KR20180100808A - 세포 손상 확인용 바이오마커 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인산완충생리식염수(PBS)에 보관된 세포 손상 확인용 바이오마커 조성물에 관한 것으로, 상기 PBS에 보관된 중간엽줄기세포는 보관시간 경과에 따라, 세포 내에서 높은 과산화 지방질 생성이 나타났으며, 상기 과산화 지방질 생성과 관련된 유전자의 발현 수준 변화가 확인됨에 따라, 상기 발현 수준 변화가 확인된 유전자를 중간엽줄기세포의 손상도 확인 및 이식 적합성 판단을 위한 효과적인 생물학적 지표로 제공하여, PBS 보관에 따른 세포 손상 정도를 확인하여 이식에 적합한 중간엽줄기세포를 선별함으로써 생체 내 세포이식 효율성을 증가시킬 수 있다.

Description

세포 손상 확인용 바이오마커 조성물 및 이의 용도{Biomarkers composition for detecting damage of cell and uses thereof}
본 발명은 인산완충생리식염수(Phosphate bufferd saline; PBS)에 보관된 중간엽줄기세포의 손상 확인용 바이오마커 조성물에 관한 것이다.
인간중간엽줄기세포(hMSCs)는 세포의 분화와 발생 및 여러 가지 면역조절작용 효과를 가지므로(Hidvegi, Raso et al. 1999; Felka, Schafer et al. 2009; Chen, Lee et al. 2012), 난치성 질환의 치료와 여러 가지 임상실험에 사용되고 있는 줄기세포로, 보고된 바에 따르면, hMSCs은 다 분화 가능성을 이용한 세포 치료와 조직공학에 이용되며, 신경, 혈관 및 간세포 등으로 분화하여 임상실험에 많이 적용되고 있다(Spadaccio, Rainer et al. 2009).
hMSCs 세포는 조직 내에 침투된 후 비교적 조직특이적으로 분화되고, 신체 내에서 안전하다는 장점을 가지므로, 다양한 의학 분야에서의 세포치료를 이용하여 장기 재생을 시도하는 재생의학의 영역에 사용되고 있으며, 세포증식억제 및 혈관생성 촉진, 항염증, 면역조절작용에 효과가 있어 조직이나 기관을 이식할 때 사용 되어지기도 한다(Zacharek, Chen et al. 2007; Comsa, Ciuculescu et al. 2011).
또한, 발생과정이 끝난 이후에도 신체의 한 부분이 손상을 받았을 때 이들 세포를 재생할 수 있는 분화의 유연성 기능도 가지고 있다.
이와 같이 다양한 기능을 가지는 hMSCs는 현재 심근경색, 뇌졸중, 퇴행성 질환 그리고 다계통위축증(multiple system atrophy; MAS) 환자들에게 임상실험치료 도구로 사용되고 있는 데(Lai, Arslan et al. 2010), hMSCs를 환자에게 적용하기 위해서 사람의 골수에서 추출한 후 혈구계 줄기세포를 제거하고, 증식과정인 세포 배양을 거친 후 생리식염수에 보관되어 환자에게 주입된다.
그러나 상기 보관 시간이 경과할수록 hMSCs의 세포사멸(apoptosis)이 증가되고, 세포의 형태 변화가 나타남에 따라, 환자에게 이식할 수 있는 세포 수가 감소되고 hMSCs 세포 이식 후에도 향상된 이식효과를 기대하기 어렵다.
일본공개특허 제2008-220334호(2008.09.25)
따라서 본 발명은 세포 이식 효율성을 향상시키기 위해, 개체로부터 분리된 후 PBS에 보관된 중간엽줄기세포의 손상도를 확인하고, 보관된 세포의 이식 적합성을 평가하기 위한 생물학적 지표를 제시하고자 한다.
본 발명은 SOD2(superoxide dismutase 2; NCBI accession number: BC016934.1), CYP4A11(cytochrome P450, family 4 subfamily A polypeptide 11, NCBI accession number: BC041158.1), TTPA(tocopherol α transfer protein; NCBI accession number: BC058000.1), PTGER4(prostaglandin E receptor 4; NCBI accession number: BC101534.1) 및 PRKAA2(5'-AMP-activated protein kinase catalytic subunit alpha-2; NCBI accession number: BC069823.1)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 포함하는 세포 손상 확인용 바이오마커 조성물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 SOD2(superoxide dismutase 2; NCBI accession number: BC016934.1), CYP4A11(cytochrome P450, family 4 subfamily A polypeptide 11, NCBI accession number: BC041158.1), TTPA(tocopherol α transfer protein; NCBI accession number: BC058000.1), PTGER4(prostaglandin E receptor 4; NCBI accession number: BC101534.1) 및 PRKAA2(5'-AMP-activated protein kinase catalytic subunit alpha-2; NCBI accession number: BC069823.1)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자 발현 수준을 확인하는 단계; 및 상기 유전자의 발현 정도를 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 세포의 이식 적합성 평가를 위한 정보를 제공하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명에 따르면, 개체로부터 분리되어 PBS에 보관된 중간엽줄기세포가 보관시간 경과에 따라, 세포 내에서 높은 과산화 지방질 생성이 확인되었으며, 상기 과산화 지방질 생성과 관련된 유전자의 발현 수준 변화가 확인됨에 따라, 상기 발현 수준 변화가 확인된 유전자는 중간엽줄기세포의 손상도 확인 및 이식 적합성 판단을 위한 생물학적 지표로 사용될 수 있으므로, 보관된 세포 중 이식에 적합한 중간엽줄기세포를 선별하여 생체 내 세포이식 효율성을 증가시킬 수 있다.
도 1은 12시간 동안 PBS에 보관된 hBM-MSCs의 마이크로 어레이 및 아미노산 프로필에 대한 생물 정보학 분석결과로, 도 1(A)는 IPA를 이용한 알고리즘으로 확인된 과산화 지질 관련 유전자 및 아미노산 네트워크를 나타낸 모식도로, 적색 및 녹색은 각각 증가 및 감소된 유전자를 나타내며, 도 1(B)는 PBS에 6 및 12 시간동안 보관된 hBM-MSCs세포에서 각각 지질 과산화관련 유전자 발현 수준을 확인한 qPCR 분석결과이다 *P < 0.05, **P < 0.001 vs. 0 h (대조군).
도 2는 PBS에 6 및 12 시간동안 보관된 hBM-MSCs의 NAC 처리 또는 미처리에 따른 과산화 지방질의 양을 측정한 결과이다.
본 발명은 SOD2(superoxide dismutase 2; NCBI accession number: BC016934.1), CYP4A11(cytochrome P450, family 4 subfamily A polypeptide 11, NCBI accession number: BC041158.1), TTPA(tocopherol α transfer protein; NCBI accession number: BC058000.1), PTGER4(prostaglandin E receptor 4; NCBI accession number: BC101534.1) 및 PRKAA2(5'-AMP-activated protein kinase catalytic subunit alpha-2; NCBI accession number: BC069823.1)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 포함하는 세포 손상 확인용 바이오마커 조성물을 제공할 수 있다.
상기 SOD2(superoxide dismutase 2) 및 CYP4A11(cytochrome P450, family 4 subfamily A polypeptide 11) 유전자는 PBS 보관시간 증가에 의해 발현이 감소될 수 있다.
상기 TTPA(tocopherol α transfer protein), PTGER4(prostaglandin E receptor 4) 및 PRKAA2(5'-AMP-activated protein kinase catalytic subunit alpha-2) 유전자는 PBS 보관시간 증가에 의해 발현이 증가될 수 있다.
상기 세포는 인간으로부터 분리된 중간엽줄기세포일 수 있으며, 상기 세포는 인산완충생리식염수(PBS)에 보관된 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
보다 상세하게는 상기 유전자들은 과산화 지방질과 관련된 유전자들로, 본 발명의 일실시예에 따르면, 인간으로부터 분리된 hBM-MSCs 세포를 PBS에서 6 및 12 시간 동안 보관된 후 각 보관 시간별 hBM-MSCs 세포에서 마이크로어레이 및 아미노산 프로파일링 데이터를 분석을 진행한 결과, 도 2와 같이 12시간 PBS에 보관된 세포에서 6시간 보관된 세포보다 과산화 지방질이 증가된 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과를 통하여, 과산화 지방질 관련 유전자의 발현 수준을 확인한 결과, 도 1b와 같이 0시간 보관된 실험군보다 12시간 보관된 중간엽줄기세포군에서 수퍼 옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase 2; SOD2), 사이토크롬 P450(family 4 subfamily A polypeptide 11; CYP4A11)의 발현이 상대적으로 감소한 반면, 토코페롤 α 수송 단백질(tocopherol α transfer protein; TTPA), 프로스타클란딘 E 수용체 4(prostaglandin E receptor 4; PTGER4), PRKAA2(5'-AMP-activated protein kinase catalytic subunit alpha-2)는 12시간 보관된 세포군에서 0시간 보관된 세포군보다 상대적으로 발현이 증가된 것을 확인할 수 있었다.
보고에 따르면, 생쥐 동물모델에서 주요 항산화 효소인 SOD2의 결핍은 아포지질단백질 B(apolipoprotein B) 활성을 통하여 과산화 지방질을 유도하고, 미토콘드리아에 존재하는 CYP4A 단백질은 항산화 경로를 조절하는 것으로 알려졌으며, α-토코페롤 수송 단백질(TTPA) 및 프로스타클란딘 E 수용체 4(PTGER4)의 발현 변화는 과산화 지방질과 관련된 세포 반응에 영향을 미치는 것으로 보고되어졌다.
세포 내 과산화 지방질 증가는 세포막의 유연성을 감소시키고, 이에 따라 세포변형률을 감소시키는 원인으로, 상기 결과와 같이 분리된 중간엽줄기세포의 PBS 보관 시간 경과에 따른 상기 유전자들의 발현 변화는 hBM-MSC 세포 내 과산화 지방질을 증가시켜 세포막의 유연성 및 세포변형률을 감소시키고, 줄기세포의 생체 내 이식 효율성 감소시키는 원인이 될 수 있다.
또한, 본 발명은 SOD2(superoxide dismutase 2), CYP4A11(cytochrome P450, family 4 subfamily A polypeptide 11), TTPA(tocopherol α transfer protein), PTGER4(prostaglandin E receptor 4) 및 PRKAA2(5'-AMP-activated protein kinase catalytic subunit alpha-2)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자 발현 수준을 확인하는 단계; 및 상기 유전자의 발현 정도를 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 세포의 이식 적합성 평가를 위한 정보를 제공하는 방법을 제공할 수 있다.
상기 세포는 인간으로부터 분리된 중간엽줄기세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 세포는 인산완충생리식염수(PBS)에 보관된 세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실시예 1> PBS에 보관된 중간엽줄기세포의 이식 적합성 확인을 위한 바이오마커 확인
1. 세포배양
65세 백인 남성에게서 분리된 hBM-MSCs 세포를 PromoCell (Heidelberg, Germany)에서 구입하였다.
상기 세포를 PBS로 세척하고 10% 태아소혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 글루코스가 낮은 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)에 부유시켰다.
6번 계대배양한 세포를 수집하여 CD105 및 CD73을 포함하여 분화와 관련된 hBM-MSC 표면 마커 클러스터의 발현을 유세포 분석기로 확인하였다.
그 결과, hBM-MSCs에서 상기 양성 마커의 높은 발현(~99%)이 확인되었으며, 음성 마커인 CD34 및 CD45는 낮은 발현(~1%)이 확인되었다.
각 분획의 106 세포를 500 × g에서 5분간 원심분리하고 PBS로 세 번 세척한 후 PBS에서 6 또는 12 시간 동안 인큐베이션하였다.
2. 가스 크로마토그래피 ( GC -MS) 분석
각각의 아미노산 함량은 GC-MS 분석으로 확인하였다.
5975B mass-selective detector (70 eV, electron impact ionization mode; Agilent Technologies) 장비를 갖춘 model 6890N gas chromatograph (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 각 스캔 및 SIM 모드에서 GC-MS 분석을 수행하였다.
3. 마이크로어레이 및 아미노산 프로파일링
54,675 프로브를 이용하여 Human U133 Plus 2.0 50K 마이크로어레이(microarray)와 연결된 Affymetrix system(Istech, Ilsan, Korea)으로 hBM-MSCs 세포 내 유전자 발현 변화를 확인하였다.
GenPlex 3.0 소프트웨어로 데이터 분포의 차이를 분석하였으며, IPA(Ingenuity pathway analysis) web-based bioinformatics software (Qiagen)를 이용하여 생물학적 경로 및 기능을 확인하였다.
0시간 대조군과 비교하여 6 및 12시간 보관된 hBM-MSCs 세포에서 3배 발현 차이를 나타내는 유전자를 컷-오프 값으로 사용하였다.
4. 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응(quantitative polymerase chain reaction; qPCR )
과산화 지방질(lipid peroxidation)관련 유전자 분석을 위해, RealMOD SYBR Green real-time PCR kit (Intron)와 유전자 특이적 프라이머 쌍을 이용하여 Rotor Gene-Q system (Qiagen, Valencia, CA, USA)으로 qPCR을 수행하였다. 반응 조건은 95℃에서 5분 반응 후, 95℃에서 5초, 60℃에서 30초를 50 사이클 반복하였다.
통계적으로 백그라운드 수준보다 높게 검출된 형광 포인트를 Ct/Cq(threshold/quantification cycle) 값으로 결정하였으며, Rotor-Gene 1.7 software (Qiagen)를 이용하여 분석된 용융 곡선을 기초로 PCR 생산물을 분석하였다.
상기 과정으로 PCR 반응을 독립적인 시료로 세 번 반복수행하고, 2- ΔΔCt 방법을 이용하여 목적 유전자 발현의 상대적 정량값을 얻었다.
5. hBM - MSCs세포에서 유전자 동시 발현 네트워크 및 아미노산 프로파일 확인
IPA를 이용하여 상기 실험과정으로 얻은 마이크로어레이 및 아미노산 프로파일링 데이터를 분석하여 유전자 동시 발현 네트워크를 확인하고, 도 1a와 같이 발현이 증가 및 감소된 유전자를 각각 적색 및 녹색으로 표시하였다.
상기 결과에 따라, qPCR를 수행하여 과산화 지방질 관련 유전자의 발현 수준을 확인하였다.
그 결과, 도 1b와 같이 0시간 보관된 실험군과 비교하여 12시간 보관된 실험군에서는 수퍼 옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase 2; SOD2), CYP4A11(cytochrome P450, family 4 subfamily A polypeptide 11)의 발현이 감소된 반면, 토코페롤 α 수송 단백질(tocopherol α transfer protein; TTPA), 프로스타클란딘 E 수용체 4(prostaglandin E receptor 4; PTGER4), PRKAA2(5'-AMP-activated protein kinase catalytic subunit alpha-2)는 0시간 실험군과 비교하여 12시간 보관된 실험군에서 상대적으로 발현이 증가된 것을 확인할 수 있었다.
또한, 상기 결과를 바탕으로 hBM-MSCs 세포막의 과산화 지방질 양을 앞서 보고된 문헌(Lee, S. et al., An ultra-sensitive nanoarray chip based on single-molecule sandwich immunoassay and TIRFM for protein detection in biologic fluids. Analyst 134, 933-938 (2009))에 개재된 방법으로, 티오시안산제일철(ferrous thiocyanate)을 세포에 처리한 후 세포들의 형광강도를 측정하여 확인하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 6시간 보관된 세포와 비교하여 12시간 보관된 세포에서 과산화 지방질이 증가된 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (8)

  1. SOD2(superoxide dismutase 2; NCBI accession number: BC016934.1), CYP4A11(cytochrome P450, family 4 subfamily A polypeptide 11, NCBI accession number: BC041158.1), TTPA(tocopherol α transfer protein; NCBI accession number: BC058000.1), PTGER4(prostaglandin E receptor 4; NCBI accession number: BC101534.1) 및 PRKAA2(5'-AMP-activated protein kinase catalytic subunit alpha-2; NCBI accession number: BC069823.1)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 포함하는 세포 손상 확인용 바이오마커 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 SOD2(superoxide dismutase 2) 및 CYP4A11(cytochrome P450, family 4 subfamily A polypeptide 11) 유전자는 인산완충생리식염수(PBS) 보관시간 증가에 의해 발현이 감소되는 것을 특징으로 하는 바이오마커 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, TTPA(tocopherol α transfer protein), PTGER4(prostaglandin E receptor 4) 및 PRKAA2(5'-AMP-activated protein kinase catalytic subunit alpha-2) 유전자는 인산완충생리식염수(PBS) 보관시간 증가에 의해 발현이 증가되는 것을 특징으로 하는 바이오마커 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 세포는 인간으로부터 분리된 중간엽줄기세포인 것을 특징으로 하는 바이오마커 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 세포는 인산완충생리식염수(Phosphate bufferd saline; PBS)에 보관된 세포인 것을 특징으로 하는 바이오마커 조성물.
  6. SOD2(superoxide dismutase 2; NCBI accession number: BC016934.1), CYP4A11(cytochrome P450, family 4 subfamily A polypeptide 11, NCBI accession number: BC041158.1), TTPA(tocopherol α transfer protein; NCBI accession number: BC058000.1), PTGER4(prostaglandin E receptor 4; NCBI accession number: BC101534.1) 및 PRKAA2(5'-AMP-activated protein kinase catalytic subunit alpha-2; NCBI accession number: BC069823.1)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자 발현 수준을 확인하는 단계; 및
    상기 유전자의 발현 정도를 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 세포의 이식 적합성 평가를 위한 정보를 제공하는 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 세포는 인간으로부터 분리된 중간엽줄기세포인 것을 특징으로 하는 세포의 이식 적합성 평가를 위한 정보를 제공하는 방법.
  8. 청구항 6에 있어서, 상기 세포는 인산완충생리식염수(PBS)에 보관된 세포인 것을 특징으로 하는 세포의 이식 적합성 평가를 위한 정보를 제공하는 방법.
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