KR20180106681A

KR20180106681A - αTAT1 유전자 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20180106681A
Application number: KR1020170035381A
Authority: KR
Inventors: 이상명; 오소미
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2017-03-21
Filing date: 2017-03-21
Publication date: 2018-10-01

Abstract

본 발명은 αTAT1(α-Tubulin acetyltransferase1) 유전자 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물 등에 관한 것이며, Wnt1/β-catenin 신호전달 경로를 조절하는 αTAT1은 암 세포주에서 특이적으로 현저하게 과발현되며, αTAT1 유전자의 발현 억제에 의해 악성 종양 세포주의 이동성, 침투성 및 전이 관련 유전자의 발현이 저해됨을 알 수 있다. 따라서, αTAT1 유전자의 발현 억제제는 암세포의 치료 또는 전이 억제용 약물로 개발될 수 있을 것으로 기대되며, 또한, 본 발명은 암전이 억제 또는 암 치료제 후보 약물의 스크리닝 방법으로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

αTAT1 유전자 발현 억제제를 유효성분을 포함하는 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for cancer treatment or suppression of metastasis comprising αTAT1 gene expression inhibitor as an active ingredient}

본 발명은 αTAT1(α-Tubulin acetyltransferase1, 알파-튜불린 아세틸전이효소1) 유전자 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물 등에 관한 것이다.

1982년 Roel Nusse와 Harold Varmus가 마우스의 유방암 바이러스로 활성화되는 암유전자인 Integrase-1(Int1)을 보고하였으며, 몇 년 후 Int1은 1973년에 발견된 초파리의 발생과정에서 날개 형성에 관여하는 segment polarity gene인 Wingless(Wg)와 동족체(homologue)라는 것을 확인하였다. Wnt는 Wingless와 Intergrase-1의 이름을 합쳐서 붙여진 이름으로서, 발생과정 및 암과 관련해서 현재까지 많은 연구들이 이루어지고 있다.

Wnt 단백질은 매우 보존된 신호 분자로써 많은 종과 기관에서 세포운명의 결정이나 전구세포(progenitor cell)의 세포증식 및 배(embryo) 발달과정에서 분비되는 중요한 단백질로, Wnt 유전자 또는 Wnt 신호경로의 구성성분들의 변이는 발생적 결함이나 암과 같은 질환에 관여한다고 알려져 있다.

Wnt 신호경로에서 핵심적인 역할을 하는 전사인자는 베타-카테닌(β-catenin)이며, 베타-카테닌은 세포막에 카데린(cadherin)과 결합한 형태로 존재하기도 하면서, 세포-세포간 부착(adhesion)을 조절하기도 한다. 이러한 베타-카테닌을 포함하는 신호경로를 규범적 경로(canonical pathway)라 하며, 이 전사인자는 규범적 경로(canonical pathway)에서 TCF/LEF(T cell factor)(lymphocyte-enhancer-binding factor)와 결합하여 사이클린 D1(cyclin D1) 및 c-myc등과 같은 유전자를 발현시킴으로서 암 발생에 관여한다.

한편, 스케폴딩 단백질(Scaffolding protein)인 APC(adenomatous polyposis coli)와 axin(axis inhibition protein) 그리고 세린/트레오신 키네이스인 글리코겐 신타제 키나제 3-베타(이하 간략하게 'Gsk 3-β'라 함)와 CK1(casein kinase1)로 이루어진 destruction complex는 Wnt 신호가 없을 때, 베타-카테닌을 분해시켜 세포 내에서의 베타-카테닌 수준을 낮게 유지한다. 구체적으로, GSK3-β가 베타-카테닌을 인산화시키면, 이를 인지한 E3 유비퀴틴 리가아제(ubiquitin ligase)인 베타-TrCP(beta-transducin repeat containing protein)가 베타-카테닌을 폴리유비퀴티네이션(polyubiquitination) 시키게 되고, 폴리유비퀴티네이션된 베타-카테닌은 프로테아좀(proteasome)에 의해 분해된다. 그 결과 베타-카테닌이 핵으로 들어가지 못하여 사이클린 D1 및 c-myc과 같은 발암 유전자를 발현하지 못하게 된다.

따라서, 상기와 같은 Wnt 신호를 조절할 수 있는 다양한 단백질 또는 이들을 암호화하는 유전자들은 Wnt 신호와 관련된 질환의 치료에 있어서 중요한 타겟이며(한국공개특허공보 10-2014-0065215호 참조), 이에 대한 많은 연구들이 진행되었지만, Wnt 신호를 조절하는 유전자에 대한 연구는 아직 미비한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 암 치료 또는 전이 억제에 효과적인 신규 치료제를 개발하기 위해 연구하던 중, αTAT1 유전자의 발현 억제제를 발견하였고, 이들이 αTAT1 발현의 하향조절을 통한 Wnt/β-catenin 신호 방해 기작으로 암세포의 증식 및 침투를 억제할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 αTAT1 유전자의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 αTAT1 유전자를 이용하여 암 치료 또는 암 전이 억제용 후보 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 αTAT1 유전자의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는, 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 αTAT1 유전자의 발현 억제제는 암세포의 증식 및 침투성을 억제하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 일 구현예로, 상기 αTAT1 유전자의 발현 억제제는 WNT1, CCND1(Cyclin D1, 싸이클린 디1), MMP2(matrix metalloproteinase2, 기질금속단백질가수분해효소2), 및 MMP9(matrix metalloproteinase9, 기질금속단백질가수분해효소9)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 발현을 억제하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 일 구현예로, 상기 αTAT1 유전자의 발현 억제제는 인테그린에 의존적이나, β-catenin(베타-카테닌)에 독립적인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 일 구현예로, 상기 암은 대장암, 유방암, 또는 흑색종인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 일 구현예로, 상기 αTAT1 유전자의 발현 억제제는 αTAT1 유전자의 mRNA와 상보적으로 결합하는 안티센스뉴클레오티드(antisense nucleotide), 짧은 헤어핀 RNA(small hairpin RNA, shRNA), 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA), 리보자임(ribozyme), 및 유전자 가위(CRISPR/Cas-9)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 암 치료 또는 암 전이 억제용 후보 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.:

(1) αTAT1 유전자의 발현 세포주에 시험물질을 처리하는 단계;

(2) 상기 세포주에서 αTAT1 유전자의 발현 정도를 측정하는 단계; 및

(3) 상기 αTAT1 유전자의 발현 정도가 시험물질을 처리하지 않은 대조군(대장암 세포주 HCT116)에 비해 감소한 시험물질을 선별하는 단계.

본 발명의 일 구현예로, 상기 암은 대장암, 유방암, 또는 흑색종인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 단계 (2)에서, 상기 αTAT1 유전자 발현 정도는 면역침강법(immunoprecipitation), 전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase chain Reaction, RT-PCR), 효소면역분석법(ELISA), 면역세포화학(Immunocytochemistry), 웨스턴 블랏(Western Blotting), 및 유세포 분석법(FACS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법으로 측정하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 상기 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료 또는 암 전이 억제 방법을 제공한다.

본 발명은 αTAT1 유전자의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물의 암 치료 또는 암 전이 억제 용도를 제공한다.

본 발명에 따르면, Wnt1/β-catenin 신호전달 경로를 조절하는 αTAT1은 암 세포주에서 특이적으로 현저하게 과발현되며, αTAT1 유전자의 발현 억제에 의해 악성 종양 세포주의 이동성, 침투성 및 전이 관련 유전자의 발현이 저해됨을 알 수 있다. 따라서, αTAT1 유전자의 발현 억제제는 암세포의 치료 또는 전이 억제용 약물로 개발될 수 있을 것으로 기대되며, 또한, 본 발명은 암전이 억제 또는 암 치료제 후보 약물의 스크리닝 방법으로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1a는 MERAV 데이터베이스를 사용하여 정상 및 암 조직에서 ATAT1 및 HDAC6 발현의 분석을 나타낸 것이다.
도 1b는 CRISPR / Cas9 시스템의 가이드 RNA에 의해 인식되는 ATAT1의 표적 서열을 나타내는 개략도를 나타낸 것이다.
도 1c는 αTAT1 KO 세포 용해물을 항-아세틸화 α-튜불린 및 항-탈티로신화(anti-detyrosinated) α- 튜브린 항체를 사용하여 면역블로팅(immunoblotting)을 한 결과를 나타낸 것이다.
도 1d는 아세틸화 α-튜불린과 HCT116 야생형 및 αTAT1 KO 세포주에서 α-튜불린의 면역 염색을 나타낸 것이다.
도 1e는 αTAT1 KO 세포주의 증식을 MTT 분석으로 조사한 것이다.
도 2a는 Matrigel-coated 트렌스웰 분석 방법으로 αTAT1 KO 세포의 침투 정도를 48 시간 동안 검사한 결과를 나타낸 것으로, 왼쪽 패널은 침입한 세포의 대표 이미지, 오른쪽 패널은 cells/photographic flied 당 침입한 수의 평균을 도시한 것이다.
도 2b는 αTAT1 KO 세포를 GFP 또는 GFP-αTAT1을 24시간동안 일시적으로 감염시켜 아세틸화 α-튜블린으로 면역 형광 염색 시킨 것의 결과(적색)를 나타낸 것이다.
도 2c는 Matrigel-coated 트렌스웰 분석 방법으로 GFP가 태그된 대조군(대장암 세포주 HCT116), GFP가 태그된 αTAT1 KO 세포 또는 GFP-αTAT1이 태그된 αTAT1 KO 세포의 침투 분석 결과로, 왼쪽 패널은 침투한 대표 이미지, 오른쪽 패널은 사진 필드 당 침투한 세포의 평균을 나타낸 것이다.
도 2d는 GFP, GFP-K40Q 또는 GFP-K40A가 태그된 αTAT1 KO 세포의 침투 정도를 데이터로 정량화한 것이다.
도 3a는 HCT116 및 MDA-MB-231 (MDA-231) αTAT1 KO 세포 용해물을 항 아세틸화 α-튜불린 및 항-α-튜불린 항체를 사용하여 면역블롯팅한 결과이다.
도 3b는 HCT116 와 MDA-231 αTAT1 KO 세포에서 WNT1 및 WNT2의 발현 정도를 RT-PCR로 분석한 것이다.
도 3c 및 도 3d는 CCND1, MMP2 및 MMP9를 지시자로서 다양한 플라스미드를 일시적으로 감염시켜 야생형과 αTAT1 KO 세포에서 발현 정도를 RT-PCR로 분석한 결과이다.
도 3e는 αTAT1 KO 세포에서 β-catenin 및 액틴(actin)에 대한 면역염색(immunostaining) 결과이다.
도 3f는 상부 패널의 경우, 세포질 및 막 분획에서 β-catenin의 수준을 웨스턴블랏 분석 방법으로 측정하여 나타낸 것으로, 각 분획은 전체 세포 용해물(W), 세포질 분획(C) 및 막 분획(M)으로 표시하였고, 하부 패널의 경우, Imagej software로 β-catenin의 상대적인 배율을 표시한 것이다.
도 4a는 재조합 Wnt1 단백질로 처리 된 αTAT1 KO 세포에서 CCND1, MMP2 및 MMP9의 발현 정도를 RT-PCR 분석 결과이다.
도 4b는 αTAT1 KO 세포에 Wnt1 단백질을 첨가하여 트렌스웰 분석한 결과로, 상부 패널은 침투한 세포의 대표도를 나타낸 것이고, 하부 패널은 5개 그룹에서 침투한 세포의 수를 측정한 것이다.
도 4c는 컨플루언트(confluent) 세포층을 표시된 시간 동안 0.025% 트립신/EDTA 용액으로 처리 한 결과이다.
도 4d는 도 4c에 기술 된 것과 동일한 조건하에 제조 된 세포 용해물을 웨스턴블랏 분석을 통하여하여 인테그린(integrin)의 다운 스트림 효과기인 pMLC의 수준을 분석한 결과이다.
도 4e는 국소접착(focal adhesion) 구조를 고정 및 항-vinculin 항체로 염색한 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 αTAT1 유전자 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는, 암 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 "암(cancer)"은 세포가 정상적인 성장 한계를 무시하고 분열 및 성장하는 공격적(aggressive) 특성, 주위 조직에 침투하는 침투적(invasive) 특성 및 체내의 다른 부위로 퍼지는 전이적(metastatic) 특성을 갖는 세포에 의한 질병을 총칭하는 의미이다.

본 발명에서 사용되는 암의 종류에는 제한이 없으나, 대장암, 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 비소세포성폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구 내 흑색종, 자궁암, 난소암, 소장암, 직장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종, 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 바람직하게는 대장암, 유방암, 또는 흑색종일 수 있다.

본 발명에서 상기 αTAT1 유전자의 발현 억제제는 암세포의 증식 및 침투성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다(실시예 2 및 실시예 3 참조).

본 발명에서 상기 αTAT1 유전자의 발현 억제제는 WNT1, CCND1, MMP2, 및 MMP9으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다(실시예 4 참조).

본 발명에서 상기 αTAT1 유전자의 발현 억제제는 인테그린에 의존적이나, β-catenin 독립적인 것을 특징으로 하는, 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다(실시예 5 참조).

본 발명에서 상기 αTAT1 유전자의 발현 억제제는 αTAT1 유전자의 mRNA와 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 짧은 헤어핀 RNA(small hairpin RNA, shRNA), 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA), 및 리보자임(ribozyme)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 αTAT1 유전자를 이용한, 암 치료 또는 암 전이 억제용 후보 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

구체적으로, 상기 방법은 (1) αTAT1 유전자의 발현 세포주에 시험물질을 처리하는 단계; (2) 상기 세포주에서 αTAT1 유전자의 발현 정도를 측정하는 단계; 및 (3) 상기 αTAT1 유전자의 발현 정도가 시험물질을 처리하지 않은 대조군(대장암 세포주 HCT116)에 비해 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 (2)의 유전자 발현 정도는 면역침강법(immunoprecipitation), 전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase chain Reaction, RT-PCR), 효소면역분석법(ELISA), 면역세포화학(Immunocytochemistry), 웨스턴 블랏(Western Blotting), 및 유세포 분석법(FACS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법으로 측정하는 것이 바람직하나, 당업자에게 알려진 유전자 또는 전사체의 양을 측정하는 모든 방법을 사용할 수 있다.

본 발명자들은 αTAT1 유전자 발현 조절을 통해 암 치료 또는 암 전이에 대하여 연구하던 중, 안정된 αTAT1 KO 세포주를 생성하였고(실시예 1-2 참조), αTAT1 유전자가 암의 증식과 전이에 관련이 있는지 그 연관성을 규명하고자 하였다.

우선, 본 발명의 일실시예에서는, αTAT1 KO 세포주의 증식을 MTT 분석을 수행하여 확인하였고, 570nm에서 흡광도 측정을 통해 αTAT1 KO 세포주 및 대조군(대장암 세포주 HCT116) 세포의 증식을 확인하였다(실시예 2 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, αTAT1 KO 세포주의 침투성을 Matrigel-coated 트랜스웰 시스템을 수행하여 확인하였고, αTAT1 KO 세포주 및 대조군의 침투성은 GFP 형광을 통해 확인하였다(실시예 3 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, αTAT1 유전자가 β-catenin의 위치를 바꿈으로서 WNT1 발현을 조절하는지 여부를 확인하였고(실시예 4 참조), 외인성 Wnt1 단백질의 β-catenin 독립적 경로를 통한 αTAT1 KO 세포의 세포 부착 및 침투성을 회복하는지 여부를 확인하였다(실시예 5 참조).

상기로부터, αTAT1 유전자의 발현을 억제시킴으로써, 암세포의 증식 및 침투성을 감소시킴을 확인하였다. 따라서, αTAT1 유전자의 발현 억제제에 의한 암세포 증식 및 전이억제가 기대되며, 본 발명은 αTAT1 유전자의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는, 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 약학적 조성물은 αTAT1 유전자의 발현 또는 활성 억제제와 함께 항암 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 더 포함할 수 있다.

본 발명의 αTAT1 유전자의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 유효성분을 0.0001 내지 50 중량%로 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 피하, 정맥, 근육, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 약학적 조성물을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료 방법 또는 암 전이 억제 방법을 제공한다.

본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.

상기 조성물은 암세포의 증식, 이동, 침투 또는 전이의 저해 활성을 가질 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험준비 및 실험방법

1-1. 세포 배양

인간의 대장암 세포주 HCT116과 인간의 유방암 세포주 MDA-MB-231은 한국의 세포주 은행에서 구매하였으며, HCT116과 MDA-MB-231은 10%(v/v) 소 태아 혈청 (FBS; Young in Frontier), 100 units/ml 페니실린(penicillin)과 100 ㎍/ml 스트렙토마이신(streptomycin)을 첨가한 Roswell Park Memorial Institute 1640 배지(RPMI1640; Gibco-BRL, Grand Island, NY)에서, 5% CO₂, 37℃의 습한 환경에서 배양하였다.

1-2. 안정된 αTAT1 knockout 세포주 생성

ATAT1의 다섯번째 엑손(exon)내의 DNA를 표적으로 삼는 20-bp의 유도 서열(guide sequence)(5’-CATGAGTCTGTGCAACGCCA-3’)은 인간의 엑솜(exome)에서 고특이성 PAM (protospacer adjacent motif)으로 예측된 표적 위치를 공공 데이터베이스를 통하여 선택하였고, ATAT1 유도 서열 및 BsmBI (NEB, Beverly, Ma) 라이게이션 어뎁터(ligation adaptor)를 포함하는 2개의 상보적 올리고(oligo)를 합성하였으며, 각각의 올리고는 T4 polynucleotide kinase (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)를 사용하여 인산화 및 어닐링(annealing)하였다. 어닐링 된 올리고를 BsmBI-digested lentiCRISPRv2 벡터에 결착하였고 상기 벡터의 서열은 DNA 시퀀싱(DNA sequencing)을 통해 확인하였다. HCT116 및 MDA-MB-231 세포를 70-80 % 컨플루언스(confluence)로 6-웰 플레이트에 시딩(seeding)하였으며, lentiCRISPRv2 또는 lentiCRISPRv2-gRNA construct를 polyethylenimine (PEI)으로 24시간 동안 형질 전환시켜 세포에 도입하였고, 250ng/ml 퓨로마이신 (puromycin, Sigma-Aldrich)에서 2주 동안 배양하여 안정한 세포주를 선발하였다.

1-3. 세포 증식 분석 (Cell proliferation assay)

세포 증식 속도는 MTT [3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-ml)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide]분석으로 측정하였다. 구체적으로 약 2×10³cells/well을 96-웰 배양 플레이트에서 3중(triplicate)으로 시딩하고 24시간 동안 부착시킨 후 2일, 4일 및 6일 동안 세포 배양하였고, MTT (1mg/ml) 용액 10㎕를 각 웰에 200㎕의 배지에 첨가하였다. MTT 대사를 위해 세포를 2시간 동안 추가로 배양한 후, 배지를 흡인하고, 100㎕의 DMSO를 웰에 첨가하여 자주색 포르마잔(formazan) 결정을 용해하고, 플레이트 판독기로 570nm에서 흡광도를 측정하였다.

1-4. 세포 침투성 분석 (Cell invasion assay)

세포 침투의 효과를 보기 위하여 트렌스웰 (8㎛ 기공 크기의 24-웰 트렌스웰 플레이트; Costar, Corning, NY, USA)을 10㎍/ml Matrigel(BD Bioscience, Bedford, MA, USA)로 코팅한 후 200㎕의 세포 현탁액 (2×10⁵cells/ml)에 100ng/ml의 Wnt1 재조합 단백질(Peprotech, Rocky Hill, NJ)이 있는 무혈청배지(serum free medium)와 상기 Wnt1 재조합 단백질이 없는 무혈청배지(serum free medium)를 상부 챔버에 시딩하였다. GFP가 태그된 대조군 HCT116, GFP가 태그된 αTAT1 KO 세포, GFP-αTAT1이 태그된 αTAT1 KO 세포, acetyl-mimic α-tubulin (K40Q) 돌연변이가 태그된 αTAT1 KO 세포 또는 acetyl null α-tubulin (K40A) 돌연변이가 태그된 αTAT1 KO 세포를 상부 챔버 무혈청배지(serum free medium)에 시딩하고, 하부 챔버에는 20% FBS를 부가한 RPMI를 주입하였다. 48시간 후, 세포를 메탄올로 고정시키고 0.1% crystal violet으로 염색하였다. 비침투세포를 면봉으로 제거한 후 침투세포 숫자를 최소 5개의 임의장(random field)에서 집계하여 수치화하였다.

1-5. 트립신 기반 세포 분리 분석 ( Trypsin based cell detachment assays)

1.5×10⁵cells/well 세포를 48-웰 플레이트에 시딩하여 Wnt1 재조합 단백질(50ng/ml)이 있는 조건 또는 Wnt1 재조합 단백질이 없는 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 배양의 마지막 순서에 세포를 0.025% trypsin/EDTA 용액에서 0-4분 동안 배양하고 비부착세포(Non-adherent cell)는 PBS로 세척하여 제거하고, 부착세포(Adherent cell)는 3.7% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정한 다음, 20% (v/v) 메탄올에서 0.5% crystal로 염색하였다. 2% SDS를 첨가하여 세포에서 염료를 제거하고, 550nm에서 흡광도를 측정하였다.

1-6. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT- PCR )

총 RNA는 RNAiso Plus (TaKaRa)을 사용하여 수득하였고, cDNA 합성은 M-MLV (M. Biotech, Seoul, Korea) 역전사효소를 통해 준비하였으며, RT-PCR은 Ex-Taq DNA 중합 효소(TaKaRa)를 사용하여 표 1에 열거된 프라이머로 수행하였다. 밴드 밀도는 Quantity One 시스템(Bio-Rad)을 사용하여 분석하였다.

이 연구에서 사용하는 RT-PCR 프라이머
	Forward (5' to 3')	Reverse (5' to 3')
WNT1	CGGCGTTTATCTTCGCTATC	GGGCGATTTCTCGAAGTAGA
WNT2	GGTGATGTGCGATAATGTGC	TGGCACTTGCACTCTTGTTT
CCND1	CGTGGCCTCTAAGATGAAGG	TCCTCCTCTTCCTCCTCCTC
MMP2	GGCCCTGTCACTCCTGAGAT	GGCATCCAGGTTATCGGGGA
MMP9	CCGGACCAAGGATACAGTTT	CCATTCACGTCGTCCTTATG
CTNNB1	GGTCCGCATGGAAGAAATAG	CTGGCCATATCCACCAGAGT

1-7. 웨스턴블랏분석 (Western blot analysis)

세포를 용해 버퍼(lysis buffer) [105mM NaCl, 6mM Na₂HPO₄, 4mM NaH₂PO₄, 2mM EDTA, 1% sodium deoxycholate, 1% NP-40, 50mM NaF, 2% sodium dodecyl sulfate (SDS), 1mM Na₃VO₄, and 10mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)]에서 균질화한 후 샘플을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)하고 polyvinylidene difluoride (PVDF) 막(Millipore, Bedford, MA, USA)으로 옮긴 다음, 항-αTAT 항체 (1차 항체)와 배양한 다음, HRP가 결합된 항-IgG 항체(2차 항체)와 함께 배양하였다.

1-8, 면역세포화학 ( Immunocytochemistry )

세포를 50㎍/ml Type Ⅰ 콜라겐(collagen)이 도말된 12mm 커버슬립에 시딩하고 아세틸화 튜불린 면역형광법(immunofluorescence)을 위하여 20℃에서 메탄올을 이용하여 10분간 고정 시킨 후 0.5% Triton X-100 PBS에 10분간 세척하여 샘플을 얻었다. 상기 샘플을 Alexa Fluor 488-phalloidin (Life Technologies)에 따라 항-αTubulin 항체(1차 항체)로 염색한 후 Fluoromount-G (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL)와 함께 유리 슬라이드에 올렸다.

1-9. 통계적 분석

그룹 간 차이는 GraphPad PRISM 소프트웨어 (Graphpad Software, San Diego, CA, USA)를 사용하여 students t-test를 이용하여 수행하였고, 데이터는 세 번의 독립적인 실험을 거쳐 평균 ± SEM(standard error of the mean)으로 표현하였다. P value가 0.05 이하일 때 유의한 수준의 차이로 판단하였다.

실시예 2. 대장암세포의 증식을 조절하는 ATAT1의 발현 증가 확인

대장암 세포주 HCT116에서 ATAT1및 HDAC6 유전자의 활성을 알아보기 위해 Metabolic gEne Rapid Visualizer (MERAV) 소프트웨어를 활용하였다. 실시예 1-1에 따라, 대장암 세포주 HCT116는 0%(v/v) 소 태아 혈청 (FBS; Young in Frontier), 100 units/ml 페니실린(penicillin)과 100 ㎍/ml 스트렙토마이신(streptomycin)을 첨가한 Roswell Park Memorial Institute 1640 배지(RPMI1640; Gibco-BRL, Grand Island, NY)에서, 5% CO₂, 37℃의 습한 환경에서 배양하였다.

그 결과, 도 1a에 나타난 바와 같이, 대장암 세포주 HCT116에서 HDAC6 유전자가 아닌 ATAT1 유전자의 발현만 증가하는 것을 확인하였다.

한편, 실시예 1-2의 방법에 따라 CRISPR/Cas9 시스템으로, 안정된 αTAT1 knockout 세포주를 생성하기 위해 실험하였다. 구체적으로, ATAT1 유도 서열 및 BsmBI (NEB, Beverly, Ma) 라이게이션 어뎁터(ligation adaptor)를 포함하는 2개의 상보적 올리고(oligo)를 T4 polynucleotide kinase (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)를 사용하여 인산화 및 어닐링하였고, 어닐링 된 올리고를 BsmBI-digested lentiCRISPRv2 벡터에 결착하였다. 대장암 세포주 HCT116을 70-80 % 컨플루언스로 6-웰 플레이트에 시딩(seeding)하여, lentiCRISPRv2 또는 lentiCRISPRv2-gRNA construct를 polyethylenimine (PEI)으로 24시간 동안 형질 전환시켜 세포에 도입한 후 DNA 시퀀싱을 통해 αTAT1 KO 세포의 서열을 확인하였다.

그 결과, 도 1b에 나타난 바와 같이, CRISPR/Cas9 시스템으로 생성한 αTAT1 KO 세포주의 클론이 #1 및 #2 두 가지임을 확인하였고, #1 및 #2클론 모두 표적 ATAT1 mRNA 시퀀스의 엑손 프레임시프트 돌연변이임을 확인하였다.

αTAT1 KO 세포에서 α-튜블린 아세틸화(α-tubulin acetylation), α-튜블린 탈티로신화(α-tubulin detyrosination) 및 미세 소관 네트워크가 온전한지 여부를 확인하기 위해 실시예 1-7의 웨스턴블랏 분석을 실시하였다. 구체적으로, 대조군, αTAT1 KO #1 세포 및 αTAT1 KO #2 세포에 대하여 면역블로팅하여 항-아세틸화-α-튜블린 항체(anti-acetylated α-tubulin antibody) 및 항-탈티로신화-α-튜블린 항체(anti-detyrosinated α-tubulin antibody)를 이용하여 α-튜블린 아세틸화 (α-tubulin acetylation) 및 α-튜블린 탈티로신화(α-tubulin detyrosination)을 검출하였다.

그 결과, 도 1c에 나타난 바와 같이, αTAT1 KO #1 세포 및 αTAT1 KO #2 세포에서 α-튜블린 아세틸화를 검출할 수 없었지만, α-튜블린 탈티로신화는 대조군과 비슷한 수준으로 남아있음을 확인하였다.

HCT116 세포의 증식에 대한 αTAT1 결손의 효과를 알아보기 위해 대조군, αTAT1 KO #1 세포 및 αTAT1 KO #2 세포의 아세틸화-α-튜블린(acetylated α-tubulin) 및 α-튜블린(α-tubulin)에 대한 면역염색 결과를 관찰하였다.

그 결과, 도 1d에 나타난 바와 같이, αTAT1 KO 세포에서 전반적인 미세 소관 네트워크 및 세포 형태가 정상임을 확인하였다. 이는, αTAT1의 결손이 내인성 미세 소관(endogenous microtubule) 구조에 영향을 주지 않는다는 것을 의미한다.

또한, αTAT1 KO 세포주의 증식을 MTT 분석으로 조사하였다. 대조군, αTAT1 KO #1 세포 및 αTAT1 KO #2 세포를 2일, 4일 및 6일간 배양하면서 570nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 1e에 나타난 바와 같이, αTAT1 KO #1 세포 및 αTAT1 KO #2 세포의 흡광도가 대조군과 비교하여 αTAT1 KO 세포 그룹에서 유의적으로 감소되었다 (p < 0.05). 이는, αTAT1 유전자의 발현 억제가 증식에 큰 영향을 준다는 점을 의미한다.

실시예 3. 아세틸 모방 α- 튜불린 (acetyl mimic α- tubulin ) 과발현 효과 확인

αTAT1 KO 세포의 침투성을 실시예 1-4의 Matrigel-coated 트랜스웰 시스템으로 측정하였다. 구체적으로, 트랜스웰을 10㎍/ml Matrigel(BD Bioscience, Bedford, MA, USA)로 코팅한 후 대조군, αTAT1 KO #1 세포 및 αTAT1 KO #2 세포 각각의 200㎕ 세포 현탁액에 100ng/ml의 Wnt1 재조합 단백질이 없는 무혈청배지(serum free medium)를 상부 챔버에 시딩하고, 하부 챔버에는 20% FBS를 부가한 RPMI를 주입하였다. 48시간 후, 세포를 메탄올로 고정시키고 0.1% crystal violet으로 염색하였다. 비침투세포를 면봉으로 제거한 후 침투세포 숫자를 최소 5개의 임의장에서 집계하여 수치화하였다.

그 결과, 도 2a에 나타난 바와 같이, 두 αTAT1 KO 세포 클론의 세포 침투성이 대조군과 비교하여 상당히 감소하였음을 확인하였다.

또한, αTAT1 KO 세포에 αTAT1 유전자 도입의 효과를 알아보기 위해 실시예 1-4의 Matrigel-coated 트렌스웰 시스템으로 측정하였다. 구체적으로, GFP가 태그된 대조군, GFP가 태그된 αTAT1 KO 세포 또는 GFP-αTAT1이 태그된 αTAT1 KO 세포는 상부 챔버 무혈청배지(serum free medium)에 시딩하고, 하부 챔버에는 20% FBS를 부가한 RPMI를 주입하였다. 48시간 후, 세포를 메탄올로 고정시키고 0.1% crystal violet으로 염색하였다. 비침투세포를 면봉으로 제거한 후 침투세포 숫자를 최소 5개의 임의장에서 집계하여 수치화하였다.

그 결과, 도 2b에서 나타난 바와 같이, GFP-αTAT1이 태그된 αTAT1 KO 세포에서 튜불린 아세틸화가 회복되었다.

또한, 도 2c에서 나타난 바와 같이, GFP가 태그된 αTAT1 KO 세포 또는 GFP-αTAT1이 태그된 αTAT1 KO 세포의 침투성을 측정하였더니, αTAT1의 이소성(ectopic) 발현으로 αTAT1 KO 세포의 침투성이 회복함을 확인하였다.

상기 αTAT1 과발현에 의한 침투성의 회복이 α-튜불린 아세틸화에 의해 일어남을 확인하기 위해 실시예 1-4의 Matrigel-coated 트렌스웰 시스템으로 측정하였다. GFP가 태그된 대조군, GFP가 태그된 αTAT1 KO 세포, acetyl-mimic α-tubulin (K40Q) 돌연변이가 태그된 αTAT1 KO 세포 또는 acetyl null α-tubulin (K40A) 돌연변이가 태그된 αTAT1 KO 세포는 상부 챔버 무혈청배지(serum free medium)에 시딩하였고, 하부 챔버에는 20% FBS를 부가한 RPMI를 주입하였다. 48시간 후, 세포를 메탄올로 고정시키고 0.1% crystal violet으로 염색하였다. 비침투세포를 면봉으로 제거한 후 침투세포 숫자를 최소 5개의 임의장에서 집계하여 수치화하였다.

그 결과, 도 2d에 나타난 바와 같이, GFP가 태그된 αTAT1 KO 세포, acetyl-mimic α-tubulin (K40Q) 돌연변이가 태그된 αTAT1 KO 세포 또는 acetyl null α-tubulin (K40A) 돌연변이가 태그된 αTAT1 KO 세포의 침투성을 측정하였더니, acetyl-mimic α-tubulin (K40Q)의 과발현에 의해 침투성이 회복한다는 것을 확인하였다. 이는, αTAT1 유전자의 과발현에 의해 조절되는 미세 소관 아세틸화가 대장암 세포 침투에 중요한 역할을 함을 의미한다.

실시예 4. αTAT1 유전자가 β- catenin의 위치를 바꿈으로서 WNT1 발현을 조절하는지 여부 확인

공격성 유방암 세포(aggressive breast cancer) MDA-MB-231 및 대장암 세포 HCT116에서 WNT1 유전자 발현이 감소하는지 확인하기 위해 실시예 1-7의 웨스턴블랏 분석을 실시하였다. 구체적으로, MDA-231 및 HCT116 αTAT1 KO 세포 용해물에 항 아세틸화 α-튜불린 및 항-α-튜불린 항체를 사용하여 면역블로팅 하였고, WNT1 및 WNT2의 발현은 실시예 1-6의 RT-PCR로 분석하였다.

그 결과, 도 3a 및 도 3b에 나타난 바와 같이, MDA-MB-231 αTAT1의 KO 세포는 HCT116 세포와 비슷한 수준으로 WNT1 유전자 발현을 하향 조절함을 확인하였다. 이는, 대장암 및 유방암 세포에서 αTAT1 유전자가 WNT1 유전자의 발현을 조절한다는 것을 의미한다.

αTAT1 KO 세포에서 감소된 WNT1 발현의 특이성을 확인하기 위해, Wnt 신호가 조절하는 다운스트림 유전자의 발현을 측정하였다. 구체적으로, 실시예 1-7의 웨스턴블랏 분석을 실시하였으며, 대조군과 αTAT1 KO 세포에서 WNT1, CCND1, MMP2, MMP9 및 GAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)의 발현을 RT-PCR로 분석하였다.

그 결과, 도 3c에 나타난 바와 같이, αTAT1 KO 세포는 Wnt 다운스트림 유전자의 발현을 억제하나, GFP-αTAT1의 과발현에 의해 WNT1, CCND1, MMP2, 및 MMP9으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 유전자의 발현이 완전히 회복하는 것을 확인하였다.

또한, 도 3d에 나타난 바와 같이, αTAT1 KO 세포에서 K40Q α-튜불린의 과발현이 Wnt1 다운스트림 유전자 발현을 유도한다는 것을 확인하였다.

따라서, 도 3c 및 3d에 나타난 결과를 종합하면, αTAT1이 미세 소관 아세틸화를 통해 WNT1의 발현을 조절함으로써 Wnt1 신호 전달을 조절한다는 것을 확인할 수 있다.

또한, 규범적(canonical) Wnt 경로에서, β-catenin이 Wnt 자극 후 세포막에서 핵으로 이동하는 세포 내 신호 변환기 역할을 하는지 알아보기 위해 실시예 1-8의 면역세포화학방법에 따라 대조군 및 αTAT1 KO 세포에서 β-catenin의 세포 내 위치를 확인하였다. 구체적으로, 대조군 및 αTAT1 KO 세포를 50㎍/ml 1형 콜라겐 코팅 12mm 커버슬립에 시딩하고 3.7% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)에서 15분간 고정 (또는 아세틸화 튜불린 면역형광법(immunofluorescence)은 20℃ 메탄올에서 10분간 고정)시키고 0.5% Triton X-100 PBS에 10분간 세척하여 샘플을 얻었다. 상기 샘플을 Alexa Fluor 488-phalloidin (Life Technologies)에 따라 1차 항체로 염색한 후 Fluoromount-G (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL)와 함께 유리 슬라이드에 올려 카메라로 촬영하였다.

그 결과, 도 3e에 나타난 바와 같이, 야생형(WT) 세포에서는 β-catenin이 원형질막과 핵에 분포하는 반면, αTAT1 KO 세포에서는 원형질막의 β-catenin이 감소하는 것을 확인하였다.

또한, 도 3f에 나타난 바와 같이, 막 분획 역시 원형질막에서 β-catenin이 유의적으로 감소한 것을 확인하였다(p < 0.05).

도 3e 및 도 3f에 나타난 결과를 종합하면, αTAT1 KO 세포에서 β-catenin의 비정상적인 세포 위치가 WNT1 및 다운스트림 유전자 발현의 억제를 초래함을 알 수 있다.

실시예 5. 외인성(exogenous) Wnt1 단백질의 β- catenin 독립적 경로를 통한 αTAT1 KO 세포의 세포 부착 및 세포 침투(cell adhension and invasion) 회복 확인

Wnt1이 αTAT1 매개 신호와 관련이 있다는 직접적인 증거를 얻기 위해, 외인성 Wnt1 재조합 단백질을 αTAT1 KO 세포에 첨가하여, 실시예 1-7의 웨스턴블랏 분석을 실시하여 Wnt/β-catenin 다운스트림 유전자의 발현을 평가하였다. 구체적으로, 웨스턴블랏 분석에 의해 대조군, αTAT1 KO 세포 및 Wnt1 재조합 단백질을 부가한 αTAT1 KO 세포에 대하여 CCND1, MMP2, MMP9 및 GAPDH 유전자의 발현 및 Matrigel-coated 트렌스웰 분석에 의해 대조군, αTAT1 KO 세포 및 Wnt1 재조합 단백질을 부가한 αTAT1 KO 세포의 침투성을 측정하였다.

그 결과, 도 4a에 나타난 바와 같이, αTAT KO 세포에서 Wnt 표적 유전자의 발현이 외인성 Wnt1에 의해 회복되지 않았다.

또한, 도 4b에 나타난 바와 같이, αTAT1 KO 세포의 침투성이 외인성 Wnt1에 의해 유의적으로 증가한 것을 확인하였다(p < 0.05). 이는 αTAT1 KO 세포에서 외인성 Wnt1에 반응하여 활성화 되는 또 다른 경로가 있음을 보여준다.

αTAT1 KO 세포에서 트립신/EDTA에 의해 유도된 세포 분리가 외인성 Wnt1에 의해 감소하는지 확인하기 위하여 실시예 １-５의 트립신 기반 세포 분리 분석을 실시하였다. 구체적으로, 1.5×10⁵cells/well의 대조군 및 αTAT1 KO 세포를 48-웰 플레이트에 시딩하여 재조합 Wnt1(50ng/ml)이 있는 조건 또는 없는 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 마지막에 세포를 0.025% trypsin/EDTA 용액에서 0-4분 동안 배양하고 비부착세포(non-adherent cell)는 PBS로 세척하여 제거한 후 부착세포(adherent cell)는 3.7% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정하였고, 20% (v/v) 메탄올에서 0.5% crystal로 염색하였다. 염료는 2% SDS를 첨가에 의해 세포에서 방출하였고, 염료 용액의 흡광도는 550nm에서 0, 1, 2, 3 및 4분마다 측정하였다.

그 결과, 도 4c에 나타난 바와 같이, αTAT1 KO 세포에서 트립신/EDTA에 의해 유도된 세포의 분리가 외인성 Wnt1에 의해 유의적으로 감소한 것을 확인하였다(p < 0.05).

또한, 외인성 Wnt1에 의해 αTAT1 KO 세포에서 트립신/EDTA에 의해 유도된 세포의 분리가 감소하는 것이 인테그린-중재 신호에 의존적인지 여부를 확인하기 위해, 실시예 1-7의 웨스턴블랏 분석을 통해 phosphorylated myosin light chain (pMLC)의 수준과 트립신 처치에 대한 국소접착 형성을 분석하였다. 구체적으로, 트립신을 각각 처리한 대조군, αTAT1 KO 세포 및 Wnt1 재조합 단백질을 부가한 αTAT1 KO 세포에서 pMLC, 아세틸화-α-튜블린 및 α-튜블린의 발현을 측정하였다.

그 결과, 도 4d에 나타난 바와 같이, 트립신 처리한 αTAT1 KO 세포에서는 pMLC가 하향 조절되나, Wnt1 재조합 단백질을 부가한 αTAT1 KO 세포에는 대조군만큼 pMLC의 수준이 유지됨을 확인하였다. 이로써, Wnt1이 αTAT1 KO 세포에서 인테그린 의존적 양성 시그널링을 활성화한다는 것을 알 수 있다.

Wnt1이 αTAT1 KO 세포에서 인테그린 신호 전달을 활성화시키는지 실시예 1-8의 면역세포화학방법에 의해 확인하였다. 구체적으로, 대조군, αTAT1 KO 세포 및 Wnt1 재조합 단백질을 부가한 αTAT1 KO 세포를 50㎍/ml 1형 콜라겐 코팅 12mm 커버슬립에 시딩하고 3.7% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)에서 15분간 고정 (또는 아세틸화 튜불린 면역형광법(immunofluorescence)은 20℃ 메탄올에서 10분간 고정)시키고 0.5% Triton X-100 PBS에 10분간 세척하여 샘플을 얻었다. 상기 샘플을 Alexa Fluor 488-phalloidin (Life Technologies)에 따라 1차 항체로 염색한 후 Fluoromount-G (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL)와 함께 유리 슬라이드에 올려 사진을 촬영하였다.

그 결과, 도 4e에 나타난 바와 같이, 대조군 및 Wnt1 재조합 단백질을 부가한 αTAT1 KO 세포에서 국소접착이 관측되었다. 따라서, Wnt1이 αTAT1 KO 세포에서 인테그린 신호 전달을 활성화한다는 것을 알 수 있다. 상기로부터, Wnt1 적용 후 αTAT1 KO HCT116 세포의 회복된 침투성은 인테그린에 대하여 의존적이나, β-catenin에 대하여는 독립적인 활성의 결과임을 확인하였다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

αTAT1(α-Tubulin acetyltransferase1) 유전자의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는, 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 αTAT1 유전자의 발현 억제제는 암세포의 증식 및 침투성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 αTAT1 유전자의 발현 억제제는 WNT1, CCND1(Cyclin D1), MMP2(matrix metalloproteinase2), 및 MMP9(matrix metalloproteinase9)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는, 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 αTAT1 유전자의 발현 억제제는 인테그린에 의존적이나, β-catenin 독립적인 것을 특징으로 하는, 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 암은 대장암, 유방암, 또는 흑색종인 것을 특징으로 하는, 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 αTAT1 유전자의 발현 억제제는 αTAT1 유전자의 mRNA와 상보적으로 결합하는 안티센스뉴클레오티드(antisense nucleotide), 짧은 헤어핀 RNA(small hairpin RNA, shRNA), 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA), 리보자임(ribozyme), 및 유전자 가위(CRISPR/Cas-9)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물.
하기 단계를 포함하는, 암 치료 또는 암 전이 억제용 후보 물질의 스크리닝 방법:
(1) αTAT1 유전자의 발현 세포주에 시험물질을 처리하는 단계;
(2) 상기 세포주에서 αTAT1 유전자의 발현 정도를 측정하는 단계; 및
(3) 상기 αTAT1 유전자의 발현 정도가 시험물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 시험물질을 선별하는 단계.
제 7항에 있어서, 상기 암은 대장암, 유방암, 또는 흑색종인 것을 특징으로 하는, 암 치료 또는 암 전이 억제용 후보 물질의 스크리닝 방법.
제 7항에 있어서, 상기 단계 (2)에서, 상기 αTAT1 유전자 발현 정도는 면역침강법(immunoprecipitation), 전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase chain Reaction, RT-PCR), 효소면역분석법(ELISA), 면역세포화학(Immunocytochemistry), 웨스턴 블랏(Western Blotting), 및 유세포 분석법(FACS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법으로 측정하는 것을 특징으로 하는, 암 치료 또는 암 전이 억제용 후보 물질의 스크리닝 방법.