KR20180091345A - Methods for identification of proteins using phenolic compounds for protein labeling - Google Patents

Methods for identification of proteins using phenolic compounds for protein labeling Download PDF

Info

Publication number
KR20180091345A
KR20180091345A KR1020170016359A KR20170016359A KR20180091345A KR 20180091345 A KR20180091345 A KR 20180091345A KR 1020170016359 A KR1020170016359 A KR 1020170016359A KR 20170016359 A KR20170016359 A KR 20170016359A KR 20180091345 A KR20180091345 A KR 20180091345A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
ala
protein
leu
glu
Prior art date
Application number
KR1020170016359A
Other languages
Korean (ko)
Other versions
KR101910169B1 (en
Inventor
이현우
이송이
Original Assignee
울산과학기술원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 울산과학기술원 filed Critical 울산과학기술원
Priority to KR1020170016359A priority Critical patent/KR101910169B1/en
Publication of KR20180091345A publication Critical patent/KR20180091345A/en
Application granted granted Critical
Publication of KR101910169B1 publication Critical patent/KR101910169B1/en

Links

Images

Classifications

    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532Production of labelled immunochemicals
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12YENZYMES
    • C12Y111/00Oxidoreductases acting on a peroxide as acceptor (1.11)
    • C12Y111/01Peroxidases (1.11.1)
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326Magnetic particles
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848Methods of protein analysis involving mass spectrometry

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

The present invention relates to a phenol compound and to a manufacturing method thereof, and specifically, to desthiobiotin-phenol (DBP), a manufacturing method thereof, a protein labeling method using the DBP, and a use for detecting a protein. The present invention relates to the method for detecting the protein using the phenol compound. More particularly, the present invention relates to the method for detecting the protein using the DBP, which can identify the labeled protein.

Description

단백질 표지화용 페놀 화합물을 이용한 단백질을 탐지하는 방법 {Methods for identification of proteins using phenolic compounds for protein labeling}Methods for identifying proteins using phenolic compounds for protein labeling [

본 발명은 단백질 표지화용 페놀 화합물을 포함하는 단백질 탐지용 조성물,및 상기 페놀 화합물을 이용한 단백질 탐지하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 데스티오비오틴-페놀 (Desthiobiotin-Phenol; DBP)을 이용하여 단백질을 표지하여 단백질을 탐지하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for detecting a protein comprising a phenol compound for protein labeling, and a method for detecting a protein using the phenol compound. Specifically, the present invention relates to a method for detecting proteins by labeling proteins using Desthiobiotin-Phenol (DBP).

사람 세포에 존재한다고 알려져 있는 18,000여개의 단백질들은 각자 적절한 세포 소기관에 특유의 구조로 존재하면서 기능을 수행한다.Over 18,000 proteins, known to be present in human cells, function in their own unique structures in the appropriate organelle.

단백질은 직선의 1차 구조 (Primary structure)에서 나선 또는 병풍구조로 바뀌는 2차 구조 (Secondary structure)를 거쳐 수소결합, 이온결합, 소수성 결합 등을 통해 3차 구조 (Tertiary structure)를 형성하며, 여러 개의 3차 구조가 모여 4차 구조 (Quaternary structure)를 형성하기도 한다. 단백질의 구조는 매우 복잡하고 단백질이 존재하는 주변 환경에 따라서 그 구조가 유동적으로 변화하기 때문에 단백질의 정확한 구조를 알아내기가 쉽지 않다.Proteins form a tertiary structure through hydrogen bonding, ionic bonding, hydrophobic bonding, etc. through a secondary structure that changes from a linear primary structure to a spiral or screening structure, The three tertiary structures are gathered to form a quaternary structure. Because the structure of proteins is very complex and the structure changes fluidly depending on the surrounding environment in which the proteins exist, it is difficult to know the exact structure of the proteins.

과거 생물학자들은 반응성이 있는 바이오틴 프로브를 사용하여 막단백질 (Membrane protein)의 토폴로지 (Topology)를 확인하거나 단백질 표면의 용제 접근 가능 잔기 (Residue)를 찾곤 하였다. 하지만 바이오틴-에스터 또는 바이오틴 말레이마이드는 수용액 상에서 수명이 매우 길고 (t1/2 = 1 hr) 정제된 단백질이나 세포막에만 적용할 수 있다는 단점이 있어 적용상의 한계가 있었다.Historically, biologists have used reactive biotin probes to identify membrane protein topology or to find solvent accessible residues on protein surfaces. However, biotin-ester or biotin maleimide has a long life span in aqueous solution (t1 / 2 = 1 hr) and can be applied only to purified proteins or cell membranes, thus there are limitations in application.

최근, 과산화효소 (Peroxidase)를 미토콘드리아 기질 (Mitochondrial Matrix)과 막사이공간에 발현시켜 바이오틴 페놀로 주변단백질을 표지하여 미토콘드리아 기질과 막사이공간을 맵핑한 연구가 있었다. 하지만 이 방법은 페놀기가 표지되지 않은 펩타이드를 분석하는 것이기 때문에 위양성 (False positive)의 결과를 얻을 가능성이 존재하는 문제가 있었다. 또한, 종래의 경우에는 바이오틴의 황원자의 산화 작용 때문에 단일한 최종산물이 아니라 다양한 종류의 최종산물이 혼재하게 되어, 직접적으로 페놀기가 표지된 펩타이드를 질량분석 할 수가 없는 문제점이 있었다.Recently, peroxidase was expressed in the mitochondrial matrix and intermembrane space, and the surrounding proteins were labeled with biotin phenol to map the space between the mitochondrial matrix and the membrane. However, since this method analyzes peptides that are not labeled with phenol groups, there is a possibility of obtaining false positive results. In addition, in the conventional case, due to the oxidizing action of the sulfur atom of biotin, not a single final product but various kinds of final products are mixed, and thus there is a problem that mass spectrometry of the peptide directly labeled with a phenol group can not be performed.

이에, 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해서 과산화효소를 이용한 단백질 표지를 하기 위한 프로브를 개발하여 본 발명을 완성하였다.In order to solve the above problems, a probe for protein labeling using peroxidase has been developed and the present invention has been completed.

본 발명의 목적은 화합물내에 황원자가 존재하지 않기 때문에 표지된 단백질 또는 펩타이드가 한 종류만 존재하여, 표지된 단백질 또는 펩타이드의 질량분석이 가능하고, 상기 질량분석 결과를 통해 단백질의 종류를 확인하고, 그 구조정보도 확인이 가능한, 하기 화학식 1을 갖는 페놀 화합물, 및 이의 제조방법에 관한 것이다.It is an object of the present invention to provide a method for mass spectrometric analysis of a labeled protein or peptide in which only one labeled protein or peptide exists because no sulfur is present in the compound, A phenolic compound having the following formula (1), and a method for producing the same.

[화학식 1][Chemical Formula 1]

Figure pat00001
Figure pat00001

본 발명의 또 다른 목적은, 상기의 화학식 1의 페놀 화합물, 이의 입체 이성질체, 호변 이성질체, 또는 이들의 염을 포함하는 단백질 또는 펩타이드 표지용 조성물을 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a composition for labeling a protein or peptide comprising the phenolic compound of formula (I), a stereoisomer thereof, a tautomer thereof, or a salt thereof.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기의 화학식 1의 페놀 화합물, 이의 입체 이성질체, 호변 이성질체, 또는 이들의 염을 포함하는 단백질 또는 펩타이드의 표지화하는 방법에 관한 것이다.Still another object of the present invention relates to a method for labeling a protein or peptide comprising a phenol compound of the above formula (1), a stereoisomer thereof, a tautomer thereof, or a salt thereof.

또한, 본 발명의 목적은 화합물내에 황원자가 존재하지 않기 때문에 표지된 단백질 또는 펩타이드가 한 종류만 존재하여, 표지된 단백질 또는 펩타이드의 질량분석이 가능하고, 상기 질량분석 결과를 통해 단백질의 종류를 확인할 수 있는, 상기 화학식 1을 갖는 페놀 화합물를 이용하여 단백질을 표지하여 단백질을 탐지하는 방법에 관한 것이다.In addition, the object of the present invention is to provide a method for mass spectrometric analysis of a labeled protein or a peptide, wherein only one labeled protein or peptide is present because no sulfur element is present in the compound, A method for detecting a protein by labeling the protein using the phenol compound having the formula (1).

본 발명의 또 다른 목적은 상기 화학식 1을 갖는 페놀 화합물를 포함하는 단백질 탐지용 조성물을 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a composition for detecting a protein comprising a phenol compound having the formula (1).

이에, 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해서 과산화효소를 이용한 단백질 표지를 하기 위한 프로브를 개발하여 본 발명을 완성하였다.In order to solve the above problems, a probe for protein labeling using peroxidase has been developed and the present invention has been completed.

본 발명의 목적은 화합물내에 황원자가 존재하지 않기 때문에 표지된 단백질 또는 펩타이드가 한 종류만 존재하여, 표지된 단백질 또는 펩타이드의 질량분석이 가능하고, 상기 질량분석 결과를 통해 단백질의 종류를 확인하고, 그 구조정보도 확인이 가능한, 하기 화학식 1을 갖는 페놀 화합물, 및 이의 제조방법에 관한 것이다.It is an object of the present invention to provide a method for mass spectrometric analysis of a labeled protein or peptide in which only one labeled protein or peptide exists because no sulfur is present in the compound, A phenolic compound having the following formula (1), and a method for producing the same.

[화학식 1][Chemical Formula 1]

Figure pat00002
Figure pat00002

본 발명의 또 다른 목적은, 상기의 화학식 1의 페놀 화합물, 이의 입체 이성질체, 호변 이성질체, 또는 이들의 염을 포함하는 단백질 또는 펩타이드 표지용 조성물을 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a composition for labeling a protein or peptide comprising the phenolic compound of formula (I), a stereoisomer thereof, a tautomer thereof, or a salt thereof.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기의 화학식 1의 페놀 화합물, 이의 입체 이성질체, 호변 이성질체, 또는 이들의 염을 포함하는 단백질 또는 펩타이드의 표지화하는 방법에 관한 것이다.Still another object of the present invention relates to a method for labeling a protein or peptide comprising a phenol compound of the above formula (1), a stereoisomer thereof, a tautomer thereof, or a salt thereof.

또한, 본 발명의 목적은 화합물내에 황원자가 존재하지 않기 때문에 표지된 단백질 또는 펩타이드가 한 종류만 존재하여, 표지된 단백질 또는 펩타이드의 질량분석이 가능하고, 상기 질량분석 결과를 통해 단백질의 종류를 확인할 수 있는, 상기 화학식 1을 갖는 페놀 화합물를 이용하여 단백질을 표지하여 단백질을 탐지하는 방법에 관한 것이다.In addition, the object of the present invention is to provide a method for mass spectrometric analysis of a labeled protein or a peptide, wherein only one labeled protein or peptide is present because no sulfur element is present in the compound, A method for detecting a protein by labeling the protein using the phenol compound having the formula (1).

본 발명의 또 다른 목적은 상기 화학식 1을 갖는 페놀 화합물를 포함하는 단백질 탐지용 조성물을 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a composition for detecting a protein comprising a phenol compound having the formula (1).

본 발명에 따른 페놀 화합물인 데스티오비오틴-페놀 (Desthiobiotin-Phenol; DBP)은 황원자를 포함하지 않기 때문에 최종산물이 한 종류만 존재하여, 이를 이용하여 단백질을 표시할 경우, 표지된 단백질을 용이하게 탐지할 수 있다. 자세하게는, 본 발명에 따른 데스티오비오틴-페놀은 단백질의, 타이로신 잔기에 결합하여, 표지하며, 그 단백질의 구조에 관한 정보도 확인할 수 있다.Since Desthiobiotin-Phenol (DBP), which is a phenol compound according to the present invention, does not contain a sulfur atom, only one kind of final product exists, and when a protein is expressed using the resultant product, It can detect. In detail, the desiobiotin-phenol according to the present invention binds to and labels the tyrosine residue of the protein, and information on the structure of the protein can also be confirmed.

본 발명의 일예는 하기의 화학식 1의 구조를 가지는 페놀 화합물, 이의 입체 이성질체 (Sereoisomers), 호변 이성질체 (Tautomers) 또는 이들의 염을 제공하는 것이다.An example of the present invention is to provide a phenol compound having the structure of the following formula (1), its stereoisomers (Sautomers), tautomers (Tautomers) or salts thereof.

[화학식 1][Chemical Formula 1]

Figure pat00003
Figure pat00003

본 발명의 일예는 하기 화학식 2의 화합물과 티라민 (Tyramine)을 아미드 결합으로 연결하는 단계를 포함하는, 상기 화학식 1의 화합물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.An example of the present invention is to provide a method for preparing the compound of formula (1), which comprises coupling a compound of formula (2) with tyramine by an amide bond.

[화학식 2] (2)

Figure pat00004
Figure pat00004

본 발명의 일예는 상기의 화학식 1의 페놀 화합물, 이의 입체 이성질체, 호변 이성질체, 또는 이들의 염을 포함하는 단백질 또는 펩타이드 표지용 조성물을 제공하는 것이다.An example of the present invention is to provide a composition for labeling a protein or peptide comprising the phenol compound of Formula 1, a stereoisomer thereof, a tautomer thereof, or a salt thereof.

본 발명의 일예는 표지를 위한 세포 내 목적 단백질이 존재하는 세포 소기관으로 표적화 서열을 코딩하는 유전자와 과산화효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 세포에 도입하는 단계;In one embodiment of the present invention, there is provided a method for producing a target organism, the method comprising: introducing a polynucleotide comprising a gene encoding a targeting sequence and a gene encoding a peroxidase into a cell organelle where a target protein in the cell exists for labeling;

상기 화합물 및 과산화수소를 상기 세포에 처리하는 단계; Treating the cell with the compound and hydrogen peroxide;

상기 세포를 파쇄하여 세포 파쇄물을 수득하는 단계; 및Disrupting the cell to obtain a cell lysate; And

상기 세포 파쇄물에 스트렙타아비딘 (Streptavidin: SA) 비드를 넣어 표지된 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 단백질의 표지 방법을 제공하는 것이다.And then labeling the cell lysate with streptavidin (SA) beads to obtain a labeled protein.

본 발명자들은 새로운 화학적 프로브 (a new chemical probe)를 디자인하였다. 본 발명의 새로운 화학적 프로브는 과산화효소에 의해서 단백질을 표지하는 역할을 할 수 있다.The present inventors have designed a new chemical probe. The novel chemical probe of the present invention can serve to label proteins with peroxidase.

본 발명에 있어서, 과산화효소를 세포에 처리하고 상기 화학적 프로브 (데비오틴이 결합된 페놀 화합물) 및 과산화수소를 처리하면, 세포 안에서 발현된 상기 APEX의 작용으로 데스티오비오틴이 결합된 페놀가 데스티오비오틴이 결합된 페녹시 라디칼 (biotin-phenoxyl radical)로 전환되고, 상기 데스티오비오틴이 결합된 페녹시 라디칼은 반경 약 5 내지 50 nm 내에 존재하는 단백질들에 존재하는 타이로신 (Tyrosine)기와 공유결합을 형성함으로써 상기 단백질들에 데스티오비오틴이 결합하게 된다. 또한, 생성된 데스티오비오틴이 결합된 페녹시 라디칼은 인지질 막을 건널 수 없을 만큼 짧은 시간 동안만 존재하기 때문에, 막으로 둘러싸인 각각의 세포 소기관내에서 비오틴이 결합된 페녹시 라디칼이 생성되는 경우 각 세포 소기관내의 고유의 단백질들에만 비오틴이 결합할 수 있게 된다.In the present invention, when cells are treated with a peroxidase and the above-described chemical probe (phenol compound with debiotin) and hydrogen peroxide are treated, the action of the APEX expressed in the cells causes the deoxyribonucleotide deoxyribose The phenoxy radical to which the desistiobiotin is bound forms a covalent bond with a tyrosine group present in proteins present within a radius of about 5 to 50 nm, Resulting in binding of these proteins to destiobiotin. In addition, since the phenoxy radical to which the desoxybiotin is bound is present only for a short time not to cross the phospholipid membrane, when biotin-bound phenoxy radicals are generated in each of the cell organelles surrounded by the membrane, Biotin binds only to the intrinsic proteins in the organelle.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본 발명은 하기의 화학식 1의 구조를 가지는 신규한 페놀 화합물, 이의 입체 이성질체 (Stereoisomers), 호변 이성질체 (Tautomers) 또는 이들의 염에 관한 것이다.The present invention relates to a novel phenol compound, its stereoisomers, tautomers or salts thereof, having the structure of the following formula (1).

[화학식 1] [Chemical Formula 1]

Figure pat00005
Figure pat00005

상기 화학식 1의 구조를 가지는 신규한 화합물은 데스티오비오틴-페놀(Desthiobiotin-Phenol; 이하 DBP)이다.The novel compound having the structure of Formula 1 is Desthiobiotin-Phenol (DBP).

본 명세서에서, 용어 "입체 이성질체"는 분자식 및 구성원자의 연결 방법도 같으나 원자 사이의 공간적 배치가 다른 것을 말하며, 그 결합방법의 차이에 따라 부분입체 이성질체 및 거울상 이성질체로 나뉜다.In the present specification, the term "stereoisomer" refers to a molecule having a different spatial arrangement between atoms and members, but it is divided into a diastereomer and an enantiomer depending on the difference in the bonding method.

본 명세서에서, 용어 "호변 이성질체"는 유기물이 쉽게 변환이 가능한 구조 이성질체를 의미하며, 두 개의 호변 이성질체 간의 변환은 대개는 수소원자의 결합 위치가 변함으로써 일어나는 것이 알려져 있다.As used herein, the term "tautomer " refers to a structural isomer that is readily convertible to an organic material, and the conversion between two tautomers is generally known to occur by altering the bonding position of the hydrogen atom.

상기 신규한 화합물, 이의 입체 이성질체, 또는 호변 이성질체에 대한 염은 산 또는 염기의 부가염 및 그의 입체화학적 이성체 형태를 모두 포함하며, 예컨대, 유기산 또는 무기산의 부가염일 수 있다. 상기 염에는 투여 대상에서 모화합물(parent compound)의 활성을 유지하며 바람직하지 못한 효과를 유발하지 않는 염이라면 어느 것이든 포함되는 것으로, 특별히 제한되는 것이 아니다. Salts for the novel compounds, stereoisomers, or tautomers thereof include both acid addition salts of bases and stereochemically isomeric forms thereof, for example, addition salts of organic acids or inorganic acids. The salt is not particularly limited as long as it contains any salt that maintains the activity of the parent compound in the subject to be administered and does not cause undesirable effects.

이러한 염에는 무기염과 유기염이 포함되며, 예를 들어, 아세트산, 질산, 아스파트산, 술폰산, 설퓨릭산, 말레산, 글루탐산, 포름산, 숙신산, 인산, 프탈산, 탄닌산, 타르타르산, 히드로브롬산, 프로피온산, 벤젠술폰산, 벤조산, 스테아르산, 락트산(lactic acid), 비카르본산, 비설퓨릭산, 비타르타르산, 옥살산, 부틸산, 칼슘 이데트, 카르보닉산, 클로로벤조산, 시트르산, 이데트산, 톨루엔술폰산, 푸마르산, 글루셉트산, 에실린산, 파모익산, 글루코닉산, 메틸니트릭산, 말론산, 히드로클로린산, 히드로요도익산, 히드록시나프톨산, 이세티온산, 락토비오닉산, 만델산, 점액산, 나프실릭산, 뮤코닉산, p-니트로메탄설포닉산, 헥사믹산, 판토테닉산, 모노히드로겐인산, 디히드로겐인산, 살리실산, 술파민산, 술파닐린산, 메탄술폰산일 수 있다. Such salts include inorganic and organic salts and include, for example, acetic, nitric, aspartic, sulfonic, sulfuric, maleic, glutamic, formic, succinic, phosphoric, phthalic, tannic, tartaric, hydrobromic , Propionic acid, benzenesulfonic acid, benzoic acid, stearic acid, lactic acid, bicarboxylic acid, unsulfuric acid, non-tartaric acid, oxalic acid, butyric acid, calcium adduct, carbonic acid, chlorobenzoic acid, citric acid, But are not limited to, sulfonic acid, fumaric acid, gluceptic acid, eicosylic acid, pamoic acid, gluconic acid, methylnitric acid, malonic acid, hydrochloric acid, hydroiodo acids, hydroxynaphthol acid, isethionic acid, But are not limited to, hydrochloric acid, hydrobromic acid, hydrobromic acid, hydrobromic acid, hydrobromic acid, hydrobromic acid, hydrobromic acid, hydrobromic acid, menthyl acid, menthyl acid, mucilic acid, naphthylic acid, muconic acid, p-nitromethanesulfonic acid, hexamic acid, pantothenic acid, monohydrogenphosphoric acid, dihydrogenphosphoric acid, have.

또한, 상기 염의 형태로는, 암모늄염, 리튬염, 소듐염, 포타슘염, 마그네슘염 및 칼슘염과 같은 알칼리 및 알칼리 토금속의 염, 예를 들어, 벤자틴, N-메틸-D-글루카민, 하이드라바민 염과 같은 유기 염기를 갖는 염, 및 아르기닌, 리신과 같은 아미노산을 갖는 염을 포함한다. 또한, 상기 염 형태는 적당한 염기 또는 산으로 처리함으로써 유리 형태로 전환될 수도 있다. Examples of the salts include salts of alkali and alkaline earth metals such as ammonium salts, lithium salts, sodium salts, potassium salts, magnesium salts and calcium salts such as benzathine, N-methyl-D-glucamine, Salts with organic bases such as arabinic salts, and salts with amino acids such as arginine, lysine. The salt form may also be converted to the free form by treatment with an appropriate base or acid.

상기 페놀 화합물은 과산화효소에 의해서 라디칼을 생성하며, 상기 과산화효소 자체에서도 라디칼이 생성될 수 있다. 상기 페놀 화합물 또는 과산화효소에 생성된 라디칼은 전파 (propagation)될 수도 있다. 상기 페놀 화합물에 라디칼이 생성되는 위치 및 상기 라디칼이 전파되는 과정은 도 30에 나타나 있다.The phenol compound generates radicals by peroxidase, and radicals can also be produced in the peroxidase itself. The phenol compound or the radical generated in the peroxidase may be propagated. The position where radicals are generated in the phenol compound and the process of propagating the radicals are shown in FIG.

상기 생성된 라디칼은 단백질 또는 펩타이드에 존재하는 타이로신 (Tyrosine)기와 공유결합을 형성하여 상기 단백질 또는 펩타이드에 결합하는 것일 수 있으며, 상기 라디칼이 단백질 또는 펩타이드에 결합하는 거리는 5 내지 50 nm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The generated radical may form a covalent bond with a tyrosine group present in a protein or a peptide to bind to the protein or peptide. The distance that the radical binds to the protein or peptide may be 5 to 50 nm, But is not limited thereto.

상기 과산화효소는 대두 아스코르베이트 과산화효소(Soybean ascorbate peroxidase), 애기장대 아스코르베이트 과산화효소 (Arabidopsis ascorbate peroxidase), 시금치 아스코르베이트 과산화효소 (Spinach ascorbate peroxidase), 사카로미세스 세레비시에 시토크롬 c 과산화효소 (Saccharomyces cerevisiae cytochrome c peroxidase), 파네로카에테 크리소스포리움 과산화효소 PCL1 (Phanerochaete chrysosporium PCL1), 파네로카에테 크리소스포리움 과산화효소 PCM (Phanerochaete chrysosporium PCM), 코프리놉시스 시네레아 과산화효소 (Coprinopsis cinerea peroxidase), 땅콩 과산화효소 (Peanut Peroxidase), 애기장대 과산화효소 ATPA2 (Arabidopsis ATPA2), 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 효소, 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 효소 및 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 효소로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 효소일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The peroxidase may be selected from the group consisting of soybean ascorbate peroxidase, Arabidopsis ascorbate peroxidase, spinach ascorbate peroxidase, saccharomyces cerevisiae cytochrome c peroxide The enzymes Saccharomyces cerevisiae cytochrome c peroxidase, Phanerochaete chrysosporium PCL1, Phanerochaete chrysosporium PCM, Coprinopsis cinereosporium peroxidase, An enzyme consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, an enzyme consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 An enzyme selected from the group consisting of Soil can be, but is not limited to this.

상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 아스코르베이트 과산화효소는 서열번호 2의 염기 서열에 의하여 코딩되고, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 아스코르베이트 과산화효소는 서열번호 4의 염기 서열에 의하여 코딩될 수 있다.The ascorbate peroxidase comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, and the ascorbate peroxidase comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 is encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: Lt; / RTI >

본 발명에서, 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 효소는 호스라디쉬 과산화효소(Horseradish Peroxidase, HRP)이다. 상기 호스라디쉬 과산화효소는 산화 환경을 갖춘 분비 경로(Secretory Pathway)에서 활성을 나타내는 것으로, 본 발명에서는 자연적으로 산화환경이 조성되어있는 분비 경로상의 세포 내 공간인 소포체나 골지체 등에서 서열번호 1 또는 서열번호 3으로 이루어진 아스코르베이트 과산화효소와 동일한 효과를 낼 수 있다. 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 호스라디쉬 과산화효소는 서열번호 6의 염기 서열에 의하여 코딩될 수 있다.In the present invention, the enzyme consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 is Horseradish Peroxidase (HRP). The hosadradish peroxidase exhibits activity in a secretory pathway with an oxidizing environment. In the present invention, in the intracellular space, such as an endoplasmic reticulum or Golgi, in the secretory pathway naturally oxidized, The same effect as the ascorbate peroxidase of No. 3 can be obtained. The horseradish peroxidase comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO:

본 발명은 하기 화학식 1의 화합물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.The present invention provides a process for preparing a compound of formula (1).

본 발명에서 하기 화학식 1의 화합물은 하기의 화학식 2의 화합물을 시작물질로 사용하여 반응식 1의 반응에 의해 제조될 수 있다.In the present invention, the compound of the formula (1) can be prepared by the reaction of the reaction formula (1) using the compound of the following formula (2) as a starting material.

[화학식 1][Chemical Formula 1]

Figure pat00006
Figure pat00006

[화학식 2](2)

Figure pat00007
Figure pat00007

[반응식 1][Reaction Scheme 1]

Figure pat00008
Figure pat00008

구체적으로, 상기 화학식 2의 화합물과 티라민 (Tyramine)을 아미드 결합으로 연결할 수 있고, 상기 아미드 결합은 상기 화학식 2의 화합물을 유기용매에 용해하고 커플링제와 티라민을 첨가하여 형성할 수 있으며, 상기 커플링제는 2-(7-aza-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU)과 N,N-diisopropylethylamine (DIPEA)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The amide bond may be formed by dissolving the compound of Formula 2 in an organic solvent, adding a coupling agent and tyramine, and the coupling agent may be formed by coupling the compound of Formula 2 with tyramine, But are not limited to, 2- (7-aza-1H-benzotriazole-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU) and N, N-diisopropylethylamine (DIPEA).

본 발명은 하기의 화학식 1의 페놀 화합물을 포함하는 단백질 또는 펩타이드 표지용 조성물을 제공하는 것이다.The present invention provides a protein or peptide labeling composition comprising a phenol compound represented by the following general formula (1).

본 발명에서 상기 단백질 표지용 조성물은 하기의 화학식 1의 페놀 화합물, 이의 입체 이성질체, 호변 이성질체, 또는 이들의 염을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다:In the present invention, the protein labeling composition may include, but is not limited to, a phenol compound represented by the following formula (1), a stereoisomer thereof, a tautomer thereof, or a salt thereof:

[화학식 1][Chemical Formula 1]

Figure pat00009
Figure pat00009

상기 페놀 화합물은 과산화효소에 의해서 라디칼을 생성하며, 상기 과산화효소 자체에서도 라디칼이 생성될 수 있다. 상기 페놀 화합물 또는 과산화효소에 생성된 라디칼은 전파 (propagation)될 수도 있다. 상기 페놀 화합물에 라디칼이 생성되는 위치 및 상기 라디칼이 전파되는 과정은 도 30에 나타나 있다.The phenol compound generates radicals by peroxidase, and radicals can also be produced in the peroxidase itself. The phenol compound or the radical generated in the peroxidase may be propagated. The position where radicals are generated in the phenol compound and the process of propagating the radicals are shown in FIG.

상기 생성된 라디칼은 단백질 또는 펩타이드에 존재하는 타이로신 (Tyrosine)기와 공유결합을 형성하여 상기 단백질 또는 펩타이드에 결합하는 것일 수 있으며, 상기 라디칼이 단백질 또는 펩타이드에 결합하는 거리는 5 내지 50 nm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The generated radical may form a covalent bond with a tyrosine group present in a protein or a peptide to bind to the protein or peptide. The distance that the radical binds to the protein or peptide may be 5 to 50 nm, But is not limited thereto.

상기 과산화효소는 대두 아스코르베이트 과산화효소(Soybean ascorbate peroxidase), 애기장대 아스코르베이트 과산화효소 (Arabidopsis ascorbate peroxidase), 시금치 아스코르베이트 과산화효소 (Spinach ascorbate peroxidase), 사카로미세스 세레비시에 시토크롬 c 과산화효소 (Saccharomyces cerevisiae cytochrome c peroxidase), 파네로카에테 크리소스포리움 과산화효소 PCL1 (Phanerochaete chrysosporium PCL1), 파네로카에테 크리소스포리움 과산화효소 PCM (Phanerochaete chrysosporium PCM), 코프리놉시스 시네레아 과산화효소 (Coprinopsis cinerea peroxidase), 땅콩 과산화효소 (Peanut Peroxidase), 애기장대 과산화효소 ATPA2 (Arabidopsis ATPA2), 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 효소, 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 효소 및 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 효소로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 효소일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The peroxidase may be selected from the group consisting of soybean ascorbate peroxidase, Arabidopsis ascorbate peroxidase, spinach ascorbate peroxidase, saccharomyces cerevisiae cytochrome c peroxide The enzymes Saccharomyces cerevisiae cytochrome c peroxidase, Phanerochaete chrysosporium PCL1, Phanerochaete chrysosporium PCM, Coprinopsis cinereosporium peroxidase, An enzyme consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, an enzyme consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 An enzyme selected from the group consisting of Soil can be, but is not limited to this.

본 발명에서 상기 단백질 표지용 조성물은 표지를 위한 세포 내 목적 단백질을 표지하는데 사용될 수 있다.In the present invention, the protein labeling composition can be used to label target proteins in cells for labeling.

본 발명은 하기 화학식 1의 페놀 화합물을 이용하여 단백질을 표지하는 방법을 제공하는 것이다.The present invention provides a method for labeling a protein using a phenol compound represented by the following formula (1).

상기 단백질을 표지하는 방법은 하기와 같은 방법을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The method of labeling the protein can be performed by the following method, but is not limited thereto.

구체적으로, 본 발명은 표지를 위한 세포 내 목적 단백질이 존재하는 세포 소기관으로 표적화 서열을 코딩하는 유전자와 과산화효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 세포에 도입하는 단계; 및Specifically, the present invention provides a method for detecting a target organism, the method comprising: introducing a polynucleotide including a gene encoding a targeting sequence and a gene encoding a peroxidase into a cell organelle where a target protein in the cell exists for a label; And

상기 세포에 하기 화학식 1의 페놀 화합물 및 과산화수소를 처리하여 상기 페놀 화합물로 세포 내 단백질을 표지화하는 단계를 포함하는 단백질의 표지 방법을 제공하는 것이다.Treating the cell with a phenol compound represented by the following formula (1) and hydrogen peroxide to label the protein in the cell with the phenol compound.

[화학식 1][Chemical Formula 1]

Figure pat00010
Figure pat00010

상기 폴리뉴클레오타이드를 세포에 도입하는 단계 이전에 상기 폴리뉴클레오타이드를 제조하는 과정을 추가로 포함할 수 있다.And the step of preparing the polynucleotide before the step of introducing the polynucleotide into the cell.

상기 폴리뉴클레오타이드를 제조하는 과정은 상기 목적 단백질이 존재하는 세포 소기관으로 표적화 서열을 코딩하는 유전자와 과산화효소를 코딩하는 유전자가 연결되도록 융합된 폴리뉴클레오타이드를 제조한 것을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The process for producing the polynucleotide may include preparing a polynucleotide fused so that a gene encoding a targeting sequence and a gene encoding a peroxidase are linked to a cell organelle in which the target protein exists, no.

상기 폴리뉴클레오타이드를 제조하는 과정에서, 상기 세포 소기관은 미토콘드리아, 소포체, 핵, 세포질 및 골지체로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 상기 세포 소기관으로 표적화 서열을 코딩하는 유전자에는 미토콘드리아 기질 발현 유전자, 세포질 발현 유전자, 미토콘드리아 이중막 사이 공간 발현 유전자, 핵 발현 유전자, 세포 외막 발현 유전자, 소포체 내막 발현 유전자, 소포체 외막 발현 유전자, 또는 세포 내막 발현 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 세포 소기관으로 표적화 서열을 코딩하는 유전자는 하기 표 1에 나타나 있다.In the process of preparing the polynucleotide, the cell organelles may be selected from the group consisting of mitochondria, endoplasmic reticulum, nucleus, cytoplasm, and Golgi. The gene coding for the targeting sequence in the cell organelle may include a mitochondrial substrate expression gene, But are not limited to, a gene, a space expression gene between mitochondrial double membranes, a nuclear expression gene, an extracellular membrane expression gene, an endoplasmic reticulum expression gene, an endoplasmic reticulum expression gene, or an intracellular expression gene. The genes encoding the targeting sequences into the organelles are shown in Table 1 below.

플라스미드Plasmid 특징Characteristic Promoter/ VectorPromoter / Vector 세부사항Detail mito-APEXmito-APEX NotI-mito-BamHI-V5-APEX-Stop-XhoI
미토콘드리아 기질 발현
NotI-mito-BamHI-V5-APEX-Stop-XhoI
Mitochondrial substrate expression
CMV/pCDNA3CMV / pCDNA3 mito matrix targeting sequence: MLATRVFSLVGKRAISTSVCVRAH
V5: GKPIPNPLLGLDST
mito matrix targeting sequence: MLATRVFSLVGKRAISTSVCVRAH
V5: GKPIPNPLLGLDST
APEX-NES
APEX-NES
NotI-Flag-APEX-NES-Stop-XhoI
세포질 발현
NotI-Flag-APEX-NES-Stop-XhoI
Cytoplasmic expression
CMV/pCDNA3CMV / pCDNA3 NES: LQLPPLERLTLDNES: LQLPPLERLTLD
IMS-APEXIMS-APEX NotI-LACTB(1-68)-BamHI-V5-APEX-Stop-XhoI
미토콘드리아 이중 막 사이 공간 발현
NotI-LACTB (1-68) -BamHI-V5-APEX-Stop-XhoI
Expression of space between mitochondrial membrane
CMV/pCDNA3CMV / pCDNA3 LACTB(1-68): MYRLLSSVTARAAATAGPAWDGGRRGAHRRPGLPVLGLGWAGGLGLGLGLALGAKLVVGLRGAVPIQS
LACTB (1-68): MYRLLSSVTARAAATAGPAWDGGRRGAHRRPGLPVLGLGWAGGLGLGLGLALGAKLVVGLRGAVPIQS
APEX-NLSAPEX-NLS NotI-Flag-APEX-EcoRI-NLS-Stop-XhoI
핵 발현
NotI-Flag-APEX-EcoRI-NLS-Stop-XhoI
Nuclear manifestation
CMV/pCDNA3CMV / pCDNA3 NLS: PKKKRKVDPKKKRKVDPKKKRKVNLS: PKKKRKVDPKKKRKVDPKKKRKV
APEX-TMAPEX-TM EcoRI-ss-HA-ApaI-APEX-SacII-myc-TM-Stop-NotI
세포외막 발현
EcoRI-ss-HA-ApaI-APEX-SacII-myc-TM-Stop-NotI
Extracellular membrane expression
CMV/pDisplayCMV / pDisplay ss: Igk chain signal sequence in pDisplay (Invitrogen).
HA: YPYDVPDYA
myc: EQKLISEEDL
TM: transmembrane domain of PDGF receptor from pDisplay (Invitrogen)
ss: Igk chain signal sequence in pDisplay (Invitrogen).
HA: YPYDVPDYA
myc: EQKLISEEDL
TM: transmembrane domain of PDGF receptor from pDisplay (Invitrogen)
APEX-KDELAPEX-KDEL EcoRI-ss-BglII-APEX-V5-KDEL-Stop-NotI
소포체 내막 발현
EcoRI-ss-BglII-APEX-V5-KDEL-Stop-NotI
Expression of endoplasmic reticulum
CMV/pDisplayCMV / pDisplay KDEL: ER retention motif
KDEL: ER retention motif
C1(1-29)-APEXC1 (1-29) -APEX HindIII-C1(1-29)-NotI-APEX-V5-Stop-XhoI
소포체 외막 발현
HindIII-C1 (1-29) -NotI-APEX-V5-Stop-XhoI
Expression of endoplasmic reticulum outer membrane
CMV/pCDNA3CMV / pCDNA3 C1(1-29):MDPVVVLGLCLSCLLLLSLWKQSYGGGKL (endoplasmic reticulum membrane anchor)C1 (1-29): MDPVVVLGLCLSCLLLLSLWKQSYGGGKL (endoplasmic reticulum membrane anchor)
W41AAPX-CAAXW41AAPX-CAAX NotI-Flag-W41AAPX-EcoRI-CAAX-Stop-XhoI
세포내막 발현
NotI-Flag-W41AAPX-EcoRI-CAAX-Stop-XhoI
Intracellular membrane expression
CMV/pCDNA3CMV / pCDNA3 CAAX: RSKLNPPDESGPGCMSCKCVLSCAAX: RSKLNPPDESGPGCMSCKCVLS
HRP-TMHRP-TM EcoRI-ss-HA-ApaI-HRP-SacII-myc-TM-Stop-NotI
세포외막 발현
EcoRI-ss-HA-ApaI-HRP-SacII-myc-TM-Stop-NotI
Extracellular membrane expression
CMV/pDisplayCMV / pDisplay The HRP gene was a gift from Frances Arnold (Caltech)The HRP gene was a gift from Frances Arnold (Caltech)
HRP-KDELHRP-KDEL EcoRI-ss-BglII-HRP-V5-KDEL-Stop-NotI
소포체 내막 발현
EcoRI-ss-BglII-HRP-V5-KDEL-Stop-NotI
Expression of endoplasmic reticulum
CMV/pDisplayCMV / pDisplay

상기 폴리뉴클레오타이드를 세포에 도입하는 단계는 형질 전환 (Transfection) 또는 형질 도입 (Transduction)을 통해 매개될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 위의 APEX 폴리뉴클레오타이드 자리에 퍼옥시데이즈 활성이 더욱 향상된 APEX2의 폴리뉴클레오타이드 (서열번호 3의 아미노산 및 서열번호 4의 염시서열)를 사용할수 있으나 이에 제한되지 않는다. The step of introducing the polynucleotide into a cell may be mediated through, but not limited to, transfection or transduction. The polynucleotide of APEX2 (the amino acid of SEQ ID NO: 3 and the salt sequence of SEQ ID NO: 4) which further enhances the peroxidase activity in the above APEX polynucleotide site can be used but is not limited thereto.

상기 페놀 화합물 및 과산화수소를 처리하는 단계에서, 상기 화합물의 처리는, 상기 화학식 1의 구조를 가지는 화합물을 0.1 uM 내지 1 mM의 농도로 10 내지 60분 동안 처리하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the step of treating the phenol compound and the hydrogen peroxide, the treatment of the compound may be performed by treating the compound having the structure of Formula 1 at a concentration of 0.1 uM to 1 mM for 10 to 60 minutes, but is not limited thereto .

상기 페놀 화합물 및 과산화수소를 처리하는 단계에서, 과산화효소는 대두 아스코르베이트 과산화효소(Soybean ascorbate peroxidase), 애기장대 아스코르베이트 과산화효소 (Arabidopsis ascorbate peroxidase), 시금치 아스코르베이트 과산화효소 (Spinach ascorbate peroxidase), 사카로미세스 세레비시에 시토크롬 c 과산화효소 (Saccharomyces cerevisiae cytochrome c peroxidase), 파네로카에테 크리소스포리움 과산화효소 PCL1 (Phanerochaete chrysosporium PCL1), 파네로카에테 크리소스포리움 과산화효소 PCM (Phanerochaete chrysosporium PCM), 코프리놉시스 시네레아 과산화효소 (Coprinopsis cinerea peroxidase), 땅콩 과산화효소 (Peanut Peroxidase), 애기장대 과산화효소 ATPA2 (Arabidopsis ATPA2), 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 효소, 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 효소 및 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 효소로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 효소일 수 있고, 상기 과산화수소의 처리는 과산화수소를 0.1 내지 2 mM의 농도로 1 내지 10분 동안 처리하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the step of treating the phenol compound and the hydrogen peroxide, the peroxidase is selected from the group consisting of soybean ascorbate peroxidase, Arabidopsis ascorbate peroxidase, spinach ascorbate peroxidase, , Saccharomyces cerevisiae cytochrome c peroxidase, Phanerochaete chrysosporium PCL1, Phanerochaete chrysosporium PCL1, Phanerochaete chrysosporium PCL1, PCM), Coprinopsis cinerea peroxidase, Peanut Peroxidase, Arabidopsis ATPA2, an enzyme consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 And an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 May be at least one enzyme selected from the group consisting of binary luer enzyme, the process of the hydrogen peroxide is not intended to be to process for 1 to 10 minutes of hydrogen peroxide at a concentration of 0.1 to 2 mM, but limited.

상기 세포는 제한이 없고, 모든 동물 세포, 식물 세포, 미생물 등을 포함할 수 있다. 예를 들어, 형질 감염(transfection)이 가능한 동물 세포 (Mammalian cell)일 수 있다. 구체적인 예로, 신장 세포, 암 세포, 피부 세포, 난소 세포, 활막세포, 말초혈액단핵구 세포, 섬유아세포, 섬유세포, 신경세포, 상피세포, 각질세포, 조혈세포, 멜라닌 세포, 연골세포, 대식세포, 근육세포, 혈액 세포, 골수 세포, 림프구 세포, 단핵세포, 폐 세포, 췌장 세포, 간 세포, 위 세포, 장 세포, 심장 세포, 방광 세포, 요도 세포, 배아 생식세포 또는 난구세포 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 더욱 구체적으로, 상기 동물 세포는 신장세포 (HEK293T 세포, HEK293 세포 등), 암 세포 (HeLa 세포 등), 원숭이 콩팥 세포 (COS-7 세포 등), 골육종 세포 (U2OS 세포 등), 피부세포 (NIH3T3 세포 등), 난소 세포 (CHO 세포 등) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The cell is not limited and may include all animal cells, plant cells, microorganisms, and the like. For example, it may be a mammalian cell capable of transfection. Specific examples thereof include kidney cells, cancer cells, skin cells, ovarian cells, synovial cells, peripheral blood mononuclear cells, fibroblasts, fibroblasts, neurons, epithelial cells, keratinocytes, hematopoietic cells, melanocytes, cartilage cells, macrophages, And may include muscle cells, blood cells, bone marrow cells, lymphocyte cells, mononuclear cells, lung cells, pancreatic cells, liver cells, gastric cells, intestinal cells, cardiac cells, bladder cells, urethral cells, embryonic germ cells or cumulus cells But is not limited thereto. More specifically, the animal cells can be cultured in an animal such as kidney cells (HEK293T cells, HEK293 cells), cancer cells (HeLa cells, etc.), monkey kidney cells (COS-7 cells, etc.), osteosarcoma cells (U2OS cells, etc.) Cells, etc.), ovary cells (CHO cells, etc.), and the like.

본 발명에서 과산화효소를 세포에 주입하고 페놀 화합물 및 과산화수소를 처리하면, 세포 안에서 발현된 상기 효소의 작용으로 페놀가 페녹시 라디칼로 전환되고, 상기 페녹시 라디칼은 반경 약 5 내지 50 nm 내에 존재하는 단백질들의에 존재하는 타이로신 (Tyrosine)기와 공유결합을 형성함으로써 상기 단백질들에 결합하게 된다. 또한, 생성된 페녹시 라디칼은 인지질 막을 건널 수 없을 만큼 짧은 시간 동안만 존재하기 때문에, 막으로 둘러싸인 각각의 세포 소기관내에서 페녹시 라디칼이 생성되는 경우 각 세포 소기관내의 고유의 단백질들에만 페놀 화합물이 결합할 수 있게 된다.In the present invention, when a peroxidase is injected into a cell and a phenol compound and hydrogen peroxide are treated, the phenol is converted into a phenoxy radical by the action of the enzyme expressed in the cell, and the phenoxy radical is a protein having a radius of about 5 to 50 nm And binds to the proteins by forming a covalent bond with the tyrosine group present in the ss. In addition, since the produced phenoxy radicals exist only for a short time so as not to be able to cross the phospholipid membrane, when phenoxy radicals are generated in the membrane-enclosed cell organelles, only phenolic compounds Lt; / RTI >

상기 화합물은 과산화효소에 의해서 라디칼 (Radical)을 생성하는 것이고, 상기 생성된 라디칼은 단백질 또는 펩타이드에 존재하는 타이로신 (Tyrosine)기와 공유결합을 형성하여 상기 단백질 또는 펩타이드에 결합하는 것이며, 상기 라디칼이 단백질 또는 펩타이드에 결합하는 거리는 5 내지 50 nm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The compound produces a radical by a peroxidase enzyme and the produced radical forms a covalent bond with a tyrosine group present in a protein or peptide to bind to the protein or peptide, Or the distance to the peptide may be 5 to 50 nm, but is not limited thereto.

각 세포 소기관에는 고유의 단백질체가 존재하기 때문에, 상기와 같이 데스티오비오틴이 결합되는 단백질들은 세포 소기관마다 상이하고 과산화효소를 발현시킨 공간에 존재하는 단백질들이 표지된다. 상기 표지된 세포를 용해 후, 데스티오비오틴과 결합할 수 있는 스트렙타아비딘 (Streptavidin; SA)-비드에 상기 표지된 단백질들을 붙여두고 트립신 처리를 하여 표지되지 않은 펩타이드들을 잘라낼 수 있다. 그리고 나서, 포름아마이드 (Formamide)를 비드에 결합된 표지된 단백질에 처리하고 가열하여 표지된 펩타이드를 얻어내며, 이를 질량분석하여 그 단백질을 동정하고 그 구조 정보를 확인할 수 있다.Since each intracellular organelle has an intrinsic protein body, the proteins to which deschiobiotin is bound are different for each organelle and the proteins present in the space in which the peroxidase is expressed are labeled. After the labeled cells are dissolved, the labeled proteins can be stuck to streptavidin (SA) -beads capable of binding to destiobiotin, and trypsin treatment can be performed to remove unlabeled peptides. Then, the formamide is treated with the labeled protein bound to the beads and heated to obtain the labeled peptide, which is then mass analyzed to identify the protein and confirm its structural information.

상기 세포 소기관 (Organelle)은 세포의 내부에 존재하며 세포의 여러 가지 기능을 분업으로 하고 있는 구조단위를 의미한다. 바람직하게, 본 발명에 있어서 세포 소기관은 세포 내막에 싸인 구조체로, 다른 공간과는 구획한 세포 내 구획을 형성하고 있으며 고유의 미세환경을 갖는 소기관을 의미한다. 이러한 세포 소기관은 고유의 기능을 가지며, 예를 들어, 미토콘드리아, 소포체, 핵, 세포질, 골지체, 리소솜, 파고솜, 퍼옥시솜 등 일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 식물세포의 경우 엽록체, 액포 등을 포함할 수 있다.The organelle refers to a structural unit that is present in the interior of a cell and that divides various functions of cells. Preferably, in the present invention, a cell organelle is a structure surrounded by an intracellular membrane, and forms an intracellular compartment that is separated from another space and means an organelle having a unique microenvironment. These organelles have their own functions and may be, for example, mitochondria, endoplasmic reticulum, nucleus, cytoplasm, Golgi, lysosomes, pagosomes, peroxisomes and the like. In the case of plant cells, . ≪ / RTI >

상기 페놀 화합물로 세포 내 단백질을 표지화 하는 단계 이후에 세포를 파쇄하여 세포 파쇄물을 수득하고, 상기 세포의 파쇄물에 스트렙타비딘 (Streptavidin: SA) 비드를 첨가하여, 상기 스트렙타비딘 비드에 결합된 표지 단백질을 수득하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.The step of labeling the intracellular protein with the phenol compound is followed by disruption of the cell to obtain a cell lysate. Streptavidin (SA) beads are added to the cell lysate to form a label attached to the streptavidin bead And a step of obtaining a protein.

상기 스트렙타비딘 비드에 결합된 표지 단백질을 수득하는 단계에서 상기 세포 파쇄물에 스트렙타비딘 비드를 첨가하면 페놀 화합물, 구체적으로는 DBP가 결합된 표지 단백질이 스트렙타비딘 비드와 결합할 수 있다.When a streptavidin bead is added to the cell lysate in the step of obtaining the labeled protein bound to the streptavidin bead, a phenol compound, specifically, a labeled protein to which DBP is bound can bind to the streptavidin bead.

본 발명은 상기 페놀 화합물을 이용하여 단백질을 표지하는 방법을 제공하고, 상기 표지된 단백질을 확인하여 단백질을 탐지하는 방법을 제공한다.The present invention provides a method for labeling a protein using the phenol compound and a method for identifying the labeled protein to detect the protein.

구체적으로, 탐지를 위한 세포 내 목적 단백질이 존재하는 세포 소기관으로 표적화 서열을 코딩하는 유전자와 과산화효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 세포에 도입하는 단계;Specifically, introducing into a cell a polynucleotide comprising a gene encoding a targeting sequence and a gene encoding a peroxidase into a cell organelle in which an intracellular target protein exists for detection;

상기 세포에 하기 화학식 1의 구조를 갖는 페놀 화합물 및 과산화수소를 처리하여 상기 페놀 화합물로 세포 내 단백질을 표지화하는 단계;Treating the cell with a phenol compound having a structure represented by the following formula (1) and hydrogen peroxide to label the intracellular protein with the phenol compound;

상기 세포의 파쇄물에 스트렙타비딘 (Streptavidin: SA) 비드를 첨가하여, 상기 스트렙타비딘 비드에 결합된 표지 단백질을 수득하는 단계; 및Adding a Streptavidin (SA) bead to the cell lysate to obtain a labeled protein bound to the streptavidin bead; And

상기 수득물에서 목적 단백질을 확인하는 단계를 포함하는 단백질의 탐지 방법을 통해서 표지된 목적 단백질을 탐지할 수 있다.And detecting the target protein by detecting the target protein in the obtained product.

[화학식 1] [Chemical Formula 1]

Figure pat00011
Figure pat00011

상기 폴리뉴클레오타이드를 세포에 도입하는 단계 이전에 상기 폴리뉴클레오타이드를 제조하는 과정을 추가로 포함할 수 있다.And the step of preparing the polynucleotide before the step of introducing the polynucleotide into the cell.

상기 폴리뉴클레오타이드를 제조하는 과정은 상기 목적 단백질이 존재하는 세포 소기관으로 표적화 서열을 코딩하는 유전자와 과산화효소를 코딩하는 유전자가 연결되도록 융합된 폴리뉴클레오타이드를 제조한 것을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The process for producing the polynucleotide may include preparing a polynucleotide fused so that a gene encoding a targeting sequence and a gene encoding a peroxidase are linked to a cell organelle in which the target protein exists, no.

상기 폴리뉴클레오타이드를 세포에 도입하는 단계에서, 상기 세포 소기관은 미토콘드리아, 소포체, 핵, 세포질 및 골지체로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 상기 세포 소기관으로 표적화 서열을 코딩하는 유전자에는 미토콘드리아 기질 발현 유전자, 세포질 발현 유전자, 미토콘드리아 이중막 사이 공간 발현 유전자, 핵 발현 유전자, 세포 외막 발현 유전자, 소포체 내막 발현 유전자, 소포체 외막 발현 유전자, 또는 세포 내막 발현 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 세포 소기관으로 표적화 서열을 코딩하는 유전자는 상기 표 1에 나타나 있다. In the step of introducing the polynucleotide into the cell, the cell organelle may be selected from the group consisting of mitochondria, an endoplasmic reticulum, a nucleus, a cytoplasm and a Golgi apparatus. The gene coding for the targeting sequence to the cell organelle may include a mitochondrial substrate- But are not limited to, a cytoplasmic expression gene, a mitochondrial bilayer membrane expression gene, a nuclear expression gene, an extracellular membrane expression gene, an endoplasmic reticulum expression gene, an endoplasmic reticulum expression gene, or an intracellular membrane expression gene. The genes encoding the targeting sequences into the organelles are shown in Table 1 above.

상기 폴리뉴클레오타이드를 세포에 도입하는 단계는 형질 전환 (Transfection) 또는 형질 도입 (Transduction)을 통해 매개될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The step of introducing the polynucleotide into a cell may be mediated through, but not limited to, transfection or transduction.

상기 페놀 화합물 및 과산화수소의 처리에서, 상기 페놀 화합물의 처리는 페놀 화합물을 0.1 내지 1 mM의 농도로 10 내지 60분 동안 처리하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the treatment of the phenolic compound and hydrogen peroxide, the treatment of the phenolic compound may be, but not limited to, treating the phenolic compound at a concentration of 0.1 to 1 mM for 10 to 60 minutes.

상기 화합물은 과산화효소에 의해서 라디칼 (Radical)을 생성하는 것이고, 상기 생성된 라디칼은 단백질 또는 펩타이드에 존재하는 타이로신 (Tyrosine)기와 공유결합을 형성하여 상기 단백질 또는 펩타이드에 결합하는 것이며, 상기 라디칼이 단백질 또는 펩타이드에 결합하는 거리는 5 내지 50 nm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The compound produces a radical by a peroxidase enzyme and the produced radical forms a covalent bond with a tyrosine group present in a protein or peptide to bind to the protein or peptide, Or the distance to the peptide may be 5 to 50 nm, but is not limited thereto.

상기 과산화효소는 대두 아스코르베이트 과산화효소(Soybean ascorbate peroxidase), 애기장대 아스코르베이트 과산화효소 (Arabidopsis ascorbate peroxidase), 시금치 아스코르베이트 과산화효소 (Spinach ascorbate peroxidase), 사카로미세스 세레비시에 시토크롬 c 과산화효소 (Saccharomyces cerevisiae cytochrome c peroxidase), 파네로카에테 크리소스포리움 과산화효소 PCL1 (Phanerochaete chrysosporium PCL1), 파네로카에테 크리소스포리움 과산화효소 PCM (Phanerochaete chrysosporium PCM), 코프리놉시스 시네레아 과산화효소 (Coprinopsis cinerea peroxidase), 땅콩 과산화효소 (Peanut Peroxidase), 애기장대 과산화효소 ATPA2 (Arabidopsis ATPA2), 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 효소, 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 효소 및 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 효소로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 효소일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The peroxidase may be selected from the group consisting of soybean ascorbate peroxidase, Arabidopsis ascorbate peroxidase, spinach ascorbate peroxidase, saccharomyces cerevisiae cytochrome c peroxide The enzymes Saccharomyces cerevisiae cytochrome c peroxidase, Phanerochaete chrysosporium PCL1, Phanerochaete chrysosporium PCM, Coprinopsis cinereosporium peroxidase, An enzyme consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, an enzyme consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 An enzyme selected from the group consisting of Soil can be, but is not limited to this.

상기 세포 소기관은 미토콘드리아, 소포체, 핵, 세포질 및 골지체로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The organelles may be selected from the group consisting of mitochondria, endoplasmic reticulum, nucleus, cytoplasm and Golgi apparatus, but the present invention is not limited thereto.

상기 페놀 화합물로 세포 내 단백질을 표지화 하는 단계 이후에 세포를 파쇄하여 세포 파쇄물을 수득하고, 상기 세포 파쇄물에 스트렙타아비딘 (Streptavidin: SA) 비드를 넣어 표지된 단백질을 수득할 수 있다.After labeling the intracellular protein with the phenol compound, cells are disrupted to obtain a cell lysate, and streptavidin (SA) beads are added to the cell lysate to obtain a labeled protein.

상기 스트렙타비딘 비드에 결합된 표지 단백질을 수득하는 단계에서 상기 세포 파쇄물에 스트렙타비딘 비드를 첨가하면 페놀 화합물, 구체적으로는 DBP가 결합된 표지 단백질이 스트렙타비딘 비드와 결합할 수 있다.When a streptavidin bead is added to the cell lysate in the step of obtaining the labeled protein bound to the streptavidin bead, a phenol compound, specifically, a labeled protein to which DBP is bound can bind to the streptavidin bead.

상기 상기 수득물에서 목적 단백질을 확인하는 단계는, 상기 스트렙타비딘 비드에 결합된 표지 단백질에 효소를 처리하여 단백질을 절단하고, 상기 스트렙타비딘 비드에 결합된 절단 단편을 분리하여 분리된 절단 단편을 얻고, 상기 분리된 절단 단편을 분석하는 단계로 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The step of identifying the target protein in the product may include treating the labeled protein bound to the streptavidin bead with an enzyme to cleave the protein, separating the cleaved fragment bound to the streptavidin bead, And analyzing the separated cleavage fragments. However, the present invention is not limited thereto.

상기 절단 단편을 분리하는 것은 탈염처리 (desalting)하여 수행하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.Separation of the cleaved fragments may be performed by desalting, but is not limited thereto.

상기 효소는 트립신 (trypsin)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The enzyme may be, but is not limited to, trypsin.

상기 폴리뉴클레오타이드를 세포에 도입하는 단계에 앞서, 목적 단백질의 세포내 위치를 분석하는 단계를 수행하는 것일 수 있다.The step of analyzing the intracellular position of the target protein may be performed prior to the step of introducing the polynucleotide into the cell.

상기 목적 단백질의 세포내 위치를 분석하는 단계는 과산화효소를 이용하여 세포 내 단백질 위치를 확인하는 방법을 사용할 수 있으며, 이는 대한민국 공개특허공보 제2016-0071960호에 자세히 기재되어 있다.In the step of analyzing the intracellular location of the target protein, a method of confirming the intracellular protein position using a peroxidase enzyme can be used, which is described in detail in Korean Patent Laid-Open Publication No. 2016-0071960.

상기 스트렙타아비딘 비드는 스트렙타아비딘 코팅된 자성 비드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The streptavidin beads may be streptavidin-coated magnetic beads, but are not limited thereto.

상기 수득물에서 목적 단백질을 확인하는 단계에서 목적 단백질을 확인하는 방법은 질량 분석, 웨스턴 블롯, 형광 현미경 분석, 닷 블롯, 또는 ELISA일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The method of identifying a target protein in the step of identifying a target protein in the above-mentioned product may be mass analysis, Western blot, fluorescence microscopy, dot blot, or ELISA, but is not limited thereto.

본 발명은 페놀 화합물를 이용하여 단백질을 탐지하는 방법에 관한 것으로서, 구체적으로 본 발명은 데스티오비오틴-페놀 (Desthiobiotin-Phenol; DBP)을 이용하여 단백질을 탐지하는 방법에 관한 것이며, 본 발명의 단백질을 탐지하는 방법을 통해 표지된 단백질을 확인할 수 있다.The present invention relates to a method for detecting a protein using a phenol compound. More particularly, the present invention relates to a method for detecting a protein using desthiobiotin-phenol (DBP) You can identify the labeled protein by way of detection.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 데스티오비오틴-페놀 (Desthiobiotin-Phenol; DBP)을 제조하기 위한 반응식이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 비오틴-페놀과 데스티오비오틴-페놀로 표지하여 펩타이드를 검출하였을 때, 비오틴-페놀은 산화된 비오틴-페놀이 검출되어 질량분석에서 더 약한 신호 세기를 보여주는 것을 나타내는 도식도이다.
도 3의 왼쪽은 본 발명의 일 실시예에 따른 데스티오비오틴-페놀에 의해 표지되는 자리를 질량분석 신호 세기에 따라 다양한 색으로 표시한 것이고, 오른쪽은 단백질 구조및 질량분석 신호 세기와 용제 접근 면적의 상관관계 그래프를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 비오틴-페놀, 산화된 비오틴-페놀 및 데스티오비오틴-페놀로 표지된 펩타이드의 MS/MS 스펙트럼 결과를 보여주는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 표지된 펩타이드의 펩타이드 점수(Peptide score) (Sequest X corr value)를 나타내는 표이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 비오틴-페놀로 표지한 APEX가 트렌스펙션된 전체 세포 용해물의 Streptavidin (SA)-HRP 웨스턴 블랏 (WB) 결과를 보여주는 사진이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 데스티오비오틴- 페놀로 표지한 APEX가 트렌스펙션된 전체 세포 용해물의 Streptavidin(SA)-HRP 웨스턴 블롯 (WB) 결과를 보여주는 사진이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 DBP 또는 BP로 표지한 단백질의 Sco1-APEX2를 사용한 SA-비드 농축 (enrichment)을 확인한 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 DBP 또는 BP로 표지된 단백질의 Sco1-APEX2를 사용한 이미징 어세이 (Imaging assay) 결과이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 mitochondrial matrix-APEX2, Lactb-APEX2 또는 Sco1-APEX2가 트렌스펙션된 세포, 및 트렌스펙션되지 않은 세포에서의 215개의 DBP에 의해 표지된 자리를 나타내는 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 그룹 I 내지 V의 미토콘드라아 특이성을 보여주는 그래프이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 동정된 단백질과 기존의 알려진 단백질의 숫자를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 Lactb-APEX2 또는 Sco1-APEX2에 의해 표지된 단백질을 보여주는 그림이다.
도 14는은 본 발명의 일 실시예 CYP51A1의 결정 구조 및 이의 DBP에 의해 표지되는 티로신 잔기 (녹색) 및 헴 (heme, 빨간색)을 보여주는 그림이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 TMEM261-V5-APEX2를 트렌스펙션한 세포를 DBP로 표지링하여 관찰한 결과이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 미토콘드리에서의 TMEM261의 막 위상(Membrane topology)을 보여주는 그림이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 미토피린 (Mitofilin; IMMT) 단백질 위상을 보여주는 그림이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 IMM-TM 단백질의 위상을 보여주는 그림이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따라 표지된 사이트 결과에 따라 결정된 IMM-TM 위상을 보여주는 그림이다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따라 표지된 사이트 결과에 따라 결정된 LETM1 및 HIGD2A의 막 위상을 보여주는 그림이다. matrix-APEX2에 의해 DBP 표지된 자리는 녹색 동그라미로 표시하였으며, IMS-APEX2에 의해 DBP 표지된 자리는 파란 동그라미로 표시하였다.
도 21은 본 발명의 일 실시예의 결과에 따른 주변 막 단백질 바인딩 face를 보여주는 그림이다. matrix-APEX2에 의해 DBP 표지된 자리는 녹색 동그라미, IMS-APEX2에 의해 DBP 표지된 자리는 파란 동그라미로 표시하였다.
도 22는 본 발명의 일 실시예에 따른 IMM에서의 표지된 사이트에 의거한 몇몇 표면 막 단백질의 막 바인딩 face를 보여주는 그림이다. matrix-APEX2에 의해 DBP 표지된 자리는 녹색 동그라미, IMS-APEX2에 의해 DBP 표지된 자리는 파란 동그라미로 표시하였다.
도 23은 본 발명의 일 실시예에 따라 DBP로 표지된 자리를 mitochondrial ATP synthase complex (PDB ID: 2WSS)에 맵핑한 그림이다. matrix-APEX2에 의해 DBP 표지된 티로신 잔기(녹색) 및 IMS-APEX2의해 DBP 표지된 자리 (파란색)으로 표시하였다.
도 24는 본 발명의 일 실시예에 따라 DBP로 표지된 자리를 mitochondrial complex II (PDB ID: 1BCC) (왼쪽) 및 complex IV (PDB ID 1OCC) (오른쪽)에 맵핑한 그림이다. matrix-APEX2에 의해 DBP 표지된 티로신 잔기 (녹색) 및 IMS-APEX2의해 DBP 표지된 자리 (파란색)를 표시하였다.
도 25는 본 발명의 일 실시예에 따라 DBP로 표지된 자리를 mitochondrial chaperone complex (right: PDB ID: 4PJ1)에 맵핑한 그림이다. matrix-APEX2에 의해 DBP 표지된 티로신 잔기 (녹색)를 표시하였다.
도 26은 본 발명의 일 실시예에 따라 합성한 DBP에 대하여 1H-NMR를 수행한 결과를 나타낸다.
도 27은 본 발명의 일 실시예에 따라 합성한 DBP에 대하여 13C-NMR를 수행한 결과를 나타낸다.
도 28은 BP (Biotin-Phenol)를 이용하여 단백질 탐지하는 방법을 나타내는 모식도이다.
도 29은 DBP를 이용하여 단백질을 탐지하는 방법을 나타내는 모식도이며, 상기 방법을 이용하여 단백질의 구조탐색이 가능하다.
도 30은 본 발명의 일 실시예에 따라 DBP에 라디칼이 생성되는 위치 및 상기 라디칼이 전파되는 과정을 나타낸 모식도이다.
1 is a reaction formula for preparing Desthiobiotin-Phenol (DBP) according to an embodiment of the present invention.
FIG. 2 is a graph showing the results of biotin-phenol biotin-phenol biosynthesis assay in which biotin-phenol was detected when peptide was detected by biotin-phenol and dextobiotin-phenol according to an embodiment of the present invention, Fig.
The left side of FIG. 3 shows the place labeled with desistiobiotin-phenol according to an embodiment of the present invention in various colors according to the mass spectrometry signal intensity. On the right side, the protein structure and the mass analysis signal intensity, In the graph of FIG.
FIG. 4 is a graph showing MS / MS spectral results of biotin-phenol, oxidized biotin-phenol and peptide labeled with dextobiotin-phenol according to an embodiment of the present invention.
FIG. 5 is a table showing the peptide score (Sequest X corr value) of a labeled peptide according to an embodiment of the present invention.
6 is a photograph showing Streptavidin (SA) -HRP Western Blot (WB) results of biotin-phenol-labeled APEX transfected whole cell lysate according to an embodiment of the present invention.
Figure 7 is a photograph showing Streptavidin (SA) -HRP Western blot (WB) results of whole cell lysates transfected with desipio biotin-phenol labeled APEX according to one embodiment of the present invention.
FIG. 8 shows SA-bead enrichment using Sco1-APEX2 of a protein labeled with DBP or BP according to an embodiment of the present invention.
FIG. 9 is a result of an imaging assay using Sco1-APEX2 of a protein labeled with DBP or BP according to an embodiment of the present invention.
FIG. 10 is a graph showing the positions labeled with 215 DBPs in mitochondrial matrix-APEX2, Lactb-APEX2 or Sco1-APEX2 transfected cells and untransfected cells according to an embodiment of the present invention.
Figure 11 is a graph showing the mitochondrial specificity of Groups I through V according to one embodiment of the present invention.
Figure 12 shows the number of identified proteins and known proteins according to one embodiment of the present invention.
FIG. 13 is a graph showing proteins labeled by Lactb-APEX2 or Sco1-APEX2 according to an embodiment of the present invention.
Figure 14 is a diagram showing the crystal structure of an embodiment CYP51A1 of the present invention and the tyrosine residues (green) and heme (red) labeled by its DBP.
FIG. 15 shows the results of labeling of cells transfected with TMEM261-V5-APEX2 according to an embodiment of the present invention by labeling with DBP.
16 is a view showing a membrane topology of TMEM 261 in mitochondria according to an embodiment of the present invention.
17 is a view showing the mitofilin (IMMT) protein phase according to an embodiment of the present invention.
18 is a view showing the phase of the IMM-TM protein according to an embodiment of the present invention.
FIG. 19 is a diagram illustrating the IMM-TM phase determined according to a labeled site result according to an embodiment of the present invention. FIG.
FIG. 20 is a diagram showing the membrane phases of LETM1 and HIGD2A determined according to the labeled site results according to an embodiment of the present invention. FIG. DBP-labeled sites were labeled with a green circle by matrix-APEX2, and DBP labeled sites by IMS-APEX2 were indicated by a blue circle.
FIG. 21 is a view showing a peripheral membrane protein binding face according to a result of an embodiment of the present invention. FIG. The DBP-labeled spot by matrix-APEX2 is indicated by a green circle, and the DBP labeled spot by IMS-APEX2 is indicated by a blue circle.
Figure 22 is a diagram showing the membrane binding faces of some surface membrane proteins based on the labeled sites in an IMM according to an embodiment of the present invention. The DBP-labeled spot by matrix-APEX2 is indicated by a green circle, and the DBP labeled spot by IMS-APEX2 is indicated by a blue circle.
23 is a map mapping a DBP-labeled site to a mitochondrial ATP synthase complex (PDB ID: 2WSS) according to an embodiment of the present invention. labeled with DBP-labeled tyrosine residues (green) by matrix-APEX2 and DBP labeled sites (blue) by IMS-APEX2.
24 is a map mapping DBP-labeled sites to mitochondrial complex II (PDB ID: 1BCC) (left) and complex IV (PDB ID 1OCC) (right) according to an embodiment of the present invention. labeled DBP-labeled tyrosine residues (green) by matrix-APEX2 and DBP labeled sites (blue) by IMS-APEX2.
25 is a map mapping a DBP-labeled site to a mitochondrial chaperone complex (right: PDB ID: 4PJ1) according to an embodiment of the present invention. The tyrosine residue (green) labeled with DBP by matrix-APEX2 was displayed.
26 shows the results of 1 H-NMR of DBP synthesized according to an embodiment of the present invention.
FIG. 27 shows the results of 13 C-NMR of DBP synthesized according to an embodiment of the present invention.
28 is a schematic diagram showing a method of protein detection using BP (Biotin-Phenol).
FIG. 29 is a schematic diagram showing a method of detecting a protein using DBP, and the structure of a protein can be searched using the above method.
30 is a schematic diagram illustrating a position where radicals are generated in DBP and a process of propagating the radicals according to an embodiment of the present invention.

이하, 본 발명을 하기의 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, these examples are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited by these examples.

실시예Example 1.  One. DesthiobiotinDesthiobiotin -Phenol의 합성 및 정제-Phenol synthesis and purification

실온 (25℃)에서 데스티오비오틴 (Desthiobiotin, Sigma, 카달로그 번호 D1411) 100 mg을 2 mL의 DMSO (dimethyl sulfoxide, Sigma-Aldrich, USA)에 용해시켜 0.233 M의 용액을 만든 후, 1.1 당량의 HATU (2-(7-aza-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate, 0.257 M)과 2.0 당량의 DIPEA (N,N-diisopropylethylamine, 0.467 M)를 첨가하고 실온에서 10분간 교반하여 혼합 용액을 제조하였다. 그 다음, 상기 혼합 용액에 2.0 당량의 티라민 (Tyramine, 0.467 M)을 첨가하고, 실온에서 하룻밤 동안 교반하여 반응을 완료시켰다. 상기 합성 방법은 도 1에 도식화했다.A solution of 0.233 M was prepared by dissolving 100 mg of desthiobiotin (Sigma, Catalog No. D1411) in 2 mL of DMSO (dimethyl sulfoxide, Sigma-Aldrich, USA) at room temperature (25 ° C) (0.257 M) and 2.0 equivalents of DIPEA (N, N-diisopropylethylamine, 0.467 M) were added at room temperature For 10 minutes to prepare a mixed solution. Then, 2.0 equivalents of tyramine (0.467 M) was added to the mixed solution, and the reaction was completed by stirring at room temperature overnight. The synthesis method is illustrated in FIG.

상기 반응으로 제조된 Desthiobiotin-phenol을 C18 역상컬럼 (Agilent Dynamax 250 X 21.4 mm, microsorb 300-5 C18)을 사용한 HPLC (영린 Semi-prep HPLC YL9100)로 5-95% 그래디언트의 아세토나이트릴/물로 40분간 정제하였다. HLPC 작동은 제조사의 프로토콜에 따라 수행되었고, 그 결과 얻은 화합물은 20분 근처에서 용출되었으며 수율은 약 70%였다.The prepared Desthiobiotin-phenol was purified by HPLC (Yeonlin Semi-prep HPLC YL9100) using a C18 reverse phase column (Agilent Dynamax 250 X 21.4 mm, microsorb 300-5 C18) in a 5-95% gradient acetonitrile / Minute. The HLPC operation was performed according to the manufacturer's protocol, and the resulting compound eluted near 20 minutes with a yield of about 70%.

HPLC로 정제하여 얻은 Desthiobiotin-phenol를 Bruker 400 MHz NMR 기계를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라서 NMR을 수행하였다.Purified by HPLC, Desthiobiotin-phenol was subjected to NMR according to the manufacturer's protocol using a Bruker 400 MHz NMR machine.

1H-NMR에 대한 결과는 도 26 및 13C-NMR에 대한 결과는 도 27에 나타나 있다. 도 26 및 도 27에 나타난 1H-NMR 및 13C-NMR 결과를 통해서, HPLC로 정제하여 얻은 물질은 Desthiobiotin-phenol임을 알 수 있었다. The results for 1 H-NMR are shown in FIG. 26 and those for 13 C-NMR are shown in FIG. From the 1 H-NMR and 13 C-NMR results shown in Figs. 26 and 27, it was found that the substance purified by HPLC was Desthiobiotin-phenol.

1H-NMR (400 MHz, d4-Methanol) : δ 1.10 (3H,d,J = 6.5 Hz), 1.30-1.46 (8H,m), 1.57 (2H,m), 2.14(2H,t,J = 7.5 Hz), 2.68 (2H,t,J = 7.5 Hz), 3.35 (2H,m), 3.77 (1H,m), 3.81 (1H,m), 6.70 (2H, d, J = 8 Hz), 7.02 (2H, d, J = 8 Hz). 1 H-NMR (400 MHz, d4-Methanol): δ 1.10 (3H, d, J = 6.5 Hz), 1.30-1.46 (8H, m), 1.57 (2H, m), 2.14 (2H, t, J = M), 6.70 (2H, d, J = 8 Hz), 7.02 (2H, (2H, d, J = 8 Hz).

13C-NMR (100 MHz, d6-DMSO): δ 15.508, 25.212, 25.591, 28.710, 29.522, 34.439, 35.371, 40.433, 50.259, 55.016, 115.049, 129.450, 129.564, 155.581, 162.865, 171.963, HMRS m/z (C18H28N3O3): theoretical: 334.2131, observed: 334.2136. 13 C-NMR (100 MHz, d6-DMSO): δ 15.508, 25.212, 25.591, 28.710, 29.522, 34.439, 35.371, 40.433, 50.259, 55.016, 115.049, 129.450, 129.564, 155.581, 162.865, 171.963, HMRS m / z (C 18 H 28 N 3 O 3 ): theoretical: 334.2131, observed: 334.2136.

실시예Example 2. 단백질 표지화 2. Protein labeling

2-1. 형질 전환2-1. Transformation

ATCC에서 구입한 HEK293T 세포를 10% (v/v) 소태아혈청(Fetal Bovine Serum), 50 units/mL penicillin, 및 50 ug/mL streptomycin이 함유된 MEM (Minimum Essential Medium, Gibco) 배지에 37℃로 16 내지 24시간동안 5% 이하의 CO2 incubator 에서 배양하였다. 세포는 두 개의 T75 플라스크에서 배양했다.HEK293T cells purchased from ATCC were cultured in MEM (Minimum Essential Medium, Gibco) medium containing 10% (v / v) fetal bovine serum, 50 units / mL penicillin and 50 ug / mL streptomycin at 37 ° C For 16-24 hours in a 5% CO2 incubator. Cells were cultured in two T75 flasks.

각기 다른 세포 소기관 (예를 들어, 미토콘드리아 기질 공간 (Mitochondria matrix), 미토콘드리아 이중막 사이 공간 (Intermembrane Space of Mitochondrial, IMS), 미토콘드리아의 외막 공간 (Outer mitochondrial membrane, OMM), 소포체, 핵, 세포질, 골지체 등)에 APEX를 도입하기 위하여, 각 세포 소기관으로 타겟팅하는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자와 APEX2의 유전자 서열이 연결된 폴리뉴클레오타이드가 삽입된 벡터를 리포펙타민 2000 (Lipofectamine 2000, Thermo Fisher Scientific) transfection reagent를 사용하여 상기 배양된 HEK293T 세포에 트렌스펙션하였다. 상기 벡터는 타겟팅하고자 하는 세포 소기관에 따라 다른 종류의 것을 사용하였으며, 본 발명에서 사용한 벡터들의 구성 및 특징을 아래 표 2에 정리하였다.It is known that different organelles (for example, mitochondria matrix, intermembrane space of mitochondrial (IMS), outer mitochondrial membrane (OMM), endoplasmic reticulum, nucleus, cytoplasm, ), A vector into which a polynucleotide inserted with a gene coding for an amino acid sequence targeted to each cell organelle and a gene sequence of APEX2 was inserted was transfected with Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) transfection reagent Lt; RTI ID = 0.0 > HEK293T < / RTI > The above vectors used different kinds of organelles depending on the organelle to be targeted, and the structures and characteristics of the vectors used in the present invention are summarized in Table 2 below.

항목Item 명명 denomination 특징Characteristic Promotor/
Vector
Promotor /
Vector
세부사항Detail
1One Mito-V5-APEX2
(unprocessed: 32kDa, processed: 29kDa)
Mito-V5-APEX2
(unprocessed: 32 kDa, processed: 29 kDa)
NotI-Mito-BamHI-V5-APEX2-Stop-XhoINotI-Mito-BamHI-V5-APEX2-Stop-XhoI CMV/
pCDNA3
CMV /
pCDNA3
Mito-: MLATRVFSLVGKRAISTSVCVRAH (matrix targeting sequence, Fornuskova et al., 2010)Mito-: MLATRVFSLVGKRAISTSVCVRAH (matrix targeting sequence, Fornuskova et al., 2010)
22 ScoI-V5-APEX2
(unprocessed:62kDa,
processed:59kDa)
ScoI-V5-APEX2
(unprocessed: 62 kDa,
processed: 59 kDa)
KpnI-ScoI-BamHI-
V5-APEX2-Stop-
XhoI
KpnI-ScoI-BamHI-
V5-APEX2-Stop-
XhoI
CMV/
pCDNA3
CMV /
pCDNA3
Sco1 (NM_004589)Sco1 (NM_004589)
33 ScoI-V5-APEX2
(unprocessed: 62kDa,
processed:59kDa)
ScoI-V5-APEX2
(unprocessed: 62 kDa,
processed: 59 kDa)
HindIII-ScoI-
BamHI-V5-
APEX2-Stop-XhoI
HindIII-ScoI-
BamHI-V5-
APEX2-Stop-XhoI
CMV/
pCDNA5
CMV /
pCDNA5
Sco1 (NM_004589)Sco1 (NM_004589)
44 Tom20-V5-APEX2
(45.7 kDa)
Tom20-V5-APEX2
(45.7 kDa)
NotI-Tom20-10aa
linker-NheI-V5-
APEX2-Stop-XhoI
NotI-Tom20-10aa
linker-NheI-V5-
APEX2-Stop-XhoI
CMV/
pCDNA3
CMV /
pCDNA3
10aa linker : GGSGDPPVAT
Tom20 (NM_014765.2)
10aa linker: GGSGDPPVAT
Tom20 (NM_014765.2)
55 TRMT61B-V5-APEX2
(81.5 kDa)
TRMT61B-V5-APEX2
(81.5 kDa)
NotI-TRMT61B-
NheI-V5-APEX2-
Stop-XhoI
NotI-TRMT61B-
NheI-V5-APEX2-
Stop-XhoI
CMV/
pCDNA3
CMV /
pCDNA3
TRMT61B (NM_017910)TRMT61B (NM_017910)
66 ATP5J-V5-APEX2
(unprocessed:41.2kDa,
processed:37.2kDa)
ATP5J-V5-APEX2
(unprocessed: 41.2 kDa,
processed: 37.2 kDa)
NotI-ATP5J-
BamHI-V5-
APEX2-Stop-XhoI
NotI-ATP5J-
BamHI-V5-
APEX2-Stop-XhoI
CMV/
pCDNA3
CMV /
pCDNA3
ATP5J (NM_001685)ATP5J (NM_001685)
77 MGST3-V5-APEX2
(45.1 kDa)
MGST3-V5-APEX2
(45.1 kDa)
NotI-MGST3-
BamHI-V5-
APEX2-Stop-XhoI
NotI-MGST3-
BamHI-V5-
APEX2-Stop-XhoI
CMV/
pCDNA3
CMV /
pCDNA3
MGST3 (NM_004528)MGST3 (NM_004528)
88 V5-APEX2-NES
(29.8 kDa)
V5-APEX2-NES
(29.8 kDa)
NotI-V5-APEX2-
NES-Stop-XhoI
NotI-V5-APEX2-
NES-Stop-XhoI
CMV/
pCDNA3
CMV /
pCDNA3
NES: LQLPPLERLTLD
(nuclear exclusion signal)
NES: LQLPPLERLTLD
(nuclear exclusion signal)
99 LACTB-V5-APEX2
(unprocessed:35 kDa,
processed: 29 kDa)
LACTB-V5-APEX2
(unprocessed: 35 kDa,
processed: 29 kDa)
NotI-LACTB-
BamHI-V5-
APEX2-Stop-XhoI
NotI-LACTB-
BamHI-V5-
APEX2-Stop-XhoI
CMV/
pCDNA3
CMV /
pCDNA3
LACTB (1-68): MYRLLSSVTARAAATAGPAWDGGRRGAHRRPGLPVLGLGWAGGLGLGLGLALGAKLVVGLRGAVPIQS
(IMS targeting signal, Polianskyte et al., 2009)
Flag: DYKDDDDK
LACTB (1-68): MYRLLSSVTARAAATAGPAWDGGRRGAHRRPGLPVLGLGWAGGLGLGLGLALGAKLVVGLRGAVPIQS
(IMS targeting signal, Polianskyte et al., 2009)
Flag: DYKDDDDK
1010 TMEM261-V5-APEX2
(unprocessed:42.8kDa)
TMEM261-V5-APEX2
(unprocessed: 42.8 kDa)
HindIII-TMEM261-
BamHI-V5-
APEX2-Stop-XhoI
HindIII-TMEM261-
BamHI-V5-
APEX2-Stop-XhoI
CMV/
pCDNA3
CMV /
pCDNA3
TMEM261 (NM_033428.1)TMEM261 (NM_033428.1)
1111 Pdk1-V5-APEX2*
(unprocessed, 81.5 kDa, processed: 76.0 kDa)
Pdk1-V5-APEX2 *
(unprocessed, 81.5 kDa, processed: 76.0 kDa)
NotI-Pdk1-10aa linker-NheI-V5-APEX2-Stop-XhoINotI-Pdk1-10aa linker-NheI-V5-APEX2-Stop-XhoI CMV/
pCDNA3
CMV /
pCDNA3
Pdk1 (NM_002610)Pdk1 (NM_002610)

2-2. 2-2. 세포내Intracellular 단백질 표지화 Protein labeling

T75 플라스크 두 개에 HEK293T 세포를 배양하고, APEX2를 HEK293T 세포에 트렌스펙션하였다. APEX2를 HEK293T 세포에 트렌스펙션하고 12 내지 24 시간 후, Desthiobiotin-phenol이 250 uM의 농도가 되도록 처리하고 37℃에서 30분 동안 배양했다. 그 후, H2O2를 1 mM의 농도가 되도록 넣고, 1분후 5 mM Trolox (Sigma Aldrich, 제품번호 238813), 10 mM sodium azide, 10 mM sodium ascorbate (이하 3가지 혼합물을 소광물질이라 함)이 들어있는 DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Thermo Fisher Scientific)로 3번 씻어주었다. 세포를 20 mL DPBS로 파이펫팅하여 50 mL 튜브에 옮긴 후, 1500g 속도로 5분간 원심분리하여 세포 펠렛을 만들어 상층액은 버린다. 다시 DBPS로 파이펫팅 하여 1.5 mL 마이크로 튜브에 옮긴 후, 1500g 속도에서 5분간 원심분리하여 세포 펠렛을 만들어 상층액은 버린다. 1X 프로테아좀 저해제 칵테일 (Protease inhibitor cocktail, Sigma, P8849), PMSF 1 mM (phenylmethylsulfonylfluoride, Biosesang, P1021), 및 소광물질 용액이 첨가된 RIPA 용해 버퍼(lysis buffer) 3 mL (Biosesang, R2002)로 세포를 모두 용해 (Lysis)시켰다.HEK293T cells were cultured in two T75 flasks and APEX2 was transfected into HEK293T cells. APEX2 was transfected into HEK293T cells, and after 12 to 24 hours, Desthiobiotin-phenol was treated to a concentration of 250 uM and incubated at 37 DEG C for 30 minutes. Then, H 2 O 2 was added to a concentration of 1 mM, and after 1 minute, 5 mM Trolox (Sigma Aldrich, product number 238813), 10 mM sodium azide, 10 mM sodium ascorbate And then washed three times with DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Thermo Fisher Scientific). Cells are pipetted into 20 mL DPBS, transferred to a 50 mL tube, and centrifuged at 1500 g for 5 minutes to make cell pellet and discard the supernatant. The cells were transferred to a 1.5-mL microtube by pipetting with DBPS, centrifuged at a speed of 1500 g for 5 minutes, and the cell pellet was discarded. (Biosesang, R2002) with 1X protease inhibitor cocktail (Sigma, P8849), PMSF 1 mM (phenylmethylsulfonylfluoride, Biosesang, P1021) and RIPA lysis buffer supplemented with a minerals solution Were all dissolved (Lysis).

2-3. 표지된 2-3. Labeled 펩타이드의Of peptide 수득 purchase

상기 세포 용해물을 4℃의 온도에서 원심 분리기를 이용하여 20,000 rpm의 속도로 10분간 원심분리하여 상층액만을 수득하였다. 상층액은 Amicon filter (10K 원심필터, Merck Milipore, Amicon Ultra-15) 에 넣고 7500g의 속도로 4℃로 20분간 원심분리하였다. 그 후, PBS를 첨가하여 3회 더 원심분리 하였다. 남은 용액을 1.5 mL 마이크로튜브에 옮겨 PBS를 첨가해 1 mL로 맞추고 스트렙타아비딘 (streptavidin; SA) 코팅된 자성 비드 300 uL를 넣고 1시간 동안 상온(25℃)에서 천천히 돌려주었다. 마그네틱 스탠드에 꽂아서 상층액은 타겟 단백질이 남김없이 수득 (enrichment)가 잘 되었는지 테스트용으로 사용하기 위해 따로 보관했다. 이후 자성 비드는 PBS로 3회 세척하였다. PBS를 제거하고 100 uL의 6 M Urea, 2 M Thiourea, 10 mM Hepes를 넣어 서스펜션 시켰다. 50 mM Ammonium bicarbonate (ABC)에 들어있는 100 mM DTT를 20 uL 넣어주고 800rpm 속도로 56℃에서 1시간 원심분리했다. 50 mM ABC에 들어있는 300 mM Iodoacetamide 35 uL를 넣고 800rpm 속도로 30분동안 원심분리했다. 50 mM ABC를 840 uL 첨가한다. 1 ug/uL 트립신 (Promega, V5280) 8 uL를 넣어주었다. 37℃에서 6-18시간동안 800rpm 속도로 원심분리했다. 마그네틱 스탠드에 꽂아서 상층액은 모아두고 자성 비드를 PBS로 4회 세척했다. 95% (v/v) 포름아마이드 (Formamide), 10 mM EDTA, pH 8.2 용액을 250 uL 첨가하고 95℃에서 10분간 가열했다. 그리고 나서 즉시 마그네틱 스탠드에 꽂은 후, 얼음에 두어 식혔다. 3% (v/v) Acetonitrile /0.1% (v/v) Formic acid 용액을 750 uL 첨가했다.The cell lysate was centrifuged at a temperature of 4 캜 for 10 minutes at a speed of 20,000 rpm using a centrifuge to obtain only supernatant. The supernatant was placed in an Amicon filter (10K centrifugal filter, Merck Milipore, Amicon Ultra-15) and centrifuged at 7500 g for 20 min at 4 ° C. After that, PBS was added and centrifugation was performed three more times. The remaining solution was transferred to a 1.5-mL microtube, and PBS was added to make 1 mL. Then, 300 μL of streptavidin (SA) -coated magnetic beads was added and slowly returned at room temperature (25 ° C.) for 1 hour. The supernatant was placed on a magnetic stand and stored separately for use as a test for whether the target protein was fully enrichment-free. The magnetic beads were then washed three times with PBS. PBS was removed and suspended in 100 uL of 6 M Urea, 2 M Thiourea, 10 mM Hepes. 20 uL of 100 mM DTT in 50 mM Ammonium bicarbonate (ABC) was added and centrifuged at 56 ° C for 1 hour at 800 rpm. 35 uL of 300 mM iodoacetamide in 50 mM ABC was added and centrifuged at 800 rpm for 30 minutes. Add 840 uL of 50 mM ABC. And 8 uL of 1 ug / uL trypsin (Promega, V5280). And centrifuged at 37 ° C for 6-18 hours at 800 rpm. The supernatant was collected by putting it on a magnetic stand and the magnetic beads were washed with PBS 4 times. 250 uL of 95% (v / v) formamide, 10 mM EDTA, pH 8.2 solution was added and heated at 95 캜 for 10 minutes. Then, immediately put it on the magnetic stand, put it on ice, and it cooled down. 750 uL of 3% (v / v) Acetonitrile / 0.1% (v / v) formic acid solution was added.

2-4. 2-4. 펩타이드Peptides 절단 단편의 분리 Isolation of Cleaved Fragments

상기 스트렙타아비딘에 결합된 펩타이드 절단 단편을 분리하기 위해서 Varian Bond ELUT (Agilent, 12109301)를 이용하여 하기와 같은 방법으로 디솔팅 (desalting)을 수행하였다.Desatting was performed using a Varian Bond ELUT (Agilent, 12109301) in the following manner in order to isolate the peptide cleavage fragment bound to the streptavidin.

1 mL의 3% (v/v) Acetonitrile /0.1% (v/v) Formic acid, 1 mL의 100% acetonitrile, 그리고 2 mL 3% (v/v) Acetonitrile /0.1% (v/v) Formic acid를 흘려주어 컬럼을 활성화시켜다. 샘플을 컬럼에 천천히 흘려주어 펩타이드 절단 단편을 컬럼에 붙게했다. 2 mL의 3% (v/v) Acetonitrile /0.1% (v/v) Formic acid 용액으로 컬럼을 씻어주었다. 1.4 mL의 70% (v/v) Acetonitrile /0.1% (v/v) Formic acid 용액 과 500 uL의 100% acetonitrile를 흘려주어 펩타이드를 추출했다. Add 1 mL of 3% (v / v) Acetonitrile / 0.1% (v / v) Formic acid, 1 mL of 100% acetonitrile and 2 mL of 3% v / v Acetonitrile / To activate the column. The sample was slowly poured into the column to attach the peptide cleavage fragment to the column. The column was washed with 2 mL of 3% (v / v) Acetonitrile / 0.1% (v / v) formic acid solution. The peptide was eluted with 1.4 mL of 70% (v / v) Acetonitrile / 0.1% (v / v) Formic acid solution and 500 uL of 100% acetonitrile.

질량 분석을 위해서는 추출된 용액을 완전히 말린 후, 0.1% (v/v) Formic acid에 다시 녹이는 작업을 수행하였다.For mass analysis, the extracted solution was completely dried and then re-dissolved in 0.1% (v / v) formic acid.

비교예Comparative Example 1. 비오틴-페놀을 처리한 경우 1. Treatment with biotin-phenol

실시예 1 내지 2와 동일한 방법으로 실험을 수행하되, 실시예 2에서 APEX2를 HEK293T 세포에 트렌스펙션하고 12 내지 24 시간 후 페놀 화합물을 처리하는 단계에서, 데스티오비오틴-페놀 대신 500 uM 농도의 비오틴-페놀을 처리하였다.Experiments were carried out in the same manner as in Examples 1 and 2 except that APEX2 was transfected into HEK293T cells in Example 2 and treated at a phenol compound treatment time of 12 to 24 hours in a concentration of 500 uM instead of destiobiotin- - phenol.

실험예Experimental Example 1. 질량 분석 1. Mass spectrometry

본 발명에서 합성하여 사용한 데스티오비오틴-페놀에 의해서 표지된 펩타이드에는 산화된 형태가 존재하지 않음을 확인하기 위해서, 실시예 1 및 2를 수행하여 수득한 펩타이드 절단 단편 및 비교예 1을 수행하여 수득한 펩타이드 절단 단편에 대하여 하기 방법으로 질량분석을 수행하였다.The peptide cleavage fragments obtained by carrying out Examples 1 and 2 and Comparative Example 1 were obtained by confirming that the peptide labeled with desistiobiotin-phenol synthesized in the present invention had no oxidized form One peptide cleavage fragment was subjected to mass spectrometry in the following manner.

펩타이드 혼합물을 분리하기 위해, 10 내지 24% (v/v) Acetonitrile /0.1% (v/v) Formic acid 구배의 300 nL/min의 유량에서 90분 동안 C18 역상 HPLC 컬럼(150 mm x 75 um)을 이용하였다. (150 mm x 75 [mu] m) for 90 minutes at a flow rate of 300 nL / min of a 10 to 24% (v / v) Acetonitrile / 0.1% (v / v) Formic acid gradient to separate the peptide mixture, Was used.

그러고 나서, MS/MS 분석을 위해 precursor ion scan MS spectra (m/z 400 내지 2000)를 Orbitrap spectrometer (Thermo Fisher Scientific, Germany)를 사용하였다. Orbitrap의 resolution은 400 m/z을 기준으로 60,000의 분해능 (resolution) 으로 맞추어졌으며 내부적인 internal lock mass 기능을 이용하였다. 20개의 가장 강한 이온을 CID (collisionally induced dissociation, 충돌에 의한 분자 쪼개짐 반응)모드로 분리하고 조각화하였다.Then, an Orbitrap spectrometer (Thermo Fisher Scientific, Germany) was used for MS / MS analysis of precursor ion scan MS spectra (m / z 400-2000). The resolution of the Orbitrap was set at a resolution of 60,000 at 400 m / z and utilized an internal internal lock mass function. Twenty strongest ions were separated and fragmented by CID (collisionally induced dissociation) mode.

MS/MS 분석은 Sequest (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA; version 1.4.1.14)와 X! Tandem (The GPM, thegpm.org; version CYCLONE (2010.12.01.1))를 이용하여 수행하였다. MS / MS analysis was performed using Sequest (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA; version 1.4.1.14) Tandem (The GPM, thegpm.org; version CYCLONE (Dec. 1, 2010)).

구체적으로, Sequest 및 X! Tandem은 호모 사피엔스(Homo sapiens) 단백질 서열 데이터베이스 (89113 entries, UniProt (www.uniprot.org))을 트립신 효소에 의한 소화를 가정하여 검색하도록 셋팅하였다. Sequest 및 X! Tandem은 0.60 Da의 질량 허용 이온 조각(fragment ion mass tolerance)과 10.0 PPM의 상위 이온 허용 조각(parent ion tolerance)을 검색하였다.Specifically, Sequest and X! Tandem set the homo sapiens protein sequence database (89113 entries, UniProt ( www.uniprot.org) ) to assume the digestion by trypsin enzyme. Sequest and X! Tandem searched for a fragment ion mass tolerance of 0.60 Da and a parent ion tolerance of 10.0 PPM.

카바미도메틸 시스테인 (Carbamidomethyl cysteine)은 고정 수정(fixed modification)으로 Sequest 및 X! Tandem에서 지정하였으며, 하기의 조건에서 수행하였다: Carbamidomethyl cysteine is a fixed modification of Sequest and X! Tandem and was performed under the following conditions:

Glu->pyro-Glu of n-terminus, Glu-> pyro-Glu of n-terminus,

ammonia-loss of n-terminus, 및 ammonia-loss of n-terminus, and

gln->pyro-Glu of n-terminus.gln- > pyro-Glu of n-terminus.

메티오닌의 산화 및 BP (delta monoisotopic mass: 361.146), 산화된 BP (delta monoisotopic mass: 377.1409), 티로신의 DBP (delta monoisotopic mass: 331.1896)는 X! Tandem 및 Sequest에서 변수 수정(variable modifications)으로 사용하였다.Methionine oxidation and BP (delta monoisotopic mass: 361.146), oxidized BP (delta monoisotopic mass: 377.1409), and tyrosine DBP (delta monoisotopic mass: 331.1896) Tandem and Sequest were used as variable modifications.

도 4 및 도 5에 나타난 것과 같이, 실시예 1 및 2의 방법으로 데스티오비오틴-페놀에 의해서 펩타이드를 표지한 경우에는 펩타이드의 티로신기에 데스티오비오틴-페놀 (Y+DBP)가 공유결합을 한 프로브의 mass 값인 M+331 Da만을 검출할 수 있었지만, 비교예 1의 방법으로 데스티오비오틴-페놀 대신 비오틴-페놀을 처리한 경우에는 펩타이드의 티로신기에 비오틴-페놀 (Y+BP)가 공유결합을 한 프로브의 mass 값인 M+361 Da 및 상기 비오틴 페놀이 산화된 형태 (Y+oxidized BP)의 프로브의 mass 값인 M+377 Da이 동시에 검출할 수 있었다. 상기 결과는 도 2에 도식화했다.As shown in Figs. 4 and 5, when peptides were labeled with des-biotin-phenol by the methods of Examples 1 and 2, des-thiobiotin-phenol (Y + DBP) was covalently bonded to the tyrosine group of the peptide It was possible to detect only the mass value M + 331 Da of the probe. However, when the biotin-phenol was treated in place of the desiobiotin-phenol in the method of Comparative Example 1, biotin-phenol (Y + BP) was covalently bonded to the tyrosine group of the peptide M + 361 Da, which is the mass value of one probe, and M + 377 Da, which is the mass value of the probe of the oxidized form of the biotin phenol (Y + oxidized BP). The results are illustrated in FIG.

또한, 상기 질량 분석 결과를 바탕으로 질량분석 신호 세기와 단백질의 용제 접근 면적간의 상관관계를 도 3에 나타냈다. 그 결과, 용제 접근 면적이 증가할수록 질량분석 신호 세기가 증가하는 양의 상관관계가 있음을 확인할 수 있었다.3 shows the correlation between the mass spectrometry signal intensity and the solvent access area of the protein based on the mass analysis results. As a result, it was confirmed that the mass analyzing signal intensity increases positively as the solvent access area increases.

실험예Experimental Example 2. 표지된 단백질의 확인 2. Identification of labeled proteins

본 발명에서 합성하여 사용한 데스티오비오틴-페놀에 의해서 표지된 펩타이드를 확인하기 위해서, 실시예 2-1 내지 2-2를 수행하여 얻은 세포 용해물 및 및 비교예 1를 수행하여 얻은 세포 용해물에 대하여 하기와 같은 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하였다.In order to confirm the peptide labeled with dextobiotin-phenol synthesized and used in the present invention, the cell lysate obtained in Examples 2-1 to 2-2 and the cell lysate obtained in Comparative Example 1 Western blotting was performed in the following manner.

구체적으로, 실시예 2-2 및 비교예 1를 수행하여 얻은 세포 용해물을 SDS-PAGE를 위해서 샘플링하고, SDS-PAGE 젤에 150V에서 약 1시간 동안 전기영동을 실시하였다. 그 다음, SDS-PAGE 젤에 전기 영동된 단백질들을 니트로섬유소막 (Nitrocellulose membrane)으로 옮긴 후, 폰슈 염색(ponceau staining)을 통해 전체 단백질 양을 시각적으로 확인하고, TBST용액 (Tris-Buffered Saline 및 Tween 20의 혼합액)으로 폰슈를 제거하고, 2% (w/v)의 투석된 BSA 용액으로 1시간 동안 상온에서 교반하였다. 2% (w/v)의 투석된 BSA 용액에 SA-HRP를 10000:1로 희석하여 1시간동안 상온에서 교반하였다. 그 다음, 1회당 5분씩 총 4회 TBST로 막 (Membrane)을 씻었다. TBST로 세척한 막을 현상액으로 현상하고, 제조사의 프로토콜에 따라서 LAS 4000 장비 (GE, USA, LAS 4000)를 사용하여 이미지를 얻었다.Specifically, the cell lysate obtained by carrying out Example 2-2 and Comparative Example 1 was sampled for SDS-PAGE and electrophoresed on an SDS-PAGE gel at 150V for about 1 hour. Then, electrophoresed proteins on SDS-PAGE gels were transferred to a nitrocellulose membrane, visualized by ponceau staining, and analyzed with TBST solution (Tris-Buffered Saline and Tween 20), and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour with a 2% (w / v) dialyzed BSA solution. SA-HRP was diluted to 10000: 1 with 2% (w / v) dialyzed BSA solution and stirred at room temperature for 1 hour. Membrane was then washed with TBST four times for 5 minutes each time. Membranes washed with TBST were developed with a developer and images were obtained using a LAS 4000 instrument (GE, USA, LAS 4000) according to the manufacturer's protocol.

도 6 및 도 7의 1번은 표 2의 1 (MitoMatrix-APEX2)이고, 2번은 표 2의 9 (LACTB-APEX2 (IMS))이고, 3번은 표 2의 4 (Tom20-APEX2 (OMM))이고, 4번은 표 2의 8 (APEX2-NES)이고, 5번은 표 2의 11 (Pdk1-APEX2 (matrix))이고, 6번은 표 2의 3 (SCO1-APEX2 (IMS))이고, 7번은 표 2의 5 (TRMT61B-APEX2)이고, 8번은 표 2의 6 (ATP5J-APEX2)이고, 9번은 표 2의 7 (MGST3-APEX2)이다. 6 and 7 are 1 (MitoMatrix-APEX2) in Table 2, 2 is LACTB-APEX2 (IMS) in Table 2, 3 is Tom20-APEX2 (OMM) in Table 2, APEX2 (NMS) in Table 2, 11 (Pdk1-APEX2 (matrix) in Table 2), No. 3 (SCO1-APEX2 (TRMT61B-APEX2), 8 is 6 (ATP5J-APEX2) in Table 2, and 9 is 7 (MGST3-APEX2) in Table 2.

도 7에서 나타난 것과 같이, 각 세포소기관에서 desthiobiotin-phenol에 의해 표지된 단백질의 웨스턴 블롯 패턴을 확인할 수 있었고, 상기 표지된 단백질의 웨스턴 블롯 패턴은 도 6에서 나타난 것과 같이 biotin-phenol에 의해서 표지된 단백질의 웨스턴 블롯 패턴과 유사함을 확인할 수 있었다.As shown in FIG. 7, the western blot pattern of the protein labeled by desthiobiotin-phenol was confirmed in each organelle, and the western blot pattern of the labeled protein was labeled with biotin-phenol as shown in FIG. 6 Similar to the western blot pattern of the protein.

실험예Experimental Example 3. 수득한 표지  3. Obtained label 펩타이드의Of peptide 확인 Confirm

실시예 2-3에서 스트렙타아비딘에 결합시켜 수득한 표지 펩타이드를 확인하기 위해서, 실시예 2-3 및 비교예 1을 수행하여 수득한 표지 펩타이드를 실험예 2와 같은 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하였다.In order to identify the labeled peptides obtained by binding to streptavidin in Example 2-3, the labeled peptides obtained by carrying out Example 2-3 and Comparative Example 1 were subjected to Western blotting in the same manner as in Experimental Example 2 .

DBP는 실시예 1 및 실시예 2의 방법을 수행한 것이고, BP는 비교예 1을 수행한 것이다. Input은 스트렙타아비딘에 결합하기 전의 샘플, Flow-through는 스트렙타아비딘과 결합시키고 마그네틱 스탠드에 꽂아 가라앉힌 후의 상층액, SA-Enriched는 스트렙타아비딘에 결합한 샘플을 나타낸다.DBP was the method of Example 1 and Example 2, and BP was Comparative Example 1. The input is the sample before binding to streptavidin, the flow-through is the supernatant after binding to streptavidin and immersed in the magnetic stand, and SA-Enriched is the sample bound to streptavidin.

도 8에 나타난 것과 같이, Input에 존재하는 DBP로 표지된 단백질이 스트렙타아비딘 비드에 특이적으로 결합함을 확인 할 수 있었고, 상기 결과는 BP로 표지된 단백질이 스트렙타아비딘 비드에 특이적으로 결합하는 웨스턴 블롯 패턴과 유사함을 확인할 수 있었다.As shown in FIG. 8, it was confirmed that the protein labeled with DBP existing in the input specifically binds to streptavidin beads, and the result shows that the BP-labeled protein specifically binds to streptavidin beads Similar to the Western blot pattern.

실험예Experimental Example 4. 형광 현미경 분석 4. Fluorescence Microscopy Analysis

실시예 1 및 2의 방법으로 DBP로 단백질을 표지한 세포 및 비교예 1의 방법으로 BP로 단백질을 표지한 세포들을 하기와 같은 방법으로 형광 현미경을 사용하여 분석하였다.Cells labeled with DBP by the methods of Examples 1 and 2 and cells labeled with BP by the method of Comparative Example 1 were analyzed by fluorescence microscopy in the following manner.

형광 현미경 분석을 위해, 실시예 1 및 2의 방법으로 DBP로 단백질을 표지한 세포 및 비교예 1의 방법으로 BP로 단백질을 표지한 세포들을 4% (v/v) 파라포름알데히드 (paraformaldehyde)를 포함한 DPBS 용액으로 실온에서 15분 동안 고정시켰다. 그 다음, 세포들을 DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, Gibco)로 3번 세척하고, 4

Figure pat00012
에서 보관한 메탄올을 -20℃에서 5분 동안 처리하여 세포를 투과시켰다 (Permeabilized).For fluorescence microscopic analysis, the cells labeled with DBP by the methods of Examples 1 and 2 and the cells labeled with BP by the method of Comparative Example 1 were treated with 4% (v / v) paraformaldehyde With DPBS solution at room temperature for 15 min. The cells were then washed three times with DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, Gibco), and 4
Figure pat00012
Was treated at -20 ° C for 5 minutes to permeabilize the cells (Permeabilized).

위와 같이 세포를 투과시킨 후, 세포들을 다시 DPBS로 3번 세척하고, 2% (w/v) BSA (Bovine serum albumin)를 포함하고 있는 DPBS (blocking buffer)로 실온에서 1시간 동안 블록킹하였다. After the cells were permeated as above, the cells were washed three times with DPBS and blocked with DPBS (blocking buffer) containing 2% (w / v) BSA (Bovine serum albumin) for 1 hour at room temperature.

APEX2-융합 단백질의 발현을 탐지하기 위해, 세포들은 마우스 항-V5 항체 (Invitrogen, R960-25, 1:5000 희석)와 함께 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 그 다음, 세포들을 TBST를 이용하여 5분씩 4회 세척 후, 동시에 이차 Alexa Fluor 488-염소 항-마우스 IgG (Invitrogen, A-11001, 1:1000 희석) 및 streptavidin-Alexa Fluor 568 IgG (Invitrogen, S11226, 1:1000 희석)의 존재 하에서 30분 동안 실온에서 배양하였다. 그 다음, 상기 세포들을 TBST를 사용하여 5분씩 4회 세척하고, EVOS Epi-fluorescence microscope (Life Technology)를 이용한 이미징을 위해 얼음 위에 보관한 DPBS에 놓았다. 형광 현미경을 사용한 이미징은 제조사의 프로토콜에 따라서 수행하였다. 그 결과를, 도 9 및 15에 나타내었다.To detect the expression of the APEX2-fusion protein, cells were incubated with mouse anti-V5 antibody (Invitrogen, R960-25, 1: 5000 dilution) for 1 hour at room temperature. Cells were then washed four times for 5 minutes each using TBST and then simultaneously injected with secondary Alexa Fluor 488-goat anti-mouse IgG (Invitrogen, A-11001, 1: 1000 dilution) and streptavidin-Alexa Fluor 568 IgG (Invitrogen, , 1: 1000 dilution) for 30 minutes at room temperature. The cells were then washed four times for 5 minutes each using TBST and placed on ice-stored DPBS for imaging using an EVOS Epi-fluorescence microscope (Life Technology). Imaging using a fluorescence microscope was performed according to the manufacturer's protocol. The results are shown in Figs. 9 and 15.

도 9에서 확인할 수 있듯이, 실시예 1 및 2의 방법으로 DBP로 단백질을 표지한 세포 및 비교예 1의 방법으로 BP로 단백질을 표지한 세포의 형광 이미징한 결과는 큰 차이가 없이 동일했다.As can be seen from FIG. 9, the fluorescence imaging results of the cells labeled with DBP by the methods of Examples 1 and 2 and the cells labeled with BP by the method of Comparative Example 1 were the same without any significant difference.

도 15는, U2OS 세포에 실시예 2-1 및 2-2와 같은 방법으로 Mito-BFP와 TMEM261-V5-APEX2를 발현시킨 후, DBP로 표지하였다. 녹색은 항-V5로 TMEM261-V5-APEX2의 발현 패턴을 관찰한 것이고, 빨간색은 SA-568, 즉 DBP 표지된 단백질의 패턴을 관찰한 것이고, 파란색은 Mito-BFP, 즉 미토콘드리아 패턴을 관찰한 것이다. 상기 3가지를 오버랩한 것이 merged이며, 녹색과 파란색은 잘 겹쳐지기 때문에 TMEM261-V5-APEX2가 미토콘드리아에 잘 발현되는 것을 의미하고, 빨간색이 잘 겹치지 않는 것은 DBP 표지가 제한된 공간이 아닌 OMM (Outer mitochondrial membrane)이나 IMS (Intermembrane space)에서 일어나는 것을 의미한다. IMM (Inner mitochondrial membrane)과 다르게 OMM에는 pore가 존재하기 때문에 OMM이나 IMS는 matrix와는 다르게 제한되지 않은 공간이다.15 shows the expression of Mito-BFP and TMEM261-V5-APEX2 in U2OS cells in the same manner as in Examples 2-1 and 2-2, followed by labeling with DBP. Green was the observation of the expression pattern of TMEM261-V5-APEX2 with anti-V5, red was the pattern of SA-568, that is, the pattern of DBP-labeled protein, and blue was Mito-BFP, that is, the mitochondrial pattern . Since the green and blue overlap well, TMEM261-V5-APEX2 is expressed well in the mitochondria, and the red does not overlap well because the DBP label is not limited space but OMM (Outer mitochondrial membrane or IMS (Intermembrane space). Unlike the IMM (Inner Mitochondrial Membrane), OMM and IMS are unconstrained spaces because they have pores in the OMM.

실험예Experimental Example 5. DBP로 표지한 특정  5. DBP labeled specific 세포소기관Cell organelle 단백질의 탐지 Protein detection

본 발명의 방법에 의해서 특정 세포세포 소기관에 존재하는 단백질을 탐지하기 위해서 실시예 1 및 2의 방법을 사용하여 실험을 수행하고, 얻어진 펩타이드 절단을 실험예 1과 같은 방법으로 질량분석을 수행하여 그 결과를 분석하였다.Experiments were conducted using the methods of Examples 1 and 2 in order to detect proteins present in specific cell cell organelles by the method of the present invention, and the obtained peptide cleavage was subjected to mass spectrometry in the same manner as in Experimental Example 1, The results were analyzed.

그 결과 도 10 내지 14에서 확인 할 수 있는 바와 같이, 미토콘드리아 세포소기관의 이중막 사이공간 (IMS)에 존재하는 LACTB 단백질과 근접거리에 존재하는 세포질에 존재하는 ENO1 단백질이 표지되었음을 확인할 수 있었고, 미토콘드리아 세포소기관 이중막 사이공간에 존해하는 SCO1 단백질과 근접거리에 존재하는 IMS에 존재하는 HIGD1A 단백질이 표지되었음을 확인할 수 있었다. 이는 OMM은 투과 가능 (permeable)하고, IMM은 투과 가능하지 않기 (impermeable) 때문에, LACTB는 OMM에 가까운 위치에 존재하여 세포질에 존재하는 단백질을 DBP로 표지가 가능하지만, SCO1은 IMM 또는 매트릭스 (matrix)에 가까운 위치에 존재함에도 불구하고 매트릭스에 존재하는 단백질을 DBP로 표지가 불가능하기 때문이라고 판단된다.As a result, as can be seen from FIGS. 10 to 14, it was confirmed that the ENO1 protein present in the cytoplasm existing in proximity to the LACTB protein present in the intermembrane space (IMS) of mitochondrial organelles was labeled, and mitochondria It was confirmed that HIGD1A protein present in IMS which is close to SCO1 protein, which is dependent on space between cell organelles, is marked. Since the OMM is permeable and the IMM is impermeable, LACTB is located close to the OMM and can be labeled with DBP as a protein present in the cytoplasm, whereas SCO1 is either an IMM or a matrix ), It is judged that the protein present in the matrix can not be labeled with DBP.

즉, LACTB와 SCO1은 둘다 IMS에 존재하는 단백질이지만, LACTB는 SCO1에 바햐서 상대적으로 IMS 공간중에서 세포질쪽에 가까운 위치에 존재하고, SCO1은 LACTB에 비해서 상대적으로 IMS 공간중에서 IMM쪽에 가까운 위치에 때문에, LACTB-APEX2는 세포질에 존재하는 단백질을 표지가능하지만, SCO1-APEX2는 세포질에 존재하는 단백질을 표지할 수 없다.That is, since LACTB and SCO1 are both proteins present in IMS, LACTB is located closer to the cytoplasmic side in IMS space than SCO1, and SCO1 is located closer to IMM in IMS space than LACTB, LACTB-APEX2 can label proteins present in the cytoplasm, but SCO1-APEX2 can not label proteins present in the cytoplasm.

실험예Experimental Example 6. DBP로 특정  6. Specific to DBP 세포소기관Cell organelle 단백질을 표지하여  Protein is labeled 막방향성Membrane orientation 구조 규명 Structure identification

비교예 1의 biotin-phenol (BP)을 사용하여 표지한 단백질을 탐지하는 방법 (도 28)은 단백질 상에서 어떤 타이로신 잔기가 biotin-phenol과 반응했는지 알수 없지만, 본 발명의 실시예 1 및 2의 방법으로 desthiobiotin-phenol (DBP)을 사용하여 단백질을 표지하고, 상기 표지한 단백질을 탐지하는 방법 (도 29)은 단백질 상의 어떤 타이로신 잔기가 표지되었는지 질량분석으로 확인할 수 있으므로, 이를 통해서 DBP로 표지된 단백질의 구조적 정보도 확인할 수 있는지 여부를 하기와 같이 확인하였다.The method of detecting labeled proteins using biotin-phenol (BP) of Comparative Example 1 (FIG. 28) does not know which tyrosine residues on the protein reacted with biotin-phenol, but the method of Examples 1 and 2 of the present invention (Fig. 29), the protein is labeled with desthiobiotin-phenol (DBP), and the tyrosine residue on the protein is identified by mass spectrometry. Thus, the protein labeled with DBP And also to confirm the structural information of the user.

구체적으로, 실시예 1 및 2과 같은 방법으로 APEX를 미토콘드리아 이중막 사이공간 (IMS)에 발현시키고 DBP 처리후, 실험예 1과 같은 방법으로 질량분석을 수행하면, 도 17에 나타난 것과 같이 IMMT라고 하는 미토콘드리아 막단백질의 경우 이중막 사이공간에 노출된 단백질 도메인만 DBP로 표지됨을 확인할 수 있었다.Specifically, when APEX was expressed in the space between mitochondria (IMS) by the same method as in Examples 1 and 2 and subjected to DBP treatment and mass analysis in the same manner as Experimental Example 1, IMMT In the case of the mitochondrial membrane protein, it was confirmed that only the protein domain exposed in the intermembrane space was labeled with DBP.

또한, APEX를 미토콘드리아 기질공간 (Matrix)에 발현시킨 경우에는, 도 17에 나타난 것과 같이 상기 IMS에 발현시킨 경우와 다르게 미토콘드리아 기질 공간에 노출된 도메인이 표지됨을 확인 할 수 있었다. In addition, when APEX was expressed in the mitochondrial matrix space, it was confirmed that the domains exposed to the mitochondrial matrix space were labeled differently from those expressed in the IMS as shown in FIG.

상기 방법과 동일하게 미토콘드리아 이중막 사이공간에 발현시킨 SCO1-APEX2 (파란색표시) 및 미토콘드리아 기질공간에 발현시킨 Matrix-APEX2 (초록색 표시)을 이용하여 막방향성을 결정하였고, 그 결과는 도 16, 도 18 내지 22에 나타냈다.The membrane orientation was determined using SCO1-APEX2 (blue color) expressed in the space between the mitochondrial bilayers and Matrix-APEX2 (green color) expressed in the mitochondrial matrix space in the same manner as described above. 18-22.

본 발명의 DBP를 이용한 특정 세포세포 소기관에 존재하는 단백질의 표지 및 상기 단백질의 확인 방법을 통해서 미토콘드리아 막단백질의 막방향성이 아직 확립되지 않은 다양한 미토콘드리아 막단백질의 막방향성을 명확히 규명할 수 있다.The membrane orientation of various mitochondrial membrane proteins, for which the membrane orientation of mitochondrial membrane proteins has not yet been established, can be clearly identified through the labeling of proteins present in specific cell cell organelles using the DBP of the present invention and the identification method of the proteins.

상기와 같은 방법으로 DBP로 표지하여 mitochondrial ATP synthase complex (PDB ID: 2WSS)를 맵핑한 결과는 도 23, mitochondrial complex II (PDB ID: 1BCC) 및 complex IV (PDB ID 1OCC)를 맵핑한 결과는 도 24, 및 mitochondrial chaperone complex (right: PDB ID: 4PJ1)를 맵핑한 결과를 도 25에 나타냈다.The result of mapping the mitochondrial ATP synthase complex (PDB ID: 2WSS) labeled with DBP in the same manner as above was mapped to the mitochondrial complex II (PDB ID: 1BCC) and complex IV (PDB ID 1OCC) 24, and the mitochondrial chaperone complex (right: PDB ID: 4PJ1).

<110> UNIST(ULSAN NATIONAL INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY) <120> Methods for identification of proteins using phenolic compounds for protein labeling <130> DPP20160206KR <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 692 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered ascorbate peroxidase(APEX) <400> 1 Met Glu Thr Gly Leu Tyr Leu Tyr Ser Ser Glu Arg Thr Tyr Arg Pro 1 5 10 15 Arg Thr His Arg Val Ala Leu Ser Glu Arg Ala Leu Ala Ala Ser Pro 20 25 30 Thr Tyr Arg Gly Leu Asn Ala Ser Pro Ala Leu Ala Val Ala Leu Gly 35 40 45 Leu Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Glu Ala Arg Gly Gly Leu Tyr Pro His Glu Ile Leu Glu Ala Leu 65 70 75 80 Ala Gly Leu Leu Tyr Ser Ala Arg Gly Cys Tyr Ser Ala Leu Ala Pro 85 90 95 Arg Leu Glu Met Glu Thr Leu Glu Ala Arg Gly Leu Glu Ala Leu Ala 100 105 110 Pro His Glu His Ile Ser Ser Glu Arg Ala Leu Ala Gly Leu Tyr Thr 115 120 125 His Arg Pro His Glu Ala Ser Pro Leu Tyr Ser Gly Leu Tyr Thr His 130 135 140 Arg Leu Tyr Ser Thr His Arg Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Pro Arg Pro 145 150 155 160 His Glu Gly Leu Tyr Thr His Arg Ile Leu Glu Leu Tyr Ser His Ile 165 170 175 Ser Pro Arg Ala Leu Ala Gly Leu Leu Glu Ala Leu Ala His Ile Ser 180 185 190 Ser Glu Arg Ala Leu Ala Ala Ser Asn Ala Ser Asn Gly Leu Tyr Leu 195 200 205 Glu Ala Ser Pro Ile Leu Glu Ala Leu Ala Val Ala Leu Ala Arg Gly 210 215 220 Leu Glu Leu Glu Gly Leu Pro Arg Leu Glu Leu Tyr Ser Ala Leu Ala 225 230 235 240 Gly Leu Pro His Glu Pro Arg Ile Leu Glu Leu Glu Ser Glu Arg Thr 245 250 255 Tyr Arg Ala Leu Ala Ala Ser Pro Pro His Glu Thr Tyr Arg Gly Leu 260 265 270 Asn Leu Glu Ala Leu Ala Gly Leu Tyr Val Ala Leu Val Ala Leu Ala 275 280 285 Leu Ala Val Ala Leu Gly Leu Val Ala Leu Thr His Arg Gly Leu Tyr 290 295 300 Gly Leu Tyr Pro Arg Leu Tyr Ser Val Ala Leu Pro Arg Pro His Glu 305 310 315 320 His Ile Ser Pro Arg Gly Leu Tyr Ala Arg Gly Gly Leu Ala Ser Pro 325 330 335 Leu Tyr Ser Pro Arg Gly Leu Pro Arg Pro Arg Pro Arg Gly Leu Gly 340 345 350 Leu Tyr Ala Arg Gly Leu Glu Pro Arg Ala Ser Pro Ala Leu Ala Thr 355 360 365 His Arg Leu Tyr Ser Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Ala Ser Pro His Ile 370 375 380 Ser Leu Glu Ala Arg Gly Ala Ser Pro Val Ala Leu Pro His Glu Gly 385 390 395 400 Leu Tyr Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Met Glu Thr Gly Leu Tyr Leu Glu 405 410 415 Thr His Arg Ala Ser Pro Gly Leu Asn Ala Ser Pro Ile Leu Glu Val 420 425 430 Ala Leu Ala Leu Ala Leu Glu Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr 435 440 445 His Ile Ser Thr His Arg Ile Leu Glu Gly Leu Tyr Ala Leu Ala Ala 450 455 460 Leu Ala His Ile Ser Leu Tyr Ser Gly Leu Ala Arg Gly Ser Glu Arg 465 470 475 480 Gly Leu Tyr Pro His Glu Gly Leu Gly Leu Tyr Pro Arg Thr Arg Pro 485 490 495 Thr His Arg Ser Glu Arg Ala Ser Asn Pro Arg Leu Glu Ile Leu Glu 500 505 510 Pro His Glu Ala Ser Pro Ala Ser Asn Ser Glu Arg Thr Tyr Arg Pro 515 520 525 His Glu Thr His Arg Gly Leu Leu Glu Leu Glu Ser Glu Arg Gly Leu 530 535 540 Tyr Gly Leu Leu Tyr Ser Gly Leu Gly Leu Tyr Leu Glu Leu Glu Gly 545 550 555 560 Leu Asn Leu Glu Pro Arg Ser Glu Arg Ala Ser Pro Leu Tyr Ser Ala 565 570 575 Leu Ala Leu Glu Leu Glu Ser Glu Arg Ala Ser Pro Pro Arg Val Ala 580 585 590 Leu Pro His Glu Ala Arg Gly Pro Arg Leu Glu Val Ala Leu Ala Ser 595 600 605 Pro Leu Tyr Ser Thr Tyr Arg Ala Leu Ala Ala Leu Ala Ala Ser Pro 610 615 620 Gly Leu Ala Ser Pro Ala Leu Ala Pro His Glu Pro His Glu Ala Leu 625 630 635 640 Ala Ala Ser Pro Thr Tyr Arg Ala Leu Ala Gly Leu Ala Ala Leu Ala 645 650 655 His Ile Ser Gly Leu Asn Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Ser Glu Arg Gly 660 665 670 Leu Ala Leu Glu Ala Gly Leu Tyr Pro His Glu Ala Leu Ala Ala Ser 675 680 685 Pro Ala Leu Ala 690 <210> 2 <211> 750 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gene of Engineered ascorbate peroxidase(APEX) <400> 2 atgggaaagt cttacccaac tgtgagtgct gattaccagg acgccgttga gaaggcgaag 60 aagaagctca gaggcttcat cgctgagaag agatgcgctc ctctaatgct ccgtttggca 120 ttccactctg ctggaacctt tgacaagggc acgaagaccg gtggaccctt cggaaccatc 180 aagcaccctg ccgaactggc tcacagcgct aacaacggtc ttgacatcgc tgttaggctt 240 ttggagccac tcaaggcgga gttccctatt ttgagctacg ccgatttcta ccagttggct 300 ggcgttgttg ccgttgaggt cacgggtgga cctaaggttc cattccaccc tggaagagag 360 gacaagcctg agccaccacc agagggtcgc ttgcccgatg ccactaaggg ttctgaccat 420 ttgagagatg tgtttggcaa agctatgggg cttactgacc aagatatcgt tgctctatct 480 gggggtcaca ctattggagc tgcacacaag gagcgttctg gatttgaggg tccctggacc 540 tctaatcctc ttattttcga caactcatac ttcacggagt tgttgagtgg tgagaaggaa 600 ggtctccttc agctaccttc tgacaaggct cttttgtctg accctgtatt ccgccctctc 660 gttgataaat atgcagcgga cgaagatgcc ttctttgctg attacgctga ggctcaccaa 720 aagctttccg agcttgggtt tgctgatgcc 750 <210> 3 <211> 691 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered ascorbate peroxidase 2 (APEX2) <400> 3 Met Glu Thr Gly Leu Tyr Leu Tyr Ser Ser Glu Arg Thr Tyr Arg Pro 1 5 10 15 Arg Thr His Arg Val Ala Leu Ser Glu Arg Ala Leu Ala Ala Ser Pro 20 25 30 Thr Tyr Arg Gly Leu Asn Ala Ser Pro Ala Leu Ala Val Ala Leu Gly 35 40 45 Leu Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Glu Ala Arg Gly Gly Leu Tyr Pro His Glu Ile Leu Glu Ala Leu 65 70 75 80 Ala Gly Leu Leu Tyr Ser Ala Arg Gly Cys Tyr Ser Ala Leu Ala Pro 85 90 95 Arg Leu Glu Met Glu Thr Leu Glu Ala Arg Gly Leu Glu Ala Leu Ala 100 105 110 Pro His Glu His Ile Ser Ser Glu Arg Ala Leu Ala Gly Leu Tyr Thr 115 120 125 His Arg Pro His Glu Ala Ser Pro Leu Tyr Ser Gly Leu Tyr Thr His 130 135 140 Arg Leu Tyr Ser Thr His Arg Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Pro Arg Pro 145 150 155 160 His Glu Gly Leu Tyr Thr His Arg Ile Leu Glu Leu Tyr Ser His Ile 165 170 175 Ser Pro Arg Ala Leu Ala Gly Leu Leu Glu Ala Leu Ala His Ile Ser 180 185 190 Ser Glu Arg Ala Leu Ala Ala Ser Asn Ala Ser Asn Gly Leu Tyr Leu 195 200 205 Glu Ala Ser Pro Ile Leu Glu Ala Leu Ala Val Ala Leu Ala Arg Gly 210 215 220 Leu Glu Leu Glu Gly Leu Pro Arg Leu Glu Leu Tyr Ser Ala Leu Ala 225 230 235 240 Gly Leu Pro His Glu Pro Arg Ile Leu Glu Leu Glu Ser Glu Arg Thr 245 250 255 Tyr Arg Ala Leu Ala Ala Ser Pro Pro His Glu Thr Tyr Arg Gly Leu 260 265 270 Asn Leu Glu Ala Leu Ala Gly Leu Tyr Val Ala Leu Val Ala Leu Ala 275 280 285 Leu Ala Val Ala Leu Gly Leu Val Ala Leu Thr His Arg Gly Leu Tyr 290 295 300 Gly Leu Tyr Pro Arg Leu Tyr Ser Val Ala Leu Pro Arg Pro His Glu 305 310 315 320 His Ile Ser Pro Arg Gly Leu Tyr Ala Arg Gly Gly Leu Ala Ser Pro 325 330 335 Leu Tyr Ser Pro Arg Gly Leu Pro Arg Pro Arg Pro Arg Gly Leu Gly 340 345 350 Leu Tyr Ala Arg Gly Leu Glu Pro Arg Ala Ser Pro Pro Arg Thr His 355 360 365 Arg Leu Tyr Ser Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Ala Ser Pro His Ile Ser 370 375 380 Leu Glu Ala Arg Gly Ala Ser Pro Val Ala Leu Pro His Glu Gly Leu 385 390 395 400 Tyr Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Met Glu Thr Gly Leu Tyr Leu Glu Thr 405 410 415 His Arg Ala Ser Pro Gly Leu Asn Ala Ser Pro Ile Leu Glu Val Ala 420 425 430 Leu Ala Leu Ala Leu Glu Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr His 435 440 445 Ile Ser Thr His Arg Ile Leu Glu Gly Leu Tyr Ala Leu Ala Ala Leu 450 455 460 Ala His Ile Ser Leu Tyr Ser Gly Leu Ala Arg Gly Ser Glu Arg Gly 465 470 475 480 Leu Tyr Pro His Glu Gly Leu Gly Leu Tyr Pro Arg Thr Arg Pro Thr 485 490 495 His Arg Ser Glu Arg Ala Ser Asn Pro Arg Leu Glu Ile Leu Glu Pro 500 505 510 His Glu Ala Ser Pro Ala Ser Asn Ser Glu Arg Thr Tyr Arg Pro His 515 520 525 Glu Thr His Arg Gly Leu Leu Glu Leu Glu Ser Glu Arg Gly Leu Tyr 530 535 540 Gly Leu Leu Tyr Ser Gly Leu Gly Leu Tyr Leu Glu Leu Glu Gly Leu 545 550 555 560 Asn Leu Glu Pro Arg Ser Glu Arg Ala Ser Pro Leu Tyr Ser Ala Leu 565 570 575 Ala Leu Glu Leu Glu Ser Glu Arg Ala Ser Pro Pro Arg Val Ala Leu 580 585 590 Pro His Glu Ala Arg Gly Pro Arg Leu Glu Val Ala Leu Ala Ser Pro 595 600 605 Leu Tyr Ser Thr Tyr Arg Ala Leu Ala Ala Leu Ala Ala Ser Pro Gly 610 615 620 Leu Ala Ser Pro Ala Leu Ala Pro His Glu Pro His Glu Ala Leu Ala 625 630 635 640 Ala Ser Pro Thr Tyr Arg Ala Leu Ala Gly Leu Ala Ala Leu Ala His 645 650 655 Ile Ser Gly Leu Asn Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Ser Glu Arg Gly Leu 660 665 670 Ala Leu Glu Ala Gly Leu Tyr Pro His Glu Ala Leu Ala Ala Ser Pro 675 680 685 Ala Leu Ala 690 <210> 4 <211> 750 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gene of Engineered ascorbate peroxidase 2 (APEX2) <400> 4 atgggaaagt cttacccaac tgtgagtgct gattaccagg acgccgttga gaaggcgaag 60 aagaagctca gaggcttcat cgctgagaag agatgcgctc ctctaatgct ccgtttggca 120 ttccactctg ctggaacctt tgacaagggc acgaagaccg gtggaccctt cggaaccatc 180 aagcaccctg ccgaactggc tcacagcgct aacaacggtc ttgacatcgc tgttaggctt 240 ttggagccac tcaaggcgga gttccctatt ttgagctacg ccgatttcta ccagttggct 300 ggcgttgttg ccgttgaggt cacgggtgga cctaaggttc cattccaccc tggaagagag 360 gacaagcctg agccaccacc agagggtcgc ttgcccgatc ccactaaggg ttctgaccat 420 ttgagagatg tgtttggcaa agctatgggg cttactgacc aagatatcgt tgctctatct 480 gggggtcaca ctattggagc tgcacacaag gagcgttctg gatttgaggg tccctggacc 540 tctaatcctc ttattttcga caactcatac ttcacggagt tgttgagtgg tgagaaggaa 600 ggtctccttc agctaccttc tgacaaggct cttttgtctg accctgtatt ccgccctctc 660 gttgataaat atgcagcgga cgaagatgcc ttctttgctg attacgctga ggctcaccaa 720 aagctttccg agcttgggtt tgctgatgcc 750 <210> 5 <211> 870 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Horseradish peroxidase <400> 5 Met Glu Thr Gly Leu Asn Leu Glu Thr His Arg Pro Arg Thr His Arg 1 5 10 15 Pro His Glu Thr Tyr Arg Ala Ser Pro Ala Ser Asn Ser Glu Arg Cys 20 25 30 Tyr Ser Pro Arg Ala Ser Asn Val Ala Leu Ser Glu Arg Ala Ser Asn 35 40 45 Ile Leu Glu Val Ala Leu Ala Arg Gly Ala Ser Pro Thr His Arg Ile 50 55 60 Leu Glu Val Ala Leu Ala Ser Asn Gly Leu Leu Glu Ala Arg Gly Ser 65 70 75 80 Glu Arg Ala Ser Pro Pro Arg Ala Arg Gly Ile Leu Glu Ala Leu Ala 85 90 95 Ala Leu Ala Ser Glu Arg Ile Leu Glu Leu Glu Ala Arg Gly Leu Glu 100 105 110 His Ile Ser Pro His Glu His Ile Ser Ala Ser Pro Cys Tyr Ser Pro 115 120 125 His Glu Val Ala Leu Ala Ser Asn Gly Leu Tyr Cys Tyr Ser Ala Ser 130 135 140 Pro Ala Leu Ala Ser Glu Arg Ile Leu Glu Leu Glu Leu Glu Ala Ser 145 150 155 160 Pro Ala Ser Asn Thr His Arg Thr His Arg Ser Glu Arg Pro His Glu 165 170 175 Ala Arg Gly Thr His Arg Gly Leu Leu Tyr Ser Ala Ser Pro Ala Leu 180 185 190 Ala Pro His Glu Gly Leu Tyr Ala Ser Asn Ala Leu Ala Ala Ser Asn 195 200 205 Ser Glu Arg Ala Leu Ala Ala Arg Gly Gly Leu Tyr Pro His Glu Pro 210 215 220 Arg Val Ala Leu Ile Leu Glu Ala Ser Pro Ala Arg Gly Met Glu Thr 225 230 235 240 Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Ala Leu Ala Val Ala Leu Gly Leu Ser Glu 245 250 255 Arg Ala Leu Ala Cys Tyr Ser Pro Arg Ala Arg Gly Thr His Arg Val 260 265 270 Ala Leu Ser Glu Arg Cys Tyr Ser Ala Leu Ala Ala Ser Pro Leu Glu 275 280 285 Leu Glu Thr His Arg Ile Leu Glu Ala Leu Ala Ala Leu Ala Gly Leu 290 295 300 Asn Gly Leu Asn Ser Glu Arg Val Ala Leu Thr His Arg Leu Glu Ala 305 310 315 320 Leu Ala Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Pro Arg Ser Glu Arg Thr Arg Pro 325 330 335 Ala Arg Gly Val Ala Leu Pro Arg Leu Glu Gly Leu Tyr Ala Arg Gly 340 345 350 Ala Arg Gly Ala Ser Pro Ser Glu Arg Leu Glu Gly Leu Asn Ala Leu 355 360 365 Ala Pro His Glu Leu Glu Ala Ser Pro Leu Glu Ala Leu Ala Ala Ser 370 375 380 Asn Ala Leu Ala Ala Ser Asn Leu Glu Pro Arg Ala Leu Ala Pro Arg 385 390 395 400 Pro His Glu Pro His Glu Thr His Arg Leu Glu Pro Arg Gly Leu Asn 405 410 415 Leu Glu Leu Tyr Ser Ala Ser Pro Ser Glu Arg Pro His Glu Ala Arg 420 425 430 Gly Ala Ser Asn Val Ala Leu Gly Leu Tyr Leu Glu Ala Ser Asn Ala 435 440 445 Arg Gly Ser Glu Arg Ser Glu Arg Ala Ser Pro Leu Glu Val Ala Leu 450 455 460 Ala Leu Ala Leu Glu Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr His Ile 465 470 475 480 Ser Thr His Arg Pro His Glu Gly Leu Tyr Leu Tyr Ser Ala Ser Asn 485 490 495 Gly Leu Asn Cys Tyr Ser Ala Arg Gly Pro His Glu Ile Leu Glu Met 500 505 510 Glu Thr Ala Ser Pro Ala Arg Gly Leu Glu Thr Tyr Arg Ala Ser Asn 515 520 525 Pro His Glu Ser Glu Arg Ala Ser Asn Thr His Arg Gly Leu Tyr Leu 530 535 540 Glu Pro Arg Ala Ser Pro Pro Arg Thr His Arg Leu Glu Ala Ser Asn 545 550 555 560 Thr His Arg Thr His Arg Thr Tyr Arg Leu Glu Gly Leu Asn Thr His 565 570 575 Arg Leu Glu Ala Arg Gly Gly Leu Tyr Leu Glu Cys Tyr Ser Pro Arg 580 585 590 Leu Glu Ala Ser Asn Gly Leu Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Glu Arg 595 600 605 Ala Leu Ala Leu Glu Val Ala Leu Ala Ser Pro Pro His Glu Ala Ser 610 615 620 Pro Leu Glu Ala Arg Gly Thr His Arg Pro Arg Thr His Arg Ile Leu 625 630 635 640 Glu Pro His Glu Ala Ser Pro Ala Ser Asn Leu Tyr Ser Thr Tyr Arg 645 650 655 Thr Tyr Arg Val Ala Leu Ala Ser Asn Leu Glu Gly Leu Gly Leu Gly 660 665 670 Leu Asn Leu Tyr Ser Gly Leu Tyr Leu Glu Ile Leu Glu Gly Leu Asn 675 680 685 Ser Glu Arg Ala Ser Pro Gly Leu Asn Gly Leu Leu Glu Pro His Glu 690 695 700 Ser Glu Arg Ser Glu Arg Pro Arg Ala Ser Asn Ala Leu Ala Thr His 705 710 715 720 Arg Ala Ser Pro Thr His Arg Ile Leu Glu Pro Arg Leu Glu Val Ala 725 730 735 Leu Ala Arg Gly Ser Glu Arg Pro His Glu Ala Leu Ala Ala Ser Asn 740 745 750 Ser Glu Arg Thr His Arg Gly Leu Asn Thr His Arg Pro His Glu Pro 755 760 765 His Glu Ala Ser Asn Ala Leu Ala Pro His Glu Val Ala Leu Gly Leu 770 775 780 Ala Leu Ala Met Glu Thr Ala Ser Pro Ala Arg Gly Met Glu Thr Gly 785 790 795 800 Leu Tyr Ala Ser Asn Ile Leu Glu Thr His Arg Pro Arg Leu Glu Ala 805 810 815 Thr His Arg Gly Leu Tyr Thr His Arg Gly Leu Asn Gly Leu Tyr Gly 820 825 830 Leu Asn Ile Leu Glu Ala Arg Gly Leu Glu Ala Ala Ser Asn Cys Tyr 835 840 845 Ser Ala Arg Gly Val Ala Leu Val Ala Leu Ala Ser Asn Ser Glu Arg 850 855 860 Ala Ser Asn Ser Glu Arg 865 870 <210> 6 <211> 927 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gene of Horseradish peroxidase <400> 6 atgcagttaa cccctacatt ctacgacaat agctgtccca acgtgtccaa catcgttcgc 60 gacacaatcg tcaacgagct cagatccgat cccaggatcg ctgcttcaat attacgtctg 120 cacttccatg actgcttcgt gaatggttgc gacgctagca tattactgga caacaccacc 180 agtttccgca ctgaaaagga tgcattcggg aacgctaaca gcgccagggg ctttccagtg 240 atcgatcgca tgaaggctgc cgttgagtca gcatgcccac gaacagtcag ttgtgcagac 300 ctgctgacta tagctgcgca acagagcgtg actcttgcag gcggaccgtc ctggagagtg 360 ccgctcggtc gacgtgactc cctacaggca ttcctagatc tggccaacgc caacttgcct 420 gctccattct tcaccctgcc ccagctgaag gatagcttta gaaacgtggg tctgaatcgc 480 tcgagtgacc ttgtggctct gtccggagga cacacatttg gaaagaacca gtgtaggttc 540 atcatggata ggctctacaa tttcagcaac actgggttac ctgaccccac gctgaacact 600 acgtatctcc agacactgag aggcttgtgc ccactgaatg gcaacctcag tgcactagtg 660 gactttgatc tgcggacccc aaccatcttc gataacaagt actatgtgaa tctagaggag 720 cagaaaggcc tgatacagag tgatcaagaa ctgtttagca gtccaaacgc cactgacacc 780 atcccactgg tgagaagttt tgctaactct actcaaacct tctttaacgc cttcgtggaa 840 gccatggacc gtatgggtaa cattacccct ctgacgggta cccaaggcca gattcgtctg 900 aactgcagag tggtcaacag caactct 927 <110> UNIST (ULSAN NATIONAL INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY) <120> Methods for identification of proteins using phenolic compounds          for protein labeling <130> DPP20160206KR <160> 6 <170> KoPatentin 3.0 <210> 1 <211> 692 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered ascorbate peroxidase (APEX) <400> 1 Met Glu Thr Gly Leu Tyr Leu Tyr Ser Ser Glu Arg Thr Tyr Arg Pro   1 5 10 15 Arg Thr His Arg Val Ala Leu Ser Glu Arg Ala Leu Ala Ala Ser Pro              20 25 30 Thr Tyr Arg Gly Leu Asn Ala Ser Pro Ala Leu Ala Val Ala Leu Gly          35 40 45 Leu Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser      50 55 60 Leu Glu Ala Arg Gly Gly Leu Tyr Pro His Glu Ile Leu Glu Ala Leu  65 70 75 80 Ala Gly Leu Leu Tyr Ser Ala Arg Gly Cys Tyr Ser Ala Leu Ala Pro                  85 90 95 Arg Leu Glu Met Glu Thr Leu Glu Ala Arg Gly Leu Glu Ala Leu Ala             100 105 110 Pro His Glu His Ile Ser Ser Glu Arg Ala Leu Ala Gly Leu Tyr Thr         115 120 125 His Arg Pro His Glu Ala Ser Pro Leu Tyr Ser Gly Leu Tyr Thr His     130 135 140 Arg Leu Tyr Ser Thr His Arg Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Pro Arg Pro 145 150 155 160 His Glu Gly Leu Tyr Thr His Arg Ile Leu Glu Leu Tyr Ser His Ile                 165 170 175 Ser Pro Arg Ala Leu Ala Gly Leu Leu Glu Ala Leu Ala His Ile Ser             180 185 190 Ser Glu Arg Ala Leu Ala Ala Ser Asn Ala Ser Asn Gly Leu Tyr Leu         195 200 205 Glu Ala Ser Pro Ile Leu Glu Ala Leu Ala Val Ala Leu Ala Arg Gly     210 215 220 Leu Glu Leu Glu Gly Leu Pro Arg Leu Glu Leu Tyr Ser Ala Leu Ala 225 230 235 240 Gly Leu Pro His Glu Pro Arg Ile Leu Glu Leu Glu Ser Glu Arg Thr                 245 250 255 Tyr Arg Ala Leu Ala Ala Ser Pro Pro His Glu Thr Tyr Arg Gly Leu             260 265 270 Asn Leu Glu Ala Leu Ala Gly Leu Tyr Val Ala Leu Val Ala Leu Ala         275 280 285 Leu Ala Val Ala Leu Gly Leu Val Ala Leu Thr His Arg Gly Leu Tyr     290 295 300 Gly Leu Tyr Pro Arg Leu Tyr Ser Val Ala Leu Pro Arg Pro His Glu 305 310 315 320 His Ile Ser Pro Arg Gly Leu Tyr Ala Arg Gly Gly Leu Ala Ser Pro                 325 330 335 Leu Tyr Ser Pro Arg Gly Leu Pro Arg Pro Arg Pro Gly Leu Gly             340 345 350 Leu Tyr Ala Arg Gly Leu Glu Pro Arg Ala Ser Pro Ala Leu Ala Thr         355 360 365 His Arg Leu Tyr Ser Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Ala Ser Pro His Ile     370 375 380 Ser Leu Glu Ala Arg Gly Ala Ser Pro Val Ala Leu Pro His Glu Gly 385 390 395 400 Leu Tyr Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Met Glu Thr Gly Leu Tyr Leu Glu                 405 410 415 Thr His Arg Ala Ser Pro Gly Leu Asn Ala Ser Pro Ile Leu Glu Val             420 425 430 Ala Leu Ala Leu Ala Leu Glu Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr         435 440 445 His Ile Ser Thr His Arg Ile Leu Glu Gly Leu Tyr Ala Leu Ala Ala     450 455 460 Leu Ala His Ile Ser Leu Tyr Ser Gly Leu Ala Arg Gly Ser Glu Arg 465 470 475 480 Gly Leu Tyr Pro His Glu Gly Leu Gly Leu Tyr Pro Arg Thr Arg Pro                 485 490 495 Thr His Arg Ser Glu Arg Ala Ser Asn Pro Arg Leu Glu Ile Leu Glu             500 505 510 Pro His Glu Ala Ser Pro Ala Ser Asn Ser Glu Arg Thr Tyr Arg Pro         515 520 525 His Glu Thr His Arg Gly Leu Leu Glu Leu Glu Ser Glu Arg Gly Leu     530 535 540 Tyr Gly Leu Leu Tyr Ser Gly Leu Gly Leu Tyr Leu Glu Leu Glu Gly 545 550 555 560 Leu Asn Leu Glu Pro Arg Ser Glu Arg Ala Ser Pro Leu Tyr Ser Ala                 565 570 575 Leu Ala Leu Glu Leu Glu Ser Glu Arg Ala Ser Pro Pro Arg Val Ala             580 585 590 Leu Pro His Glu Ala Arg Gly Pro Arg Leu Glu Val Ala Leu Ala Ser         595 600 605 Pro Leu Tyr Ser Thr Tyr Arg Ala Leu Ala Ala Leu Ala Ala Ser Pro     610 615 620 Gly Leu Ala Ser Pro Ala Leu Ala Pro His Glu Pro His Glu Ala Leu 625 630 635 640 Ala Ala Ser Pro Thr Tyr Arg Ala Leu Ala Gly Leu Ala Ala Leu Ala                 645 650 655 His Ile Ser Gly Leu Asn Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Ser Glu Arg Gly             660 665 670 Leu Ala Leu Glu Ala Gly Leu Tyr Pro His Glu Ala Leu Ala Ala Ser         675 680 685 Pro Ala Leu Ala     690 <210> 2 <211> 750 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gene of Engineered ascorbate peroxidase (APEX) <400> 2 atgggaaagt cttacccaac tgtgagtgct gattaccagg acgccgttga gaaggcgaag 60 cgctgagaag ttccactctg ctggaacctt tgacaagggc acgaagaccg gtggaccctt cggaaccatc 180 aagcaccctg ccgaactggc tcacagcgct aacaacggtc ttgacatcgc tgttaggctt 240 ttggagccac tcaaggcgga gttccctatt ttgagctacg ccgatttcta ccagttggct 300 ggcgttgttg ccgttgaggt cacgggtgga cctaaggttc cattccaccc tggaagagag 360 gacaagcctg agccaccacc agagggtcgc ttgcccgatg ccactaaggg ttctgaccat 420 ttgagagatg tgtttggcaa agctatgggg cttactgacc aagatatcgt tgctctatct 480 gggggtcaca ctattggagc tgcacacaag gagcgttctg gatttgaggg tccctggacc 540 tctaatcctc ttattttcga caactcatac ttcacggagt tgttgagtgg tgagaaggaa 600 ggtctccttc agctaccttc tgacaaggct cttttgtctg accctgtatt ccgccctctc 660 gttgataaat atgcagcgga cgaagatgcc ttctttgctg attacgctga ggctcaccaa 720 aagctttccg agcttgggtt tgctgatgcc 750 <210> 3 <211> 691 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered ascorbate peroxidase 2 (APEX2) <400> 3 Met Glu Thr Gly Leu Tyr Leu Tyr Ser Ser Glu Arg Thr Tyr Arg Pro   1 5 10 15 Arg Thr His Arg Val Ala Leu Ser Glu Arg Ala Leu Ala Ala Ser Pro              20 25 30 Thr Tyr Arg Gly Leu Asn Ala Ser Pro Ala Leu Ala Val Ala Leu Gly          35 40 45 Leu Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser      50 55 60 Leu Glu Ala Arg Gly Gly Leu Tyr Pro His Glu Ile Leu Glu Ala Leu  65 70 75 80 Ala Gly Leu Leu Tyr Ser Ala Arg Gly Cys Tyr Ser Ala Leu Ala Pro                  85 90 95 Arg Leu Glu Met Glu Thr Leu Glu Ala Arg Gly Leu Glu Ala Leu Ala             100 105 110 Pro His Glu His Ile Ser Ser Glu Arg Ala Leu Ala Gly Leu Tyr Thr         115 120 125 His Arg Pro His Glu Ala Ser Pro Leu Tyr Ser Gly Leu Tyr Thr His     130 135 140 Arg Leu Tyr Ser Thr His Arg Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Pro Arg Pro 145 150 155 160 His Glu Gly Leu Tyr Thr His Arg Ile Leu Glu Leu Tyr Ser His Ile                 165 170 175 Ser Pro Arg Ala Leu Ala Gly Leu Leu Glu Ala Leu Ala His Ile Ser             180 185 190 Ser Glu Arg Ala Leu Ala Ala Ser Asn Ala Ser Asn Gly Leu Tyr Leu         195 200 205 Glu Ala Ser Pro Ile Leu Glu Ala Leu Ala Val Ala Leu Ala Arg Gly     210 215 220 Leu Glu Leu Glu Gly Leu Pro Arg Leu Glu Leu Tyr Ser Ala Leu Ala 225 230 235 240 Gly Leu Pro His Glu Pro Arg Ile Leu Glu Leu Glu Ser Glu Arg Thr                 245 250 255 Tyr Arg Ala Leu Ala Ala Ser Pro Pro His Glu Thr Tyr Arg Gly Leu             260 265 270 Asn Leu Glu Ala Leu Ala Gly Leu Tyr Val Ala Leu Val Ala Leu Ala         275 280 285 Leu Ala Val Ala Leu Gly Leu Val Ala Leu Thr His Arg Gly Leu Tyr     290 295 300 Gly Leu Tyr Pro Arg Leu Tyr Ser Val Ala Leu Pro Arg Pro His Glu 305 310 315 320 His Ile Ser Pro Arg Gly Leu Tyr Ala Arg Gly Gly Leu Ala Ser Pro                 325 330 335 Leu Tyr Ser Pro Arg Gly Leu Pro Arg Pro Arg Pro Gly Leu Gly             340 345 350 Leu Tyr Ala Arg Gly Leu Glu Pro Arg Ala Ser Pro Pro Arg Thr His         355 360 365 Arg Leu Tyr Ser Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Ala Ser Pro His Ile Ser     370 375 380 Leu Glu Ala Arg Gly Ala Ser Pro Val Ala Leu Pro His Glu Gly Leu 385 390 395 400 Tyr Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Met Glu Thr Gly Leu Tyr Leu Glu Thr                 405 410 415 His Arg Ala Ser Pro Gly Leu Asn Ala Ser Pro Ile Leu Glu Val Ala             420 425 430 Leu Ala Leu Ala Leu Glu Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr His         435 440 445 Ile Ser Thr His Arg Ile Leu Glu Gly Leu Tyr Ala Leu Ala Ala Leu     450 455 460 Ala His Ile Ser Leu Tyr Ser Gly Leu Ala Arg Gly Ser Glu Arg Gly 465 470 475 480 Leu Tyr Pro His Glu Gly Leu Gly Leu Tyr Pro Arg Thr Arg Pro Thr                 485 490 495 His Arg Ser Glu Arg Ala Ser Asn Pro Arg Leu Glu Ile Leu Glu Pro             500 505 510 His Glu Ala Ser Pro Ala Ser Asn Ser Glu Arg Thr Tyr Arg Pro His         515 520 525 Glu Thr His Arg Gly Leu Leu Glu Leu Glu Ser Glu Arg Gly Leu Tyr     530 535 540 Gly Leu Leu Tyr Ser Gly Leu Gly Leu Tyr Leu Glu Leu Glu Gly Leu 545 550 555 560 Asn Leu Glu Pro Arg Ser Glu Arg Ala Ser Pro Leu Tyr Ser Ala Leu                 565 570 575 Ala Leu Glu Leu Glu Ser Glu Arg Ala Ser Pro Pro Arg Ala Leu             580 585 590 Pro His Glu Ala Arg Gly Pro Arg Leu Glu Val Ala Leu Ala Ser Pro         595 600 605 Leu Tyr Ser Thr Tyr Arg Ala Leu Ala Ala Leu Ala Ala Ser Pro Gly     610 615 620 Leu Ala Ser Pro Ala Leu Ala Pro His Glu Pro His Glu Ala Leu Ala 625 630 635 640 Ala Ser Pro Thr Tyr Arg Ala Leu Ala Gly Leu Ala Ala Leu Ala His                 645 650 655 Ile Ser Gly Leu Asn Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Ser Glu Arg Gly Leu             660 665 670 Ala Leu Glu Ala Gly Leu Tyr Pro His Glu Ala Leu Ala Ala Ser Pro         675 680 685 Ala Leu Ala     690 <210> 4 <211> 750 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gene of Engineered ascorbate peroxidase 2 (APEX2) <400> 4 atgggaaagt cttacccaac tgtgagtgct gattaccagg acgccgttga gaaggcgaag 60 cgctgagaag ttccactctg ctggaacctt tgacaagggc acgaagaccg gtggaccctt cggaaccatc 180 aagcaccctg ccgaactggc tcacagcgct aacaacggtc ttgacatcgc tgttaggctt 240 ttggagccac tcaaggcgga gttccctatt ttgagctacg ccgatttcta ccagttggct 300 ggcgttgttg ccgttgaggt cacgggtgga cctaaggttc cattccaccc tggaagagag 360 gacaagcctg agccaccacc agagggtcgc ttgcccgatc ccactaaggg ttctgaccat 420 ttgagagatg tgtttggcaa agctatgggg cttactgacc aagatatcgt tgctctatct 480 gggggtcaca ctattggagc tgcacacaag gagcgttctg gatttgaggg tccctggacc 540 tctaatcctc ttattttcga caactcatac ttcacggagt tgttgagtgg tgagaaggaa 600 ggtctccttc agctaccttc tgacaaggct cttttgtctg accctgtatt ccgccctctc 660 gttgataaat atgcagcgga cgaagatgcc ttctttgctg attacgctga ggctcaccaa 720 aagctttccg agcttgggtt tgctgatgcc 750 <210> 5 <211> 870 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Horseradish peroxidase <400> 5 Met Glu Thr Gly Leu Asn Leu Glu Thr His Arg Pro Arg Thr His Arg   1 5 10 15 Pro His Glu Thr Tyr Arg Ala Ser Pro Ala Ser Asn Ser Glu Arg Cys              20 25 30 Tyr Ser Pro Arg Ala Ser Asn Val Ala Leu Ser Glu Arg Ala Ser Asn          35 40 45 Ile Leu Glu Val Ala Leu Ala Arg Gly Ala Ser Pro Thr His Arg Ile      50 55 60 Leu Glu Val Ala Leu Ala Ser Asn Gly Leu Leu Glu Ala Arg Gly Ser  65 70 75 80 Glu Arg Ala Ser Pro Pro Arg Ala Arg Gly Ile Leu Glu Ala Leu Ala                  85 90 95 Ala Leu Ala Ser Glu Arg Ile Leu Glu Leu Glu Ala Arg Gly Leu Glu             100 105 110 His Ile Ser Pro His Glu His Ile Ser Ala Ser Pro Cys Tyr Ser Pro         115 120 125 His Glu Val Ala Leu Ala Ser Asn Gly Leu Tyr Cys Tyr Ser Ala Ser     130 135 140 Pro Ala Leu Ala Ser Glu Arg Ile Leu Glu Leu Glu Leu Glu Ala Ser 145 150 155 160 Pro Ala Ser Asn Thr His Arg Thr His Arg Ser Glu Arg Pro His Glu                 165 170 175 Ala Arg Gly Thr His Arg Gly Leu Leu Tyr Ser Ala Ser Pro Ala Leu             180 185 190 Ala Pro His Glu Gly Leu Tyr Ala Ser Asn Ala Leu Ala Ala Ser Asn         195 200 205 Ser Glu Arg Ala Leu Ala Ala Arg Gly Gly Leu Tyr Pro His Glu Pro     210 215 220 Arg Val Ala Leu Ile Leu Glu Ala Ser Pro Ala Arg Gly Met Glu Thr 225 230 235 240 Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Leu Ala Val Ala Leu Gly Leu Ser Glu                 245 250 255 Arg Ala Leu Ala Cys Tyr Ser Pro Arg Ala Arg Gly Thr His Arg Val             260 265 270 Ala Leu Ser Glu Arg Cys Tyr Ser Ala Leu Ala Ala Ser Pro Leu Glu         275 280 285 Leu Glu Thr His Arg Ile Leu Glu Ala Leu Ala Ala Leu Ala Gly Leu     290 295 300 Asn Gly Leu Asn Ser Glu Arg Val Ala Leu Thr His Arg Leu Glu Ala 305 310 315 320 Leu Ala Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Pro Arg Ser Glu Arg Thr Arg Pro                 325 330 335 Ala Arg Gly Val Ala Leu Pro Arg Leu Glu Gly Leu Tyr Ala Arg Gly             340 345 350 Ala Arg Gly Ala Ser Ser Glu Arg Leu Glu Gly Leu Asn Ala Leu         355 360 365 Ala Pro His Glu Leu Glu Ala Ser Pro Leu Glu Ala Leu Ala Ala Ser     370 375 380 Asn Ala Leu Ala Ala Ser Asn Leu Glu Pro Arg Ala Leu Ala Pro Arg 385 390 395 400 Pro His Glu Pro His Glu Thr His Arg Leu Glu Pro Arg Gly Leu Asn                 405 410 415 Leu Glu Leu Tyr Ser Ala Ser Pro Ser Glu Arg Pro His Glu Ala Arg             420 425 430 Gly Ala Ser Asn Val Ala Leu Gly Leu Tyr Leu Glu Ala Ser Asn Ala         435 440 445 Arg Gly Ser Glu Arg Ser Glu Arg Ala Ser Pro Leu Glu Val Ala Leu     450 455 460 Ala Leu Ala Leu Glu Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr His Ile 465 470 475 480 Ser Thr His Arg Pro His Glu Gly Leu Tyr Leu Tyr Ser Ala Ser Asn                 485 490 495 Gly Leu Asn Cys Tyr Ser Ala Arg Gly Pro His Glu Ile Leu Glu Met             500 505 510 Glu Thr Ala Ser Pro Ala Arg Gly Leu Glu Thr Tyr Arg Ala Ser Asn         515 520 525 Pro His Glu Ser Glu Arg Ala Ser Asn Thr His Arg Gly Leu Tyr Leu     530 535 540 Glu Pro Arg Ala Ser Pro Pro Arg Thr His Arg Leu Glu Ala Ser Asn 545 550 555 560 Thr His Arg Thr His Arg Thr Tyr Arg Leu Glu Gly Leu Asn Thr His                 565 570 575 Arg Leu Glu Ala Arg Gly Gly Leu Tyr Leu Glu Cys Tyr Ser Pro Arg             580 585 590 Leu Glu Ala Ser Asn Gly Leu Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Glu Arg         595 600 605 Ala Leu Ala Leu Glu Val Ala Leu Ala Ser Pro Pro His Glu Ala Ser     610 615 620 Pro Leu Glu Ala Arg Gly Thr His Arg Pro Thr His Arg Ile Leu 625 630 635 640 Glu Pro His Glu Ala Ser Pro Ala Ser Asn Leu Tyr Ser Thr Tyr Arg                 645 650 655 Thr Tyr Arg Val Ala Leu Ala Ser Asn Leu Glu Gly Leu Gly Leu Gly             660 665 670 Leu Asn Leu Tyr Ser Gly Leu Tyr Leu Glu Ile Leu Glu Gly Leu Asn         675 680 685 Ser Glu Arg Ala Ser Pro Gly Leu Asn Gly Leu Leu Glu Pro His Glu     690 695 700 Ser Glu Arg Ser Glu Arg Pro Ala Ser Ser Asn Ala Leu Ala Thr His 705 710 715 720 Arg Ala Ser Pro Thr His Arg Ile Leu Glu Pro Arg Leu Glu Val Ala                 725 730 735 Leu Ala Arg Gly Ser Glu Arg Pro His Glu Ala Leu Ala Ala Ser Asn             740 745 750 Ser Glu Arg Thr His Arg Gly Leu Asn Thr His Arg Pro His Glu Pro         755 760 765 His Glu Ala Ser Asn Ala Leu Ala Pro His Glu Val Ala Leu Gly Leu     770 775 780 Ala Leu Ala Met Glu Thr Ala Ser Pro Ala Arg Gly Met Glu Thr Gly 785 790 795 800 Leu Tyr Ala Ser Asn Ile Leu Glu Thr His Arg Pro Arg Leu Glu Ala                 805 810 815 Thr His Arg Gly Leu Tyr Thr His Arg Gly Leu Asn Gly Leu Tyr Gly             820 825 830 Leu Asn Ile Leu Glu Ala Arg Gly Leu Glu Ala Ala Ser Asn Cys Tyr         835 840 845 Ser Ala Arg Gly Val Ala Leu Val Ala Leu Ala Ser Asn Ser Glu Arg     850 855 860 Ala Ser Asn Ser Glu Arg 865 870 <210> 6 <211> 927 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gene of Horseradish peroxidase <400> 6 atgcagttaa cccctacatt ctacgacaat agctgtccca acgtgtccaa catcgttcgc 60 gacacaatcg tcaacgagct cagatccgat cccaggatcg ctgcttcaat attacgtctg 120 cacttccatg actgcttcgt gaatggttgc gacgctagca tattactgga caacaccacc 180 agtttccgca ctgaaaagga tgcattcggg aacgctaaca gcgccagggg ctttccagtg 240 atcgatcgca tgaaggctgc cgttgagtca gcatgcccac gaacagtcag ttgtgcagac 300 ctgctgacta tagctgcgca acagagcgtg actcttgcag gcggaccgtc ctggagagtg 360 ccgctcggtc gacgtgactc cctacaggca ttcctagatc tggccaacgc caacttgcct 420 gctccattct tcaccctgcc ccagctgaag gatagcttta gaaacgtggg tctgaatcgc 480 tcgagtgacc ttgtggctct gtccggagga cacacatttg gaaagaacca gtgtaggttc 540 atcatggata ggctctacaa tttcagcaac actgggttac ctgaccccac gctgaacact 600 acgtatctcc agacactgag aggcttgtgc ccactgaatg gcaacctcag tgcactagtg 660 gactttgatc tgcggacccc aaccatcttc gataacaagt actatgtgaa tctagaggag 720 cagaaaggcc tgatacagag tgatcaagaa ctgtttagca gtccaaacgc cactgacacc 780 atcccactgg tgagaagttt tgctaactct actcaaacct tctttaacgc cttcgtggaa 840 gccatggacc gtatgggtaa cattacccct ctgacgggta cccaaggcca gattcgtctg 900 aactgcagag tggtcaacag caactct 927

Claims (16)

탐지를 위한 세포 내 목적 단백질이 존재하는 세포 소기관으로 표적화 서열을 코딩하는 유전자와 과산화효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 세포에 도입하는 단계;
상기 세포에 과산화수소와 하기 화학식 1의 구조를 갖는 페놀 화합물, 이의 입체 이성질체 (Stereoisomers), 호변 이성질체 (Tautomers) 또는 이들의 염을 처리하여 상기 페놀 화합물로 세포 내 단백질을 표지화하는 단계;
상기 세포의 파쇄물에 스트렙타비딘 (Streptavidin: SA) 비드를 첨가하여, 상기 스트렙타비딘 비드에 결합된 표지 단백질을 수득하는 단계; 및
상기 수득물에서 목적 단백질을 확인하는 단계를 포함하는 단백질의 탐지 방법:
[화학식 1]
Figure pat00013
Introducing into the cell a polynucleotide comprising a gene encoding a targeting sequence and a gene encoding a peroxidase into a cell organelle in which an intracellular target protein exists for detection;
Treating the cell with a phenol compound, a stereoisomer, a tautomer or a salt thereof having hydrogen peroxide and a structure represented by the following formula (1) to label the intracellular protein with the phenol compound;
Adding a Streptavidin (SA) bead to the cell lysate to obtain a labeled protein bound to the streptavidin bead; And
Identifying a protein of interest in said product;
[Chemical Formula 1]
Figure pat00013
제1항에 있어서, 상기 수득물에서 목적 단백질을 확인하는 단계는, 상기 스트렙타비딘 비드에 결합된 표지 단백질에 효소를 처리하여 단백질을 절단하고, 상기 스트렙타비딘 비드에 결합된 절단 단편을 분리하고, 상기 분리된 절단 단편을 분석하는 단계로 수행되는 것인, 단백질의 탐지 방법. The method according to claim 1, wherein the step of identifying the target protein in the product comprises: treating the labeled protein bound to the streptavidin bead with an enzyme to cleave the protein; separating the cleaved fragment bound to the streptavidin bead And analyzing the separated cleaved fragments. &Lt; Desc / Clms Page number 19 &gt; 제2항에 있어서, 상기 절단 단편을 분리하는 것은 탈염처리 (desalting) 하여 수행하는 것인, 단백질의 탐지 방법. 3. The method of claim 2, wherein separating the cleaved fragments is performed by desalting. 제2항에 있어서, 상기 효소는 트립신 (trypsin)인, 단백질의 탐지방법.3. The method according to claim 2, wherein the enzyme is trypsin. 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드를 세포에 도입하는 단계에 앞서, 목적 단백질의 세포내 위치를 분석하는 단계를 수행하는 것인 단백질의 탐지방법.2. The method of detecting a protein according to claim 1, wherein the step of analyzing the intracellular position of the target protein is performed prior to the step of introducing the polynucleotide into the cell. 제1항에 있어서, 상기 페놀 화합물은 과산화효소에 의해서 라디칼 (Radical)을 생성하는 것인, 단백질의 탐지 방법.The method of claim 1, wherein the phenolic compound produces a radical by peroxidase. 제6항에 있어서, 상기 과산화효소는 대두 아스코르베이트 과산화효소(Soybean ascorbate peroxidase), 애기장대 아스코르베이트 과산화효소 (Arabidopsis ascorbate peroxidase), 시금치 아스코르베이트 과산화효소 (Spinach ascorbate peroxidase), 사카로미세스 세레비시에 시토크롬 c 과산화효소 (Saccharomyces cerevisiae cytochrome c peroxidase), 파네로카에테 크리소스포리움 과산화효소 PCL1 (Phanerochaete chrysosporium PCL1), 파네로카에테 크리소스포리움 과산화효소 PCM (Phanerochaete chrysosporium PCM), 코프리놉시스 시네레아 과산화효소 (Coprinopsis cinerea peroxidase), 땅콩 과산화효소 (Peanut Peroxidase), 애기장대 과산화효소 ATPA2 (Arabidopsis ATPA2), 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 효소, 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 효소 및 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 효소로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 효소인, 단백질의 탐지 방법.7. The method of claim 6, wherein the peroxidase is selected from the group consisting of Soybean ascorbate peroxidase, Arabidopsis ascorbate peroxidase, Spinach ascorbate peroxidase, Saccharomyces cerevisiae cytochrome c peroxidase, Phanerochaete chrysosporium PCL1, Phanerochaete chrysosporium PCM (PCM), Phanerochaete chrysosporium PCM (PCM) An enzyme comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, an enzyme consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, an enzyme consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, an enzyme consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: And an enzyme consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 The one or more selected enzymes, detection methods of protein. 제6항에 있어서, 상기 생성된 라디칼은 단백질 또는 펩타이드 표면에 존재하는 타이로신 (Tyrosine)기와 공유결합을 형성하여 상기 단백질 또는 펩타이드에 결합하는 것인, 단백질의 탐지 방법.The method according to claim 6, wherein the generated radical forms a covalent bond with a tyrosine group present on the protein or peptide surface and binds to the protein or peptide. 제4항에 있어서, 상기 라디칼이 단백질 또는 펩타이드에 결합하는 거리는 5 내지 50 nm인, 단백질의 탐지 방법.5. The method of claim 4, wherein the distance that the radical binds to the protein or peptide is 5 to 50 nm. 제1항에 있어서, 상기 세포 소기관은 미토콘드리아, 소포체, 핵, 세포질 및 골지체로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 단백질의 탐지 방법.The method of claim 1, wherein the organelle is selected from the group consisting of mitochondria, endoplasmic reticulum, nucleus, cytoplasm and Golgi. 제1항에 있어서, 상기 페놀 화합물의 처리는, 하기 하기 화학식 1의 구조를 가지는 화합물을 0.1 uM 내지 1 mM농도로 10 내지 60분 동안 처리하는 것인, 단백질의 탐지 방법:
[화학식 1]
Figure pat00014
The method for detecting a protein according to claim 1, wherein the phenol compound is treated with a compound having a structure of the following formula (1) at a concentration of 0.1 uM to 1 mM for 10 to 60 minutes:
[Chemical Formula 1]
Figure pat00014
제1항에 있어서, 상기 과산화수소의 처리는, 과산화수소를 0.1 내지 2mM의 농도로 1 내지 10분 동안 처리하는 것인, 단백질의 탐지 방법.2. The method of claim 1, wherein the treatment with hydrogen peroxide comprises treating the hydrogen peroxide with a concentration of 0.1 to 2 mM for 1 to 10 minutes. 제1항에 있어서, 상기 세포 소기관으로 표적화 서열을 코딩하는 유전자는 미토콘드리아 기질 발현 유전자, 세포질 발현 유전자, 미토콘드리아 이중막 사이 공간 발현 유전자, 핵 발현 유전자, 세포 외막 발현 유전자, 소포체 내막 발현 유전자, 소포체 외막 발현 유전자, 또는 세포 내막 발현 유전자인, 단백질의 탐지 방법.The method according to claim 1, wherein the gene coding for the targeting sequence to the organelle is selected from the group consisting of mitochondrial substrate expression gene, cytoplasmic expression gene, mitochondrial bilayer membrane spacer gene, nuclear expression gene, extracellular membrane expression gene, endoplasmic reticulum expression gene, An expression gene, or an intracellular membrane expression gene. 제1항에 있어서, 상기 세포는 신장 세포, 암 세포, 피부 세포, 난소 세포, 활막세포, 말초혈액단핵구 세포, 섬유아세포, 섬유세포, 신경세포, 상피세포, 각질세포, 조혈세포, 멜라닌 세포, 연골세포, 대식세포, 근육세포, 혈액 세포, 골수 세포, 림프구 세포, 단핵세포, 폐 세포, 췌장 세포, 간 세포, 위 세포, 장 세포, 심장 세포, 방광 세포, 요도 세포, 배아 생식세포 또는 난구세포인, 단백질의 탐지 방법.The method of claim 1, wherein the cells are selected from the group consisting of kidney cells, cancer cells, skin cells, ovarian cells, synovial cells, peripheral blood mononuclear cells, fibroblasts, fibroblasts, neurons, epithelial cells, keratinocytes, hematopoietic cells, Chondrocytes, macrophages, muscle cells, blood cells, bone marrow cells, lymphocyte cells, mononuclear cells, lung cells, pancreatic cells, liver cells, gastric cells, intestinal cells, cardiac cells, bladder cells, urethral cells, A method of detecting a protein that is a cell. 제1항에 있어서, 상기 스트렙타아비딘 비드는 스트렙타아비딘 코팅된 자성 비드인 것인, 단백질의 탐지 방법.The method of claim 1, wherein the streptavidin bead is a streptavidin-coated magnetic bead. 제1항에 있어서, 상기 목적 단백질을 확인하는 단계는 질량 분석, 웨스턴 블롯, 형광 현미경 분석, 닷 블롯, 또는 ELISA인, 단백질의 탐지 방법.The method of claim 1, wherein identifying the target protein is mass spectrometry, Western blot, fluorescence microscopy, dot blot, or ELISA.
KR1020170016359A 2017-02-06 2017-02-06 Methods for identification of proteins using phenolic compounds for protein labeling KR101910169B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170016359A KR101910169B1 (en) 2017-02-06 2017-02-06 Methods for identification of proteins using phenolic compounds for protein labeling

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170016359A KR101910169B1 (en) 2017-02-06 2017-02-06 Methods for identification of proteins using phenolic compounds for protein labeling

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20180091345A true KR20180091345A (en) 2018-08-16
KR101910169B1 KR101910169B1 (en) 2018-10-19

Family

ID=63443948

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020170016359A KR101910169B1 (en) 2017-02-06 2017-02-06 Methods for identification of proteins using phenolic compounds for protein labeling

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101910169B1 (en)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023277457A1 (en) * 2021-06-28 2023-01-05 서울대학교산학협력단 Transgenic animal in which apex2 is specifically expressed in mitochondrial matrix and uses thereof
WO2024049154A1 (en) * 2022-08-29 2024-03-07 서울대학교산학협력단 Phenol compound substituted with non-radioactive isotope, and use thereof

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9624524B2 (en) 2011-06-15 2017-04-18 Massachusetts Institute Of Technology In vivo proteomic mapping

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023277457A1 (en) * 2021-06-28 2023-01-05 서울대학교산학협력단 Transgenic animal in which apex2 is specifically expressed in mitochondrial matrix and uses thereof
WO2024049154A1 (en) * 2022-08-29 2024-03-07 서울대학교산학협력단 Phenol compound substituted with non-radioactive isotope, and use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
KR101910169B1 (en) 2018-10-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ji et al. Translocation of polyubiquitinated protein substrates by the hexameric Cdc48 ATPase
JP6343604B2 (en) Method for incorporating amino acid containing BCN group into polypeptide using orthogonal codon encoding amino acid containing BCN group and orthogonal PylRS synthase
CN110577564B (en) Polypeptides and methods
KR20060015612A (en) Methods for protein labeling based on acyl carrier protein
WO2012083872A1 (en) Photoaffinity labeling double function probe molecule, preparation method and application thereof
AU2017342062A1 (en) Archaeal pyrrolysyl tRNA synthetases for orthogonal use
KR101910169B1 (en) Methods for identification of proteins using phenolic compounds for protein labeling
EP3733687A1 (en) Means and methods for site-specific functionalization of polypeptides
Ishikawa et al. Chemoproteomics profiling of surfactin-producing nonribosomal peptide synthetases in living bacterial cells
KR20050049513A (en) Protein labelling with o6-alkylguanine-dna alkyltransferase
JP6893510B2 (en) Trifunctional cross-linking reagent
CN102439014A (en) Biomolecular labelling using multifunctional biotin analogues
Camarda et al. Regulated oligomerisation and molecular interactions of the early gametocyte protein Pfg27 in Plasmodium falciparum sexual differentiation
KR101738137B1 (en) Method for providing information of protein location using peroxidase
KR101868917B1 (en) Phenolic compound for labeling to protein and preparation method thereof
WO2011024887A1 (en) Conjugate containing cyclic peptide and method for producing same
WO2013144656A1 (en) Active site probes
US20240166594A1 (en) Photocaged citrulline analogs and methods for site-specific incorporation of citrulline into proteins
Prasad et al. A mechanism-based fluorescence transfer assay for examining ketosynthase selectivity
WO2018104962A1 (en) Hemiaminal-tag for protein labeling and purification
US20230046728A1 (en) Technologies useful for assessing permeability
EP4102227A1 (en) Novel compound to be photo-crosslinked by visible light, and use thereof
CN114940979B (en) Method for improving cation-pi interaction by utilizing genetic code expansion and application
JP5686385B2 (en) Methods for fluorescently labeling proteins
US20240182425A1 (en) Novel compounds photo-crosslinked by visible light and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant