직경에 이르는 프로브 DNA 스팟 전체를 이미지화 할 수 없기 때문에 프로브 DNA 스팟 일부만을 스캔하여 표적 DNA 개수를 정량하고 그 결과를 전체 면적으로 환산하였으며, 이때 검출 한계는 fM 수준에 불과하였다. 그러나 프로브 DNA 스팟 직경이 2 마이크론 이내라면 전체 면적을 스캔할 수 있기 때문에 절대 정량이 가능하므로 단 한 개의 DNA도 놓치지 않고 aM 수준 미만의 검출이 가능하다. As shown in FIG. 2, if the 2 × 2 micron region is imaged with a 128 × 128 pixel resolution with an atomic force microscope, it is sufficient to find individual target DNA because high-resolution imaging of less than 20 nanometers is possible. However, conventionally, since the entire probe DNA spot with a diameter of 100 microns could not be imaged under the corresponding conditions, only a part of the probe DNA spot was scanned to quantify the number of target DNA and the result was converted to the total area.At this time, the detection limit is at the fM level. It was only. However, if the probe DNA spot diameter is less than 2 microns, since the entire area can be scanned, absolute quantification is possible, so it is possible to detect less than aM level without missing a single DNA.
본 발명의 표적 DNA 정량 분석 방법은 표적 DNA가 포함된 시료를 상기 표적 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 포함하는 프로브 DNA 인쇄 기판에 접촉하여 DNA/DNA 이합체를 형성하는 혼성화 단계를 포함한다.The method for quantitative analysis of target DNA of the present invention includes a hybridization step of forming a DNA/DNA dimer by contacting a sample containing a target DNA with a probe DNA printed substrate containing a nucleotide sequence capable of complementarily binding to the target DNA. do.
수 십 마이크로 리터의 부피의 시료를 담지할 수 있는 우물 패턴을 갖는 유리 슬라이드 형태의 혼성화 챔버(chamber)에 표적 DNA 시료를 넣고, 그 위에 프로브 DNA 스팟을 인쇄한 기판을 덮는다. 주어진 시간 및 온도 조건 하에서 효과적으로 혼성화가 일어나도록 혼성화 챔버-기판의 결합체를 반복적으로 회전함으로써 표적 DNA를 프로브 DNA 스팟 영역에 포집할 수 있다.A target DNA sample is placed in a hybridization chamber in the form of a glass slide having a well pattern capable of holding a sample of several tens of microliters, and the substrate on which the probe DNA spot is printed is covered. Target DNA can be captured in the probe DNA spot region by repeatedly rotating the hybridization chamber-substrate conjugate to effectively hybridize under a given time and temperature condition.
본 발명의 상기 표적 DNA가 포함된 시료는 표적 DNA가 1aM 이하 농도로 포함된 것일 수 있으며, 바람직하게는 10 zM ~ 1 aM 농도인 것이 좋다. The sample containing the target DNA of the present invention may contain the target DNA at a concentration of 1 aM or less, preferably 10 zM to 1 aM.
이때 표적 DNA와 프로브 DNA 이합체의 녹는점이 표적 DNA와 검출 DNA의 이합체의 녹는점보다 높도록 프로브 DNA 염기서열을 결정할 수 있다. 이때 프로브 DNA와 검출 DNA가 표적 DNA를 인식하는 영역이 겹치지 않고 두 영역 사이에 충분한 거리가 있다. 따라서 스팟 내에 포집한 표적 DNA를 캔틸레버에 도입된 검출 DNA와의 결합힘을 이용하여 수직으로 당길 때 이합체를 형성하지 않고 남아있는 표적 DNA의 단일 가닥 부분이 탄력적으로 늘어날 수 있다. 이를 통해 특이적인 늘어짐 길이(stretching distance)와 결합힘을 보이는 힘-거리 곡선을 얻을 수 있고, 이는 비 특이적인 결합을 구별하는데 사용한다.At this time, the probe DNA sequence may be determined so that the melting point of the target DNA and the probe DNA dimer is higher than the melting point of the target DNA and the detection DNA dimer. At this time, the regions where the probe DNA and the detection DNA recognize the target DNA do not overlap, and there is a sufficient distance between the two regions. Therefore, when the target DNA collected in the spot is pulled vertically using the binding force with the detection DNA introduced into the cantilever, the single stranded portion of the target DNA remaining without forming a dimer can be elastically stretched. Through this, a force-distance curve showing specific stretching distance and binding force can be obtained, which is used to distinguish non-specific binding.
다음으로, 본 발명에 따른 표적 DNA 정량 분석 방법은 상기 표적 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 포함하는 검출 DNA가 고정된 원자간력 현미경용 캔틸레버를 상기 DNA/DNA 이합체가 형성된 인쇄 기판에 접촉하여 개별 프로브 DNA 스팟 내 결합힘-지도화를 수행하는 단계를 포함한다.Next, the method for quantitative analysis of target DNA according to the present invention includes a cantilever for an atomic force microscope on which detection DNA including a nucleotide sequence capable of complementary binding to the target DNA is fixed, and the printed substrate on which the DNA/DNA dimer is formed. Contacting and performing binding force-mapping in individual probe DNA spots.
상기 힘-거리 곡선을 스팟 영역 내에서 무작위로 수집하면 특이적인 결합 힘을 발견할 수 있고, 이때 특이적인 결합힘이 관찰된 위치에서 수 나노미터의 픽셀 간격으로 힘-거리 곡선을 수집하여 단일 표적 DNA의 결합힘-지도를 얻는다. 지도 상에 나타난 단일 표적 DNA 이미지의 반지름(cluster radius)을 계산하여 평균화한다. 측정한 반지름 값을 바탕으로 프로브 DNA 스팟 전체 영역을 스캔하는데 적용할 최적의 픽셀 크기를 결정함으로써 캔틸레버가 표면 위에 존재하는 표적 DNA의 위치를 놓치지 않고 조사할 수 있도록 한다. 또한 위양성 이미지를 구별하기 위한 임계 값으로 클러스터의 반지름 값을 활용할 수 있다.When the force-distance curve is randomly collected within the spot area, a specific binding force can be found, and at this time, the force-distance curve is collected at a pixel interval of several nanometers at the position where the specific binding force is observed to be a single target. Get the binding force-map of the DNA. The cluster radius of the single target DNA image displayed on the map is calculated and averaged. By determining the optimal pixel size to be applied to scan the entire area of the probe DNA spot based on the measured radius value, the cantilever can investigate the location of the target DNA existing on the surface without missing. In addition, the radius value of the cluster can be used as a threshold value for distinguishing false positive images.
다음으로, 본 발명의 표적 DNA 정량 분석 방법은 상기 결합힘-지도 상의 결합힘이 관찰되는 스팟에서 상기 프로브 DNA와 표적 DNA의 DNA/DNA 이합체의 존재를 검출하고, 공간적 분포를 분석하는 단계를 포함한다.Next, the method of quantifying target DNA of the present invention includes the step of detecting the presence of a DNA/DNA dimer of the probe DNA and the target DNA at the spot where the binding force on the binding force-map is observed, and analyzing the spatial distribution. do.
본 발명의 공간적 분포 분석은 시료 내 결합힘이 관찰되는 DNA/DNA 이합체의 개수를 카운팅하여 수행될 수 있다.The spatial distribution analysis of the present invention may be performed by counting the number of DNA/DNA dimers in which the binding force in the sample is observed.
상기 공간적 분포 분석에 있어서 분석의 신호 대 잡음 비를 높이기 위해 상기 이합체의 위치는 동일 프로브 DNA 스팟에서 연속적으로 얻은 여러 개의 힘-지도를 겹친 결과를 바탕으로 결정한다. In the spatial distribution analysis, in order to increase the signal-to-noise ratio of the analysis, the position of the dimer is determined based on the result of overlapping several force-maps successively obtained from the same probe DNA spot.
구체적으로 상기 DNA/DNA 이합체의 개수를 카운팅하는 방법은 동일 프로브 DNA 스팟 내에서 연속적으로 복수 개의 결합힘-지도를 얻는 단계, 상기 복수 개의 결합힘-지도를 겹쳤을 때 2 이상의 인접한 픽셀에서 특이적인 결합힘이 관찰되는 클러스터를 분리하는 단계, 상기 분리된 클러스터 중 동일 픽셀에서 2회 이상 반복적으로 특이적인 결합힘이 관찰되는 클러스터를 분리하는 단계 및 상기 복수 개의 픽셀이 겹쳐서 생기는 픽셀 클러스터 중 직경이 단일 표적 DNA 클러스터 직경 이상의 크기를 갖는 클러스터를 DNA/DNA 이합체가 존재하는 위치로 결정하고 그의 개수를 카운팅하는 단계를 포함한다.Specifically, the method of counting the number of DNA/DNA dimers is the step of obtaining a plurality of binding force-maps in succession within the same probe DNA spot, and when the plurality of binding force-maps are overlapped, specific in two or more adjacent pixels. Separating a cluster in which a bonding force is observed, separating a cluster in which a specific bonding force is repeatedly observed two or more times in the same pixel among the separated clusters, and a pixel cluster generated by overlapping the plurality of pixels having a single diameter Determining a cluster having a size equal to or larger than the target DNA cluster diameter as a location where the DNA/DNA dimer is present and counting the number thereof.
결합힘이 관찰되는 픽셀 클러스터란, 픽셀의 인접 무리를 의미하는 것으로, 클러스터의 면적이 표적 DNA의 평균적인 동역학적 거동 반지름에 부합하는 크기일 경우 해당 위치에 DNA/DNA 이합체가 존재하는 것으로 결정할 수 있어 표적 DNA의 공간적 분포 분석이 가능하다. The pixel cluster in which the binding force is observed refers to an adjacent group of pixels.If the area of the cluster is a size corresponding to the average radius of dynamic behavior of the target DNA, it can be determined that a DNA/DNA dimer exists at the corresponding position. So it is possible to analyze the spatial distribution of the target DNA.
상기 공간적 분포 분석은 특정 영역의 결합힘-지도화를 1 내지 10회, 바람직하게는 2 내지 6회, 더욱 바람직하게는 3회 내지 5회 수행한 평균 값으로 결정하는 경우, 더욱 정확한 값을 얻을 수 있다.When the spatial distribution analysis is determined by the average value of 1 to 10 times, preferably 2 to 6 times, more preferably 3 to 5 times, the binding force-mapping of a specific area is performed, a more accurate value can be obtained. I can.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, a preferred embodiment is presented to aid the understanding of the present invention. However, the following examples are provided for easier understanding of the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the following examples.
실시예Example 1: 검출 DNA가 고정된 1: detection DNA is immobilized 캔틸레버의Cantilever 제조 Produce
JPK Instruments사의 원자간력 현미경 장비를 사용하였다. 사용한 캔틸레버는 NanoInk 사의 DPN Probe Type B이며 평균 약 30 ~ 40 pN/nm의 용수철 상수를 갖는다.Atomic force microscope equipment manufactured by JPK Instruments was used. The cantilever used is NanoInk's DPN Probe Type B and has a spring constant of about 30 ~ 40 pN/nm on average.
검출 DNA를 고정하기 위해 캔틸레버를 세척하고 실릴화(silylation) 처리 후 나노콘 분자를 코팅하여 팁 표면에 아민 작용기가 균일하게 도입되도록 유도하였다. 그런 다음 1차 아민과 선택적으로 공유 결합하는 이작용기 링커로서 DSC(disuccinimidyl carbonate)를 표면에 도입하였다. 이어서 5’말단에 아민기가 붙어있는 검출 DNA(5'-NH2-(CH2)6-GTC CAG AGT GGA GGG AGA AC-3': 서열번호 1) 수용액을 처리하여 최종적으로 검출 DNA를 팁 말단에 부착한 캔틸레버를 생산하였다.In order to fix the detection DNA, the cantilever was washed, and after silylation treatment, nanocon molecules were coated to induce an amine functional group to be uniformly introduced to the tip surface. Then, DSC (disuccinimidyl carbonate) was introduced to the surface as a bifunctional linker that selectively covalently bonds with the primary amine. Subsequently, detection DNA with an amine group attached to the 5'end (5'-NH 2 -(CH 2 ) 6 -GTC CAG AGT GGA GGG AGA AC-3': SEQ ID NO: 1) was treated with an aqueous solution to finally detect DNA at the tip end. A cantilever attached to was produced.
실시예Example 2: 2: 프로브Probe DNA DNA 스팟Spot 제작 making
2-1. 유리 슬라이드 2-1. Glass slide 식각Etching
유도 결합 플라즈마(inductively coupled plasma)를 이용하여 200 nm 의 깊이와 20 μm × 20 μm 크기를 가지는 사각형 패턴을 식각하였다.A square pattern having a depth of 200 nm and a size of 20 μm × 20 μm was etched using an inductively coupled plasma.
2-2. 2-2. 프로브Probe DNA DNA 스팟Spot 프린팅 Printing
고체 표면의 특정 영역에 프로브 DNA를 고정하여 프로브 DNA 스팟을 제작하기 위해 유리 슬라이드를 사용하였다. 상기 유리 슬라이드를 세척하고 실릴화(silylation) 처리 후 나노콘 분자를 코팅하여 팁 표면에 아민 작용기가 균일하게 도입하도록 유도하였다. 그런 다음 1차 아민과 선택적으로 공유 결합하는 이작용기 링커로서 DSC (disuccinimidyl carbonate)를 표면에 도입하였다. 그리고 3’말단에 아민기가 붙어있는 프로브 DNA(5'-GAC CAT CAA TAA GGA AGA AGC CCT TCA GAG GCC AGT AGC A-(CH2)6-NH2-3': 서열번호 2)를 표면에 고정한다. 이때 유리 슬라이드에 프로브 DNA 스팟을 생성하기 위해 Nanosurf사의 FluidFM을 사용하였다. 사용하는 캔틸레버 내부에는 마이크로 채널이 있어 프로브 DNA 수용액(30 mM sodium citrate, 300 mM NaCl, 12.5% glycerol)을 채워 넣을 수 있다. 또한 캔틸레버의 팁 말단에 약 300 nm의 구멍이 뚫려 있어 이곳으로 수용액을 배출할 수 있다. 프로브 DNA 스팟의 지름을 약 2 μm 미만으로 조절하여 유리 슬라이드에 프린트 하였다. 프로브 DNA 스팟의 예를 도 3의 (b)에 도시하였다. 도 3의 (b)는 20 μm × 20 μm 크기로 식각된 유리 슬라이드 표면에 생성된 프로브 DNA 스팟의 형태를 원자간력 현미경을 이용해서 얻은 표면 이미지이다. 프로브 DNA를 프린트한 유리 슬라이드는 40℃ 의 세척 용액(30 mM sodium citrate, 300 mM NaCl, 0.2% sodium dodecyl sulfate)에 20분간 담그고 잔여물을 씻어내어 완성하였다.A glass slide was used to prepare a probe DNA spot by immobilizing the probe DNA on a specific area of the solid surface. The glass slide was washed, and after silylation treatment, nanocone molecules were coated to induce uniform introduction of amine functional groups to the tip surface. Then, DSC (disuccinimidyl carbonate) was introduced to the surface as a bifunctional linker that selectively covalently bonds with the primary amine. And probe DNA with an amine group attached to the 3'end (5'-GAC CAT CAA TAA GGA AGA AGC CCT TCA GAG GCC AGT AGC A-(CH 2 ) 6 -NH 2 -3': SEQ ID NO: 2) was fixed on the surface. do. At this time, Nanosurf's FluidFM was used to create a probe DNA spot on the glass slide. There is a microchannel inside the cantilever to be used, so that the probe DNA aqueous solution (30 mM sodium citrate, 300 mM NaCl, 12.5% glycerol) can be filled. In addition, there is a hole of about 300 nm in the tip end of the cantilever, so that the aqueous solution can be discharged there. The diameter of the probe DNA spot was adjusted to less than about 2 μm and printed on a glass slide. An example of the probe DNA spot is shown in Fig. 3B. 3B is a surface image obtained by using an atomic force microscope of the shape of a probe DNA spot generated on the surface of a glass slide etched to a size of 20 μm × 20 μm. The glass slide printed with the probe DNA was immersed in a washing solution (30 mM sodium citrate, 300 mM NaCl, 0.2% sodium dodecyl sulfate) at 40° C. for 20 minutes, and the residue was washed off to complete it.
실시예Example 3: 표적 DNA 정량 분석법 3: Target DNA quantification method
3-1. 표적 DNA 3-1. Target DNA 혼성화Hybridization
표적 DNA로 만성 골수성 백혈병의 생체 표지자인 BCR - ABL 유전자의 일부 시퀀스(5'-TGC TAC TGG CCG CTG AAG GGC TTC TTC CTT ATT GAT GGT CAG CGG AAT GCT GTG GAC AGT CTG GAG TTT CAC ACA CGA GTT GGT CAG CAT CTG CAG CTC CAC GGA TGT CAG GGA GAA GCT TCT GAA ACA CTT CTT CTG CTG CTC CCG GAT GTT CTC CCT CCA CTC TGC AC- 3': 서열번호 3)를 합성 제작하였다. 40 zM(1 copy), 80 zM(2 copies), 200 zM(5 copies), 400 zM(10 copies), 1 aM(24 copies) 의 농도를 갖는 각각의 표적 DNA 수용액 40 μl를 95℃ 에 3분 간 열처리 한 후 혼성화 챔버에 떨어뜨렸다. 상기 실시예 2의 프로브 DNA 스팟이 인쇄된 유리 슬라이드를 혼성화 챔버 위에 덮어 결합한 채로 52℃ 에서 24시간 동안 용액을 프로브 DNA 스팟 주변을 움직일 수 있도록 회전시켰다. 반응이 끝난 유리 슬라이드는 72℃ 에서 20분간 세척 완충용액에 담그고 잔여물을 씻어내었다. A partial sequence of the BCR - ABL gene, a biomarker of chronic myelogenous leukemia as a target DNA (5'-TGC TAC TGG CCG CTG AAG GGC TTC TTC CTT ATT GAT GGT CAG CGG AAT GCT GTG GAC AGT CTG GAG TTT CAC ACA CGA GTT GGT CAG CAT CTG CAG CTC CAC GGA TGT CAG GGA GAA GCT TCT GAA ACA CTT CTT CTG CTG CTC CCG GAT GTT CTC CCT CCA CTC TGC AC-3': SEQ ID NO: 3) was synthesized. 40 μl of each target DNA aqueous solution having a concentration of 40 zM (1 copy), 80 zM (2 copies), 200 zM (5 copies), 400 zM (10 copies), and 1 aM (24 copies) was added at 95°C for 3 After heat treatment for a minute, it was dropped into the hybridization chamber. The glass slide on which the probe DNA spot of Example 2 was printed was covered and bound on the hybridization chamber, and the solution was rotated so as to move around the probe DNA spot for 24 hours at 52°C. The glass slide after the reaction was immersed in a washing buffer solution at 72° C. for 20 minutes, and the residue was washed off.
3-2. 3-2. 프로브Probe DNA에 On DNA 혼성화Hybridization 한 단일 표적 DNA의 동역학적 거동 범위 분석 Analysis of the range of dynamic behavior of a single target DNA
원자간력 현미경으로 PBS(phosphate buffered saline) 수용액 내에서 상기 실시예 1에서 제조한 검출 DNA를 부착한 캔틸레버를 이용하여 표적 DNA가 혼성화 한 프로브 DNA 스팟을 조사하였으며, 그 모식도를 도 4(a)에 나타내었다. 캔틸레버가 접촉한 위치에 표적 DNA가 존재할 때 검출 DNA와 표적 DNA 간의 상호작용을 나타내는 특이적인 힘-거리 곡선을 관찰할 수 있었다. 단일 표적 DNA의 동역학적 거동 범위와 특이적인 힘-거리 곡선을 분석하기 위해 표적 DNA가 존재하는 위치에서 8 nm의 분해능으로 결합힘-지도를 얻었다.A probe DNA spot hybridized with the target DNA was investigated using a cantilever to which the detection DNA prepared in Example 1 was attached in an aqueous solution of PBS (phosphate buffered saline) under an atomic force microscope, and a schematic diagram of FIG. 4(a) Shown in. When the target DNA was present at the location in contact with the cantilever, a specific force-distance curve indicating the interaction between the detection DNA and the target DNA could be observed. In order to analyze the dynamic behavior range and specific force-distance curve of a single target DNA, a binding force-map was obtained with a resolution of 8 nm at the location of the target DNA.
도 4(b)는 검출 DNA와 표적 DNA-프로브 DNA 혼성화체의 상보적인 서열 사이의 결합에 따른 힘-거리 곡선과 결합힘과 결합거리의 히스토그램을 나타낸 것이다.FIG. 4(b) shows a force-distance curve according to binding between a detection DNA and a complementary sequence of a target DNA-probe DNA hybrid, and a histogram of the binding force and binding distance.
도 4(b)에 도시한 힘-거리 곡선과 결합힘, 결합 거리의 히스토그램은 BCR - ABL 유전자중 일부를 대상으로 하여 얻은 값으로서, 도 4(b)의 히스토그램을 Gaussian 분포에 피팅(fitting)함으로써 결합힘과 결합 거리의 대표 값을 각각 30.8 피코뉴튼, 13.9 나노미터로 구할 수 있었다. 힘-거리 곡선의 형태에 따라 특이적인 결합힘과 비특이적인 결합힘을 구분할 수 있다. The histogram of the force-distance curve, the coupling force, and the coupling distance shown in Fig. 4(b) is a value obtained for some of the BCR - ABL genes, and the histogram of Fig. 4(b) is fitted to the Gaussian distribution. By doing so, the representative values of the bonding force and the bonding distance could be obtained as 30.8 piconewtons and 13.9 nanometers, respectively. Depending on the shape of the force-distance curve, specific binding forces and non-specific binding forces can be distinguished.
도 4(c)에 나타낸 바와 같이 단일 표적 DNA의 이미지를 결합힘 값, 늘어짐 거리 값, 타원 피팅의 결과 값을 정량적으로 지도에 표시하였다. 단일 표적 DNA 클러스터의 반지름을 측정하기 위해 사용된 방법은 타원 피팅 방법으로서, 구체적으로 먼저 각 위치 별로 3개 또는 6개의 이미지를 얻은 뒤, 3개의 연속적인 이미지를 겹쳐서 연속적으로 두 번 또는 한 번의 힘이 측정된 부분을 얻었다. 총 3개의 다른 위치에서 5개의 겹친 이미지를 얻을 수 있었고, 이때 얻은 클러스터의 평균 반지름의 크기는 29.9 nm였다. 이를 기준으로 하여 다른 힘-지도에서도 클러스터의 크기를 통해 단일 표적 DNA를 판단하고 정량적인 분석을 수행하였다.As shown in Fig. 4(c), the binding force value, the sagging distance value, and the result value of ellipse fitting were quantitatively displayed on the map as an image of a single target DNA. The method used to measure the radius of a single target DNA cluster is an ellipse fitting method. Specifically, first, 3 or 6 images are obtained for each position, and then 3 consecutive images are superimposed to make two or one force in succession. This measured part was obtained. Five overlapping images were obtained from a total of three different positions, and the average radius of the obtained cluster was 29.9 nm. Based on this, a single target DNA was determined through the size of the cluster in other force-maps and quantitative analysis was performed.
3-3. 다양한 농도의 표적 DNA를 처리한 3-3. Processing various concentrations of target DNA 프로브Probe DNA DNA 스팟에서At the spot 결합힘Bonding -지도 분석-Map analysis
원자간력 현미경의 결합힘-지도 픽셀 수(128 × 128 pixels)를 고려하여 프로브 DNA 스팟 전체를 아우르는 스캔 범위를 2.00 μm × 2.00 μm 부터 2.35 μm × 2.35 μm 이내로 설정함으로써 분해능이 15.6 nm 에서 최대 18.4 nm 가 되도록 하였다. 이는 앞서 3-2에서 확인한 단일 표적 DNA의 동역학적 거동 반지름보다 충분히 작아 지도 상에서 표적 DNA의 위치를 놓치지 않을 수 있다. 해당 조건으로 동일 프로브 DNA 스팟에서 3장의 연속적인 결합힘-지도를 얻었다.By setting the scan range covering the entire probe DNA spot within the range of 2.00 μm × 2.00 μm to 2.35 μm × 2.35 μm, taking into account the number of binding force-map pixels (128 × 128 pixels) of the atomic force microscope, the resolution is up to 18.4 at 15.6 nm. nm. This is sufficiently smaller than the radius of kinetic behavior of the single target DNA identified in 3-2, so that the position of the target DNA on the map can not be missed. Under the corresponding conditions, three consecutive binding force-maps were obtained from the same probe DNA spot.
3장의 결합힘-지도를 겹쳐서 특이적인 힘-거리 곡선이 검출된 위치를 명확히 하였다. 먼저 결합힘-지도를 얻는 동안 함께 얻을 수 있는 프로브 DNA 스팟의 높이 이미지와 영의 계수 이미지를 분석한 후 첫 번째와 두 번째, 그리고 두 번째와 세 번째 이미지를 비교하여 스캔 시간으로 인해 발생한 이미지 간의 틀어짐 정도를 측정하고 보정하였다. 그 결과 도 5에 나타낸 바와 같이 3 장의 이미지를 겹친 프로브 DNA 스팟 이미지를 얻을 수 있다.The three combined force-maps were superimposed to clarify the location where the specific force-distance curve was detected. First, analyze the height image and Young's modulus image of the probe DNA spot that can be obtained together while obtaining the binding force-map, and then compare the first and second, and the second and third images to determine the difference between the images caused by the scan time. The degree of distortion was measured and corrected. As a result, as shown in Fig. 5, a probe DNA spot image in which three images are overlapped can be obtained.
도 6(a)에 도시된 1 aM의 표적 DNA의 결합힘-지도 결과는 연속적으로 얻은 3개의 결함힘-지도와 이를 겹쳤을 때 관찰되는 클러스터를 나타낸 이미지이다. 결합힘이 한 번 관찰된 픽셀을 녹색, 두 번 이상 연속적으로 결합힘이 관찰된 픽셀은 붉은색으로 나타내었다. 두 번 이상 연속적으로 힘이 나타나고, 반지름이 26.0 nm 이상인 클러스터는 17개가 관찰되었다. 한편, 도 6(b)의 경우 표적 DNA를 혼성화 하지 않은 프로브 DNA 스팟에서 얻는 결합힘-지도를 나타내었는데, 대조적으로 9개의 스팟을 확인했을 때 하나의 클러스터만이 관찰되었다.The binding force-map result of 1 aM target DNA shown in FIG. 6(a) is an image showing three defect force-maps obtained in succession and clusters observed when overlapping them. The pixels in which the bonding force was observed once were shown in green, and the pixels in which the bonding force was observed twice or more in succession was shown in red. The force appeared more than twice in succession, and 17 clusters with a radius of 26.0 nm or more were observed. On the other hand, in the case of FIG. 6(b), the binding force-map obtained from the probe DNA spot that did not hybridize the target DNA was shown. In contrast, when nine spots were identified, only one cluster was observed.
다음으로, 1 aM 이외의 다른 농도의 표적 DNA가 혼성화된 스팟에서 결합힘-지도화를 수행하고 결과를 분석하였다. 0 M, 40 zM, 80 zM, 200 zM, 400 zM의 농도를 가지는 표적 DNA를 프로브 DNA 스팟에 혼성화 한 후 결함힘-지도를 통해 반복적인 분석을 수행하였다. 매우 낮은 농도인 40 zM의 표적 DNA 분석의 경우, 정량에 영향을 끼칠 수 있는 여러 가지 조건을 고려하여 9번의 각각 다른 분석을 수행하였고, 더 높은 농도의 경우에는 5번 또는 3번의 각각 다른 분석을 수행하였다. 클러스터의 반지름이 26.0 nm 보다 큰 경우에만 클러스터에 포함을 시켜 클러스터 숫자를 파악하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.Next, binding force-mapping was performed at a spot in which a target DNA of a concentration other than 1 aM was hybridized, and the results were analyzed. Target DNA having a concentration of 0 M, 40 zM, 80 zM, 200 zM, and 400 zM was hybridized to the probe DNA spot, and then repeated analysis was performed through a defect force-map. In the case of the target DNA analysis of 40 zM, which is a very low concentration, 9 different analyzes were performed in consideration of various conditions that may affect the quantification, and 5 or 3 different analyzes were performed for higher concentrations. Performed. Only when the radius of the cluster is larger than 26.0 nm was included in the cluster to determine the number of clusters, and the results are shown in Table 1 below.
[표1] 표적 DNA의 농도에 따라 관찰된 클러스터의 수[Table 1] Number of clusters observed according to the concentration of target DNA
그 결과 표적 DNA의 분자가 하나만 존재하는 40 zM의 경우 9개의 스팟 중 2개의 스팟에서 각각 1개의 클러스터가 관찰되었고, 표적 DNA 분자가 2개 존재하는 80 zM의 경우에는 5개의 스팟 중 2개의 스팟에서 각각 1개, 2개의 클러스터가 관찰되었다. 표적 DNA 분자가 5개, 10개 존재하는 경우에는 모든 스팟에서 클러스터가 관찰되었고, 관찰된 클러스터의 평균값은 각각 2.4, 4.7로 나타났다.As a result, in the case of 40 zM with only one target DNA molecule, one cluster was observed in two of the nine spots, and in the case of 80 zM with two target DNA molecules, two of the five spots In each, 1 and 2 clusters were observed. When 5 and 10 target DNA molecules were present, clusters were observed in all spots, and the average values of the observed clusters were 2.4 and 4.7, respectively.
도 7에 표적 DNA의 분자 수와 분석 결과의 클러스터 수의 상관관계를 도시 하였다. 두 결과 값은 선형의 강한 상관관계를 나타내고 있으며(선형회귀모형, R2 = 0.994), 관찰된 클러스터의 평균 반지름 값은 32.6 nm 이었다. 이를 통해 매우 낮은 농도의 DNA도 증폭, 변형, 형광 표지 없이 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다.7 shows the correlation between the number of molecules of the target DNA and the number of clusters in the analysis result. The two results showed a strong linear correlation (linear regression model, R 2 = 0.994), and the average radius value of the observed clusters was 32.6 nm. Through this, it was confirmed that even very low concentrations of DNA can be detected without amplification, modification, or fluorescent labeling.
<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> METHOD AND APPARATUS FOR ULTRASENSITIVE QUANTIFICATION OF DNA BIOMARKER <130> 1064816 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> detection DNA <400> 1 gtccagagtg gagggagaac 20 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe DNA <400> 2 gaccatcaat aaggaagaag cccttcagag gccagtagca 40 <210> 3 <211> 170 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a part of BCR-ABL gene as a biomarker <400> 3 tgctactggc cgctgaaggg cttcttcctt attgatggtc agcggaatgc tgtggacagt 60 ctggagtttc acacacgagt tggtcagcat ctgcagctcc acggatgtca gggagaagct 120 tctgaaacac ttcttctgct gctcccggat gttctccctc cactctgcac 170 <110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> METHOD AND APPARATUS FOR ULTRASENSITIVE QUANTIFICATION OF DNA BIOMARKER <130> 1064816 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> detection DNA <400> 1 gtccagagtg gagggagaac 20 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe DNA <400> 2 gaccatcaat aaggaagaag cccttcagag gccagtagca 40 <210> 3 <211> 170 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a part of BCR-ABL gene as a biomarker <400> 3 tgctactggc cgctgaaggg cttcttcctt attgatggtc agcggaatgc tgtggacagt 60 ctggagtttc acacacgagt tggtcagcat ctgcagctcc acggatgtca gggagaagct 120 tctgaaacac ttcttctgct gctcccggat gttctccctc cactctgcac 170
Claims (16)
표적 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 포함하는 프로브 DNA가 지름 100 nm ~ 10 μm의 스팟으로 고정된 인쇄 기판을 포함하는 표적 DNA 정량 분석 키트.
A cantilever for an atomic force microscope in which detection DNAs including a tip formed at the distal end of the body and a base sequence capable of binding complementarily to the target DNA on the surface of the tip are immobilized; And
A target DNA quantitation kit comprising a print substrate on which a probe DNA comprising a base sequence capable of binding complementarily to a target DNA is fixed with a spot having a diameter of 100 nm to 10 μm.
상기 프로브 DNA는 기판 위에 10 ~ 900 μm2 면적, 10 ~ 900 nm 깊이로 식각된 패턴 상에 인쇄되는 것을 특징으로 하는 표적 DNA 정량 분석 키트.
The method according to claim 1,
The probe DNA is the target DNA quantitation kit, characterized in that to be printed on the pattern etched in 10 ~ 900 μm 2 area, 10 ~ 900 nm depth on the substrate.
상기 프로브 DNA는 3' 말단에 아민기를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 DNA 정량 분석 키트.
The method according to claim 1,
Wherein the probe DNA comprises an amine group at the 3 'terminus.
상기 인쇄 기판은 유리, 금속, 플라스틱, 실리콘, 실리케이트, 세라믹, 반도체, 합성 유기 금속, 합성 반도체 및 합금으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상인 것을 특징으로 하는 표적 DNA 정량 분석 키트.
The method according to claim 1,
Wherein the printed substrate is at least one selected from the group consisting of glass, metal, plastic, silicon, silicate, ceramic, semiconductor, synthetic organic metal, synthetic semiconductors and alloys.
상기 검출 DNA는 5' 말단에 아민기를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 DNA 정량 분석 키트.
The method according to claim 1,
Wherein the detection DNA comprises an amine group at the 5 'terminus.
상기 키트는 원자간력 현미경을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 DNA 정량분석 키트.
6. The method according to any one of claims 1 to 5,
Wherein the kit further comprises an atomic force microscope.
상기 인쇄 기판에 10 ~ 900 μm2 면적, 10 ~ 900 nm 깊이의 패턴을 식각하는 단계; 및
상기 식각된 패턴에 표적 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 포함하는 프로브 DNA 수용액을 지름 100 nm ~ 10 μm의 스팟으로 떨어뜨려서 프로브 DNA 스팟을 인쇄하는 단계를 포함하는 표적 DNA 정량 분석용 인쇄 기판의 제조방법.
Preparing a printed board;
The printed board 10 ~ 900 μm 2 in area, the method comprising: etching a pattern of 10 ~ 900 nm deep; And
A step of printing a probe DNA spot by dropping a probe DNA aqueous solution containing a base sequence complementary to the target DNA in the etched pattern onto a spot having a diameter of 100 nm to 10 μm, A method of manufacturing a printed substrate.
상기 프로브 DNA는 3' 말단에 아민기를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 DNA 정량 분석용 인쇄 기판의 제조방법.
8. The method of claim 7,
Wherein the probe DNA comprises an amine group at the 3 'terminus.
상기 인쇄 기판은 유리, 금속, 플라스틱, 실리콘, 실리케이트, 세라믹, 반도체, 합성 유기 금속, 합성 반도체 및 합금으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상인 것을 특징으로 하는 표적 DNA 정량 분석용 인쇄 기판의 제조방법.
8. The method of claim 7,
Wherein the printed substrate is at least one selected from the group consisting of glass, metal, plastic, silicon, silicate, ceramic, semiconductor, synthetic organic metal, synthetic semiconductor and alloy.
상기 기판을 식각한 후에 기판 표면에 아민 작용기를 도입하는 단계 및 아민 작용기와 선택적으로 공유 결합하는 링커를 결합시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 DNA 정량 분석용 인쇄 기판의 제조방법.
8. The method of claim 7,
Introducing an amine functional group onto the surface of the substrate after etching the substrate, and bonding a linker that selectively covalently binds the amine functional group to the surface of the substrate.
(b) 표적 DNA가 10 zM ~ 1 aM 농도로 포함된 시료를 상기 프로브 DNA 인쇄 기판에 접촉하여 DNA/DNA 이합체를 형성하는 혼성화 단계;
(c) 상기 표적 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 포함하는 검출 DNA가 고정된 원자간력 현미경용 캔틸레버를 상기 DNA/DNA 이합체가 형성된 인쇄 기판에 접촉하여 개별 프로브 DNA 스팟 내 결합힘-지도화를 수행하는 단계; 및
(d) 상기 결합힘-지도 상의 결합힘이 관찰되는 스팟에서 상기 프로브 DNA와 표적 DNA의 DNA/DNA 이합체의 존재를 검출하고, 공간적 분포를 분석하는 단계를 포함하는 표적 DNA 정량 분석 방법.
(a) preparing a printed substrate on which a probe DNA comprising a base sequence capable of complementarily binding with a target DNA is fixed with a spot having a diameter of 100 nm to 10 μm;
(b) hybridizing a sample containing the target DNA at a concentration of 10 zM to 1 aM to the probe DNA print substrate to form a DNA / DNA duplex;
(c) contacting a cantilever for an atomic force microscope with a detection DNA containing a base sequence complementary to the target DNA to a printed substrate on which the DNA / DNA duplex is formed, Performing a mapping; And
(d) detecting the presence of the DNA / DNA duplex of the probe DNA and the target DNA at the spot where the binding force on the binding force-map is observed, and analyzing the spatial distribution.
상기 프로브 DNA는 10 ~ 900 μm2 면적, 10 ~ 900 nm 깊이로 식각된 패턴 상에 인쇄되는 것을 특징으로 하는 표적 DNA 정량 분석 방법.
12. The method of claim 11,
Wherein the probe DNA is printed on a pattern etched to a depth of 10 to 900 nm and an area of 10 to 900 μm 2 .
상기 (c) 단계의 결합힘-지도화 수행 단계는 상기 원자간력 현미경용 캔틸레버가 접촉한 위치에서 상기 검출 DNA와 표적 DNA 사이의 상호작용으로 나타나는 특이적인 힘-거리 곡선을 측정함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 표적 DNA 정량 분석 방법.
12. The method of claim 11,
The coupling-force mapping step of step (c) may be performed by measuring a specific force-distance curve that appears as the interaction between the detection DNA and the target DNA at the position where the cantilever for atomic force microscopy comes into contact Characterized in that the target DNA is quantitatively analyzed.
상기 (d) 단계의 공간적 분포 분석은 시료 내 결합힘이 관찰되는 DNA/DNA 이합체의 개수를 카운팅하여 수행되는 것인 표적 DNA 정량 분석 방법.
12. The method of claim 11,
Wherein the spatial distribution analysis of step (d) is performed by counting the number of DNA / DNA duplexes in which the binding force in the sample is observed.
상기 DNA/DNA 이합체의 개수를 카운팅하는 방법은
동일 프로브 DNA 스팟 내에서 연속적으로 복수 개의 결합힘-지도를 얻는 단계;
상기 복수 개의 결합힘-지도를 겹쳤을 때 2 이상의 인접한 픽셀에서 특이적인 결합힘이 관찰되는 클러스터를 분리하는 단계;
상기 분리된 클러스터 중 동일 픽셀에서 2회 이상 반복적으로 특이적인 결합힘이 관찰되는 클러스터를 분리하는 단계; 및
상기 복수 개의 픽셀이 겹쳐서 생기는 픽셀 클러스터 중 직경이 단일 표적 DNA 클러스터 직경 이상의 크기를 갖는 클러스터의 개수를 카운팅하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 DNA 정량 분석 방법.
15. The method of claim 14,
The method of counting the number of DNA / DNA duplexes
Obtaining a plurality of binding force maps in succession in the same probe DNA spot;
Separating clusters in which a specific binding force is observed at two or more adjacent pixels when the plurality of binding force-maps are overlapped;
Separating the clusters in which the specific binding force is repeatedly observed twice or more at the same pixel among the separated clusters; And
Counting the number of clusters whose diameters are greater than or equal to the diameter of a single target DNA cluster in the pixel clusters resulting from the overlapping of the plurality of pixels.
상기 (d) 단계 이후에 표적 DNA의 농도를 결정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 DNA 정량 분석 방법.
12. The method of claim 11,
Further comprising the step of determining the concentration of the target DNA after the step (d).
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020180142621A KR102359854B1 (en) | 2016-11-16 | 2018-11-19 | Method and apparatus for ultrasensitive quantification of dna biomarker |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020160152895A KR20180055977A (en) | 2016-11-16 | 2016-11-16 | Method and apparatus for ultrasensitive quantification of dna biomarker |
| KR1020180142621A KR102359854B1 (en) | 2016-11-16 | 2018-11-19 | Method and apparatus for ultrasensitive quantification of dna biomarker |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020160152895A Division KR20180055977A (en) | 2016-11-16 | 2016-11-16 | Method and apparatus for ultrasensitive quantification of dna biomarker |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20180125934A true KR20180125934A (en) | 2018-11-26 |
| KR102359854B1 KR102359854B1 (en) | 2022-02-07 |
Family
ID=80252983
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020180142621A KR102359854B1 (en) | 2016-11-16 | 2018-11-19 | Method and apparatus for ultrasensitive quantification of dna biomarker |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102359854B1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20230047536A (en) | 2021-10-01 | 2023-04-10 | 부산대학교병원 | Methods for quantification of cell-free DNA |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20030041726A (en) * | 2001-11-21 | 2003-05-27 | 국양 | Single/Multiple Cantilever Probe Having High Resolution for Atomic Force Microscopy and Method for Producing the Same |
| US20090227040A1 (en) * | 2005-04-22 | 2009-09-10 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Detection of macromolecular complexes on ultraflat surfaces with harmonic cantilevers |
| KR101355019B1 (en) * | 2013-03-04 | 2014-01-27 | 한국과학기술연구원 | Cantilever sensor for atomic force microscopy and the manufacturing mothod of the same |
| KR101742211B1 (en) * | 2015-11-23 | 2017-05-31 | 주식회사 포스코 | Method and apparatus for ultrasensitive quantification of microrna |
-
2018
- 2018-11-19 KR KR1020180142621A patent/KR102359854B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20030041726A (en) * | 2001-11-21 | 2003-05-27 | 국양 | Single/Multiple Cantilever Probe Having High Resolution for Atomic Force Microscopy and Method for Producing the Same |
| US20090227040A1 (en) * | 2005-04-22 | 2009-09-10 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Detection of macromolecular complexes on ultraflat surfaces with harmonic cantilevers |
| KR101355019B1 (en) * | 2013-03-04 | 2014-01-27 | 한국과학기술연구원 | Cantilever sensor for atomic force microscopy and the manufacturing mothod of the same |
| KR101742211B1 (en) * | 2015-11-23 | 2017-05-31 | 주식회사 포스코 | Method and apparatus for ultrasensitive quantification of microrna |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Nucleic Acids Res. 40(22):11728-36 (2012.12.)* * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20230047536A (en) | 2021-10-01 | 2023-04-10 | 부산대학교병원 | Methods for quantification of cell-free DNA |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR102359854B1 (en) | 2022-02-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6397065B2 (en) | Single molecule detection assays and uses thereof | |
| US20050106587A1 (en) | Method for determining of nucleic acid analytes | |
| Kim et al. | Imaging and three-dimensional reconstruction of chemical groups inside a protein complex using atomic force microscopy | |
| TWI310406B (en) | Method for determining nucleic acid analytes | |
| CN101464456B (en) | Method for virus detection by surface plasma resonance technology and chip used in the same | |
| US11111528B2 (en) | Method and apparatus for ultrasensitive quantification of microRNA using an atomic force microscope and a hybrid binding domain | |
| JP2009534033A5 (en) | ||
| KR102359854B1 (en) | Method and apparatus for ultrasensitive quantification of dna biomarker | |
| KR20180055977A (en) | Method and apparatus for ultrasensitive quantification of dna biomarker | |
| JP4740876B2 (en) | Analysis chip with reference area, kit and analysis method | |
| Kirimli et al. | Amplification-free in situ KRAS point mutation detection at 60 copies per mL in urine in a background of 1000-fold wild type | |
| Zibadi et al. | Designing and evaluation of a novel electrochemical biosensor based on carbon quantum dots and gold core-shell to detect and measure Human T-lymphotropic Virus-1 (HTLV-1) in clinical samples | |
| CN104561290A (en) | Gene chip detection method based on mixed probe | |
| US12025581B2 (en) | Devices and methods for detecting/discriminating complementary and mismatched nucleic acids using ultrathin film field-effect transistors | |
| US20240117442A1 (en) | Apparatus and Methods for Analysis of Gene Mutation | |
| KR101731611B1 (en) | Method for nanoparticle based highly sensitive multiple detection of gene mutation using Kelvin Probe Force Microscopy | |
| KR101731615B1 (en) | High-throughput detection method for single-to-multiple nucleotide mutations based on nanoparticle-DNA corona complex via Kelvin probe force microscopy | |
| US20230416851A1 (en) | Rapid diagnostic electrochemical biosensing targeted with antisense oligonucleotides | |
| Simion et al. | Detection of human papilloma viruses using nanostructurated silicon support in microarray technology | |
| KR101991593B1 (en) | Sensor for detection of gene mutation using resonance frequency shift | |
| CN117757901A (en) | SERS detection kit for detecting acute myocardial infarction micro-nucleic acid markers, and preparation method and application thereof | |
| Lee et al. | Detection of single nucleotide polymorphisms using a biosensor-containing titanium-well array | |
| Mishra et al. | 8 Atomic Force Microscopy and Detecting a DNA Biomarker of a Few Copies without Amplification | |
| Pasdar et al. | Early detection of cervical cancer based on high-risk HPV DNA-based genosensors: A systematic review | |
| CN104561291A (en) | Gene chip detection method based on double functional probes |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A107 | Divisional application of patent | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |