KR20180106344A - Antibody-functionalization Method and Method for Manufacturing Nanoparticle-Antibody Conjugated Nano-platform - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to a method for functionalizing an antibody with high efficiency while maintaining bioactivation of the antibody, and a method for manufacturing a nanoparticle-antibody conjugated nano-platform, in which orientation of the antibody is controlled. According to the method for functionalizing an antibody, a disulfide group within an Fc domain of the antibody is only reduced to functionalize the antibody in a state that bioactivation of the antibody is maintained as it is, bind the antibody with nanoparticles with high coupling efficiency and control orientation of the antibody bound with the nanoparticles. In addition, the present invention couples the antibody to surface of the nanoparticles with excellent coupling efficiency to optimize the number of the antibodies and the nanoparticles needed for manufacturing the nanoplatform such that costs are saved, sensitivity of the manufactured nanoplatform is very high, and binding activity with a target molecule is excellent. Moreover, the present invention can measure the number of bound antibodies and target binding capability quantitatively and experimentally, can be properly applied to a high cost diagnosis and treatment, and can be easily commercialized like a diagnosis kit.

Description

항체 작용화 방법 및 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조 방법{Antibody-functionalization Method and Method for Manufacturing Nanoparticle-Antibody Conjugated Nano-platform}[0001] The present invention relates to a nanoparticle-antibody-conjugated nano-platform,

본 발명은 항체 작용화 방법 및 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 항체의 생체활성을 유지하면서도 높은 효율로 항체를 작용화하는 방법, 항체의 배향이 제어된 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조방법, 항체의 생체활성이 유지된 작용화된(functionalized) 항체, 및 항체의 배향이 제어된 나노입자-항체 결합 나노플랫폼에 관한 것이다.The present invention relates to an antibody functionalization method and a nanoparticle-antibody coupled nanoparticle preparation method, and more particularly to a method of functionalizing an antibody with high efficiency while maintaining the bioactivity of the antibody, Antibody-bound nanoparticle, a nanoparticle-antibody binding nanoparticle, a nanoparticle-antibody bound nanoparticle, a nanoparticle-antibody bound nanoparticle, a nanoparticle-antibody bound nanoparticle with controlled bioactivity,

항체는 높은 친화도(affinity), 특이성(specificity) 및 범용성으로 인하여, 면역분석법(immunoassays), 나노입자-표적화 분자 진단법(nanoparticle-targeted molecular diagnosis), 표적지향 약물전달(targeted drug delivery), 방사면역치료법(radioimmunotherapy) 등과 같은 진단 및 치료 분야에서 표적 잔기(targeting moiety)로서 널리 사용되어 왔다. Because of the high affinity, specificity and versatility of antibodies, immunoassays, nanoparticle-targeted molecular diagnosis, targeted drug delivery, radioimmunoassay And has been widely used as a targeting moiety in diagnostic and therapeutic applications such as radioimmunotherapy.

이들 분야에서 항체가 갖는 이점들을 살리기 위해서는, 항체를 나노입자와 같은 나노프로브와 결합시키는 것이 필수적이다. 그러나, 지금까지 알려진 대부분의 결합 방법들은 비균질성, 낮은 결합 효율 및 낮은 재현성 등과 같은 다양한 제한들로 인하여 활용되기 어려운 문제가 있었다. 특히, 항체가 고체 표면에 결합되는 경우, 결합된 항체의 배향(orientation)에 따라 움직임의 자유가 제한되고 이에 따라 항원 결합 부위의 접근성이 제한되기 때문에, 결합된 항체의 배향은 생체 표적의 탐지를 위한 중요한 요소이다. 결국, 항체를 이용하는 의학 분야에서 면역 센서의 민감성이나 표적화 치료의 효험은 항체 결합 방법에 의해 크게 영향을 받는다. 따라서 항체의 생체작용성을 보전하면서도 효율적으로 항체를 결합할 수 있는 항체 결합 방법을 개발하기 위한 노력이 계속되었다. In order to take advantage of the advantages of antibodies in these fields, it is essential to bind the antibody with nanoprobes such as nanoparticles. However, most binding methods known hitherto are difficult to utilize due to various limitations such as heterogeneity, low binding efficiency and low reproducibility. In particular, when the antibody is bound to a solid surface, the freedom of movement is limited by the orientation of the bound antibody, and thus the accessibility of the antigen binding site is limited, so that the orientation of the bound antibody is sufficient to detect biotarget It is an important factor for. Ultimately, in the medical field using antibodies, the sensitivity of the immune sensor or the efficacy of targeted treatment is greatly influenced by the antibody binding method. Therefore, efforts have been made to develop an antibody binding method capable of efficiently binding an antibody while preserving the bioactivity of the antibody.

한편, 나노입자(nanoparticle)는 입자 크기가 수 nm에서 수백 nm 크기의 범주에 속하는 입자를 말하는데, 다양한 작용기들을 함유할 수 있고 주어진 목적에 따라서 그들의 물리화학적 성질을 세밀하게 조정할 수 있기 때문에, 분자적 표적화제, 약물 전달 수단, 및 항체를 표면에 결합시키는 분자 이미징을 위한 콘트라스트 촉진제로서 사용되어 왔다. 나노입자를 이용한 의약학 분야에 있어서, 나노입자에 특이성을 부여하는 것은 특정 조직에 선택적으로 나노 입자를 운반하는 기술을 체내 적용할 수 있고, 조직염색학이나 세포결합분석 등 시험관 내 연구분야에도 유용하게 이용될 수 있다. 특히, 항체가 결합된 나노입자는 표적 분자에 대한 친화도 및 특이성 향상으로 인하여, 탐지, 독성시험, 및 원치 않는 축적으로 인한 암소음(background noise)에 사용되는 나노입자의 필요량을 줄이는 등의 상당한 이점을 갖는다. On the other hand, nanoparticles are particles whose particle size falls within the range of several nanometers to several hundreds of nanometers. Since they can contain various functional groups and can fine-tune their physicochemical properties according to a given purpose, Have been used as contrasting agents for targeting molecules, drug delivery vehicles, and molecular imaging to bind antibodies to the surface. In the field of medicine using nanoparticles, imparting specificity to nanoparticles can be applied to the body in which nanoparticles are selectively transported to specific tissues and useful in in vitro studies such as tissue dyeing and cell binding analysis Can be used. In particular, antibody-bound nanoparticles have a significant advantage, such as reduced sensitivity to nanoparticles used for background noise due to detection, toxicity testing, and unwanted accumulation, due to improved affinity and specificity for target molecules Respectively.

이와 같은 이점으로 인하여, 항체를 나노입자 표면 상에 결합시키기 위한 다양한 전략들이 개발되어 왔다. 통상적인 항체 결합 방법 중 하나는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 하이드로클로라이드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride; EDC) 및/또는 N-하이드록시설포숙신이미드(N-hydroxysulfosuccinimide; Sulfo-NHS)를 커플링 시약으로 사용하여 항체 내의 1차 아민 작용기를 이용하는 방법이다. 이 결합 방법은 나노입자와 항체 사이에 공유 아미드 결합을 형성함으로써 다양한 생물학적 조건에서 높은 안정성을 제공한다. 그러나, 1차 아민 작용기는 항체 내에서 무작위로 존재하기 때문에 1차 아민 작용기를 활용한 항체 결합 방법에 의해 고체 표면에 결합된 항체도 무작위로 배향되게 되어, 항원 결합 부위에 입체 장해가 발생하고, 결과적으로 선택적 결합능력이 약화되는 문제가 있었다. 더욱이, 상기 EDC/Sulfo-NHS 커플링 방법은 1 내지 20%의 항체만이 고체 표면과 결합하는 매우 저조한 커플링 효율을 나타내기 때문에, 선택적으로 추적가능한 나노입자를 제조하기 위한 비용이 많이 소요되며, 화학 반응 중에 항체의 부분적인 변성이 발생할 수 있어서 항원 결합 능력이 감소되는 문제 또한 존재하였다.These advantages have led to the development of various strategies for binding antibodies on the surface of nanoparticles. One of the common antibody binding methods is 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide hydrochloride (EDC) and / or N- It is a method using primary amine functional group in antibody by using N- hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS) as a coupling reagent. This binding method provides a high stability in a variety of biological conditions by forming a covalent amide bond between the nanoparticle and the antibody. However, since the primary amine functional group is randomly present in the antibody, the antibody bound to the solid surface is randomly oriented by the antibody binding method using the primary amine functional group, so that steric hindrance occurs at the antigen binding site, As a result, there is a problem that the selective coupling ability is weakened. Moreover, the EDC / Sulfo-NHS coupling method is costly to produce selectively traceable nanoparticles because only 1 to 20% of the antibodies exhibit very poor coupling efficiency with binding to the solid surface , Partial denaturation of the antibody may occur during the chemical reaction, and the antigen binding ability is also reduced.

이에 대한 대안으로서, 클릭 화학(click chemistry)이 항체를 나노입자와 결합시키기 위한 방법으로 제안되었다. 클릭 화학에 의한 항체-나노입자의 결합은 높은 결합 효율 및 재현성을 나타내고, 아자이드 및 알킨 작용기와의 우수한 반응 특이성을 나타내며, 트리아졸을 형성함으로써 서로 반응하기 때문에 체내 시스템에서 체내의 생물학적 물질을 간섭하지 않아 생체분자를 조사하는 것을 가능하게 한다. 특히, 클릭 반응은 Stain-promoted alkyne-azide cycloaddition (SPAAC) 반응을 사용하기 때문에 온화한 조건에서도 진행될 수 있어, 결합 반응 중에 발생할 수 있는 항체의 화학적 데미지를 최소화할 수 있다. 또한, 클릭 화학 기반의 항체 결합 방법의 적용 가능성은 형광, 세포 독소(cytotoxin), 및 방사성 핵종(radionuclide)과 같은 추가의 작용기들을 함유하는 다수의 클릭 화합물을 사용함으로서 쉽게 확장될 수 있다. 그러나, 통상의 클릭 화학 기반의 항체 결합 키트는 항체 내의 아민기를 이용하기 때문에, 결합된 항체의 배향을 조절할 수 없다는 문제가 여전히 남아 있었다.As an alternative to this, click chemistry has been proposed as a method for binding antibodies to nanoparticles. The binding of antibody-nanoparticles by click chemistry exhibits high binding efficiency and reproducibility, exhibits excellent reaction specificity with azide and alkyne functional groups, and reacts with each other by forming triazole, thereby interfering with biological substances in the body Thereby making it possible to irradiate biomolecules. In particular, since the click reaction utilizes the stain-promoted alkyne-azide cycloaddition (SPAAC) reaction, it can proceed under mild conditions, minimizing the chemical damage of the antibody that may occur during the binding reaction. In addition, the applicability of the click chemistry based antibody binding method can be easily extended by using multiple click compounds containing additional functional groups such as fluorescence, cytotoxin, and radionuclide. However, because the conventional click chemistry based antibody binding kits utilize amine groups in the antibody, there remains a problem that the orientation of the bound antibody can not be controlled.

또한, 지금까지 개발된 항체-나노입자 결합 방법으로는 단일 나노입자에 결합된 항체의 개수 및 결합된 항체의 표적 결합 능력을 정량적/실험적으로 결정할 수 없기 때문에, 항체 결합된 나노입자로 표지된 생물학적 분석의 결과를 적절하게 해석하는 것이 어려운 문제가 있었다. 비록 나노입자와 결합된 항체의 수를 정량적으로 측정하기 위한 다수의 노력들이 있어 왔지만, 결합된 항체의 항원 결합 능력의 평가를 위한 정량적/실험적 분석법은 여전히 충분하지 못하였다. In addition, since the antibody-nanoparticle binding method developed so far can not quantitatively / experimentally determine the number of antibodies bound to single nanoparticles and the target binding ability of the bound antibody, the antibody-bound nanoparticle- There is a problem that it is difficult to properly interpret the results of the analysis. Although there have been many efforts to quantitatively measure the number of antibodies bound to nanoparticles, quantitative / experimental assays for assessing the antigen binding ability of bound antibodies have still not been sufficient.

이와 같은 배경하에, 본 발명자들은 항체 고정화 방법과 항체와 나노입자를 결합한 나노플랫폼에 대한 문제점을 해결하고자 노력한 결과, 특정 환원 조건에서 항체를 환원시키고 작용기를 도입하는 경우, 항체의 생체활성이 유지되면서 높은 효율로 항체를 나노입자와 결합할 수 있고, 결합된 항체의 배향을 제어할 수 있으며, 나아가 결합된 항체의 개수 및 표적 결합 능력을 정량적으로 측정할 수 있다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.Under these circumstances, the present inventors have made efforts to solve the problems of the antibody immobilization method and the nanoparticle combining the antibody and the nanoparticles, and as a result, it has been found that when the antibody is reduced and the functional group is introduced under specific reducing conditions, The present inventors completed the present invention by confirming that the antibody can be bound to the nanoparticles with high efficiency, the orientation of the bound antibody can be controlled, and further the number of the bound antibodies and the target binding ability can be quantitatively measured.

본 발명의 목적은 항체의 생체활성을 유지하면서도 높은 효율로 항체를 작용화하는 방법을 제공하는 것이다. It is an object of the present invention to provide a method for functionalizing an antibody with high efficiency while maintaining the bioactivity of the antibody.

본 발명의 다른 목적은 항체의 배향이 제어된 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조방법을 제공하는 것이다. It is another object of the present invention to provide a method for producing a nanoparticle-antibody binding nano platform in which the orientation of the antibody is controlled.

본 발명의 또 다른 목적은 항체의 생체활성이 유지된 작용화된(functionalized) 항체를 제공하는 것이다. It is another object of the present invention to provide a functionalized antibody in which the bioactivity of the antibody is maintained.

본 발명의 또 다른 목적은 항체의 배향이 제어된 나노입자-항체 결합 나노플랫폼을 제공하는 것이다.It is yet another object of the present invention to provide a nanoparticle-antibody binding nano platform with controlled orientation of the antibody.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 양태는 환원제를 이용하여 항체의 Fc 도메인 내의 디설파이드(disulfide)기를 티올(thiol)기로 환원시키는 단계 및 상기 티올기에 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 A를 연결시키는 단계를 포함하는 항체 작용화(antibody-functionalization) 방법을 제공한다. One aspect of the present invention for achieving the above object is a method for reducing a disulfide group in an Fc domain of an antibody using a reducing agent to a thiol group and linking the thiol group with A of a compound represented by the following formula Functionalization method comprising the steps of:

[화학식1][Chemical Formula 1]

R-L-AR-L-A

상기 식에서, In this formula,

R은 C6~C30의 알켄기 또는 알킨기, 또는 아자이드기를 나타내고,R represents a C 6 to C 30 alkenyl group or an alkynyl group or an azide group,

L은 단일결합, C1~C18의 알킬기, 알켄기 또는 알킨기, -S-S- 및 (polyethylene glycol)n(n=1~6의 정수)로부터 선택되는 연결기를 나타내며,L represents a linking group selected from a single bond, a C 1 -C 18 alkyl group, an alkenyl group or an alkynyl group, -SS- and (polyethylene glycol) n (n = an integer of 1 to 6)

A는 말레이미드, SCN기, OCN기, 에폭사이드 및 C5~C12의 알킬할라이드로부터 선택되는 작용기를 나타낸다. A represents a functional group selected from maleimide, SCN group, OCN group, epoxide and C 5 to C 12 alkyl halide.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 환원제는 2-머캅토에탄올 또는 다이클로로-다이페닐-트리클로로에탄(dichloro-diphenyl-trichloroethane; DDT)인 것을 특징으로 할 수 있다. In one embodiment of the present invention, the reducing agent may be 2-mercaptoethanol or dichloro-diphenyl-trichloroethane (DDT).

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항체 및 환원제는 1:500 내지 1:2000의 몰비, 바람직하게는 1:500 내지 1:1000의 몰비로 사용되는 것을 특징으로 할 수 있다. In one embodiment of the present invention, the antibody and the reducing agent are used in a molar ratio of 1: 500 to 1: 2000, preferably 1: 500 to 1: 1000.

본 발명의 일 양태는, 상기 화학식 1의 R이 C6~C30의 알킨기인 것을 특징으로 하는 항체 작용화 방법을 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 알킨기는 사이클로옥틴(cyclooctyne)기인 것을 특징으로 할 수 있으며, 본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 사이클로옥틴기는

Figure pat00001
,
Figure pat00002
,
Figure pat00003
,
Figure pat00004
,
Figure pat00005
,
Figure pat00006
,
Figure pat00007
,
Figure pat00008
또는
Figure pat00009
인 것을 특징으로 할 수 있다. One aspect of the present invention provides an antibody functionalizing method, wherein R in the above formula (1) is an alkyne group of C 6 to C 30 . In the present invention, the alkyne group may be a cyclooctyne group. In a preferred embodiment of the present invention, the cyclooctyne group is
Figure pat00001
,
Figure pat00002
,
Figure pat00003
,
Figure pat00004
,
Figure pat00005
,
Figure pat00006
,
Figure pat00007
,
Figure pat00008
or
Figure pat00009
.

본 발명의 다른 양태는, 상기 화학식 1의 R이 아자이드기인 것을 특징으로 할 수 있다. In another aspect of the present invention, R in formula (1) may be an azide group.

본 발명의 일 양태는, 상기 화학식 1의 L이 (polyethylene glycol)4인 것을 특징으로 하는 항체 작용화 방법을 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 화학식 1의 A가 말레이미드기인 것을 특징으로 할 수 있다.One aspect of the present invention provides a method for functionalizing an antibody, wherein L in the formula (1) is polyethylene glycol 4 . In the present invention, it is preferable that A in the formula (1) is a maleimide group.

본 발명의 일 구현예는, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물이 아자-디벤조사이클로옥틴-말레이미드(aza-dibenzocyclooctyne-maleimide; ADIBO-Mal), 아자-디벤조사이클로옥틴-(폴리에틸렌글리콜)4-말레이미드(aza-dibenzocyclootyne-(polyethylene glycol)4-maleimide; ADIBO-PEG4-Mal), ADIBO-S-S-Mal, N3-Mal, N3-PEG4-Mal 및 N3-S-S-Mal로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 작용화 방법을 제공한다.In one embodiment of the present invention, the compound represented by Formula 1 is aza-dibenzocyclooctyne-maleimide (ADIBO-Mal), aza-dibenzocyclooctin- (polyethylene glycol) 4- Selected from aza-dibenzocyclo- tyne (polyethylene glycol) 4 -maleimide (ADIBO-PEG 4 -Mal), ADIBO-SS-Mal, N 3 -Mal, N 3 -PEG 4 -Mal and N 3 -SS-Mal ≪ RTI ID = 0.0 > a < / RTI >

본 발명에 있어서, 상기 항체는 힌지 부위가 살아있는 모든 항체에 대해서 적용가능하며, 바람직하게는 상기 항체가 IgG인 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the antibody is applicable to all antibodies in which the hinge region is live, and preferably, the antibody is IgG.

본 발명의 다른 양태는, 나노입자의 표면에 아자이드(N3) 작용기를 도입하는 단계; 및 상기 아자이드(N3) 작용기가 도입된 나노입자를 상술한 방법에 의해 작용화된 항체와 구리 촉매 없이 클릭 화학(Cu-free click chemistry) 반응시키는 단계를 포함하는 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조방법을 제공한다. In another aspect of the present invention, there is provided a method of preparing a nanoparticle comprising: introducing an azide (N 3 ) functional group onto a surface of a nanoparticle; And a step of reacting the nanoparticles with the azide (N 3 ) functional group by a Cu-free click chemistry reaction with an antibody functionalized by the method described above without a copper catalyst. Of the present invention.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 나노입자는 실리카 나노입자 또는 실리카-캡슐화된(silica-encapsulated) 나노입자인 것을 특징으로 할 수 있다. In one embodiment of the present invention, the nanoparticles may be silica nanoparticles or silica-encapsulated nanoparticles.

본 발명의 일 구현예는, 상기 아자이드 작용기를 도입하는 단계가 아자이드 작용기를 갖는 화합물을 나노입자 표면의 하이드록시기와 반응시켜 이루어지는 것을 특징으로 하는, 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 아자이드 작용기를 갖는 화합물은 에톡시실록산 말단을 갖는 것을 특징으로 할 수 있으며, 본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 아자이드 작용기를 갖는 화합물은 N-[3-(트리에톡시실릴)프로필]-2-아지도아세트아미드(N-[3-(triethoxysilyl)propyl]-2-azidoacetamide; NTPA)일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the step of introducing the azide functional group comprises reacting a compound having an azide functional group with a hydroxy group on the surface of the nanoparticle, wherein the nanoparticle- to provide. In the present invention, the compound having an azide functional group may be characterized by having an end of an ethoxysiloxane. In a preferred embodiment of the present invention, the compound having an azide functional group is N- [3- (tri Ethoxysilyl) propyl] -2-azidoacetamide (N- [3- (triethoxysilyl) propyl] -2-azidoacetamide; NTPA).

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 아자이드 작용기가 상기 화학식 1의 R과 구리 촉매 없이 클릭 화학(Cu-free click chemistry) 반응하는 것을 특징으로 할 수 있다. In one embodiment of the present invention, the azide functional group may be reacted with R in the formula (1) without a copper catalyst in a Cu-free click chemistry.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 실리카 나노입자, 양자점, 산화철(iron oxide), 업컨버전 나노입자(upconversion nanoparticle; UCNP), 표면 증감 라만 산란 나노프로브(surface enhanced Raman scattering nanoprobe; SERS Dot), 및 형광 SERS dot으로부터 선택될 수 있다.In one embodiment of the present invention, the nanoparticles include silica nanoparticles, quantum dots, iron oxide, upconversion nanoparticles (UCNP), surface enhanced Raman scattering nanoprobes (SERS Dot), and fluorescence SERS dot.

본 발명의 다른 양태는, 나노입자의 표면에 사이클로옥틴 작용기를 도입하는 단계; 및 상기 사이클로옥틴 작용기가 도입된 나노입자를 상술한 방법에 의해 작용화된 항체와 구리 촉매 없이 클릭 화학(Cu-free click chemistry) 반응시키는 단계를 포함하는 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조방법을 제공한다. Another aspect of the present invention is a method for preparing a nanoparticle comprising: introducing a cyclotooctane functional group to the surface of the nanoparticle; And a step of reacting the nanoparticles into which the cyclooctane functional group has been introduced by a Cu-free click chemistry without reacting with the antibody functionalized by the method described above. to provide.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 나노입자는 표면에 올레산(oleic acid) 작용기를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. In one embodiment of the present invention, the nanoparticles may be characterized in that they have an oleic acid functional group on their surface.

본 발명에서, 상기 사이클로옥틴 작용기를 도입하는 단계는 사이클로옥틴 작용기를 갖는 화합물을 나노입자 표면의 올레산 작용기와 반응시켜 이루어지는 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the step of introducing the cyclooctane functional group may be characterized by reacting a compound having a cyclooctane functional group with an oleic acid functional group on the surface of the nanoparticles.

상기 사이클로옥틴 작용기를 갖는 화합물은 소수성 말단을 갖는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 ADIBO-PEG4-C18 또는 ADIBO-PEG2000-DSPE인 것을 특징으로 할 수 있다. The compound having the cyclooctane functional group may be characterized in that it has a hydrophobic end and is preferably ADIBO-PEG 4 -C 18 or ADIBO-PEG 2000-DSPE.

본 발명에 있어서, 상기 사이클로옥틴 작용기는 상기 화학식 1의 R과 구리 촉매 없이 클릭 화학(Cu-free click chemistry) 반응하는 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the cyclooctane functional group may be reacted with R in the formula (1) without a copper catalyst by a Cu-free click chemistry.

본 발명의 또 다른 양태는, 항체의 Fc 도메인 내의 디설파이드기가 환원되어 생성된 티올기에 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 A가 연결된 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 작용화된 항체(functionalized antibody)를 제공한다. Another embodiment of the present invention provides a functionalized antibody characterized in that a disulfide group in the Fc domain of an antibody is reduced to have a structure in which the resulting thiol group has A linked to the compound represented by the formula 1 .

본 발명의 또 다른 하나의 양태는, 나노입자의 표면에 본 발명의 일 양태에 따른 작용화된 항체가 고정된 것을 특징으로 하는, 나노입자-항체 결합 나노플랫폼을 제공한다. Another aspect of the present invention provides a nanoparticle-antibody binding nano platform characterized in that the functionalized antibody according to one aspect of the present invention is immobilized on the surface of nanoparticles.

본 발명에 있어서, 상기 나노입자는 실리카-캡슐화된 나노입자인 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the nanoparticles may be silica-encapsulated nanoparticles.

본 발명의 일 구현예는, 상기 나노입자에 아미노산, 펩타이드, 단백질, 핵산, 비타민, 호르몬, 신경전달물질, 당, 킬레이트화제 및 형광염료로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 추가로 결합된 것을 특징으로 하는, 나노입자-항체 결합 나노플랫폼을 제공한다.One embodiment of the present invention is characterized in that the nanoparticles are further combined with at least one selected from the group consisting of amino acids, peptides, proteins, nucleic acids, vitamins, hormones, neurotransmitters, sugars, chelating agents and fluorescent dyes To provide a nanoparticle-antibody binding nano platform.

본 발명의 항체 작용화 방법은 항체의 Fc 도메인 내의 디설파이드기만을 환원시키기 때문에, 항체의 생체활성이 그대로 유지된 상태에서 항체를 작용화할 수 있고, 높은 결합 효율로 항체를 나노입자와 결합시킬 수 있으며, 나노입자와 결합된 항체의 배향을 제어하는 것이 가능하다. Since the antibody functionalization method of the present invention reduces only the disulfide group in the Fc domain of the antibody, the antibody can be functionalized while maintaining the biological activity of the antibody, and the antibody can be bound to the nanoparticle with high binding efficiency , It is possible to control the orientation of the antibody bound to the nanoparticles.

또한, 우수한 결합 효율로 항체가 나노입자의 표면에 결합되기 때문에, 나노플랫폼을 제조하기 위해 필요한 항체 및 나노입자의 수가 최적화되어 비용이 절감되고, 제조된 나노플랫폼의 민감성이 매우 높고, 표적 분자와의 결합 활성도 매우 우수하다. 나아가, 결합된 항체의 개수 및 표적 결합 능력을 정량적/실험적으로 측정하는 것이 가능하여, 고비용 진단 및 치료 용도에 적용하기에 적합하고, 진단 키트 등과 같이 상업화하는 것이 용이하다.In addition, since the antibody binds to the surface of the nanoparticles with excellent binding efficiency, the number of antibodies and nanoparticles necessary for manufacturing the nanoparticle is optimized, the cost is reduced, the sensitivity of the prepared nanoparticle is very high, Is very excellent. Further, it is possible to quantitatively / experimentally measure the number of the bound antibodies and the target binding ability, which is suitable for high-cost diagnostic and therapeutic applications, and is easy to commercialize such as a diagnostic kit and the like.

도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조 공정을 나타낸 것이다.
도 2는 온전한 전체 항체가 환원에 의해 생성될 수 있는 절편들을 나타낸다.
도 3는 실시예 1의 환원조건에 따라 환원된 항체를 나트륨 도데실설폰산염 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis; SDS-PAGE) 분석법으로 분석한 결과를 나타낸다.
도 4는 실시예 2의 환원조건에 따라 환원된 항체를 SDS-PAGE 분석법으로 분석한 결과를 나타낸다.
도 5a은 방사선 동위원소 64Cu가 표지된 NOTA-실리카 나노입자(SiNP)의 radio-ITLC-SG 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 5b는 방사선 동위원소 64Cu가 표지된 NOTA-항체의 radio-ITLC-SG 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 6a는 형광 항체를 클릭 화학에 의해 실리카 나노입자와 결합하는 과정을 도식화한 것이다.
도 6b는 ADIBO 결합된 형광 항체를 IVIS로 측정한 형광 이미지이다.
도 6c는 형광 신호를 이용하여 단일 실리카 나노입자 상에 결합된 항체의 수를 정량적으로 분석한 것이다.
도 7a는 형광 HER2 항원을 이용한 생물학적 정량 방법을 도식화한 것이다.
도 7b는 소혈청 알부민(BSA) 처리된 실리카 나노입자, EDC/NHS 커플링 방법으로 제조된 anti-HER2 항체 결합된 실리카 나노입자, 및 본 발명의 방법으로 제조된 anti-HER2 항체 결합된 실리카 나노입자의 형광 이미지를 나타낸다.
도 7c는 각 방법에 따라 포획된 형광 항원의 수를 나타낸다.
도 8a는 본 발명의 방법으로 제조된 anti-HER2-QD2 click에 의해 표적화된 암 세포의 형광 이미지를 나타낸다.
도 8b는 종래의 EDC/NHS 커플링에 의해 제조된 anti-HER2-QD2 EDC / NHS에 의해 표적화된 암 세포의 형광 이미지를 나타낸다.
도 8c는 항체가 결합되지 않은 소혈청 알부민(BSA) 처리된 QD2를 사용한 형광 이미지를 나타낸다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 다양한 나노입자와 결합된 항체의 SDS-PAGE 분석결과를 나타낸다.FIG. 1 shows a manufacturing process of a nanoparticle-antibody binding nano platform according to a preferred embodiment of the present invention.
Figure 2 shows fragments from which a whole whole antibody can be produced by reduction.
FIG. 3 shows the result of analysis of the antibody reduced according to the reducing conditions of Example 1 by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis.
FIG. 4 shows the results of SDS-PAGE analysis of antibodies reduced according to the reducing conditions of Example 2. FIG.
FIG. 5A shows the results of radio-ITLC-SG measurement of NOTA-silica nanoparticles (SiNP) labeled with 64 isotopes of radioisotope.
FIG. 5B shows the result of radio-ITLC-SG measurement of NOTA-antibody labeled with 64 isotopes of radioisotope.
FIG. 6A is a diagram illustrating a process of binding a fluorescent antibody to silica nanoparticles by click chemistry.
6B is a fluorescence image of an ADIBO-coupled fluorescent antibody measured by IVIS.
6C is a quantitative analysis of the number of antibodies bound on a single silica nanoparticle using a fluorescence signal.
Figure 7a is a schematic representation of a biological assay method using a fluorescent HER2 antigen.
FIG. 7B is a graph showing the results of immunoblot analysis of anti-HER2 antibody-bound silica nanoparticles prepared by bovine serum albumin (BSA) -treated silica nanoparticles, EDC / NHS coupling method, and anti-HER2 antibody- Fluorescence images of particles are shown.
Figure 7C shows the number of fluorescent antigens captured according to each method.
Figure 8a shows a fluorescent image of the tumor cells targeted by the anti-HER2-QD 2 click produced by the process of the present invention.
Figure 8b shows a fluorescent image of the tumor cells targeted by the anti-HER2-QD 2 EDC / NHS prepared by conventional EDC / NHS coupling.
FIG. 8C shows fluorescence images using QD 2 treated with bovine serum albumin (BSA) to which no antibody is bound.
Figure 9 shows SDS-PAGE analysis of antibodies bound to various nanoparticles according to an embodiment of the present invention.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져있고 통상적으로 사용되는 것이다.Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. In general, the nomenclature used herein is well known and commonly used in the art.

본 발명은 항체의 생체활성을 유지하면서도 높은 효율로 항체를 작용화하는 방법을 및 항체의 배향이 제어된 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조방법을 제공하는 것이다. The present invention provides a method for functionalizing an antibody with high efficiency while maintaining the bioactivity of the antibody, and a method for producing a nanoparticle-antibody binding nano platform in which the orientation of the antibody is controlled.

이와 같은 목적에서 본 발명은, 환원제를 이용하여 항체의 Fc 도메인 내의 디설파이드(disulfide)기를 티올(thiol)기로 환원시키는 단계; 및 상기 티올기에 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 A를 연결시키는 단계를 포함하는 항체 작용화 방법에 관한 것이다. For this purpose, the present invention relates to a method for reducing the disulfide group in the Fc domain of an antibody to a thiol group using a reducing agent; And linking A to a compound represented by the following formula (1) in the thiol group.

[화학식 1][Chemical Formula 1]

R-L-AR-L-A

상기 식에서, In this formula,

R은 C6~C30의 알켄기 또는 알킨기, 또는 아자이드기를 나타내고,R represents a C 6 to C 30 alkenyl group or an alkynyl group or an azide group,

L은 단일결합, C1~C18의 알킬기, 알켄기 또는 알킨기, -S-S- 및 (polyethylene glycol)n(n=1~6의 정수)로부터 선택되는 연결기를 나타내며,L represents a linking group selected from a single bond, a C 1 -C 18 alkyl group, an alkenyl group or an alkynyl group, -SS- and (polyethylene glycol) n (n = an integer of 1 to 6)

A는 말레이미드, SCN기, OCN기, 에폭사이드 및 C5~C12의 알킬할라이드로부터 선택되는 작용기를 나타낸다. A represents a functional group selected from maleimide, SCN group, OCN group, epoxide and C 5 to C 12 alkyl halide.

본 발명에 따른 항체 작용화 방법은, 종래 항체 내의 아민기를 사용하는 방법과는 달리, 항체의 Fc 도메인 내의 디설파이드기만을 환원시키고, 상기 디설파이드기가 환원된 티올기를 이용하여 항체를 작용화시키기 때문에, 항체의 생체활성이 전혀 저해되지 않고, 항체의 배향을 제어할 수 있으며, 항체를 나노입자와 결합시키는 경우 결합 효율이 매우 우수하고, 결합된 항체의 개수를 정량적으로 측정할 수 있다. Since the method of antibody functionalization according to the present invention reduces the disulfide group only in the Fc domain of the antibody and functionalizes the antibody using the thiol group reduced by the disulfide group, unlike the method using the amine group in the conventional antibody, The orientation of the antibody can be controlled and the binding efficiency of the antibody with the nanoparticles is excellent and the number of bound antibodies can be quantitatively measured.

본 발명에 있어서, 상기 항체는 힌지 부위가 살아있는 모든 항체에 대해서 적용가능하며, 바람직하게는 상기 항체가 IgG인 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the antibody is applicable to all antibodies in which the hinge region is live, and preferably, the antibody is IgG.

본 발명에 있어서, 항체의 Fc 도메인 내의 디설파이드기를 환원시키기 위해 사용되는 환원제는 2-머캅토에탄올 또는 다이클로로-다이페닐-트리클로로에탄(dichloro-diphenyl-trichloroethane; DDT)로부터 선택되는 것이 바람직하며, 특히, 2-머캅토에탄올을 환원제로서 사용하는 것이 바람직하다. In the present invention, the reducing agent used for reducing the disulfide group in the Fc domain of the antibody is preferably selected from 2-mercaptoethanol or dichloro-diphenyl-trichloroethane (DDT) In particular, it is preferable to use 2-mercaptoethanol as the reducing agent.

일반적으로 항체 내에 존재하는 디설파이드기를 환원시키는 경우, 도 2에 나타낸 바와 같이, 아래의 4가지 생성물이 생성될 수 있다: Generally, when reducing a disulfide group present in an antibody, the following four products can be produced, as shown in Figure 2:

- 부분적으로 환원된 온전한 전체 항체(분자량: 150 kD)- partially reduced total intact whole antibody (molecular weight: 150 kD)

- 반으로 쪼개진 절편(75 kD)- Half sectioned (75 kD)

- 중쇄(heavy chain)(50kD)- heavy chain (50 kD)

- 경쇄(light chain)(25kD)- light chain (25 kD)

이들 생성물 중에서, 부분적으로 환원된 온전한 전체 항체(150 kD) 및 반으로 쪼개진 절편(75 kD)만이 특정 표적과 결합가능한 생체-활성을 가지며, 중쇄 또는 경쇄로만 이루어진 절편은 생체 활성을 나타내지 않는다. 이러한 이유로, 항체의 생체작용성을 보전하기 위해서는, 항원-결합 부위 내의 디설파이드가 환원되지 않도록 환원조건을 최적화하는 것이 중요하다. Of these products, only partial reduced whole antibodies (150 kD) and half-cleaved fragments (75 kD) have bio-activity capable of binding to a particular target, and fragments consisting only of heavy or light chain do not exhibit bioactivity. For this reason, in order to preserve the bioactivity of the antibody, it is important to optimize the reducing conditions so that the disulfide in the antigen-binding site is not reduced.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 상기 항체의 환원 조건을 조절함으로써, 온전한 전체 항체 및 반으로 쪼개진 절편만을 생성하고, 중쇄 또는 경쇄 절편이 생성되지 않도록 하는 환원 조건을 확인하였다. In one specific embodiment of the present invention, reducing conditions of the antibody were controlled to produce only whole antibodies and half-cleaved fragments, and the reducing conditions to avoid generation of heavy or light chain fragments.

구체적으로, 상기 항체 및 환원제는 1:500 내지 1:2000의 몰비, 바람직하게는 1:500 내지 1:1000의 몰비로 사용되는 것이 항체의 Fc 도메인 내의 디설파이드기만을 환원시키기 위해 바람직하다. 항체 및 환원제를 1:500 내지 1:1000의 몰비로 사용하는 경우, 환원 이후에도 항체가 절반으로 쪼개지지 않고 전체-길이 항체의 형태를 유지할 수 있어 특히 바람직하다. 상기 항체 및 환원제를 1:2000 초과의 몰비로 사용하는 경우, 항체의 Fc 도메인과 Fab 도메인 사이의 디설파이드기가 환원되어 항체가 중쇄(heavy chain) 절편 및 경쇄(light chain) 절편까지 쪼개지게 되어, 항체의 생체 활성을 잃게 된다.Specifically, the antibody and the reducing agent are preferably used in a molar ratio of 1: 500 to 1: 2000, preferably 1: 500 to 1: 1000, to reduce only the disulfide group in the Fc domain of the antibody. When the antibody and the reducing agent are used in a molar ratio of 1: 500 to 1: 1000, the antibody may not be cleaved in half even after the reduction, and the form of the whole-length antibody can be maintained. When the antibody and the reducing agent are used at a molar ratio of more than 1: 2000, the disulfide group between the Fc domain and the Fab domain of the antibody is reduced so that the antibody is cleaved to the heavy chain fragment and the light chain fragment, Lt; / RTI >

본 발명의 일 양태에 있어서, 상기와 같이 Fc 도메인 내의 디설파이드기가 티올기로 환원된 항체에 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 연결함으로써, 항체를 작용화(functionalization)시킬 수 있다. In one embodiment of the present invention, the antibody can be functionalized by linking the compound represented by Formula 1 to an antibody in which a disulfide group in the Fc domain is reduced to a thiol group.

상기 화학식 1에서 식에서, R은 C6~C30의 알켄기 또는 알킨기, 또는 아자이드기를 나타내고, L은 단일결합, C1~C18의 알킬기, 알켄기 또는 알킨기, -S-S- 및 (polyethylene glycol)n(n=1~6의 정수)로부터 선택되는 연결기를 나타내며, A는 말레이미드, SCN기, OCN기, 에폭사이드 및 C5~C12의 알킬할라이드로부터 선택되는 작용기를 나타낸다. Wherein R represents a C 6 to C 30 alkenyl group or an alkynyl group or an azide group, L represents a single bond, a C 1 to C 18 alkyl group, an alkenyl group or an alkynyl group, -SS- and polyethylene glycol) n (n is an integer of 1 to 6), and A represents a functional group selected from maleimide, SCN group, OCN group, epoxide and C 5 to C 12 alkyl halide.

본 발명에 있어서, 상기 화학식 1의 R은 C6~C30의 알킨기인 것이 바람직하다. 상기 R을 C6~C30의 알킨기로 함으로써, 추후 나노입자와 항체를 결합하는 과정에서 나노입자에 작용화된 아자이드기와 클릭 화학(click chemistry) 반응에 의해 연결될 수 있다. In the present invention, it is preferable that R in the formula (1) is an alkyne group of C 6 to C 30 . The R may be linked to the azide group functionalized on the nanoparticles by a click chemistry reaction in the process of binding the nanoparticles to the antibody by making the R 6 to C 6 to C 30 alkyne groups.

이와 같은 관점에서, 상기 화학식 1의 R은 사이클로옥틴(cyclooctyne)기인 것이 바람직하다. 본 발명에서 사이클로옥틴기란 ring strain을 받고 있는 삼중결합을 포함하는 8원 지방족 고리를 말하며, 특히 구리 촉매 없는 클릭 화학(Cu-Free click chemistry)의 일종인 1,3-dipolar cycloaddition 반응에서 전자수용체(electron acceptor) 역할을 하여, triaza-5-membered ring을 만드는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 사이클로옥틴(Cyclooctyne)의 구조적 특징, 즉 ring strain을 받고 있는 삼중결합 구조로 인하여 Cu(I) 촉매 없이도 클릭 화학이 가능하다. From such a viewpoint, it is preferable that R in the above formula (1) is a cyclooctyne group. In the present invention, the term "cyclooctene group" refers to an 8-membered aliphatic ring containing a triple bond which undergoes a ring strain. Especially, in the 1,3-dipolar cycloaddition reaction, which is a kind of Cu- electron acceptor, and is known to function as a triaza-5-membered ring. Due to the structural features of Cyclooctyne, ie the triple bond structure under ring strain, click chemistry is possible without Cu (I) catalyst.

본 발명에 있어서, 사이클로옥틴기는 4-cyclooctyn-1-yl(

Figure pat00010
), 3-cyclooctyn-1-yl(
Figure pat00011
), 2-cyclooctyn-1-yl(
Figure pat00012
), Monofluorinated cyclooctyne(MOFO)(
Figure pat00013
), Difluororinated cyclooctyne(DIFO)(
Figure pat00014
), Dimethoxyazacyclooctyne(DIMAC)(
Figure pat00015
), Dibenzocyclooctyne(DIBO)(
Figure pat00016
), Azadibenzocyclooctyne(ADIBO)(
Figure pat00017
) 또는 Bizrylazacyclooctynone(BARAC)(
Figure pat00018
)일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 사이클로옥틴기는 ADIBO인 것이 클릭 화학 반응의 효율의 관점에서 바람직하다.In the present invention, the cyclooctane group is 4-cyclooctyn-1-yl (
Figure pat00010
), 3-cyclooctyn-1-yl (
Figure pat00011
), 2-cyclooctyn-1-yl (
Figure pat00012
), Monofluorinated cyclooctyne (MOFO) (
Figure pat00013
), Difluororinated cyclooctyne (DIFO) (
Figure pat00014
), Dimethoxyazacyclooctyne (DIMAC) (
Figure pat00015
), Dibenzocyclooctyne (DIBO) (
Figure pat00016
), Azadibenzocyclooctyne (ADIBO) (
Figure pat00017
) Or Bizrylazacyclooctynone (BARAC) (
Figure pat00018
). In one embodiment of the present invention, the cyclooctane group is preferably ADIBO in view of the efficiency of click chemistry.

본 발명에 있어서, 상기 화학식 1의 A는 항체의 Fc 도메인의 디설파이드기가 환원되어 형성된 티올기와 반응하여 연결되는 역할을 한다. 상기 A는 말레이미드, SCN기, OCN기, 에폭사이드 및 C5~C12의 알킬할라이드로부터 선택되는 작용기인 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 말레이미드기일 수 있다. A가 말레이미드기인 경우, 항체의 티올기가 말레이미드의 5원환의 이중결합을 구성하는 탄소와 연결되어, 항체를 고정화시킬 수 있다. In the present invention, A in the above formula (1) reacts with a thiol group formed by reducing the disulfide group of the Fc domain of the antibody. The A is preferably a functional group selected from maleimide, SCN group, OCN group, epoxide and C 5 -C 12 alkyl halide, and most preferably a maleimide group. When A is a maleimide group, the thiol group of the antibody is linked to the carbon constituting the double bond of the five-membered ring of the maleimide to immobilize the antibody .

본 발명에 있어서, 상기 화학식 1의 L은 클릭 화학 반응에 참여하는 R과 항체와 연결되는 A를 연결하는 연결기의 역할을 한다. 본 발명의 일 양태에서, 상기 L은 단일결합, C1~C18의 알킬기, 알켄기 또는 알킨기, -S-S- 및 (polyethylene glycol)n(n=1~6의 정수)로부터 선택되는 연결기일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 L은 (polyethylene glycol)4일 수 있다. L로서 PEG가 3개 이상 연결된 기를 사용하는 경우 비특이적 결합을 방지할 수 있다.In the present invention, L in the above formula (1) serves as a linking group connecting R bonded to the click chemistry and A connected to the antibody. In one aspect of the present invention, L is a linking group selected from a single bond, a C 1 -C 18 alkyl group, an alkenyl group or an alkynyl group, -SS-, and (polyethylene glycol) n (n is an integer of 1 to 6) . In the present invention, L may be polyethylene glycol 4 . Non-specific binding can be prevented when a group having three or more PEGs as L is used.

본 발명의 바람직한 일 실시예에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 아자-디벤조사이클로옥틴-말레이미드(aza-dibenzocyclooctyne-maleimide; ADIBO-Mal), 아자-디벤조사이클로옥틴-(폴리에틸렌글리콜)4-말레이미드(aza-dibenzocyclootyne-(polyethylene glycol)4-maleimide; ADIBO-PEG4-Mal), ADIBO-S-S-Mal, N3-Mal, N3-PEG4-Mal 및 N3-S-S-Mal로부터 선택될 수 있으며, 가장 바람직하게는 ADIBO-PEG4-Mal일 수 있다. In one preferred embodiment of the present invention, the compound represented by Formula 1 is aza-dibenzocyclooctyne-maleimide (ADIBO-Mal), aza-dibenzocyclooctin- (polyethylene glycol) 4-maleimide (aza-dibenzocyclootyne- (polyethylene glycol) 4 -maleimide; ADIBO-PEG 4 -Mal), ADIBO-SS-Mal, N 3 -Mal, N 3 -PEG 4 -Mal and N 3 -SS-Mal , And most preferably ADIBO-PEG 4 -Mal.

본 발명에서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 항체와 1:5 내지 1:20의 항체:화학식 1로 표시되는 화합물의 몰비로 도입되는 것이 가장 안정적으로 항체를 작용화시킬 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 항체와 ADIBO-PEG4-Mal을 1:10의 몰비로 반응시키는 경우 가장 안정적으로 ADIBO 작용화된 항체를 제조할 수 있다는 것을 확인하였다. In the present invention, the compound represented by Formula 1 is most stable when the antibody is introduced at a molar ratio of the antibody to the compound represented by Formula 1: 1: 5 to 1:20. In one embodiment of the present invention, it was confirmed that the ADIBO-functionalized antibody can be most stably produced when the antibody and ADIBO-PEG4-Mal are reacted at a molar ratio of 1:10.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 항체의 Fc 도메인 내의 디설파이드기가 환원되어 생성된 티올기에 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 A가 연결된 구조를 갖는 작용화된 항체(functionalized antibody)에 관한 것이다. In another embodiment, the present invention relates to a functionalized antibody having a structure in which a disulfide group in the Fc domain of an antibody is reduced to form a thiol group, wherein A of the compound represented by the following formula (1) is linked.

[화학식1][Chemical Formula 1]

R-L-AR-L-A

상기 식에서, R, L 및 A는 앞서 설명한 것과 동일한 기를 나타낸다. In the above formula, R, L and A represent the same groups as described above.

본 발명은 다른 양태에 있어서, 나노입자의 표면에 아자이드(N3) 작용기를 도입하는 단계; 및 상기 아자이드(N3) 작용기가 도입된 나노입자를 앞서 설명한 방법에 의해 작용화된 항체와 구리 촉매 없이 클릭 화학(Cu-free click chemistry) 반응시키는 단계를 포함하는 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조방법에 관한 것이다. In another aspect, the present invention provides a method for preparing nanoparticles, comprising: introducing an azide (N 3 ) functional group onto the surface of the nanoparticles; And a step of reacting the nanoparticles with the azide (N 3 ) functional group by a Cu-free click chemistry reaction with an antibody functionalized by the above-described method without using a copper catalyst. And a method for producing the same.

본 발명의 방법으로 작용화된 항체는 쪼개지지 않은 전체-길이 항체의 Fc 도메인이 작용화된 구조를 갖기 때문에, 항체의 생체 활성이 유지된 채로 나노입자와 결합하고, 결합시 항체의 배향을 제어할 수 있으며, 높은 효율로 나노입자와 결합할 수 있다.Since the antibody functionalized by the method of the present invention has a structure in which the Fc domain of the non-cleaved full-length antibody is functionalized, the antibody binds to the nanoparticles while maintaining the bioactivity of the antibody, and the orientation And can bind nanoparticles with high efficiency.

본 발명에 있어서, 아자이드(azide, N3)기란 질소 3개에 의해서 이루어진 반응기로, 높은 반응성을 가지며, 특히 Cu-Free click chemistry의 일종인 1,3-dipolar cycloaddition 반응에서 전자공여체(electron donor) 역할을 하여 triaza-5-membered ring을 만드는 역할을 하는 것으로 알려져 있다.In the present invention, the azide (N 3 ) group is a reactor made up of three nitrogen atoms and has a high reactivity. In particular, in the 1,3-dipolar cycloaddition reaction, which is a type of Cu-Free click chemistry, ) To act as a triaza-5-membered ring.

본 발명의 일 실시형태에서, 상기 나노입자는 실리카 나노입자 또는 실리카-캡슐화된(silica-encapslated) 나노입자인 것이 바람직하며, 이들 나노입자 표면의 하이드록시기를 아자이드 작용기를 갖는 화합물과 반응시켜, 아자이드 작용화된 나노입자를 제조할 수 있다. In one embodiment of the present invention, the nanoparticles are preferably silica nanoparticles or silica-encapsulated nanoparticles, and the hydroxy groups on the surface of these nanoparticles are reacted with a compound having an azide functional group, Lt; / RTI > functionalized nanoparticles can be prepared.

본 발명에 있어서, 상기 아자이드 작용기를 갖는 화합물은 에톡시실릴(ethoxysilyl) 말단을 갖는 것이 실리카 나노입자의 표면에서 하이드록시기와 반응하여 결합하기 위해 바람직하다. 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 아자이드 작용기를 갖는 화합물은 N-[3-(트리에톡시실릴)프로필]-2-아지도아세트아미드(N-[3-(triethoxysilyl)propyl]-2-azidoacetamide; NTPA)일 수 있다. In the present invention, the compound having an azide functional group is preferable because the compound having an ethoxysilyl terminal reacts with and reacts with a hydroxy group on the surface of the silica nanoparticle. In one embodiment of the present invention, the compound having an azide functional group is selected from N- [3- (triethoxysilyl) propyl] -2-azidacetamide (N- [3- (triethoxysilyl) propyl] -azidoacetamide (NTPA).

본 발명에 있어서, 나노입자의 표면에 아자이드 작용기를 도입하는 단계는 나노입자의 실리카 표면 상의 하이드록시기와 아자이드 작용기를 갖는 화합물의 에톡시실릴 말단의 실란 커플링에 의해 이루어질 수 있다.In the present invention, the step of introducing an azide functional group on the surface of the nanoparticles may be carried out by silane coupling of the ethoxysilyl end of the compound having a hydroxy group and an azide functional group on the surface of the silica of the nanoparticles.

이와 같이 아자이드 작용화된 나노입자를 앞서 설명한 방법에 의해 작용화된 항체와 실온에서 혼합함으로써, 나노입자-항체 결합 나노플랫폼을 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 작용화된 항체가 알킨 작용기를 포함하는 경우, 알킨 작용기와 아자이드 작용기 사이의 클릭 화학에 의해 항체와 나노입자를 결합시킬 수 있다. 특히, 본 발명의 바람직한 일 실시예에 있어서, ADIBO-작용화된 항체를 아자이드-작용화된 나노입자와 결합하는 경우, 하나의 ADIBO 분자 내에서 두 벤젠고리가 사이클로옥틴과 결합되어 있기 때문에, 아자이드 작용기와의 클릭 화학 반응이 높은 효율과 재현성으로 진행될 수 있다. Thus, nanoparticle-antibody coupled nanoparticles can be prepared by mixing the azide functionalized nanoparticles with the antibody functionalized by the method described above at room temperature. When the functionalized antibody according to the present invention comprises an alkyne functional group, the antibody and the nanoparticle can be bound by the click chemistry between the alkyne functional group and the azide functional group. In particular, in one preferred embodiment of the present invention, when the ADIBO-functionalized antibody is conjugated with the azide-functionalized nanoparticles, since two benzene rings are bound to the cyclooctane within one ADIBO molecule, The click chemistry with the azide functional group can proceed with high efficiency and reproducibility.

상기 작용화된 나노입자는 작용화된 항체와 10:1 내지 1000:1의 질량비, 바람직하게는 50:1 내지 200:1의 질량비로 혼합할 수 있다. The functionalized nanoparticles may be mixed with the functionalized antibody at a mass ratio of from 10: 1 to 1000: 1, preferably from 50: 1 to 200: 1.

도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조 공정을 나타낸 것이다. 도 1의 좌상단 그림은 실리카 캡슐화된 나노입자 표면의 하이드록시기와 NTPA의 에톡시실릴기가 실란 커플링에 의해 연결됨으로써, 아자이드-작용화된 실리카 나노입자를 형성하는 과정을 나타낸다. 도 1의 우상단 그림은 ADIBO-PEG4-Maleimide의 말레이미드 작용기가 항체의 Fc 도메인 내의 디설파이드기가 환원된 티올기와 결합하는 과정을 나타낸다. 이렇게 형성된 아자이드-작용화된 실리카 나노입자 및 ADIBO-작용화된 항체는 도 1의 중단의 그림에서 나타낸 바와 같이 아자이드기와 ADIBO의 클릭 화학으로 연결되게 되고, 최종적으로 도 1의 하단 그림에서 나타낸 바와 같은 형태의 나노입자-항체 결합 나노플랫폼이 제조되게 된다. FIG. 1 shows a manufacturing process of a nanoparticle-antibody binding nano platform according to a preferred embodiment of the present invention. 1 shows the process of forming the azide-functionalized silica nanoparticles by linking the hydroxyl group of the surface of the silica-encapsulated nanoparticles with the ethoxysilyl group of NTPA by silane coupling. 1 shows the process in which the maleimide functional group of ADIBO-PEG 4 -Maleimide binds to the reduced thiol group of the disulfide group in the Fc domain of the antibody. The thus formed azide-functionalized silica nanoparticles and the ADIBO-functionalized antibody are linked by the click chemistry of the azide group and the ADIBO as shown in the figure of the interruption of FIG. 1, Nanoparticle-antibody binding nano platforms of the type as shown in Fig.

본 발명에 따른 항체-나노입자 결합 방법은 실리카 표면을 갖는 나노입자라면 종류에 상관없이 쉽고 안정적으로 적용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 나노입자는 실리카 나노입자, 양자점, 산화철(iron oxide), 업컨버전 나노입자(upconversion nanoparticle; UCNP), 표면 증감 라만 산란 나노프로브(surface enhanced Raman scattering nanoprobe; SERS Dot), 및 형광 SERS dot으로부터 선택하여 사용할 수 있다. The antibody-nanoparticle binding method according to the present invention can be easily and stably applied to nanoparticles having a silica surface irrespective of kinds thereof. For example, the nanoparticles of the present invention include silica nanoparticles, quantum dots, iron oxides, upconversion nanoparticles (UCNP), surface enhanced Raman scattering nanoprobes (SERS Dot) And fluorescence SERS dot.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 나노입자의 표면에 작용화된 항체가 결합된 것을 특징으로 하는 나노입자-항체 결합 나노플랫폼에 관한 것이다. 상기 나노입자-항체 결합 나노플랫폼에 있어서, 상기 나노입자는 실리카-캡슐화된 나노입자인 것이 바람직하다. In another embodiment, the present invention relates to a nanoparticle-antibody binding nano platform characterized in that a functionalized antibody is bound to the surface of nanoparticles. In the nanoparticle-antibody binding nano platform, the nanoparticles are preferably silica-encapsulated nanoparticles.

본 발명은 또 다른 양태에 있어서, 나노입자의 표면에 사이클로옥틴 작용기를 도입하는 단계; 및 상기 사이클로옥틴 작용기가 도입된 나노입자를 앞서 설명한 방법에 의해 작용화된 항체와 구리 촉매 없이 클릭 화학(Cu-free click chemistry) 반응시키는 단계를 포함하는 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조방법에 관한 것이다. In another aspect, the present invention relates to a method of preparing a nanoparticle comprising: introducing a cyclotooctane functional group to the surface of the nanoparticle; And a step of reacting the nanoparticles with the cyclooctane functional group reacted with the antibody functionalized by the above-described method with a Cu-free click chemistry without a copper catalyst. .

본 발명의 방법으로 작용화된 항체는 쪼개지지 않은 전체-길이 항체의 Fc 도메인이 작용화된 구조를 갖기 때문에, 항체의 생체 활성이 유지된 채로 나노입자와 결합하고, 결합시 항체의 배향을 제어할 수 있으며, 높은 효율로 나노입자와 결합할 수 있다.Since the antibody functionalized by the method of the present invention has a structure in which the Fc domain of the non-cleaved full-length antibody is functionalized, the antibody binds to the nanoparticles while maintaining the bioactivity of the antibody, and the orientation And can bind nanoparticles with high efficiency.

본 발명에 있어서, 사이클로옥틴 작용기는 4-cyclooctyn-1-yl(

Figure pat00019
), 3-cyclooctyn-1-yl(
Figure pat00020
), 2-cyclooctyn-1-yl(
Figure pat00021
), Monofluorinated cyclooctyne(MOFO)(
Figure pat00022
), Difluororinated cyclooctyne(DIFO)(
Figure pat00023
), Dimethoxyazacyclooctyne(DIMAC)(
Figure pat00024
), Dibenzocyclooctyne(DIBO)(), Azadibenzocyclooctyne(ADIBO)(
Figure pat00026
) 또는 Bizrylazacyclooctynone(BARAC)(
Figure pat00027
)일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 사이클로옥틴기는 ADIBO인 것이 클릭 화학 반응의 효율의 관점에서 바람직하다.In the present invention, the cyclooctane functional group is 4-cyclooctyn-1-yl (
Figure pat00019
), 3-cyclooctyn-1-yl (
Figure pat00020
), 2-cyclooctyn-1-yl (
Figure pat00021
), Monofluorinated cyclooctyne (MOFO) (
Figure pat00022
), Difluororinated cyclooctyne (DIFO) (
Figure pat00023
), Dimethoxyazacyclooctyne (DIMAC) (
Figure pat00024
), Dibenzocyclooctyne (DIBO) ( ), Azadibenzocyclooctyne (ADIBO) (
Figure pat00026
) Or Bizrylazacyclooctynone (BARAC) (
Figure pat00027
). In one embodiment of the present invention, the cyclooctane group is preferably ADIBO in view of the efficiency of click chemistry.

본 발명에서, 나노입자의 표면에 사이클로옥틴 작용기를 도입하는 단계는 유기용매에 나노입자를 분산시키고, 사이클로옥틴기를 갖는 화합물을 혼합하여 수행할 수 있다. 이때, 상기 사이클로옥틴기를 갖는 화합물은 소수성 말단 작용기를 갖는 화합물이 바람직하다. 예를 들어, 상기 사이클로옥틴기를 갖는 화합물로서 ADIBO-PEG4-C18 또는 ADIBO-PEG2000-DSPE를 사용할 수 있다. 상기 C18은 탄소수 18개의 알킬기로서, 예를 들어 올레산기일 수 있다. 상기 PEG2000은 분자량 약 2000의 PEG를 의미하며, DSPE는 distearoyl phosphoethanolamine을 의미한다. In the present invention, the step of introducing the cyclotooctane functional group onto the surface of the nanoparticles can be carried out by dispersing the nanoparticles in an organic solvent and mixing the compound having a cyclooctane group. At this time, the compound having the cyclooctane group is preferably a compound having a hydrophobic terminal functional group. For example, ADIBO-PEG 4 -C 18 or ADIBO-PEG 2000-DSPE may be used as the compound having the cyclooctane group. The C 18 is an alkyl group having 18 carbon atoms, and may be, for example, an oleic acid group. PEG2000 means a PEG having a molecular weight of about 2000, and DSPE means distearoyl phosphoethanolamine.

본 발명에서 나노입자는 올레산(oleic acid) 작용기를 갖는 것이 바람직하다. 구체적으로, 유기용매에 나노입자와 사이클로옥틴기를 갖는 화합물을 혼합하고, 초음파을 이용하여 분산시키면, 나노입자 표면의 올레산의 소수성 사슬과 사이클로옥틴기를 갖는 화합물의 소수성 사슬이 소수성-소수성 상호작용하여 서로 연결되게 된다. In the present invention, the nanoparticles preferably have an oleic acid functional group. Specifically, when a mixture of nanoparticles and a compound having a cyclooctane group is mixed with an organic solvent and dispersed using an ultrasonic wave, the hydrophobic chains of the oleic acid on the surface of the nanoparticles and the hydrophobic chains of the compound having a cyclodextrin group are hydrophobic- .

상기 나노입자와 사이클로옥틴기를 갖는 화합물의 반응은 계면활성제의 존재 하에서 수행될 수 있다. 상기 계면활성제는 Tween-20, Tween-40, Tween-60, Tween-80, BriJ-35 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 사용되기에 가장 바람직한 계면활성제는 Tween-60을 사용할 수 있다. 상기 계면활성제는 미셀(micelle)의 형태로 도입되는 것이 바람직하다. 상기 계면활성제는 전체 용액에 대하여 10 v/v% 이하로 포함되는 것이 바람직하다. The reaction of the nanoparticles with the compound having a cyclooctane group can be carried out in the presence of a surfactant. Tween-20, Tween-40, Tween-60, Tween-80 and BriJ-35 may be used as the surfactant, but the surfactant is not limited thereto. Tween-60 may be used as the most preferable surfactant to be used in the present invention. The surfactant is preferably introduced in the form of a micelle. The surfactant is preferably contained in an amount of 10 v / v% or less based on the total solution.

이와 같이 사이클로옥틴 작용화된 나노입자를 앞서 설명한 방법에 의해 작용화된 항체와 실온에서 혼합함으로써, 나노입자-항체 결합 나노플랫폼을 제조할 수 있다. 상기 작용화된 나노입자는 작용화된 항체와 10:1 내지 1000:1의 질량비, 바람직하게는 50:1 내지 200:1의 질량비로 혼합할 수 있다. Nanoparticle-antibody binding nano platforms can be prepared by mixing the cyclooctin functionalized nanoparticles with the antibody functionalized by the method described above at room temperature. The functionalized nanoparticles may be mixed with the functionalized antibody at a mass ratio of from 10: 1 to 1000: 1, preferably from 50: 1 to 200: 1.

본 발명에 따른 작용화된 항체가 아자이드 작용기를 포함하는 경우, 사이클로옥틴 작용기와 아자이드 작용기 사이의 클릭 화학에 의해 항체와 나노입자를 결합시킬 수 있다. 특히, 본 발명의 바람직한 일 실시예에 있어서, 아자이드-작용화된 항체를 ADIBO-작용화된 나노입자와 결합하는 경우, 하나의 ADIBO 분자 내에서 두 벤젠고리가 사이클로옥틴과 결합되어 있기 때문에, 아자이드 작용기와의 클릭 화학 반응이 높은 효율과 재현성으로 진행될 수 있다. When the functionalized antibody according to the present invention comprises an azide functional group, the antibody and the nanoparticle can be bound by the click chemistry between the cyclooctane functional group and the azide functional group. In particular, in one preferred embodiment of the present invention, when an azide-functionalized antibody is conjugated to an ADIBO-functionalized nanoparticle, since two benzene rings in one ADIBO molecule are associated with the cyclooctane, The click chemistry with the azide functional group can proceed with high efficiency and reproducibility.

본 발명에 따른 항체-나노입자 결합 방법은, 예를 들어, 실리카 나노입자, 양자점, 산화철(iron oxide), 업컨버전 나노입자(upconversion nanoparticle; UCNP), 표면 증감 라만 산란 나노프로브(surface enhanced Raman scattering nanoprobe; SERS Dot), 및 형광 SERS dot으로부터 선택되는 나노입자를 사용할 수 있다. The antibody-nanoparticle binding method according to the present invention can be applied to a variety of methods including, for example, silica nanoparticles, quantum dots, iron oxide, upconversion nanoparticles (UCNP), surface enhanced Raman scattering nanoprobes (SERS Dot), and fluorescent SERS dots.

본 발명의 방법으로 제조된 나노입자-항체 결합 나노플랫폼은 항체가 완전한 항원 결합 능력을 유지되고 배향이 제어될 수 있기 때문에, 나노플랫폼의 민감성과 결합 활성이 매우 우수하고, 종래의 EDC/NHS 커플링을 이용한 방법에 비하여 현저히 우수한 결합 효율을 나타낸다. 또한, 선택적으로 표적가능한 나노입자를 제조하기 위해 필요한 항체의 양이 크게 감소될 수 있으며, 커플링 효율을 증가시킴으로써 결합된 항체의 수도 크게 증가할 수 있다. The nanoparticle-antibody binding nano platform prepared by the method of the present invention has excellent sensitivity and binding activity of the nano platform and can be used as a conventional EDC / NHS couples because the antibody can maintain the full antigen binding ability and the orientation can be controlled. And exhibits remarkably excellent bonding efficiency as compared with the method using a ring. In addition, the amount of antibody required to produce selectively targetable nanoparticles can be greatly reduced, and the number of bound antibodies can be greatly increased by increasing the coupling efficiency.

또한, 나노입자-항체 결합 나노플랫폼에 추가의 작용기를 함유하는 다수의 클릭 화합물을 사용함으로써 적용가능성을 쉽게 확장할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 나노입자-항체 결합 나노플랫폼은, 아미노산, 펩타이드, 단백질, 핵산, 비타민, 호르몬, 신경전달물질, 당, 킬레이트화제 및 형광염료로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 추가로 결합되어, 원하는 목적에 따른 나노플랫폼으로서 활용될 수 있다. In addition, applicability can be easily extended by using multiple click compounds that contain additional functional groups in the nanoparticle-antibody binding nano platform. For example, the nanoparticle-antibody binding nano platform according to the present invention may comprise at least one selected from the group consisting of amino acids, peptides, proteins, nucleic acids, vitamins, hormones, neurotransmitters, sugars, chelating agents and fluorescent dyes And can be utilized as a nano platform according to a desired purpose.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위하여 일부 실험방법과 조성을 나타낸 것으로, 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 제한되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. It should be noted, however, that these examples are illustrative of some experimental methods and compositions in order to illustrate the present invention, and the scope of the present invention is not limited to these examples.

실시예Example 1: 환원 조건에 따른 항체의 절편 확인 1: Identification of antibody fragments by reducing conditions

환원 조건에 따라 생성되는 항체의 절편을 확인하기 위해서, 항체와 환원제의 비율을 아래의 4가지로 조정하여 항체의 환원을 실시하였다. Antibody reduction was performed by adjusting the ratio of the antibody to the reducing agent to the following four values in order to identify the antibody fragments generated according to the reducing conditions.

(1) 반응조건 1 - 항체:환원제 = 1:500(1) Reaction condition 1 - antibody: reducing agent = 1: 500

인간 면역글로블린 G(IgG)를 사용하고, 환원제는 500㎕ 인산완충식염수(phosphate-buffer saline; PBS) 용액에 0.3M의 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 2㎕, 1M의 나트륨바이카보네이트(sodiumbicarbonate) 버퍼 2㎕ 및 β-머캅토에탄올 2.5㎕(1500nmole/μL)을 첨가하여 사용하였다. 항체와 환원제가 1:500의 몰비가 되도록 함량을 조절하여 사용하였다. Human immunoglobulin G (IgG) was used as a reducing agent and 2 μl of 0.3 M of ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) was added to a 500 μl phosphate-buffered saline (PBS) solution, 1 M sodium bicarbonate buffer And 2.5 μl of β-mercaptoethanol (1500 nmole / μL). The content was adjusted so that the antibody and reducing agent were in a molar ratio of 1: 500.

(2) 반응조건 2 - 항체:환원제 = 1:800(2) Reaction condition 2 - antibody: reducing agent = 1: 800

반응조건 1과 동일한 항체와 환원제를 사용하되, 항체와 환원제의 비율을 1:800으로 구성하여 사용하였다. The same antibody and reducing agent as in reaction condition 1 were used, and the ratio of antibody to reducing agent was 1: 800.

(3) 반응조건 3 - 항체:환원제 = 1:1000(3) Reaction condition 3 - antibody: reducing agent = 1: 1000

반응조건 1과 동일한 항체와 환원제를 사용하되, 항체와 환원제의 비율을 1:1000으로 구성하여 사용하였다. The same antibody and reducing agent as in reaction condition 1 were used, and the ratio of antibody to reducing agent was set to 1: 1000.

(4) 반응조건 4 - 항체:환원제 = 1:2000(4) Reaction condition 4 - antibody: reducing agent = 1: 2000

반응조건 1과 동일한 항체와 환원제를 사용하되, 항체와 환원제의 비율을 1:2000으로 구성하여 사용하였다. The same antibody and reducing agent as in reaction condition 1 were used, and the ratio of antibody to reducing agent was 1: 2000.

상기 반응조건 1-4의 반응을 모두 37℃에서 30분간 동안 온치한 후, 환원된 항체를 PD-10 컬럼(GE Healthcare로부터 입수가능)을 사용하여 PBS로 정제하였다. After all of the reactions under reaction conditions 1 to 4 were incubated at 37 ° C for 30 minutes, the reduced antibody was purified with PBS using a PD-10 column (available from GE Healthcare).

정제된 항체를 나트륨 도데실설폰산염 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis; SDS-PAGE) 분석법으로 분석한 결과를 도 3에 나타내었다. The purified antibody was analyzed by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis. The results are shown in FIG.

도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 반응조건 1 내지 4에서 모두 160kD에 해당하는 위치에 강한 쿠마시 블루(coomassie blue) 얼룩의 밴드가 나타났다. 이는 항체가 온전한 형태를 갖도록 환원되었다는 것을 의미한다. As can be seen in FIG. 3, strong coomassie blue staining bands appeared at 160 kD in all of reaction conditions 1 to 4. This means that the antibody has been reduced to have an intact form.

특히, 반응조건 1 및 2에서는 오직 160kD 위치에서만 밴드가 나타내서 모든 항체가 온전한 형태를 갖도록 환원되었다는 것을 알 수 있으며, 반응조건 3 및 4에서는 대부분의 항체가 온전한 형태로 환원되었으며, 극소수는 반으로 쪼개진 절편의 형태로 환원되었다는 것을 알 수 있다.In particular, in reaction conditions 1 and 2, bands appeared only at the 160 kD position, indicating that all the antibodies were reduced to have an intact form. In reaction conditions 3 and 4, most of the antibodies were reduced to intact forms, And it was reduced to the form of intercept.

즉, 항체와 환원제를 1:500 내지 1:2000의 몰비로 사용하는 경우 환원된 항체가 모두 온전한 생체-활성을 갖는다는 것을 확인할 수 있다. That is, when the antibody and the reducing agent are used in a molar ratio of 1: 500 to 1: 2000, it can be confirmed that the reduced antibody has an intact bio-activity.

실시예Example 2: 항체와 환원 조건에 따른 항체의 절편 확인 2: Identification of antibody fragments by antibody and reduction conditions

항체로서 헤르셉틴(herceptin) 및 IgG를 각각 사용하고, 항체:환원제의 몰비를 각각 1:1000, 1:2000, 1:4000 및 1:8000으로 하여 실시예 1과 동일한 방법으로 SDS-PAGE 분석을 수행하였다. SDS-PAGE analysis was performed in the same manner as in Example 1, except that herceptin and IgG were used as antibodies, respectively, and the molar ratios of antibody: reducing agent were 1: 1000, 1: 2000, 1: 4000 and 1: Respectively.

도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 헤르셉틴과 IgG에서 유사한 결과를 얻을 수 있었다. 구체적으로, 두 항체 모두 항체:환원제=1:1000의 조건에서 오직 160kD에 해당하는 위치에 쿠마시 블루 얼룩의 밴드가 나타나, 모든 항체가 온전한 형태를 갖도록 환원되었다는 것이 확인되었다. As can be seen from Fig. 4, similar results were obtained with Herceptin and IgG. Specifically, it was confirmed that a band of Kumasi blue stain appeared at a position corresponding to only 160 kD under the condition of antibody: reducing agent = 1: 1000 in both antibodies, and all the antibodies were reduced to have an intact form.

또한, 항체:환원제=1:2000에서는 160kD 위치에 밴드가 나타났으며, 75kD 위치에는 미약한 밴드가 나타났다. 이는, 대부분의 항체가 온전한 형태로 환원되고, 일부 항체가 반으로 쪼개진 절편의 형태로 환원되었다는 것을 의미한다. In the antibody: reducing agent = 1: 2000, a band appeared at a position of 160 kD, and a weak band appeared at a position of 75 kD. This means that most antibodies are reduced to intact form and some antibodies are reduced to half cleaved fragments.

한편, 항체:환원제=1:4000 및 1:8000에서는, 중쇄와 경쇄의 분자량에 해당하는 50kD 및 25kD 위치에서도 밴드가 관측되어, 항체가 중쇄 및 경쇄 절편으로까지 환원되었다는 것을 알 수 있다. On the other hand, in the antibody: reducing agent = 1: 4000 and 1: 8000, bands were observed at the 50 kD and 25 kD positions corresponding to the molecular weights of the heavy chain and the light chain, indicating that the antibody was reduced to the heavy chain and light chain fragments.

따라서, 항체:환원제를 1:2000의 몰비 이하로 사용하는 것이 환원 후에도 항체가 온전한 생체-활성을 갖도록 할 수 있다는 것을 확인하였다. Therefore, it was confirmed that the use of an antibody: reducing agent at a molar ratio of 1: 2000 or less enables the antibody to have an intact bio-activity even after reduction.

실시예Example 3: 나노입자-항원 결합 나노플랫폼의 제조 3: Manufacture of nanoparticle-antigen binding nano platform

도 1에 나타낸 절차에 따라 나노입자-항원 결합 나노플랫폼을 제조하였다.The nanoparticle-antigen binding nano platform was prepared according to the procedure shown in Fig.

3-1. 항체 3-1. Antibody 작용화Functionalization

실시예 1의 반응조건 1을 사용하여 항체를 환원한 후(항체의 Fc 도메인 내의 디설파이드기만을 티올기로 환원), 20nmole/μL로 DMSO 용액에 녹인 ADIBO-PEG4-maleimide 3 μL 와 혼합한 후, 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 이때, 항체와 ADIBO-PEG4-maleimide는 1:10의 몰비로 혼합하였다. After the antibody was reduced using Reaction Condition 1 of Example 1 (only the disulfide group in the Fc domain of the antibody was reduced to a thiol group), the mixture was mixed with 3 μL of ADIBO-PEG4-maleimide dissolved in DMSO solution at 20 nmole / For 2 hours. At this time, the antibody and ADIBO-PEG4-maleimide were mixed at a molar ratio of 1:10.

반응 후 PD-10 컬럼을 이용하며 분획을 얻고, 얻은 분획을 쿠마시 블루(coomassie blue) 염색을 통해 단백질이 있는 분획만을 선택적으로 수득하여 ADIBO-작용화된 항체를 제조하였다.After the reaction, fractions were obtained using a PD-10 column, and the obtained fractions were subjected to coomassie blue staining to selectively obtain a protein-containing fraction to prepare an ADIBO-functionalized antibody.

3-2. 나노입자 표면에 3-2. On the surface of nanoparticles 아자이드Azide 작용기 도입 Introduction of functional group

약 230nm 크기의 실리카 나노입자(SiNP)를 Stober 방법을 사용하여 제조하였다. Silica nanoparticles (SiNP) about 230 nm in size were prepared using the Stober method.

테트라에틸 오쏘실리케이트(TEOS, 16mL)를 무수 에탄올 35mL 및 탈염수 5mL의 혼합물에 용해시킨 후, 산화암모늄(NH4OH, 27%, 5mL)를 첨가하였다. 혼합물을 마그네틱 바를 이용하여 25℃에서 20시간 동안 교반하였다. 원심분리를 통하여 SiNP를 분리한 후, 과량의 시약을 제거하기 위하여 에탄올로 여러 번 세척하였다.Tetraethylorthosilicate (TEOS, 16 mL) was dissolved in a mixture of 35 mL of absolute ethanol and 5 mL of demineralized water followed by the addition of ammonium oxide (NH 4 OH, 27%, 5 mL). The mixture was stirred at 25 < 0 > C for 20 hours using a magnetic bar. After separating SiNP by centrifugation, it was washed several times with ethanol to remove excess reagent.

제조된 SiNP 1mg을 NTPA 50㎍ 및 NH4OH(27%) 10㎛을 함유하는 에탄올 1mL에 분산시켰다. 혼합물을 25㎍에서 1시간동안 교반함으로써, NTPA의 에톡시실릴기가 실리카 나노입자 표면 상의 하이드록시기와 실란 커플링에 의해 연결되어, 아자이드 작용기가 실리카 캡슐화된 나노입자의 표면에 도입되도록 하였다. 제조된 N3-SiNP를 원심분리하고, 에탄올과 PBS를 이용하여 수차례 세척하였다.The prepared SiNP 1mg was dispersed in ethanol, 1mL containing NTPA 50㎍ and NH 4 OH (27%) 10㎛ . The mixture was stirred for 1 hour at 25 占, to cause the ethoxysilyl group of NTPA to be connected by a silane coupling with a hydroxyl group on the surface of the silica nanoparticles so that the azide functional group was introduced to the surface of the silica encapsulated nanoparticles. The prepared N 3 -SiNP was centrifuged and washed several times with ethanol and PBS.

3-3. 항체-나노입자 결합 나노플랫폼 제조3-3. Manufacture of antibody-nanoparticle binding nano platform

아자이드-작용화된 실리카 나노입자 1mg 및 ADIBO-작용화된 항체 50㎍을 1mL의 PBS에 첨가하여 25℃에서 1시간동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 항체-작용하된 나노입자를 원심분리하고, 0.1%(w/v) Tween-20를 함유하는 PBS를 이용하여 수차례 세척하였다. 1 mg of the azide-functionalized silica nanoparticles and 50 μg of the ADIBO-functionalized antibody were added to 1 mL of PBS and reacted at 25 ° C. for 1 hour. After the reaction was completed, the antibody-underactivated nanoparticles were centrifuged and washed several times with PBS containing 0.1% (w / v) Tween-20.

하나의 ADIBO 분자 내에서 두 벤젠고리가 사이클로옥틴과 결합되어 있기 때문에, 구리 없는 클릭 화학(Cu-free click chemistry) 반응으로 알려진 strain-promoted alkyne-azide cycloaddition(SPAAC)에 의해, 항체의 ADIBO 작용기와 실리카 나노입자의 아자이드 작용기가 높은 효율과 재현성으로 결합함으로써, 나노입자-항체 결합 나노플랫폼을 제조하였다.  Because two benzene rings are bound to the cyclooctane in one ADIBO molecule, the ADIBO functional group of the antibody can be detected by strain-promoted alkyne-azide cycloaddition (SPAAC), also known as Cu-free click chemistry Nanoparticle-antibody binding nano platforms were fabricated by combining the azide functional groups of silica nanoparticles with high efficiency and reproducibility.

실시예Example 4: 작용기 변화 평가 4: Evaluation of functional group change

실리카 나노입자 및 항체의 작용기 변화를 평가하기 위하여, 방사성 박막 크로마토그래피(radio thin-layer chromatohraphy; TLC) 분석법을 수행하였다. To evaluate the functional group change of silica nanoparticles and antibody, radio-thin-layer chromatography (TLC) analysis was performed.

방사성동위원소 64Cu를 함유하는 유리병을 흄후드에서 1시간동안 건조한 N2 가스를 불어넣어 건조하였다. 유리병이 완전히 건조된 후, 1M의 나트륨 아세테이트 완충액(pH5.3) 200㎕를 pH 5가 될 때까지 첨가하였다. 7.5nmol의 azido-NOTA 및 NOTA-ADIBO를 각각 첨가하고, 60℃에서 30분간 가열 블록 상에서 온치하여, 64Cu로 표지된 azido-NOTA 및 NOTA-ADIBO를 제조하였다. A glass bottle containing 64 radioisotopes Cu was dried by blowing dry N 2 gas in a fume hood for 1 hour. After the vial was completely dried, 200 쨉 l of a 1M sodium acetate buffer (pH 5.3) was added to pH 5. 7.5 nmol of azido-NOTA and NOTA-ADIBO were added, respectively, and the solution was heated on a heating block at 60 DEG C for 30 minutes to prepare azido-NOTA and NOTA-ADIBO labeled with 64 Cu.

이후, 아자이드-작용화된 실리카 나노입자를 64Cu-표지된 NOTA-ADIBO와 결합하고, 다른 편에서는, ADIBO-작용화된 항체를 64Cu-표지된 azido-NOTA와 반응시켰다. 이들 각각을 radio-instant thin layer chromatography-silica gel(radio-ITLC-SG)를 사용하여 측정한 결과를 도 3에 나타내었다. The azide-functionalized silica nanoparticles were then combined with 64 Cu-labeled NOTA-ADIBO and, on the other hand, the ADIBO-functionalized antibody was reacted with 64 Cu-labeled azido-NOTA. The results of measurement by radio-instant thin layer chromatography-silica gel (radio-ITLC-SG) are shown in FIG.

도 5a에서 확인할 수 있는 바와 같이, 64Cu-표지된 NOTA와 아자이드-작용화된 실리카 나노입자를 클릭 반응시킨 이후, 각 피크가 초기 위치 쪽으로 이동된 것을 알 수 있다. 또한, 도 5b에서 확인할 수 있듯이, 64Cu-표지된 NOTA를 ADIBO-작용화된 항체와 클릭 반응시킨 경우에도, 각 피크가 초기 위치 쪽으로 이동하였다. 이와 같은 결과로부터, 실리카 나노입자 및 항체가 모두 성공적으로 작용화되었다는 것을 알 수 있다. As can be seen in Figure 5a, after clicking reacting the 64 Cu-labeled NOTA with the azide-functionalized silica nanoparticles, it can be seen that each peak has migrated toward the initial position. Also, as can be seen in FIG. 5B, even when 64Cu-labeled NOTA was click-reacted with the ADIBO-functionalized antibody, each peak migrated toward the initial position. From these results, it can be seen that both the silica nanoparticles and the antibody were successfully functionalized.

한편, 작용화되지 않은 항체와 ADIBO-PEG4-maleimide(분자량 674.74g/mol)와 결합된 항체에 대해서 MALDI-TOF 질량분석기를 사용하여 질량을 분석하였다. 그 결과, 항체의 질량은 ADIBO-PEG4-Maleimide와 결합한 이후 약 2200g/mol 증가하였는데, 이는 ADIBO-PEG4-maleimide 3분자의 질량과 일치한다. 즉, 항체가 ADIBO-작용화되었다는 것을 확인할 수 있을 뿐만 아니라, 하나의 항체에 결합된 ADIBO 분자의 정량적인 함유량 또한 확인할 수 있었다. On the other hand, masses were analyzed using MALDI-TOF mass spectrometry on antibodies conjugated with unfunctionalized antibody and ADIBO-PEG 4 -maleimide (molecular weight 674.74 g / mol). As a result, the mass of the antibody increased about 2200 g / mol after binding to ADIBO-PEG4-Maleimide, which corresponds to the mass of three molecules of ADIBO-PEG4-maleimide. In other words, it was confirmed that the antibody was ADIBO-functionalized, and the quantitative content of ADIBO molecules bound to one antibody was also confirmed.

실시예Example 5: 나노입자에  5: To nanoparticles 결합된Combined 항체의 수의 정량적 평가 Quantitative evaluation of the number of antibodies

하나의 실리카 나노입자 상에 결합된 항체의 수를 정량적/실험적으로 평가하기 위해서 형광성 항체(FL-항체)를 실리카 나노입자와 클릭 화학을 이용하여 결합하는 실험을 진행하였다. In order to quantitatively / experimentally evaluate the number of antibodies bound on one silica nanoparticle, an experiment was conducted in which a fluorescent antibody (FL-antibody) was bound with silica nanoparticles using click chemistry.

우선, FL-항체를 ADIBO-PEG4-maleimide를 사용하여 ADIBO-작용화하고, 그 다음으로 ADIBO-FL-항체의 농도를 늘려가면서 azido-실리카 나노입자와 클릭 반응을 진행하였다. 정량적인 분석을 위해 azido-실리카 나노입자의 농도는 추적 분석(nanoparticle tracking analysis; NTA)(NanoSightTM)을 사용하여 결정하였으며, ADIBO-FL-항체의 농도는 Nano-DropTM 분광광도계로 결정하였다. FL-항체 결합된 실리카 나노입자의 형광 신호를 형광 이미징 장치(IVISTM)를 사용하여 형광 이미지를 얻음으로써 측정하였다. 도 6에서 나타낸 바와 같이, 각각의 실리카 나노입자와 결합된 FL-항체는 ADIBO-FL-항체의 표준 곡선에 근거하여 정량적으로 분석되었다.First, the FL-antibody was ADIBO-functionalized with ADIBO-PEG 4 -maleimide, followed by a click reaction with azido-silica nanoparticles while increasing the concentration of ADIBO-FL-antibody. For quantitative analysis, the concentration of azido-silica nanoparticles was determined using nanoparticle tracking analysis (NTA) (NanoSight ™ ) and the concentration of ADIBO-FL-antibody was determined with a Nano-Drop ™ spectrophotometer. Fluorescence signals of FL-antibody bound silica nanoparticles were measured by obtaining fluorescence images using a fluorescence imaging device (IVIS TM ). As shown in FIG. 6, the FL-antibodies bound to each of the silica nanoparticles were quantitatively analyzed based on the standard curve of ADIBO-FL-antibody.

분석 결과, 230nm의 직경을 갖는 단일 실리카 나노입자의 표면에 약 450개의 항체가 결합되었다는 것을 확인할 수 있었다. 이론적으로 230nm 구체로 생긴 실리카 나노입자는 오직 항체의 직경(약 15nm)과 실리카 나노 입자의 표면적만을 고려할 경우 약 900개의 항체를 결합할 수 있는데, 전체-길이 항체 사이의 반발력을 고려할 때, 실리카 나노입자 상의 가용한 아자이드 작용기 대부분이 ADIBO-항체와 반응했다는 것을 확인할 수 있다. As a result of the analysis, it was confirmed that about 450 antibodies were bound to the surface of the single silica nanoparticles having a diameter of 230 nm. Theoretically, a silica nanoparticle formed from a 230-nm sphere can bind about 900 antibodies when considering only the diameter of the antibody (about 15 nm) and the surface area of the silica nanoparticle. Considering the repulsive force between the whole-length antibody, It can be seen that most of the available azide functional groups on the particles reacted with the ADIBO-antibody.

이와 같은 결과는, 종래 기술의 EDC/NHS 커플링의 결합 효율(20% 이하)과 비교할 때 현저히 우수한 결합 효율을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 방법에 따르면 선택적으로 표적가능한 나노입자를 제조하기 위해 필요한 항체의 양이 크게 감소할 수 있으며, 또한, 커플링 효율을 증가시킴으로써, 결합된 항체의 수도 크게 증가할 수 있다. 이는 본 발명에 따른 항체-결합된 나노입자가 매우 민감성이 높고, 결합 활성도 우수하다는 것을 의미한다. These results show a significantly better coupling efficiency when compared to the coupling efficiency (less than 20%) of EDC / NHS coupling of the prior art. Thus, the method of the present invention can greatly reduce the amount of antibody required to produce selectively targetable nanoparticles, and can also greatly increase the number of bound antibodies by increasing the coupling efficiency. This means that the antibody-bound nanoparticles according to the present invention are highly sensitive and have excellent binding activity.

실시예Example 6: 단일 실리카 나노입자에  6: Single silica nanoparticles 결합된Combined 항체들의 표적 능력 Targeting Ability of Antibodies

단일 실리카 나노입자에 결합된 항체들의 표적 능력을 평가하기 위하여, 형광 항원을 사용한 정량적 평가를 수행하였다. Quantitative evaluation using fluorescent antigens was performed to evaluate the target capacities of antibodies bound to single silica nanoparticles.

항-인간 상피 증식인자 수용체(anti-human epidermal growth factor receptor 2; anti-HER2) 항체들을 본 발명에 따른 방법 및 종래의 EDC/NHS 방법으로 각각 실리카 나노입자와 결합하였다. 그 다음, 두 방법으로 결합된 anti-HER2-실리카 나노입자들을 각각 형광 염료(FNR-648)로 표지된 HER2 항원과 반응시켰다. Anti-human epidermal growth factor receptor 2 (anti-HER2) antibodies were bound to the silica nanoparticles, respectively, by the method of the present invention and the conventional EDC / NHS method. The combined anti-HER2-silica nanoparticles were then reacted with the HER2 antigen labeled with a fluorescent dye (FNR-648), respectively.

도 7c에서 확인 가능한 바와 같이, 본 발명의 방법에 의해 제조된 단일 anti-HER2-실리카 나노입자는 약 800개의 형광 항원과 결합하였으나, EDC/HNS 커플링 방법에 의해 제조된 단일 anti-HER2 실리카 나노입자는 약 100개의 항원만을 포획하였다는 것을 알 수 있다. 실시예 5에서 확인한 바와 같이, 본 발명의 방법에 의해 제조된 단일 실리카 나노입자에는 약 450개의 항체가 결합되어 있다는 것을 고려할 때, 결합된 항체의 대부분이 생체활성이 우수하다는 것을 알 수 있다. 이는, 본 발명에 따른 항체 고정화 방법은 항체 내의 부위-특이적 티올 작용기만이 반응에 참여함으로써 항체의 생체활성을 저해하지 않기 때문이다. 반면, EDC/NHS 커플링 방법은 항체를 고정하기 위하여 항체 내에 무작위로 배치된 1차 아민 작용기를 이용하기 때문에, 항체와의 결합 효율이 낮고, 항체가 나노입자 상에 무작위 배향된 상태로 결합되기 때문에, 항체의 생체활성이 낮다는 것을 알 수 있다. As can be seen in FIG. 7C, the single anti-HER2-silica nanoparticles prepared by the method of the present invention bound to about 800 fluorescent antigens, but the single anti-HER2 silica nanoparticles prepared by the EDC / HNS coupling method It can be seen that the particles only captured about 100 antigens. As shown in Example 5, considering that about 450 antibodies are bound to the single silica nanoparticles prepared by the method of the present invention, it can be seen that most of the bound antibodies are excellent in bioactivity. This is because the antibody immobilization method according to the present invention does not inhibit the bioactivity of the antibody because only the site-specific thiol functional group in the antibody participates in the reaction. On the other hand, since the EDC / NHS coupling method uses a primary amine functional group randomly placed in the antibody to immobilize the antibody, the coupling efficiency with the antibody is low, and the antibody binds to the nanoparticles in a random orientation Therefore, it can be seen that the bioactivity of the antibody is low.

실시예Example 7: 표적 결합 능력 7: Target binding ability

본 발명의 방법에 의해 나노입자에 결합된 항체와 종래의 EDC/HNS 커플링 방법으로 나노입자에 결합된 항체의 표적 결합 능력을 비교하기 위하여, 유방암 세포인 MDA-MB 231/HER2에 in vitro 면역분석법을 수행하였다. In order to compare the target binding ability of the antibody bound to the nanoparticles with the antibody with a conventional EDC / HNS coupling method coupled to the nanoparticles by the method of the present invention, in vitro immunization of breast cancer cells, MDA-MB 231 / HER2 The analysis was performed.

선택적인 추적가능 나노프로브로서는, 실리카 캡슐화된 양자점을 내장시킨 실리카 나노입자(QD2)를 단일 양자점보다 훨씬 더 밝은 anti-HER2 항체와 결합하여 이용하였다. Anti-HER2-QD2의 표적 결합 능력 평가는 anti-HER2-QD2 처리된 암 세포의 형광 이미지(도 8)를 공초점 레이져 현미경(confocal laser scanning microscopy; CLSM)을 사용하여 얻음으로써 평가하였다. As selective traceable nanoprobe, silica nanoparticles (QD 2 ) with incorporated silica-encapsulated Qdots were used in combination with anti-HER2 antibodies that were much brighter than single quantum dots. Target binding capacity Evaluation of Anti-HER2-QD 2 is a fluorescent image (Fig. 8) of the anti-HER2-QD 2-treated cancer cells, a confocal laser microscope; was evaluated by obtaining using the (confocal laser scanning microscopy CLSM).

도 8에서, 스케일바(scale bar)는 20㎛를 나타내며, anti-HER2-QD2는 붉은색으로 표시되고, DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole)에 의해 염색된 핵은 파란색으로 표시된다. 도 8a는 본 발명의 방법으로 제조된 anti-HER2-QD2 click에 의해 표적화된 암 세포의 형광 이미지이고, 도 8b는 종래의 EDC/NHS 커플링에 의해 제조된 anti-HER2-QD2 EDC/NHS에 의해 표적화된 암 세포의 형광 이미지이며, 도 8c는 음성대조군으로서, 항체가 결합되지 않은 소혈청 알부민(bovine serum albumin; BSA) 처리된 QD2를 사용한 형광 이미지이다. 8, the scale bars (scale bar) denotes the 20㎛, anti-HER2-QD 2 is displayed in red, the nuclei stained by DAPI (4,6-diamidino-2- phenylindole) are displayed in blue do. 8A is a fluorescence image of cancer cells targeted by anti-HER2-QD 2 click produced by the method of the present invention, and FIG. 8B is a fluorescence image of cancer cells targeted by anti-HER2-QD 2 EDC / 8C is a fluorescence image using QD 2 treated with bovine serum albumin (BSA) without antibody binding as a negative control. Fig. 8C is a fluorescence image of cancer cells targeted by NHS .

도 8a 및 8b로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 50pM의 anti-HER2 QD2가 세포에 처리되었을 때, 본 발명의 방법으로 제조된 anti-HER2-QD2 click가 anti-HER2-QD2 EDC / NHS에 비하여 훨씬 더 높은 표적 결합 능력을 나타내었다. 이는 본 발명의 방법으로 결합된 항체는 배향성이 제어되고 높은 결합 효율로 결합되며, 온전한 생체작용성을 나타내기 때문이며, 이와 같은 결과는 실시예 5에서의 정량적 평가 결과(본 발명에 의해 제조된 항체 결합된 실리카 나노입자는 EDC/NHS 커플링 방법보다 8배 뛰어난 표적 결합 능력을 나타냄)와도 일치한다. As can be seen from Figures 8a and 8b, when the anti-HER2 QD 2 of 50pM have been treated to the cells, prepared by the method of the present invention anti-HER2-QD 2 click is on anti-HER2-QD 2 EDC / NHS The target binding ability was much higher. This is because the antibodies bound by the method of the present invention are controlled in their orientation, bound at a high binding efficiency and exhibit intact biofunctionality, and these results are shown in the quantitative evaluation results of Example 5 Bonded silica nanoparticles exhibit an 8-fold better target binding ability than the EDC / NHS coupling method).

한편, 도 8c에서 확인할 수 있듯, 항체가 결합되지 않은 BSA-QD2는 형광 이미지에서 관측되지 않았다. On the other hand, as can be seen from FIG. 8C, BSA-QD2 without antibody binding was not observed in fluorescence image.

실시예Example 8: 본 발명의 항체  8: Antibody of the present invention 작용화Functionalization 방법의 적용가능성 평가 Assessing the applicability of the method

본 발명에 따른 항체 작용화 방법의 적용가능성을 평가하기 위해, anti-HER2 항체를 QD2, 표면 증감 라만 산란 나노프로브(surface enhanced Raman scattering nanoprobe; SERS Dot), 및 형광 SERS 점(F-SERS dots)의 실리카 캡슐화된 나노프로브와 각각 결합하였다. 그리고나서, SDS-PAGE 분석법을 이용하여 항체가 각각의 나노프로브와 어떠한 형태로 결합하였는지 분석하였다. To evaluate the applicability of the antibody functionalization method according to the present invention, the anti-HER2 antibody was incubated with QD 2 , surface enhanced Raman scattering nanoprobes (SERS Dot), and fluorescence SERS points (F-SERS dots ) Of silica encapsulated nanoprobes, respectively. Then, SDS-PAGE analysis was used to analyze how the antibody bound to each nanoprobe.

SDS-PAGE 분석한 결과, 도 9에서 확인 가능한 바와 같이, 모든 종류의 나노프로브에서 오직 SDS-PAGE 겔의 탑에서만 밴드가 관측되었다. 이는 모든 종류의 나노프로브에서 항체가 깨어짐 없이 성공적으로 결합하였다는 것을 의미한다. As a result of SDS-PAGE analysis, as can be seen in FIG. 9, bands were observed only in SDS-PAGE gel towers of all kinds of nano-probes. This means that in all types of nanoprobes, the antibody successfully binds without breaking.

이와 같은 결과는, 본 발명의 항체 작용화 방법을 이용한 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조방법이 캡슐화된 나노입자 내부의 구조와는 상관없이 모든 종류의 나노프로브에 항체를 결합시킬 수 있는 매우 넓은 적용 가능성을 갖는다는 것을 의미한다. 이 결과는 또한 본 발명의 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조방법이 유리 기판 상의 면역 센서에도 광범위하게 사용될 수 있다는 것을 의미한다. These results indicate that the nanoparticle-antibody binding nanoparticle preparation method using the antibody functionalization method of the present invention is very useful for binding an antibody to all types of nanoprobes regardless of the structure inside the encapsulated nanoparticles It has applicability. This result also means that the method of producing nanoparticle-antibody binding nano platform of the present invention can be widely used in immunosensors on glass substrates.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.From the above description, it will be understood by those skilled in the art that the present invention may be embodied in other specific forms without departing from the spirit or essential characteristics thereof. In this regard, it should be understood that the above-described embodiments are to be considered in all respects as illustrative and not restrictive. The scope of the present invention should be construed as being included in the scope of the present invention without departing from the scope of the present invention as defined by the appended claims.

Claims (27)

환원제를 이용하여 항체의 Fc 도메인 내의 디설파이드(disulfide)기를 티올(thiol)기로 환원시키는 단계; 및
상기 티올기에 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 A를 연결시키는 단계
를 포함하는 항체 작용화(antibody-functionalization) 방법:
[화학식1]
R-L-A
상기 식에서,
R은 C6~C30의 알켄기 또는 알킨기, 또는 아자이드기를 나타내고,
L은 단일결합, C1~C18의 알킬기, 알켄기 또는 알킨기, -S-S- 및 (polyethylene glycol)n(n=1~6의 정수)로부터 선택되는 연결기를 나타내며,
A는 말레이미드, SCN기, OCN기, 에폭사이드 및 C5~C12의 알킬할라이드로부터 선택되는 작용기를 나타낸다.
Reducing the disulfide group in the Fc domain of the antibody to a thiol group using a reducing agent; And
Linking A of the compound represented by the formula (1) to the thiol group
Antibody-functionalization method comprising:
[Chemical Formula 1]
RLA
In this formula,
R represents a C 6 to C 30 alkenyl group or an alkynyl group or an azide group,
L represents a linking group selected from a single bond, a C 1 -C 18 alkyl group, an alkenyl group or an alkynyl group, -SS- and (polyethylene glycol) n (n = an integer of 1 to 6)
A represents a functional group selected from maleimide, SCN group, OCN group, epoxide and C 5 to C 12 alkyl halide.
제 1 항에 있어서,
상기 환원제가 2-머캅토에탄올 또는 다이클로로-다이페닐-트리클로로에탄(dichloro-diphenyl-trichloroethane; DDT)인 것을 특징으로 하는, 항체 작용화 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the reducing agent is 2-mercaptoethanol or dichloro-diphenyl-trichloroethane (DDT).
제 1 항에 있어서,
상기 항체 및 환원제가 1:500 내지 1:2000의 몰비로 사용되는 것을 특징으로 하는, 항체 작용화 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the antibody and the reducing agent are used in a molar ratio of 1: 500 to 1: 2000.
제 1 항에 있어서,
상기 화학식 1의 R이 C6~C30의 알킨기인 것을 특징으로 하는, 항체 작용화 방법.
The method according to claim 1,
Wherein R in the above formula (1) is an alkyne group having 6 to 30 carbon atoms.
제 4 항에 있어서,
상기 알킨기가 사이클로옥틴(cyclooctyne)기인 것을 특징으로 하는, 항체 작용화 방법.
5. The method of claim 4,
Wherein the alkyne group is a cyclooctyne group.
제 5 항에 있어서,
상기 사이클로옥틴기가
Figure pat00028
,
Figure pat00029
,
Figure pat00030
,
Figure pat00031
,
Figure pat00032
,
Figure pat00033
,
Figure pat00034
,
Figure pat00035
또는
Figure pat00036
인 것을 특징으로 하는, 항체 작용화 방법.
6. The method of claim 5,
When the cyclooctane group is
Figure pat00028
,
Figure pat00029
,
Figure pat00030
,
Figure pat00031
,
Figure pat00032
,
Figure pat00033
,
Figure pat00034
,
Figure pat00035
or
Figure pat00036
≪ / RTI >
제 1 항에 있어서,
상기 화학식 1의 L이 (polyethylene glycol)4인 것을 특징으로 하는, 항체 작용화 방법.
The method according to claim 1,
The L of the general formula (1), characterized in that (polyethylene glycol) is 4, the antibody functionalization methods.
제 1 항에 있어서,
상기 화학식 1의 A가 말레이미드기인 것을 특징으로 하는, 항체 작용화 방법.
The method according to claim 1,
A method for functionalizing an antibody, wherein A in the formula (1) is a maleimide group.
제 1 항에 있어서,
상기 화학식 1로 표시되는 화합물이 아자-디벤조사이클로옥틴-말레이미드(aza-dibenzocyclooctyne-maleimide; ADIBO-Mal), ADIBO-(폴리에틸렌글리콜)4-Mal(ADIBO-PEG4-Mal), ADIBO-S-S-Mal, N3-Mal, N3-PEG4-Mal 및 N3-S-S-Mal로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 항체 작용화 방법.
The method according to claim 1,
The compounds represented by the above formula (1) are aza-dibenzocyclooctyne-maleimide (ADIBO-Mal), ADIBO- (polyethylene glycol) 4 -Mal (ADIBO-PEG 4 -Mal) -Mal, N 3 -Mal, N 3 -PEG 4 -Mal and N 3 -SS-Mal.
제 1 항에 있어서,
상기 항체가 IgG인 것을 특징으로 하는, 항체 작용화 방법.
The method according to claim 1,
RTI ID = 0.0 > IgG. ≪ / RTI >
나노입자의 표면에 아자이드(N3) 작용기를 도입하는 단계; 및
상기 아자이드(N3) 작용기가 도입된 나노입자를 제 1 항의 방법에 의해 작용화된 항체와 구리 촉매 없이 클릭 화학(Cu-free click chemistry) 반응시키는 단계
를 포함하는 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조방법.
Introducing an azide (N 3 ) functional group onto the surface of the nanoparticles; And
Reacting the nanoparticles with the azide (N 3 ) functional group by a Cu-free click chemistry reaction with an antibody functionalized by the method of claim 1 without a copper catalyst
Wherein the nanoparticle-antibody-bound nano-platform is a nanoparticle-antibody bound nanoparticle.
제 11 항에 있어서,
상기 나노입자가 실리카 나노입자 또는 실리카-캡슐화된(silica-encapsulated) 나노입자인 것을 특징으로 하는, 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조방법.
12. The method of claim 11,
Wherein the nanoparticles are silica nanoparticles or silica-encapsulated nanoparticles. ≪ RTI ID = 0.0 > 21. < / RTI >
제 12 항에 있어서,
상기 아자이드 작용기를 도입하는 단계는 아자이드 작용기를 갖는 화합물을 나노입자 표면의 하이드록시기와 반응시켜 이루어지는 것을 특징으로 하는, 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조방법.
13. The method of claim 12,
Wherein the step of introducing the azide functional group is performed by reacting a compound having an azide functional group with a hydroxy group on the surface of the nanoparticle.
제 13 항에 있어서,
상기 아자이드 작용기를 갖는 화합물이 에톡시실록산 말단을 갖는 것을 특징으로 하는, 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조방법.
14. The method of claim 13,
Wherein the compound having an azide functional group has an end of an ethoxysiloxane.
제 14 항에 있어서,
상기 아자이드 작용기를 갖는 화합물이 N-[3-(트리에톡시실릴)프로필]-2-아지도아세트아미드(N-[3-(triethoxysilyl)propyl]-2-azidoacetamide; NTPA)인 것을 특징으로 하는, 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조방법.
15. The method of claim 14,
Wherein the compound having an azide functional group is N- [3- (triethoxysilyl) propyl] -2-azidoacetamide (N- [3- (triethoxysilyl) propyl] -2-azidoacetamide To produce nanoparticle-antibody binding nanoparticles.
제 11 항에 있어서,
상기 아자이드 작용기가 상기 화학식 1의 R과 구리 촉매 없이 클릭 화학(Cu-free click chemistry) 반응하는 것을 특징으로 하는, 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조방법.
12. The method of claim 11,
Wherein the azide functional group reacts with R of the formula (1) without a copper catalyst in a Cu-free click chemistry.
제 11 항에 있어서,
상기 나노입자가 실리카 나노입자, 양자점, 산화철(iron oxide), 업컨버전 나노입자(upconversion nanoparticle; UCNP), 표면 증감 라만 산란 나노프로브(surface enhanced Raman scattering nanoprobe; SERS Dot), 및 형광 SERS dot으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조방법.
12. The method of claim 11,
The nanoparticles are selected from silica nanoparticles, quantum dots, iron oxides, upconversion nanoparticles (UCNP), surface enhanced Raman scattering nanoprobes (SERS Dot), and fluorescent SERS dots. Wherein said nanoparticle-antibody binding nano-platform is a nanoparticle-antibody binding nanoparticle.
나노입자의 표면에 사이클로옥틴 작용기를 도입하는 단계; 및
상기 사이클로옥틴 작용기가 도입된 나노입자를 제 1 항의 방법에 의해 작용화된 항체와 구리 촉매 없이 클릭 화학(Cu-free click chemistry) 반응시키는 단계
를 포함하는 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조방법.
Introducing a cyclooctane functional group to the surface of the nanoparticle; And
Reacting the nanoparticle with the cyclooctane functional group reacted with the antibody functionalized by the method of claim 1 with a copper-free click chemistry
Wherein the nanoparticle-antibody-bound nano-platform is a nanoparticle-antibody bound nanoparticle.
제 18 항에 있어서,
상기 나노입자가 표면에 올레산(oleic acid) 작용기를 갖는 것을 특징으로 하는, 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조방법.
19. The method of claim 18,
Wherein the nanoparticles have an oleic acid functional group on the surface thereof.
제 18 항에 있어서,
상기 사이클로옥틴 작용기를 도입하는 단계는 사이클로옥틴 작용기를 갖는 화합물을 나노입자 표면의 올레산 작용기와 반응시켜 이루어지는 것을 특징으로 하는, 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조방법.
19. The method of claim 18,
Wherein the step of introducing the cyclooctane functional group comprises reacting a compound having a cyclooctane functional group with an oleic acid functional group on the surface of the nanoparticle.
제 20 항에 있어서,
상기 사이클로옥틴 작용기를 갖는 화합물이 소수성 말단을 갖는 것을 특징으로 하는, 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조방법.
21. The method of claim 20,
Wherein the compound having the cyclooctane functional group has a hydrophobic end.
제 21 항에 있어서,
상기 사이클로옥틴 작용기를 갖는 화합물이 ADIBO-PEG4-C18 또는 ADIBO-PEG2000-DSPE인 것을 특징으로 하는, 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조방법.
22. The method of claim 21,
Wherein the compound having the cyclooctane functional group is ADIBO-PEG 4 -C 18 or ADIBO-PEG 2000-DSPE.
제 18 항에 있어서,
상기 사이클로옥틴 작용기가 상기 화학식 1의 R과 구리 촉매 없이 클릭 화학(Cu-free click chemistry) 반응하는 것을 특징으로 하는, 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조방법.
19. The method of claim 18,
Wherein the cyclooctane functional group reacts with R of formula (1) without a copper catalyst in a Cu-free click chemistry.
항체의 Fc 도메인 내의 디설파이드기가 환원되어 생성된 티올기에 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 A가 연결된 구조를 갖는 것을 특징으로 하는, 작용화된 항체(functionalized antibody):
[화학식1]
R-L-A
상기 식에서,
R은 C6~C30의 알켄기 또는 알킨기, 또는 아자이드기를 나타내고,
L은 단일결합, C1~C18의 알킬기, 알켄기 또는 알킨기, -S-S- 및 (polyethylene glycol)n(n=1~6의 정수)로부터 선택되는 연결기를 나타내며,
A는 말레이미드, SCN기, OCN기, 에폭사이드 및 C5~C12의 알킬할라이드로부터 선택되는 작용기를 나타낸다.
Characterized in that the disulfide group in the Fc domain of the antibody is reduced and the resulting thiol group has a structure in which A of the compound represented by the following formula 1 is linked:
[Chemical Formula 1]
RLA
In this formula,
R represents a C 6 to C 30 alkenyl group or an alkynyl group or an azide group,
L represents a linking group selected from a single bond, a C 1 -C 18 alkyl group, an alkenyl group or an alkynyl group, -SS- and (polyethylene glycol) n (n = an integer of 1 to 6)
A represents a functional group selected from maleimide, SCN group, OCN group, epoxide and C 5 to C 12 alkyl halide.
나노입자의 표면에 제 24 항에 따른 작용화된 항체가 고정된 것을 특징으로 하는, 나노입자-항체 결합 나노플랫폼.
A nanoparticle-antibody binding nano platform, characterized in that the functionalized antibody according to claim 24 is immobilized on the surface of the nanoparticle.
제 25 항에 있어서,
상기 나노입자가 실리카 나노입자 또는 실리카-캡슐화된 나노입자인 것을 특징으로 하는, 나노입자-항체 결합 나노플랫폼.
26. The method of claim 25,
Wherein the nanoparticle is a silica nanoparticle or a silica-encapsulated nanoparticle.
제 25 항에 있어서,
상기 나노입자에 아미노산, 펩타이드, 단백질, 핵산, 비타민, 호르몬, 신경전달물질, 당, 킬레이트화제 및 형광염료로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 추가로 결합된 것을 특징으로 하는, 나노입자-항체 결합 나노플랫폼.26. The method of claim 25,
Characterized in that the nanoparticles are further combined with at least one selected from the group consisting of amino acids, peptides, proteins, nucleic acids, vitamins, hormones, neurotransmitters, sugars, chelating agents and fluorescent dyes. Nano platform.
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