KR20180112180A

KR20180112180A - miRNA의 표적 유전자 검증용 DNA 구조체

Info

Publication number: KR20180112180A
Application number: KR1020170041544A
Authority: KR
Inventors: 류성호; 최철원
Original assignee: 순천향대학교 산학협력단
Priority date: 2017-03-31
Filing date: 2017-03-31
Publication date: 2018-10-12
Also published as: KR101921522B1

Abstract

본 발명은 miRNA 조절 요소(miRNA regulatory element, MRE) 및 링커가 결합된 MRE-링커 결합체를 포함하는, miRNA의 표적 유전자 검증용 DNA 구조체에 관한 것으로, 알고리즘에 의해 예측되는 표적 유전자의 3'-UTR에 포함되는 20-25 bp의 miRNA 조절 인자(miRNA regulatory element, MRE)와 링커가 결합된 MRE-링커 결합체를 이용하여 진정한 표적 유전자를 정확하게 검증할 수 있어, 종래의 표적 유전자를 검증하기 위하여 전체 3'-UTR 전체를 이용한 방법에 비해 합성에 시간을 절약할 수 있고 클로닝 효율을 높일 수 있어 시간과 노력을 단축할 수 있다.

Description

miRNA의 표적 유전자 검증용 DNA 구조체{DNA structure for validation of miRNA target}

본 발명은 miRNA의 표적 유전자 검증용 DNA 구조체에 관한 것이다.

miRNA는 단일 가닥, 작고 비-코딩(non-coding) RNA로, 약 18-25 뉴클레오타이드로 구성된다(Zhong et al., 2012). miRNA는 성숙한 miRNA를 얻기 위하여 Drosha와 Dicer에 의해 후속 절단과정(subsequent cleaving processes)을 격고, 헤어핀(hairpin)-유사 구조를 지니는 pri-miRNA로부터 유래된다(Lee et al., 2006). miRNA는 표적 mRNA의 3'-비번역 영역(UTR)에 부분적 또는 완전히 결합하여 유전자 발현의 포스트-전사 조절(post-transcriptional regulation)을 조절하는 억제 기능이 있으며, 이에 의해 mRNA의 번역 억제 또는 분해를 매개한다(Ha & Kim, 2014). 바이오인포마틱스 분석에 근거하면, 개개의 miRNA는 수백 개의 유전자에 결합할 수 있으며, 인간 miRNA의 1/3을 잠재적으로 조절하는데(John et al., 2004; Lewis et al., 2005), 이는 miRNA가 세포 생물학의 모든 측면에 영향을 미칠 수 있음을 암시한다. 실제로, miRNA는 다양한 생물학적 과정, 예컨대 발달, 증식, 분화, 세포 운명 결정, 세포 사멸, 신호 전달, 숙주-바이러스 상호 작용 및 종양 형성에 중요한 역할을 한다(Stern-Ginossar et al., 2007; Welch et al., 2007; Choy et al., 2008; Ivey & Srivastava, 2010, Baumjohann & Ansel, 2013). miRNA-표적 유전자 상호작용의 조절 장애(dysregulation)는 암 발달 및 전이와 같은 질병을 초래할 수 있다(Tavazoie et al., 2008; Hayes et al., 2014).

최근 들어 miRNA를 이용한 질병의 진단이나 치료에 많은 연구가 되고 있으나 miRNA의 고유한 기능을 연구하기 위해서는 각 miRNA들의 표적 유전자를 찾는 것이 중요하며 이 과정은 많은 시간과 비용이 발생하는 것이 현실이다. miRNA 표적 유전자를 예측하는데 유용한 여러 연산 도구(computational tools)에도 불구하고, 후보 유전자는 완전한 합법성(legitimacy)을 얻을 수 있도록 실험적으로 검증되어야 한다. 노던 블랏(northern blot), 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription polymerase chain reaction), 마이크로 어레이, RNA 시퀀싱, 웨스턴 블랏과 효소 결합 면역 흡착제 분석(enzyme-linked immunosorbent assay) 같은 기존의 분자 테크닉은 표적 유전자를 검증하는데 사용되어 왔다. 그렇지만, 이들 방법은 miRNA와 후보 유전자 사이에 직접적인 상관관계를 드러내는 면에서, 이러한 테크닉의 한계로 인해 연산(computational) 알고리즘으로부터 예측된 후보 유전자의 전체 리스트를 검증하는데 적합하지 않았다.

3'-UTR 리포터 분석은 직접적인 miRNA 표적을 실험적으로 검증하는데 일반적으로 사용되어 왔다(Aldred et al., 2011). 이 방법은 miRNA가 이의 표적 mRNA의 번역을 억제하여 기능한다는 아이디어에 근거한 것이다. 특정 miRNAs의 표적 유전자를 검증하기 위해서 시험관내 3'-UTR 리포터 분석법을 사용한 여러 연구가 수행되었다(Kuhn et al., 2008; Thomson et al., 2011). 또한, 루시퍼라제 리포터 시스템은 최근에 miRNA가 표적 유전자의 3'-UTR 영역에 결합하는 지를 연구하기 위하여 이용되었다(Oh & Do Won Hwang, 2013).

루시퍼라제 리포터 시스템을 적용하기 위하여, 잠재적인 miRNA 표적 유전자의 전체 3'-UTR 영역을 리포터 벡터에 클로닝하였다. 종래 표적 유전자의 전체 3'-UTR 영역을 루시퍼라제 리포터 시스템에 클로닝하였다(도 1 왼쪽). 전체 3'-UTR 서열이 miRNA와 이의 표적을 연구하는 데 이상적임에도 불구하고, 전체 3'-UTR 영역을 합성하는데에 상당한 시간이 소요되고, 클로닝 효율이 낮아서, 전체 3'-UTR 영역을 이용한 표적 유전자 검증방법은 시간과 노력이 많이 필요하다는 단점이 있었다.

본 발명의 목적은 miRNA 조절 요소(miRNA regulatory element, MRE) 및 링커가 결합된 MRE-링커 결합체를 포함하는, miRNA의 표적 유전자 검증용 DNA 구조체를 제공하는 것이다.

종래 miRNA 표적 유전자를 검증하기 위하여, 표적 유전자의 전체 3'-UTR 영역을 증폭하고 이를 리포터 벡터에 삽입하여 검증하는 방법을 사용하였는데, 이러한 종래의 방법은 전체 3'-UTR 영역을 합성하는데에 상당한 시간이 소요되고, 클로닝 효율이 낮은 단점이 있었다. 이에 본 발명자는 표적 예측 알고리즘에 의해 예측된 유전자들이 진정한 miRNA의 표적 유전자에 해당하는 지를 검증하기 위하여, 표적 유전자의 전체 3'-UTR에 포함되는 20-25 bp의 miRNA 조절 인자(miRNA regulatory element, MRE)와 링커가 결합된 MRE-링커 결합체를 리포턱 벡터에 삽입하여 전체 3'-UTR과 마찬가지로 동일한 강도로 동일한 표적 유전자를 검증할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다. 즉, 본 발명에서는 짧은 miRNA 조절 인자(miRNA regulatory element, MRE) 서열이 표적 유전자를 검증하는 간단한 플랫폼임을 증명하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서, miRNA 조절 요소(miRNA regulatory element, MRE) 및 링커가 결합된 MRE-링커 결합체를 포함하는, miRNA의 표적 유전자 검증용 DNA 구조체를 제공한다.

본 발명에서, "DNA 구조체"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA를 발현할 수 있는 구조체로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 상기 DNA 구조체는 바람직하게는 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 벡터일 수 있다.

상기 "벡터"는 핵산 분자로서 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터는 비제한적으로, 단일-가닥, 이중-가닥 또는 부분적 이중-가닥인 핵산 분자; 하나 이상의 자유 말단, 비 자유 말단(예를 들어, 환형)을 포함하는 핵산 분자; DNA, RNA 또는 이 둘 모두를 포함하는 핵산 분자; 및 당업계에 공지된 다른 다양한 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 한 유형의 벡터는 "플라스미드"이며, 이는 환형의 이중 가닥 DNA 루프를 지칭하는 것으로서, 여기에 예컨대, 표준 분자 클로닝 기법에 의해 추가적인 DNA 세그먼트가 삽입될 수 있다.

본 발명에서 상기 구조체는 유전자 삽입물의 발현을 위한 프로모터를 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 "프로모터"는 적당한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 다른 핵산 서열의 발현을 조절하는 핵산 서열을 의미하며, 본 발명에서 "작동가능하게 연결(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어, 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. DNA 구조체내에서 프로모터의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

또한, "프로모터"는 전사 조절 인자들이 결합하는 모든 DNA 염기서열 부위를 지칭하는 것으로, 일반적으로 전사를 조절할 대상이 되는 유전자의 유전정보를 지니고 있는 DNA 염기서열 앞부분에 위치한다. 진핵생물에서는 전사조절인자라고 하는 단백질들이 프로모터 부분에 결합함으로써 RNA 중합효소를 이끌고 오는 일에 관여한다. 프로모터는 이러한 전사 조절 인자들이 결합하는 모든 DNA 염기서열 부위를 지칭한다고 할 수 있다. 그에 비해 원핵생물에서의 프로모터는 대개 RNA 중합효소가 결합하는 전사시작지점 바로 근처의 결합부위로 정의된다. 전사를 조절하는 DNA 염기서열은 프로모터 외에도 인핸서가 존재하나 프로모터가 전사시작 지점 바로 근처의 결합부위로 정의된다. 전사를 조절하는 DNA 염기서열은 프로모터외에도 인핸서가 존재하나 프로모터가 전사시작지점으로부터 바로 앞쪽으로 수백 염기쌍 이내에 위치하는데 비해 인핸서는 프로모터로 부터 수천 염기쌍 이상 떨어져 있다는 점에서 구분할 수 있다.

본 발명에서 상기 프로모터는 CMV(사이토메갈로바이러스), RSV(로우스 사르코마 바이러스), 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, SV40 프로모터, 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제(PGK) 프로모터 및 EF1α 프로모터로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함한다.

본 발명에서, 상기 구조체는 하나 이상의 리포터 유전자를 포함하는데, 상기 리포터 유전자는 LacZ, 클로람페니콜 아세틸 전이효소(CAT: chloramphenicol acetyl transferase), 레닐라 루시퍼라제(Renila luciferase), 반딧불이(firefly) 루시퍼라제, 적색형광단백질(RFP), 녹색형광단백질(GFP), 분비성 태반 알칼라인 포스파타아제(secreted placental alkaline phosphatase, SEAP) 및 HSV-tk(Herpes simplex virus-thymidine kinase)를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.

이러한 리포터 단백질들의 활성은, 반딧불이 루시페라제(de Wet J. et al., Mol. Cell Biol., 7, 725-737, 1987 참조), 레닐라 루시페라제([Lorenz W.W. et al., PNAS 88, 4438-42, 1991) 참조), 클로람페니콜 아세틸 전이효소(Gorman C. et al.,Mol. Cell Biol., 2, 1044-1051, 1982 참조), LacZ(Hall C.V. et al., J. Mol. Appl. Genet., 2,101-109, 1983 참조), 인간 성장 호르몬(Selden R. et al.., Mol. Cell Biol., 6, 3173-3179, 1986 참조), 녹색 형광 단백질(Chalfie M. et al., Science, 263, 802-805, 1994 참조) 및 분비성 태반 알칼린 포스파타아제(Berger, J. et al., Gene, 66, 1-10, 1988 참조)에 대하여 당업자에게 공지되어 있는 방법을 사용하여 측정할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 상기 구조체가 포스포글리세롤 키나제(PGK) 프로모터와 SV40 프로모터를 포함하며, 상기 포스포글리세롤 키나제(PGK) 프로모터는 반딧불이(firefly) 루시퍼라제를 암호화하는 유전자의 전사를 위해, 상기 SV40 프로모터는 레닐라 루시퍼라제(Renila luciferase)를 암호화하는 유전자의 전사를 위해 이들 유전자 서열의 앞부분에 위치하게 하였다.

본 발명에서 용어, "miRNA"는 19-25 nt 길이의 단일 가닥 RNA 분자로서 내재적(endogenous) 헤어핀-구조 전사체 (hairpin-shaped transcript) (Bartel, D.P., Cell 116:281-297, 2004; Kim, V.N., Mol. Cells. 19:1-15, 2005)에 의해 생성되고, 타겟 서열을 포함하는 mRNA의 3' 비번역 영역(UTR)에 상보적으로 결합하여 전사 후 유전자 억제자(post-transcriptional gene suppressor)로서 작용하며, 번역 억제와 mRNA 불안정화를 유도함으로써 표적 유전자를 억제한다. miRNA는 발달, 분화, 증식, 세포사멸 및 물질대사와 같은 다양한 과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 miRNA 조절 요소(miRNA regulatory element, MRE) 및 링커가 결합된 MRE-링커 결합체를 포함하는 miRNA의 표적 유전자 검증용 DNA 구조체는, 예측되는 표적 유전자가 진정한 miRNA의 표적에 해당하는 지를 리포터 유전자의 발현 정도를 측정하여 miRNA의 진정한 표적 유전자를 검정할 수 있다. 리포터 유전자의 발현이 억제되는 경우 miRNA의 표적 유전자로 검증할 수 있으며, 리포터 유전자의 발현이 억제되지 않는 경우, miRNA의 표적 유전자가 아닌 것으로 간단히 검증할 수 있다.

본 발명에서 용어 "miRNA 조절 인자(miRNA regulatory element, MRE)"는 3’-UTR에서 miRNA가 결합하는 부위를 MRE (miRNA regulatory element)라고 칭한다. 상기 MRE는 3'-비번역 영역(UTR)에 포함되며, 3'-비번역 영역(UTR)의 일부분에 해당한다. 구체적으로, 상기 3'-비번역 영역(UTR)은 검증 대상이 되는 표적 유전자의 mRNA의 3'-비번역 영역(UTR)으로, 상기 miRNA 조절 인자(miRNA regulatory element, MRE) 역시 검증 대상이 되는 표적 유전자의 mRNA의 3'-비번역 영역(UTR)에 포함되게 된다. 상기 "miRNA 조절 인자"는 20~25bp의 염기서열을 가질 수 있다.

본 발명에서 용어, "링커(linker)"란 miRNA 조절 인자(miRNA regulatory element, MRE)의 양말단에 연결된 추가의 염기서열로, 제한 효소 사이트(restriction enzyme sites)를 포함할 수 있다. 상기 MRE와 링커의 결합체가 이중 가닥을 형성할 때, 양 말단이 점착성 말단(sticky end)을 형성하도록 제한 효소 사이트를 포함할 수 있다. 상기 제한 효소로는 이에 제한되지 않지만, NheI, XbaI, EcoRI, BamHI, BglII, HindIII, HinfI, sam3A, AluI, HaeIII, TaqI, NotI, HpaII, PstI, SmaI, 및 XmaI로 이루어진 군에서 선택되는 서로 다른 두 가지 제한효소의 조합일 수 있다.

본 발명에서 용어 "표적 유전자"는 miRNA가 mRNA의 3'-비번역 영역(UTR)에 부분적 또는 완전히 결합하여 상기 mRNA의 번역이 억제되거나 분해가 되는 유전자를 의미한다. 본 발명에서 상기 표적 유전자는 mRNA 일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 TargetScan, miRanda 및 PicTar를 포함하는 표적 예측 알고리즘에 따라 예측된 miR-708 결합 서열을 분석하여 miR-708에 결합하는 것으로 추정되는 표적 유전자의 3'-UTR 서열과 3'-UTR 서열로부터 miRNA regulatory element(MRE)를 얻었다. 잠재적인 표적 mRNA의 전체 3'-UTR 중의 일부에 해당하는 20-25 bp의 miRNA 조절 인자(miRNA regulatory element, MRE)와 링커가 결합된 MRE-링커 결합체를 리포턱 벡터에 삽입한 경우, 잠재적인 표적 mRNA의 전체 3'-UTR 영역을 이용한 경우와 동일하게 MRE-링커 결합체를 이용하여 동일한 표적 유전자를 동일한 효율로 검증할 수 있음을 확인하였다(도 3 참조).

이에 따라, 본 발명은 전체 표적 mRNA의 전체 3'-UTR 영역을 합성하는데에 상당한 시간이 소요되고, 클로닝 효율이 낮은 종래의 방법에 비해, 표적 mRNA의 전체 3'-UTR에 포함되는 20-25 bp의 miRNA 조절 인자(miRNA regulatory element, MRE)와 링커가 결합된 MRE-링커 결합체를 리포터 벡터에 삽입함으로써, MRE 서열 합성에 시간을 단축할 수 있고 클로닝 효율이 좋은 리포터 분석 시스템을 제공할 수 있으며, 동일한 표적 유전자를 동일한 강도로 검증할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 상기 miRNA는 miR-708 일 수 있으며, 상기 miR-708의 표적 유전자는 NNAT(Neuronatin), CD44, TLK1(Serine/threonine-protein kinase tousled-like 1), EFNA5(Ephrin A5), 및 SSH-2(Slingshot Protein Phosphatase 2)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 TargetScan, miRanda 및 PicTar를 포함하는 표적 예측 알고리즘에 따라, 예측된 잠재적인 miR-708의 표적 유전자를 추정하고, 실제로 예측된 유전자가 miR-708의 표적 유전자인지를 확인하기 위하여, 해당 표적 유전자의 3'-UTR에 포함되는 20-25 bp의 miRNA 조절 인자(miRNA regulatory element, MRE)와 링커가 MRE-링커 결합체를 리포터 유전자를 포함하는 벡터에 삽입하여 루시퍼라제 유전자의 활성을 측정하여, 표적 예측 알고리즘에 의해 추정된 다수의 유전자 중에서, NNAT(Neuronatin), CD44, TLK1(Serine/threonine-protein kinase tousled-like 1), EFNA/5(Ephrin A5), 및 SSH-2(Slingshot Protein Phosphatase 2) 유전자가 miR-708의 표적 유전자임을 검증하였다.

상기 NNAT(Neuronatin), CD44, TLK1(Serine/threonine-protein kinase tousled-like 1), EFNA5(Ephrin A5), 및 SSH-2(Slingshot Protein Phosphatase 2)의 MRE-링커 결합체를 형성하는 단일 가닥의 서열 정보는 다음과 같다

1. CD44

서열번호 1(forward): 5′-TCGAGAGAAAGAAGAAGAAAAGCTCCTGT-3′

서열번호 2(reverse): 5′-CTAGACAGGAGCTTTTCTTCTTCTTTCTC-3′

2. EFNA5(Ephrin A5)

서열번호 3(forward): 5′-TCGAGCACCAGTGGTTCGTCAGCTCCTGT-3′

서열번호 4(reverse): 5′-CTAGACAGGAGCTGACGAACCACTGGTGC-3′

3. NNAT(Neuronatin)

서열번호 5(forward): 5′-TCGAGCCCAGCTAGATTGTAAGCTCCTTT-3′

서열번호 6(reverse): 5′-CTAGAAAGGAGCTTACAATCTAGCTGGGC-3′

4. TLK1(Serine/threonine-protein kinase tousled-like 1)

서열번호 7(forward): 5′-TCGAGGATATTGACTAACTGAGCTCCTTT-3′

서열번호 8(reverse): 5′-CTAGAAAGGAGCTCAGTTAGTCAATATCC-3′

5. SSH-2(Slingshot Protein Phosphatase 2)

서열번호 9(forward): 5′-TCGAGGTTGCCCAGAGTGGAAGCTCCTAT-3′

서열번호 10(reverse): 5′-CTAGATAGGAGCTTCCACTCTGGGCAACC-3′

도 1은 변형된 링커 리포터 분석 도식을 나타낸 것이다. TargetScan, miRanda 및 PicTar를 포함하는 표적 예측 알고리즘에 따라 miR-708에 결합하는 것으로 추정되는 miRNA regulatory element(MRE)를 발견하기 위하여, 3'-비번역 영역(UTR)의 전체 서열을 분석하였다. 실험적 검증을 위해서 전체 3'-UTR(왼쪽), 3'-UTR의 부분 서열을 갖는 MRE(중간) 또는 MRE 서열만(오른쪽)을 리포터 벡터에 삽입하였다. 본 발명에서 전체 3'-UTR(왼쪽)과 MRE 서열만(오른쪽)인 두 가지 경우를 테스트했다.
도 2는 링커 설계에 관한 것이다. (a) miR-708에 의해 조절되는 miRNA regulatory element 링커 또는 표적 유전자의 전체 3'-비번역 영역을 pmirGLO 듀얼 루시퍼라제 벡터에 삽입하였다. 두 가지 효소 -NheI와 XbaI은 클로닝에 사용되었다. (b) 상기 '링커'는 두 개의 설계된 단일-가닥 프라이머의 셀프-라이게이션에 의해 제조되었다. 2 개의 프라이머가 이중 가닥을 형성할 때, 양 말단은 자동적으로 점착성(sticky) 말단 (5′-NheI 및 3′-XbaI) 이 되고, 추가 효소 절단 없이 절단된 벡터에 직접 연결된다.
도 3은 전체 3'- 비번역 영역(UTR) 리포터 분석에 필적하는 변형된 링커 리포터 분석에 관한 것이다. NNAT와 CD44를 포함한 여러 후보 유전자는 여러 표적 예측 알고리즘에 의해 예측되었으며, 3'-UTR 클로닝을 위해 선택되었다. (a) 빈 벡터 또는 miR-708 베어링(bearing) 벡터를 293 T 세포에 리포터 벡터와 함께 형질감염하였다(co-transfected). 배양 24 시간 후, 루시퍼라제의 활성을 측정하였다. 전체 3'-UTR로부터의 루시퍼라제 신호를 miRNA regulatory element(MRE) 링커로부터의 신호와 비교하였다. (b) high-throughput miRNA 타겟 분석을 위해 많은 링커가 선택되었다. 상기 MRE 서열은 Probability of Interaction by Target Accessibility(PITA) 표적 예측 알고리즘에 의해 설계되었으며, 리포터 벡터에 클로닝되었다. 빈 또는 miR-708 베어링 벡터를 293 T 세포 내로 리포터 벡터와 함께 형질감염시켰다. 배양 24 시간 후, 루시퍼라제 활성을 측정하였다. * p-값 <0,05.
도 4는 제작된 NNAT, TLK1, EFNA5, SSH2의 MRE-링커 결합체의 서열이 miR-708과 특이적으로 결합하여 루시퍼라제의 활성을 억제한다는 실험 결과이다. (a)는 상기 MRE-링커 결합체에 결합된 루시퍼라제의 활성이 miR-708과 같이 발현될 경우에 대조군인 empty vector에 비해 감소되었다. (b) 반면 miR-708 대신에 miR-200a을 같이 발현시킨 경우에는 miR-708과는 달리, empty vector에 비해 루시퍼라제의 활성이 감소되지 않았다. * p-값 <0.05

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<재료 및 실험방법>

1. MRE -링커 설계

추정된 표적 유전자 목록은 miRanda, TargetRank 및 TargetScan 같은 miRNA 표적 예측 도구로부터 획득하였다(Ryu et al., 2013). 예측된 miR-708 결합 서열을 분석하여 추정된 표적 유전자의 3'-UTR 서열로부터 MRE 서열을 얻었다. 링커 서열은 상보적으로 miRNA에 결합하는 MRE 서열을 계산적으로(computationally) 예측하여 설계했다(표 1). 두 개의 짧고, 단일 가닥의 프라이머를 화학적으로 합성하고, 10 mM Tris(Qiagen, Venlo, The Netherlands)에 녹여서 100 μM의 스톡(stock)으로 만들었다(표 1). 쌍을 이루는 2 개 프라이머는 자가-연결되어(self-ligated) 이중 가닥 링커를 형성하였다. 간단히 말하면, 각각의 프라이머는 1 : 1의 비율로 첨가하고 95 ℃에서 5 분간 끓이고 천천히 실온으로 냉각시켰다.

리포터 벡터와 연결하기 위해서는 링커는 양 말단에 제한 효소 사이트(restriction enzyme sites)를 가지고 있어야 한다. 본 발명의 상기 링커는 두 가지 다른 제한 효소 사이트가 있다: 각각 MRE 서열의 5' 및 3' 말단에서 NheI 및 XbaI(도 2b). 간단히 말해, 두 프라이머가 이중가닥을 형성할 때, 양 말단은 점착성(sticky) 말단이 되고, 자동적으로 효소-절단된 삽입물(inserts)를 모방하며, 여분의 제한 효소 절단 단계가 없다. 즉, 단일 enzyme으로 벡터를 자르게 되면, 잘려진 부위가 스스로 다시 결합하는 self-ligation이 빈번히 발생하고 이는 cloning 효율을 저하시키는 가장 큰 요인이 된다. 따라서 추후 벡터의 self-ligation을 억제하기 위해서는 추가적인 5’ phosphorylation modification 과정이 필요한데, 본 발명의 MRE-링커 결합체는 MRE에 결합하는 링커의 양 말단에 서로 다른 점착성 말단을 형성하는 제한 효소 사이트(restriction enzyme sites)를 가지고 있기 때문에 추가적인 탈인산화 과정이 필요없게 되므로, 시간과 비용을 절약할 수 있다. 상기 MRE-링커 결합체와 3'UTR에 프라이머 서열 정보는 표 1과 표 2에 나타내었다. 모든 링커를 단일 튜브에서 혼합하고 동시에 벡터와 연결시켰다(ligated). 벡터 및 링커 라이게이션을 위해 1 : 3의 비율로 혼합하였다. T4 DNA 리가아제(ligase) 효소가 라이게이션(ligation)에 사용되었다. 링커의 수보다 3배 많은 수의 콜로니가 링커의 유형을 결정하기 위해 선택되었다.

2. MRE -링커를 포하하는 리포터 벡터의 구축

pmirGLO 듀얼 루시퍼라제 벡터(Promega, Fitchburg, WI)를 사용하여 변형된 루시퍼라제 리포터 분석 시스템을 제조하였다. 이 벡터는 반딧불이 루시퍼라제 (Fluc)를 함유하고 있어, miR-708의 상호 작용을 측정하는 데 사용될 수 있다(Ko et al., 2009). Renilla 루시퍼라제(Rluc)는 DNA 벡터의 형질 감염의 효율을 표준화하는데 사용되었다(Ko et al., 2009). miR-708에 의해 조절되는 'MRE(miRNA regulatory element)-링커' 또는 표적 유전자의 전체 3'-UTR 영역은 pmirGLO 벡터에 삽입되었다(도 2a).

3. DNA 형질 감염 및 루시퍼라제 활성 분석

리포터 벡터의 형질 감염은 293 T 세포에서 감소된 혈청 배지인 Opti-MEM (Thermo Scientific, Waltham, MA)에서 Lipofectamine 2000(Invitrogen, Carlsbad, CA)의 혼합물을 사용하여 수행하였다. miR-708을 포함하거나 포함하지 않는 '링커 리포터 플라스미드 벡터', 또는 빈 벡터를 293 T 세포로 형질감염시켰다. 각각의 MRE 링커 리포터 플라스미드와 빈 벡터 또는 miR-708-bearing vector 총 1 μg을 4㎕의 Lipofectamine 2000을 함유하는 293 T 세포에 형질감염시켰다. 24 시간 후 293 T 세포를 1X 수동 용해 완충액에 용해하고, 루시퍼라제 활성을 측정 하였다(도 1).

<실험 결과>

실험예 1. MRE -링커의 서열 설계 및 MRE -링커를 포함하는 리포터 벡터 구축

본 출원인은 암 전이에 있어서 miR-708가 NNAT 발현을 조절하여 생물학적 역할을 하는 것을 보고하였다(Ryu et al., 2013). NNAT는 NNAT의 전체 3'-UTR 영역을 갖는 리포터 벡터를 사용하여 진정한 표적 유전자로 동정되었으며, 이는 돌연변이된 결합 부위를 갖는 리포터 벡터를 사용하여 확인되었다(Ryu et al., 2013). 본 발명에서는 본 출원인에 의해 새로 개발된 테크닉(technique)을 테스트 하기 위하여, miR-708의 확인된 표적 유전자로서 NNAT를 이용하였다.

우리는 miRanda, TargetRank 및 TargetScan 같은 여러 miRNA 표적 예측 알고리즘을 사용하여 NNAT를 포함하는 예측된 표적 유전자 리스트를 얻었다(Ryu et al., 2013). NNAT 및 HOXB3는 3개의 독특한 알고리즘에 의해 예측되었다(Ryu et al., 2013). 또한, SSRP1, HNRNPK, EPDR1 및 FLT1은 본 출원인의 이전 연구에서 두 개 이상의 알고리즘에서 예측되었다(Ryu et al., 2013).

이러한 결과를 바탕으로, 후보 표적 유전자의 목록에 대한 'MRE-링커가 결합된 결합체'를 합성하고 전체 3'-UTR을 증폭시키기 위하여 적당한 프라이머를 디자인하였다(표 1 및 표 2). 3'-UTR 영역의 길이는 수백에서 약 1000bp까지 다양하였다(표 2). 이후에, 이를 루시퍼라제 리포터 벡터인 pmirGLO 듀얼 루시퍼라제 벡터에 클로닝하였다. 이 벡터는 두 개의 독립적인 루시퍼라제 : 번역 억제용 반딧불이 루시퍼라제(Fluc)와 표준화용 레닐라 루시퍼라제(Rluc)를 포함한다(도 2).

상기 MRE-링커의 결합체를 만들기 위해, 우리는 표 1에 기재된 바와 같이, MRE 서열 양 말단에서 서로 다른 제한 효소 사이트(restriction enzyme sites)를 가지는 이중 형태(duplex form)의 ''MRE-링커의 결합체'의 두개의 짧은 서열을 화학적으로 합성했다. 같은 제한 효소 사이트를 링커로 사용하게 되면, 벡터의 self-ligation이 발생하여 추후 벡터에 라이게이션(ligation)을 위해서는 삽입용 MRE-링커의 결합체에 대한 추가적인 5’ phosphorylation modification 필요한데, 본 발명의 MRE-링커 결합체는 MRE에 결합하는 링커의 양 말단에 서로 다른 점착성 말단을 형성하는 제한 효소 사이트(restriction enzyme sites)를 가지고 있기 때문에 추가적인 탈인산화 과정이 필요없게 되므로, 시간과 비용을 절약할 수 있다(표 3 참조). 즉, 본 발명에서 인산화 단계없이 벡터의 셀프-라이게이션을 막기 위하여, 각 말단에 서로 다른 제한 효소인 NheI과 XbaI을 사용했다(도 2b).

	동일한 제한 효소 사이트를 포함하고 60bp이상의 길이가 긴 링커	다른 제한 효소 사이트를 포함하고 22bp 길이가 짧은 링커
1 oligo 당 합성비용	70,000원	13,000원
제작시간	1 weekend (같은 enzyme으로 자른 후 다시 ligation을 위해서는 insert DNA를 제작시 추가로 5’ phosphorylation modification 필요함)	1 day
합성 외 비용	Alkaline phosphatase (12만원)	-
실험시간	Alkaline phosphatase를 이용한 탈인산화 과정이 필요함 (+ 2시간)	탈 인산화 과정이 불필요함

또한, 본 발명에서는 3'-비번역 영역(UTR)에 포함되며, 3'-비번역 영역(UTR)에서 miRNA가 결합하는 부위에 해당하는 "miRNA 조절 인자(miRNA regulatory element, MRE)"의 서열을 20~25bp의 염기서열로 사용하였으며, 이의 서열에 서로 다른 제한효소사이트를 포함하는 링커를 결합하여 MRE-링커 결합체를 제작하였다(도 5의 실시예).

반면, 기존 방법인 miRNA 조절 인자(miRNA regulatory element, MRE) 외에 이의 주변 영역까지 포함하여, 서열이 60 bp 이상으로 길어지게 되는 경우, MRE 주변영역(surrounding region of the MRE)-링커 결합체의 제작비용은 MRE-링커 결합체의 제작비용에 비해 약 6-7배 이상 증가하게 되며, 합성에 소요되는 기간도 7배 증가하게 되므로, MRE-링커 결합체에 비하여, MRE 주변영역(surrounding region of the MRE)-링커 결합체는 알고리즘에 의해 예측된 miR-708의 후보 표적 유전자를 검증하는 데, 비효율적인 것을 알 수 있었다(도 5 참조).

실험예 2. MRE -링커 결합체의 리포터 활성 검증

먼저, 새로 개발된 테크닉이 종래의 루시퍼라제 리포터 분석과 비교하여, miRNA에 의한 발광 신호를 억제할 정도로 충분히 정확한지 테스트하였다. 다음으로, 293 T 세포에서 miR-708-발현 벡터 또는 빈 벡터를 형질전환 후 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 빈 벡터와 비교하여, miR-708-발현 벡터를 형질전환 후에 NNAT의 MRE-링커의 결합체와 연결된 루시퍼라제 활성은 현저하게 감소했다(도 3a). 결론적으로, MRE-링커의 결합체의 리포터 분석을 사용하여, 검증된 표적 유전자 NNAT가 직접적으로 miR-708에 의해 조절되는 것을 증명했다.

다음으로, miR-708의 다양한 후보 표적 유전자에 대한 3'-UTR 영역의 전체길이와 MRE-링커의 결합체 사이에서 루시퍼라제 활성을 비교했다. 그러나, 다른 유전자들은 miR-708의 형질 전환에 의해 크게 영향을 받지 않았는데, 이는 종래의 루시퍼라제리포터 분석과 일치하였다(도 3a). 종래의 3'-UTR과 MRE-링커의 결합체 루시퍼라제 분석 둘다 miR-708의 후보 표적 유전자 목록으로부터 일관되게 진정한 표적(예 : NNAT 및 CD44)을 구별하게 했다. 종합하여 보면, 이 데이터는 본 발명에서 새로 개발된 테크닉이 전통적인 방법과 비교하여, 표적 유전자를 검증하는 데 신뢰할 만한 것을 보여주는 것이다.

결론적으로, 이전에 보고된 바와 같이, 본 발명에서는 NNAT와 CD44가 종래의 3'-UTR 및 MRE-링커의 결합체의 루시퍼라제 분석에 의해 miR-708의 진짜 표적임을 확인했다(Saini et al., 2012; Ryu et al., 2013). miR-708의 새롭고 진정한 표적을 발견하기 위하여, 다른 예측 알고리즘인 PITA(Probability of Interaction by Target Accessibility)을 사용하여, miR-708의 후보 표적 유전자를 추가적으로 조사했다. 이 알고리즘은 접근성 및 유사성에 기반한 miRNAs의 표적 유전자를 에측하기 위해 개발된 것이다(Kertesz et al., 2007).

PITA 알고리즘에 따르면, 총 2069 유전자가 표적 후보로 예측되었다. 총 45개의 유전자는 PITA와 인-하우스(in-house) 알고리즘 둘다에 의해 예측되었으며, 이는 최대 유사성 값만을 고려한 것이다. 본 발명의 도 3b에서는 상기 45 개 중에서 MLL와 TLK1를 포함하는 16 개의 유전자를 선택하여 추가 검증을 하였다. TLK1, EFNA5 및 SSH-2를 포함하여 여러 유전자가 억제되었으나(대략 miR-708에 의해 20 %), NNAT의 억제가 50%에 가까운 것과 비교하여 이들 유전자의 억제 정도는 그다지 크지 않았다(도 3b).

다음으로, 이러한 신호가 노이즈(noise)인지를 확인하기 위하여, 다른 miRNA인 miR-200a를 이용하여 비교 평가했다. 도 4는 제작된 NNAT, TLK1, EFNA5, SSH2의 MRE-링커 결합체의 서열이 miR-708과 특이적으로 결합하여 루시퍼라제의 활성을 억제한다는 실험 결과이다. (a)는 상기 유전자들의 MRE-링커 결합체에 결합된 루시퍼라제의 활성이 miR-708과 같이 발현될 경우 대조군인 empty vector에 비해 감소되었다. (b) 반면 miR-708 대신에 miR-200a을 같이 발현시킨 경우에는 miR-708과는 달리, empty vector에 비해 루시퍼라제의 활성이 감소되지 않았다.

예상대로, miR-200a는 NNAT, SSH-2, EFAN5 및 TLK1 MRE-링커 결합체의 루시퍼라제 활성을 억제하지 않았다(도 4). 이들 데이터를 조합하면, 본 발명에서 새롭게 개발된 MRE-링커의 결합체의 리포터 분석은 상보적인 결합에 의존하여 miRNA의 표적을 특이적으로 억제하는 것을 알 수 있었다. 또한, 위 결과를 토대로 본 발명의 MRE-링커 결합체 시퀀스의 경우 miR-708 특이적으로 해당 유전자의 발현을 감소시킴을 알수 있었다.

<110> Soonchunhyang University Industry Academy Cooperation Foundation <120> DNA structure for validation of miRNA target <130> DP20170035 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD44 MRE-LINKER forward <400> 1 tcgagagaaa gaagaagaaa agctcctgt 29 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD44 MRE-LINKER reverse <400> 2 ctagacagga gcttttcttc ttctttctc 29 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EFNA5 MRE-LINKER forward <400> 3 tcgagcacca gtggttcgtc agctcctgt 29 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EFNA5 MRE-LINKER reverse <400> 4 ctagacagga gctgacgaac cactggtgc 29 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NNAT MRE-LINKER forward <400> 5 tcgagcccag ctagattgta agctccttt 29 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NNAT MRE-LINKER reverse <400> 6 ctagaaagga gcttacaatc tagctgggc 29 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TLK1 MRE-LINKER forward <400> 7 tcgaggatat tgactaactg agctccttt 29 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TLK1 MRE-LINKER reverse <400> 8 ctagaaagga gctcagttag tcaatatcc 29 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SSH-2 MRE-LINKER forward <400> 9 tcgaggttgc ccagagtgga agctcctat 29 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SSH-2 MRE-LINKER reverse <400> 10 ctagatagga gcttccactc tgggcaacc 29

Claims

miRNA 조절 요소(miRNA regulatory element, MRE) 및 링커가 결합된 MRE-링커 결합체를 포함하는, miRNA의 표적 유전자 검증용 DNA 구조체.
제1항에 있어서, 상기 구조체는 리포터 유전자를 포함하는 것인, DNA 구조체.
제2항에 있어서, 상기 리포터 유전자는 LacZ, 클로람페니콜 아세틸 전이효소(CAT: chloramphenicol acetyl transferase), 레닐라 루시퍼라제(Renila luciferase), 반딧불이(firefly) 루시퍼라제, 적색형광단백질(RFP), 녹색형광단백질(GFP), 분비성 태반 알칼라인 포스파타아제(secreted placental alkaline phosphatase, SEAP) 및 HSV-tk(Herpes simplex virus-thymidine kinase)를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, DNA 구조체.
제1항에 있어서, 상기 miRNA 조절 요소는 3'-비번역 영역(UTR)에 포함되는 것인, DNA 구조체.
제1항에 있어서, 상기 miRNA 조절 요소는 20~25bp의 염기서열을 가지는 것인, DNA 구조체.
제1항에 있어서, 상기 링커는 제한 효소 사이트(restriction enzyme sites)를 포함하는 것인, DNA 구조체.
제1항에 있어서, 상기 링커는 miRNA 조절 요소의 양 말단에 연결된 것인, DNA 구조체.
제6항에 있어서, 상기 제한효소는 NheI, XbaI, EcoRI, BamHI, BglII, HindIII, HinfI, sam3A, AluI, HaeIII, TaqI, NotI, HpaII, PstI, SmaI, 및 XmaI로 이루어진 군에서 선택되는 서로 다른 두 가지 제한효소의 조합인 것인, DNA 구조체.
제1항에 있어서, 상기 MRE-링커 결합체는 점착성 말단의 이중 가닥을 형성하는 것인, DNA 구조체.
제1항에 있어서, 상기 miRNA는 miR-708인 것인, DNA 구조체.
제10항에 있어서, 상기 miR-708의 표적 유전자는 NNAT(Neuronatin), CD44, TLK1(Serine/threonine-protein kinase tousled-like 1), EFNA5(Ephrin A5), 및 SSH-2(Slingshot Protein Phosphatase 2)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, DNA 구조체.