KR20180111293A - 병용투여에 대한 감수성 예측용 마커 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 PI3K(phosphatidylinositol-3-kinases) 서브유닛 p85 의 인산화 수준을 측정하는 제제를 포함하는, PI3K 억제제 및 Src 억제제 병용투여에 대한 암세포의 감수성 예측용 마커 조성물 및 키트, 생물학적 시료에서 p85의 인산화 수준을 측정하는 단계; 를 포함하는 PI3K 억제제 및 Src 억제제 병용투여에 대한 암세포의 감수성 진단에 대한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 PI3K(phosphatidylinositol-3-kinases) 서브유닛 p85 의 인산화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 마커 조성물 및 이를 이용한 방법은 암 환자에게 PI3K 억제제 및 Src 억제제의 병용 투여 여부를 결정함에 있어, 상기 약물의 병용 투여에 의하여 효과를 나타낼 수 있는 암 환자를 조기에 신속하게 분류할 수 있어, 환자 맞춤형 항암 치료를 효율적으로 수행할 수 있다.

Description

병용투여에 대한 감수성 예측용 마커 {Marker for predicting susceptibility to combination therapy}
본 발명은 PI3K(phosphatidylinositol-3-kinases) 서브유닛 p85 의 인산화 수준을 측정하는 제제를 포함하는, PI3K 억제제 및 Src 억제제 병용투여에 대한 암세포의 감수성 예측용 마커 조성물 및 키트, 생물학적 시료에서 p85의 인산화 수준을 측정하는 단계; 를 포함하는 PI3K 억제제 및 Src 억제제 병용투여에 대한 암세포의 감수성 진단에 대한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
의학 관련 기술이 급속도로 발전한 오늘날에 있어서도 암은 아직 완전히 인류에게 위협적인 질병 중 하나이며, 많은 사람들이 암 진단을 받고, 암 또는 그와 관련된 합병증으로 인해 사망하고 있다. 유병률에 따른 우리나라 7대 암은 위암, 간암, 폐암, 대장암, 자궁암, 유방암, 두경부암으로 이중 폐암과 상부소화기계 암에 속하는 두경부암은 상호 관련성이 있는 것으로 알려져 있다. 상부 소화호흡기계 (upper aerodigestive tract, UADT) 암이란 후두, 구강, 구인두, 비강, 부비동, 비인두, 하인두, 타액선 등의 다양한 신체부위에서 발생하는 종양을 총괄하여 지칭하는 것으로 해석할 수 있다.
세계적으로 두경부암과 같은 상부 소화호흡기계 암의 발생빈도는 점차로 증가하고 있으며, 암의 치료를 위해서 현재 임상에서 사용되고 있는 항암제 중 가장 강력한 항암제인 시스플라틴이 사용되고 있음에도 시스플라틴에 대한 저항성이 지속적으로 유발되는 한계점이 있다. 따라서 이를 대체할 수 있는 새로운 항암제에 대한 필요성이 매우 높으며, 최근에는 Phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/AKT/mTOR 신호전달체계를 타깃으로 한 새로운 항암제를 개발하기 위한 연구가 수행되고 있다.
PI3K/AKT/mTOR 신호전달체계는 암세포의 세포대사, 성장, 생존, 혈관생성 등의 기본적인 세포 기능을 조절하는 중요한 인자로, 일반적으로 PI3K 기전의 활성화는 암세포의 진행, 전이, 불량한 예후 인자 및 방사선 치료에 대한 저항성을 나타내는 요인으로 알려져 있다. 따라서, PI3K/Akt/mTOR 경로를 억제하는 약물 개발, 다양한 약제들이 현재 임상실험단계에 있다. 특히 상기 경로에서 핵심적 역할을 하는 PI3K 를 표적으로 하는 약물의 개발은 PI3K- addicted cancer 를 효과적으로 억제할 수 있으며, 이러한 PI3K 억제제는 암세포의 감수성을 증가시킬 수 있는 역할을 할 것으로 기대된다. 하지만 최근 몇 가지 임상적인 적용에 있어, PI3K 억제제를 이용한 표적치료에서 PI3K 억제제에 대한 저항성이 발견되고 있어, 암 치료에 있어 기술적 한계를 나타내고 있다. 그럼에도 불구하고 아직까지 PI3K 억제제에 대한 정확한 저항성 기전 및 저항성을 해소하기 위한 방안, 새로운 치료법의 적용에 대한 연구가 많이 이루어지지 않아, PI3K 억제제에 대한 암세포의 저항성 문제를 해결하기 위한 새로운 방법에 대한 필요성이 있다.
이에 본 발명자들은 PI3K 억제제에 대한 저항성 기전 및 저항성을 해소하기 위한 적절한 치료방법에 대하여 연구한 결과, PI3K 의 서브유닛인 p85의 인산화 및 Src 인산화의 상호 조절이 PI3K 억제제 저항성과 관련되어 있음을 확인하였으며, PI3K 억제제와 Src 억제제의 병용 투여를 결정하기 위한 바이오 마커로 PI3K 서브유닛 p85 의 인산화를 이용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은, PI3K(phosphatidylinositol-3-kinases) p85 의 인산화 수준을 측정하는 제제를 포함하는, PI3K 억제제 및 Src 억제제 병용투여에 대한 암세포의 감수성 예측용 마커 조성물 및 키트를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 생물학적 시료에서 p85의 인산화 수준을 측정하는 단계; 를 포함하는 PI3K 억제제 및 Src 억제제 병용투여에 대한 암세포의 감수성 진단에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 PI3K 억제제 및 Src 억제제를 포함하는, PI3K 억제제 저항성 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 PI3K 억제제 저항성 암 세포에 후보 물질을 처리하는 단계; 및 PI3K p85 인산화 및 Src 인산화를 억제하는 물질을 선별하는 단계; 를 포함하는 PI3K 억제제 저항성 억제 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 PI3K(phosphatidylinositol-3-kinases) p85 의 인산화 수준을 측정하는 제제를 포함하는, PI3K 억제제 및 Src 억제제 병용투여에 대한 암세포의 감수성 예측용 마커 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 PI3K(phosphatidylinositol-3-kinases) p85 의 인산화 수준을 측정하는 제제를 포함하는, PI3K 억제제 및 Src 억제제 병용투여에 대한 암세포의 감수성 예측용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 생물학적 시료에서 p85의 인산화 수준을 측정하는 단계; 를 포함하는 PI3K 억제제 및 Src 억제제 병용투여에 대한 암세포의 감수성 진단에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 PI3K 억제제 및 Src 억제제를 포함하는, PI3K 억제제 저항성 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 PI3K 억제제 저항성 암 세포에 후보 물질을 처리하는 단계; 및 PI3K p85 인산화 및 Src 인산화를 억제하는 물질을 선별하는 단계; 를 포함하는 PI3K 억제제 저항성 억제 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 PI3K(phosphatidylinositol-3-kinases) p85 의 인산화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 마커 조성물 및 이를 이용한 방법은 암 환자에게 PI3K 억제제 및 Src 억제제의 병용 투여 여부를 결정함에 있어, 상기 약물의 병용 투여에 의하여 효과를 나타낼 수 있는 암 환자를 조기에 신속하게 분류할 수 있어, 환자 맞춤형 항암 치료를 효율적으로 수행할 수 있다.
도 1은 AMC-HN-3, HN30, HN31 세포주에서 PI3K의 서브유닛 p85의 인산화 여부를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 AMC-HN-3, HN30, HN31 세포주에서 PI3K 억제제(LY294002, BYL719) 의 처리에 따른 암세포 사멸 효과 및 PI3K p85의 인산화 수준을 확인한 결과를 나타낸 도이다 (* p<0.05).
도 3은 AMC-HN-3, HN30, HN31 세포주에서 Src 의 인산화 정도를 비교한 결과(A) 및 PI3K 억제제(LY294002, BYL719) 의 처리에 따른 Src 인산화 억제 효과 (B)를 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 PI3K 억제제 저항성 HN31 세포주에서, Src 억제제 다사티닙 및 PI3K 억제제 (LY294002, BYL719)의 단독 또는 병용 처리에 따른 집락형성 분석 결과 및 Src 및 p85의 인산화 감소를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 PI3K 억제제 감수성 암 세포와 PI3K 억제제 저항성 암 세포에서 p85 인산화 및 Src 인산화 상호 조절과 관련된 기전을 나타낸 모식도이다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 PI3K(phosphatidylinositol-3-kinases) p85 의 인산화 수준을 측정하는 제제를 포함하는, PI3K 억제제 및 Src 억제제 병용투여에 대한 암세포의 감수성 예측용 마커 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 PI3K(phosphatidylinositol-3-kinases) p85 의 인산화 수준을 측정하는 제제를 통해, 암세포에서 p85의 인산화가 확인되는 경우 PI3K 억제제 및 Src 억제제의 병용투여에 상기 암세포가 감수성이 있음을 예측할 수 있으며, 이를 통해 병용 투여에 적합한 환자를 효과적으로 선별할 수 있다.
또한 상기 마커 조성물은 Src 의 인산화 수준을 측정하는 제제를 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어, “인산화 수준을 측정하는 제제”는 당 분야에 알려진 통상의 인산화 측정 방법에 사용되는 제제를 제한없이 포함할 수 있으며, 예컨대 인산화기를 인식하는 항체, 인산화기를 인식하는 화학물질, 발광법 등에 사용되는 제제를 이용 가능하다. 상기 인산화기를 인식하는 화학물질은 Zn2+복합체 기반 비오틴화 인산 특이적 리간드(biotinylated phosphate-specific ligand based on Zn2+ complex) 등의 분자 프로브일 수 있으며, 구체적으로 phos-tag 등일 수 있다. 보다 바람직하게 본 발명의 인산화 수준을 측정하는 제제는 인산화 수준을 측정하는 항체 또는 phos-tag 일 수 있다.
상기 인산화 수준을 측정하는 제제를 이용하여 인산화 수준을 측정할 수 있는 방법은 웨스턴 블롯, MALDI-TOF/MS, ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay), 방사성 동위원소 표지 방법 및 당해 업계의 당업자에게 공지된 다양한 표지 방법 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로, 웨스턴 블롯과 ELISA는 인산화된 기질 특이적인 항체를 이용하여 수행할 수 있으며, 방사성 동위원소 표지 방법은 [32P]γ-ATP와 바이오틴(biotin)화된 키나아제 기질과 흡착력이 있으며, 아비딘이 흡착되어 있는 막(membrane)을 이용하여 인산화 측정을 수행할 수 있다. 또한 방사성 동위원소를 사용하지 않으면서, 인산화 반응 후 기질의 알짜전하(net charge) 차이로 인한 전기영동 상의 이동차를 이용하여 인산화 활성 측정을 수행할 수 있으며, 당업자에게 알려진 인산화 활성 측정 방법이라면 모두 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 인산화 수준 측정은 인산화의 유무 및 인산화의 증감을 모두 포함하는 의미로 사용될 수 있으며, Src 억제제 병용 투여 여부를 결정하기 위한 인산화 수준 측정에 있어서, PI3K p85의 인산화 수준의 측정은 바람직하게는 p85의 인산화 유무를 확인하는 것일 수 있고, Src 인산화 수준의 측정은 바람직하게는 Src 인산화가 PI3K 감수성 세포와 비교하여 증가되어 있는 것을 확인하는 것을 의미하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 상기 암세포는 PI3K 억제제 저항성 암인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 "저항성" 은 항암제의 처리에도 불구하고 세포 증식에 유의적인 변화를 나타내지 않는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 PI3K 억제제 저항성 암은 PI3K p85에서 인산화가 확인되고, Src 의 인산화와 p85의 상호 조절을 통해 지속적인 활성화를 유지함으로써, 저항성을 나타내는 것을 특징으로 할 수 있다.
반면 본 발명에 있어 "감수성" 이란 항암제에 의해 효과적으로 세포 증식이 변화하는 상태, 즉 암세포가 사멸하는 상태를 말하며, 항암제 처리에 의해 목적하고자 하는 항암 효과가 달성될 수 있는 상태를 의미한다. 따라서 본 발명에 있어 PI3K 억제제 및 Src 억제제 병용투여에 대한 암세포의 감수성 예측은, PI3K 억제제 및 Src 억제제 병용투여에 의하여 암 세포, 바람직하게는 PI3K 억제제 저항성 암세포가 효과적으로 사멸될 수 있는지 여부를 예측하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어, 상기 암은 상부 소화호흡기계 암일 수 있으며, 구체적인 예로서 두경부암, 후두암, 인두암, 구강암, 구인두암, 비인두암, 비강암, 중피암, 폐암 및 식도암으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 암일 수 있다.
본 발명에 있어, “PI3K 억제제”는 LY294002 (CAS number:　154447-36-6), BYL719(CAS number: 1217486-61-7), 쿼세틴(Quercetin) (CAS number: 117-39-5), 보르트만닌(Wortmannin) (CAS number: 19545-26-7), 이델라리십(Idelalisib)(CAS number: 870281-82-6) 및 픽틸리십(Pictilisib) (CAS number: 957054-30-7) 으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 LY294002, BYL719 이나 이에 제한되지 않는다.
또한 본 발명에 있어, "Src"는 EC 2.7.10.2에 상응하는 단백질을 지칭한다. Src는 비-수용체 티로신 키나제 및 원발암 유전자이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "Src 억제제"는 Src 유전자의 발현 생성물이 생성되는 것을 방해함으로써 (Src 유전자 전사를 중단시키고/시키거나 Src 유전자 발현으로부터 나오는 mRNA의 번역을 차단함으로써) 및 Src 단백질 활성을 직접적으로 억제함으로써 Src 유전자 발현을 완전히 또는 부분적으로 억제할 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 구체적인 예로 본원 발명의 Src 억제제는 바람직하게는 다사티닙 (Dasatinib), 보수티닙 (Bosutinib) 및 사라카니티닙 (saracatinib) 으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 가장 바람직하게는 다사티닙일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 하나의 양태로서 본 발명은 상기 예측용 조성물을 포함하는 PI3K 억제제 및 Src 억제제 병용투여에 대한 암세포의 감수성 예측용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 "키트" 란 PI3K(phosphatidylinositol-3-kinases) p85 의 인산화 수준을 측정하는 제제 및/또는 Src 의 인산화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 조성물을 포함함으로써, PI3K 억제제 및 Src 억제제 병용투여에 대한 암세포의 감수성을 예측할 수 있도록 하는 도구를 의미한다. 본 발명의 키트에는 상기 조성물 외에도 감수성 예측에 필요한 다른 구성성분 조성물, 용액, 장치가 포함될 수 있으며, 제1 구획에는 PI3K p85 의 인산화 수준을 측정하는 제제, 제2구획에는 Src 의 인산화 수준을 측정하는 제제를 나누어 포함할 수 있다.
또 하나의 양태로서 본 발명은, 생물학적 시료에서 p85의 인산화 수준을 측정하는 단계; 를 포함하는 PI3K 억제제 및 Src 억제제 병용투여에 대한 암세포의 감수성 진단에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 Src 의 인산화 수준을 측정하는 단계; 를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생물학적 시료는 암 조직 또는 암 세포일 수 있다.
상기 방법은 구체적으로 다음과 같은 방법을 통해 수행될 수 있다.
생물학적 시료에서 p85의 인산화 수준을 측정하는 단계는 앞서 설명한 PI3K p85의 인산화 수준을 측정하는 제제 및 방법을 통해 수행될 수 있으며, 생물학적 시료, 바람직하게는 암 세포에서 p85의 인산화가 확인되는 경우, 이 암세포 및/또는 환자는 PI3K 억제제 및 Src 억제제 병용투여에 대한 암세포의 감수성이 있는 것으로 진단할 수 있다. 또한 Src 의 인산화 수준을 측정하는 제제 및 방법을 통해 Src 인산화 수준을 측정하고 인산화 수준이 PI3K 억제제에 감수성인 대조군 세포와 비교하여 증가되어 있는 경우, 이 암세포 및/또는 암환자는 PI3K 억제제 및 Src 억제제 병용투여에 대한 감수성이 있는 것으로 진단할 수 있다.
상기와 같은 진단 방법을 통해, PI3K 억제제 및 Src 억제제 병용투여를 통해 PI3K 억제제에 대한 저항성을 극복하고 항암 효과를 얻을 수 있는 암 환자를 조기에 선별할 수 있으며, 환자 맞춤형 치료를 수행할 수 있다.
또한 본 발명은 PI3K 억제제 및 Src 억제제를 포함하는, PI3K 억제제 저항성 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
PI3K 억제제 및 Src 억제제를 병용 투여하는 경우 PI3K 억제제 저항성을 해소하고, 암세포의 효과적인 사멸을 유도할 수 있으며, 특히 상기 병용 투여가 바람직한 대상은 PI3K p85의 인산화가 확인되는 암 및 PI3K 억제제 감수성 암 세포와 비교하여 지속적인 Src 인산화 증가가 확인되는 암이다.
상기 PI3K 억제제 및 Src 억제제는 상술한 바와 동일하며, 본원 발명의 구체적인 일 예에서는 PI3K 억제제로 LY294002 또는 BYL719를, Src 억제제로 다사티닙을 p85의 인산화가 확인되는 PI3K 억제제 저항성 암세포에 병용 투여함으로써, p85의 인산화가 감소하고, Src 인산화가 효과적으로 저해되어 암세포의 사멸을 유도할 수 있음을 확인하였다. 본 발명에 있어 병용 투여는 순차적으로 또는 동시에 투여되는 모든 투약 행위를 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되며 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일, 식염수, PBS(phosphate buffered saline) 또는 배지 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 또는 피하 투여될 수 있고, 항암 치료를 위한 추가적인 성분을 포함하여 함께, 동시에, 순차적으로 사용할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
또한 본 발명은 PI3K 억제제 저항성 암 치료를 위한 PI3K 억제제 및 Src 억제제를 포함하는 키트 또는 상업용 패키지를 포함할 수 있으며, 상기 키트 또는 상업용 패키지는 PI3K 억제제 저항성 암 치료에 있어, PI3K 억제제 및 Src 억제제의 동시적, 개별적　또는 순차적 사용에 대한 설명서를 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 PI3K 억제제 저항성 암 치료에 사용하기 위한 약제의 제조에 있어, PI3K 억제제와 조합된 Src 억제제의 용도를 포함한다.
또한 본 발명은 PI3K 억제제 저항성 암 세포에 후보 물질을 처리하는 단계; 및 PI3K p85 인산화 및 Src 인산화를 억제하는 물질을 선별하는 단계; 를 포함하는 PI3K 억제제 저항성 억제 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
PI3K 억제제 저항성은 p85 인산화 및 Src 의 증가된 인산화, 그리고 이들의 상호 조절에 의한 지속적인 인산화 유지에 의하여 기인하는 것으로, 본원 발명의 구체적인 일 실시예에서는 PI3K 억제제 및 Src 억제제의 병용 투여를 통해 PI3K 억제제에 대한 저항성이 해소되고 상기 병용처리에 대하여 감수성을 보여 암세포가 사멸하는 경우, Src 의 인산화가 감소되고, PI3K p85의 인산화 역시 감소되는 것을 확인하였다. 따라서, PI3K 억제제 저항성 세포에서 PI3K p85 인산화 및 Src 인산화를 억제하는 물질을 확인하는 경우, 이는 PI3K 억제제 저항성 억제 물질로 사용 가능한 물질로 선별 및 개발할 수 있고, 이와 같은 PI3K 억제제 저항성 억제 물질, 예컨대 PI3K 억제제 및 Src 억제제의 병용 투여 제제는 PI3K 억제제 저항성 암에 대한 치료제로 활용 가능하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 포스파티딜이노시톨 -3-키나아제 억제제 저항성 세포주에서 p85 인산화 확인
포스파티딜이노시톨-3-키나아제 (phosphatidylinositol-3-kinase) (이하, PI3K) 저항성 두경부암 세포주 (HN31) 과 감수성 세포주 (HN30, AMC-HN-3) 에서 PI3K/Akt 의 활성화 정도를 비교하기 위한 실험을 수행하였다. 실험에 사용한 세포 주 중, AMC-HN-3 는 아산병원의 두경부암 환자로부터 분리하여 보유하고 있는 두경부암 세포주이며, HN30 및 HN31 은 University of texas MD Anderson cancer center 의 Dr. Myer 로부터 제공받아 이용하였다. 구체적으로 상기 3 종의 세포, AMC-HN-3, HN30, HN31에서 PI3K p85 의 인산화 (p-PI3K p85), AKT의 인산화(p-AKT), T-AKT 활성화 정도를 인산화 발현 단백질 특이적 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 이용하여 확인하였다. 대조군으로는 베타 엑틴을 이용하였고, 상기 저항성 및 감수성 세포에서 PI3K/Akt 활성화 정도를 확인한 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 저항성 세포주 HN31에서는 감수성 세포주 HN3, HN30 과 비교하여 PI3K/Akt의 활성화가 증가되어 있음을 확인하였다. 특히 감수성 세포주인 HN3 및 HN30에서는 PI3K의 서브유닛인 p85 의 인산화가 확인되지 않았으나, 저항성 세포주인 HN31 세포주에서는 p85의 뚜렷한 인산화가 확인되었으므로, p85서브유닛의 인산화가 PI3K 억제제에 대한 저항성에서 중요한 역할을 함을 확인하였다.
PI3K 억제제 저항성과 p85 인산화와의 관련성을 확인하기 위하여, 앞서 확인한 바와 같이 PI3K/Akt 의 발현이 증가되어 있는 PI3K 억제제 저항성 두경부암 세포주인 HN31 과 감수성 세포주 HN30 및 AMC-HN3에 PI3K 억제제인 Ly294002, BYL719을 농도 별로 각각 처리하고 암세포의 세포 생존율 및 IC50 값을 확인하였으며, Ly294002 (25uM), BYL719 (10uM)을 각각 0 내지 6시간 처리하면서 PI3K p85의 인산화 수준을 측정하고 그 결과를 도 2에 나타내었다. 약물 처리후 세포 생존은 MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) dye 를 이용하여 확인하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이, HN31 세포주의 경우, PI3K/Akt 의 활성화가 증가되어 있음에도 불구하고 PI3K 억제제에 대한 저항성이 있는 것으로 나타났다. 구체적으로 HN31의 IC50 값은 감수성 세포주인 HN30 과 비교하여 LY294002, BYL719에 대하여 약 3배 정도 높게 확인되었다.
이러한 감수성의 차이를 알아보고자 PI3K 관련 단백질의 활성화를 웨스턴 블랏을 이용하여 알아보았고, 감수성 세포주인 HN3 및 HN30에서는 p85의 인산화가 확인되지 않았으나, 저항성 세포주인 HN31에서는 뚜렷한 p85의 인산화가 확인되었다. 또한, LY294002 및 BYL719의 시간에 따른 처리에 의해서도 인산화가 감소되지 않고 지속적인 활성화가 유지됨을 확인하였다.
이와 같은 결과를 통해, PI3K/Akt 의 활성화가 증가되어 있는 저항성 세포주에서 PI3K 억제제에 대하여 저항성을 나타내는 기전은 PI3K p85의 인산화가 억제되지 않고 지속적인 활성 상태를 유지하기 때문인 것을 확인하였다. 즉, PI3K 억제제에 대한 암세포의 저항성은 PI3K 서브유닛 p85의 인산화에 의하여 나타남을 알 수 있다.
실시예 2. p85 인산화 및 Src 키나아제 인산화의 상호 조절 확인
상기 실시예 1에서 확인한 바와 같이, PI3K 억제제 저항성 세포주에서 PI3K 억제제 처리시 PI3K p85 의 인산화가 억제되지 않고 p85 의 지속적인 인산화에 따른 활성이 유지되고 있음을 확인하였으므로, 이를 조절하는 신호에 대한 연구를 수행하였다. p85의 지속적인 활성화 및 저항성 기전에 PI3K/Akt 신호전달체계의 교차 신호 중 하나인 Src (a member of a superfamily of membrane-associated nonreceptor protein tyrosine kinases) 의 인산화를 통한 활성화 기전이 관여할 것으로 예상하고, HN3, HN30, HN31에서 Src의 인산화 여부를 웨스턴 블랏을 이용하여 비교 분석하였다. 또한 각각의 세포에 PI3K 억제제인 LY294002 (25uM), BYL719 (10uM) 를 0내지 6시간 처리하고 암세포에서 Src의 Thr416 (Src 활성화 부분) 인산화 정도를 비교한 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 웨스턴 블랏 PI3K 억제제에 대하여 저항성이 있는 세포주인 HN31에서는 Src 의 인산화, 특히 Thr416에서의 인산화가 유의하게 증가되어 있음을 확인하였다(A). 이와 같은 결과를 통해, PI3K 억제제에 대한 저항성과 Src의 Thr416 위치에서의 인산화가 관련이 있음을 알 수 있었다.
또한 PI3K 억제제에 대하여 저항성이 있는 HN31 세포주에 PI3K 억제제를 처리한 결과, Src의 지속적인 인산화, 즉 활성화 상태의 유지를 확인할 수 있었다. 반면 감수성인 AMC-HN-3, HN30 세포주는 PI3K 억제제를 처리한 경우 Src의 인산화가 뚜렷하게 억제되었다 (B).
상기와 같은 결과를 통해 PI3K 억제제에 대한 암 세포의 저항성에 있어서, PI3K p85 와 Src 의 상호 조절에 의한 지속적인 인산화가 중요한 역할을 하며, p85 인산화 유무 및 Src 인산화 증감 여부가 PI3K 억제제에 대한 저항성에 대한 마커 또는 저항성 감소의 타깃이 될 수 있음을 확인하였다. 즉 본 발명에서 확인된 결과에 따르면, p85의 인산화 및 Src 의 인산화가 PI3K 억제제 저항성에 있어서 중요한 역할을 하므로, 이를 억제하는 물질을 스크리닝하여, PI3K 억제제의 저항성을 억제하고, 감수성을 증진시킬 수 있는 물질로 선별할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 3. Src 억제제 병용 치료에 대한 바이오 마커로서의 p85 의 효용성 확인
실시예 2를 통해, PI3K p85 와 Src 의 상호 조절에 의한 지속적인 인산화가 PI3K 억제제에 대한 저항성의 원인이 되는 기전임을 확인하였으므로 PI3K p85의 인산화가 확인되는 PI3K 억제제 저항성 세포에 PI3K 억제제와 Src 억제제를 병용 처리하는 경우, PI3K 억제제에 대한 저항성을 극복하고 암세포 사멸 효과를 달성할 수 있는지 여부 및 이에 따른 p85, Src 인산화 수준의 변화를 확인하였다. 이를 위하여 PI3K 억제제인 LY294002 (25uM), BYL719 (10uM) 와 Src 억제제로서 다사티닙(Dasatinib)(200nM)을 각각 또는 함께 투여하고 Src의 인산화, PI3K p85 의 인산화 억제 여부 및 항암제의 효과를 확인하기 위한 집락형성 분석법 (clonogenic assay) 을 수행하였다. 집락형성 분석을 위하여, PI3K 억제제와 Src 억제제를 처리하고 14일 후 50개 이상의 세포가 모여있는 것을 집락으로 평가하고 이를 크리스털 바이올렛으로 염색한 후 현미경으로 관찰하였고, 이를 대조군에 대한 비율로 환산하여 나타내었다. 또한 약물 단독 및 병용 투여에 의한 Src 인산화 및 PI3K p85의 인산화 변화를 웨스턴 블랏을 통해 확인하고 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 약물 처리 14일후 시행한 집락형성 분석법의 결과 다사티닙 처리 없이 PI3K 억제제만을 처리한 군에서는 PI3K 저항성에 의하여 항암제의 효과가 나타나지 않았으나, 다사티닙과 PI3K 억제제를 함께 투여한 군에서는 집락 형성이 매우 현저하게 감소하여 (p<0.0001), Src 억제제와 PI3K 억제제의 병용 투여가 PI3K 억제제에 대한 저항성 기전을 차단하여 PI3K 억제제에 대한 감수성을 회복시킬 수 있도록 할 수 있음을 확인하였다. 상기와 같은 결과는 PI3K 억제제에 대한 저항성에 Src 및 p85 의 인산화가 관여함을 다시 한번 입증하는 것이다.
또한 다사티닙과 PI3K 억제제의 병용 투여 시 p85 및 Src 의 인산화 변화를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과, 다사티닙 단독 투여군에서는 Src와 P85의 인산화가 지속적으로 유지되는 반면, 다사티닙과 PI3K 억제제의 병용 투여군에서는 Src 의 Thr416 위치에서의 인산화가 뚜렷하게 소실되며, PI3K p85의 인산화 수준 역시 뚜렷하게 감소되는 것을 확인하였다. 이와 같은 결과는 p85 의 인산화 및 Src 의 인산화의 상호 조절에 의한 지속적 인산화가 PI3K 억제제에 대한 저항성을 유발하는 원인이며, 이들의 지속적인 인산화를 억제하는 경우 PI3K 억제제에 대한 감수성을 회복시킬 수 있음을 보여주는 것이다.
즉, p85의 인산화 및 Src의 인산화는 상호 조절에 의하여 지속적 인산화를 유발하므로, p85의 인산화가 지속적으로 유지되는 PI3K 억제제 저항성 암세포에 Src 억제제를 함께 처리하면 상호 조절에 의한 인산화를 차단하고 PI3K 억제제에 대한 감수성이 증진될 수 있는 것이며, 이와 같은 병용 치료 가부는PI3K 억제제 저항성 암세포에서 p85 의 인산화; 또는 p85 의 인산화 및 Src 의 인산화 정도; 를 바이오 마커로 특정하여 확인함으로써 결정될 수 있다. 즉, 암 세포, 특히 PI3K 억제제 저항성 암 세포에서 p85의 인산화가 확인되는 경우, 또는 p85 의 인산화와 Src 의 증가된 인산화가 확인되는 경우, 상기 세포를 PI3K 억제제 및 Src 억제제를 병용 투여하는 경우 항암 효과를 나타낼 수 있는 암 세포로 결정할 수 있다. 또한 PI3K p85 인산화가 확인되는 암세포에 PI3K 억제제와 Src 억제제를 병용 투여하는 경우, PI3K 억제제 저항성 암에서 감수성을 증가시켜 항암 효과를 증진시킬 수 있다.
상기 실시예들을 통해 확인한 PI3K 억제제에 대한 저항성 기전을 도 5에 모식화하여 나타내었다.

Claims (11)

  1. PI3K(phosphatidylinositol-3-kinases) 서브유닛 p85 의 인산화 수준을 측정하는 제제를 포함하는, PI3K 억제제 및 Src 억제제 병용투여에 대한 암세포의 감수성 예측용 마커 조성물.
  2. 제1항에 있어서, Src의 인산화 수준을 측정하는 제제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 감수성 예측용 마커 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 암은 PI3K 억제제 저항성 암인 것을 특징으로 하는, 감수성 예측용 마커 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 암은 두경부암, 후두암, 인두암, 구강암, 구인두암, 비인두암, 비강암, 중피암, 폐암 및 식도암으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 감수성 예측용 마커 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 PI3K 억제제 및 Src 억제제 병용투여에 대한 암세포의 감수성 예측용 키트.
  6. 생물학적 시료에서 p85의 인산화 수준을 측정하는 단계; 를 포함하는 PI3K 억제제 및 Src 억제제 병용투여에 대한 암세포의 감수성 진단에 대한 정보를 제공하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, Src 의 인산화 수준을 측정하는 단계; 를 더 포함하는 PI3K 억제제 및 Src 억제제 병용투여에 대한 암세포의 감수성 진단에 대한 정보를 제공하는 방법.
  8. PI3K 억제제 및 Src 억제제를 포함하는, PI3K 억제제 저항성 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 PI3K 억제제는 LY294002, BYL719, 쿼세틴 (Quercetin), 보르트만닌 (Wortmannin), 이델라리십 (Idelalisib) 및 픽틸리십 (Pictilisib) 으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, PI3K 억제제 저항성 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제8항에 있어서, Src 억제제는 다사티닙(Dasatinib), 보수티닙(Bosutinib) 및 사라카니티닙(saracatinib) 으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, PI3K 억제제 저항성 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. PI3K 억제제 저항성 암 세포에 후보 물질을 처리하는 단계; 및
    PI3K 서브유닛 p85의 인산화 및 Src 인산화를 억제하는 물질을 선별하는 단계; 를 포함하는 PI3K 억제제 저항성 억제 물질의 스크리닝 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Jiezhong Chen et al., ‘The Role of Src in Colon Cancer and Its Therapeutic Implications’, Clinical Colorectal Cancer, 2014, Vol. 13, pp 5-13. 1부.* *
Julian Carretero et al., ‘Integrative Genomic and Proteomic Analyses Identify Targets for Lkb1-Deficient Metastatic Lung Tumors’, Cancer Cell, 2010, Vol. 17, pp 547-559. 1부.* *

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