KR20180116367A - 재조합효소 돌연변이체 - Google Patents

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Abstract

핵산의 개선된 재조합효소 매개된 증폭을 위한 재조합효소, 예컨대, 개선된 클러스터 증폭을 위해 패턴화된 유세포 표면 상의 단일 가닥 어댑터 영역을 갖는 PCR-라이브러리, 및 이를 사용한 방법 및 키트가 본 명세서에 제시된다.

Description

재조합효소 돌연변이체
계속 출원 데이터
본 출원은 2016년 3월 28일자에 출원된 미국 가출원 제62/314,273호(본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)의 이익을 주장한다.
서열 목록
본 출원은, 97.7킬로바이트의 크기를 갖고 2017년 3월 24일에 생성된, 파일명이 "1447 SeqLisiting_ST25"인 ASCII 텍스트 파일로서 EFS 웹을 통해 미국 특허상표청에 전자로 제출된 서열 목록을 함유한다. 서열 목록의 전자 제출로 인해, 전자로 제출된 서열 목록은 37 CFR § 1.821(c)가 요구한 종이 카피 및 § 1.821(e)가 요구한 CRF 둘 다로서 발부된다. 서열 목록에 함유된 정보는 본 명세서에 참고로 포함된다.
재조합효소 효소는 핵산의 재조합효소 매개된 증폭에서 유용하다. 예를 들어, 재조합효소 효소는 중합효소에 의한 DNA의 복제를 허용하도록 DNA 표적에 대한 올리고뉴클레오타이드의 표적화를 수월하게 할 수 있다. 개선된 특성을 갖는 변형된 재조합효소에 대한 수요가 존재한다.
핵산의 개선된 재조합효소 매개된 증폭을 위한 재조합효소가 본 명세서에 제시된다. 본 발명자들은 패턴화된 유세포 표면 상에 핵산을 시딩, 즉, 파종(seeding)하는 데 있어서 실질적으로 개선된 특징을 갖는 소정의 변경된 재조합효소를 놀랍게도 확인하였다. 소정의 실시형태에서, 변경된 재조합효소는 개선된 클러스터 증폭을 위해 패턴화된 유세포 표면 상에 PCR-프리 라이브러리, 예컨대, 단일 가닥 어댑터 영역을 갖는 PCR-라이브러리의 시딩을 개선한다.
본 발명은 서열 번호 1과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 변경된 UvsX 재조합효소를 포함하고, 재조합 UvsX는 RB49 UvsX 아미노산 서열에서 Pro321 및 Asp334와 기능적으로 동등한 위치에서 적어도 하나의 아미노산 치환 돌연변이를 포함한다.
몇몇 양태에서, 적어도 하나의 치환 돌연변이는 하전된 잔기에 대한 돌연변이를 포함한다.
몇몇 양태에서, 적어도 하나의 치환 돌연변이는 염기성 잔기에 대한 돌연변이를 포함한다.
몇몇 양태에서, 적어도 하나의 치환 돌연변이는 RB49 UvsX 아미노산 서열에서 Pro321Lys에 상동성인 돌연변이를 포함한다.
몇몇 양태에서, 적어도 하나의 치환 돌연변이는 RB49 UvsX 아미노산 서열에서 Asp334Lys에 상동성인 돌연변이를 포함한다.
몇몇 양태에서, 적어도 하나의 치환 돌연변이는 RB49 UvsX 아미노산 서열에서 Pro321Lys 및 Asp334Lys에 상동성인 돌연변이를 포함한다.
몇몇 양태에서, 변경된 재조합효소는 RB49 UvsX 아미노산 서열에서 Pro256과 기능적으로 동등한 위치에서 치환 돌연변이를 추가로 갖는 임의의 상기 기재된 재조합 UvsX 재조합효소를 포함한다. 몇몇 양태에서, 치환 돌연변이는 RB49 UvsX 아미노산 서열에서 Pro256Lys에 상동성인 돌연변이를 포함한다.
몇몇 양태에서, 변경된 재조합효소는 RB49 UvsX 아미노산 서열에서 His63과 기능적으로 동등한 위치에서 치환 돌연변이를 추가로 갖는 임의의 상기 기재된 재조합 UvsX 재조합효소를 포함한다. 몇몇 양태에서, 치환 돌연변이는 RB49 UvsX 아미노산 서열에서 His63Ser에 상동성인 돌연변이를 포함한다.
몇몇 양태에서, 변경된 재조합효소는 T4(서열 번호 8), T6(서열 번호 9), Rb69(서열 번호 11), Aeh1(서열 번호 12), KVP40(서열 번호 14), 아시네토박터 파지(Acinetobacter phage) 133(서열 번호 10), 아에로모나스 파지(Aeromonas phage) 65(서열 번호 13), 사이아노파지(cyanophage) P-SSM2(서열 번호 16), 사이아노파지 PSSM4(서열 번호 17), 사이아노파지 S-PM2(서열 번호 18), Rb32(서열 번호 19), 비브리오 파지(Vibrio phage) nt-1(서열 번호 20), Rb16(서열 번호 21), Rb43(서열 번호 15) 및 Rb49(서열 번호 1)로부터 선택된 미오비리대(myoviridae) 파지로부터 유래된 임의의 상기 기재된 재조합 UvsX 재조합효소를 포함한다.
본 발명은 서열 번호 3 또는 4 중 임의의 아미노산 서열을 포함하는 반보존된 도메인에 대한 치환 돌연변이(여기서, 치환 돌연변이는 Phe 또는 Asp 이외의 임의의 잔기에 4번 위치에서의 치환으로부터 선택된 돌연변이를 포함함)를 갖고/갖거나, 서열 번호 5 또는 6 중 임의의 아미노산 서열을 포함하는 반보존된 도메인에 대한 치환 돌연변이(여기서, 치환 돌연변이는 Arg 또는 Asp 이외의 임의의 잔기에 4번 위치에서의 치환으로부터 선택된 돌연변이를 포함함)를 갖는, 변경된 UvsX 재조합효소를 포함한다. 몇몇 양태에서, 돌연변이는 하전된 잔기에 대한 돌연변이를 포함한다. 몇몇 양태에서, 돌연변이는 Lys에 대한 4번에서의 치환을 포함한다.
본 발명은 서열 번호 1, 2 및 8 내지 35 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 갖는 변경된 UvsX 재조합효소를 포함한다. 몇몇 양태에서, 재조합 UvsX 재조합효소는 RB49 UvsX 아미노산 서열에서 Pro256과 기능적으로 동등한 위치에서의 치환 돌연변이, RB49 UvsX 아미노산 서열에서 His63과 기능적으로 동등한 위치에서의 치환 돌연변이, RB49 UvsX 아미노산 서열에서 Pro321과 기능적으로 동등한 위치에서의 치환 돌연변이, RB49 UvsX 아미노산 서열에서 Asp334와 기능적으로 동등한 위치에서의 치환 돌연변이 및/또는 RB49 UvsX 아미노산 서열에서 Pro321 및 Asp334와 기능적으로 동등한 위치에서의 치환 돌연변이를 더 포함한다. 몇몇 양태에서, 치환 돌연변이는 RB49 UvsX 아미노산 서열에서 Pro256Lys에 상동성인 치환 돌연변이, RB49 UvsX 아미노산 서열에서 His63Ser에 상동성인 치환 돌연변이, RB49 UvsX 아미노산 서열에서 Pro321Lys에 상동성인 치환 돌연변이, RB49 UvsX 아미노산 서열에서 Asp334Lys에 상동성인 치환 돌연변이 및/또는 RB49 UvsX 아미노산 서열에서 Pro321Lys 및 Asp334Lys에 상동성인 치환 돌연변이를 포함한다.
몇몇 양태에서, 변경된 재조합효소는 C 말단에서의 하나 이상의 글루탐산 잔기의 부가, C 말단에서의 하나 이상의 아스파르트산 잔기의 부가, 및 이들의 조합으로부터 선택된 돌연변이를 추가로 갖는 임의의 상기 기재된 재조합 UvsX 재조합효소를 포함한다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 변경된 UvsX 재조합효소를 코딩하는 단리된 핵산 분자를 포함한다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 변경된 UvsX 재조합효소를 코딩하는 단리된 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 포함한다.
본 발명은 하나 이상의 본 명세서에 기재된 변경된 UvsX 재조합효소, 하나 이상의 본 명세서에 기재된 바와 같은 변경된 UvsX 재조합효소를 코딩하는 단리된 핵산 분자 및/또는 하나 이상의 본 명세서에 기재된 바와 같은 변경된 UvsX 재조합효소를 코딩하는 단리된 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 키트를 포한다.
하나 이상의 실시형태의 세부사항은 하기 동반된 도면 및 설명에 기재되어 있다. 다른 특징, 목적 및 이점은 설명 및 도면, 및 청구항으로부터 명확할 것이다.
도 1a는, US 제2009/0029421호의 도입된 자료에 또한 기재한, 엔테로박테리아 파지(Enterobacteria phage) T4(T4)(서열 번호 8), 엔테로박테리아 파지 T6(T6)(서열 번호 9), 아시네토박터 파지 133(Phage133)(서열 번호 10), 엔테로박테리아 파지 RB69(Rb69)(서열 번호 11), 아에로모나스 파지 Aeh1(Aeh1)(서열 번호 12), 아에로모나스 파지 65(Ae65)(서열 번호 13), 비브리오 파지 KVP40(Kvp40)(서열 번호 14), 엔테로박테리아 파지 RB43(Rb43)(서열 번호 15), 프로클로로코커스 파지(Prochlorococcus phage) P-SSM2(PSSM2)(서열 번호 16) 및 프로클로로코커스 파지 P-SSM4(PSSM4)(서열 번호 17)로부터의 UvsX 아미노산 서열의 정렬을 보여주는 도식이다. RB49 UvsX 아미노산 서열에서 Pro321 및 Asp334와 위치상으로 그리고/또는 기능적으로 동등한 잔기는 박스 표시되고 삼각형 기호로 표시된다.
도 1b는 도 1a에 기재된 정렬의 연속을 보여주는 도식이다. RB49 UvsX 아미노산 서열에서 Pro321 및 Asp334와 위치상으로 그리고/또는 기능적으로 동등한 잔기는 박스 표시되고 삼각형 기호로 표시된다.
도 2는 엔테로박테리아 파지 RB49(RB49)(서열 번호 1) 및 엔테로박테리아 파지 T4(T4)(서열 번호 8)로부터의 UvsX 아미노산 서열의 정렬을 보여주는 도식이다. RB49 UvsX 아미노산 서열에서 Pro256과 위치상으로 그리고/또는 기능적으로 동등한 잔기는 하이라이트 표시된다. RB49 UvsX 아미노산 서열에서 Pro321 및 Asp334와 위치상으로 그리고/또는 기능적으로 동등한 잔기는 박스 표시되고 삼각형 기호로 표시된다.
도 3은 700nM 피치 v2.5 pFC에서 V2 화학에 의해 클러스터링된 150pM 인간 PCR-프리 라이브러리의 녹색 형광(G 또는 T 도입) 및 적색 형광(A 또는 C 도입)을 측정하는 타이푼 스캐너에서 영상화된 제1 사이클 DNA 서열분석의 타이푼 영상이다. 레인 1은 H63S P256K이다. 레인 2는 완충제 1 중의 H63S P321K D334K이다. 레인 3은 완충제 2 중의 H63S P321K D334K이다. 레인 4는 Wt RB69 UvsX이다. 레인 5는 H63S P256K이다. 레인 6은 완충제 1 중의 H63S P321K D334K이다. 레인 7은 완충제 2 중의 H63S P321K D334K이다. 레인 8은 DNA를 갖지 않는 것이다. 완충제 1은 20mM Tris pH 7.5, 200mM NaCl, 1mM EDTA 및 1mM BME이다. 완충제 2는 50mM Tris PH 7.5, 100mM NaCL, 1mM DTT, 0.1mM EDTA 및 50% 글라이세롤이다.
핵산의 개선된 재조합효소 매개된 증폭을 위한 재조합효소가 본 명세서에 제시된다. 본 발명자들은 패턴화된 유세포 표면 상에 핵산을 시딩하는 데 있어서 실질적으로 개선된 특징을 갖는 소정의 변경된 재조합효소를 놀랍게도 확인하였다.
하기 더 자세히 기재된 것처럼, 본 발명자들은 재조합효소에서의 하나 이상의 잔기에 대한 하나 이상의 돌연변이가 패턴화된 유세포 표면 상에 예를 들어 단일 가닥 어댑터 영역을 갖는 PCR-라이브러리와 같은 DNA 라이브러리를 시딩하여 개선된 클러스터 증폭을 제공하는 데 있어서 심오한 개선을 발생시킨다는 것을 놀랍게도 발견하였다.
소정의 실시형태에서, 치환 돌연변이는 하전된 측쇄를 갖는 잔기에 대한 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에서, 하전된 아미노산은 양으로 하전된 아미노산 잔기이다. 용어 "양으로 하전된 아미노산"은 7 초과의 측쇄 pKa 값을 갖는 친수성 아미노산, 즉 염기성 아미노산을 의미한다. 염기성 아미노산은 통상적으로 하이드로늄 이온과의 회합으로 인해 생리학적 pH에서 양으로 하전된 측쇄를 갖는다. 천연 발생(유전자 코딩된) 염기성 아미노산은 라이신(Lys, K), 아르기닌(Arg, R) 및 히스티딘(His, H)을 포함하는 한편, 비천연(유전자 비코딩된 또는 비표준) 염기성 아미노산은 예를 들어 오르니틴, 2,3-다이아미노프로피온산, 2,4-다이아미노뷰티르산, 2,5,6-트라이아미노헥산산, 2-아미노-4-구아니디노뷰탄산 및 호모아르기닌을 포함한다. 용어 "음으로 하전된 아미노산"은, 키랄성과 무관하게, C 말단 카복실기 이외에, 적어도 하나의 추가의 음으로 하전된 기, 예컨대, 카복실, 포스페이트, 포스포네이트, 설포네이트 등을 함유하는 천연 또는 비천연 아미노산을 의미한다.
재조합 UvsX의 반보존된 도메인에 대한 치환 돌연변이를 포함하는 재조합 UvsX 재조합효소가 또한 본 명세서에 제시된다. 본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "반보존된 도메인"은 다양한 종 중에 완전히 보존되거나 적어도 부분적으로 보존된 재조합 UvsX의 부분을 의미한다. 반보존된 도메인에서의 하나 이상의 잔기의 돌연변이가 특히 단일 가닥 주형 핵산의 존재 하에 재조합효소 활성에 영향을 미쳐서, 재조합효소 매개된 증폭 반응에서 시딩 및/또는 증폭의 증대를 발생시킨다는 것이 놀랍게도 발견되었다. 이 돌연변이된 재조합효소는 패턴화된 유세포 표면 상의 PCR-프리 라이브러리, 예컨대, 단일 가닥 어댑터 영역을 갖는 PCR-라이브러리의 시딩에서 개선된 성능을 가져서 하기 실시예 부문에 기재된 바대로 개선된 클러스터 증폭을 발생시킨다.
몇몇 실시형태에서, 반보존된 도메인은 서열 번호 3 또는 4 중 어느 하나에 기재된 서열을 갖는 아미노산을 포함한다. 서열 번호 3 또는 4는 다양한 종 중에서 반보존된 도메인에서의 잔기에 상응한다. 서열 번호 3은 본 명세서에서 서열 번호 8로 기재된 T4 UvsX 아미노산 서열의 319번 내지 323번 잔기에 상응한다. 반보존된 도메인에서 다양한 종 중에 보존을 보여주는 정렬은 도 1 및 도 2에 기재되어 있다. 도 1에 도시된 UvsX 서열은 유전자은행 데이터베이스 수탁 번호 NP_049656(T4), YP_004300647(Phage133); NP_861734(RB69); NP_943894.1(Aeh1); YP_004300858(Ae65); NP_899256(KVP40); YP_239013(RB43); YP_214417(P-SSM2); YP_214708(P-SSM4); 및 미국 공보 제2009/0029421호(T6)로부터 얻어진다. 도 2는 엔테로박테리아 파지 RB49(RB49)(서열 번호 1) 및 엔테로박테리아 파지 T4(T4)(서열 번호 8)로부터의 UvsX 아미노산 서열의 정렬을 보여주는 도식이다. RB49 UvsX 아미노산 서열에서 Pro256과 위치적으로 그리고/또는 기능적으로 동등한 잔기는 하이라이트 표시된다. RB49 UvsX 아미노산 서열에서 Pro321 및 Asp334와 위치적으로 그리고/또는 기능적으로 동등한 잔기는 삼각형 기호로 표시된다. 도 2에 도시된 UvsX 서열은 유전자은행 데이터베이스 수탁 번호 NP_891595(RB49) 및 NP_049656(T4)으로부터 얻어진다.
반보존된 도메인에서의 하나 이상의 잔기에 대한 돌연변이가 특히 단일 가닥 주형 핵산의 존재 하에 재조합효소 활성을 증가시켜서, 재조합효소 매개된 증폭 반응에서 시딩 및/또는 증폭의 증대를 발생시킨다는 것이 놀랍게도 발견되었다. 이 돌연변이된 재조합효소는 패턴화된 유세포 표면 상의 PCR-프리 라이브러리, 예컨대, 단일 가닥 어댑터 영역을 갖는 PCR-라이브러리의 시딩에서 개선된 성능을 가져서 하기 실시예 부문에 기재된 바대로 개선된 클러스터 증폭을 발생시킨다. 예를 들어, 본 명세서에 제시된 재조합 UvsX의 몇몇 실시형태에서, 치환 돌연변이는 Phe 또는 Asp 이외의 임의의 잔기에 대한 서열 번호 3 또는 4 중 어느 하나의 서열의 4번 위치에서의 돌연변이를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 재조합 UvsX는 서열 번호 3 또는 4 중 어느 하나의 서열의 4번 위치에서 Lys에 대한 돌연변이를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 반보존된 도메인은 서열 번호 5 또는 6 중 어느 하나에 기재된 서열을 갖는 아미노산을 포함한다. 서열 번호 5 또는 6은 다양한 종 중에서 반보존된 도메인에서의 잔기에 상응한다. 서열 번호 5는 본 명세서에서 서열 번호 8로 기재된 T4 UvsX 아미노산 서열의 332번 내지 337번 잔기에 상응한다. 반보존된 도메인에서 다양한 종 중에 보존을 보여주는 정렬은 도 1 및 도 2에 기재되어 있다.
본 명세서에 제시된 재조합 UvsX의 몇몇 실시형태에서, 치환 돌연변이는 Arg 또는 Asp 이외의 임의의 잔기에 대한 서열 번호 5 또는 6 중 어느 하나의 서열의 4번 위치에서의 돌연변이를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 재조합 UvsX는 임의의 서열 번호 5 또는 6의 4번 위치에서의 Lys에 대한 돌연변이를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 반보존된 도메인은 서열 번호 36 또는 서열 번호 7 중 어느 하나에 기재된 서열을 갖는 아미노산을 포함한다. 서열 번호 7은 다양한 종 중에서 반보존된 도메인에서의 잔기에 상응한다. 서열 번호 36은 본 명세서에서 서열 번호 8로 기재된 T4 UvsX 아미노산 서열의 329번 내지 337번 잔기에 상응한다. 반보존된 도메인에서 다양한 종 중에 보존을 보여주는 정렬은 도 1 및 도 2에 기재되어 있다.
본 명세서에 제시된 재조합 UvsX의 몇몇 실시형태에서, 치환 돌연변이는 Arg, Thr, Asn, Glu 또는 Asp 이외의 임의의 잔기에 대한 서열 번호 36 또는 서열 번호 7 중 어느 하나의 서열의 7번 위치에서의 돌연변이를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 재조합 UvsX는 서열 번호 36 또는 서열 번호 7 중 어느 하나의 서열의 7번 위치에서의 Lys에 대한 돌연변이를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 재조합효소는 UvsX 단백질이다. 예를 들어, 파지 재조합효소, 예컨대, 미오비리대 파지, 예를 들어 T4, T6, Rb69, Aeh1, KVP40, 아시네토박터 파지 133, 아에로모나스 파지 65, 사이아노파지 P-SSM2, 사이아노파지 PSSM4, 사이아노파지 S-PM2, Rb32, 비브리오 파지 nt-1, Rb16, Rb43 및 Rb49 등으로부터 유래된 UvsX 또는 UvsX 유사 재조합효소를 포함하는, 임의의 파지 재조합효소를 본 명세서에 제시된 실시형태에서 사용할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 재조합효소는 미오비리대 파지, 예를 들어 T2, Rb14, 아에로모나스 파지 25, phi-1, 파지 31, 파지 44RR2.8t, 파지 Rb3, 및 파지 LZ2 등으로부터 유래된 UvsX 또는 UvsX 유사 재조합효소이다. 다른 재조합효소 단백질이 본 명세서에 제시된 실시형태에서 사용될 수 있는 것이 당해 분야의 숙련자에게 용이하게 명확할 것이다. 적합한 재조합효소 단백질은 임의의 수의 당해 분야에 공지된 다수의 방법, 예를 들어 하기 더 자세히 기재된 바와 같은 BLAST 정렬 등을 이용하여 UvsX에 대한 상동성에 의해 확인될 수 있다.
"기능적으로 동등한"이란, 제어 재조합효소가, 완전히 상이한 재조합효소를 사용한 연구의 경우에, 효소에서 동일한 기능적 역할을 갖는 다른 재조합효소에서의 아미노산 위치에서 발생하는 것으로 생각되는 아미노산 치환을 함유할 것이라는 것을 의미한다. 예로서, T4 UvsX에서의 라이신으로 프롤린의 322번 위치에서의 돌연변이(P322K)가 RB49 UvsX에서 라이신으로 프롤린의 321번 위치에서의 치환(P321K)과 기능적으로 동등할 것이다. 유사하게, T4 UvsX에서의 라이신으로 아르기닌의 335번 위치에서의 돌연변이(R335K)가 RB49 UvsX에서 라이신으로 아스파르테이트의 334번 위치에서의 치환(D334K)과 기능적으로 동등할 것이다.
2개 이상의 상이한 재조합효소에서의 일반적으로 기능적으로 동등한 치환 돌연변이는 재조합효소의 아미노산 서열에서 상동성 아미노산 위치에서 발생한다. 그러므로, 용어 "기능적으로 동등한"의 본 명세서에서의 사용은 또한, 돌연변이된 아미노산의 특정한 기능이 공지되든 또는 아니든지와 관계 없이, 소정의 돌연변이와 "위치상으로 동등한" 또는 "상동성"인 돌연변이를 포함한다. 서열 정렬 및/또는 분자 모델링에 기초하여 2개 이상의 상이한 재조합효소의 아미노산 서열에서 위치상으로 동등한 또는 상동성 아미노산 잔기를 확인할 수 있다. 위치상으로 동등한 및/또는 기능적으로 동등한 잔기를 확인하기 위한 서열 정렬의 예는 도 1에 기재되어 있고, 이 도면은, US 제2009/0029421호의 도입된 자료에 또한 기재한, 엔테로박테리아 파지 T4(T4)(서열 번호 8), 엔테로박테리아 파지 T6(T6)(서열 번호 9), 아시네토박터 파지 133(Phage133)(서열 번호 10), 엔테로박테리아 파지 RB69(Rb69)(서열 번호 11), 아에로모나스 파지 Aeh1(Aeh1)(서열 번호 12), 아에로모나스 파지 65(Ae65)(서열 번호 13), 비브리오 파지 KVP40(Kvp40)(서열 번호 14), 엔테로박테리아 파지 RB43(Rb43)(서열 번호 15), 프로클로로코커스 파지 P-SSM2(PSSM2)(서열 번호 16) 및 프로클로로코커스 파지 P-SSM4(PSSM4)(서열 번호 17)로부터의 UvsX 아미노산 서열의 정렬을 기재한다. 도 1에 기재된 UvsX 서열은 유전자은행 데이터베이스 수탁 번호 NP_049656(T4), YP_004300647(Phage133); NP_861734 (RB69); NP_943894.1(Aeh1); YP_004300858(Ae65); NP_899256(KVP40); YP_239013(RB43); YP_214417(P-SSM2); YP_214708(P-SSM4); 및 미국 공보 제2009/0029421(T6)로부터 얻어진다.
도 2는 엔테로박테리아 파지 RB49(RB49)(서열 번호 1) 및 엔테로박테리아 파지 T4(T4)(서열 번호 8)로부터의 UvsX 아미노산 서열의 정렬을 보여주는 도식이다. RB49 UvsX 아미노산 서열에서 Pro256과 위치상으로 그리고/또는 기능적으로 동등한 잔기는 하이라이트 표시된다. RB49 UvsX 아미노산 서열에서 Pro321 및 Asp334와 위치상으로 그리고/또는 기능적으로 동등한 잔기는 하이라이트 표시되고 삼각형으로 표시된다. 도 2에 기재된 UvsX 서열은 유전자은행 데이터베이스 수탁 번호 NP_891595(RB49) 및 NP_049656(T4)으로부터 얻어진다.
위치상으로 동등한 및/또는 기능적으로 동등한 잔기는 이 서열을 기준 서열, 예컨대, T4 및 RB49의 것과 정렬함으로써 임의의 수의 다른 UvsX 서열 중 하나 이상에 대해 결정될 수 있다. 비제한적인 예로서, 시네쵸코커스 파지 S-PM2, 엔테로박테리아 파지 RB32, 비브리오 파지 nt-1, 엔테로박테리아 파지 RB16으로부터의 UvsX 서열은 서열 번호 18 내지 21로서 기재되고, 유전자은행 데이터베이스 수탁 번호 YP_195169.1; YP_802982.1; YP_008125207.1; YP_003858336.1로부터 얻어지고, 기준 UvsX 서열, 예를 들어 T4 UvsX(서열 번호 8) 및 RB49 UvsX(서열 번호 1) 등과 정렬될 수 있고, 위치상으로 동등한 및/또는 기능적으로 동등한 잔기가 확인된다. 예로서, 하기 표 1에 기재된 잔기는 RB49 UvsX 아미노산 서열에서 Pro321 및 Asp334와 위치상으로 동등한 및/또는 기능적으로 동등한 것으로 확인된다. 다른 UvsX 단백질에 대해 위치상으로 동등한 및/또는 기능적으로 동등한 위치가 하기 유사한 접근법에 의해 확인될 수 있는 것으로 당해 분야의 숙련자에 의해 용이하게 이해될 것이다.
Figure pct00001
상기 기재된 재조합 UvsX 단백질은 재조합효소 활성, 안정성 또는 임의의 다른 원하는 특성 중 하나 이상의 양태를 증대시키는 것으로 공지된 추가의 치환 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에서, 임의의 상기 돌연변이 이외에, 재조합 UvsX는 당해 분야에 공지되고, US 제2009/0029421호(이의 전문이 참고로 포함됨)의 개시내용에 의해 예시된 바대로, RB49 UvsX 아미노산 서열에서의 His63과 기능적으로 동등한 위치에서 치환 돌연변이를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 소정의 실시형태에서, 재조합 UvsX는 RB49 UvsX 아미노산 서열에서 His63Ser에 상동성인 치환 돌연변이를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 임의의 상기 돌연변이 이외에, 재조합 UvsX는 당해 분야에 공지되고, 2015년 9월 29일자에 출원되고, 발명의 명칭이 "Recombinase Mutants"인 미국 출원 제14/869,744호(이의 전문이 참고로 포함됨)의 개시내용에 의해 예시된 바대로, RB49 UvsX 아미노산 서열에서 Pro256과 기능적으로 동등한 위치에서 치환 돌연변이를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 소정의 실시형태에서, 재조합 UvsX는 RB49 UvsX 아미노산 서열에서 Pro256Lys에 상동성인 치환 돌연변이를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 변경된 재조합효소는, 예를 들어 변경 P321K, 변경 D334K, 변경 P321K 및 D334K, 및 변경 P321K, D334K 및 P256K를 포함하는, Pro321, Asp334 및/또는 Pro256에서의 변경을 갖는, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 엔테로박테리아 파지 RB49 UvsX를 포함한다. 이러한 변경된 재조합효소는 변경 H63S, 예를 들어 변경 H63S 및 P321K, 변경 H63S 및 D334K, 변경 H63S, P321K 및 D334K, 변경 H63S 및 P256K, 및 변경 H63S, P321K, D334K 및 P256K 등을 더 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 변경된 재조합효소는, 예를 들어 변경 P322K, 변경 R335K, 변경 P322K 및 R335K, 및 변경 F257K, P322K 및 R335K를 포함하는, Pro322, Arg335 및/또는 Phe 257에서의 변경을 갖는, 서열 번호 8의 아미노산을 갖는 엔테로박테리아 파지 T4 UvsX를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 변경된 재조합효소는, 예를 들어 변경 P324K, 변경 R337K, 변경 P324K 및 R337K, 및 변경 F259K, P324K 및 R337K를 포함하는, Pro324, Arg337 및/또는 Phe259에서의 변경을 갖는, 서열 번호 9의 아미노산 서열을 갖는 엔테로박테리아 파지 T6 UvsX를 포함한다. 이러한 변경된 재조합효소는 변경 H66S, 예를 들어 변경 H66S 및 P324K, 변경 H66S 및 R337K, 변경 H66S, P324K 및 R337K, 및 변경 H66S, F259K, P324K 및 R337K 등을 더 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 변경된 재조합효소는, 예를 들어 변경 P320K, 변경 T333K, 변경 P320K 및 T333K, 및 변경 P257K, P320K 및 T333K를 포함하는, Pro320, Thr333 및/또는 Pro257에서의 변경을 갖는, 서열 번호 10의 아미노산 서열을 갖는 아시네토박터 파지 133 UvsX를 포함한다. 이러한 변경된 재조합효소는 변경 H64S, 예를 들어 변경 H64S 및 P320K, 변경 H64S 및 T333K, 변경 H64S, P320K 및 T333K, 및 변경 H64S, P257K, P320K 및 T333K 등을 더 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 변경된 재조합효소는, 예를 들어 변경 P323K, 변경 T336K, 변경 P323K 및 T336K, 및 변경 P258K, P323K 및 T336K를 포함하는, Pro258, Pro323 및/또는 Thr336에서의 변경을 갖는, 서열 번호 11의 아미노산 서열을 갖는 엔테로박테리아 파지 RB69 UvsX를 포함한다. 이러한 변경된 재조합효소는 변경 H64S, 예를 들어 변경 H64S 및 P323K, 변경 H64S 및 T336K, 변경 H64S, P323K 및 T336K, 및 변경 H64S, P258K, P323K 및 T336K 등을 더 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 변경된 재조합효소는, 예를 들어 변경 P334K, 변경 D347K, 변경 P334K 및 D347K, 및 변경 P269K, P334K 및 D347K를 포함하는, Pro269, Pro334 및/또는 Asp347에서의 변경을 갖는, 서열 번호 12의 아미노산 서열을 갖는 아에로모나스 파지 Aeh1 UvsX로부터 유래된 UvsX 재조합효소를 포함한다. 이러한 변경된 재조합효소는 변경 H76S, 예를 들어 변경 H76S 및 P334K, 변경 H76S 및 D347K, 변경 H76S, P334K 및 D347K, 및 변경 H76S, P269K, P334K 및 D347K 등을 더 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 변경된 재조합효소는, 예를 들어 변경 P333K, 변경 N346K, 변경 P333K 및 N236K, 및 변경 D266K, P333K 및 N236K를 포함하는, Asp226, Pro333 및/또는 Asn346에서의 변경을 갖는, 서열 번호 13의 아미노산 서열을 갖는 아에로모나스 파지 65 UvsX로부터 유래된 UvsX 재조합효소를 포함한다. 이러한 변경된 재조합효소는 변경 H73S, 예를 들어 변경 H73S 및 P333K, 변경 H73S 및 N346K, 변경 H73S, P333K 및 N236K, 및 변경 H73S, D266K, P333K 및 N236K 등을 더 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 변경된 재조합효소는, 예를 들어 변경 D332K, 변경 R345K, 변경 D332K 및 R345K, 및 변경 P267K, D332K 및 R345K를 포함하는, Pro267, Asp332 및/또는 Arg345에서의 변경을 갖는, 서열 번호 14의 아미노산 서열을 갖는 비브리오 파지 KVP40 UvsX로부터 유래된 UvsX 재조합효소를 포함한다. 이러한 변경된 재조합효소는 변경 H64S, 예를 들어 변경 H64S 및 D332K, 변경 H64S 및 R345K, 변경 H64S, D332K 및 R345K, 및 변경 H64S, P267K, D332K 및 R345K 등을 더 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 변경된 재조합효소는, 예를 들어 변경 P324K, 변경 D337K, 변경 P324K 및 D337K, 및 변경 P259K, P324K 및 D337K를 포함하는, Pro259, Pro324 및/또는 Asp337에서의 변경을 갖는, 서열 번호 15의 아미노산 서열을 갖는 엔테로박테리아 파지 RB43 UvsX를 포함한다. 이러한 변경된 재조합효소는 변경 H66S, 예를 들어 변경 H66S 및 P324K, 변경 H66S 및 D337K, 변경 H66Sm P324K 및 D337K, 및 변경 H66S, P259K, P324K 및 D337K 등을 더 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 변경된 재조합효소는, 예를 들어 변경 E328K, 및 변경 Q261K 및 E328K를 포함하는, Gln261 및/또는 Glu328에서의 변경을 갖는, 서열 번호 16의 아미노산 서열을 갖는 프로클로로코커스 파지 P-SSM2 UvsX로부터 유래된 UvsX 재조합효소를 포함한다. 이러한 변경된 재조합효소는 변경 T62S, 예를 들어 변경 T62S 및 E328K, 및 변경 T62S, Q261K 및 E328K 등을 더 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 변경된 재조합효소는, 예를 들어 K330에서의 변경을 포함하는, Lys330에서의 변경을 갖는, 서열 번호 17의 아미노산 서열을 갖는 프로클로로코커스 파지 P-SSM4 UvsX를 포함한다. 이러한 변경된 재조합효소는 변경 T65S를 더 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 변경된 재조합효소는, 예를 들어 변경 R331K, 및 변경 E264K 및 R331K를 포함하는, Arg331 및/또는 Glu264에서의 변경을 갖는, 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖는 시네쵸코커스 파지 S-PM2 UvsX를 포함한다. 이러한 변경된 재조합효소는 변경 T65S, 예를 들어 변경 T65S 및 R331K, 및 변경 T65S, E264K 및 R331K 등을 더 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 변경된 재조합효소는, 예를 들어 변경 P324K, 변경 R337K, 및 변경 P324K 및 R337K를 포함하는, Pro324 및/또는 Arg337에서의 변경을 갖는, 서열 번호 19의 아미노산 서열을 갖는 엔테로박테리아 파지 RB32를 포함한다. 이러한 변경된 재조합효소는 변경 H66S, 예를 들어 변경 H66S 및 P324K, 변경 H66S 및 R337K, 및 변경 H66S, P324K 및 R337K 등을 더 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 변경된 재조합효소는, 예를 들어 변경 E332K, 변경 R345K, 변경 E332K 및 R345K, 및 변경 F259, E332K 및 R345K를 포함하는, Phe259, Glu332 및/또는 Arg345에서의 변경을 갖는, 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는 비브리오 파지 nt-1 UvsX를 포함한다. 이러한 변경된 재조합효소는 변경 H64S, 예를 들어 변경 H64S 및 E332K, 변경 H64S 및 R345K, 변경 H64S, E332K 및 R345K, 및 변경 H64S, F259, E332K 및 R345K 등을 더 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 변경된 재조합효소는, 예를 들어 변경 P324K, 변경 D337K, 변경 P324K 및 D337K, 및 변경 P259K, P324K 및 D337K를 포함하는, Pro259, Pro324 및/또는 Asp337에서의 변경을 갖는, 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는 엔테로박테리아 파지 RB16 UvsX를 포함한다. 이러한 변경된 재조합효소는 변경 H66S, 예를 들어 변경 H66S 및 P324K, 변경 H66S 및 D337K, 변경 H66S, P324K 및 D337K, 및 변경 H66S, P259K, P324K 및 D337K 등을 더 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 변경된 재조합효소는 여기에 포함된 표 1 내지 5 중 임의의 하나에 기재된 바대로 UvsX 재조합효소를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 임의의 상기 돌연변이 이외에, 재조합 UvsX는 야생형 재조합효소와 비교하여 추가의 치환, 결실 및/또는 부가 돌연변이를 포함할 수 있다. 하나 이상의 위치에서의 임의의 다양한 치환 돌연변이는 당해 분야에 공지되고, 제2009/0029421호(이의 전문이 참고로 포함됨)의 자료에 의해 예시된 바대로 만들어질 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에서, 상기 돌연변이 이외에, 재조합 UvsX는 C 말단에서의 하나 이상의 글루탐산 잔기의 부가; C 말단에서의 하나 이상의 아스파르트산 잔기의 부가; 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 돌연변이를 더 포함할 수 있다.
돌연변이 재조합효소
다양한 유형의 돌연변이유발은 예를 들어 재조합효소 모델 및 모델 예측에 따라 또는 랜덤 또는 반램덤 돌연변이 접근법을 이용하여 변이체를 제조하기 위해, 예를 들어, 재조합효소를 변형시키도록 본 개시내용에서 임의로 사용된다. 일반적으로, 임의의 이용 가능한 돌연변이유발 절차는 재조합효소 돌연변이체를 만들기 위해 이용될 수 있다. 이러한 돌연변이유발 절차는 임의로 하나 이상의 관심 대상의 활성(예를 들어, 고체 지지체에서의 증대된 시딩 및/또는 증폭)에 대한 돌연변이체 핵산 및 폴리펩타이드의 선택을 포함한다. 이용될 수 있는 절차는 부위 지정 점 돌연변이유발, 랜덤 점 돌연변이유발, 시험관내 또는 생체내 상동성 재조합(DNA 셔플링 및 조합 오버랩 PCR), 유라실 함유 주형을 사용한 돌연변이유발, 올리고뉴클레오타이드 지정 돌연변이유발, 포스포로티오에이트 변형된 DNA 돌연변이유발, 갭 듀플렉스 DNA를 사용한 돌연변이유발, 점 미스매치 보수, 보수 결핍 숙주 균주를 이용한 돌연변이유발, 제한-선택 및 제한-정제, 결실 돌연변이유발, 전체 유전자 합성에 의한 돌연변이유발, 축퇴성 PCR, 이중 가닥 파괴 보수 및 숙련자에게 공지된 많은 기타를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 예를 들어, US 제2009/0029421호(이의 전문이 참고로 포함됨)에서 확인된 것과 같은 이용 가능한 재조합효소 돌연변이체를 포함하는, 돌연변이에 대한 출발 재조합효소는 임의의 본 명세서에 기재된 것일 수 있다.
임의로, 돌연변이유발은 자연 발생 재조합효소 분자로부터의, 또는 공지된 변경된 또는 돌연변이된 재조합효소(예를 들어, 이전의 참고문헌에 기재된 바와 같은 기존의 돌연변이체 재조합효소를 사용), 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 서열, 서열 비교, 물성, 결정 구조 및/또는 기타 등등의 공지된 정보에 의해 지시될 수 있다. 그러나, 실시형태의 또 다른 종류에서, 변형은 본질적으로 랜덤일 수 있다(예를 들어, 전통적인 또는 "패밀리" DNA 셔플링에서처럼, 예를 들어 문헌[Crameri et al. (1998) "DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution" Nature 391:288-291]을 참조한다).
돌연변이 포맷에 대한 추가 정보는 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning -- A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 2000 ("Sambrook"); Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. 및 John Wiley & Sons, Inc., (2011년에 보충) ("Ausubel")) 및 PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis et al. eds) Academic Press Inc. San Diego, Calif. (1990) ("Innis")]에서 발견된다. 하기 공보 및 이것 내에 인용된 참고문헌은 돌연변이 포맷에 대한 추가의 상세내용을 제공한다: Arnold, "Protein engineering for unusual environments," Current Opinion in Biotechnology 4:450-455 (1993); Bass et al., "Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities," Science 242:240-245 (1988); Bordo and Argos (1991) "Suggestions for "Safe" Residue Substitutions" in Site-directed Mutagenesis 217:721-729; Botstein and Shortle, "Strategies and applications of in vitro mutagenesis," Science 229:1193-1201 (1985); Carter et al., "Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors," Nucl Acids Res 13: 4431-4443 (1985); Carter, "Site-directed mutagenesis," Biochem J 237:1-7 (1986); Carter, "Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors," Methods in Enzymol 154: 382-403 (1987); Dale et al., "Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method," Methods Mol. 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Mol . Biol. 330:287-296 (2003). Additional details on many of the above methods can be found in Methods in Enzymology Volume 154. 많은 상기 방법에 관한 추가의 상세내용은 다양한 돌연변이유발 방법에 의한 장해 조정 문제에 대한 유용한 대조군을 또한 기재하는 문헌[Methods in Enzymology Volume 154]에서 발견될 수 있다.
재조합 재조합효소의 제조 및 단리
일반적으로, 본 명세서에 제시된 바와 같은 재조합효소를 코딩하는 핵산은 클로닝, 재조합, 시험관내 합성, 시험관내 증폭 및/또는 다른 이용 가능한 방법에 의해 제조될 수 있다. 다양한 재조합 방법은 본 명세서에 제시된 바와 같은 재조합효소를 코딩하는 발현 벡터를 발현하기 위해 이용될 수 있다. 재조합 핵산을 제조하는 방법, 발현된 산물의 발현 및 단리는 당해 분야에 널리 공지되고 기재되어 있다. 다수의 예시적인 돌연변이 및 돌연변이의 조합, 및 원하는 돌연변이의 설계를 위한 전략은 본 명세서에 기재되어 있다.
돌연변이, 재조합 및 시험관내 핵산 조작 방법(클로닝, 발현, PCR 등 포함)에 대한 추가의 유용한 참고문헌은 문헌[Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology Volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (Berger); Kaufman et al. (2003) Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine Second Edition Ceske (ed) CRC Press (Kaufman); 및 The Nucleic Acid Protocols Handbook Ralph Rapley (ed) (2000) Cold Spring Harbor, Humana Press Inc (Rapley); Chen et al. (ed) PCR Cloning Protocols, Second Edition (Methods in Molecular Biology, volume 192) Humana Press; 및 Viljoen et al. (2005) Molecular Diagnostic PCR Handbook Springer, ISBN 1402034032]을 포함한다.
또한, 과다한 키트는 세포로부터의 플라스미드 또는 다른 관련 핵산의 정제에 상업적으로 이용 가능하다(예를 들어, EASY PREP(상표명) 및 FLEXIPRPEP(상표명)(둘 다 Pharmacia Biotech로부터 입수); STRATACLEAN(상표명)(Stratagene으로부터 입수); 및 QIAPREP(상표명)(Qiagen으로부터 입수) 참조). 임의의 단리된 및/또는 정제된 핵산은 추가로 다른 핵산을 생산하기 위해 조작되고/되거나, 세포를 형질주입하기 위해 사용되고/되거나, 발현을 위해 유기체를 감염시키기 위해 관련된 벡터로 도입되고/되거나, 기타 등등일 수 있다. 통상적인 클로닝 벡터는 전사 및 번역 종결자, 전사 및 번역 개시 서열, 및 특정한 표적 핵산의 발현의 조절에 유용한 촉진자를 함유한다. 벡터는 임의로 적어도 하나의 독립적인 종결자 서열을 함유하는 유전자 발현 카세트, 진핵생물 또는 원핵생물, 또는 둘 다에서의 카세트의 복제를 허용하는 서열(예를 들어, 셔틀 벡터), 및 원핵생물 및 진핵생물 시스템 둘 다에 대한 선택 마커를 포함한다. 벡터는 원핵생물 또는 진핵생물 또는 둘 다에서 복제 및 통합에 적합하다.
예를 들어, 세포 단리 및 배양에 대한(예를 들어, 후속하는 핵산 단리에 대한) 다른 유용한 참고문헌은 문헌[Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley-Liss, New York 및 여기에 인용된 참고문헌; Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, N.Y.; Gamborg and Phillips (eds) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York) and Atlas and Parks (eds) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, Fla]을 포함한다.
본 명세서에 개시된 재조합 재조합효소를 코딩하는 핵산은 또한 본 명세서에 제시된 실시형태의 특징이다. 특정한 아미노산은 다수의 코돈에 의해 코딩될 수 있고, 소정의 번역 시스템(예를 들어, 원핵생물 또는 진핵생물 세포)은 대개 코돈 바이어스를 나타내고, 예를 들어 상이한 유기체는 대개 동일한 아미노산을 코딩하는 몇몇 동의성 코돈 중 하나를 선호한다. 그러므로, 본 명세서에 제시된 핵산은 임의로 "코돈 최적화"되고, 이는 핵산이 재조합효소를 발현하도록 이용된 특정한 번역 시스템이 선호하는 코돈을 포함하도록 합성된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 박테리아 세포(또는 심지어 박테리아의 특정한 균주)에서 재조합효소를 발현시키는 것이 바람직할 때, 핵산은 재조합효소의 효율적인 발현을 위해 그 박테리아 세포의 게놈에서 가장 흔히 발견되는 코돈을 포함하도록 합성될 수 있다. 진핵생물 세포에서 재조합효소를 발현시키는 것이 바람직할 때 유사한 전략을 이용할 수 있고, 예를 들어 핵산은 그 진핵생물 세포가 선호하는 코돈을 포함할 수 있다.
다양한 단백질 단리 및 검출 방법은 공지되어 있고, 예를 들어 본 명세서에 제시된 재조합 재조합효소를 발현하는 세포의 재조합 배양으로부터 재조합효소를 단리하도록 이용될 수 있다. 다양한 단백질 단리 및 검출 방법은 예를 들어 문헌[R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982); Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N.Y. (1990); Sandana (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; Bollag et al. (1996) Protein Methods, 2nd Edition Wiley-Liss, NY; Walker (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris and Angal (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Harris and Angal Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Scopes (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3rd Edition Springer Verlag, NY; Janson and Ryden (1998) Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications, Second Edition Wiley-VCH, NY; and Walker (1998) Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ; 및 여기에 인용된 참고문헌]에 기재된 것을 포함하여 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 단백질 정제 및 검출 방법에 관한 추가의 상세내용은 문헌[Satinder Ahuja ed., Handbook of Bioseparations, Academic Press (2000)]에서 발견될 수 있다.
사용 방법
본 명세서에 제시된 변경된 재조합효소는 재조합효소 매개된 증폭 절차, 예컨대, 재조합효소 중합효소 증폭(recombinase polymerase amplification: RPA) 기법에서 사용될 수 있다. 간단히 말하면, RPA는 표적 핵산을 표적 핵산 분자에 특이적인 단일 가닥 핵산 프라이머 및 재조합효소와 접촉시킴으로써 개시될 수 있다. 이후, 혼성화된 프라이머는 중합효소, 예컨대, 이중 가닥 표적 핵산 분자 및 핵산 분자의 대체된 가닥을 생성하기 위해 dNTP의 존재 하에 가닥 대체를 할 수 있는 중합효소에 의해 연장될 수 있다. 추가의 증폭은 이중 가닥 핵산 분자를 생성하기 위해 핵산 분자의 대체된 가닥에 대한 프라이머의 재조합효소 매개된 표적화 및 프라이머의 연장에 의해 발생할 수 있다. RPA 과정은 상기 기재된 성분과 예를 들어 재조합효소 로딩 인자, 특이적 가닥 대체 중합효소 및 튼튼한 에너지 재생 시스템의 조합에 의해 조정될 수 있다. 본 개시내용의 재조합 UvsX 단백질과 사용하기 위해 용이하게 채택 가능한 예시적인 RPA 절차, 시스템 및 성분은 예를 들어 미국 특허 제8,071,308호; 제7,399,590호; 제7,485,428호; 제7,270,981호; 제8,030,000호; 제7,666,598호; 제7,763,427호; 제8,017,399호; 제8,062,850호; 및 제7,435,561호(이들의 각각은 본 명세서에서 참고로 포함됨)에 기재되어 있다.
몇몇 실시형태에서, 등온 증폭은 배제 증폭(ExAmp)이라고도 칭하는 키네틱 배제 증폭(kinetic exclusion amplification: KEA)을 이용하여 수행될 수 있다. 본 개시내용의 핵산 라이브러리는 키네틱 배제를 이용하는 방법을 이용하여 만들어질 수 있다. 또 다른 사건 또는 과정이 발생하는 것을 효과적으로 배제하기 위해 충분히 빠른 속도로 과정이 발생할 때 키네틱 배제가 발생할 수 있다. 예를 들어, 핵산 어레이의 제조를 취하고, 여기서 어레이의 부위는 용액으로부터 표적 핵산에 의해 랜덤으로 시딩되고, 표적 핵산의 카피는 캐패시티로 시딩된 부위의 각각을 충전하도록 증폭 과정에서 생성된다. 본 개시내용의 키네틱 배제 방법에 따라, 시딩 및 증폭 과정은 증폭 속도가 시딩 속도를 초과하는 조건 하에 동시에 진행할 수 있다. 그러므로, 제1 표적 핵산에 의해 시딩된 부위에서 카피가 만들어지는 비교적 빠른 속도는 제2 핵산이 증폭에 대한 부위를 시딩하는 것을 배제할 것이다. 키네틱 배제 증폭 방법은 미국 출원 제2013/0338042호(본 명세서에 이의 전문이 참고로 포함됨)의 개시내용에 자세히 기재된 바대로 수행될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 증폭된 표적 핵산은 완전히 이중 가닥이다. 몇몇 실시형태에서, 증폭된 표적 핵산은 이중 가닥 핵산의 영역을 포함하고, 또한 단일 가닥 핵산을 갖는 영역을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 표적 핵산은 라이브러리 단편의 각각의 말단에서 단일 가닥 서열의 약 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개 또는 약 40개 초과의 염기의 영역을 갖는 하나 이상의 포크의 어댑터를 포함한다. 포크의 어댑터의 설계 및 사용은 미국 출원 제7,742,463호 및 제8,563,748호(이들의 각각은 본 명세서에 이의 전문이 참고로 포함됨)의 개시내용에 더 자세히 기재되어 있다.
키네틱 배제는 표적 핵산의 후속하는 또는 제1 카피를 만들기 위한 비교적 빠른 속도에 대비된 표적 핵산의 제1 카피를 만들기 위한 비교적 느린 속도를 이용할 수 있다. 이전의 문단의 예에서, 키네틱 배제는 핵산 시드(nucleic acid seed)의 카피에 의해 부위를 충전하도록 증폭이 발생하는 비교적 빠른 속도에 대비된 표적 핵산 시딩의 비교적 느린 시딩(예를 들어, 비교적 느린 확산 또는 운반)으로 인해 발생한다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, 키네틱 배제는 후속하는 카피가 부위를 충전하도록 만들어지는 비교적 빠른 속도에 대비된 부위를 시딩한 표적 핵산의 제1 카피의 형성에서의 지연(예를 들어, 지연된 또는 느린 활성화)으로 인해 발생할 수 있다. 이 예에서, 개별 부위는 몇몇 상이한 표적 핵산에 의해 시딩될 수 있다(예를 들어, 몇몇 표적 핵산은 증폭 전에 각각의 부위에 존재할 수 있음). 그러나, 임의의 소정의 표적 핵산에 대한 제1 카피 형성은 제1 카피 형성의 평균 속도가 후속하는 카피가 생성되는 속도와 비교하여 비교적 느리도록 랜덤으로 활성화될 수 있다. 이 경우에, 개별 부위가 몇몇 상이한 표적 핵산에 의해 시딩될 수 있지만, 키네틱 배제는 이 표적 핵산 중 오직 하나가 증폭되게 허용할 것이다. 더 구체적으로, 제1 표적 핵산이 증폭에 대해 활성화되면, 부위는 이의 카피에 의해 캐패시티로 빠르게 충전하여서, 제2 표적 핵산의 카피가 부위에서 만들어지는 것을 막을 것이다.
증폭 시약은 앰플리콘 형성을 수월하게 하고, 몇몇 경우에 앰플리콘 형성의 속도를 증가시키는 추가의 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어 UvsX와 같은 재조합효소는 반복된 침범/연장을 허용함으로써 앰플리콘 형성을 수월하게 할 수 있다. 더 구체적으로, 재조합효소는 중합효소에 의한 표적 핵산의 침범 및 앰플리콘 형성에 대한 주형으로서 표적 핵산을 사용한 중합효소에 의한 프라이머의 연장을 수월하게 할 수 있다. 이 과정은 사슬 반응으로 반복될 수 있고, 여기서 각각의 회차의 침범/연장으로부터 생산된 앰플리콘은 후속하는 회차에서 주형으로서 작용한다. 과정은, (예를 들어, 가열 또는 화학 변성을 통해) 변성 사이클이 필요하지 않으므로, 표준 PCR보다 더 신속히 발생할 수 있다. 그러므로, 재조합효소 촉진된 증폭은 등온으로 수행될 수 있다. 증폭을 수월하게 하도록 재조합효소 촉진된 증폭 시약에서 ATP, 또는 다른 뉴클레오타이드(또는 몇몇 경우에 이의 가수분해 불가능한 유사체)를 포함하는 것이 일반적으로 바람직하다. SSB가 증폭을 더 수월하게 할 수 있으므로, 재조합효소 및 단일 가닥 결합(SSB) 단백질의 혼합물은 특히 유용하다. 재조합효소 촉진된 증폭에 대한 예시적인 제제는 TwistDx(영국 캠브릿지)에 의한 TwistAmp 키트로서 상업적으로 판매되는 것을 포함한다. 재조합효소 촉진된 증폭 시약의 유용한 성분 및 반응 조건은 US 제5,223,414호 및 US 제7,399,590호(이들의 각각은 본 명세서에 참고로 포함됨)에 기재되어 있다.
서열 비교, 동일성 및 상동성
용어 "동일한" 또는 "동일성 백분율"은, 2개 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열의 맥락에서, 하기 기재된 서열 비교 알고리즘(또는 숙련자에게 이용 가능한 다른 알고리즘) 중 하나를 사용하여 또는 육안 검사에 의해 결정된 바대로, 정렬되고 최대 상응에 대해 정렬될 때, 이것들이거나 이것들인 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드의 특정한 백분율을 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 의미한다.
구절 "실질적으로 동일한"은, 2개의 핵산 또는 폴리펩타이드(예를 들어, 재조합효소, 또는 재조합효소의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA)의 맥락에서, 서열 비교 알고리즘을 사용하여 또는 육안 검사에 의해 결정된 바대로, 정렬되고 최대 상응에 대해 정렬될 때, 적어도 약 60%, 약 80%, 약 90% 내지 95%, 약 98%, 약 99% 또는 이것 초과의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기 동일성을 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 의미한다. 이러한 "실질적으로 동일한" 서열은 통상적으로 실제 원형(ancestry)을 참조함이 없이 "상동성"인 것으로 생각된다. 바람직하게는, "실질적인 동일성"은 적어도 약 50개의 잔기의 길이인 서열의 영역에 걸쳐, 더 바람직하게는 적어도 약 100개의 잔기의 영역에 걸쳐 존재하고, 가장 바람직하게는, 서열은 적어도 약 150개의 잔기, 또는 비교되는 2개의 서열의 완전 길이에 걸쳐 실질적으로 동일하다.
단백질 및/또는 단백질 서열은 이들이 흔한 원형 단백질 또는 단백질 서열로부터 천연으로 또는 인공으로 유래되는 경우 "상동성"이다. 유사하게, 핵산 및/또는 핵산 서열은 이들이 흔한 원형 핵산 또는 핵산 서열로부터 천연으로 또는 인공으로 유래되는 경우 상동성이다. 상동성은 일반적으로 2개 이상의 핵산 또는 단백질(또는 이의 서열) 사이의 서열 유사성으로부터 추론된다. 상동성을 확립하는 데 유용한 서열 사이의 유사성의 정확도 백분율은 논의 중인 핵산 및 단백질에 따라 변하지만, 50개, 100개, 150개 또는 초과의 잔기에 대해 25%만큼 적은 서열 유사성은 상동성을 확립하기 위해 일상적으로 이용된다. 서열 유사성의 더 높은 수준, 예를 들어 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 또는 초과는 상동성을 확립하기 위해 또한 이용될 수 있다. 서열 유사성 백분율을 결정하기 위한 방법(예를 들어, 디폴트 매개변수를 사용한 BLASTP 및 BLASTN)은 본 명세서에 기재되어 있고, 일반적으로 이용 가능하다.
서열 비교 및 상동성 결정을 위해, 통상적으로 하나의 서열은 시험 서열이 비교되는 기준 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때, 시험 및 기준 서열은 컴퓨터로 입력되고, 하위서열 좌표는 필요한 경우 지정되고, 서열 알고리즘 프로그램 매개변수는 지정된다. 이후, 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 매개변수에 기초하여 기준 서열에 대비된 시험 서열(들)에 대한 서열 동일성 백분율을 계산한다.
비교에 대한 서열의 최적 정렬은 예를 들어 문헌[Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)]의 국소 상동성 알고리즘에 의해, 문헌[Needleman and Wunsch, J. Mol . Biol. 48:443 (1970)]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 문헌[Pearson and Lipman, Proc . Nat'l . Acad . Sci . USA 85:2444 (1988)]의 유사성 방법에 대한 조사에 의해, 이 알고리즘의 컴퓨터 실행(Wisconsin Genetics Software Package(미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 제네틱스 컴퓨터 그룹)의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA)에 의해 또는 시각 검사(일반적으로 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., 2004년에 보충] 참조)에 의해 수행될 수 있다.
서열 동일성 및 서열 유사성 백분율을 결정하기에 적합한 알고리즘의 일 예는 문헌[Altschul et al., J. Mol . Biol . 215:403-410 (1990)]에 기재된 BLAST 알고리즘이다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생명과학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공공에 이용 가능하다. 이 알고리즘은, 데이터베이스 서열에서의 동일한 길이의 단어와 정렬될 때, 일부 양의 값의 한계치 점수 T를 일치시키거나 만족시키는, 쿼리 서열에서 길이 W의 짧은 워드를 확인함으로써 고 스코어링 서열 쌍(high scoring sequence: HSP)을 처음에 확인하는 것을 수반한다. T는 이웃 워드 점수 한계치라 불린다(상기 Altschul 등의 문헌 참조). 이 초기 이웃 워드 히트는 이를 함유하는 더 긴 HSP를 발견하기 위해 조사를 개시하기 위한 시드로서 작용한다. 이후, 워드 히트는 누적 정렬 점수가 증가할 수 있는 한 각각의 서열을 따라 양 방향에서 연장된다. 누적 점수는, 뉴클레오타이드 서열에 대해, 매개변수 M(한 쌍의 매칭 잔기에 대한 보상 점수; 항상 0 초과) 및 N(미스매칭 잔기에 대한 패널티 점수; 항상 0 미만)을 사용하여 계산된다. 아미노산 서열에 대해, 스코어링 매트릭스는 누적 점수를 계산하도록 이용된다. 각각의 방향에서의 워드 히트의 연장은, 누적 정렬 점수가 이의 최대 획득 값으로부터 분량 X만큼 줄어들 때; 누적 점수가 하나 이상의 음의 점수의 잔기 정렬의 축적으로 인해 0 미만으로 갈 때; 또는 서열 중 어느 하나의 말단이 도달될 때 중지된다. BLAST 알고리즘 매개변수 W, T 및 X는 정렬의 민감도 및 속도를 결정한다. (뉴클레오타이드 서열에 대해) BLASTN 프로그램은 디폴트로서 11의 워드길이(W), 10의 예상(E), 100의 컷오프, M=5, N=-4, 및 a 가닥 둘 다의 비교를 이용한다. 아미노산 서열에 대해, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 3의 워드길이(W), 10의 예상(E) 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스를 이용한다(문헌[Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)] 참조).
서열 동일성 백분율을 계산하는 것 이외에, BLAST 알고리즘은 또한 2개의 서열 사이의 유사성의 통계 분석을 수행한다(예를 들어, 문헌[Karlin and Altschul, Proc. Nat'l . Acad . Sci . USA 90:5873-5787 (1993)] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공된 유사성의 일 측정은 2개의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 사이의 매치가 우연히 발생하는 확률의 표시를 제공하는 최소 합 확률(P(N))이다. 예를 들어, 기준 핵산에 대한 시험 핵산의 비교에서의 최소 합 확률이 약 0.1 미만, 더 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우, 핵산은 기준 서열과 유사하다고 생각된다.
변경된 재조합효소를 코딩하는 핵산
본 명세서에 제시된 변경된 재조합효소 효소를 코딩하는 핵산 분자가 본 명세서에 추가로 제시된다. 아미노산 서열 및 바람직하게는 또한 재조합효소를 코딩하는 야생형 뉴클레오타이드 서열이 공지된 재조합효소의 돌연변이체 버전인 임의의 소정의 변경된 재조합효소에 대해, 분자 생물학의 기본 원칙에 따라 돌연변이체를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 얻을 수 있다. 예를 들어, RB49 UvsX 재조합효소를 코딩하는 야생형 뉴클레오타이드 서열이 공지됨을 가정하여, 표준 유전자 코드를 이용하여 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 RB49 UvsX의 임의의 소정의 돌연변이체 버전을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 추론할 수 있다. 유사하게, 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어 T4, T6, Rb69, Aeh1, KVP40, 아시네토박터 파지 133, 아에로모나스 파지 65, 사이아노파지 P-SSM2, 사이아노파지 PSSM4, 사이아노파지 S-PM2, Rb32, 비브리오 파지 nt-1, Rb16, Rb43, T2, Rb14, 아에로모나스 파지 25, phi-1, 파지 31, 파지 44RR2.8t, 파지 Rb3 및 파지 LZ2 등과 같은 다른 재조합효소는 돌연변이체 버전에 대해 용이하게 유래될 수 있다. 이후, 획득된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자는 당해 분야에 공지된 표준 분자 생물학 기법을 이용하여 작제될 수 있다.
본 명세서에 제시된 실시형태에 따라, 정의된 핵산은, 특히 보존적 아미노산 치환에서의 축퇴성 코돈으로 인해 동의성 코돈(동일한 아미노산 잔기를 규명하는 상이한 코돈)을 발생시키는 경우에, 치환을 포함하여, 동일한 핵산뿐만 아니라 임의의 소수의 염기 변이를 포함한다. 용어 "핵산 서열"은 또한 염기 변이와 관련하여 주어진 임의의 단일 가닥 서열에 대한 상보성 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 핵산 분자는 또한 유리하게는 적합한 숙주에서 이로부터 코딩된 재조합효소 단백질을 발현시키도록 적합한 발현 벡터에 포함될 수 있다. 상기 세포의 후속하는 형질전환에 적합한 발현 벡터로의 클로닝된 DNA의 도입 및 형질전환된 세포의 후속하는 선택은 문헌[Sambrook et al. (1989), Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory](이의 전문이 참고로 포함됨)에 제공된 바대로 당해 분야의 숙련자에게 널리 공지되어 있다.
이러한 발현 벡터는 조절 서열, 예컨대, 상기 DNA 단편의 발현을 실행할 수 있는 촉진자 영역에 작동적으로 연결된 본 명세서에 제시된 실시형태에 따른 핵산을 갖는 벡터를 포함한다. 용어 "작동적으로 연결된"은 기재된 성분이 이들이 이의 의도된 방식으로 기능하게 허용하는 관계에 있는 병치를 의미한다. 이러한 벡터는 본 명세서에 제시된 실시형태에 따른 단백질의 발현을 제공하기 위해 적합한 숙주 세포로 형질전환될 수 있다.
핵산 분자는 성숙 단백질 또는 프로서열을 갖는 단백질, 예를 들어 프리단백질(성숙 단백질을 형성하기 위해 숙주 세포에 의해 이후 절단됨)에서 리더 서열을 코딩하는 것을 코딩할 수 있다. 벡터는 예를 들어, 복제 기원이 제공된 플라스미드, 바이러스 또는 파지 벡터, 및 임의로 상기 뉴클레오타이드의 발현을 위한 촉진자 및 임의로 촉진자의 조절자일 수 있다. 벡터는 하나 이상의 선택 가능한 마커, 예를 들어 항생제 내성 유전자 등을 함유할 수 있다.
발현에 필요한 조절 유전요소는 RNA 중합효소를 결합시키고 리보솜 결합에 대해 전사 개시 및 또한 번역 개시 서열의 적절한 수준을 지시하기 위한 촉진자 서열을 포함한다. 예를 들어, 박테리아 발현 벡터는 촉진자, 예컨대, lac 촉진자 및 번역 개시를 위해 샤인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 및 출발 코돈 AUG를 포함할 수 있다. 유사하게, 진핵생물 발현 벡터는 RNA 중합효소 II에 대한 비상동성 또는 상동성 촉진자, 하류 폴리아데닐화 신호, 출발 코돈 AUG 및 리보솜의 부착을 위한 종결 코돈을 포함할 수 있다. 이러한 벡터는 상업적으로 입수되거나, 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 기재된 서열로부터 조립될 수 있다.
고등 진핵생물에 의한 재조합효소를 코딩하는 DNA의 전사는 벡터에서 증강자 서열을 포함함으로써 최적화될 수 있다. 증강자는 전사의 수준을 증가시키기 위해 촉진자에서 작용하는 DNA의 시스 작용성 유전요소이다. 벡터는 또한 일반적으로 선택 가능한 마커 이외에 복제 기원을 포함할 것이다.
실시예 1
P321K에 상동성인 돌연변이를 갖는 돌연변이체의 평가
P321K에 상동성인 돌연변이를 갖는 재조합효소 돌연변이체의 성능을 평가하였다. 이 실시예에서, "대조군" 재조합효소는 하기 표에서 "대조군" 열에 기재된 바대로 RB49에서 H63S에 상동성인 돌연변이를 포함하도록 야생형 재조합효소를 변형시킴으로써 생성되었다. "P321K 동족체" 돌연변이체는 하기 표 2에서 "P321K 동족체" 열에 기재된 바대로 RB49에서 P321K에 상동성인 돌연변이를 보유하도록 대조군을 추가로 변형시킴으로써 생성되었다.
예를 들어, T6 UvsX에 대해, 대조군은 H66S 돌연변이를 보유하도록 야생형 T6 UvsX(서열 번호 9)를 변형시킴으로써 생성되었다. P321K 동족체는 H66S 및 P324K 돌연변이 둘 다를 보유하도록 추가로 변형되었다.
Figure pct00002
패턴화된 유세포에서 PCR-프리 라이브러리의 클러스터링은 대조군 또는 P321K 돌연변이체를 사용하여 하기 기재된 바대로 cBot에서 수행되었다. 이후, 서열분석은 HiSeq 장치(Illumina, Inc.)에서 수행되고, 서열분석 결과는, 통상적으로 이전의 서열분석 데이터에 빈약하게 표시된 다양한 영역의 호출성(callability)을 결정하기 위해, 하기 기재된 바대로 분석되었다.
대조군 대 P321K 동족체 돌연변이체에 대한 호출성 데이터의 비교는 P321K 동족체 돌연변이체가, 대조군의 것과 비교하여, 포스미드 촉진자 영역, 고 GC, 막대한 GC, 저 GC, 고 AT, 막대한 AT 및 AT 다이뉴클레오타이드 반복 영역 중 하나 이상의 호출성의 예상치 못한 상당한 개선을 보여준다는 것을 입증한다.
클러스터링 효율의 결정
패턴화된 유세포 표면 상의 PCR-프리 라이브러리를 시딩하는 데 있어서 돌연변이체 재조합효소 제제의 효율을 평가하기 위해, PCR-프리 라이브러리는 TruSeq(등록상표) DNA PCR-프리 샘플 제조 키트(Illumina, Inc.)를 사용하여 생성되었다. TruSeq(등록상표) 라이브러리 제조 키트를 사용하여 생성된 PCR-프리 라이브러리는 라이브러리 단편의 각각의 말단에서 단일 가닥 서열의 약 40개의 염기의 영역을 갖는 포크의 어댑터를 갖는다.
라이브러리를 T4 UvsX 제제 또는 돌연변이체 재조합효소 제제와 100pM 최종 농도로 혼합하고, 유세포에서 플러싱 처리하고, 38℃에서 cBot에서 항온처리하였다. 1시간 항온처리 기간 후, 온도를 20℃로 낮추고, 유세포를 HT2 세척 완충제(Illumina)에 의해 세척하였다. 클러스터를 0.1M Tris/0.1M 아스코르브산나트륨 중의 SYBR(등록상표) Green(Life Technologies)의 1:5,000 희석에 의해 염색하고, 형광 현미경에서 영상화하였다. 형광의 강도에 기초하여, 돌연변이체 재조합효소를 포함하는 제제를 사용하여 패턴화된 유세포 상에 PCR-프리 라이브러리를 시딩함으로써 생성된 클러스터의 밀도가 실질적으로 개선되는 것으로 결정된다.
이후, 서열분석은 HiSeq 장치(Illumina, Inc.)에서 수행되고, 서열분석 결과는, 통상적으로 이전의 서열분석 데이터에 빈약하게 표시된 다양한 영역의 호출성을 결정하기 위해 분석되었다.
호출성은 단일 뉴클레오타이드 다형(SNP)이 정확히 호출되는 부위의 분획의 측정치이다. 이상적으로는, 이 값은 (100%에 대해) 1이고, 이는 영역의 특정한 타입(즉, 고 GC 등) 내의 부위의 100%에서 SNP가 정확히 호출된다는 것을 의미한다. 커버리지는 커버리지 > n(여기서, n은 통상적으로 30x(즉, 인간 게놈에 대한 표준 커버리지)임)을 갖는 부위의 분획의 측정치이다. 포스미드 촉진자는 이전의 서열분석 데이터에 빈약하게 표시된 것으로 확인된 100개의 유전자 촉진자의 세트이다. 촉진자는 포스미드 벡터로 클로닝되었다. 고 GC 영역은 GC 함량이 75% 이상(N50 (G + C ≥ 0.75) 100 N50)인 적어도 100bp를 갖는 영역으로서 정의될 수 있다. 막대한 GC 영역은 GC 함량이 85% 이상(N50 (G + C ≥ 0.85) 100 N50)인 적어도 100bp를 갖는 영역으로서 정의될 수 있다. 저 GC 영역은 GC 함량이 40% 이하(N50 (G + C ≥ 0.40) 100 N50)인 적어도 100bp를 갖는 영역으로서 정의될 수 있다. 고 AT 영역은, 약 50k 영역으로 다운샘플링된, AT 함량이 75% 이상(N50 (A + T ≥ 0.75) 100 N50)인 적어도 100bp를 갖는 영역으로서 정의될 수 있다. 막대한 AT 영역은, 약 50k 영역으로 다운샘플링된, AT 함량이 85% 이상(N50 (A + T ≥ 0.85) 100 N50)인 적어도 100bp를 갖는 영역으로서 정의될 수 있다. AT 다이뉴클레오타이드 반복 영역은 ATAT 반복의 긴 스트레치를 포함하는 영역으로서 정의될 수 있다.
대조군 대 돌연변이체에 대한 호출성 데이터의 비교는 돌연변이체가, 대조군의 것과 비교하여, 포스미드 촉진자 영역, 고 GC, 막대한 GC, 저 GC, 고 AT, 막대한 AT 및 AT 다이뉴클레오타이드 반복 영역 중 하나 이상의 호출성의 예상치 못한 상당한 개선을 보여준다는 것을 입증한다.
실시예 2
D334K에 상동성인 돌연변이를 갖는 돌연변이체의 평가
D334K에 상동성인 돌연변이를 갖는 재조합효소 돌연변이체의 성능을 평가하였다. 이 실시예에서, "대조군" 재조합효소는 하기 표 3에서 "대조군" 열에 기재된 바대로 RB49에서 H63S에 상동성인 돌연변이를 포함하도록 야생형 재조합효소를 변형시킴으로써 생성되었다. "D334K 동족체" 돌연변이체는 하기 표에서 "D334K 동족체" 열에 기재된 바대로 RB49에서 D334K에 상동성인 돌연변이를 보유하도록 대조군을 추가로 변형시킴으로써 생성되었다.
예를 들어, T6 UvsX에 대해, 대조군은 H66S 돌연변이를 보유하도록 야생형 T6 UvsX(서열 번호 9)를 변형시킴으로써 생성되었다. D334K 동족체는 H66S 및 R337K 돌연변이 둘 다를 보유하도록 추가로 변형되었다.
Figure pct00003
패턴화된 유세포에서 PCR-프리 라이브러리의 클러스터링은 대조군 또는 D334K 돌연변이체를 사용하여 상기 실시예 1에 기재된 바대로 cBot에서 수행되었다. 이후, 서열분석은 HiSeq 장치(Illumina, Inc.)에서 수행되고, 서열분석 결과는, 통상적으로 이전의 서열분석 데이터에 빈약하게 표시된 다양한 영역의 호출성을 결정하기 위해, 상기 실시예 1에 기재된 바대로 분석되었다.
대조군 대 D334K 동족체 돌연변이체에 대한 호출성 데이터의 비교는 D334K 동족체 돌연변이체가, 대조군의 것과 비교하여, 포스미드 촉진자 영역, 고 GC, 막대한 GC, 저 GC, 고 AT, 막대한 AT 및 AT 다이뉴클레오타이드 반복 영역 중 하나 이상의 호출성의 예상치 못한 상당한 개선을 보여준다는 것을 입증한다.
실시예 3
P321K 및 D334K 이중 돌연변이체에 상동성인 돌연변이를 갖는 돌연변이체의 평가
P321K 및 D334K에 상동성인 돌연변이를 갖는 재조합효소 돌연변이체의 성능을 평가하였다. 이 실시예에서, "대조군" 재조합효소는 하기 표에서 "대조군" 열에 기재된 바대로 RB49에서 H63S에 상동성인 돌연변이를 포함하도록 야생형 재조합효소를 변형시킴으로써 생성되었다. "P321K D334K 동족체" 돌연변이체는 하기 표 4에서 "P321K D334K 동족체" 열에 기재된 바대로 RB49에서 P321K 및 D334K에 상동성인 돌연변이를 보유하도록 대조군을 추가로 변형시킴으로써 생성되었다.
도 1에 의해 입증된 바대로, 사이아노파지 P-SSM2, 사이아노파지 PSSM4 및 사이아노파지 S-PM2가 RB49 Pro321에 상동성인 영역을 갖지 않는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 하기 표에 기재된 돌연변이체가 "이중 돌연변이체"라 불리지만, 오직 소정의 재조합효소가 대조군 골격에 대한 2개의 돌연변이를 포함한다.
예를 들어, T6 UvsX에 대해, 대조군은 H66S 돌연변이를 보유하도록 야생형 T6 UvsX(서열 번호 9)를 변형시킴으로써 생성되었다. P321K D334K 동족체는 H66S, P324K 및 R337K 돌연변이를 보유하도록 추가로 변형되었다.
Figure pct00004
패턴화된 유세포에서 PCR-프리 라이브러리의 클러스터링은 대조군 또는 P321K D334K 돌연변이체를 사용하여 상기 실시예 1에 기재된 바대로 cBot에서 수행되었다. 이후, 서열분석은 HiSeq 장치(Illumina, Inc.)에서 수행되고, 서열분석 결과는, 통상적으로 이전의 서열분석 데이터에 빈약하게 표시된 다양한 영역의 호출성을 결정하기 위해, 상기 실시예 1에 기재된 바대로 분석되었다.
대조군 대 P321K D334K 동족체 돌연변이체에 대한 호출성 데이터의 비교는 P321K D334K 동족체 돌연변이체가, 대조군의 것과 비교하여, 포스미드 촉진자 영역, 고 GC, 막대한 GC, 저 GC, 고 AT, 막대한 AT 및 AT 다이뉴클레오타이드 반복 영역 중 하나 이상의 호출성의 예상치 못한 상당한 개선을 보여준다는 것을 입증한다.
실시예 4
P256K P321K 및 D334K 삼중 돌연변이체에 상동성인 돌연변이를 갖는 돌연변이체의 평가
P256K, P321K 및 D334K에 상동성인 돌연변이를 갖는 재조합효소 돌연변이체의 성능을 평가하였다. 이 실시예에서, "대조군" 재조합효소는 하기 표에서 "대조군" 열에 기재된 바대로 RB49에서 H63S에 상동성인 돌연변이를 포함하도록 야생형 재조합효소를 변형시킴으로써 생성되었다. "P256K P321K D334K 동족체" 삼중 돌연변이체는 하기 표에서 "P256K P321K D334K 동족체" 열에 기재된 바대로 RB49에서 P256K, P321K 및 D334K에 상동성인 돌연변이를 보유하도록 대조군을 추가로 변형시킴으로써 생성되었다.
도 1에 의해 입증된 바대로, 사이아노파지 P-SSM2, 사이아노파지 PSSM4 및 사이아노파지 S-PM2가 RB49 Pro321에 상동성인 영역을 갖지 않는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 하기 표 5에 기재된 돌연변이체가 "삼중 돌연변이체"라 불리지만, 오직 소정의 재조합효소가 대조군 골격에 대한 3개의 돌연변이를 포함한다.
예를 들어, T6 UvsX에 대해, 대조군은 H66S 돌연변이를 보유하도록 야생형 T6 UvsX(서열 번호 9)를 변형시킴으로써 생성되었다. P321K D334K 동족체는 H66S, F259K, P324K 및 R337K 돌연변이를 보유하도록 추가로 변형되었다.
Figure pct00005
Figure pct00006
패턴화된 유세포에서 PCR-프리 라이브러리의 클러스터링은 대조군 또는 P256K P321K D334K 삼중 돌연변이체를 사용하여 상기 실시예 1에 기재된 바대로 cBot에서 수행되었다. 이후, 서열분석은 HiSeq 장치(Illumina, Inc.)에서 수행되고, 서열분석 결과는, 통상적으로 이전의 서열분석 데이터에 빈약하게 표시된 다양한 영역의 호출성을 결정하기 위해, 상기 실시예 1에 기재된 바대로 분석되었다.
대조군 대 P256K P321K D334K 동족체 삼중 돌연변이체에 대한 호출성 데이터의 비교는 P256K P321K D334K 동족체 돌연변이체가, 대조군의 것과 비교하여, 포스미드 촉진자 영역, 고 GC, 막대한 GC, 저 GC, 고 AT, 막대한 AT 및 AT 다이뉴클레오타이드 반복 영역 중 하나 이상의 호출성의 예상치 못한 상당한 개선을 보여준다는 것을 입증한다.
실시예 5
RB49 UvsX의 H63S P256K 및 H63S P321K D334K를 갖는 클러스터링
RB49 UvsX에서의 H63S P256K 및 RB49 Uv에서의 H63S P321K D334K 재조합효소 돌연변이체의 성능을 평가하였다. 패턴화된 유세포에서 PCR-프리 라이브러리의 클러스터링은 상기 실시예 1 내지 4에 기재된 바대로 cBot에서 수행되었다. 이후, 서열분석은 HiSeq 장치(Illumina, Inc.)에서 수행되고, 서열분석 결과는, 통상적으로 이전의 서열분석 데이터에 빈약하게 표시된 다양한 영역의 호출성을 결정하기 위해, 상기 실시예 1 내지 4에 기재된 바대로 분석되었다.
도 3은 700nM 피치 v2.5 pFC에서 V2 화학에 의해 클러스터링된 150pM 인간 PCR-프리 라이브러리의 타이푼 영상을 보여준다. 제1 사이클 DNA 서열분석은 녹색 형광(G 또는 T 도입) 및 적색 형광(A 또는 C 도입)을 측정하는 타이푼 스캐너에서 영상화되었다. 레인 배정은 하기와 같다. 간단히 말하면, 레인 1은 H63S P256K이다. 레인 2는 완충제 1 중의 H63S P321K D334K이다. 레인 3은 완충제 2 중의 H63S P321K D334K이다. 레인 4는 Wt RB69 UvsX이다. 레인 5는 H63S P256K이다. 레인 6은 완충제 1 중의 H63S P321K D334K이다. 레인 7은 완충제 2 중의 H63S P321K D334K이다. 레인 8은 DNA를 갖지 않는 것이다. 완충제 1은 20mM Tris pH 7.5, 200mM NaCl, 1mM EDTA 및 1mM BME이다. 완충제 2는 50mM Tris PH 7.5, 100mM NaCL, 1mM DTT, 0.1mM EDTA 및 50% 글라이세롤이다.
본 출원에 걸쳐 다양한 공보, 특허 및/또는 특허 출원이 참조된다. 이들 공보의 개시내용은 그 전문이 본 출원에 참고로 본 명세서에 의해 포함된다.
용어 포함은 인용된 부재를 포함할 뿐만 아니라 임의의 추가 부재를 더 포함하는 개방 말단일 것으로 본 명세서에서 의도된다.
다수의 실시형태가 기재되어 있다. 그럼에도 불구하고, 다양한 변형이 이루어질 수 있는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 다른 실시형태는 하기 청구항의 범위 내에 있다.
서열 번호 1 엔테로박테리아 파지 RB49 UvsX 아미노산 서열
서열 번호 2 His63Ser(H63S) 및 Pro321Lys(P321K) 돌연변이를 포함하는 아미노산 서열 엔테로박테리아 파지 RB49 UvsX 돌연변이체
서열 번호 3 엔테로박테리아 파지 T4 UvsX의 319번 내지 323번 아미노산 잔기에 상응하는 반보존된 도메인
서열 번호 4 엔테로박테리아 파지 T4 UvsX의 반보존된 도메인 319 내지 323의 변이체
서열 번호 5 엔테로박테리아 파지 T4 UvsX의 332번 내지 337번 아미노산 잔기에 상응하는 반보존된 도메인
서열 번호 6 엔테로박테리아 파지 T4 UvsX의 반보존된 도메인 319 내지 323의 변이체
서열 번호 7 엔테로박테리아 파지 T4 UvsX의 반보존된 도메인 329 내지 337의 변이체
서열 번호 8 엔테로박테리아 파지 T4 UvsX 아미노산 서열
서열 번호 9 엔테로박테리아 파지 T6 UvsX 아미노산 서열
서열 번호 10 아시네토박터 파지 133 UvsX 아미노산 서열
서열 번호 11 엔테로박테리아 파지 RB69 UvsX 아미노산 서열
서열 번호 12 아에로모나스 파지 Aeh1 UvsX 아미노산 서열
서열 번호 13 아에로모나스 파지 65 UvsX 아미노산 서열
서열 번호 14 비브리오 파지 KVP40 UvsX 아미노산 서열
서열 번호 15 엔테로박테리아 파지 RB43 UvsX 아미노산 서열
서열 번호 16 프로클로로코커스 파지 P-SSM2 UvsX 아미노산 서열
서열 번호 17 프로클로로코커스 파지 P-SSM4 UvsX 아미노산 서열
서열 번호 18 시네쵸코커스 파지 S-PM2 UvsX 아미노산 서열
서열 번호 19 엔테로박테리아 파지 RB32 UvsX 아미노산 서열
서열 번호 20 비브리오 파지 nt-1 UvsX 아미노산 서열
서열 번호 21 엔테로박테리아 파지 RB16 UvsX 아미노산 서열
서열 번호 22 Phe257Lys(F257K) 돌연변이를 갖는 아미노산 서열 엔테로박테리아 파지 T4 UvsX 돌연변이체
서열 번호 23 Phe259Lys(F259K) 돌연변이를 갖는 아미노산 서열 엔테로박테리아 파지 T6 UvsX 돌연변이체
서열 번호 24 Pro257Lys(P257K) 돌연변이를 갖는 아미노산 서열 아시네토박터 파지 133 UvsX 돌연변이체
서열 번호 25 Pro258Lys(P258K) 돌연변이를 갖는 아미노산 서열 엔테로박테리아 파지 RB69 UvsX 돌연변이체
서열 번호 26 Pro269Lys(P269K) 돌연변이를 갖는 아미노산 서열 아에로모나스 파지 Aeh1 UvsX 돌연변이체
서열 번호 27 Asp266Lys(D266K) 돌연변이를 갖는 아미노산 서열 아에로모나스 파지 65 UvsX 돌연변이체
서열 번호 28 Pro267Lys(P266K) 돌연변이를 갖는 아미노산 서열 비브리오 파지 KVP40UvsX 돌연변이체
서열 번호 29 Pro259Lys(P259K) 돌연변이를 갖는 아미노산 서열 엔테로박테리아 파지 RB43 UvsX 돌연변이체
서열 번호 30 Gln261Lys(Q261K) 돌연변이를 갖는 아미노산 서열 프로클로로코커스 파지 P-SSM2 UvsX 돌연변이체
서열 번호 31 Glu264Lys(E264K) 돌연변이를 갖는 아미노산 서열 프로클로로코커스 파지 P-SSM4 UvsX 돌연변이체
서열 번호 32 Glu264Lys(E264K) 돌연변이를 갖는 아미노산 서열 시네쵸코커스 파지 S-PM2 UvsX 돌연변이체
서열 번호 33 Phe259Lys(F259K) 돌연변이를 갖는 아미노산 서열 엔테로박테리아 파지 RB32 UvsX 돌연변이체
서열 번호 34 Pro267Lys(P267K) 돌연변이를 갖는 아미노산 서열 비브리오 파지 nt-1 UvsX 돌연변이체
서열 번호 35 Pro259Lys(P259K) 돌연변이를 갖는 아미노산 서열 엔테로박테리아 파지 RB16 UvsX 돌연변이체
서열 번호 36 엔테로박테리아 파지 T4 UvsX의 329번 내지 337번 아미노산 잔기에 상응하는 반보존된 도메인
SEQUENCE LISTING <110> ILLUMINA, INC. <120> RECOMBINASE MUTANTS <130> WO2017/172699 <140> PCT/US2017/024451 <141> 2017-03-28 <150> US 62/314,273 <151> 2016-03-28 <160> 36 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 356 <212> PRT <213> Enterobacteria phage RB49 <400> 1 Met Ser Val Leu Glu Lys Leu Lys Lys Asn Ser Thr Leu Lys Thr Thr 1 5 10 15 Ala Val Leu Ser Lys Ser Ser Phe Phe Asn Glu Lys Thr Asn Thr Arg 20 25 30 Thr Lys Ile Pro Met Leu Asn Ile Ala Phe Ser Gly Asp Leu Lys Lys 35 40 45 Gly Phe Gln Ser Gly Leu Ile Phe Phe Ala Gly Pro Ser Lys His Phe 50 55 60 Lys Ser Asn Met Gly Leu Thr Cys Val Ser Ala Tyr Met Lys Gln Asn 65 70 75 80 Pro Asp Ala Ala Cys Leu Phe Phe Asp Ser Glu Phe Gly Ile Thr Ser 85 90 95 Ala Tyr Leu Glu Ser Met Gly Val Asp Pro Asp Arg Val Val His Val 100 105 110 Pro Ile Lys Asn Ile Glu Glu Leu Lys Phe Glu Ile Met Asn Gln Leu 115 120 125 Glu Gln Ile Thr Arg Glu Asp Lys Val Ile Ile Phe Ile Asp Ser Ile 130 135 140 Gly Asn Leu Ala Ser Lys Lys Glu Val Glu Asp Ala Ile Asn Glu Lys 145 150 155 160 Ser Ala Gln Asp Met Thr Arg Ala Lys Ala Leu Lys Gly Leu Phe Arg 165 170 175 Met Val Thr Pro Tyr Leu Thr Met Asn Asp Ile Pro Cys Ile Ala Ile 180 185 190 Asn His Thr Tyr Glu Thr Gln Glu Met Phe Ser Lys Thr Val Met Ser 195 200 205 Gly Gly Thr Gly Ala Met Tyr Ser Ala Asn Glu Val Phe Ile Ile Gly 210 215 220 Arg Arg Gln Gln Lys Glu Gly Thr Glu Ile Thr Gly Tyr Asp Phe Ile 225 230 235 240 Leu Asn Ala Glu Lys Ser Arg Thr Val Lys Glu Lys Ser Lys Phe Pro 245 250 255 Ile Ser Val Thr Phe Ser Gly Gly Ile Asp Pro Tyr Ser Gly Leu Leu 260 265 270 Glu Leu Ala Val Glu Leu Gly Trp Val Val Lys Pro Ser Asn Gly Trp 275 280 285 Tyr Ser Arg Ser Ile Leu Asn Thr Glu Thr Gly Glu Met Glu Thr Glu 290 295 300 Glu Arg Lys Phe Arg Ala Lys Glu Thr Asn Ser Ile Glu Phe Trp Lys 305 310 315 320 Pro Leu Leu Thr Asn Asp Lys Phe Asn Glu Ala Ile Asn Asp His Tyr 325 330 335 Lys Leu Gly Gln Val Ile Ser Asp Glu Ala Val Asp Lys Glu Ile Glu 340 345 350 Asp Met Leu Ala 355 <210> 2 <211> 356 <212> PRT <213> Enterobacteria phage RB49 <400> 2 Met Ser Val Leu Glu Lys Leu Lys Lys Asn Ser Thr Leu Lys Thr Thr 1 5 10 15 Ala Val Leu Ser Lys Ser Ser Phe Phe Asn Glu Lys Thr Asn Thr Arg 20 25 30 Thr Lys Ile Pro Met Leu Asn Ile Ala Phe Ser Gly Asp Leu Lys Lys 35 40 45 Gly Phe Gln Ser Gly Leu Ile Phe Phe Ala Gly Pro Ser Lys Ser Phe 50 55 60 Lys Ser Asn Met Gly Leu Thr Cys Val Ser Ala Tyr Met Lys Gln Asn 65 70 75 80 Pro Asp Ala Ala Cys Leu Phe Phe Asp Ser Glu Phe Gly Ile Thr Ser 85 90 95 Ala Tyr Leu Glu Ser Met Gly Val Asp Pro Asp Arg Val Val His Val 100 105 110 Pro Ile Lys Asn Ile Glu Glu Leu Lys Phe Glu Ile Met Asn Gln Leu 115 120 125 Glu Gln Ile Thr Arg Glu Asp Lys Val Ile Ile Phe Ile Asp Ser Ile 130 135 140 Gly Asn Leu Ala Ser Lys Lys Glu Val Glu Asp Ala Ile Asn Glu Lys 145 150 155 160 Ser Ala Gln Asp Met Thr Arg Ala Lys Ala Leu Lys Gly Leu Phe Arg 165 170 175 Met Val Thr Pro Tyr Leu Thr Met Asn Asp Ile Pro Cys Ile Ala Ile 180 185 190 Asn His Thr Tyr Glu Thr Gln Glu Met Phe Ser Lys Thr Val Met Ser 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Acinetobacter phage 133 <400> 24 Met Ser Ser Leu Lys Glu Arg Leu Ile Lys Ala Ser Thr Ser Lys Met 1 5 10 15 Thr Ala Glu Leu Thr Lys Ser Lys Phe Phe Asn Asp Lys Thr Val Val 20 25 30 Arg Thr Arg Ile Pro Met Leu Asn Ile Ala Ile Ser Gly Ala Leu Asn 35 40 45 Gly Gly Met Gln Ser Gly Leu Thr Ile Phe Ala Gly Pro Ser Lys His 50 55 60 Phe Lys Ser Asn Met Gly Leu Thr Met Val Ala Ala Tyr Met Lys Ala 65 70 75 80 Phe Pro Asp Ala Val Cys Met Phe Tyr Asp Ser Glu Phe Gly Ile Thr 85 90 95 Pro Ala Tyr Leu Lys Ala Met Gly Val Asp Pro Asp Arg Val Ile His 100 105 110 Thr Pro Val Gln Ser Val Glu Gln Leu Lys Ile Asp Met Thr Asn Gln 115 120 125 Leu Glu Glu Val Lys Arg Gly Glu Lys Val Ile Val Phe Ile Asp Ser 130 135 140 Ile Gly Asn Leu Ala Ser Lys Lys Glu Thr Glu Asp Ala Leu Asn Glu 145 150 155 160 Lys Thr Thr Ala Asp Met Thr Arg Ala Lys Ala Leu Lys Ser Leu Phe 165 170 175 Arg Ile Val Thr Pro Tyr Phe Ser Ile Lys Asp Ile Pro Cys Val Ala 180 185 190 Val Asn His Thr Leu Gln Thr Leu Glu Met Phe Ser Lys Glu Val Met 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Leu 20 25 30 Ala Asp Ser Lys Phe Phe Asn Asp Lys Asp Cys Val Arg Thr Arg Val 35 40 45 Pro Leu Leu Asn Leu Ala Met Ser Gly Glu Leu Asp Gly Gly Leu Thr 50 55 60 Pro Gly Leu Thr Val Leu Ala Gly Pro Ser Lys His Phe Lys Ser Asn 65 70 75 80 Leu Ser Leu Val Phe Val Ala Ala Tyr Leu Arg Lys Tyr Pro Asp Ala 85 90 95 Val Cys Ile Phe Phe Asp Asn Glu Phe Gly Ser Thr Pro Gly Tyr Phe 100 105 110 Glu Ser Gln Gly Val Asp Ile Ser Arg Val Ile His Cys Pro Phe Lys 115 120 125 Asn Ile Glu Glu Leu Lys Phe Asp Ile Val Lys Lys Leu Glu Ala Ile 130 135 140 Glu Arg Gly Asp Arg Val Ile Val Phe Val Asp Ser Ile Gly Asn Ala 145 150 155 160 Ala Ser Lys Lys Glu Ile Asp Asp Ala Ile Asp Glu Lys Ser Val Ser 165 170 175 Asp Met Thr Arg Ala Lys Gln Ile Lys Ser Leu Thr Arg Met Met Thr 180 185 190 Pro Tyr Leu Thr Val Asn Asp Ile Pro Ala Ile Met Val Ala His Thr 195 200 205 Tyr Asp Thr Gln Glu Met Tyr Ser Lys Lys Val Val Ser Gly Gly Thr 210 215 220 Gly Ile Thr Tyr Ser Ser Asp Thr Val Ile Ile Ile Gly Arg Gln Gln 225 230 235 240 Glu Lys Asp Gly Lys Glu Leu Leu Gly Tyr Asn Phe Val Leu Asn Met 245 250 255 Glu Lys Ser Arg Phe Val Lys Glu Gln Ser Lys Leu Lys Leu Glu Val 260 265 270 Thr Phe Gln Gly Gly Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Met Leu Asp Ile Ala 275 280 285 Leu Glu Val Gly Phe Val Val Lys Pro Ser Asn Gly Trp Phe Ser Arg 290 295 300 Ala Phe Leu Asp Glu Glu Thr Gly Glu Leu Val Glu Glu Asp Arg Lys 305 310 315 320 Trp Arg Arg Ala Asp Thr Asn Cys Leu Glu Phe Trp Lys Pro Met Phe 325 330 335 Ala His Gln Pro Phe Lys Thr Ala Cys Ser Asp Met Phe Lys Leu Lys 340 345 350 Ser Val Ala Val Lys Asp Glu Val Phe Asp Glu Val Asp Glu Leu Phe 355 360 365 Ser Gly Glu Ala Glu Met Pro Val Asn Met Gly Arg Lys Leu Asp Thr 370 375 380 Ala Asp Gln Glu Glu Ile Asp Gln Leu Glu Glu Val Asp Val Glu Gly 385 390 395 400 Ser Asp Ser Asp Glu Leu Phe Ala Asn Leu Asp 405 410 <210> 27 <211> 368 <212> PRT <213> Aeromonas phage 65 <400> 27 Met Ala Lys Lys Ala Lys Val Val Asn Ser Gly Asp Leu Leu Glu Arg 1 5 10 15 Leu Asn Gly Thr Ser Ser Asn Lys Met Ser Ala 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Leu Gly Leu Val Gly Val Ala Ala Tyr Leu Lys Lys 65 70 75 80 Tyr Pro Asp Ala Val Cys Val Phe Ile Asp Thr Glu Phe Gly Ile Thr 85 90 95 Pro Ser Tyr Leu Arg Ser Gln Gly Val Asp Pro Asp Arg Val Leu His 100 105 110 Ile Gln Cys Glu Ser Val Glu Arg Met Lys Phe Glu Met Ala Asn Gln 115 120 125 Leu Lys Asp Leu Ala Glu Arg Lys Arg Ala Lys Lys Ala Gly Glu Glu 130 135 140 Pro Asp Arg Val Ile Phe Phe Ile Asp Ser Val Gly Asn Val Ala Ser 145 150 155 160 Ala Lys Glu Ile Asp Asp Ala Gln Asn Glu Lys Ser Val Ala Asp Met 165 170 175 Ser Arg Ala Lys Gln Leu Lys Ser Leu Phe Arg Ile Ile Thr Pro Tyr 180 185 190 Phe Thr Met Leu Asp Ile Pro Cys Ile Ala Ile Asn His Thr Tyr Gln 195 200 205 Thr Gln Glu Ile Tyr Ser Lys Thr Val Met Ser Gly Gly Thr Gly Ile 210 215 220 Met Tyr Ser Ala Asp Thr Val Ile Ile Leu Gly Lys Gln Gln Glu Lys 225 230 235 240 Asp Gly Lys Asp Ile Ile Gly Tyr His Phe Ile Met Asn Ile Glu Lys 245 250 255 Ser Arg Phe Val Lys Glu Lys Met Lys Val Lys Leu Thr Val Thr Tyr 260 265 270 Glu Asn Gly Ile Asp Pro Phe Ser Gly Leu Leu Asp Ile Ala Leu Gln 275 280 285 Thr Gly His Val Val Lys Pro Ser Asn Gly Trp Tyr Gln Arg Ala Thr 290 295 300 Val Asp Glu Glu Thr Gly Glu Met Ile Val Glu Glu Lys Lys Tyr Arg 305 310 315 320 Ala Lys Glu Thr Gln Thr Ile Ser Phe Trp Lys Asp Ile Ile Asn Ser 325 330 335 Pro Thr Phe Lys Glu Gly Val Lys Arg Ile Tyr Cys Leu Gly Gln Leu 340 345 350 Asp Glu Ser Glu Leu Phe Gly Glu Val Asp Ser Leu Phe Asp 355 360 365 <210> 29 <211> 386 <212> PRT <213> Enterobacteria phage RB43 <400> 29 Met Ser Asn Lys Ala Leu Leu Lys Lys Leu Ile Lys Asn Ser Asn Ser 1 5 10 15 Gln Ser Ala Ala Ile Leu Ser Glu Ser Asp Val Phe Asn Asn Ile Thr 20 25 30 Lys Thr Arg Thr Arg Val Pro Ile Leu Asn Leu Ala Leu Ser Gly Ala 35 40 45 Phe Asp Gly Gly Leu Thr Ser Gly Leu Thr Leu Phe Ala Gly Pro Ser 50 55 60 Lys His Phe Lys Ser Asn Leu Gly Leu Val Thr Val Ser Ala Tyr Leu 65 70 75 80 Lys Ala Asn Glu Asp Ala Val Cys Leu Phe Tyr Asp Ser Glu Lys Gly 85 90 95 Val Thr Lys Ser Tyr Leu Lys Ser Met Gly Val Asp Pro Asp Arg Val 100 105 110 Val Tyr Thr Arg Ile Thr Thr Val Glu Gln Leu Arg Asn Asp Val Val 115 120 125 Ser Gln Leu Asp Ala Leu Glu Arg Gly Asp Lys Val Ile Ile Phe Val 130 135 140 Asp Ser Val Gly Asn Thr Ala Ser Lys Lys Glu Leu Ala Asp Ala Leu 145 150 155 160 Ser Asp Asn Asp Lys Gln Asp Met Thr Arg Ala Lys Ala Leu Lys Gly 165 170 175 Met Phe Arg Met Val Thr Pro Tyr Leu Ala Asp Leu Asp Ile Pro Met 180 185 190 Val Cys Ile Cys His Thr Tyr Asp Thr Gln Glu Met Tyr Ser Lys Lys 195 200 205 Val Ile Ser Gly Gly Thr Gly Leu Met Tyr Ser Ala Asp Thr Ala Ile 210 215 220 Ile Leu Gly Lys Gln Gln Val Lys Glu Gly Thr Glu Val Val Gly Tyr 225 230 235 240 Asp Phe Ile Met Asn Ile Glu Lys Ser Arg Phe Val Lys Glu Lys Ser 245 250 255 Lys Phe Lys Leu His Val Thr Tyr Glu Gly Gly Ile Ser Met Tyr Ser 260 265 270 Gly Leu Leu Asp Leu Ala Met Glu Met Asn Phe Val Gln Thr Pro Thr 275 280 285 Lys Gly Trp Arg Gly Arg Ala Phe Leu Asn Thr Glu Thr Gly Glu Leu 290 295 300 Glu Leu Glu Glu Lys Lys Trp Arg Glu Ser Glu Thr Asn Ser Ile Glu 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Ile Tyr Leu Lys Thr Ser Glu Glu Glu Arg Lys Pro Cys Met Phe Val 130 135 140 Leu Asp Ser Leu Gly Met Leu Ser Thr Glu Lys Glu Ile Arg Asp Ala 145 150 155 160 Leu Asp Asp Lys Gln Val Arg Asp Met Thr Lys Ser Gln Leu Val Lys 165 170 175 Gly Ala Phe Arg Met Leu Thr Leu Lys Leu Gly Gln Ala Asn Ile Pro 180 185 190 Leu Ile Val Thr Asn His Thr Tyr Asp Val Ile Gly Ser Tyr Val Pro 195 200 205 Thr Lys Glu Met Gly Gly Gly Ser Gly Leu Lys Tyr Ala Ala Ser Thr 210 215 220 Ile Ile Tyr Leu Ser Lys Lys Lys Glu Lys Asp Gln Lys Glu Val Ile 225 230 235 240 Gly Asn Leu Ile Lys Ala Lys Thr His Lys Ser Arg Leu Ser Lys Glu 245 250 255 Asn Lys Glu Val Lys Ile Arg Leu Tyr Tyr Asp Glu Arg Gly Leu Asp 260 265 270 Arg Tyr Tyr Gly Leu Leu Glu Leu Gly Glu Ile Gly Gly Met Trp Lys 275 280 285 Asn Val Ala Gly Arg Tyr Glu Met Asn Gly Lys Lys Ile Tyr Ala Lys 290 295 300 Glu Ile Leu Lys Asn Pro Thr Glu Tyr Phe Thr Asp Asp Ile Met Glu 305 310 315 320 Gln Leu Asp Asn Ile Ala Lys Glu His Phe Ser Tyr Gly Thr Asn 325 330 335 <210> 31 <211> 336 <212> PRT <213> Prochlorococcus phage P-SSM4 <400> 31 Met Asn Phe Leu Lys Asp Ile Ala Lys Glu Ile Gly Asn Asp Tyr Ala 1 5 10 15 Ser Leu Val Ser Glu Gly Val Ser Ala Gly Asp Thr Ala Gly Phe Ile 20 25 30 Asp Thr Gly Ser Tyr Ile Phe Asn Ala Leu Leu Ser Gly Ser Ile Tyr 35 40 45 Gly Gly Ile Pro Asn Asn Lys Ile Thr Ala Ile Ala Gly Glu Thr Ser 50 55 60 Thr Gly Lys Thr Phe Phe Cys Leu Gly Met Val Gln His Phe Leu Glu 65 70 75 80 Ser Asn Pro Asp Ala Gly Val Ile Tyr Phe Glu Ser Glu Ser Ala Ile 85 90 95 Ser Lys Gln Met Ile Glu Asp Arg Gly Ile Asp Ser Asn Arg Met Leu 100 105 110 Leu Val Pro Val Thr Thr Val Gln Glu Phe Arg Leu Gln Ala Ile Lys 115 120 125 Ile Leu Asp Lys Tyr Asn Glu Gln Thr Ala Glu Glu Arg Lys Pro Leu 130 135 140 Met Phe Val Leu Asp Ser Leu Gly Met Leu Ser Thr Ser Lys Glu Val 145 150 155 160 Glu Asp Ser Glu Ala Gly Lys Glu Thr Arg Asp Met Thr Arg Ala Gln 165 170 175 Val Val Lys Ser Ile Phe Arg Val Leu Thr Leu Lys Leu Gly Lys Ala 180 185 190 Asn Val Pro Leu Ile Val 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Leu Ala Gly Glu Ser Gly 50 55 60 Thr Gly Lys Thr Phe Phe Cys Leu Ser Val Val Arg Asn Phe Leu Asn 65 70 75 80 Thr Asp Pro Asp Ala Gly Val Ile Tyr Phe Glu Thr Glu Ser Ala Ile 85 90 95 Ser Lys Gln Met Ile Glu Ser Arg Gly Ile Asp Ser Thr Arg Met Ile 100 105 110 Ile Phe Pro Val Asp Thr Ile Glu Asp Phe Arg Thr Gln Ala Val Arg 115 120 125 Ile Ile Asp Lys Tyr Met Glu Gln Asn Lys Ser Glu Arg Lys Pro Leu 130 135 140 Met Phe Val Leu Asp Ser Leu Gly Met Leu Ala Thr Lys Lys Glu Val 145 150 155 160 Glu Asp Ala Ser Asn Asp Lys Gln Val Arg Asp Met Thr Lys Ala Gln 165 170 175 Ile Val Lys Ser Ala Phe Arg Ile Leu Thr Leu Lys Met Gly Lys Ala 180 185 190 Asn Ile Pro Met Leu Val Thr Asn His Thr Tyr Asp Val Val Gly Ser 195 200 205 Tyr Val Pro Thr Lys Glu Met Gly Gly Gly Ser Gly Leu Lys Tyr Ser 210 215 220 Ala Ser Thr Ile Val Tyr Leu Gly Lys Lys Lys Glu Lys Asp Gly Thr 225 230 235 240 Asp Leu Val Gly Asn Ile Ile Lys Cys Glu Ala Lys Lys Ser Arg Leu 245 250 255 Thr Arg Glu Gly Ser Lys Val Lys Thr Arg Leu Phe 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Lys Ile Asp Met Val 115 120 125 Asn Gln Leu Glu Ala Ile Glu Arg Gly Glu Lys Val Ile Val Phe Ile 130 135 140 Asp Ser Ile Gly Asn Met Ala Ser Lys Lys Glu Thr Glu Asp Ala Leu 145 150 155 160 Asn Glu Lys Ser Val Ala Asp Met Thr Arg Ala Lys Ser Leu Lys Ser 165 170 175 Leu Phe Arg Ile Val Thr Pro Tyr Phe Ser Ile Lys Asn Ile Pro Cys 180 185 190 Val Ala Val Asn His Thr Ile Glu Thr Ile Glu Met Phe Ser Lys Thr 195 200 205 Val Met Thr Gly Gly Thr Gly Val Met Tyr Ser Ala Asp Thr Val Phe 210 215 220 Ile Ile Gly Lys Arg Gln Ile Lys Asp Gly Ser Asp Leu Gln Gly Tyr 225 230 235 240 Gln Phe Val Leu Asn Val Glu Lys Ser Arg Thr Val Lys Glu Lys Ser 245 250 255 Lys Phe Lys Ile Asp Val Lys Phe Asp Gly Gly Ile Asp Pro Tyr Ser 260 265 270 Gly Leu Leu Asp Met Ala Leu Glu Leu Gly Phe Val Val Lys Pro Lys 275 280 285 Asn Gly Trp Tyr Ala Arg Glu Phe Leu Asp Glu Glu Thr Gly Glu Met 290 295 300 Ile Arg Glu Glu Lys Ser Trp Arg Ala Lys Asp Thr Asn Cys Thr Thr 305 310 315 320 Phe Trp Gly Pro Leu Phe Lys His Gln Pro Phe 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Lys Lys Ala Gly Glu Glu 130 135 140 Pro Asp Arg Val Val Phe Phe Ile Asp Ser Val Gly Asn Val Ala Ser 145 150 155 160 Ala Lys Glu Ile Asp Asp Ala Gln Asn Glu Lys Ser Val Ala Asp Met 165 170 175 Ser Arg Ala Lys Gln Leu Lys Ser Leu Phe Arg Ile Ile Thr Pro Tyr 180 185 190 Phe Thr Met Leu Asp Ile Pro Cys Ile Ala Ile Asn His Thr Tyr Gln 195 200 205 Thr Gln Glu Met Tyr Ser Lys Thr Val Met Ser Gly Gly Thr Gly Ile 210 215 220 Met Tyr Ser Ala Asp Thr Val Ile Ile Leu Gly Lys Gln Gln Glu Lys 225 230 235 240 Asp Gly Lys Glu Ile Ile Gly Tyr His Phe Ile Met Asn Ile Glu Lys 245 250 255 Ser Arg Phe Val Lys Glu Lys Met Lys Val Lys Leu Thr Val Thr Tyr 260 265 270 Glu His Gly Ile Asp Gln Phe Ser Gly Leu Leu Asp Ile Ala Leu Gln 275 280 285 Thr Gly His Val Val Lys Pro Ser Asn Gly Trp Tyr Gln Arg Ala Phe 290 295 300 Ile Asp Glu Glu Thr Gly Glu Ile Glu Ile Glu Glu Lys Lys Tyr Arg 305 310 315 320 Ala Lys Glu Thr Gln Thr Leu Ser Phe Trp Lys Glu Ile Ile Asn Ser 325 330 335 Pro Thr Phe Lys Thr Gly Val Lys Arg Leu 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<212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Semi Conserved Domain <400> 36 Phe Arg Asp Ala Ile Lys Arg Ala Tyr 1 5

Claims (20)

  1. 서열 번호 1과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 재조합 UvsX 재조합효소로서, 재조합 UvsX는 상기 RB49 UvsX 아미노산 서열에서 Pro321 및 Asp334와 기능적으로 동등한 위치에서 적어도 하나의 아미노산 치환 돌연변이를 포함하는, 재조합 UvsX 재조합효소.
  2. 제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 치환 돌연변이는 하전된 잔기에 대한 돌연변이를 포함하는, 재조합 UvsX 재조합효소.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 적어도 하나의 치환 돌연변이는 염기성 잔기에 대한 돌연변이를 포함하는, 재조합 UvsX 재조합효소.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 치환 돌연변이는 상기 RB49 UvsX 아미노산 서열에서 Pro321Lys에 상동성인 돌연변이를 포함하는, 재조합 UvsX 재조합효소.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 치환 돌연변이는 상기 RB49 UvsX 아미노산 서열에서 Asp334Lys에 상동성인 돌연변이를 포함하는, 재조합 UvsX 재조합효소.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 치환 돌연변이는 상기 RB49 UvsX 아미노산 서열에서 Pro321Lys 및 Asp334Lys에 상동성인 돌연변이를 포함하는, 재조합 UvsX 재조합효소.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RB49 UvsX 아미노산 서열에서 Pro256과 기능적으로 동등한 위치에서 치환 돌연변이를 더 포함하는, 재조합 UvsX 재조합효소.
  8. 제7항에 있어서, 상기 RB49 UvsX 아미노산 서열에서 Pro256Lys에 상동성인 치환 돌연변이를 포함하는, 재조합 UvsX 재조합효소.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RB49 UvsX 아미노산 서열에서 His63과 기능적으로 동등한 위치에서 치환 돌연변이를 더 포함하는, 재조합 UvsX 재조합효소.
  10. 제9항에 있어서, 상기 RB49 UvsX 아미노산 서열에서 His63Ser에 상동성인 치환 돌연변이를 포함하는, 재조합 UvsX 재조합효소.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, C 말단에서의 하나 이상의 글루탐산 잔기의 부가, C 말단에서의 하나 이상의 아스파르트산 잔기의 부가, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 돌연변이를 더 포함하는, 재조합 UvsX 재조합효소.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, T4, T6, Rb69, Aeh1, KVP40, 아시네토박터 파지(Acinetobacter phage) 133, 아에로모나스 파지(Aeromonas phage) 65, 사이아노파지(cyanophage) P-SSM2, 사이아노파지 PSSM4, 사이아노파지 S-PM2, Rb32, 비브리오 파지(Vibrio phage) nt-1, Rb16, Rb43 및 Rb49로 이루어진 군으로부터 선택된 미오비리대(myoviridae) 파지로부터 유래된, 재조합 UvsX 재조합효소.
  13. 서열 번호 3 또는 4 중 임의의 아미노산 서열을 포함하는 반보존된 도메인에 대한 치환 돌연변이(상기 치환 돌연변이는 Phe 또는 Asp 이외의 임의의 잔기에 대한 4번 위치에서의 치환으로부터 선택된 돌연변이를 포함함), 또는 서열 번호 5 또는 6 중 임의의 아미노산 서열을 포함하는 반보존된 도메인에 대한 치환 돌연변이(상기 치환 돌연변이는 Arg 또는 Asp 이외의 임의의 잔기에 대한 4번 위치에서의 치환으로부터 선택된 돌연변이를 포함함)를 포함하는, 재조합 UvsX 재조합효소.
  14. 제13항에 있어서, 상기 돌연변이는 하전된 잔기에 대한 돌연변이를 포함하는, 재조합 UvsX 재조합효소.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 돌연변이는 Lys에 대한 4번 위치에서의 치환을 포함하는, 재조합 UvsX 재조합효소.
  16. 서열 번호 2 및 22 내지 35 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 UvsX 재조합효소.
  17. 제16항에 있어서, 상기 RB49 UvsX 아미노산 서열에서 Pro256과 기능적으로 동등한 위치에서 치환 돌연변이를 더 포함하는, 재조합 UvsX 재조합효소.
  18. 제17항에 있어서, 상기 RB49 UvsX 아미노산 서열에서 Pro256Lys에 상동성인 치환 돌연변이를 포함하는, 재조합 UvsX 재조합효소.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RB49 UvsX 아미노산 서열에서 His63과 기능적으로 동등한 위치에서 치환 돌연변이를 더 포함하는, 재조합 UvsX 재조합효소.
  20. 제19항에 있어서, 상기 RB49 UvsX 아미노산 서열에서 His63Ser에 상동성인 치환 돌연변이를 포함하는, 재조합 UvsX 재조합효소.
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