KR20180120044A - Breast cancer diagnostic kit using autoantibody - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 자가항체를 이용한 유방암의 진단용 조성물, 진단키트 및 진단방법에 관한 것이다.The present invention relates to a diagnostic composition, a diagnostic kit and a diagnostic method for breast cancer using an autoantibody.
유방암(breast cancer)은 유방에 발생하는 모든 악성 종양을 통틀어 말하는 것으로, 유방에 비정상적인 세포조직이 계속 자라거나 다른 장기로 퍼지는 치명적인 질병이다. 이러한 유방암에 관한 연구는 고령화 사회로 인해 증가되고 있는 유방암의 예방 및 치료를 위한 핵심적 기술 분야이며, 여성의 건강과 행복한 삶을 위해 극복해야 할 인류의 난제이다. 특히, 우리나라는 전 세계에서 고령화 속도가 가장 빠른 나라중의 하나로 향후 유방암의 치료제에 대한 수요가 급증할 것으로 전망되고 있다. 따라서 유방암에 대한 여러 치료제의 효능 검사를 빠른 시간 내에 측정할 수 있는 방법의 개발은 물론, 적절한 치료제의 투여 및 조기 진단을 위한 정확한 진단 기술의 개발이 절실히 요구되고 있다.Breast cancer is a term that refers to all the malignant tumors that occur in the breast, and it is a fatal disease that continues to grow abnormal cell tissue in the breast or spread to other organs. Research on breast cancer is a key technology area for the prevention and treatment of breast cancer, which is increasing due to the aging society, and it is a human challenge to overcome for women 's health and happiness. In particular, Korea is one of the fastest aging countries in the world, and demand for treatment of breast cancer is expected to surge in the future. Therefore, it is urgently required to develop a method for measuring the efficacy of various therapeutic agents for breast cancer within a short period of time, as well as to develop an accurate diagnostic technique for administration of an appropriate therapeutic agent and early diagnosis.
현재 유방암의 확진 시 사용되는 진단법으로는 X-선 유방촬영술, 초음파검사법, 자기공명촬영법이 있고 최종적으로는 조직의 생검을 실시하여 병리학적 진단을 내리며, 그 전까지는 환자의 병력을 통한 임상적 진단 및 영상 검사에 의존하고 있다. 그러나 이러한 임상적 진단 결과는 병리학적 진단 결과와 상당한 차이를 나타내고 있기 때문에 정확한 감별 진단법의 마련이 시급한 실정이다. Currently, diagnostic methods used to confirm breast cancer include X-ray mammography, ultrasound, and magnetic resonance imaging. Ultimately, biopsy of the tissue is performed to make a pathological diagnosis. Up to that time, clinical diagnosis And image inspection. However, since the clinical diagnosis is significantly different from that of pathological diagnosis, it is urgent to establish accurate differential diagnosis.
최근 유방암 환자의 혈청을 대상으로 특이하게 증가 혹은 감소하는 표적 물질을 측정함으로써 유방암의 조기 진단에 이용하려는 시도가 이루어지고 있으며, 외국의 경우 최신의 프로테오믹스 기술을 이용하여 혈청 내 표적 물질의 양이나 변화를 측정함으로써 유방암의 조기 진단법 개발에 한 걸음 다가서고 있다.Recently, attempts have been made to use early detection of breast cancer by measuring target substances that specifically increase or decrease in the serum of breast cancer patients. In foreign countries, using the latest proteomics technology, , Which is one step closer to the development of early detection methods for breast cancer.
유방암 발병 예측 인자 개발은 바이오마커의 발굴 기술과 직결된다. 바이오마커란 DNA, RNA, 대사물질, 단백질 및 단백질 조각 등에서 유래된 단일 분자 또는 분자들의 패턴을 근거로 한 분자적 정보로서 체내에서 유전적 또는 후생 유전적 변화의 영향으로 유발된 신체의 변화를 감지할 수 있는 지표를 뜻한다. 이러한 지표들은 포스트 게놈시대를 맞이하여 맞춤형 의료를 앞당길 수 있는 주요 수단으로 급부상 하고 있다. 바이오마커는 크게 DNA, RNA를 기반으로 하는 핵산 기반 바이오마커와 단백질 및 그 일부분 등을 기반으로 하는 단백질기반 바이오마커로 구분 될 수 있으며, 이 중 단백질체 및 자가항체들은 단백질 바이오마커들로써 환자의 혈청 내에 존재하며 검출이 용이한 장점으로 인해 바이오마커로의 중요한 가치를 나타낸다. The development of predictors of breast cancer development is directly related to biomarker discovery technology. Biomarkers are molecular information based on patterns of single molecules or molecules derived from DNA, RNA, metabolites, proteins and protein fragments. They detect changes in the body caused by genetic or wartigenic genetic changes in the body. It is an indicator that can be done. These indicators are emerging as the main means of advancing customized medicine in the post genome era. Biomarkers can be classified into protein-based biomarkers based on nucleic acid-based biomarkers based on DNA and RNA, and protein-based biomarkers. Proteomic and autoantibodies are protein biomarkers, Present an important value as a biomarker due to the presence and ease of detection.
그 중에서도 단백질 칩은 이러한 단백질 바이오마커들의 검출 시 사용되는 주요 진단 도구로써 소량의 시료를 이용하여 최대한의 분석 결과를 얻을 수 있으며, 반응 시간이 단축되므로 분석에 소모되는 시간과 노동력 및 비용을 절감할 수 있다. 또한 각 환자의 시료별로 분석하고자 하는 단백질의 종류에 따라 다양한 단백질 칩을 이용할 수 있다는 장점을 지니고, 특히, 단백질 칩과 바이오마커로써의 자가항체는 유방암진단등의 암진단 뿐아니라 노인성 치매 진단 키트 개발 등에 적용되는 등 다양한 응용 분야를 가지고 있어 향후 의료 분야에서 광범위하게 이용될 수 있는 가치를 지닌다. Among them, protein chip is the main diagnostic tool used for the detection of these protein biomarkers. It can obtain the maximum analysis result by using a small amount of sample and shortens the reaction time, thereby saving time, labor and cost . In addition, according to each patient's sample, various protein chips can be used depending on the kinds of proteins to be analyzed. In particular, auto-antibodies as protein chips and biomarkers are used not only for cancer diagnosis such as breast cancer diagnosis, And the like, and thus has a value that can be widely used in the medical field in the future.
그러나 현재까지의 단백질 칩은 집적된 항원의 숫자의 제한 등으로 다양한 자가항체들의 발굴이 용이하지 않으며, 혈청 내 소량이 존재할 경우 검출 시 민감도가 매우 낮아 진단의 정확성이 떨어진다는 문제점이 있다. 따라서 단백질 칩을 활용한 바이오마커의 개발의 열쇠는 질환 특이적 바이오마커의 검출을 위해 단백질 칩의 집적된 인간유래 단백질의 수, 특이도와 민감도를 동시에 높이는 것이다.However, to date, protein chips are not easy to detect various autoantibodies due to the limitation of the number of accumulated antigens, and when there is a small amount of serum, there is a problem that the sensitivity is low and the accuracy of diagnosis is low. Therefore, the key to the development of biomarkers using protein chips is to simultaneously increase the number, specificity, and sensitivity of integrated human-derived proteins in protein chips for the detection of disease-specific biomarkers.
본 발명자들은 유방암의 진단에 있어 민감도와 특이도가 높은 새로운 유방암 진단용 바이오마커로 자가항체를 개발하고자 예의연구 노력하였다. 그 결과 유방암 환자의 자가항체에 민감도 및 특이도가 높은 유방암 바이오마커를 동정하고 본 발명을 완성하였다. The present inventors sought to develop an autoantibody as a new biomarker for the diagnosis of breast cancer, which has high sensitivity and specificity in the diagnosis of breast cancer. As a result, a breast cancer biomarker having high sensitivity and specificity for an autoantibody of breast cancer patients was identified and the present invention was completed.
대한민국 등록특허 제10-1083420호는 유방암 진단용 빈쿨린 자가항체 및 이를 이용한 진단키트를 개시하고 있으며, 대한민국 등록특허 제10-0991289호는 유방암 진단용 as-Hs 당단백질 자가항체 및 이를 이용한 진단키트를 개시하고 있다.Korean Patent No. 10-1083420 discloses a baculline autoantibody for breast cancer diagnosis and a diagnostic kit using the same. Korean Patent No. 10-0991289 discloses an as-Hs glycoprotein autoantibody for breast cancer diagnosis and a diagnostic kit using the same. .
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.
본 발명자들은 유방암의 진단에 있어 민감도와 특이도가 높은 새로운 유방암 진단용 바이오마커로 자가항체를 개발하고자 예의연구 노력하였다. 그 결과 유방암 환자의 자가항체에 민감도 및 특이도가 높은 유방암 바이오마커를 동정하고 본 발명을 완성하였다. The present inventors sought to develop an autoantibody as a new biomarker for the diagnosis of breast cancer, which has high sensitivity and specificity in the diagnosis of breast cancer. As a result, a breast cancer biomarker having high sensitivity and specificity for an autoantibody of breast cancer patients was identified and the present invention was completed.
따라서, 본 발명의 목적은 TXNL2(Thioredoxin-like 2) 단백질 또는 이의 단편에 대한 자가항체의 수준을 측정하기 위하여, 상기 자가항체에 특이적으로 결합하는 TXNL2 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 암 진단용 조성물을 제공하는데 있다.It is therefore an object of the present invention to provide a cancer diagnostic composition comprising a TXNL2 protein or a fragment thereof that specifically binds to an autoantibody to measure the level of autoantibodies against a TXNL2 (Thioredoxin-like 2) protein or fragment thereof .
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 암 진단용 키트를 제공하는데 있다.It is another object of the present invention to provide a cancer diagnostic kit comprising the composition.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 TXNL2(Thioredoxin-like 2) 단백질 또는 이의 단편에 대한 자가항체의 수준을 측정하여 암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는데 있다. It is another object of the present invention to provide a method for measuring the level of autoantibodies against the TXNL2 (Thioredoxin-like 2) protein or its fragment to provide information necessary for cancer diagnosis.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 TXNL2(Thioredoxin-like 2) 단백질 또는 이의 단편에 대한 자가항체의 수준을 측정하기 위하여, 상기 자가항체에 특이적으로 결합하는 TXNL2 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유방암 진단용 조성물을 제공한다.According to one aspect of the present invention, the present invention provides a method for detecting the level of an autoantibody against a TXNL2 (Thioredoxin-like 2) protein or fragment thereof, comprising the TXNL2 protein or fragment thereof that specifically binds to the autoantibody There is provided a composition for diagnosing breast cancer.
본 발명자들은 유방암 진단의 민감도와 특이도가 높으면서도 조기에 유방암을 진단할 수 있는 바이오 마커를 개발하기 위하여 17,000 (17K)개의 인간 단백질들이 (인간 단백질의 90% 이상을 포함함) 집적되어 있는 고밀도 인간 단백질 칩과, 임상샘플을 활용하여 바이오마커(자가 항체)를 동정하기에 이르렀다. 본 발명자들이 동정한 본 발명의 바이오마커인 TXNL2(Thioredoxin-like 2)는 GLRX3(Glutaredoxin-3)로도 명명되기도 하며 여러 개의 도메인으로 구성된 단백질로서 N-말단에 Thioredoxins 도메인이 있고 그 뒤에 두개의 Glutaredoxins이 있는 단백질이다. Thioredoxin은 산화 환원 활동에 필요한 Cys-Gly-Pro-Cys (CGPC) 활성 부위가 존재하고, 다이설파이드 형태의 다이티올(dithiol)에서 두 개의 Cys 잔기의 가역적인 산화를 겪는다. 암세포는 활성산소의 발생이 많아 세포 사멸이 일어나야 되지만 TXNL2(Thioredoxin-like 2)의 과발현을 통하여 활성산소에 의한 세포사멸을 피할 수 있는 것으로 알려져 있다. 최근보고서에 의하면 유방암 환자에서의 Thioredoxin-like 2 (TXNL2)의 과발현이 보고되고 있으나, 아직 유방암 환자에서의 Thioredoxin-like 2 (TXNL2)에 의한 자가항체를 유방암 환자의 진단에의 사용가능성에 대해서는 보고된 바 없다.The inventors of the present invention found that 17,000 (17K) human proteins (including more than 90% of human proteins) are integrated in a high density Human protein chips and clinical samples have been used to identify biomarkers (autoantibodies). TXNL2 (Thioredoxin-like 2), which is a biomarker of the present invention identified by the present inventors, is also called GLRX3 (Glutaredoxin-3), and is a protein composed of several domains, and has a Thioredoxins domain at its N-terminus followed by two Glutaredoxins It is a protein. Thioredoxin has a Cys-Gly-Pro-Cys (CGPC) active site required for redox activity and undergoes reversible oxidation of two Cys residues in a disulfide-type dithiol. Cancer cells are known to be able to avoid cell death due to active oxygen through overexpression of TXNL2 (Thioredoxin-like 2), although apoptosis must occur due to the generation of active oxygen. Recent reports have reported the overexpression of Thioredoxin-like 2 (TXNL2) in breast cancer patients, but the use of thioredoxin-like 2 (TXNL2) -dependent autoantibodies in breast cancer patients has not yet been established It is not.
본 발명자들은 특이도와 민감도의 문제를 해결한 단백질 칩 기술력으로 유방암 환자 특이적인 자가항체들의 바이오마커인 TXNL2(Thioredoxin-like2) 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 컨스트럭트를 제작하고 이를 각각 BCM102, BCM113, BCM114, BCM115, BCM120로 명명하였다.The present inventors produced constructs containing a TXNL2 (Thioredoxin-like2) protein or a fragment thereof, which is a biomarker of breast cancer-specific autoantibodies, as a protein chip technology that solves the problem of specificity and sensitivity, and prepared BCM102, BCM113, BCM114, BCM115, BCM120.
상기 BCM102는 TXNL2 단백질(aa 1-334)의 N-말단에 GST 택이 융합된 GST-TXNL2 aa 1-334이고, 상기 BCM113는 TXNL2의 단편(aa 2-130)의 N-말단에 6XHis 택이 융합된 6XHis-TXNL2 aa 2-130이며, 상기 BCM114는 TXNL2의 단편(aa 132-239)의 N-말단에 6XHis 택이 융합된 6XHis-TXNL2 aa 132-239이고, 상기 BCM115는 TXNL2의 단편(aa 229-334)의 N-말단에 6XHis 택이 융합된 6XHis-TXNL2 aa 229-334이며, 상기 BCM120은 TXNL2의 단편(aa 2-239)의 N-말단에 6XHis 택이 융합된 6XHis-TXNL2 aa 2-239이다.The BCM102 is GST-TXNL2 aa 1-334 having a GST tag fused at the N-terminus of the TXNL2 protein (aa 1-334), and the BCM113 has a 6XHis tack at the N-terminus of the TXNL2 fragment (aa 2-130) Fused 6XHis-TXNL2 aa2-130, wherein the BCM114 is 6XHis-TXNL2 aa 132-239 fused with a 6XHis tack at the N-terminus of a fragment (aa 132-239) of TXNL2 and the BCM115 is a fragment of a TXNL2 TXNL2 aa 229-334 fused with a 6XHis tack at the N-terminus of the TXNL2 fragment (aa 2-239) and 6XHis-TXNL2 aa 229-334 fused with the 6XHis tack at the N-terminus of the TXNL2 fragment -239.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 TXNL2 단백질 또는 이의 단편은 공지된 TXNL2 단백질의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 이용하여 합성하거나, 세포로부터 추출하거나, 유전자 재조합 기술을 이용하여 미생물로부터 생산할 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the TXNL2 protein or fragment thereof can be synthesized using all or a part of the amino acid sequence of a known TXNL2 protein, extracted from cells, or produced from microorganisms using gene recombination technology.
본 발명의 상기 TXNL2 단백질 또는 이의 단편은 서열목록 제1서열 내지 제5서열 중 어느 한 서열로 표시되는 아미노산 서열을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. The TXNL2 protein or fragment thereof of the present invention includes, but is not limited to, an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 1 to 5.
서열목록 제1서열은 TXNL2 전체 단백질(aa 1-334)의 아미노산 서열이고, 서열목록 제2서열은 TXNL2 단편(aa 2-130)의 아미노산 서열이며, 서열목록 제3서열은 TXNL2 단편(aa 132-239)의 아미노산 서열이고, 서열목록 제4서열은 TXNL2 단편(aa 229-334)의 아미노산 서열이며, 서열목록 제4서열은 TXNL2 단편(aa 2-239)의 아미노산 서열이다.(Aa 1-334), the second sequence is the amino acid sequence of the TXNL2 fragment (aa2-130), the third sequence is the TXNL2 fragment -239), the fourth sequence is the amino acid sequence of the TXNL2 fragment (aa 229-334), and the fourth sequence is the amino acid sequence of the TXNL2 fragment (aa2-239).
상기 아미노산 서열로 이루어진 단백질은 상술한 5종의 컨스트럭트를 숙주세포에서 발현하여 제작한 GST 태깅된, 또는 6XHis 태깅된 TXNL2 단백질 또는 단편에서 상기 GST 택, 6XHis 택을 제거함으로써 수득할 수 있다.The protein consisting of the amino acid sequence can be obtained by removing the GST tag and the 6XHis tag from a GST-tagged or 6XHis-tagged TXNL2 protein or fragment prepared by expressing the aforementioned five constructs in a host cell.
본 발명에서 상기 TXNL2 단백질 또는 이의 단편은 유방암 환자 또는 유방암으로 진단되기 전의 환자에 생물학적 시료에 포함되어 있는 TXNL2 단백질 또는 이의 단편에 대한 자가항체와 특이적으로 결합할 수 있으며, 본 발명의 실시예에서 확인된 바와 같이 상기 단백질 또는 이의 단편에 대한 자가항체를 검출함으로써 유방암의 정확한 진단이 가능하다. 따라서 본 발명의 상기 TXNL2 단백질 또는 이의 단편은 유방암 진단용 조성물로서 유용하게 사용할 수 있다.In the present invention, the TXNL2 protein or fragment thereof can specifically bind to an autoantibody to a TXNL2 protein or a fragment thereof contained in a biological sample in a patient before being diagnosed as a breast cancer patient or a breast cancer. In an embodiment of the present invention As can be seen, accurate diagnosis of breast cancer is possible by detecting autoantibodies to the protein or fragment thereof. Therefore, the TXNL2 protein or fragment thereof of the present invention can be usefully used as a composition for the diagnosis of breast cancer.
본 발명의 명세서에서 용어 “자가항체(autoantibodies, AAb)”는 항체의 일종으로 개체가 가지고 있는 개체 자신의 단백질에 대한 면역 반응에 의해 생성된 항체를 말한다. 많은 자가면역질환의 경우(예컨대 루푸스) 이러한 자가항체를 생성하는 것으로 알려져 있다. 단일한 종류의 자가항체 검사는 그 자체로 진단적이지는 않으나 특정 질환이 존재할 가능성이 있는지 또는 없는지에 대한 단서를 제공할 수 있다. 각 자가항체 결과는 개별적으로 또는 전체 병력의 일부로서 고려되어야 한다. As used herein, the term " autoantibodies (AAb) " refers to an antibody produced by an immune response to an individual's own protein that an individual has. In the case of many autoimmune diseases (such as lupus) it is known to produce such autoantibodies. A single type of autoantibody test is not diagnostic by itself, but may provide clues as to whether or not a particular disease may or may not be present. The results of each autoantibody should be considered individually or as part of the overall history.
본 발명의 명세서에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)를 포함한다.The term " diagnosing " in the context of the present invention includes determining the susceptibility of an object to a particular disease or disorder, determining whether an object currently has a particular disease or disorder, Determining the prognosis of an object (e.g., identifying a pre-metastatic or metastatic cancerous condition, determining a stage of a cancer, or determining the response of a cancer to treatment), or determining the presence or absence of a disease, such as a therametrics And monitoring the status of the object to provide information about efficacy).
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 TXNL2 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 조성물을 포함하는 유방암 진단용 키트를 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a kit for the diagnosis of breast cancer comprising a composition comprising the TXNL2 protein or a fragment thereof.
본 발명의 유방암 진단키트는 TXNL2 단백질의 자가항체를 타겟 항원으로 하여, 상기 TXNL2 단백질의 자가항체와 특이적으로 결합하는 항원-항체 반응 방식으로 실시될 수 있다. 이 경우, 상기 항원 항체 반응은 본 발명의 TXNL2 단백질의 자가항체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시된다.The breast cancer diagnostic kit of the present invention can be carried out in an antigen-antibody reaction method in which an autoantibody of TXNL2 protein is used as a target antigen and specifically binds to an autoantibody of the TXNL2 protein. In this case, the antigen-antibody reaction is carried out using an antibody or an aptamer that specifically binds to the autoantibody of the TXNL2 protein of the present invention.
본 발명에서 이용되는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.The antibody used in the present invention is a polyclonal or monoclonal antibody, preferably a monoclonal antibody. Antibodies can be produced using methods commonly practiced in the art, such as the fusion method (Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6: 511-519 (1976)), the recombinant DNA method (US Patent No. 4,816,56) Or phage antibody library methods (Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 58, 1-597 (1991)). General procedures for antibody preparation are described in Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; And Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley / Greene, NY, 1991, the disclosures of which are incorporated herein by reference. For example, the preparation of hybridoma cells producing monoclonal antibodies is accomplished by fusing an immortalized cell line with an antibody-producing lymphocyte, and the techniques necessary for this process are well known and readily practicable by those skilled in the art. Polyclonal antibodies can be obtained by injecting a protein antigen into a suitable animal, collecting the antiserum from the animal, and then separating the antibody from the antiserum using a known affinity technique.
본 발명의 진단키트에서 상기 항원-항체 반응은 통상의 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay), RIA(Radioimmnoassay), 샌드위치 측정법 (Sandwich assay), 폴리아크릴아미드 겔 상의 웨스턴 블롯(Western Blot), 면역블롯 분석(Immunoblot assay) 또는 면역조직화학염색 방법 (Immnohistochemical staining)으로 측정할 수 있다.In the diagnostic kit of the present invention, the antigen-antibody reaction can be detected by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), sandwich assay, Western blot on polyacrylamide gel, (Immunoblot assay) or immunohistochemical staining (Immunohistochemical staining).
이 경우 상기 TXNL2 단백질 또는 이의 단편 등을 고정하기 위한 고정체; 상기 TXNL2에 대한 자가항체와 특이적으로 결합하는 발색표지체가 컨쥬게이션된 2차 항체 접합체(Conjugate); 상기 표지체와 발색반응할 발색기질 용액 세척액, 및 효소반응 정지용액을 포함할 수 있다.In this case, a fixture for fixing the TXNL2 protein or a fragment thereof; A second antibody conjugate conjugated with a chromogenic marker that specifically binds to an autoantibody to TXNL2; A color developing substrate solution washing solution for color reaction with the label, and an enzyme reaction stop solution.
상기 항원-항체 결합 반응을 위한 고정체로는 니트로셀룰로오스 막, PVDF막, 폴리비닐 (Polyvinyl) 수지 또는 폴리스티렌 (Polystyrene) 수지로 합성된 웰 플레이트 (Well plate) 및 유리로 된 슬라이드 글라스(Slide glass) 등이 사용될 수 있다.Examples of the immobilizer for the antigen-antibody binding reaction include a well plate synthesized from a nitrocellulose membrane, a PVDF membrane, a polyvinyl resin or a polystyrene resin, and a slide glass made of glass Can be used.
상기 2차 항체의 표지체는 발색반응을 하는 통상의 발색제가 바람직하며, HRP(Horseradish peroxidase), 알칼리성 인산분해효소(Alkaline phosphatase), 콜로이드 골드 (Coloid gold), FITC (Poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC (Rhodamine-B-isothiocyanate) 등의 형광물질 (Fluorescein) 및 색소 (Dye) 등의 표지체가 사용될 수 있다.The marker of the secondary antibody is preferably a conventional coloring agent that undergoes a chromogenic reaction, and is preferably selected from the group consisting of HRP (Horseradish peroxidase), alkaline phosphatase, colloidal gold, poly (L-lysine-fluorescein isothiocyanate Fluorescent material such as Rhodamine-B-isothiocyanate (RITC), and coloring matter (Dye) may be used.
상기 발색을 유도하는 기질은 발색반응을 하는 표지체에 따라 사용하는 것이 바람직하며, TMB (3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS [2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)], OPD (ophenylenediamine) 등을 사용할 수 있다. 이때, 발색제 기질은 완충용액 (0.1 M NaAc, pH 5.5)에 용해된 상태로 제공되는 것이 더욱 바람직하다. TMB와 같은 발색기질은 2차 항체 접합체의 표지체로 사용된 HRP에 의해 분해되어 발색 침적체를 생성하고 그 발색 침적체의 침적 정도를 육안으로 확인함으로써 TXNL2 단백질의 자가항체 존재 유무를 검출한다.Preferably, the substrate for inducing color development is used according to a labeling substance that undergoes a color reaction. TMB (3,3 ', 5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS [2,2'-azino-bis ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid], OPD (ophenylenediamine), and the like. At this time, it is more preferable that the coloring agent substrate is provided in a dissolved state in a buffer solution (0.1 M NaAc, pH 5.5). The chromogenic substrate such as TMB is decomposed by the HRP used as a marker of the secondary antibody conjugate to generate a chromogenic precipitate, and the presence or absence of an autoantibody of TXNL2 protein is detected by visually observing the degree of deposition of the chromogenic precipitate.
세척액은 인산염 완충용액, NaCl 및 트윈 20 (Tween 20)을 포함하는 것이 바람직하며, 0.02 M 인산염 완충용액, 0.13 M NaCl, 및 0.05% 트윈 20 (Tween 20)으로 구성된 완충용액(PBST)이 더욱 바람직하다. 세척액은 항원-항체 결합반응 후 항원항체 결합체에 2차 항체를 반응시킨 다음 적당량을 고정체에 가하여 3 내지 6회 세척한다.Preferably, the wash liquor comprises a phosphate buffer solution, NaCl and
반응 정지용액은 황산 용액(H2SO4)이 사용될 수 있다.The reaction stop solution may be a sulfuric acid solution (H 2 SO 4 ).
본 발명에서 유방암 진단 마커로 선별된 TXNL2 단백질의 자가항체는 지금까지 유방암의 발병 및 진행을 진단할 수 있는 표지로서 사용될 수 있음이 알려지지 않았다. 또한, 상기 단백질은 혈액에서 검출이 가능하기 때문에 생검(biopsy)을 통해서만 진단이 가능하던 기존의 단백질과는 달리 환자에게 불편을 초래하지 않으면서 간편한 방법으로 유방암을 진단하는데 활용될 수 있다.It is not known that the autoantibody of TXNL2 protein selected by the breast cancer diagnostic marker in the present invention can be used as a marker for diagnosing the onset and progression of breast cancer. In addition, since the protein can be detected in blood, it can be used to diagnose breast cancer by a simple method without inconvenience to the patient unlike the conventional protein which was diagnosed only by biopsy.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 유방암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for providing information necessary for diagnosis of breast cancer, comprising the following steps.
(a) 검사대상 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 TXNL2(Thioredoxin-like 2) 단백질 또는 이의 단편에 대한 자가항체의 수준을 측정하는 단계;(a) measuring the level of autoantibody against a TXNL2 (Thioredoxin-like 2) protein or fragment thereof from a biological sample isolated from an individual to be tested;
(b) 상기 측정된 단백질 수준을 정상인 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 측정된 TXNL2 수준과 비교하는 단계:(b) comparing the measured protein level to a TXNL2 level measured from a biological sample isolated from a normal subject,
상기 검사 대상 개체의 TXNL2 수준이 정상인 개체의 TXNL2 수준보다 높은 경우 유방암 양성으로 판정한다.If the level of TXNL2 of the subject to be examined is higher than the level of TXNL2 of a normal subject, it is determined to be positive for breast cancer.
본 발명의 유방암의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 단계별로 설명한다:The following provides a step-by-step description of how to provide the information necessary for the diagnosis of breast cancer of the present invention:
단계 (a): 검사대상 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 Step (a): From the biological sample isolated from the subject to be tested TXNL2TXNL2 단백질 또는 이의 단편에 대한 자가항체의 수준을 측정 Determine the level of autoantibody to a protein or fragment thereof
먼저 유방암 진단에 대한 정보가 필요한 검사대상 개체로부터 생물학적 시료를 분리한다.First, the biological sample is separated from the test subject, which needs information about breast cancer diagnosis.
본 명세서에 기재된 용어 “생물학적 시료”는 혈액 등을 포함한 생물의 모든 물질을 말하는 것이며, 본 발명에 TXNL2 자가항체 검출에 사용할 수 있는 생물학적 시료는 조직, 세포, 모발, 구강 조직, 구강 세포, 혈액, 림프, 골수 액, 타액, 유즙, 소변, 분변, 안구 액, 정액, 뇌추출액, 척수 액, 관절액, 복수, 양막액 또는 세포조직액이 포함하나 이에 한정되지 않는다. 생물학적 시료로서 혈액은 전혈, 혈장, 및 혈청을 포함한다.The term " biological sample " as used herein refers to all substances of an organism including blood and the like, and biological samples that can be used in the present invention for detecting TXNL2 autoantibodies include tissues, cells, hair, oral tissues, oral cells, But are not limited to, lymph, bone marrow fluid, saliva, milk, urine, feces, ocular fluid, semen, brain extract, spinal fluid, joint fluid, ascites fluid, amniotic fluid or cell tissue fluid. As a biological sample, blood contains whole blood, plasma, and serum.
구체적으로는, 상기 생물학적 시료는 혈청이다.Specifically, the biological sample is serum.
또한 상기 TXNL2 에 대한 자가항체의 검출방법은 TXNL2 단백질 또는 이의 단편을 와 접촉시켜 항원-항체 반응을 통해 자가항체의 존재를 확인하는 것을 포함한다. 상기 항원-항체 반응은 효소면역측정법(ELISA), 면역침강법, 형광면역법, 효소기질발색법, 항원-항체응집법 등을 들 수 있다. The method of detecting an autoantibody to TXNL2 also comprises contacting the TXNL2 protein or fragment thereof with an antigen-antibody reaction to confirm the presence of the autoantibody. Examples of the antigen-antibody reaction include enzyme immunoassay (ELISA), immunoprecipitation, fluorescence immunoassay, enzyme substrate staining, and antigen-antibody aggregation.
하기 실시예에서 확인할 수 있듯이, 개체로부터 혈청을 채취하여 혈청 내의 TXNL2 자가항체 수준을 측정함으로써 유방암 여부를 진단 할 수 있다.As can be seen in the following examples, serum can be collected from an individual and the level of TXNL2 autoantibodies in the serum can be measured to diagnose breast cancer.
(b) 상기 생물학적 시료로부터 측정된 (b) measuring the biological sample TXNL2에On TXNL2 대한 About 자가항체Autoantibody 수준을 정상인 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 측정된 TXNL2의 자가항체 수준과 비교 Level compared to the level of autoantibodies of TXNL2 measured from biological samples isolated from normal subjects
다음, 상기 생물학적 시료로부터 측정된 TXNL2 에 대한 자가항체 수준을 정상인 개체의 생물학적 시료로부터 측정된 TXNL2 에 대한 자가항체 수준과 비교한다. 이때 상기 검사 대상 개체의 생물학적 시료로부터 측정된 TXNL2 에 대한 자가항체 수준보다 정상 개체의 생물학적 시료로부터 측정된 TXNL2 에 대한 자가항체 수준이 높은 경우 검사 대상 개체가 유방암 양성이거나 발병 위험도가 높은 것으로 판단한다.Next, the autoantibody levels for TXNL2 measured from the biological sample are compared to the autoantibody levels for TXNL2 measured from biological samples of normal individuals. In this case, when the autoantibody level to TXNL2 measured from the biological sample of normal individuals is higher than that of the autoantibody to TXNL2 measured from the biological sample of the test subject, it is judged that the test subject is positive for breast cancer or high risk.
구체적으로, 본 발명의 키트 또는 방법에 의해 분석되는 TXNL2에 대한 자가항체의 수준을 측정하기 위해 사용되는 TXNL2 단백질 또는 단편이 서열목록 제1서열의 아미노산을 포함하는 경우 컷-오프 값(cut-off value)은 150 pg/ml 이고, 서열목록 제2서열의 아미노산을 포함하는 경우 컷-오프 값은 804 pg/ml 이며, 서열목록 제3서열의 아미노산을 포함하는 경우 컷-오프 값은 2.9 ng/ml 이고, 서열목록 제4서열의 아미노산을 포함하는 경우 컷-오프 값은 733 pg/ml 이며, 서열목록 제5서열의 아미노산을 포함하는 경우 컷-오프 값은 OD(450 nm) 값 0.15 이다.Specifically, when the TXNL2 protein or fragment used to measure the level of autoantibody to TXNL2 analyzed by the kit or method of the present invention comprises an amino acid of the first sequence of the sequence listing, the cut-off value value is 150 pg / ml, the cut-off value when the amino acid sequence of the second sequence is included is 804 pg / ml, and the cut-off value when the amino acid sequence of the third sequence is included is 2.9 ng / ml and the cut-off value of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is 733 pg / ml, and the cut-off value of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 is 0.15 OD (450 nm).
종래 유방암의 진단은 대부분 유방촬영술에 의존해 감별을 실시하고 있으나, 치밀유방의 경우 유방촬영술을 이용한 조기진단시 50% 이하로 현저히 감별능력이 떨어진다는 문제점이 있다. 치밀조직에서의 유방암 조기진단율의 경우 유방촬영술이 22.9%, 지방형 유방은 38.9%의 감별능력을 보이는 것에 그치는데, 유방암 환자의 70% 가까이가 치밀 유방을 보유하고 있다는 점을 고려하면 치밀 유방과 관계 없는 혈청에서의 유방암 바이오마커의 개발이 절실히 필요한 실정이다(ref : Boyd et al, 2007 N ENGL j MED 336:3, Kazarian et al, BJC 2017, 116, 501,임청환 journal of the koreans society of radiology vol 6 No1).Conventional diagnosis of breast cancer is largely based on mammography. However, in the case of dense breast, early diagnosis using mammography has a problem that its ability to discriminate is less than 50%. In early detection of breast cancer in the dense tissue, mammography was 22.9% and lipomatous breast was distinguished in 38.9%. Considering that nearly 70% of breast cancer patients have dense breast, (Ref. Boyd et al., 2007 N Engl J MED 336: 3, Kazarian et al., BJC 2017, 116, 501, Journal of the Korean Society of Radiology Vol. 6 No1).
본 발명의 실시예에 따르면, 본 발명의 TXNL2 단백질 또는 단편에 대한 자가 항체는 혈청에서 보고된 단독의 바이오마커로서, 유방암 진단용도로서는 기존의 유방촬영술에 비하여 우수한 효과를 나타내며, 상술한 치밀조직을 가진 유방암 환자에서 유방촬영술로 유방암을 조기 감별할 수 없다는 한계를 고려할 때 충분한 경쟁력을 보유하고 있는 것이며 치밀 유방조직에서 유방암을 조기에 감별할 수 있는 진단제로 유용하게 사용할 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the autoantibody to the TXNL2 protein or fragment of the present invention is a biomarker that is reported in the serum as a sole biomarker, which is superior to conventional mammography for diagnosis of breast cancer. The purpose of this study was to evaluate the efficacy and usefulness of breast cancer screening for the diagnosis of breast cancer.
본 발명의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법은 상술한 유방암의 진단용 조성물, 유방암 진단용 키트를 구성으로 이용하여 수행되는 것이므로 명세서의 과도한 복잡성을 방지하기 위하여 중복되는 범위 내에서의 기재를 생략한다.The method for providing the information necessary for diagnosis of the present invention is performed using the above-described composition for the diagnosis of breast cancer and the kit for breast cancer diagnosis, so the description within the overlapping range is omitted in order to avoid excessive complexity of the specification.
본 발명은 TXNL2(Thioredoxin-like 2) 단백질 또는 이의 단편에 대한 자가항체를 이용한 유방암의 진단용 조성물, 진단키트 및 진단방법을 제공한다. 본 발명은 TXNL2(Thioredoxin-like 2) 단백질 또는 이의 단편에 대한 자가항체를 검출함으로써 유방암을 보다 정확하고 조기에 진단할 수 있다. The present invention provides a diagnostic composition, diagnostic kit and diagnostic method for breast cancer using autoantibodies against TXNL2 (Thioredoxin-like 2) protein or fragment thereof. The present invention allows for more accurate and early diagnosis of breast cancer by detecting autoantibodies against TXNL2 (Thioredoxin-like 2) protein or fragment thereof.
도 1a 내지 도 1e는 본 발명의 TXNL2 단백질 또는 이의 단편(BCM102, BCM113, BCM114, BCM115, BCM120)을 제작하기 위한 컨스트럭트의 클로닝 방법을 나타낸 모식도이다.
도 2a 내지 도 2e는 본 발명의 TXNL2 단백질 또는 이의 단편(BCM102, BCM113, BCM114, BCM115, BCM120)의 클로닝 결과를 나타낸 도이다.
도 3a 내지 도 3d는 본 발명의 TXNL2 단백질 또는 이의 단편(BCM102, BCM113, BCM114, BCM115, BCM120)의 발현을 확인한 도이다.
도 4는 본 발명의 TXNL2 단백질 또는 이의 단편(BCM102)의 크기 배제 크로마토그래피 정제 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 TXNL2 단백질 또는 이의 단편(BCM113)의 크기 배제 크로마토그래피 정제 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 TXNL2 단백질 또는 이의 단편(BCM114)의 크기 배제 크로마토그래피 정제 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 TXNL2 단백질 또는 이의 단편(BCM115)의 크기 배제 크로마토그래피 정제 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 TXNL2 단백질 또는 이의 단편(BCM120)의 크기 배제 크로마토그래피 정제 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 abcam사에서 제공한 기존 물질의 표준곡선 산출 결과를 나타낸 도이다. FIGS. 1A to 1E are schematic diagrams illustrating a method for cloning constructs for producing the TXNL2 protein or fragments thereof (BCM102, BCM113, BCM114, BCM115, BCM120) of the present invention.
FIGS. 2A to 2E are diagrams showing the results of cloning of the TXNL2 protein of the present invention or fragments thereof (BCM102, BCM113, BCM114, BCM115, BCM120).
FIGS. 3A to 3D are graphs showing the expression of the TXNL2 protein or fragments thereof (BCM102, BCM113, BCM114, BCM115, BCM120) of the present invention.
FIG. 4 is a graph showing the size-exclusion chromatography purification results of the TXNL2 protein or its fragment (BCM102) of the present invention.
FIG. 5 is a graph showing the size-exclusion chromatography purification results of the TXNL2 protein or fragment thereof (BCM113) of the present invention.
FIG. 6 is a graph showing the size-exclusion chromatography purification results of the TXNL2 protein or fragment thereof (BCM114) of the present invention.
FIG. 7 is a graph showing the size-exclusion chromatography purification results of the TXNL2 protein of the present invention or its fragment (BCM115). FIG.
FIG. 8 is a graph showing the size-exclusion chromatography purification results of the TXNL2 protein or fragment thereof (BCM120) of the present invention.
9 is a graph showing a standard curve calculation result of the existing material provided by abcam.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .
실시예Example
실시예Example 1: 유방암 1: Breast cancer 바이오마커Biomarker 컨스트럭트(construct)의Construct 제작 making
유방암 바이오 마커의 후보물질을 BCM (Breast Cancer Marker)으로 명명하고 TXNL2(Thioredoxin-like2)의 전체 도메인을 포함하여 총 5 가지 컨스트럭트를 제작하고 이들을 각각 (1) BCM102(GST-TXNL2 aa 1-334), (2) BCM113(6XHis-TXNL2 aa 2-130), (3) BCM114(6XHis-TXNL2 aa 132-239), (4) BCM115(6XHis-TXNL2 aa 229-334), (5) BCM120(6XHis-TXNL2 aa 2-239)로 명명하였다. A total of five constructs including the entire domain of TXNL2 (Thioredoxin-like2) were named as BCM (Breast Cancer Marker) and BCM102 (GST-TXNL2 aa 1- BCM114 (6XHis-TXNL2 aa 2-130), (3) BCM114 (6XHis-TXNL2 aa 132-239), (4) BCM115 (6XHis- TXNL2 aa 229-334), (5) BCM120 6XHis-TXNL2 aa 2-239).
상기 BCM102, BCM113, BCM114, BCM115, BCM120 총 5가지 후보물질을 클로닝하기 위해 TXNL2 단백질의 아미노산 서열을 근거로 합성 전문 업체(코스모진텍, 대한민국)에 의뢰하여 합성하였고 완성된 TXNL2의 DNA 염기 서열을 템플레이트(template)로 PCR 프라이머(primer)를 제작한 뒤, pGEX4T1 벡터 또는 pET-28a 벡터에 클로닝 하였다. In order to clone the five candidates, BCM102, BCM113, BCM114, BCM115 and BCM120, the cDNAs were synthesized based on the amino acid sequence of the TXNL2 protein and synthesized. The DNA sequence of the completed TXNL2 was synthesized PCR primers were prepared with a template and cloned into pGEX4T1 vector or pET-28a vector.
상기 5종의 BCM100 시리즈는 Thioredoxin-like2(TXNL2) 단백질의 N-말단에 GST-tag 또는 His-tag을 접합한 컨스트럭트들이다. BCM102 (aa 2-334), BCM113 (aa 2-130), BCM114 (aa 132-239), BCM115 (aa 229-334), BCM120 (aa 2-239) 컨스트럭트들은 각각의 제작을 위하여 TXNL2 유전자를 증폭을 위한 PCR 프라이머를 제작하고 (표 1 내지 5), pGEX4T1 또는 pET-28a 벡터에 클로닝 하였다(도 1 및 도 2).The 5 kinds of BCM100 series are constructs in which GST-tag or His-tag is conjugated to the N-terminal of Thioredoxin-like2 (TXNL2) protein. Constructs of BCM102 (aa 2-334), BCM113 (aa2-130), BCM114 (aa 132-239), BCM115 (aa 229-334), BCM120 PCR primers for amplification were prepared (Tables 1 to 5) and cloned into pGEX4T1 or pET-28a vectors (FIGS. 1 and 2).
BCM102 제작을 위한 PCR primer PCR primer for BCM102 production
BCM113 제작을 위한 PCR primer PCR primer for making BCM113
pET-28a, Forward primerBCM114 (TXNL2 aa 132-239)
pET-28a,
BCM114 제작을 위한 PCR primer PCR primer for making BCM114
BCM115 제작을 위한 PCR primer PCR primer for the production of BCM115
BCM120 제작을 위한 PCR primer PCR primer for BCM120 production
실시예 2: 유방암 바이오마커의 대장균을 이용한 발현Example 2: Expression of breast cancer biomarker using E. coli
상기 실시예 1에서 제작한 유방암 바이오 마커(BCM102, BCM113, BCM114, BCM115, BCM120) 컨스트럭트를 발현하기 위해 대장균 발현세포주인 C43(DE3) 세포에 42℃ heat shock을 통해 형질전환 시킨 후, LB 배지에서 1 mM IPTG를 처리(induction)하여 37℃ 조건하에서 배양하고 상기 5종의 유방암 마커(BCM102, BCM113, BCM114, BCM115, BCM120)의 발현을 확인하였다.To express the construct of breast cancer biomarker (BCM102, BCM113, BCM114, BCM115, BCM120) prepared in Example 1, C43 (DE3) cells expressing E. coli were transformed through heat shock at 42 DEG C, 1 mM IPTG was inoculated in the medium and cultured at 37 ° C to confirm the expression of the 5 types of breast cancer markers (BCM102, BCM113, BCM114, BCM115, BCM120).
결과는 도 3에 나타내었다.The results are shown in FIG.
도 3에 나타낸 바와 같이, 상기 5종의 유방암 바이오마커(BCM102, BCM113, BCM114, BCM115, BCM120) 컨스트럭트는 모두 발현이 잘 이루어진 것을 확인하였다. As shown in FIG. 3, all five breast cancer biomarkers (BCM102, BCM113, BCM114, BCM115 and BCM120) were found to be well expressed.
실시예 3: 유방암 바이오마커의 정제Example 3: Purification of breast cancer biomarkers
3-1. BCM102의 배양 및 정제(GST-융합 단백질의 정제)3-1. Culture and purification of BCM102 (purification of GST-fusion protein)
유방암 바이오마커 단백질 정제를 위한 숙주세포는 T7 RNA 폴리머레이즈(polymerase)의 레벨을 낮추어 과다 발현된 재조합 단백질의 독성으로 인한 세포 사멸을 감소시킬 수 있는 E. coli C43(DE3) 균주를 이용하였으며, 플라스미드(plasmid)는 pGEX-4T1 vector를 사용하여 발현하였다. 상기 플라스미드에 포함되어있는 GST 단백질 택(tag)을 이용하여 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)가 가능하도록 생성되었다.The host cell for breast cancer biomarker protein purification was E. coli C43 (DE3) strain, which can lower the level of T7 RNA polymerase and reduce cell death due to the toxicity of over-expressed recombinant protein. The plasmid (plasmid) was expressed using pGEX-4T1 vector. Was generated to allow affinity chromatography using the GST protein tag contained in the plasmid.
대장균 발현에 일반적으로 사용하는 LB 배지에 항생제 암피실린을 넣고 진탕배양기(shaking incubator)를 이용하여 37 ℃, 200 rpm의 조건으로 하룻밤 배양하였다. 이후 새로운 LB 배지에 전날 키운 세포 배양배지를 약 1%가 되도록 접종하고 항생제인 암피실린을 넣고 진탕배양기를 이용하여 37℃, 200 rpm의 조건으로 추가 배양하였다. 접종 후 OD600 값이 0.6 일 때 1 mM IPTG을 이용하여 유도하였고, 37℃, 200 rpm의 조건으로 3시간 배양하였다. 이후 배양액은 4 ℃, 8000 rpm으로 원심 분리하여 펠렛을 얻었고, 이렇게 확보된 세포에 배양배지 1 L당 약 20 ml의 세포 용해버퍼(lysis buffer) (50 mM Tris-HCl, 20mM NaCl, 10% 글리세롤, 2mM β-머캡토에탄올(mercaptoethanol), 0.2 mM PMSF, pH 8.0)를 넣어 세포와 혼합하였다. 이후 초음파 파쇄기를 이용하여 10분간 (pulse on 3초, pulse off 3초) 세포를 용해하였다. 수용액 상의 BCM102 및 단백질들과 세포를 분리하기 위하여 원심분리기를 이용하여 20,000 rpm의 속도로 1시간 원심분리를 하였다. Antibiotic ampicillin was added to LB medium, which is generally used for Escherichia coli expression, and cultured overnight at 37 ° C and 200 rpm using a shaking incubator. Then, the cells were inoculated to a fresh LB medium at a concentration of about 1%, and further cultured with ampicillin as an antibiotic in a shaking incubator at 37 ° C and 200 rpm. After inoculation OD 600 value was derived using 1 mM IPTG when 0.6 days, 37 ℃, and incubated 3 hours under the conditions of 200 rpm. Then, the culture was centrifuged at 8000 rpm at 4 ° C to obtain pellets. To the thus obtained cells, about 20 ml of lysis buffer (50 mM Tris-HCl, 20 mM NaCl, 10% glycerol , 2 mM? -Mercaptoethanol, 0.2 mM PMSF, pH 8.0) was added to the cells. The cells were then lysed for 10 minutes (pulse on 3 seconds, pulse off 3 seconds) using an ultrasonic disrupter. Centrifugation was performed at a speed of 20,000 rpm for 1 hour using a centrifuge to separate BCM102 and proteins and cells from the aqueous phase.
이렇게 세포로부터 분리된 BCM102 및 단백질 수용액에서 BCM102 만을 정제하기 위하여 친화성 크로마토그래피를 수행하였다. 상기 친화성 크로마토그래피는 폐쇄 GST 컬럼(GST Hitrap FF column, GE)을 이용하여 BCM102의 N-말단에 융합(fusion)되어 있는 GST 단백질과 결합을 유도하여 GST 융합 단백질을 정제하는 방법이다. 먼저 평형버퍼(Equilibrium buffer) (50mM Tris-HCl, 20 mM NaCl, 10% 글리세롤, 2 mM β-머캡토에탄올, pH 8.0)를 흘려주어 평형상태가 되도록 하였다. BCM102 및 단백질 수용액을 컬럼에 흘려줌으로써 레진과 GST 융합 BCM102가 결합하도록 한 후, 10 CV (column volume)의 평형버퍼(equilibrium buffer)를 흘려주어 비특이적으로 결합한 불순물들을 제거하였다. GST 선택 레진으로부터 GST 융합 BCM102를 분리하기 위해 용출버퍼(elution buffer) (50 mM Tris-HCl, 20 mM NaCl, 10% 글리세롤, 2 mM β-머캡토에탄올, 10 mM 감소 글루타치온(10 mM reduced glutathionine, pH 8.0)을 흘려주었다. 1차 정제 결과 정제된 GST 융합 BCM102의 균질성을 확인하기 위해 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다. AKTA prime FPLC 시스템에 HiLoad 16/600 Superdex 200 pg 컬럼 (GE Healthcare)을 연결하고 평형버퍼(equilibrium buffer) (PBS, pH 7.2)를 흘려주어 평형상태가 되도록 하였다. 2차 정제 과정에서 용출된 GST 융합 BCM102 수용액을 컬럼에 흘려주었고, 이때 보유 볼륨(retention volume)은 83.3 ml로 측정되었다. GPC data에 의해 모노머 형태를 형성하고 있는 것으로 예측되었다. 크로마토그램에서 GST 융합 BCM102를 나타내는 280 nm 흡광도 및 SDS-PAGE 실험 결과로 미루어 보아, 균질성은 매우 높은 것으로 평가되었다. 전기영동 결과 약 62 kDa의 BCM102 단백질이 발현 되었음을 확인하였다(도 4).Affinity chromatography was performed to purify BCM102 alone from the cell-isolated BCM102 and protein aqueous solution. The affinity chromatography is a method of purifying a GST fusion protein by inducing binding with a GST protein fused to the N-terminus of BCM102 using a closed GST column (GST Hitrap FF column, GE). First, equilibrium buffer (50 mM Tris-HCl, 20 mM NaCl, 10% glycerol, 2 mM? -Mercaptoethanol, pH 8.0) was allowed to equilibrate. BCM102 and a protein aqueous solution were flowed through the column to allow the resin and the GST fusion BCM102 to bind together. Thereafter, an equilibrium buffer of 10 CV (column volume) was poured to remove nonspecifically bound impurities. To remove the GST fusion BCM102 from the GST selection resin, an elution buffer (50 mM Tris-HCl, 20 mM NaCl, 10% glycerol, 2 mM? -Mercaptoethanol, 10 mM reduced glutathione, pH 8.0) was subjected to size exclusion chromatography to confirm the homogeneity of the purified GST fused BCM102 as a result of the first purification. [0157] The
3-2. BCM113의 배양 및 정제(His-tag 단백질의 정제)3-2. Culture and purification of BCM113 (purification of His-tag protein)
유방암 바이오마커 단백질 정제를 위한 숙주세포는 T7 RNA 폴리머레이즈의 레벨을 낮추어 과다 발현된 재조합 단백질의 독성으로 인한 세포 사멸을 감소시킬 수 있는 E. coli C43(DE3)을 이용하였으며, 플라스미드는 pET28a 벡터를 사용하여 발현하도록 하였고, 플라스미드에 포함되어있는 (His)x6 택(또는 6x His-tag)을 이용하여 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)가 가능하도록 생성되었다. The host cell for breast cancer biomarker protein purification was E. coli C43 (DE3), which reduces the level of T7 RNA polymerase and reduces cell death due to the toxicity of over-expressed recombinant protein. The plasmid contains the pET28a vector , And was generated to allow affinity chromatography using (His) x6 tag (or 6x His-tag) contained in the plasmid.
대장균 발현에 일반적으로 사용하는 LB 배지에 항생제 카나마이신을 넣고 진탕배양기(shaking incubator)를 이용하여 37 ℃, 200 rpm의 조건으로 하룻밤 배양하였다. 이후 새로운 LB 배지에 전날 키운 세포 배양배지를 약 1%가 되도록 접종하고 항생제인 카나마이신을 넣고 진탕배양기를 이용하여 37℃, 200 rpm의 조건으로 추가 배양하였다. The antibiotic kanamycin was added to the LB medium commonly used for Escherichia coli expression and cultured overnight at 37 ° C and 200 rpm using a shaking incubator. Then, the cell culture medium was incubated in a fresh LB medium at a concentration of about 1%, and kanamycin, an antibiotic, was added and further cultured at 37 ° C and 200 rpm in a shaking incubator.
접종 후 OD600 값이 0.6 일 때 1 mM IPTG을 이용하여 유도하였고, 18℃, 200 rpm의 조건으로 17시간 배양하였다. 이후 배양액은 4 ℃, 8000 rpm으로 원심 분리하여 펠렛을 얻었고, 이렇게 확보된 세포에 배양배지 1 L당 약 20 ml의 세포 용해버퍼(lysis buffer) (50 mM Tris-HCl, 20 mM NaCl, 10% 글리세롤, 2 mM β-머캡토에탄올(mercaptoethanol), 0.2 mM PMSF, pH 8.0)를 넣어 세포와 혼합하였다. 이후 초음파 파쇄기를 이용하여 10분간 (pulse on 3초, pulse off 3초) 세포를 용해하였다. 수용액 상의 BCM113 및 단백질들과 세포를 분리하기 위하여 원심분리기를 이용하여 20,000 rpm의 속도로 1시간 원심분리를 하였다. After inoculation OD 600 value was induced using 1 mM IPTG when the 0.6 days, 18 ℃, and incubated 17 hours under the conditions of 200 rpm. Then, the culture was centrifuged at 8000 rpm at 4 ° C to obtain pellets. To the thus obtained cells, about 20 ml of lysis buffer (50 mM Tris-HCl, 20 mM NaCl, 10% Glycerol, 2 mM? -Mercaptoethanol, 0.2 mM PMSF, pH 8.0) was added to the cells. The cells were then lysed for 10 minutes (pulse on 3 seconds, pulse off 3 seconds) using an ultrasonic disrupter. Centrifugation was carried out at a speed of 20,000 rpm for 1 hour using a centrifugal separator to separate BCM113 and proteins and cells from aqueous phase.
이렇게 세포로부터 분리된 BCM113 및 단백질 수용액에서 BCM113 만을 정제하기 위하여 친화성 크로마토그래피를 수행하였다. 상기 친화성 크로마토그래피는 폐쇄 히스티딘 컬럼(HisTrap FF column, GE)을 이용하여 BCM113의 N-말단에 융합되어 있는 6x히스티딘 단백질과 결합을 유도하여 6xHis-융합 단백질을 정제하는 방법이다. 먼저 평형버퍼(Equilibrium buffer) (50 mM Tris-HCl, 20 mM NaCl, 10% 글리세롤, 2 mM β-머캡토에탄올, pH 8.0)를 흘려주어 평형상태가 되도록 하였다. BCM101 및 단백질 수용액을 컬럼에 흘려줌으로써 레진과 6xHis 융합 BCM113이 결합하도록 한 후, 10 CV (column volume)의 워싱버퍼(Washing buffer) (50 mM Tris-HCl, 20 mM NaCl, 10% 글리세롤, 2 mM β-머캡토에탄올, 35 mM 이미다졸(Imidazol, pH 8.0)을 흘려주어 비특이적으로 결합한 불순물들을 제거하였다. 히스티딘 선택 레진으로부터 6xHis 융합 BCM101를 분리하기 위해 용출버퍼(elution buffer) (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 10% 글리세롤, 2 mM β-머캡토에탄올, 350 mM 이미다졸(pH 8.0)을 흘려주었다. 1차 정제 결과로 정제된 히스티딘 융합 BCM113은 균질성을 확인하기 위해 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다. AKTA prime FPLC 시스템에 HiLoad 16/600 Superdex 200 pg 컬럼 (GE Healthcare)을 연결하고 평형버퍼 (PBS, pH 7.2)를 흘려주어 평형상태가 되도록 하였다. 2차 정제 과정에서 용출된 히스티딘 융합 BCM113 수용액을 컬럼에 흘려주었고, 이때 보유 볼륨은 99.5 ml로 측정되었다. GPC data에 의해 모노머 형태를 형성하고 있는 것으로 예측되었다. 크로마토그램에서 히스티딘 융합 BCM113를 나타내는 280 nm 흡광도 및 SDS-PAGE 실험 결과로 미루어 보아, 균질성은 매우 높은 것으로 평가되었다. 전기영동한 결과 약 16 kDa의 BCM113 단백질이 발현 되었음을 확인하였다(도 5).Affinity chromatography was performed to purify BCM113 alone from BCM113 and protein aqueous solutions isolated from the cells. The affinity chromatography is a method of purifying a 6xHis-fusion protein by inducing binding to a 6x histidine protein fused to the N-terminus of BCM113 using a closed histidine column (HisTrap FF column, GE). First, equilibrium buffer (50 mM Tris-HCl, 20 mM NaCl, 10% glycerol, 2 mM? -Mercaptoethanol, pH 8.0) was allowed to equilibrate. BCM101 and a protein aqueous solution were flowed through a column to allow the resin to bind to the 6xHis fusion BCM113. Then, the column was washed with a washing buffer (50 mM Tris-HCl, 20 mM NaCl, 10% glycerol, 2 mM To remove the 6xHis fused BCM101 from the histidine selective resin, elution buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.4) was added to elute the biotinylated BCM101 from the histidine selective resin. , 150 mM NaCl, 10% glycerol, 2 mM [beta] -mercaptoethanol and 350 mM imidazole (pH 8.0) were subjected to size exclusion chromatography to confirm the homogeneity of the purified histidine fusion
3-3. BCM114의 배양 및 정제3-3. Culture and purification of BCM114
본 발명의 유방암 바이오마커인 BCM114는 상기 실시예 3-2의 BCM113과 동일한 방법을 배양 및 정제되었다.BCM114 which is a breast cancer biomarker of the present invention was cultured and purified in the same manner as BCM113 of Example 3-2.
2차 정제 과정에서 용출된 히스티딘 융합 BCM114 수용액을 컬럼에 흘려주었고, 보유 볼륨은 100.4 ml로 측정되었다. GPC data에 의해 모노머 형태를 형성하고 있는 것으로 예측되었다. 크로마토그램에서 히스티딘 융합 BCM114를 나타내는 280 nm 흡광도 및 SDS-PAGE 실험 결과로 미루어 보아, 균질성은 매우 높은 것으로 평가되었다. 전기영동 결과 약 14 kDa의 BCM114 단백질이 발현 되었음을 확인하였다(도 6).An aqueous solution of histidine-fused BCM114 eluted in the second purification step was flowed through the column and the holding volume was measured at 100.4 ml. It was predicted that the monomer form was formed by GPC data. From the results of an absorbance at 280 nm and an SDS-PAGE experiment showing histidine-fused BCM114 in the chromatogram, the homogeneity was evaluated to be very high. The electrophoresis revealed that about 14 kDa of BCM114 protein was expressed (Fig. 6).
3-4. BCM115의 배양 및 정제3-4. Culture and purification of BCM115
본 발명의 유방암 바이오마커인 BCM115는 상기 실시예 3-2의 BCM113과 동일한 방법을 배양 및 정제되었다.BCM115, which is a breast cancer biomarker of the present invention, was cultured and purified in the same manner as BCM113 of Example 3-2.
2차 정제 과정에서 용출된 히스티딘 융합 BCM115 수용액을 컬럼에 흘려주었고, 보유 볼륨은 99.3 ml로 측정되었다. GPC data에 의해 모노머 형태를 형성하고 있는 것으로 예측되었다. 크로마토그램에서 히스티딘 융합 BCM115를 나타내는 280 nm 흡광도 및 SDS-PAGE 실험 결과로 미루어 보아, 항원의 균질성은 매우 높은 것으로 평가되었다. 전기영동 결과 약 13 kDa의 BCM114 단백질이 발현 되었음을 확인하였다(도 7).An aqueous solution of histidine-fused BCM115 eluted in the second purification step was flowed through the column, and the holding volume was measured at 99.3 ml. It was predicted that the monomer form was formed by GPC data. From the results of an absorbance at 280 nm and an SDS-PAGE experiment showing histidine-fused BCM115 in the chromatogram, the homogeneity of the antigen was evaluated to be very high. The electrophoresis revealed that BCM114 protein of about 13 kDa was expressed (Fig. 7).
3-5. BCM120의 배양 및 정제3-5. Culture and purification of BCM120
본 발명의 유방암 바이오마커인 BCM120는 상기 실시예 3-2의 BCM113과 동일한 방법을 배양 및 정제되었다.BCM120, which is a breast cancer biomarker of the present invention, was cultured and purified in the same manner as BCM113 of Example 3-2.
2차 정제 과정에서 용출된 히스티딘 융합 BCM120 수용액을 HiLoad 16/600 Superdex 75 pg 컬럼 (GE Healthcare)에 흘려주었고, 이때 보유 볼륨은 67.3 ml로 측정되었다. GPC data에 의해 모노머 형태를 형성하고 있는 것으로 예측되었다. 크로마토그램에서 히스티딘 융합 BCM120을 나타내는 280 nm 흡광도 및 SDS-PAGE 실험 결과로 미루어 보아, 항원의 균질성은 매우 높은 것으로 평가되었다. 전기영동한 결과 약 27 kDa의 BCM120 단백질이 발현되었음을 확인하였다(도 8).The aqueous solution of histidine-fused BCM120 eluted in the second purification step was poured into a
실시예 4: 임상시료에 대한 본 발명의 유방암 바이오마커의 민감도 및 특이도 확인Example 4: Sensitivity and specificity of breast cancer biomarkers of the present invention to clinical samples
4-1.본 발명의 유방암 바이오마커(BCM102)의 민감도 및 특이도4-1. Sensitivity and specificity of the breast cancer biomarker (BCM102) of the present invention
정제된 항원 BCM102 (100 ng/웰)을 PBS로 희석하여 96 웰 ELISA 플레이트의 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하였다. 플레이트 표면에 항원을 고정시키기 위해서 4℃에서 하룻밤 반응한 후, 상층액을 제거하고 2X 카제인 버퍼(casein buffer) (Sigma, B6429-500ML) 200 ㎕를 각 웰에 분주하여 실온에서 한 시간 동안 블로킹 하였다. 아주대학교 의료원 IRB 에서 수득한 유방암 환자 등의 혈청을 2X 카제인 버퍼를 이용하여 1/500 희석하고, 이를 각각 100 ㎕씩 분주한 뒤 실온에서 1시간 반응하여 항원과 결합하도록 하였다. 반응이 끝난 후 PBST (PBS, 0.2% tween 20, pH 7.4)로 7회 세척하였다. 2차 항체 항-인간 IgG (H&L) HRP (Jackson immunoresearch, 209-035-088)를 1/5,000 희석하여 100 ㎕씩 각 웰에 분주하고 실온에서 1시간 반응하였다. 상층액을 제거하고 PBST로 7회 세척한 후, TMB(발색시약)를 100 ㎕씩 분주하였다. 5분 후 발색된 웰에 1 M HCl을 각각 100 ㎕씩 넣어 반응을 중지시키고, 마이크로플레이트 리더기를 이용해 450 ㎚ 파장에서의 흡광도를 측정하였다.The purified antigen BCM102 (100 ng / well) was diluted with PBS and added to each well of a 96 well ELISA plate by 100 [mu] l. After overnight incubation at 4 ° C to immobilize the antigen on the plate surface, the supernatant was removed and 200 μl of 2X casein buffer (Sigma, B6429-500ML) was added to each well and blocked for one hour at room temperature . Serum from breast cancer patients obtained from IRB of Ajou University Medical Center was diluted 1/500 with 2X casein buffer and 100 ㎕ each was dispensed, followed by reaction with antigen for 1 hour at room temperature. After the reaction, the cells were washed 7 times with PBST (PBS, 0.2
결과는 표 6 및 표 7에 나타내었다.The results are shown in Tables 6 and 7.
BCM102 임상시료 수BCM102 Clinical Sample Count
150 pg/mlcut-off:
150 pg / ml
BCM102의 정상인 대비 유방암환자에 대한 특이도 및 민감도Specificity and Sensitivity of Breast Cancer Patients to Normal Patients in BCM102
표 6 및 표 7에 나타낸 바와 같이, BCM102의 cut-off value를 150 pg/ml로 지정했을 때 정상군에서 14명 중 1명이 양성으로 검출되었고, 유방암 환자군에서 180명 중 72명이 양성으로 검출되었다. 따라서 정상군에 대한 양성예측치 98.63%, 음성예측치 10.74%, 특이도 92.86%, 민감도 40.00%로 측정되었다. As shown in Table 6 and Table 7, when the cut-off value of BCM102 was designated as 150 pg / ml, one out of 14 patients was detected as normal in the normal group and 72 out of 180 patients were detected as positive in the breast cancer group . The positive predictive value was 98.63%, the negative predictive value was 10.74%, the specificity was 92.86%, and the sensitivity was 40.00%.
4-2.본 발명의 유방암 바이오마커(BCM113)의 민감도 및 특이도4-2. Sensitivity and specificity of the breast cancer biomarker (BCM113) of the present invention
정제된 항원 BCM113 (100 ng/웰)을 PBS로 희석하여 96 웰 ELISA 플레이트의 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하였다. 플레이트 표면에 항원을 고정시키기 위해서 4℃에서 밤새 반응한 후, 상층액을 제거하고 2X 카제인 버퍼 (Sigma, B6429-500ML) 200 ㎕를 각 웰에 분주하여 실온에서 한 시간 동안 블로킹 하였다. 임상시료를 2X 카제인 버퍼를 이용하여 1/500 희석하고, 이를 각각 100 ㎕씩 분주한 뒤 실온에서 1시간 반응하여 항원과 결합하도록 하였다. 반응이 끝난 후 PBST (PBS, 0.2% tween 20, pH 7.4)로 7회간 세척하였다. 2차 항체 항-인간 IgG (H&L) HRP (Jackson immunoresearch, 209-035-088)를 1/5,000 희석하여 100 ㎕씩 각 웰에 분주하고 실온에서 1시간 반응하였다. 상층액을 제거하고 PBST로 7회 세척한 후, TMB (발색시약)을 100 ㎕씩 분주하였다. 5분 후 발색된 웰에 1 M의 HCl를 100 ㎕씩 넣어 반응을 중지시키고, 마이크로플레이트 리더기를 이용해 450 ㎚ 파장에서의 흡광도를 측정하였다.The purified antigen BCM113 (100 ng / well) was diluted with PBS and added to each well of a 96 well ELISA plate by 100 μl. After overnight reaction at 4 ° C to immobilize the antigen on the plate surface, the supernatant was removed and 200 μl of 2X casein buffer (Sigma, B6429-500ML) was dispensed into each well and blocked for one hour at room temperature. Clinical samples were diluted 1/500 in 2X casein buffer, and each was dispensed in 100 μl each, and allowed to react with antigen for 1 hour at room temperature. After the reaction, the cells were washed with PBST (PBS, 0.2
결과는 표 8 및 표 9에 나타내었다. The results are shown in Tables 8 and 9.
BCM113 임상시료 수BCM113 Clinical sample count
804 pg/mlcut-off:
804 pg / ml
BCM113의 정상인 대비 유방암환자에 대한 특이도 및 민감도 Specificity and Sensitivity of Breast Cancer Patients to Normal Patients in BCM113
표 8 및 표 9에 나타낸 바와 같이, BCM113의 cut-off value를 804 pg/ml로 지정했을 때 정상군에서 14명 중 1명이 양성으로 검출되었고, 유방암 환자군에서는 180명 중 73명이 양성으로 검출되었다. 따라서 정상군에 대한 양성예측치 98.65%, 음성예측치 10.83%, 특이도 92.86%, 민감도 40.56%로 측정되었다. As shown in Table 8 and Table 9, when the cut-off value of BCM113 was designated as 804 pg / ml, one out of 14 patients was detected as normal in the normal group and 73 of 180 patients were detected as positive in the breast cancer group . The positive predictive value was 98.65%, the negative predictive value was 10.83%, the specificity was 92.86%, and the sensitivity was 40.56%.
4-3.본 발명의 유방암 바이오마커(BCM114)의 민감도 및 특이도4-3 Sensitivity and specificity of the breast cancer biomarker (BCM114) of the present invention
정제된 항원 BCM114 (100 ng/웰)을 PBS로 희석하여 96 웰 ELISA 플레이트의 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하였다. 플레이트 표면에 항원을 고정시키기 위해서 4℃에서 밤새 반응한 후, 상층액을 제거하고 2X 카제인 버퍼 (Sigma, B6429-500ML) 200 ㎕를 각 웰에 분주하여 실온에서 한 시간 동안 블로킹 하였다. 임상시료를 2X 카제인 버퍼를 이용하여 1/500 희석하고, 이를 각각 100 ㎕씩 분주한 뒤 실온에서 1시간 반응하여 항원과 결합하도록 하였다. 반응이 끝난 후 PBST (PBS, 0.2% tween 20, pH 7.4)로 7회 세척하였다. 2차 항체 항-인간 IgG (H&L) HRP (Jackson immunoresearch, 209-035-088)를 1/5,000 희석하여 100 ㎕씩 각 웰에 분주하고 실온에서 1시간 반응하였다. 상층액을 제거하고 PBST로 7회 세척한 후, TMB (발색시약)을 100 ㎕씩 분주하였다. 5분 후 발색된 웰에 1 M HCl를 각각 100 ㎕씩 넣어 반응을 중지시키고, 마이크로플레이트 리더기를 이용해 450 ㎚ 파장에서의 흡광도를 측정하였다.The purified antigen BCM114 (100 ng / well) was diluted with PBS and added to each well of a 96 well ELISA plate by 100 [mu] l. After overnight reaction at 4 ° C to immobilize the antigen on the plate surface, the supernatant was removed and 200 μl of 2X casein buffer (Sigma, B6429-500ML) was dispensed into each well and blocked for one hour at room temperature. Clinical samples were diluted 1/500 in 2X casein buffer, and each was dispensed in 100 μl each, and allowed to react with antigen for 1 hour at room temperature. After the reaction, the cells were washed 7 times with PBST (PBS, 0.2
결과는 표 10 및 표 11에 나타내었다.The results are shown in Tables 10 and 11.
BCM114 임상시료 수BCM114 Clinical sample count
2.9 ng/mlcut-off:
2.9 ng /
BCM114의 정상인 대비 유방암환자에 대한 특이도 및 민감도 Specificity and Sensitivity of Breast Cancer Patients to Normal Patients in BCM114
표 10 및 표 11에 나타낸 바와 같이, BCM114의 cut-off value를 2.9 ng/ml로 지정했을 때 정상군에서 14명 중 0명이 검출되었고, 유방암 환자군에서 180명 중 61명이 검출되었다. 정상군에 대한 양성예측치 100.00%, 음성예측치 10.53%, 특이도 100.00%, 민감도 33.89%로 측정되었다. As shown in Table 10 and Table 11, when the cut-off value of BCM114 was set to 2.9 ng / ml, 0 out of 14 patients were detected in the normal group and 61 out of 180 patients in the breast cancer group were detected. The positive predictive value for normal group was 100.00%, the negative predictive value was 10.53%, the specificity was 100.00%, and the sensitivity was 33.89%.
4-4.본 발명의 유방암 바이오마커(BCM115)의 민감도 및 특이도4-4 Sensitivity and specificity of the breast cancer biomarker (BCM115) of the present invention
정제된 항원 BCM115 (100 ng/웰)을 PBS로 희석하여 96 웰 ELISA 플레이트의 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하였다. 플레이트 표면에 항원을 고정시키기 위해서 4℃에서 하룻밤 반응한 후, 상층액을 제거하고 2X 카제인 버퍼 (Sigma, B6429-500ML) 200 ㎕를 각 웰에 분주하여 실온에서 한 시간 동안 블로킹 하였다. 임상시료를 2X 카제인 버퍼를 이용하여 1/500 희석하고, 이를 각각 100 ㎕씩 분주한 뒤 실온에서 1시간 반응하여 항원과 결합하도록 하였다. 반응이 끝난 후 PBST (PBS, 0.2% tween 20, pH 7.4)로 7회 세척하였다. 2차 항체 항-인간 IgG (H&L) HRP (Jackson immunoresearch, 209-035-088)를 1/5,000 희석하여 100 ㎕씩 각 웰에 분주하고 실온에서 1시간 반응하였다. 상층액을 제거하고 PBST로 7회 세척한 후, TMB (발색시약)을 100 ㎕씩 분주하였다. 5분 후 발색된 웰에 1 M HCl를 각각 100 ㎕씩 넣어 반응을 중지시키고, 마이크로플레이트 리더기를 이용해 450 ㎚ 파장에서의 흡광도를 측정하였다.The purified antigen BCM115 (100 ng / well) was diluted with PBS and added to each well of a 96 well ELISA plate by 100 [mu] l. After overnight incubation at 4 ° C to immobilize the antigen on the plate surface, the supernatant was removed and 200 μl of 2X casein buffer (Sigma, B6429-500ML) was added to each well and blocked for one hour at room temperature. Clinical samples were diluted 1/500 in 2X casein buffer, and each was dispensed in 100 μl each, and allowed to react with antigen for 1 hour at room temperature. After the reaction, the cells were washed 7 times with PBST (PBS, 0.2
결과는 표 12 및 표 13에 나타내었다.The results are shown in Table 12 and Table 13.
BCM115 환자 수BCM115 patients
BCM115의 정상인 대비 유방암환자에 대한 특이도 및 민감도Specificity and Sensitivity of Breast Cancer Patients to Normal Patients in BCM115
표 12 및 표 13에 나타낸 바와 같이, BCM115의 cut-off value를 733 pg/ml로 지정했을 때 정상군에서 14명 중 1명이 양성으로 검출되었고, 유방암 환자군에서 180명 중 50명이 검출되었다. 따라서 정상군에 대한 양성예측치 98.04%, 음성예측치 9.09%, 특이도 92.86%, 민감도 27.78%로 측정되었다. As shown in Table 12 and Table 13, when the cut-off value of BCM115 was designated as 733 pg / ml, one out of 14 patients was detected as normal in the normal group and 50 out of 180 patients in the breast cancer group were detected. The positive predictive value was 98.04%, the negative predictive value was 9.09%, the specificity was 92.86%, and the sensitivity was 27.78%.
4-5.본 발명의 유방암 바이오마커(BCM120)의 민감도 및 특이도4-5 Sensitivity and specificity of the breast cancer biomarker (BCM120) of the present invention
정제된 항원 BCM120 (100 ng/웰)을 PBS로 희석하여 96 웰 ELISA 플레이트의 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하였다. 플레이트 표면에 항원을 고정시키기 위해서 4℃에서 하룻밤 반응한 후, 상층액을 제거하고 2X 카제인 버퍼 (Sigma, B6429-500ML) 200 ㎕를 각 웰에 분주하여 실온에서 한 시간 동안 블로킹 하였다. 임상시료를 2X 카제인 버퍼를 이용하여 1/500 희석하고, 이를 각각 100 ㎕씩 분주한 뒤 실온에서 1시간 반응하여 항원과 결합하도록 하였다. 반응이 끝난 후 PBST (PBS, 0.2% tween 20, pH 7.4)로 7회 세척하였다. 2차 항체 항-인간 IgG (H&L) HRP (Jackson immunoresearch, 209-035-088)를 1/5,000 희석하여 100 ㎕씩 각 웰에 분주하고 실온에서 1시간 반응하였다. 상층액을 제거하고 PBST로 7회 세척한 후, TMB (발색시약)을 100 ㎕씩 분주하였다. 5분 후 발색된 웰에 1 M HCl를 각각 100 ㎕씩 넣어 반응을 중지시키고, 마이크로플레이트 리더기를 이용해 450 ㎚ 파장에서의 흡광도를 측정하였다.The purified antigen BCM120 (100 ng / well) was diluted with PBS and added to each well of a 96 well ELISA plate by 100 [mu] l. After overnight incubation at 4 ° C to immobilize the antigen on the plate surface, the supernatant was removed and 200 μl of 2X casein buffer (Sigma, B6429-500ML) was added to each well and blocked for one hour at room temperature. Clinical samples were diluted 1/500 in 2X casein buffer, and each was dispensed in 100 μl each, and allowed to react with antigen for 1 hour at room temperature. After the reaction, the cells were washed 7 times with PBST (PBS, 0.2
결과는 표 14 및 표 15에 나타내었다.The results are shown in Tables 14 and 15.
BCM120 환자 수Number of BCM120 patients
BCM120의 정상인 대비 유방암환자에 대한 특이도 및 민감도Specificity and Sensitivity of BCM120 to Normal Patients in Breast Cancer Patients
표 14 및 표 15에 나타낸 바와 같이, BCM120의 cut-off value를 173 ng/ml로 지정했을 때 정상군에서 14명 중 1명이 검출되었고, 유방암 환자군에서 180명 중 13명이 검출되었다. 따라서 정상군에 대한 양성예측치 92.86%, 음성예측치 43.33%, 특이도 92.86%, 민감도 43.33%로 측정되었다. As shown in Table 14 and Table 15, when the cut-off value of BCM120 was set at 173 ng / ml, one out of 14 patients were detected in the normal group and 13 out of 180 patients in the breast cancer group. The positive predictive value was 92.86%, the negative predictive value was 43.33%, the specificity was 92.86%, and the sensitivity was 43.33%.
4-6. 타사 유방암 모니터링 마커(CA-15-3)의 민감도 및 특이도4-6. Sensitivity and Specificity of Third-Party Breast Cancer Monitoring Markers (CA-15-3)
본 발명의 유방암 바이오마커의 유효성을 확인하기 위하여 유방암 모니터링 마커로 알려진 CA-15-3의 민감도 및 특이도를 측정하였다.To confirm the efficacy of the breast cancer biomarker of the present invention, the sensitivity and specificity of CA-15-3, which is known as a breast cancer monitoring marker, were measured.
CA-15-3은 유방선 상피조직에서 분비되는 에피시알린(episialin)으로 알려진 뮤신의 항원으로 유방암과 같은 선암의 표면에서 과발현되어 양이 증가하면 혈액에서 검출되기 때문에 종양표지자로 이용된다. 비전이성 유방암 진단에서 양성률이 불과 23%에 불과하여 유방암 진단의 선별검사로 사용하기는 어렵고, 전이성 유방암 (80%) 추적검사로 민감도와 특이도가 높아 좋은 표지자로 알려져 있다. 종양의 크기보다는 종양세포의 활성도와 관계가 있고 재발암의 63% 정도에서 임상적 근거가 나타나기 3~4개원 전에 그 수치가 증가하는 것으로 보고되었다. 따라서 CA-15-3은 유방암의 치료평가와 경과를 감시하고, 재발 및 원격전이 여부를 파악하는데 유용하다. FDA는 진행성 또는 재발성 유방암을 치료하는데 추적검사 목적으로 상기 CA-15-3 종양표지자를 인정한다.CA-15-3 is an epitope of mucin known as episialin secreted from mammary epithelial tissues. It is overexpressed on the surface of adenocarcinomas such as breast cancer and is used as a tumor marker because it is detected in the blood when the amount increases. It is difficult to use it as a screening test because it is only 23% in the diagnosis of non - metastatic breast cancer. It is known as a good marker because of the high sensitivity and specificity of metastatic breast cancer (80%). It has been reported that the size of the tumor is related to the activity of the tumor cells and that 63% of the recurrent cancers are increased before 3 ~ 4 months before the clinical basis appears. Thus, CA-15-3 is useful for monitoring the treatment outcome and course of breast cancer and for determining recurrence and distant metastasis. The FDA recognizes the CA-15-3 tumor marker for follow-up testing to treat advanced or recurrent breast cancer.
현재 인간 유래 혈장 검체에서 유방암 유무를 판정할 수 있도록 시판되고 있는 제품은 없기 때문에, 대조군으로 유방암의 모니터링 마커로 활용하고 있는 CA15-3을 기반으로 제품화되고 있는 제품인 abcam사의 Cancer Antigen CA15-3 Human ELISA Kit를 이용하여 정상인 및 유방암과 타암종에 대한 임상시료의 특이도를 측정하였다. 실험 조건은 abcam사에서 제공하는 시험법으로 진행하였으며 abcam사에서 제공한 기준 물질로 표준곡선을 산출하였으며(도 9) 산출된 표준곡선을 이용하여 정상인과 유방암 환자의 임상시료에 대해 특이도를 산출하였다. Since there is no commercially available product to determine the presence or absence of breast cancer in human-derived plasma specimens, Cancer Antigen CA15-3 Human ELISA of abcam, which is a commercial product based on CA15-3, which is used as a monitoring marker for breast cancer, Kit was used to measure the specificity of clinical samples for normal human and breast cancer and other carcinomas. Experimental conditions were determined by the method provided by abcam, and the standard curve was calculated from the reference material provided by abcam (Fig. 9). The calculated standard curve was used to calculate the specificity of the clinical sample of normal and breast cancer patients Respectively.
판단 기준을 5 U/ml 값으로 설정한 경우, 정상인 대비 유방암 환자에서의 민감도 및 특이도는 각각 53.3%와 64.3%로 나타났다(표 16).Sensitivity and specificity in patients with breast cancer were 53.3% and 64.3%, respectively (Table 16), when the criterion was set at 5 U / ml.
abcam사의 Cancer Antigen CA15-3 Human ELISA Kit를 이용한 임상 시료의 특이도 측정 결과(Cut-off: 5 U/ml)Abcam's Cancer Antigen CA15-3 Human ELISA Kit (Cut-off: 5 U / ml)
4-7. 본 발명의 유방암 바이오마커들의 민감도 및 특이도 평가4-7. The sensitivity and specificity of the breast cancer biomarkers of the present invention
본 발명의 상기 실시예 4-1 내지 4-6의 결과를 통하여, 본 발명의 유방암 바이오마커들은 기존에 보고된 바 없는 유방암 진단용도의 혈청에서 분리한 신규한 단독의 바이오마커로서 우수한 효과를 보여주는 것으로, 상술한 바와 같이 치밀조직에서는 유방촬영술로 감별할 수 없는 한계점을 극복하기 위한 진단제로서 유용하게 사용할 수 있고, 유방암 진단용 마커로서 충분한 경쟁력을 보유한 것임을 확인할 수 있었다.The results of Examples 4-1 to 4-6 of the present invention show that the breast cancer biomarkers of the present invention are excellent as novel single biomarkers isolated from sera of breast cancer diagnostic applications which have not been reported yet As described above, it can be confirmed that the dense tissue can be effectively used as a diagnostic agent to overcome limitations that can not be distinguished by mammography, and has sufficient competitiveness as a marker for breast cancer diagnosis.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the present invention. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
<110> SINIL PHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> BREAST CANCER DIAGNOSTIC KIT USING AUTOANTIBODY <130> PN170090 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 335 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BCM102 (TXNL2 aa 1-334) <400> 1 Met Ala Ala Gly Ala Ala Glu Ala Ala Val Ala Ala Val Glu Glu Val 1 5 10 15 Gly Ser Ala Gly Gln Phe Glu Glu Leu Leu Arg Leu Lys Ala Lys Ser 20 25 30 Leu Leu Val Val His Phe Trp Ala Pro Trp Ala Pro Gln Cys Ala Gln 35 40 45 Met Asn Glu Val Met Ala Glu Leu Ala Lys Glu Leu Pro Gln Val Ser 50 55 60 Phe Val Lys Leu Glu Ala Glu Gly Val Pro Glu Val Ser Glu Lys Tyr 65 70 75 80 Glu Ile Ser Ser Val Pro Thr Phe Leu Phe Phe Lys Asn Ser Gln Lys 85 90 95 Ile Asp Arg Leu Asp Gly Ala His Ala Pro Glu Leu Thr Lys Lys Val 100 105 110 Gln Arg His Ala Ser Ser Gly Ser Phe Leu Pro Ser Ala Asn Glu His 115 120 125 Leu Lys Glu Asp Leu Asn Leu Arg Leu Lys Lys Leu Thr His Ala Ala 130 135 140 Pro Cys Met Leu Phe Met Lys Gly Thr Pro Gln Glu Pro Arg Cys Gly 145 150 155 160 Phe Ser Lys Gln Met Val Glu Ile Leu His Lys His Asn Ile Gln Phe 165 170 175 Ser Ser Phe Asp Ile Phe Ser Asp Glu Glu Val Arg Gln Gly Leu Lys 180 185 190 Ala Tyr Ser Ser Trp Pro Thr Tyr Pro Gln Leu Tyr Val Ser Gly Glu 195 200 205 Leu Ile Gly Gly Leu Asp Ile Ile Lys Glu Leu Glu Ala Ser Glu Glu 210 215 220 Leu Asp Thr Ile Cys Pro Lys Ala Pro Lys Leu Glu Glu Arg Leu Lys 225 230 235 240 Val Leu Thr Asn Lys Ala Ser Val Met Leu Phe Met Lys Gly Asn Lys 245 250 255 Gln Glu Ala Lys Cys Gly Phe Ser Lys Gln Ile Leu Glu Ile Leu Asn 260 265 270 Ser Thr Gly Val Glu Tyr Glu Thr Phe Asp Ile Leu Glu Asp Glu Glu 275 280 285 Val Arg Gln Gly Leu Lys Ala Tyr Ser Asn Trp Pro Thr Tyr Pro Gln 290 295 300 Leu Tyr Val Lys Gly Glu Leu Val Gly Gly Leu Asp Ile Val Lys Glu 305 310 315 320 Leu Lys Glu Asn Gly Glu Leu Leu Pro Ile Leu Arg Gly Glu Asn 325 330 335 <210> 2 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BCM113 (TXNL2 aa 2-130) <400> 2 Ala Ala Gly Ala Ala Glu Ala Ala Val Ala Ala Val Glu Glu Val Gly 1 5 10 15 Ser Ala Gly Gln Phe Glu Glu Leu Leu Arg Leu Lys Ala Lys Ser Leu 20 25 30 Leu Val Val His Phe Trp Ala Pro Trp Ala Pro Gln Cys Ala Gln Met 35 40 45 Asn Glu Val Met Ala Glu Leu Ala Lys Glu Leu Pro Gln Val Ser Phe 50 55 60 Val Lys Leu Glu Ala Glu Gly Val Pro Glu Val Ser Glu Lys Tyr Glu 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Pro Thr Phe Leu Phe Phe Lys Asn Ser Gln Lys Ile 85 90 95 Asp Arg Leu Asp Gly Ala His Ala Pro Glu Leu Thr Lys Lys Val Gln 100 105 110 Arg His Ala Ser Ser Gly Ser Phe Leu Pro Ser Ala Asn Glu His Leu 115 120 125 Lys <210> 3 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BCM114 (TXNL2 aa 132-239) <400> 3 Asp Leu Asn Leu Arg Leu Lys Lys Leu Thr His Ala Ala Pro Cys Met 1 5 10 15 Leu Phe Met Lys Gly Thr Pro Gln Glu Pro Arg Cys Gly Phe Ser Lys 20 25 30 Gln Met Val Glu Ile Leu His Lys His Asn Ile Gln Phe Ser Ser Phe 35 40 45 Asp Ile Phe Ser Asp Glu Glu Val Arg Gln Gly Leu Lys Ala Tyr Ser 50 55 60 Ser Trp Pro Thr Tyr Pro Gln Leu Tyr Val Ser Gly Glu Leu Ile Gly 65 70 75 80 Gly Leu Asp Ile Ile Lys Glu Leu Glu Ala Ser Glu Glu Leu Asp Thr 85 90 95 Ile Cys Pro Lys Ala Pro Lys Leu Glu Glu Arg Leu 100 105 <210> 4 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BCM115 (TXNL2 aa 229-334) <400> 4 Pro Lys Ala Pro Lys Leu Glu Glu Arg Leu Lys Val Leu Thr Asn Lys 1 5 10 15 Ala Ser Val Met Leu Phe Met Lys Gly Asn Lys Gln Glu Ala Lys Cys 20 25 30 Gly Phe Ser Lys Gln Ile Leu Glu Ile Leu Asn Ser Thr Gly Val Glu 35 40 45 Tyr Glu Thr Phe Asp Ile Leu Glu Asp Glu Glu Val Arg Gln Gly Leu 50 55 60 Lys Ala Tyr Ser Asn Trp Pro Thr Tyr Pro Gln Leu Tyr Val Lys Gly 65 70 75 80 Glu Leu Val Gly Gly Leu Asp Ile Val Lys Glu Leu Lys Glu Asn Gly 85 90 95 Glu Leu Leu Pro Ile Leu Arg Gly Glu 100 105 <210> 5 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BCM120 (TXNL2 aa 2-239) <400> 5 Ala Ala Gly Ala Ala Glu Ala Ala Val Ala Ala Val Glu Glu Val Gly 1 5 10 15 Ser Ala Gly Gln Phe Glu Glu Leu Leu Arg Leu Lys Ala Lys Ser Leu 20 25 30 Leu Val Val His Phe Trp Ala Pro Trp Ala Pro Gln Cys Ala Gln Met 35 40 45 Asn Glu Val Met Ala Glu Leu Ala Lys Glu Leu Pro Gln Val Ser Phe 50 55 60 Val Lys Leu Glu Ala Glu Gly Val Pro Glu Val Ser Glu Lys Tyr Glu 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Pro Thr Phe Leu Phe Phe Lys Asn Ser Gln Lys Ile 85 90 95 Asp Arg Leu Asp Gly Ala His Ala Pro Glu Leu Thr Lys Lys Val Gln 100 105 110 Arg His Ala Ser Ser Gly Ser Phe Leu Pro Ser Ala Asn Glu His Leu 115 120 125 Lys Glu Asp Leu Asn Leu Arg Leu Lys Lys Leu Thr His Ala Ala Pro 130 135 140 Cys Met Leu Phe Met Lys Gly Thr Pro Gln Glu Pro Arg Cys Gly Phe 145 150 155 160 Ser Lys Gln Met Val Glu Ile Leu His Lys His Asn Ile Gln Phe Ser 165 170 175 Ser Phe Asp Ile Phe Ser Asp Glu Glu Val Arg Gln Gly Leu Lys Ala 180 185 190 Tyr Ser Ser Trp Pro Thr Tyr Pro Gln Leu Tyr Val Ser Gly Glu Leu 195 200 205 Ile Gly Gly Leu Asp Ile Ile Lys Glu Leu Glu Ala Ser Glu Glu Leu 210 215 220 Asp Thr Ile Cys Pro Lys Ala Pro Lys Leu Glu Glu Arg Leu 225 230 235 <210> 6 <211> 1008 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCM102 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840 ttcgatattt tggaggatga agaagttcgg caaggattaa aagcttactc aaattggcca 900 acataccctc agctgtatgt gaaaggggag ctggtgggag gattggatat tgtgaaggaa 960 ctgaaagaaa atggtgaatt gctgcctatt ctgcgtggag aaaattaa 1008 <210> 7 <211> 390 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCM113 (TXNL2 aa 2-130) <400> 7 gcggcggggg cggctgaggc agctgtagcg gccgtggagg aggtcggctc agccgggcag 60 tttgaggagc tgctgcgcct caaagccaag tccctccttg tggtccattt ctgggcacca 120 tgggctccac agtgtgcaca gatgaacgaa gttatggcag agttagctaa agaactccct 180 caagtttcat ttgtgaagtt ggaagctgaa ggtgttcctg aagtatctga aaaatatgaa 240 attagctctg ttccgacttt tctgtttttc aagaattctc agaaaatcga ccgtttagat 300 ggtgcacatg ccccagagtt gaccaaaaaa gttcagcgtc atgcatctag tggctccttc 360 ctgccgagcg ctaatgaaca tcttaaatag 390 <210> 8 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCM114 (TXNL2 aa 132-239) <400> 8 gatctcaacc ttcgcttgaa gaaattgact catgctgccc cgtgcatgct gtttatgaaa 60 ggaactcctc aagaaccacg ctgtggtttc agcaagcaga tggtggaaat tcttcacaaa 120 cataatattc agtttagcag ttttgatatc ttctcagatg aagaggttcg tcagggactc 180 aaagcctatt ccagttggcc tacctatcct cagctctatg tttctggaga gctcattgga 240 ggacttgata ttattaagga gctggaagca tctgaagaac tggatacaat ttgtccgaaa 300 gctccgaaat tagaggaacg tctctag 327 <210> 9 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCM115 (TXNL2 aa 229-334) <400> 9 ccgaaagctc cgaaattaga ggaacgtctc aaagtgctga caaataaagc ttctgtgatg 60 ctctttatga aaggaaacaa acaggaagca aaatgtggat tcagcaaaca aattctggaa 120 attctaaata gtactggtgt tgaatatgaa acattcgata ttttggagga tgaagaagtt 180 cggcaaggat taaaagctta ctcaaattgg ccaacatacc ctcagctgta tgtgaaaggg 240 gagctggtgg gaggattgga tattgtgaag gaactgaaag aaaatggtga attgctgcct 300 attctgcgtg gagaatag 318 <210> 10 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCM120 (TXNL2 aa 2-239) <400> 10 gcggcggggg cggctgaggc agctgtagcg gccgtggagg aggtcggctc agccgggcag 60 tttgaggagc tgctgcgcct caaagccaag tccctccttg tggtccattt ctgggcacca 120 tgggctccac agtgtgcaca gatgaacgaa gttatggcag agttagctaa agaactccct 180 caagtttcat ttgtgaagtt ggaagctgaa ggtgttcctg aagtatctga aaaatatgaa 240 attagctctg ttccgacttt tctgtttttc aagaattctc agaaaatcga ccgtttagat 300 ggtgcacatg ccccagagtt gaccaaaaaa gttcagcgtc atgcatctag tggctccttc 360 ctgccgagcg ctaatgaaca tcttaaagaa gatctcaacc ttcgcttgaa gaaattgact 420 catgctgccc cgtgcatgct gtttatgaaa ggaactcctc aagaaccacg ctgtggtttc 480 agcaagcaga tggtggaaat tcttcacaaa cataatattc agtttagcag ttttgatatc 540 ttctcagatg aagaggttcg tcagggactc aaagcctatt ccagttggcc tacctatcct 600 cagctctatg tttctggaga gctcattgga ggacttgata ttattaagga gctggaagca 660 tctgaagaac tggatacaat ttgtccgaaa gctccgaaat tagaggaacg tctctag 717 <110> SINIL PHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> BREAST CANCER DIAGNOSTIC KIT USING AUTOANTIBODY <130> PN170090 <160> 10 <170> KoPatentin 3.0 <210> 1 <211> 335 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> BCM 102 (TXNL2 aa 1-334) <400> 1 Met Ala Ala Gly Ala Gla Ala Ala Ala Val Ala Val Glu Glu Val 1 5 10 15 Gly Ser Ala Gly Gln Phe Glu Glu Leu Leu Arg Leu 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atgccccaga gttgaccaaa aaagttcagc gtcatgcatc tagtggctcc 360 ttcctgccga gcgctaatga acatcttaaa gaagatctca accttcgctt gaagaaattg 420 actcatgctg ccccgtgcat gctgtttatg aaaggaactc ctcaagaacc acgctgtggt 480 ttcagcaagc agatggtgga aattcttcac aaacataata ttcagtttag cagttttgat 540 atcttctcag atgaagaggt tcgtcaggga ctcaaagcct attccagttg gcctacctat 600 cctcagctct atgtttctgg agagctcatt ggaggacttg atattattaa ggagctggaa 660 gcatctgaag aactggatac aatttgtccg aaagctccga aattagagga acgtctcaaa 720 gtgctgacaa ataaagcttc tgtgatgctc tttatgaaag gaaacaaaca ggaagcaaaa 780 tgtggattca gcaaacaaat tctggaaatt ctaaatagta ctggtgttga atatgaaaca 840 ttcgatattt tggaggatga agaagttcgg caaggattaa aagcttactc aaattggcca 900 acataccctc agctgtatgt gaaaggggag ctggtgggag gattggatat tgtgaaggaa 960 ctgaaagaaa atggtgaatt gctgcctatt ctgcgtggag aaaattaa 1008 <210> 7 <211> 390 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> BCM 113 (TXNL2 aa 2-130) <400> 7 gcggcggggg cggctgaggc agctgtagcg gccgtggagg aggtcggctc agccgggcag 60 tttgaggagc tgctgcgcct caaagccaag tccctccttg tggtccattt ctgggcacca 120 tgggctccac agtgtgcaca gatgaacgaa gttatggcag agttagctaa agaactccct 180 caagtttcat ttgtgaagtt ggaagctgaa ggtgttcctg aagtatctga aaaatatgaa 240 attagctctg ttccgacttt tctgtttttc aagaattctc agaaaatcga ccgtttagat 300 ggtgcacatg ccccagagtt gaccaaaaaa gttcagcgtc atgcatctag tggctccttc 360 ctgccgagcg ctaatgaaca tcttaaatag 390 <210> 8 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> BCM 114 (TXNL2 aa 132-239) <400> 8 gatctcaacc ttcgcttgaa gaaattgact catgctgccc cgtgcatgct gtttatgaaa 60 ggaactcctc aagaaccacg ctgtggtttc agcaagcaga tggtggaaat tcttcacaaa 120 cataatattc agtttagcag ttttgatatc ttctcagatg aagaggttcg tcagggactc 180 aaagcctatt ccagttggcc tacctatcct cagctctatg tttctggaga gctcattgga 240 ggacttgata ttattaagga gctggaagca tctgaagaac tggatacaat ttgtccgaaa 300 gctccgaaat tagaggaacg tctctag 327 <210> 9 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> BCM115 (TXNL2 aa 229-334) <400> 9 ccgaaagctc cgaaattaga ggaacgtctc aaagtgctga caaataaagc 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tcttcacaaa cataatattc agtttagcag ttttgatatc 540 ttctcagatg aagaggttcg tcagggactc aaagcctatt ccagttggcc tacctatcct 600 cagctctatg tttctggaga gctcattgga ggacttgata ttattaagga gctggaagca 660 tctgaagaac tggatacaat ttgtccgaaa gctccgaaat tagaggaacg tctctag 717
Claims (10)
A composition for diagnosing breast cancer, comprising a TXNL2 protein or fragment thereof that specifically binds to the autoantibody to measure the level of autoantibody to a TXNL2 (Thioredoxin-like 2) protein or fragment thereof.
The composition for diagnosing breast cancer according to claim 1, wherein the TXNL2 protein or fragment thereof comprises an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 1 to 5.
A kit for the diagnosis of breast cancer comprising the composition of claim 1 or 2.
4. The kit for diagnosing breast cancer according to claim 3, wherein the breast cancer diagnostic kit detects autoantibodies against TXNL2 protein or a fragment thereof.
4. The method according to claim 3, wherein the detection of the autoantibody is performed using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), a radioimmunoassay (RIA), a sandwich assay, a Western blot on polyacrylamide gel, an immunoblot assay or immunohistochemical staining. < RTI ID = 0.0 > 21. < / RTI >
(a) 검사대상 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 TXNL2(Thioredoxin-like 2) 단백질 또는 이의 단편에 대한 자가항체의 수준을 측정하는 단계;
(b) 상기 측정된 자가항체 수준을 정상인 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 측정된 TXNL2 단백질 또는 이의 단편에 대한 자가항체 수준과 비교하는 단계:
상기 검사 대상 개체의 자가항체 수준이 상기 정상인 개체의 자가항체 수준보다 높은 경우 유방암 양성으로 판정한다.
A method for providing information for breast cancer diagnosis comprising the steps of:
(a) measuring the level of autoantibody against a TXNL2 (Thioredoxin-like 2) protein or fragment thereof from a biological sample isolated from an individual to be tested;
(b) comparing the measured autoantibody levels to autoantibody levels for a TXNL2 protein or fragment thereof measured from a biological sample isolated from a normal subject,
If the autoantibody level of the subject to be tested is higher than the autoantibody level of the normal subject, it is determined to be positive for breast cancer.
상기 생물학적 시료는 조직, 전혈, 혈장, 혈청, 림프, 골수액, 타액, 유즙, 소변, 및 복수로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
The method according to claim 6,
Wherein the biological sample is selected from the group consisting of tissue, whole blood, plasma, serum, lymph, bone marrow, saliva, milk, urine, and ascites.
상기 TXNL2 단백질 또는 이의 단편에 대한 자가항체 수준은 상기 자가항체와의 항원-항체 반응을 이용하여 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
The method according to claim 6,
Wherein the autoantibody level to the TXNL2 protein or fragment thereof is measured using an antigen-antibody reaction with the autoantibody.
상기 항원-항체 반응은 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay), RIA(Radioimmnoassay), 샌드위치 측정법 (Sandwich assay), 폴리아크릴아미드 겔 상의 웨스턴 블롯(Western Blot), 면역블롯 분석(Immunoblot assay) 또는 면역조직화학염색 방법 (Immnohistochemical staining)으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
9. The method of claim 8,
The antigen-antibody reaction can be assayed by ELISA, RIA, sandwich assay, Western blot on polyacrylamide gel, immunoblot assay or immunohistochemistry Characterized in that it consists of immunohistochemical staining.
상기 TXNL2 단백질 또는 이의 단편은 서열목록 제1서열 내지 제5서열 중 어느 한 서열로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.The method according to claim 6,
Wherein the TXNL2 protein or fragment thereof comprises an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 1 to 5.
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