KR20180125372A - 알츠하이머병 위험도와 관련된 apoe 프로모터 단일염기변이 및 이것의 용도 - Google Patents

알츠하이머병 위험도와 관련된 apoe 프로모터 단일염기변이 및 이것의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 알츠하이머병의 위험도 예측에 이용될 수 있는 단일염기다형성 (SNP)에 관한 것이다. 상기 SNP는 rs405509로서, 인간 유전자 지도 GRCh38.p7 버전을 기준으로 할 때, 염색체 19번 44905579에 위치한다. 본 발명은, APOE E4/E4의 치매에 대한 위험도에 rs405509의 T 대립유전자가 위험도를 더 증가시키는 역할을 함을 제시한다. 또한, APOE 유전자형간의 대뇌피질두께와 해마부피를 비교한 결과는 E3/E3에 비해 E4/E4에서의 수축 정도가 아시아인에서 보다 더 크게 나타난 것을 제시하였다. 또한, E4/E4 유전자형을 가진 코커서스인에서, rs405509 T/T 유전자형을 가진 사람들의 대뇌피질이 보다 더 심하게 위축된 것이 확인되었다. 따라서, 본 발명은 APOE E4/E4와 함께 rs405509 T/T 변이를 확인함으로써, 알츠하이머병 및/또는 알츠하이머병에 의한 치매의 진단 또는 위험도 예측에 이용될 수 있을 것이다.

Description

알츠하이머병 위험도와 관련된 APOE 프로모터 단일염기변이 및 이것의 용도 {APOE promoter SNP associated with the risk of Alzheimer's disease and the use thereof}
본 발명은 알츠하이머병의 조기진단 및 알츠하이머병 위험도 예측을 위한 단일염기변이에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 단일염기변이를 이용한 알츠하이머병 조기진단 및 알츠하이머병 위험도 예측방법에 관한 것이다.
알츠하이머병은 진행성 신경퇴행성 질환으로서 인지능력의 감퇴 및 뇌에서의 노인성판 (senile plaques)을 특징으로 한다. 노년층에서 가장 흔한 치매 원인이며, 치매의 60 ~ 80%를 차지한다 (Barnes and Yaffe, 2011). 65세 이상 노인의 약 13% 및 85세 노인의 약 45%가 알츠하이머병 환자인 것으로 추정된다. 알츠하이머병 (Alzheimer’s disease, AD)은 복잡한 신경퇴행성 질환으로서, 기억손실 및 다른 인지장애 뿐만 아니라 뇌의 구조적 변화를 초래한다 (Ballard et al., 2011; Forero et al., 2006). AD 환자들은 뇌의 후측대상피질 (posterior cingulate cortex, PCC), 전두엽 (medial prefrontal cortex), 및 해마 (hippocampus)에서 증가된 아밀로이드 플라크, 감소된 해마 부피를 나타낸다. 또한, 환자들은 CSF에서 감소된 베타-아밀로이드 수준 및 증가된 타우 (tau) 및 p-tau 수준을 보인다 (Jack, 2012; Trojanowski et al., 2010).
알츠하이머성 치매 치료제를 개발 중에 있으나, 현재까지 뚜렷한 치료제는 없으며, 이에 조기진단 및 조기예측에 대한 필요성이 높은 실정이다. 알츠하이머 치매 진단기술로는, 신경심리검사, MRI뇌영상 검사, 전문의 소견에 의한 임상진단, 및 뇌척수액과 플로베타벤 (florbetaben) 기반의 아밀로이드-PET을 통한 병리학적 검사 등이 있다. 임상진단의 경우 치매발병 또는 경도인지장애를 진단할 수 있으나, 다른 뇌질환과의 구분이 어려운 경우가 있고, 증상이 시작된 후에 비로소 진단이 가능하므로 조기진단의 목적에는 적합하지 않다. 뇌척수액 검사의 경우, 베타 아밀로이드 단백질과 타우 단백질 분석 등 정량적 분석을 통해 수행되어 신뢰도 높은 치매진단 척도이나, 침습적 뇌척수액 채취로 인해 피험자의 거부감이 매우 높은 수준이다. 아밀로이드-PET을 통한 병리학적 검사의 경우 신뢰도는 높으나 비용이 고가이다. MRI 뇌영상의 경우 대뇌피질 위축, 해마 위축 등 치매와 동반되는 뇌손상을 규명하고 조기진단을 위한 기술이 개발 중이나 현재는 그 진단 시점이 빠르지 않은 것으로 알려져 있다. 또한, 혈액을 통한 치매 진단기술개발이 활발히 진행 중이나, 실험대상 집단의 규모와 정확성에 한계점이 있어 임상적 활용을 위해서는 신뢰도 검증이 요구되고 있다.
유전적 요인에 있어, 아밀로이드 전구체 단백질, 프레세닐린-1 (presenilin-1) 및 프레세닐린-2 (presenilin-2)가 가족력에 의한 알츠하이머병의 조기 발병에 대한 일차적인 요인이며 (Blennow et al., 2006; Hardy and Selkoe, 2002), APOE에서 e4 대립유전자가 산발적 알츠하이머병의 후발성 발병에 대한 가장 강력한 위험요인이다 (Bu, 2009; Corder et al., 1993; Huang and Mucke, 2012). APOE 유전자는 세계적으로 각각 8.4%, 77.9%, 및 13.7% 빈도를 갖는 3개의 다형성, e2, e3 및 e4를 갖는다 (Farrer et al., 1997). 알츠하이머병에서 e4 빈도는 ~ 40%까지 극적으로 증가한다 (Farrer et al., 1997). APOE는 19번 염색체 장완 (19 q13.2)에 위치하고, 112번 (Cys/Arg)과 158번 (Arg/Cys) 아미노산이 달라짐으로 인해 형성되는 3가지 대립유전자 (allele) e2, e3 및 e4의 조합에 의해 6개의 유전자형 (E2/E2, E2/E3, E3/E3, E2/E4, E3/E4, E4/E4) 다형성 (polymorphism)이 존재한다. 이들 중 APOE e4는 통상 AD 환자의 50% 이상에서 발견되나, 인지력이 정상인 대조군에서는 단지 15% 미만으로 발견된다 (Ward et al., 2012). 종래 연구는 APOE e4가 AD 발병 시기를 5 ~ 15년 앞당길 수 있다고 보고한 바 있다 (Corder et al., 1993; Gomez-Tortosa et al., 2007). 또한, 인지력 감퇴에 대한 APOE e4의 영향이 보고된 바 있으나, 일부는 APOE e4에 의한 인지력 감소를 보고한 반면에, 다른 연구는 인지력 감소에 아무런 영향이 없음을 보고하였고, 또 다른 연구 결과는 APOE e4에 의해 인지력이 천천히 감소되는 것을 제시하였다 (Anstey and Christensen, 2000; Beaudreau et al., 2013; Caselli et al., 2009; Craft et al., 1998; Deary et al., 2002; Jorm et al., 2007; Kleiman et al., 2006; Mayeux et al., 2001; Van Gerven et al., 2012). 이처럼 논의가 필요한 결과에도 불구하고, APOE e4 동형접합체 (homozygotes)를 갖는 건강한 개체가 감소된 해마 부피를 나타낸 반면에, e4 이형접합체 (heterozygotes)는 건강한 노년층 그룹에서 e4를 보유하지 않은 피험자와 차이를 보이지 않았다 (Crivello et al., 2010; Farlow et al., 2004; Lemaitre et al., 2005). 또한, APOE e4는 건강한 노년층 및 경도인지장애가 알츠하이머병으로 전환되는데 관여하는 것으로 나타났다 (Wang et al., 2011). e4 대립유전자의 위험성은 인종 그룹 (ethnic group) 간 차이가 있는 것으로 보고되었다 (Brainerd et al., 2013; Farrer et al., 1997; Heun et al., 2010; Hsiung and Sadovnick, 2007; Hsiung et al., 2004; Rose, 2005). 그러나. APOE e4를 기반으로 하는 예측의 경우도, 치매에 대한 유전적 영향도의 20% 이내에서만 설명 가능하다. 이처럼, 알츠하이머병에 대한 e4-매개 위험도 및 가능성 있는 유발 인자에 대해서는 여전히 명확하게 밝혀지지 않고 있다. 한편, 한국특허등록 제 10-1335021호는 알츠하이머병 또는 경도인지장애 (mild cognitive impairment)가 있는 환자와 APOE rs405509의 T/G 이형접합의 관련성에 대해 기술하였다.
이에, 본 발명자들은 APOE E4 유전변이 뿐만아니라, APOE E4의 치매 위험도에 영향을 줄 수 있는 유전변이들을 APOE 유전자 주변에서 연구하였다. 또한, APOE E4/E4 동형접합체 (homozygote)의 경우, 그 치매 위험도에 있어 인종별 차이가 있음을 확인하고, 이를 분석하여 그 원인을 분석하고자 하였다. 그 결과 놀랍게도 APOE 프로모터에 위치하는 유전자 단일염기변이가 APOE E4/E4 동형접합체의 인종별 위험도 차이를 설명할 뿐 아니라, 그 대립형질 또는 대립유전자 (allele)에 따라서 대뇌피질 두께의 차이를 보임을 확인하였다. 또한, 본 발명자들은 대뇌피질 두께 및 해마 부피를 분석하는 것에 의해 APOE 다형성의 뇌 구조에 대한 영향을 확인하였다.
본 발명은 알츠하이머병 및/또는 알츠하이머병에 의한 치매 위험도 예측을 위한 SNP (single nucleotide polymorphism) 유전변이를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 단일염기다형성 (SNP) 유전변이를 검출하여 알츠하이머병 및/또는 알츠하이머병에 의한 치매 위험도를 예측하는 방법에 관한 것이다.
본 발병은 알츠하이머병 및/또는 알츠하이머병에 의한 치매 위험도 예측에 사용될 수 있는 단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism; SNP)을 제공한다. 보다 구체적으로, 상기 SNP는 rs405509로서, 인간 유전자 지도 GRCh38.p7 버전을 기준으로, 염색체 19번 44905579에 위치하며, 이것의 대립유전자 (alleles)는 T와 G이다. 인종 간 소수형질빈도 (minor allele frequency, MAF)에서 차이를 보였으며,
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명은 피험자에서 분리된 샘플, 예를 들어, 세포, 조직, 혈액, 또는 체액으로부터 게놈 DNA 분리 및 정제하고, APOE 프로모터의 rs405509 단일염기변이 다형성 및 APOE 유전자형을 분석 및 확인하고 이를 통해 치매위험도를 예측한다.
본 발명의 다른 일 실시예에서, APOE 엡실론 유전변이 (rs429358 및 rs7412) 및 rs405509 유전변이를 이용하여, 알츠하이머성 치매를 예측에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 일 실시예에서, 핵산을 포함하는 피험자에서 분리된 샘플에서 경도인지장애 또는 알츠하이머병 (AD)을 나타내는 유전적 변이를 검출하여, 경도인지장애 또는 알츠하이머병을 진단하거나 이들 질환에 대한 위험도를 예측하는 방법으로서, (a) APOE E4 대립유전자를 암호화하는 유전자 또는 이들의 유전자 산물로부터 선택된 유전자에서 상기 유전적 변이의 존재 또는 부재를 검출할 수 있는 시약과 상기 샘플을 접촉시키는 단계; 및 (b) APOE 프로모터의 rs405509 T 대립유전자를 암호화하는 유전자 또는 이들의 유전자 산물로부터 선택된 상기 유전적 변이의 존재 또는 부재를 검출할 수 있는 시약과 상기 샘플을 접촉시키는 단계를 포함하여, 상기 APOE E4/E4 및 rs405509 T/T 유전적 변이의 존재는 상기 피험자가 경도인지장애 또는 알츠하이머병 환자이거나, 경도인장애 또는 알츠하이머병에 대해 높은 위험도를 갖는 것을 나타내는 것인, 경도인지장애 또는 알츠하이머병을 진단하거나 이들 질환에 대한 위험도를 예측하는 방법을 제공한다. 여기서 상기 위험도를 예측하는 방법은 상기 피험자에서 분리된 핵산을 증폭하는 것에 의한 것일 수 있으며, 상기 핵산은 게놈 DNA 이거나 RNA일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예는, 피험자의 대뇌피질두께에 대한 영상, 예를 들어, MR (magnetic resonance) 뇌영상을 수득하는 것을 더 포함하고, 상기 대뇌피질두께가 위축된 것이 상기 피험자가 경도인지장애 또는 알츠하이머병 환자이거나, 경도인장애 또는 알츠하이머병에 대해 높은 위험도를 갖는 것을 나타내는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예는, 상기 방법에서 신경심리검사, 뇌척수액 (CSF) 검사 및 아밀로이드-PET 검사로 구성된 검상 중 하나 이상을 추가로 수행하는 것을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 유전적 변이의 존재 또는 부재를 검출하는 방법은, 상기 피험자에서 분리된 샘플에서 핵산을 단일 가닥 형으로 얻어 상보적인 프라이머 세트와 복합체를 형성한 후 상기 복합체에서 유전적 변이의 존재 또는 부재를 분석하는 방법이다. 상기 복합체에서 유전적 변이의 존재 또는 부재는 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction), 핵산 분해 (nuclease digestion), 혼성화 (hybridization), 서던 블로팅 (Southern blotting), 제한효소 단편 다형성 (restriction enzyme fragment polymorphism), 시퀀싱 (sequencing), 프라이머 확장 (primer extension), 단일가닥 형태 다형성 (single-stranded conformation polymorphism), 또는 상기 방법들을 함께 사용하여 분석할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예는, APOE E4 대립유전자를 암호화하는 유전자 또는 이들의 유전자 산물 (gene product)로부터 선택된 유전자에서 상기 유전적 변이의 존재 또는 부재를 검출할 수 있는, 경도인지장애 또는 알츠하이머병의 진단 또는 예측을 위한 키트를 제공하며, APOE 프로모터의 rs405509 T 대립유전자를 암호화하는 유전자 또는 이들의 유전자 산물을 더 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에서 상기 키트는, APOE 단일염기다형성 APOE E4 및 APOE 프로모터 단일염기다형성 rs405509 T/T, T/G 및 GG에 대하여 상보적인 프라이머 세트 및 반응효소를 포함하는 키트일 수 있다.
본 발명에서 유전자 산물은 유전자 발현의 결과물로서, RNA, 예를 들어, tRNA, mRNA, rRNA, miRNA 및 siRNA, 폴리펩티드 및 단백질을 포함하는 것으로 이해된다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에서, 상기 키트는 유전적 변이를 분석하는 분석 방법이 포함되거나, 핵산을 증폭하는 방법이 포함되거나, 기준 대조표준이 포함된 키트일 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에서, APOE E4 대립유전자를 암호화하는 유전자 또는 이들의 유전자 산물로부터 선택된 유전자에서 상기 유전적 변이의 존재 또는 부재를 검출할 수 있는 상보적인 프라이머 세트가 제공되며, APOE 프로모터의 rs405509 T 대립유전자를 암호화하는 유전자 또는 이들의 유전자 산물이 함게 제공될 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 프라이머 세트는 APOE 단일염기다형성 APOE E4 및 APOE 프로모터 단일염기다형성 rs405509 T/T, T/G 및 GG에 대하여 상보적인 프라이머 세트일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 프라이머 세트는 라벨, 예를 들어, 방사성 동위원소 또는 형광물질 또는 화학 유도체가 부착된 프라이머 세트일 수 있다.
본 발명에 따르면 산발성 알츠하이머성 치매의 예측 유전변이로 APOE 유전자형, 특히 APOE E4/E4에 더하여, rs405509의 유전변이를 검사함으로써 알츠하이머성 치매 위험도를 보다 더 정확하게 진단할 수 있다.
도 1은 APOE e4/4의 위험도를 조절하는 다형성 후보를 스크리닝하는 전략을 나타난다 (도 1A). 도 1B는 APOE 유전자 구조의 개략도를 나타낸다. rs449647 (-491 A/T), rs405509 (-219 T/G), rs440446 (+113 G/C), rs429358, 및 rs7412의 SNPs를 패널 B에 나타냈다. 도 1C는 rs405509, rs449647, rs440446에 대한 유전자형 빈도의 분포는 동아시아인, 코커서스인 및 아프리카인 혈통으로부터의 전체 케이스-조절 피험자 또는 e4 동형접합체에 대해 평가한 것이다. 여기서 상기 유전자형 빈도를 각 케이스 및 대조군에서의 평균 빈도로서 계산하였다.
도 2는 동아시아인 및 코카서스인에서의 피질 두께 감소를 보여주는 맵이다 (도 2A). 일반선형모델을 적용하고 APOE e4/4 및 e3/3를 고정 요인으로, 연령, 성별 및 장 세기 (field strength)를 공변수로 사용하여 포인트-와이즈 피질 두께 차이를 추산하였다. 숫자는 통계적 차이를 나타낸다. (p < 0.05) 검은색 원은 내측후각 및 해마곁 영역에서의 뇌 위축을, 빨간색 원은 설전부 영역에서의 뇌 위축을 나타낸다 (도 2A). 중막측두피질 (medial temporal cortex) (내측후각 및 해마곁 영역) (도 2B) 및 설전부 (도 2C)에서의 평균 피질 두께를 동아시아인 및 코카서스인에서의 APOE 유전자형에 따라 비교하였다. 데이터는 e3/3에 대해 정상화 하였고, 95% 신뢰도 구간을 갖는 에러 바 (error bar)를 갖는 %로 나타냈다. 막대그래프는 동아시아인 및 코카서스인에서의 APOE 유전자형 사이의 해마 부피를 비교한 것이다 (도 2D).
도 3은 rs405509 T-대립유전자가 APOE 단백질 발현을 감소시키는 것을 나타낸다. 사람 혈청을 안티-APOE 및 안티-TF (transferrin)와 함께 웨스턴블롯팅 하여 rs405509 의존적인 APOE 단백질의 혈청 발현을 조사한다 (도 3A). 혈청 샘플을 APOE e3/3 동형접합체 중에서 rs405509 (G/G, G/T, 및 T/T) 유전자형에 대해 선택한다. 막대 그래프는 APOE 발현의 상대적 세기를 나타낸다 (도 3B). GG 유전자형을 참고로서 사용하였다. 트랜스페린 (TF)를 정상화된 대조군으로 사용하였다. 데이터는 평균 ± SEM이다. (*p < 0.05, ***p < 0.001).
도 4는 아시아인의 APOE e4/4-매개 알츠하이머병 발병에 대한 감수성을 나타낸다. 알츠하이머병에 대해 e3/3를 참고로 하는 APOE e4/4의 오즈비를 다른 인종 그룹간에 비교한 것이다. 막대그래프는 임상적 진단에 기초한 알츠하이머병 (도 4A) 및 신경병리학적으로 확인된 계열 (도 B)에 대한 e4/4의 오즈비를 나타낸다. * 데이터세트는 로지스틱회기법으로 분석하였고, †는 선행연구 결과를 인용한 것이다.
본 발명에서, 본 발명자들은 다른 인종 그룹에 대한 APOE e4-매개 AD 감수성을 대규모 연구를 통해 분석하였다. 그 결과 코카서스인 및 아프리카인 혈통과 비교하여, 동아시아인에서 e4 동형접합체가 알츠하이머병에 보다 더 취약함을 나타냈다. 또한, 본 발명자들은 신경병리학적으로 알츠하이머병으로 진단된 환자 및 대조군에 대한 연관성 연구로 이러한 인종적 차이를 확인하였다. 종래 소수의 연구가 다양한 인구집단에서 상이한 APOE e4 대립유전자 분포를 보고한 바 있다 (Farrer et al., 1997; Singh et al., 2006). e4 대립유전자의 높은 빈도수는, 아프리카, 유럽 및 아시아 순서이며, 이는 알츠하이머병에 대한 e4의 위험도 순서와 정반대이다.
APOE e4가 내후각피질 (entorhinal cortex), 해마곁피질 (parahippocampal cortex), 및 설전부 (precuneus) 내의 피질 두께를 감소시키는 것을 촉진하는 것이 보고된 바 있다 (Donix et al., 2010; Foley et al., 2016; Thompson et al., 2011). 인지력이 정상인 피험자에 대한 다른 연구는 e4를 지닌 개체가 또한 감소된 피질 두께를 갖는 것을 제시하였다 (Fouquet et al., 2014). 또한, e4 대립유전자를 갖는 개체가, 기억 기능에서 중요한 역할을 하는 해마의 심각한 위축과 기억 손상을 나타냈다 (Alexopoulos et al., 2011). 본 발명에서, 본 발명자들은 선행연구와 일치하는 결과로서, APOE e4 동형접합체가 동아시아인 및 코카서스인 둘 모두에서 APOE e3 동형접합체와 비교하여 내후각피질, 해마곁피질 및 설전부 영역에서의 심각한 피질 두께 감소 및 해마 위축과 관련됨을 밝혔다 (Donix et al., 2010; Foley et al., 2016; Thompson et al., 2011). 놀랍게도, e4/4 피험자에서 관찰된 이러한 피질 및 해마 위축은 코카서스인보다 동아시아인에서 보다 더 심각한 것으로 확인되었다. 본 발명은 APOE e4/4를 갖는 동아시아인이 코카서스인과 비교하여 알츠하이머병 뿐만 아니라 뇌의 피질두께 감소 및 해마 위축에 증가된 위험도를 갖는 것을 제시한다.
본 발명자들은 인구집단 간에 e4/4-매개 AD 위험도 차이가 유전적 배경에서의 인종적 차이, 특히 APOE 유전자 주변의 다형성에서 기인할 것으로 가정하였다. APOE e4는 알츠하이머병-관련한 유일한 APOE 다형성은 아니다. APOE 프로모터 및 인트론 영역내의 다형성이 AD 발병에서 APOE e4의 영향을 조절하는 것이 보고된 바 있다 (Bertram et al., 2007; Lambert et al., 2002; Lambert et al., 1998b; Lescai et al., 2011). 프로모터 내의 2개의 SNPs (rs449647 및 rs405509) 및 인트론 내의 하나의 SNP (rs440446)가 알츠하이머병에 대한 APOE 엡실론 변이의 영향을 조절하는 것으로 평가되었다. -491AA 유전자형 및 219TT 유전자형이 APOE 엡실론 유전자형과 독립적으로 AD 위험도를 높이는 것으로 보고된 바 있다 (Lambert et al., 2002; Lambert et al., 1998a; Lambert et al., 1998b; Limon-Sztencel et al., 2016; Wang et al., 2000). 또한, rs405509가 인지력에 대한 영향에 있어 APOE e4와 시너지 작용을 하는 것이 보고되었다 (Ma et al., 2016). 본 발명자들은 이들 SNPs가 다른 인종의 인구집단에서 상이한 대립유전자 빈도를 나타내는 것을 분석하였다. 이들 SNPs 중 rs405509의 경우, 한국인 및 일본인을 포함하는 동아시아인이 코카서스인 및 아프리카인 혈통과 비교하여 전체 인구 및 e4 동형접합체 보유 그룹 둘 모두에서 위험 대립유전자인 rs405509-T를 보다 더 높은 빈도로 보유하고 있음을 확인하였다. 이는 다른 인종 그룹과 비교하여 동아시아인에서 e4 동형접합체가 알츠하이머병에 대한 높은 위험도를 갖는 것을 뒷받침한다. 마찬가지로, 코카서스인은 아프리카인 혈통과 비교하여 rs405509-T에 대해 보다 더 높은 대립유전자 빈도를 가지며, 코카서스인은 또한 아프리카인 혈통과 비교하여 보다 더 높은 e4/4 동형접합체 오즈비를 갖는 것으로 확인되었다.
몇몇 신경영상 (neuroimaging) 연구가 뇌 위축에서 APOE e4 동형접합체의 영향을 보고한 바 있으나, APOE 프로모터 다형성의 영향은 아직 명확하게 밝혀지지 않은 상태이다. 기존의 연구는 중국인 인구집단에서 비치매성 노화과정에서의 사람 뇌에 대한 APOE 프로모터영역 내 rs405509 다형성의 영향을 보고한 바 있다. APOE e4와 함께 rs405509-TT를 지닌 개체가 rs405509 G-대립유전자를 지닌 개체와 비교하여 연령 의존적으로 피질 두께의 위축을 나타내는 것이 발견되었다 (Chen et al., 2015a). 본 발명자들은 rs405509-TT 유전자형의 개체가 알츠하이머병과 고도로 연관되고, e4 동형접합체 중에서 G-대립유전자를 지닌 개체와 비교하여 피질 두께 및 해마 부피에서 보다 더 강한 위축을 초래하는 것을 밝혔다. 특히, 이러한 피질두께 감소 패턴은 중막측두피질 (medial temporal cortex) (내후각 및 해마곁 영역) 및 설전부 (precuneus)에서 관찰되었으며, 해마곁 영역에서의 위축은 이전 연구 (Chen et al., 2015a)와 유사하다. 본 발명은 APOE e4 동형접합체와 rs405509-TT를 지닌 개체에서 내후각피질, 해마곁피질 및 설전부 영역 내의 심각한 피질두께 감소 및 해마 위축을 확인하였다. 본 발명에서, 본 발명자들은 알츠하이머병 및 뇌 위축e4/4-매개 위험도에서의 인종적 차이가 rs405509 다형성의 인종적 다양성에서 기인하는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명자들은 rs405509-TT가 사람 뇌 및 혈청에서 감소된 APOE 발현을 유도하는 것을 입증하였다. rs405509 T 또는 G 대립유전자에서의 대립유전자 치환을 이용한 리포터 유전자 분석에서, 본 발명자들은 프로모터에 rs405509-T 대립유전자를 지닌 APOE 유전자가 보다 덜 발현됨을 입증하였으며, 이는 rs405509-T를 포함하는 위험도가 감소된 APOE 단백질로부터 기인함을 제시한다.
이와 같이, 본 발명자들은 동아시아인에서의 APOE e4 동형접합체가 코카서스인 및 아프리카인 혈통과 비교하여 알츠하이머병 발병에 보다 더 취약함을 확인하였다. 인종 그룹 간 APOE 프로모터 다형성에서의 상이한 대립유전자 빈도는 APOE e4를 지닌 개체가 알츠하이머병의 발병에 대해 차별적으로 감수성이 있도록 할 것이다. APOE 단백질 수준 조절에 대한 rs405509의 관련성을 고려할 때, rs405509-TT를 지닌 e4 APOE 개체에서 감소된 APOE 수준이 알츠하이머병에 대한 증가된 위험을 유도하는 것을 제시한다.
이하 실시예에 의거하여 본 발명을 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
(1) 샘플 및 데이터
본 발명에서는 전장유전체 정보, MRI 뇌영상 정보, 임상 진단 정보를 활용하였다. 치매 코호트의 연구대상자 2075명을 대상으로 (조선대병원을 주축으로 그 외 협력병원, 정상인의 평균연령 73.45 ± 5.30 (mean ± SD), 알츠하이머병 환자 평균연령 71.65 ± 5.65 (mean ± SD), 정상인의 여성 비율 62.4%, 알츠하이머병 환자의 여성비율 61.5%)의 혈액을 이용하여 전장유전체 정보를 획득하고, 각 연구대상자의 MRI스캔 (3T MRI, Skyra, Siemems)을 통해 뇌영상 정보를 획득하였다. 각 연구대상자에 대해 치매진단에 필요한 신경심리검사 (K-MMSE 및 SNSB (Seoul Neuropsychological screening battery))를 실시하고, 그 결과로서 치매 임상 전문의에 의한 정상, 경도인지장애, 또는 치매 진단을 확인하였다. 진단 결과 각각 1145명이 정상인이고, 930명이 치매환자였다. 또한, 한국 광주의 국가치매연구센터 (The National Reserch center for Dementia, NRCD)의 데이터베이스를 이용하였다. 본 발명의 모든 실험 및 연구 프로토콜은 조선대학교 병원 이사회의 승인을 받았다. 모든 지원자 및 환자의 친척은 실험 참여에 앞서 문서로 작성된 동의서를 제출하였다. 동아시아인 피험자는 인지력이 정상인 개체 2,309명, AD 환자 1,886명으로 구성되었다. 코카서스인의 유전체는 ADNI (Alzheimers Disease Neuroimaging Initiative; http://adni.loni.usc.edu/) 데이터베이스로부터 획득하였으며, 코카서스인의 뇌영상 역시 ADNI 데이터베이스로부터 획득하였다. 정상인 515명 및 AD 환자 320명으로 구성되었다.
AD의 임상적 진단은 NINCDS-ADRDA (National Institute of Neurological and Communication Disorders and Stroke/Alzheimer’s Disease and Related Disorders Association)의 AD 판정기준에 따라 이뤄졌다 (McKhann et al., 1984b). 경도인지장애 (MCI)는 현재 합의된 기준에 따라 진단되었다 (Winblad et al., 2004). 인지력 정상인 그룹은 신경질환을 갖지 않으며 인지기능의 손상이 없거나 일상생활에 문제가 없는 그룹이다. 뇌 MRI상에서 국소병변, 머리 트라우마 경력 또는 이들의 정신력에 영향을 줄 수 있는 정신질환이 존재하는 피험자는 제외하였다. 경미한 의학적 비정상 (예를 들어, 본태성 고혈압, 심각한 합병증이 없는 당뇨, 또는 경미한 청각 장애)을 지닌 개체는 포함시켰다.
rs405509의 위험도 (Odds ratio)에 사용된 코카서스인 유전체는 NIA-LOAD (National Institute on Aging-late onset Alzheimer’s disease), NCRAD (National Cell Repository for Alzheimer’s Disease), ADNI (Alzheimers Disease Neuroimaging Initiative) 데이터세트를 사용하였다. 2종 데이터세트 또는 3종 데이터세트를 합하여 분석하였다. E4/E4 유전자형을 가진 개체들의 APOE 프로모터 단일염기를 사용하였으며, NIA-LOAD, NCRAD, ADNI를 합하여 분석한 경우, E4/E4 유전자형을 가진 개체는 총 395명이었으며, 이 중 알츠하이머성 치매환자는 330명, 정상인은 65명을 사용하였다.
(2) 뇌 아밀로이드 이미징
18F-Florbetaben PET 이미징을 종래 방법에 따라 수행하였다 (Osama Sabri, 2015, ClinTransl Imaging, Barthel,2011,Lancet_neurology). 아밀로이드 이상 (amyloid pathology)을 뇌 아밀로이드-베타 로딩 (brain amyloid-β plaque load, BAPL) 값으로 결정하였다. 설정된 RCTU (regional cortical tracer uptake) scoring system (1 = no uptake, 2 = minor uptake, 3 = pronounced uptake)에 따라 4개 뇌 영역 (전두피질 (frontal cortex), 후측대상 (posterior cingulate), 외측두엽피질 (lateral temporal cortex), 두정엽 (parietal cortex))에 대한 플로르베타벤 (florbetaben) (18F) PET 이미지를 평가하였다. 다음, 전두피질, 후측대상, 외측두엽피질, 및 두정엽에 대한 상기 RCTU 스코어를 각 PET 스캔에 대한 단일의 미리 설정된 3-등급 스코어링 시스템, 뇌 아밀로이드-β 플라크 로딩 (BAPL) 스코어 (1 = no amyloid load, 2 = minor amyloid load, 3 = significant amyloid load)로 요약하였다. Pittsburgh compound B (PiB)를 사용한 PET (positron emission tomography)로 생체 내 아밀로이드 이미징을 수행하였다. 뇌 관찰영역 (region of interest, ROI)으로의 PiB 증착은 FreeSurfer version 5.1 software (Martinos Center for Biomedical Imaging)를 사용하여 결정하였으며, 부분적인 부피 효과에 대해 보정된 SUVR (standardized uptake value ratio)를 각 관찰영역에 대해 계산하였다. 전두피질, 후측대상, 외측두엽피질, 및 두정엽 영역에서 평균 대뇌 피질 SUVR을 FreeSurfer로 계산하였다. 소뇌피질은 참고를 위한 영역으로 이용하였다. PiB 양성은 SUVR 1.42로 정의 되었고, 이는 PiB 양성에 대해 기존에 정의된 평균 대뇌피질 결합 포텐셜 0.18과 상응하였다. 18F-florbetapir 및 11C-PiB 둘 모두에 대한 코카시안의 아밀로이드-PET 데이터는 ADNI 데이터베이스 (http://adni.loni.usc.edu)로부터 입수하였다.
(3) 데이터 생성 및 분석
SNP지노타이핑
EDTA 튜브 내에 수거된 전혈세포에서 단리 한 말초혈액 백혈구로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 혈액 샘플을 1500 x g로 10분간 원심분리 하여 혈장을 제거하고, 혈액 백혈구를 DNA 추출에 사용하였다. 상기 샘플은 한국인에 최적화된 Affimetrix Genome-wide genotyping arrays (Affymetrix® Axiom KORV1.0)를 사용하여 지노타이핑 하였다. 상기 KORV1.0은 대한민국 국립보건원의 게놈사이언스 센터에 의해 디자인되었으며, 한국 칩 컨소시엄 (Korean chip consortium)으로부터 입수하였다. 또한, Taqman 또는 SNP type (Fluidigm) 방법을 통한 지노타이핑 분석을 칩-기반 SNP 지노타이핑에서의 정확도를 평가하기 위해 수행하였다. ADNI에 대한 지노타이핑 데이터는 ADNI 데이터베이스 (http://adni.loni.usc.edu)로부터 입수하였다.
게놈 와이드 데이터 임퓨테이션
NRCD로부터의 연구 데이터세트는 6,413의 개체로 구성되었다. ADNI로부터의 데이터세트는 ADNI-1로부터 818, ADNI-GO/2로부터 432 및 ADNI-WGS 데이터세트로부터 818 개체로 구성되었다. 샘플에 대한 퀄리티 컨트롤은 개체 call-rate < 95%, 성별 불일치, 이형접합성 (± 3SD from mean), 중복성 또는 트윈 (twins), SNPs with call-rate < 95%, SNPs with HWE P-value < 10-6 및 MAF < 1%를 포함하였다. 각 데이터세트는 HRC reference panel version 1.1.를 사용하여 별도로 임퓨팅하였다. NRCD로부터의 상기 HRC 임퓨테이션은, 선행-페이징된 해플로타입 (pre-phased study haplotypes)과 함께 동아시아인을 참고의 인구집단으로 선정하여 수행하였다. ADNI 데이터세트는, 선행-페이징된 해플로타입과 함께 HRC 임퓨테이션 서버 내의 유럽인을 참고의 인구집단으로서 선정하고 별도로 수행하였다. 임퓨테이션 후, 낮은 퀄리티로 임퓨팅된 SNPs (info < 0.5)는 후속 연구에서 제외하였다 (McCarthy et al., 2016; Nagy et al., 2017; Surakka et al., 2016).
(4) 이미징 프로토콜
한국인 피험자로부터 MR이미지 획득
2443명의 한국인 피험자에 대해, 전체 뇌의 근접 0.9 ㎜ 축면 (axial) MPRAGE (Magnetization prepared rapid gradient-echo) 이미지를 1.5 T MR 스캐너 (Magnetom Avanto, Siemens) (TR = 1800 ms; TE = 3.43 ms; TI = 1100 ms; 15 flip angle; FoV = 224 x 224; matrix = 256 x 256; number of slices = 176)로 획득하였다. 근접 0.8 ㎜ 시상면 (sagittal) MPRAGE 부피를 3 T MR 스캐너 (Skyra, Siemens) (TR = 2300 ms; TE = 2.143 ms; TI = 900 ms; 9 flip angle; FoV = 256 x 256; matrix = 320 x 320; number of slices = 178.volumes)로 획득하였다. 모든 이미지는 대한민국 광주시 조선대학교 병원의 MR 스캐너로 획득하였다.
ADNI로부터의 MR이미지
ADNI 데이터베이스 (ADNI, http://adni.loni.usc.edu/)로부터 463명의 인지력이 정상인 피험자, 796명의 경도인지장애 피험자, 및 310명의 AD 환자로부터의 베이스라인 1.5T 및 3T MR 이미지를 다운로드 하였다. 상기 피험자에 대한 모든 MR이미지는 표준 ADNI MPRAGE 프로토콜에 따라 1.5T 또는 3T GE, 필립스 (Philips) 및 지멘스 (Siemens) 장비로 획득한 것이다. 1.5T 스캐너에서, MPRAGE 프로토콜에 대한 노미널 파라미터는 다음과 같다: 시상면 (sagittal plane), TR = 2300 ~ 2400 ㎳ for multi-coil phased-array head coil (TR = 3000 ㎳ for bird cage or volume head coil), minimum full TE, TI = 1000 ms, flip angle 8˚, FOV=240 x 240 mm, 192 x 192 in-plane matrix and slice thickness 1.2 mm. 3T 스캐너에서, MPRAGE 프로토콜은 다음과 같다: 시상면, TR=2300 or 3000 ms, minimum full TE, T1=853-900 ms, flip angle 8-9˚, FOV=256-260 x 240 mm , 256 x 256 in-plane matrix and slice thickness 1.2 mm (Jack et al., 2008). AD 피험자는 MMSE (Burns et al., 1998) 상에서 20 ~ 26 스코어, 및 CDR = 0.5 또는 1 (Morris, 1993)에 기초하여 포함시켰다. 또한, 선정된 AD 그룹은 가능성이 높은 AD에 대한 기준인 NINCDS/AARDA 기준을 충족하였다. 건강한 대조군의 경우, CDR 0과 치매가 없는 개체를 포함시켰다 (Wolz et al., 2011).
(5) 이미지 데이터 프로세싱 및 분석
MR이미지 데이터 프로세싱
이미지 프로세싱을 뇌구조 분석에 이용되는 공용 소프트웨어 FreeSurfer software (FreeSurfer 5.3.0) (FreeSurfer, http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/)을 사용하여 수행하였다 (Dale et al., 1999; Fischl and Dale, 2000; Fischl et al., 2004). DICOM 포맷 상의 MR이미지를 FreeSurfer 프로세싱을 위한 자동화된 파이프라인에서 사용하여 뇌 피질 표면에 대한 3-차원 모델을 구성하였다 (Dale et al., 1999; Dale and Sereno, 1993; Fischl et al., 1999a). 상기 프로세싱에서, 이미지의 세기는 정상화되었고 두개골은 정상화된 이미지로부터 제거되었다. 다음, 연결성분 알고리즘 (connected components algorithm)으로 피질하부 분할 프로세싱을 시작하고, 임의의 발견된 구멍 (holes)은 메꿔서 뇌 피질 반구 둘 모두에 대한 백질 (white matter)의 단일-필링 된 부피를 나타내도록 하였다. 또한, 테셀레이션 (tessellation) 및 표면 스무드닝 (smoothening)으로 임의의 메트릭 왜곡 (metric distortions)을 감소시켰다. 다음, 미세조정 프로세스 (refinement process)로 회색질/백질의 경계를 나타내도록 하고, 이어서 초기 표면 모델 컨스트럭션을 수행하였다. 다음, 상기 표면이 바깥쪽으로 변형되어 연막 표면 (pial surface)을 형성하도록 하였다. 먼저 회백질/백질 표면의 각 지점으로부터 및 연막 표면의 지점으로부터 연막 표면까지의 최단거리를 계산하여 뇌 피질의 두께 측정법을 수득하고, 회백질/백질까지의 최단거리를 계산하였다. 다음, 최종 피질 두께를 특정 지점에서 이들 2개 값의 평균으로부터 수득하였다. 피질 맨틀 (cortical mantle) 내의 지점 또는 정점 (vertex)을 나타내는 다른 위치와 약 1 ㎜ 떨어진 삼각형 그리드로, 각 반구에서 163,842 정점에 대한 피질두께를 측정하였다. 피질 폴딩 패턴은, 맵을 0, 5, 10, 15, 20 및 25 ㎜의 반치전폭 가우시안 커넬 (full-width-half-maximum Gaussian kernel)로 맵을 스무드닝 하고 비강직성 고차원 구형 평균화 기법 (non-rigid high-dimensional spherical averaging method)으로 피험자에 대한 평균을 내어 조정하였다. 상기 조정된 맵은 피험자들 간에 ㎜이하 차이까지 검출할 수 있으며, 복셀 (voxel) 해상도에 제한을 받지 않는다. 또한 피하 부피는, FreeSurfer를 사용하는 자동화된 부피측정방법을 통해 획득하였다 (Dale et al., 1999; Fischl and Dale, 2000; Fischl et al., 1999b).
(6) 영상 통계분석
상이한 APOE 대립유전자를 갖는 그룹 간의 피질두께 차이를 MATLAB (R2012a, The Mathworks, Natick, MA, USA)에 대한 Surfstat (http://www.math.mcgill.ca/keith/surfstat/) toolbox를 사용하여 통계적으로 분석하였다. 본 발명자들은 연질 표면상의 마스킹되지 않은 각 지점을 통계적으로 테스트하였다. 일반선형모델 (General linear model, GLM)을 APOE 대립유전자 (e4/4 vs e3/3)를 고정인자로, 성별, 연령, 교육수준 및 장 세기 (field strength)를 공변수로 사용하여 포인트-와이즈 (point-wise) 피질두께 차이를 확인 하였다 (Fan et al., 2010). rs405509 대립유전자 차이를 평가하기 위해, T/T-E4/4 및 G/T-e4/4 + G/G-e4/4 해플로타입을 지닌 피험자를 e3/3를 지닌 피험자들과 별도로 비교하였다. rs405509의 GLM에서, 본 발명자들은 APOE 대립유전자 (rs405509-e4/4 해플로타입 vs e3/3)를 고정인자로, 성별, 연령, 교육수준 및 장 세기를 공변수로 사용하여 포인트-와이즈 피질두께 차이를 확인 하였다 (Chen et al., 2015b). 모든 피질두께 분석에서, 다중 포이트-와이즈 피질두께 비교에 대한 RFT (random field theory) 기반 보정을 클러스터 수준에서 적용하였으며, p < 0.05의 FDR (false discovery rate) 보정값을 통과하는 클러스터는 유의성이 있는 것으로 간주하였다 (Taylor and Adler, 2003) (http://www.math.mcgill.ca/keith/surfstat/). 또한, 해마 부피 및 해부학상 관찰영역을 R program (R version 3.3.1)에서 APOE 대립유전자를 보유하는 그룹들에 대해 통계적으로 비교하였다. 해마 부피 차이는, APOE 대립유전자 (e4/4 vs e3/3, rs405509-e4/4 해플로타입 vs e3/3)를 고정인자로, 성별, 연령, 교육수준, 진단 및 두개골 내부 부피 (intra cranial volume, ICV)를 공변수로 하고 공분산 (ANCOVA) 분석으로 평가하였다 (Hickie et al., 2005; Zierhut et al., 2013). 다음, 다른 그룹들 (e4/4 vs e3/3, rs405509-e4/4 해플로타입 vs e3/3)간의 관찰영역 (ROI) 차이를, 연령, 성별, 교육수준 및 진단을 공변수로 하여 비교하였다. 상기 분석에서, 유의성 수준은 p < 0.05에서 고려되었으며, FDR 보정이 p < 0.05 수준이면 그 결과는 유의성이 있는 것으로 간주하였다 (Stricker et al., 2013; Ye et al., 2016).
(7) 통계분석
대조군 및 AD 그룹에서의 피험자 비율을 카이 제곱검정법 (chi-square tests)으로 비교하였다. 이벤트에 대한 오즈비 (odd ratio)를, 조정되거나 (성별 및 연령) 조정되지 않은 분석 둘 모두에 대해 95% 신뢰도 구간을 갖는 로지스틱 회귀 분석을 사용하여 계산하였다 (Basaria et al., 2010). 모든 통계적 테스트는 SPSS (version 23.0) 및 R program (version 3.3) 둘 모두를 사용하여 수행하였다.
(8) 사람 혈액 샘플로부터 APOE 유전자 발현
웨스턴블롯팅
먼저 전체 혈액 (NRCD로부터 입수)으로부터 혈청을 회수하였다. SDS-PAGE 및 웨스턴블롯팅을 약간의 수정을 가하고 제조자의 지시에 따라 수행하였다 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). 멤브레인을 0.1% Tween 20을 가한 PBS 중의 5% 탈지분유로 1시간동안 블로킹한 후, 후속하여 일차 항체와 실온에서 1시간 인큐베이션하였다. 일차항체는 다음과 같이 희석하여 사용하였다: 1:1,000 토끼 안티-APOE (D719N; Cell Signaling); 1:1,000 토끼 안티-트랜스페린 (ab109503; Abcam). HRP (Horseradish peroxidase)-컨주게이션된 이차 항체는 1:5,000으로 사용하였다. 면역활성을 EZ-Western Lumi Plus (DoGen)로 측정하였다.
(9) 리포터 유전자 분석
정상인 및 AD 환자로부터 수득한 혈액 세포로부터의 다음의 프라이머를 사용하여 게놈 DNA로부터 APOE 유전자 (positions 1,983 to +935) 프로모터 영역을 증폭하였다: 전위, 5′-GGGGTACCGAAAGCAGCGGATCCTTGAT3′(서열번호: 1); 역위, 5′-CCCCTCGAGCTTCCTGCCTGTGATTGGC3′(서열번호: 2). 상기 증폭되 DNA를 KpnI 및 XhoI를 사용하여 절단하고 pGL3.basic vector (Promega)에 결합하였다. 다음 프라이머를 사용하여, PCR 기초한 rs405509 (219G/T)의 위치-특이적 변이를 이용한 G→T 및 T→G 대립형질 치환을 수행하였다: T→G 전위, 5’-GAGGAGGGTGTCTGGATTACTGGGCGAG-3’(서열번호: 3); 역위, 5′-CTCGCCCAGTAATCCAGACACCCTCCTC3′(서열번호: 4); G→T 전위, 5’-GAGGAGGGTGTCTGTATTACTGGGCGAGG-3’(서열번호: 5); 5’-CCTCGCCCAGTAATACAGACACCCTCCTC-3’(서열번호: 6). 상기 분석을 PfuUltra High-Fidelity DNA Polymerase (Agilent)를 사용하여 수행하였다.
(10) 루시페라아제 ( Luciferase ) 분석
HEK 293T 세포를 12-웰 플레이트에서 배양하였다. 24 시간 후, 세포를 TransFectin (상표명) Lipid Reagent를 사용하고 0.25 ㎍ 루시페라아제 리포터 유전자 (firefly luciferase reporter gene) (Promega)를 갖는 pGL3 0.25 ㎍ 및 pCMV-β-galactosidase (Clontech) 0.25 ㎍과 함께 24시간 동안 공동 트랜스펙션 하였다. 트랜스펙션된 세포를 리포터 용해 완충액 (Promega)으로 용해시켰다. 루시페라아제 및 β-갈락토시다아제 활성을 각각 GloMax (상표명) Luminometer (Promega) 및 Epoch microplate spectrophotometer (BioTek)를 사용하여 정량화 하였다. 루시페라아제 활성을 β-갈락토시다아제 활성으로 정상화 하였다. 결과는 3회 독립적인 실험을 나타낸다.
(11) 전장유전체 정보
전장유전체 정보는 정상인, 알츠하이머성 경도인지 장애 환자 및 알츠하이머성 치매환자로 진단된 피험자의 혈액으로부터 분리한 버피코트 (buffy coats)를 이용하고, QIAGEN DNA 미니 키트를 사용하여 gDNA를 추출한 후 정량하였다. ND-1000 분광광도계 (spectrophotometer)와 Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent and Kits를 사용하여 정량하였다. 다음, 아가로스 1.0% TBE (Tris-borate-EDTA, Invitrogen) 겔에서 전기영동하여 DNA quality를 확인 후, DNA quality control을 통과 한 샘플에 대해서 마이크로어레이 기반의 유전자형 분석을 실시하였다. Affymetrix 사의 Axiom Korean chip을 제조자의 지시에 따라 이용하여, 각 유전자형에 대한 정보를 수득하였다. 마이크로어레이 되지 않은 SNP에 대해서는 임퓨테이션 (imputation) 방법으로 유전자형분석을 수행하였다. 전장유전체 임퓨테이션을 위해, plink, EIGENSTRAT, Shapeit, impute2, GTOOL, EAGLETOOL, 및 minimac3 프로그램을 사용하였으며, 1000 Genomes (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/), Michigan imputation server (https://imputationserver.sph.umich.edu/index.html)를 참조패널로 사용하여 임퓨테이션을 수행하였다.
결과
APOE e4/4와 알츠하이머병의 연관성
알츠하이머병에 대한 관련도 있어서, 본 발명자들은 동아시아인, 코카서스인, 및 아프리카인 혈통의 서로 다른 인종 그룹들에서 APOE 변이의 위험도를 분석하였다. 대조군 및 임상적으로 알츠하이머병으로 진단된 환자를 포함하는 모든 인종 그룹에서, APOE 유전자형의 분포 및 대립유전자 빈도는 대조군과 알츠하이머병 환자군에서 커다란 차이를 보였다. 이러한 결과는 대조군보다 알츠하이머병 질환군 중 e4를 지닌 피험자에서 보다 더 두드러졌다. 비록 APOE e4가 알츠하이머병의 중요한 위험인자이기는 하나, e4-매개 위험도에서 인종적 차이는 확인된 바 없었다. 임상적으로 알츠하이머병일 가능성이 매우 높은 것으로 진단된 환자와 정상의 대조군을 사용한 분석에서, 동아시아인인 e4/4 피험자는 코카서스인과 비교하여 매우 높은 오즈비를 보였다 (odds ratios: e4/4 = 33.40 및 15.86, 동아시아인 및 코카서스인) (표 1). 표 1에서 오즈비는 e3/3를 참고로 하여 로지스틱회기법에 의해 분석하였다.
Diagnosis Population N OR (95% C.I .) Ref.
e3/4 e4/4
Clinically diagnosed
East Asian
East Asian*
( NRCD ) 		4195 3.94
(3.4-4.6) 		33.40
(17.0-65.8)
Korean† 336 2.9
(1.7-5.2)		 24.7
(2.8-214.5)		 Kim KW, 1999
Japanese† 2313 5.6
(3.9-8.0)		 33.1
(13.6-80.5)		 Farrer LA, 1997
European ancestry
Caucasian*,‡
( ADNI ) 		835 3.81
(2.73-5.3) 		15.86
(8.17-30.77)
Caucasian†
(Clinic/Autopsy)		 6305 3.2
(2.8-3.8)		 14.9
(10.8 -20.6)		 Farrer LA, 1997
Caucasian†
(population-based)		 4858 2.7
(2.2-3.2)		 12.5
(8.8 -17.7)		 Farrer LA, 1997
France† 1447 2.2
(1.5-3.5)		 11.2
(4.0 -31.6)		 Bickeboller H, 1997
Norway† 937 4.2
(3.0-5.9)		 12.9
(6.6 -26.7)		 Sando SB, 2008
African ancestry
African-Americans† 474 1.1
(0.7-1.8)		 5.7
(2.314.1)		 Farrer LA, 1997
Nigeria† 582 1.33
(0.8-2.1)		 1.68
(0.73.7)		 Gureje O, 2006
Tunisia† 129 2.9
(1.3-6.6)		 5.4
(1.421.5)		 Rassas AA, 2012
Neuropathologically confirmed
East Asian *,§
( NRCD ) 		883 5.26
(3.7-7.4) 		125.10
(16.7-935.2)
Caucasian*,¶
( ADNI ) 		1067 6.48
(4.78.9) 		20.92
(10.248.9)
† 오른쪽 컬럼은 참고로 한 오즈비를 제시한 선행연구를 나타냄; ‡ ADNI로부터의 데이터세트를 코카서스인에 대한 알츠하이머병 위험도 분석에 사용하였음; § NRCD 피험자의 신경병리학적 진단을 위해 아밀로이드 버든 (burden)를 평가함; ¶ 코카서스인에 대한 아밀로이드 축적은 ADNI로부터 입수함.
e4/4-매개 위험도가 인종 의존적인 것은 매우 놀라운 결과이며, 동아시아인 및 코카서스인 순서였다. 본 발명의 결과는 알츠하이머병에 대한 APOE 유전자형의 연관성을 분석한 이전의 연구와 일치하였다 (표 1). 아래 표 2는 임상진단에 기초한 알츠하이머병 및 대조군 그룹 내의 피험자를 나타낸 것이다.
Population Total Cognitively normal controls Alzheimer's disease cases
n Female (%) Age†
(mean ± SD)		 n Female (%) Age‡
(mean ± SD)
East Asian§
(NRCD)		 4195 2309 1423 (61.6%) 74.6 ± 5.7
 1886 1288 (68.3%) 73.6 ± 5.6
Caucasian
(ADNI)		 835 515 265 (51.4%) 74.38 ± 5.58
 320 139 (43.4%) 75.65 ± 6.84
* 60세 이상 90세 미만 노인임; † 대조군의 연령은 조사시점에서의 연령임; ‡ 알츠하이머병의 연령은 발병시 연령임; § 동아시아인의 데디터세트는 NRCD에서 입수함; ¶ 코카서스인의 데이터세트는 ADNI에서 입수함.
e4/4-매개 발병에 대한 인종 간 차이를 확인하기 위해, 본 발명자들은 한국인 및 코카서스인으로부터의 신경병리학적 진단 데이터세트를 사용하여 연관성을 분석하였다 (표 3).
Population Total Aβ (-) † Aβ (+) †
n Female (%) Age‡
(mean ± SD)		 n Female (%) Age§
(mean ± SD)
East Asian¶
(NRCD)		 883 557 321 (55.6) 72.3 ± 6.3 306 162 (52.9) 73.4 ± 6.0
Caucasian
(ADNI)		 1067 475 203 (42.7) 72.8 ± 6.5 592 266 (44.9) 74.3 ± 6.3
* 90세 미만 60세 이상 노인; † Ab (-)는 아밀로이드-음성, Ab (+)는 아밀로이드-양성을 나타냄; ‡ 대조군의 연령은 조사시점에서의 연령임; § 알츠하이머병 환자의 연령은 발병시 연령임; ¶ 동아시아인은 아밀로이드-PET 스캐닝에 참여한 한국인임; 아밀로이드 이상에 대한 코카서스인의 데이터세트는 ADNI로부터 입수함.
인종 그룹 둘 모두에서, 아밀로이드-음성그룹 보다 아밀로이드-양성 그룹에서 보다 더 많은 e4 보유자들이 확인되었다 (표 4).
APOE n Genotypes frequencies (%) Allele frequencies (%)
Genotype e2/2 e2/3 e2/4 e3/3 e3/4 e4/4 e2 e3 e4
East Asian
(NRCD)		 Aβ(-)* (%) 577 0.3 10.4 0.5 74.3 14.2 0.2 5.8 86.6 7.6
Aβ(+)* (%) 306 0.6 2.6 1.6 42.8 42.5 9.8 2.8 65.4 31.9
γ2 (P) 180.60 (4.010-37) 178.33 (1.810-39)
Caucasian
(ADNI)		 Aβ (-) (%) 475 0.4 13.7 1.1 66.1 17.1 1.7 11.5 73.5 15.0
Aβ (+) (%) 592 0 2.5 2.9 33.4 47.4 13.2 3.5 54.8 41.7
γ2 (P) 203.05 (4.51x10-46) 122.16 (2.1x10-28)
* Ab (-)는 아밀로이드-음성 피험자, Ab (+)는 아밀로이드-양성 피험자를 나타냄.
APOE 유전자형 및 아밀로이드 축적 사이의 연관성 연구에서, 한국인의 e4/4 피험자들이 코카서스인과 비교하여 현저히 높은 오즈비를 나타냈으며 (odds ratios for e4/4 = 125.1 and 20.92 for Korean and Caucasian), 이는 임상적으로 진단된 피험자로부터의 결과와 일치하였다 (표 1 및 표 5). 이러한 결과는 다른 인종 그룹과 비교하여 동아시아인의 e4 동형접합체가 보다 더 알츠하이머병에 취약함을 제시한다.
Population n e3/3† e2/2 + e2/3 e2/4 e3/4 e4/4
OR‡
(95% C.I.)		 P OR
(95% C.I.)		 P OR
(95% C.I.)		 P OR
(95% C.I.)		 P
East Asian
(NRCD)		 883 Ref 0.49
(0.2-0.9)		 0.049 5.33
(1.2-22.8)		 0.024 5.26
(3.7-7.4)		 1.910-21 125.10
(16.7-935.2)		 3.010-6
Caucasian
(ADNI)		 1067 Ref 0.38
(0.2-0.7)		 0.0015 6.27
(2.4-19.7)		 0.0005 6.46
(4.7-8.9)		 2.810-30 20.92
(10.2-48.9)		 1.310-14
* 다른 인종그룹에서 APOE 유전자형과 아밀로이드-기초 신경병리학적 진단의 연관성을 로지스틱회기법으로 분석함; † e3/3를 참고 유전자형으로 사용함; ‡ 오즈비를 성별 및 연령에 따라 조정함.
APOE 유전자 주변의 다형성 스크리닝
동아시아인, 코카서스인 및 아프리카인 혈통 순서의 위험도를 갖는 인종 간간 상이한 e4/4 위험도가, APOE 주변의 유전자 다형성에서 기인할 것으로 추정하였다. 원인 기작을 조사하기 위해, 본 발명자들은 서로 다른 인종 그룹들 간의 대립유전자 빈도에 관련된 APOE 주변 유전자 40 kb 영역 내의 SNPs를 스크리닝 하였다 (도 1의 A). 40 kb에 걸친 630개의 임퓨팅된 SNPs 중에서, 72개 SNPs를 기준, 즉 동아시아인, 코카서스인 및 아프리카인 혈통 순서의 대립유전자 빈도 또는 그 반대의 빈도 순서와 같은 기준에 따라 선정하였다. 이어서, 본 발명자들은 SNPs를, APOE 조정 없이 알츠하이머병과 유의성 있는 관련도 및 마이너 대립유전자 빈도에 따라 제거하였다. 그 결과로서, 3개의 SNPs, rs449647, rs405509, 및 rs440446를 도출하였다. 이들 다형성은 APOE 프로모터 및 인트론 영역 (도 1의 B)에 위치하였다. 이들은 동아시아인, 코카서스인 및 아프리카인 혈통에서 대립유전자 (rs449647-A, rs405509-T, 및 rs440446-G) 빈도의 큰 차이를 보였다 (도 1의 C). 이들 중에서, rs405509는 인종 그룹 간 현저한 차이들 나타냈다 (Based on 1000 genome database, T-allele frequency = 0.67, 0.48, and 0.24 for East Asian, Caucasian, and African ancestry, respectively). 특히, 동아시아인으로부터의 e4 동형접합체는 90.4% TT-유전자형인 반면에, 코카서스인 및 아프리카인은 각각 64.2% 및 21.3%의 TT-유전자형을 가졌으며, 이는 rs405509 대립유전자 빈도의 차이가 다른 인종 그룹간의 e4/4에 대한 AD 발병에 대한 감수성에 차이를 제공할 것 일 수 있다. rs449647 및 rs440446는 다른 인종 그룹 간에 상이한 대립형질 빈도를 나타냈으나, e4/4에서 이들의 빈도는 인종 그룹 간에 큰 차이가 없었다.
rs405509와 알츠하이머병의 관련성
rs405509의 TT 유전자형이 e3/4 및 e4/4에서 알츠하이머병의 높은 위험도를 부여 하는지 여부를 조사하기 위해, 본 발명자들은 e3/4 및 e4/4 피험자에서 rs405509의 관련성을 테스트하였다. 예상한 것과 같이, rs405509-TT가 NRCD 데이터세트 (동아시아인) (표 6)로부터의 3/4 및 e4/4 피험자 그룹 둘 모두에서 현저히 높은 오즈비를 보였으며, 이는 e4/4의 위험도에서의 인종적 차이를 제시하였다. 높은 rs405509-TT 빈도를 지닌 동아시아인에서의 e4 동형접합체가 알츠하이머병에 대해 코카서스인 및 아프리카인 혈통보다 더 높은 감수성을 나타냈다.
Group Total
(n) 		APOE e3/4
(n) 		rs405509 in e3/4
( TT vs GT + GG ) 		APOE e4/4
(n) 		rs405509 in e4/4
( TT vs GT + GG )
OR†
(95% C.I.) 		P OR†
(95% C.I .) 		P
NRCD NP 14322 2272 1.40
(1.19-1.65)		 6.59x10-05 140 3.59
(1.94-6.62)		 4.48 x10-05
AD 2079 855 197
† rs405509-TT 유전자형의 오즈비를 rs405509-GT+GG 유전자형을 참고로 하고, e3/4 및 e4/4 유전자형 피험자에서 로지스틱회기법으로 분석함; ‡ NP는 정상인 인구집단 대조군임; § AD는 알츠하이머병 환자임.
또한, e3/4 및 e4/4-매개 알츠하이머병 위험도에 대한 rs405509의 영향을 확인하기 위해, 본 발명자들은 다른 rs405509 유전자형 배경, rs405509-TT, GT, 및 GG에서 e3/4 및 e4/4의 연관성을 분석하였다 (표 7). 그 결과, e3/4 및 e4/4 피험자는 NRCD 및 ADNI 데이터세트 둘 모두에서 rs405509-G 대립유전자 배경보다 rs405509-TT 유전자형에 대해 보다 더 높은 오즈비를 나타냈다.
Dataset rs405509 n e3/3 e3/4 e4/4
Odds ratio
(95% C.I .) 		P Odds ratio
(95% C.I .) 		P
NRCD TT 8773 ref 4.23 (3.71 4.81) 2.55E-105 15.53 (12.14 19.87) 1.39E-105
GT 7212 ref 3.69 (3.08 4.41) 3.90E-46 7.50 (3.62 15.57) 6.24E-8
GG 7183 ref 2.09 (1.03 4.23) 0.041 4.36 (0.18 107.99) N/A
ADNI TT 265 ref 6.79 (3.67 13.03) 2.80E-9 22.83 (7.89 85.42) 1.54E-7
GT 482 ref 5.03 (3.27 7.85) 3.75E-13 11.85 (4.22 42.72) 1.83E-5
GG 197 ref 5.09 (2.09 13.63) 5.73E-4 N/A N/A
* APOE 유전자형 e3/4 및 e4/4의 오즈비를 알츠하이머병에 대한 e3/3를 참고로 하고, 각각의 rs405509 유전자형 데이터세트 (rs405509-TT, rs405509-GT, 및 rs405509-GG 유전자형)에서 로지스틱회기법으로 분석하였다.
APOE e4/4와 뇌 위축의 연관성
APOE e4/4에 의해 매개된 뇌 위축이 인종 간 차이를 나타내는지 여부를 확인하기 위해, 본 발명자들은 동아시아인 및 코카서스인을 대상으로 일반선형모델을 통해 e4/4 및 e3/3 피험자 사이의 포인트-와이즈 (point-wise) 피질 두께를 분석하였다. 동아시아인 및 코카서스인 둘 모두 e4/4 피험자가 e3/3와 비교하여 보다 더 얇은 피질 영역을 나타냈다 (도 2A, 2B, 및 2C). e4/4-의존적으로 수축된 영역은 내후각-해마곁-방추형 (entorhinal-parahippocampal-fusiform), 설전부 (precuneus), 및 하위두정소엽(inferior parietal lobule) 이었다. (P<0.05) 놀랍게도, 이들 영역에서의 피질 두께 감소가 코카서스인과 비교하여 동아시아인에서 훨씬 강하게 나타났다. 공분산 분석 (ANCOVA)를 수행하여 e4/4-유도 피질 위축에서의 인종 간 차이를 측정하였다. 피질 위축 영역에서의 상대적 평균 피질두께를 e3/3을 참조로하여 e4/4-피험자에 대해 계산하였다. 동아시아인 및 코카서스인 둘 모두 내후각피질 및 해마곁피질 (entorhinal cortex and parahippocampal cortex) 및 설전부 (precuneus)를 포함하는 중막측두피질 (medial temporal cortex) 내 평균 피질두께에서 e4/4 및 e3/3 사이에 큰 차이를 보였다 (*P < 0.05, **P < 0.01). 또한, 동아시아인은 코카서스인과 비교하여 e4/4/ 및 e3/4 사이에 보다 더 큰 차이를 나타냈다 (도 2B 및 2C). 동아시아인 및 코카서스인 사이의 e4/4의 상대적 피질 수축의 직접적인 비교 (e3/3로 정상화) 또한 유의성 있는 결과를 나타냈다 (*P < 0.05, **P < 0.01). 또한, 본 발명자들은 동아시아인 및 코카서스인에서 e4/4 및 e3/3 피험자 간의 해마 부피를 분석하였다. 동아시아인 및 코카서스인 둘 모두에서 e3/3와 비교하여 e4/4에서 해마 위축이 보다 더 현저하게 나타났으나, e3/3와 비교하여 e4/4-유도 해마 위축율은 코카서스인보다 동아시아인에서 높게 나타났다 (**P < 0.01) (도 2D). 이러한 결과는 동아시아인이 피질 두께감소 및 해마수축을 포함하는 APOE e4/4-매개 뇌 위축에 대해 보다 더 취약함을 제시한다. e4/4 동형접합체에서 rs405509의 뇌 위축에 대한 영향을 조사하기 위해, 본 발명자들은 e4/4 및 rs405509 (e4/4-TT, e4/4-GT, 및 e4/4-GG) 각 유전자형의 조합에 따른 피질 두께 감소를, 코카서스인 피험자에서의 e3/3를 참조로 하여 분석하였다 (도 2E, 2F, 및 2G). rs405509-TT를 갖는 e4/4 피험자들이 중막측두피질 (medial temporal cortex) (내후각피질 및 해마곁피질) 및 설전부 내에서 현저한 클러스터를 보였다. (P < 0.05) 반면에, rs405509-G 대립유전자를 지닌 e4/4 피험자들은 그러한 클러스터를 보이지 않았다. ACNOVA에 의한 정량적 비교분석은, r405509-TT 유전자형을 지닌 e4/4가 e3/3와 비교하여, 중막측두피질 내 (F = 8.38, P < 0.01) 및 설전부 내 (F = 10.707, P < 0.01)에서 현저한 위축을 보인 반면에, rs405509-GG를 지닌 e4/4는 피질 영역에서 어떠한 유의성도 보이지 않았다 (도 2F 및 2G). 본 발명자들은 또한 코카서스인에서 rs405509-TT 및 rs405509-GG를 지닌 e4/4 피험자의 해마 위축을 테스트하였다. rs405509-TT를 지닌 e4/4의 해마 수축이 e3/3 보다 더 강하게 나타난 반면에, rs405509-GG를 지닌 e4/4의 수축은 현저하지 않았다 (도 2H). 이들 신경영상 결과는 rs405509에서 TT 유전자형이 알츠하이머병의 위험도에 영향을 줄 뿐만아니라 e4/4 피험자의 뇌 수축에도 연관되는 것을 뒷받침한다. 표 8은 신경영상 분석에 참여한 피험자를 나타낸다.
East Asian*
(NRCD)		 Caucasian†
(ADNI)
n 1684 831
Age§ (y, mean ± SD) 72.77 ± 5.12 74.70 ± 6.59
Female (n, %) 1028 (61.0%) 358 (43.0%)
Years of education (y, mean ± SD) 9.01 ± 5.10 16.05 ± 2.78
MMSE (mean ± SD) 26.01 ± 3.84 27.43 ± 2.54
* 동아시아인은 대한민국 광주시 조선대학교 NRCD의 참여자임; † 코카서스인은 ADNI코호트 참여자임; § 노인의 연령은 60세이상 90세 미만임.
APOE의 발현
본 발명에 따르면, rs405509는 e4 동형접합체에서 알츠하이머병의 발병 및 뇌 수축과 관련된다. 따라서, 본 발명자들은 APOE의 조절에 대한 rs405509의 생물학적 관련성을 분석하였다. rs405509 유전자형이 APOE 단백질의 발현을 조절하는 지 여부를 조사하기 위해, 본 발명자들은 e3/3 피험자에서 rs405509-TT, GT, 및 GG 유전자형의 사람혈청에 대한 웨스턴블롯팅을 수행하였다 (도 3A). rs405509-TT를 지닌 상기 피험자에서 APOE 단백질 수준이 rs405509-GG 및 GT를 지닌 피험자의 수준과 비교하여 놀라운 수준으로 감소하였다 (도 3A). 이러한 결과는 이전 연구와 일치하는 것이었으며, 이는 APOE의 감소된 수준이 알츠하이머병의 증가된 위험도와 연관됨을 제시한다. 또한, APOE의 전사활성에서의 rs405509의 영향을 리포터 유전자 분석을 통해 확인하였다. 상기 분석은 rs405509-T 대립유전자를 지니는 AD 환자 및 rs405509-G를 지니고 정상의 인지력을 갖는 개체로부터의 APOE 프로모터 단편을 이용하여 수행하였다. 각 프로모터 영역에서의 rs405509 대립유전자를 선택적-대립유전자 (alternative-allele)로 변경하고고, 이어서 루시페라아제 기반의 리포터 유전자 어세이를 수행했다 (도 3C 및 3D). rs405509 위치에서 T에서 G로의 단일염기 변이는 APOE 프로모터 활성의 놀라운 증가를 가져온 반면에 (대조군 대비 160%), G에서 T로의 치환은 프로모터 활성의 극적인 감소를 가져왔다 (대조군 대비 66%). 이는 rs405509-T 대립유전자가 G 대립유전자와 비교하여 APOE 전사를 감소시키는 것을 제시한다. 이러한 결과는 rs405509가 APOE 단백질의 수준을 조절함에 의해 e4/4의 효과를 조절하는 것을 제시한다.
본 발명은 혈액 또는 생체시료로부터 채취한 게놈 DNA에서 APOE 유전자형 뿐 아니라, APOE 프로모터에 있는 rs405509의 유전변이를 분석함에 의해 치매 위험도 예측을 보다 더 정확하게 할 수 있는 방법을 제공한다. 본 발명은 MRI 뇌영상, 신경심리검사, 뇌척수액(CSF) 검사, 아밀로이드-PET검사 등의 복합적인 임상 및 병리학적 정보와 더불어 치매 빅데이터 기반의 미래 진단기술에 기여할 수 있다.
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Claims (14)

  1. 핵산을 포함하는 피험자에서 분리된 샘플에서 경도인지장애 또는 알츠하이머병 (AD)을 나타내는 유전적 변이를 검출하여, 경도인지장애 또는 알츠하이머병을 진단하거나 이들 질환에 대한 위험도를 예측하는 방법으로서,
    (a) APOE E4 대립유전자를 암호화하는 유전자 또는 이들의 유전자 산물로부터 선택된 유전자에서 상기 유전적 변이의 존재 또는 부재를 검출할 수 있는 시약과 상기 샘플을 접촉시키는 단계; 및
    (b) APOE 프로모터의 rs405509 T 대립유전자를 암호화하는 유전자 또는 이들의 유전자 산물로부터 선택된 상기 유전적 변이의 존재 또는 부재를 검출할 수 있는 시약과 상기 샘플을 접촉시키는 단계를 포함하여,
    상기 APOE E4/E4 및 rs405509 T/T 유전적 변이의 존재는 상기 피험자가 경도인지장애 또는 알츠하이머병 환자이거나, 경도인장애 또는 알츠하이머병에 대해 위험도를 갖는 것을 나타내는 것인,
    경도인지장애 또는 알츠하이머병을 진단하거나 이들 질환에 대한 위험도를 예측하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 APOE E4/E4 및 rs405509 T/T의 유전적 변이의 존재 또는 부재를 검출하는 방법이, 상기 피험자에서 분리된 샘플에서 핵산을 단일가닥 형으로 얻어 상보적인 프라이머 세트와 복합체를 형성한 후 상기 복합체에서 상기 유전적 변이의 존재 또는 부재를 분석하는 것인, 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 복합체에서 APOE E4/E4 및 rs405509 T/T의 유전적 변이의 존재 또는 부재를 분석하는 것이, 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction), 핵산 분해 (nuclease digestion), 혼성화 (hybridization), 서던 블로팅 (Southern blotting), 제한효소 단편다형성 (restriction enzyme fragment polymorphism), 시퀀싱 (sequencing), 프라이머 확장 (primer extension), 단일가닥 형태 다형성 (single-stranded conformation polymorphism), 또는 상기 방법들을 함께 사용하여 분석하는 것인, 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 피험자에서 분리된 샘플에서 얻은 핵산을 증폭하는 것인, 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 피험자에서 분리된 샘플에서 얻은 핵산이 게놈 DNA인 것인, 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 피험자에서 분리된 샘플에서 얻은 핵산이 RNA인 것인, 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 피험자의 대뇌피질두께에 대한 영상을 수득하는 것을 더 포함하고, 상기 대뇌피질두께가 위축된 것이 상기 피험자가 경도인지장애 또는 알츠하이머병 환자이거나, 경도인장애 또는 알츠하이머병에 대해 위험도를 갖는 것을 나타내는 것인, 경도인지장애 또는 알츠하이머병을 진단하거나 이들 질환에 대한 위험도를 예측하는 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 대뇌피질두께에 대한 영상이 MR 뇌영상인 것인, 경도인지장애 또는 알츠하이머병을 진단하거나 이들 질환에 대한 위험도를 예측하는 방법.
  9. 제 1항, 제 7항, 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 신경심리검사, 뇌척수액 (CSF) 검사 및 아밀로이드-PET 검사로 구성된 검상 중 하나 이상을 추가로 수행하는 것을 특징으로 하는, 경도인지장애 또는 알츠하이머병을 진단하거나 이들 질환에 대한 위험도를 예측하는 방법.
  10. APOE E4 대립유전자를 암호화하는 유전자 또는 이들의 유전자 산물로부터 선택된 유전자에서 APOE E4/E4 유전적 변이의 존재 또는 부재를 검출하고, 추가로 APOE 프로모터의 rs405509 T 대립유전자를 암호화하는 유전자 또는 이들의 유전자 산물로부터 선택된 rs405509 T/T 유전적 변이의 존재 또는 부재를 검출하는, 경도인지장애 또는 알츠하이머병의 진단 또는 예측을 위한 키트.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 APOE E4 대립유전자 및 상기 APOE 프로모터 rs405509 T 대립유전자에 대하여 상보적인 프라이머 세트 및 반응효소를 포함하는, 경도인지장애 또는 알츠하이머병의 진단 또는 예측을 위한 키트.
  12. 제 10항에 있어서, 유전적 변이를 분석하는 분석 방법이 포함된 키트.
  13. 제 10항에 있어서, 핵산을 증폭하는 방법이 포함된 키트.
  14. 제 10항에 있어서, 기준 대조표준이 포함된 키트.
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