KR20180085251A - Method for manufacturing multicellular spheroid using hydrogel microwell - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 하이드로젤 마이크로웰을 이용한 멀티셀룰라 스페로이드의 제조 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 규격화된 하이드로젤 마이크로웰을 이용함으로써, 서로 다른 종류의 세포를 혼합 배양하여 제조한 균일한 크기의 스페로이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing a multi-cellulosperoid using hydrogel microwell, and more particularly, to a method for producing multi-cellulosperoid using a hydrogel microwell using a standardized hydrogel microwell, And a method for producing the same.
암에 대한 광열 치료는 광에 기반한 것으로, 외과수술법에 비해 비파괴적이고 간단하며 부작용이 적다. 또한, 전신 마취가 불필요하고 환자의 고통도 거의 없으며, 안정과 회복을 위한 기간이 짧을 뿐만 아니라 여러 차례 반복 치료가 가능하다는 이점도 있다.Phototherapy for cancer is based on light and is nondestructive, simple, and less adverse than surgery. In addition, general anesthesia is unnecessary, patient suffering is rare, and the period for stabilization and recovery is short.
한편, 종양 부위에 발열기구를 삽입하여 단순히 가열하는 방식을 갖는 열에 의한 암 치료기술은 이미 오래 전에 시도된 바 있으나, 암세포와 정상세포의 식별이 불가능하여 암세포 주변의 정상세포들도 파괴되는 문제로 인해, 실제 임상에는 널리 적용되지 못하였다. 이에 반해, 광 치료법은 약물 치료법과 방사선 치료법의 단점을 모두 극복한 새로운 암 치료법이라 할 수 있다.On the other hand, the technique of treating cancer with heat by simply heating by inserting a heating device into the tumor site has been attempted a long time ago, but it is impossible to distinguish cancer cells from normal cells, so that normal cells around cancer cells are also destroyed Therefore, it has not been widely applied in clinical practice. In contrast, phototherapy is a new cancer treatment that overcomes both the shortcomings of drug therapy and radiation therapy.
상기의 광열 치료 방법의 적용을 위해서는 암세포를 대상으로 하여 치료 조건의 최적화가 이루어져야 하는데, 기존의 2차원적 세포배양은 주로 한 종류의 동일한 세포를 배양하므로, 서로 다른 종류의 세포 간 상호작용을 고려할 수 없었다. 일부에서 2차원적 공동배양(2D co-culture)을 통해 이러한 문제를 부분적으로 해결하고자 시도되고 있으나, 그럼에도 불구하고 생체 조직에서의 세포 환경과는 많은 차이점이 나타났다.In order to apply the above photothermal treatment method, the treatment conditions should be optimized for cancer cells. In the conventional two-dimensional cell culture, since one kind of the same cells is cultured, I could not. Although some attempts have been made to solve this problem partially through 2D co-culture, there have been many differences from the cellular environment in living tissues.
따라서, 2차원적 세포배양에서 나타나는 문제를 해결하기 위해 세포의 공간적인 구조(spatial organization)를 고려한 3차원적 세포배양 방법에 대한 연구 및 개발은 매우 중요한 의의를 지닌다. 그러므로, 최근에는 생체 내와 동등한 기능을 갖는 3차원 조직인 스페로이드의 배양이 주목을 받고 있다. 그러나 기존의 기술 중 서로 다른 종류의 세포를 퓨전하여 제조한 종양 스페로이드는 공지되어 있지 않다.Therefore, in order to solve the problem of two-dimensional cell culture, research and development of a three-dimensional cell culture method considering the spatial organization of cells have a very important significance. Therefore, recently, the cultivation of spoloid, which is a three-dimensional tissue having functions equivalent to those in vivo, has attracted attention. However, tumor spoloids produced by fusion of different kinds of cells among existing techniques are not known.
스페로이드의 배양 환경을 조성하기 위해 주로 이용하고 있는 방법은 세포를 구멍이 나 있는 생체적합성 지지체(porous biocompatible scaffold)를 이용하여 배양하는 것이다. 생체적합성 지지체의 주된 한 형태인 하이드로젤을 제작하기 위한 재료로서 널리 사용되고 있는 천연고분자는 콜라겐, 젤라틴, 실크 및 피브린 등의 프로테인과 알지네이트, 아가로스 및 키토산 등의 다당류로 나눌 수 있다. 이러한 천연고분자는 천연 물질에서 분리된 소재들이며, 임상용 소재들로 널리 적용되고 있다.The main method used to establish the culture environment of spoloids is to cultivate cells using a porous biocompatible scaffold. Natural polymers that are widely used as materials for preparing hydrogels, which are a main form of biocompatible scaffolds, include proteins such as collagen, gelatin, silk and fibrin, and polysaccharides such as alginate, agarose and chitosan. These natural polymers are separated from natural materials and widely used as clinical materials.
현재까지 이러한 천연고분자의 단독 혹은 복합 소재를 이용하여 다양한 3차원 세포배양용 하이드로젤 지지체를 개발하고자 많은 시도가 이루어지고 있으나, 각 물질이 가지는 특성으로 인해 3차원 세포배양의 효율성이 높지 않다는 문제점이 나타나고 있다. 천연 하이드로젤인 콜라겐(collagen), 폴리사카라이드(polysaccharide), 알지네이트(alginate), 아가로즈(agarose) 등은 자연에서 얻는 물질이기 때문에 안전하고 생체 적합성이 매우 우수하나 기계적 물성이 좋지 않으며 가격이 비싸고 종류도 많지 않기 때문이다.Many attempts have been made to develop various hydrogel supports for three-dimensional cell cultures using single or composite materials of these natural polymers. However, there is a problem in that the efficiency of three-dimensional cell culture is not high due to the properties of each substance . Natural hydrogels such as collagen, polysaccharide, alginate and agarose are safe and biocompatible because they are derived from nature, but their mechanical properties are poor and they are expensive There are not many kinds.
예를 들어 콜라겐의 경우 낮은 수준의 기계적 특성을 가짐에 따라, 콜라겐 단독으로는 겔화가 어렵다는 문제점이 있다. 또한 아가로스는 단독으로 겔화가 가능하여 고체형 세포배양 배지로 사용되고 있으나, 세포배양 효율이 낮은 문제점을 나타내고 있다. 따라서, 이러한 천연고분자 소재의 하이드로젤 지지체의 문제점을 해결함으로써, 세포의 공간적인 구조(spatial organization)를 고려한 효과적인 3차원적 세포배양 방법에 대한 연구 및 개발이 필요한 실정이다.For example, since collagen has a low level of mechanical properties, there is a problem that gelation is difficult with collagen alone. In addition, agarose can be gelated alone and is used as a solid cell culture medium, but shows a problem of low cell culture efficiency. Therefore, it is necessary to study and develop an effective three-dimensional cell culture method considering the spatial organization of cells by solving the problem of the hydrogel support of such a natural polymer material.
본 발명자들은 광열 치료 효과를 분석하기 위한 멀티셀룰라 스페로이드를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 제조된 스페로이드에 치료적으로 유효한 광을 조사함으로써 세포사멸을 유도할 수 있을 뿐만 아니라, 광열 입자에 항암제를 추가로 포함할 경우, 치료 효과를 더욱 극대화함을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다. The present inventors have tried to develop a multicellular steroid for analyzing the effect of photothermal therapy. As a result, it is possible to induce apoptosis by irradiating therapeutically effective light to the produced steroid, and further, when an anticancer agent is further included in the photothermal particles, the treatment effect is further maximized, .
따라서 본 발명의 목적은, 마이크로웰에서 세포를 2종 이상 혼합하여 배양하는 스페로이드 제조 방법을 제공함에 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for producing a speroid in which two or more cells are mixed and cultured in a microwell.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 스페로이드를 규격화된 형태로 제조하기 위하여 목적하는 규격에 해당하는 하이드로젤 마이크로웰의 제조 방법을 제공함에 있다.It is still another object of the present invention to provide a method of manufacturing a hydrogel microwell corresponding to a target standard for producing the spoloid in a standardized form.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 최종적으로 얻고자하는 멀티셀룰라 스페로이드의 부피 및 외형에 상응하는 내부 부피 및 3차원 내부 형상을 갖는 마이크로웰에 적어도 2종 이상의 세포를 혼합 배양(co-culture)하는 단계를 포함하는 멀티셀룰라(multicellular) 스페로이드 제조 방법을 제공한다.According to one aspect of the present invention, there is provided a method of producing a micro-well, which comprises co-culturing at least two or more cells in a microwell having an internal volume and a three-dimensional internal shape corresponding to the volume and shape of the multi- culturing the cells to obtain a multicellular spleod.
본 발명의 마이크로웰에 있어서, 동일한 부피 및/또는 형상을 갖는 복수 개의 마이크로웰이 하나의 기판 상에 함께 포함될 수 있으며, 복수 개의 마이크로웰이 포함된 기판을 이용하여 멀티셀룰라 스페로이드를 제조하는 경우에는 동시에 동일한 부피 및 형상의 멀티셀룰라 스페로이드를 제조함으로써, 이를 이용하여 다양한 암세포 치료 조건 및 약물 스크리닝에 용이하게 이용할 수 있다. In the microwell of the present invention, a plurality of microwells having the same volume and / or shape can be included together on one substrate, and when a multi-cellulosphere is manufactured using a substrate including a plurality of microwells Cellulosperoids having the same volume and shape at the same time can be easily used for various cancer cell treatment conditions and drug screening.
또한, 본 발명의 마이크로웰에 있어서, 상기 멀티셀룰라 스페로이드는 마이크로웰의 3차원 내부 형상과 일치하는 3차원 형상을 갖도록 제조되고, 이에 의해 동일·유사한 부피 및 외형을 갖는 복수개의 멀티셀룰라 스페이드 제조를 가능케 한다.Further, in the microwell of the present invention, the multi-cellulospheroid is manufactured to have a three-dimensional shape conforming to the three-dimensional inner shape of the microwell, whereby a plurality of multi-cellar spades having the same or similar volume and contour .
또한, 본 발명의 마이크로웰에 있어서, 다양한 부피를 갖는 복수 개의 마이크로웰이 하나의 기판 상에 함께 포함될 수 있으며, 다양한 부피를 갖는 마이크로웰이 포함된 기판을 이용하여 멀티셀룰라 스페로이드를 제조하는 경우에는 동시에 다양한 부피의 멀티셀룰라 스페로이드를 제조함으로써, 이를 이용하여 암세포 크기에 따른 약물 활성 또는 최적의 치료 조건 확립 등에 적절하게 이용할 수 있다. In addition, in the microwell of the present invention, a plurality of microwells having various volumes may be included together on one substrate, and in the case of producing a multi-cellulosphere using a substrate including microwells having various volumes Cellulosic steroids of various volumes at the same time. Thus, the present invention can be suitably used for drug activity depending on the size of cancer cells or for establishing optimal treatment conditions.
본 발명의 멀티셀룰라 스페로이드 제조 방법은 상술한 바와 같이, 원하는 부피 및 형상의 멀티셀룰라 스페로이드를 용이하게 제조할 수 있는 효과를 발휘하며, 암세포 치료를 위한 약물 스크리닝 시스템 및/또는 암세포 치료 조건 최적화를 위한 테스트 플랫폼을 제공할 수 있다. As described above, the method for producing multi-cellulosperoids of the present invention has the effect of easily producing multi-cellulospheroids having a desired volume and shape and can be applied to a drug screening system for treating cancer cells and / Can provide a test platform for.
본 발명의 명세서상의 용어 "혼합 배양"은 2종 이상의 세포를 함께 배양하는 것으로서 공배양 또는 공생배양이라고도 칭한다. 세포의 종류에 따라 단독배양에 비해 높은 성장률을 목적으로 혼합배양을 수행하는 경우도 있다.The term "mixed cultivation" in the specification of the present invention refers to culturing two or more kinds of cells together and also referred to as co-culture or co-culture. Depending on the type of cells, mixed cultivation may be carried out for the purpose of achieving a higher growth rate than single culture.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 혼합 배양은, 적어도 1종 이상의 종양 세포; 및 정상 세포로 수행된다. 상기 2종 이상의 세포 혼합 배양은 정상 세포와 종양 세포를 이용하여 수행함으로써 멀티셀룰라 스페로이드를 제조하여 실제 종양을 모방할 수 있고, 종양의 전이를 모사하거나 또는 광열치료 및 약물치료를 포함하는 통상적인 치료방법에 대한 내성을 확인하는 데 이용할 수도 있다. 상기와 같이 실제 종양을 모방함으로써, 광열치료, 화학요법 또는 방사선치료를 포함하는 치료방법을 적용하여 정상 세포의 손상을 최소화하고 종양 세포만을 효과적으로 치료할 수 있는 처리량 및 처리시간 조건을 확립하는 근거자료로 활용할 수 있다. 또한 종양을 모방함으로써 치료 목적으로 적용하기 위한 약물 스크리닝에도 활용할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the mixed culture comprises at least one tumor cell; And normal cells. The mixed culture of two or more kinds of cells can be carried out using normal cells and tumor cells to produce multicellular steroids to mimic actual tumors, and to simulate metastasis of tumors, or to treat normal tumors including phototherapy and drug therapy It can also be used to identify tolerance to treatment methods. As a basis for establishing the throughput and treatment time conditions that can minimize the damage of normal cells and effectively treat only tumor cells by applying a treatment method including photothermal therapy, chemotherapy or radiation treatment by imitating actual tumor as described above Can be utilized. It can also be used for drug screening for therapeutic applications by mimicking tumors.
본 명세서상의 용어 "종양 세포"는 종양을 구성하고 있는 세포를 의미하고, 종양은 양성 종양과 악성 종양으로 구분된다.The term "tumor cell" as used herein refers to a cell that constitutes a tumor, and the tumor is classified into benign and malignant tumors.
본 발명의 일 구현예에서, 종양 세포는 악성 종양을 구성하는 종양 세포이다. 악성 종양은 일반적으로 암(특히 고형암)으로 지칭되고, 대부분 유해하며 접촉시에도 세포분열이 억제되지 않는다. 이는 구조화되지 않고 여러 층을 생성하여 증식하며, 비정상적인 핵을 지니는 것으로 알려져 있다.In one embodiment of the invention, the tumor cell is a tumor cell that constitutes a malignant tumor. Malignant tumors are generally referred to as cancers (especially solid cancers), and are most toxic and do not inhibit cell division when contacted. It is not structured, but it is known to produce and propagate several layers and have abnormal nuclei.
본 발명의 특정 구현예에서, 상기 종양 세포는 난소암(ovarian cancer)세포, 자궁암(uterine cancer)세포, 교아종(glioblastoma)세포, 유방암(breast cancer)세포, 흑색종(melanoma)세포, 폐암(lung cancer)세포, 간암종(hepatocarcinoma)세포, 치은암(ulocarcinoma)세포, 설암(tongue cancer)세포, 췌장암(pancreatic cancer)세포, 전립선암(prostate cancer)세포, 신장암(renal cell carcinoma)세포, 골암(cancer of a bone)세포, 고환암(testis cancer)세포, 중피종(mesothelioma)세포, 위장암(gastric adenocarcinoma)세포, 림프종(lymphoma)세포, 뇌종양(encephaloma)세포, 결장암(colon cancer)세포 및 방광암(bladder cancer)세포이다.In certain embodiments of the invention, the tumor cells are selected from the group consisting of ovarian cancer cells, uterine cancer cells, glioblastoma cells, breast cancer cells, melanoma cells, lung cancer cells, hepatocarcinoma cells, ulcarcinoma cells, tongue cancer cells, pancreatic cancer cells, prostate cancer cells, renal cell carcinoma cells, Cancer cells, cancerous a bone cells, testis cancer cells, mesothelioma cells, gastric adenocarcinoma cells, lymphoma cells, encephaloma cells, colon cancer cells and bladder cancer (bladder cancer) cells.
본 명세서상의 용어 "정상 세포"는 어떤 조직을 구성하거나 또는 어떤 기능을 하는 세포로 분화될 것이 예상되거나, 또는 분화된 세포를 의미하나 이에 한정되지 않는다. 암세포와는 대비적으로, 접촉시 세포분열이 억제되고 구조화된 단일층을 형성하며 정상적인 핵을 지닌다. 본 명세서상에서 정상 세포는 종양 세포에 대비되는 개념으로 제시하기 위한 것으로서, 특정 조직에 존재하거나 또는 특정 기능을 하는 세포로 한정되지 않는다.As used herein, the term "normal cell " refers to a cell that is expected to or does not differentiate into cells that constitute or function in a certain tissue, but are not limited thereto. In contrast to cancer cells, cell division is inhibited during contact, forming a structured monolayer and having normal nuclei. In the present specification, normal cells are intended to be presented as a concept against tumor cells, and are not limited to cells existing in a specific tissue or performing a specific function.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 제조 방법에 의해 제조된 것을 특징으로 하는 멀티셀룰라(multicellular) 스페로이드 제조 방법을 제공한다: (a) 감광액(Photoresist)이 패턴화된 기판 위에 고분자 수지를 열경화시켜 몰드를 제조하는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 몰드 위에 고분자 섬유 및 프리 폴리머를 코팅하여 마이크로웰을 광경화시키는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)의 몰드로부터 광경화된 마이크로웰을 분리하는 단계.According to another aspect of the present invention, there is provided a method of manufacturing a multicellular spalloid, which is produced by a manufacturing method comprising the steps of: (a) Thermally curing the polymer resin on the substrate to produce a mold; (b) photocuring the microwell by coating the polymeric fiber and the prepolymer on the mold of step (a); And (c) separating the photocured microwell from the mold of step (b).
본 발명의 방법을 단계별로 이하 자세히 설명한다:The method of the present invention is described step by step as follows:
단계 (a): 감광액(Photoresist)이 패턴화된 기판 위에 고분자 수지를 열경화시켜 몰드를 제조하는 단계Step (a): a step of thermally curing the polymer resin on the substrate on which the photoresist is patterned to prepare a mold
본 발명의 단계 (a)에 있어서, 감광액이 패턴화된 기판은 일반적으로 실리콘 웨이퍼에 포토리소그라피 공정을 이용하여 형성된 패턴을 포함하는 기판을 의미한다. 그 위에 액상의 고분자 수지를 채우고 열경화시킴으로써 기판상에 마이크로웰의 챔버(chamber) 부분이 양각으로 전사된 몰드를 제조할 수 있다.In step (a) of the present invention, the substrate on which the photosensitive liquid is patterned generally means a substrate including a pattern formed by using a photolithography process on a silicon wafer. A liquid polymer resin is filled thereon and thermosetting is carried out so that a mold in which a chamber part of the microwell is transferred on the substrate in a positive direction can be manufactured.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 고분자 수지는 PDMS(polydimethylsiloxane), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리이미드(polyimides), PMMA(polymethylmeta acrylate) 및 PC(polycarbonate) 중에서 선택될 수 있다.In one embodiment of the present invention, the polymer resin may be selected from PDMS (polydimethylsiloxane), polyurethane, polyimides, polymethylmetacrylate (PMMA), and polycarbonate (PC).
본 발명의 일 구현예에서, 상기 마이크로웰은 50 내지 500 ㎛의 직경을 가질 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, 상기 마이크로웰은 75 내지 300 ㎛의 직경을 가질 수 있다.In one embodiment of the invention, the microwell may have a diameter of 50 to 500 microns. In certain embodiments of the invention, the microwell may have a diameter of from 75 to 300 microns.
단계 (b): 상기 단계 (a)의 몰드 위에 고분자 섬유 및 프리 폴리머를 코팅하여 마이크로웰을 광경화시키는 단계Step (b): The step of photocuring the microwell by coating the polymer fiber and the prepolymer on the mold of the step (a)
본 발명의 단계 (b)에 있어서, 단계 (a)에서 제조된 몰드 위에 고분자 섬유를 올리고, TMSPMA(3-(Trimetoxysily) propylmethacrylate)로 코팅한 뒤, 광경화시킴으로써 챔버 부분이 음각으로 형성된 마이크로웰을 제조할 수 있다. 광경화는 합성 유기 재료가 자외선(Ultraviolet, UV), 전자선(Electron Beam, EB) 등 빛에너지를 받아 가교 또는 경화하는 현상을 의미한다.In step (b) of the present invention, polymer fibers are placed on the mold prepared in step (a), coated with TMSPMA (3- (trimethoxysilyl) propylmethacrylate), and then photocured to form microwells Can be manufactured. Photocuring refers to a phenomenon in which a synthetic organic material receives light energy such as ultraviolet (UV), electron beam (EB), or the like to crosslink or cure.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 고분자 섬유는 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리[(락틱-co-(글리콜산)](PLGA), 폴리[(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)](PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄)(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐 알코올)](PVOH), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS), 폴리아닐린(PAN), 키토산, 엘라스틴, 히알루론산, 알지네이트, 젤라틴, 콜라겐 및 셀룰로오스 중에서 선택될 수 있다.In one embodiment of the present invention, the polymer fiber is selected from the group consisting of polyethylene glycol (PEG), polyethylene oxide (PEO), polycaprolactone (PCL), polylactic acid (PLA), polyglycolic acid (PGA) (PLGA), poly [(3-hydroxybutyrate) -co- (3-hydroxyvalerate)] (PHBV), polydioxanone (PDO), poly [(L-lactide) (polyvinyl alcohol)] (PVOH (polyvinyl alcohol)), poly [ester (polyvinyl alcohol)], poly ), Polyacrylic acid (PAA), polyvinyl alcohol (PVA), polyvinylpyrrolidone (PVP), polystyrene (PS), polyaniline (PAN), chitosan, elastin, hyaluronic acid, alginate, gelatin, collagen and cellulose .
본 발명의 일 구현예에서, 상기 프리 폴리머는 TMSPMA(3-(Trimetoxysily) propylmethacrylate), HEA(Hydroxyethyl acrylate), GMA(Glycidyl methacrylate), EGDMA(diethyleneglycol dimethacrylate), THFA(Tetrahydrofurfuryl acrylate), HMAA(Hydroxymethul acrylamide), PEA(Phenyl epoxyacrylate), HOFHA(6-Hydroxy-2, 2,3,3,4,4,5,5-octafluoro), EOPT(Polyethoxylated(4)pentaerythritoltetraacrylate), HPA(Hydroxypropyl acrylate), BMA(Buthylmethacrlate), PETIA(Pentaerythritol triacrylate), HDDA(Hexan diol diacrylate), EGPEA(Ethyleneglycol phenyletheracrylate), BM(Benzylmethacrylate), HPPA(Hydroxyphenoxypropyl acrylate), BHPEA(2-(4-Benzoyl-3-hydroxyphenoxy)ethylacrylate), HEMA, HPMA, DGDMA 중에서 선택될 수 있다.In one embodiment of the invention, the prepolymer is selected from the group consisting of TMSPMA (3- (trimethoxysilyl) propylmethacrylate), HEA (Hydroxyethyl acrylate), GMA (Glycidyl methacrylate), EGDMA (diethyleneglycol dimethacrylate), THFA (Tetrahydrofurfuryl acrylate), HMAA ), Phenyl epoxyacrylate, HOFHA (6-Hydroxy-2, 2,3,3,4,4,5,5-octafluoro), EOPT (Polyethoxylated (4) pentaerythritoltetraacrylate), HPA (Hydroxypropyl acrylate) (4-Benzoyl-3-hydroxyphenoxy) ethylacrylate), HEMA (butyl acrylate), HEMA (butyl acrylate) , HPMA, and DGDMA.
단계 (c): 상기 단계 (b)의 몰드로부터 광경화된 마이크로웰을 분리하는 단계Step (c): separating the photocured microwell from the mold of step (b)
본 발명의 단계 (c)에 있어서, 광경화된 마이크로웰을 분리함으로써 특정 직경의 챔버를 구비하는 마이크로웰을 준비할 수 있다. 상기 마이크로웰은, 특정한 규격에 해당하는 스페로이드를 제조함에 있어 유용하게 사용할 수 있다.In step (c) of the present invention, a microwell with a chamber of specific diameter can be prepared by isolating the photocured microwells. The microwell can be usefully used in the production of spoiloids corresponding to specific standards.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명에서 제시하는 방법에 따라 제조된 스페로이드는 다음과 같은 방법에 따라 광열 치료 효과를 분석하기 위해 유용하게 사용될 수 있다: a) 적어도 2종 이상의 종양세포를 혼합 배양하여 스페로이드를 제조하는 단계; b) 상기 단계 a)의 스페로이드에 광열 입자를 흡수시키는 단계; c) 상기 단계 b)의 스페로이드에 600 내지 1100 nm 파장 영역의 광을 조사하는 단계; 및 d) 상기 단계 c)의 스페로이드의 사멸 또는 괴사 여부를 확인하는 단계.According to another aspect of the present invention, the spoloids prepared according to the method of the present invention can be usefully used for analyzing the effect of photothermal therapy according to the following method: a) Mixing culture to prepare spearoid; b) absorbing the photothermal particles in the spheroids of step a); c) irradiating the spheroids of step b) with light in the wavelength range of 600 to 1100 nm; And d) determining whether the speroid of step c) is killed or necrotic.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 광열 입자는 실리카-금 나노입자(silica-gold nanoparticles), 금-황화 금 나노입자(Gold/gold sulfide nanoparticles), 전도성 고분자(PCPDTBT)와 인지질(DOPC, DOPE)이 결합된 나노입자, 및 단백질-금 복합 나노입자(Proteinticle/Gold Core/Shell nanoparticles)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.In one embodiment of the present invention, the photothermal particles include silica-gold nanoparticles, gold / gold sulfide nanoparticles, conductive polymers (PCPDTBT) and phospholipids (DOPC, DOPE) And protein-gold complex nanoparticles (Proteinticle / Gold Core / Shell nanoparticles).
본 발명의 일 구현예에서, 상기 광열 입자는 항암 또는 항종양 활성을 나타내는 약제학적 활성 성분을 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 약제학적 활성 성분은 독소루비신(doxorubicin), 에토포시드(etoposide), 미톡산트론(mitoxantrone), 다우노루비신(daunorubicin), 이다루비신(idarubicin), 테니포시드(teniposide), 암사크린(amsacrine), 에피루비신(epirubicin), 메르바론(merbarone) 및 피로잔트론하이드로클로라이드(piroxantrone hydrochloride) 중에서 선택될 수 있다.In one embodiment of the present invention, the photothermal particles may further comprise a pharmaceutically active ingredient exhibiting anti-cancer or anti-tumor activity. The pharmaceutically active ingredient may be selected from the group consisting of doxorubicin, etoposide, mitoxantrone, daunorubicin, idarubicin, teniposide, amsacrine, ), Epirubicin, merbarone, and piroxantrone hydrochloride.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 단계 c)는 700 내지 900 nm 파장 영역의 광을 100 mW 이상 1 W 이하의 전력으로 3분 이상 30분 이하로 조사하는 단계이다.In one embodiment of the present invention, the step c) is a step of irradiating light in a wavelength region of 700 to 900 nm at a power of 100 mW or more and 1 W or less for 3 minutes to 30 minutes or less.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:
본 발명은 마이크로웰에서 세포를 2종 이상 혼합하여 배양하는 스페로이드 제조 방법을 제공한다.The present invention provides a method for producing a speroid in which two or more cells are mixed and cultured in a microwell.
본 발명의 조성물을 이용하면 2종 이상의 종양 세포가 퓨전된 일정한 규격의 3차원 스페로이드가 생성되므로, 이를 효과적인 치료 모델로 활용함으로써 광열 치료의 효과 분석, 치료 조건의 최적화 및 다양한 약물 스크리닝이나 신약 개발에 이용할 수 있다.The use of the composition of the present invention allows the generation of three-dimensional spheroids of a uniform size, in which two or more tumor cells are fused. Therefore, by using this as an effective therapeutic model, it is possible to analyze the effects of photothermal therapy, optimize therapeutic conditions, .
또한 본 발명에서의 하이드로젤 마이크로웰은 간단한 공정으로 생산이 가능하므로 이를 이용하여 쉽고 빠르게 다양한 크기로 퓨전 종양 스페로이드를 형성할 수 있다.In addition, the hydrogel microwell in the present invention can be produced by a simple process, so that fusion tumor spoloids can be formed easily and quickly in various sizes.
도 1은 멀티셀룰라 스페로이드 형성을 위한 하이드로젤 마이크로웰 어레이 제작 공정을 나타낸다.
도 2는 나노 입자의 모양을 분석한 결과이다. (A) 실리카와 골드가 결합되어있는 고분자를 이용하여 할로우 메조포러스 실리카를 합성한 모식도; 및 (B) 주사전자현미경을 이용하여 나노 입자의 모양을 분석한 결과.
도 3은 나노 입자의 특성을 분석한 결과이다. (A) 원소 분석기를 통한 나노 입자의 구성 원소 분석; (B) 시간 경과에 따른 약물 방출 그래프; 및 (C) 나노 입자의 농도를 달리한 시간 경과에 따른 광열 효과에 의한 온도 그래프.
도 4는 자궁관련 암세포 멀티셀룰라 스페로이드의 광열치료 결과를 나타낸다. (A) 자궁암세포, 난소암세포 및 멀티셀룰라 스페로이드의 직경 150 μm 마이크로웰 상의 세포 사진; (B) 리플레이트된 광열 치료 전의 세포 사진; 및 (C) 광열 치료 후의 세포 사진.
도 5는 서로 다른 종류의 암세포 멀티셀룰라 스페로이드 광열치료 결과를 나타낸다. (A) 교아종세포, 유방암세포 및 멀티셀룰라 스페로이드의 직경 150 μm 마이크로웰 상의 세포 사진; B) 리플레이트된 광열 치료 전의 세포 사진; 및 (C) 광열 치료 후의 세포 사진.Figure 1 shows a process for making a hydrogel microwell array for forming multi-cellulospheroids.
Figure 2 shows the result of analyzing the shape of the nanoparticles. (A) a schematic diagram of synthesizing hollow mesoporous silica using a polymer having silica and gold bonded thereto; And (B) analysis of the shape of nanoparticles using a scanning electron microscope.
FIG. 3 shows the results of analyzing the characteristics of the nanoparticles. (A) Analysis of constituent elements of nanoparticles using elemental analyzer; (B) a drug release graph over time; And (C) temperature graphs based on photothermal effects over time with different concentrations of nanoparticles.
Fig. 4 shows phototherapy results of uterine-related cancer cell multi-cellulosperoid. (A) cell photographs on cervix cancer cells, ovarian cancer cells and multicellular spheroids, diameters of 150 μm microwells; (B) cell photographs before reflated photothermal therapy; And (C) photographs of cells after photothermal treatment.
Figure 5 shows the results of different types of cancer cell multi-cellulosic light treatment. (A) cell photographs on a 150 micrometer diameter microwell of syngeneic, breast, and multicellular spheroids; B) Cell photographs before reflazed photothermal therapy; And (C) photographs of cells after photothermal treatment.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these examples are for illustrative purposes only and that the scope of the present invention is not construed as being limited by these examples.
실시예 1. 마이크로웰의 제조Example 1. Preparation of microwells
스페로이드의 크기를 지름 75, 150 및 300 μm로 설정하기 위해서 반도체 제조 공정인 포토리소그래피(photolithography) 기술을 이용하였다. 감광제(Photoresist)가 패턴된 실리콘 웨이퍼를 제조한 후, PDMS(polydimethylsiloxane)로 마이크로 몰드를 제조하였다. 제조된 PDMS 마이크로 몰드 위에 PEG(polyethylene glycol)를 올리고, 한 시간 동안 TMSPMA(3-(trimethoxysilyl)-propyl methacrylate)로 코팅한 후, 3-DW로 세척한 유리 기판을 그 위에 올리고 UV 광을 조사하여 경화시킴으로써 PEG 하이드로젤 마이크로웰을 제작하였다.Photolithography, a semiconductor manufacturing process, was used to set the size of the spoloids to 75, 150 and 300 μm in diameter. A silicon wafer with patterned photoresist was prepared, and then a micro mold was prepared with PDMS (polydimethylsiloxane). PEG (polyethylene glycol) was placed on the prepared PDMS micro mold and coated with TMSPMA (3- (trimethoxysilyl) -propyl methacrylate) for one hour. Then, the glass substrate washed with 3-DW was placed thereon, To form a PEG hydrogel microwell.
실시예 2. 마이크로웰을 이용한 스페로이드의 형성Example 2. Formation of sphere using microwells
상기 실시예 1에서 제조한 지름 75, 150 및 300 μm의 하이드로젤 마이크로웰에서 자궁암세포(HeLa)와 난소암세포(Ovarian), 교아종세포(U87MG)와 유방암세포(MCF)를 각각 3일 동안 배양하였다. 이에 따라 자궁암세포와 난소암세포, 교아종세포와 유방암세포의 멀티셀룰라 스페로이드를 각각 제작하였다.(HeLa), ovarian cancer cells (Ovarian), hybrids (U87MG) and breast cancer cells (MCF) were cultured for 3 days in the 75, 150 and 300 μm diameter hydrogel microwells prepared in Example 1, Respectively. Thus, uterine cancer cells, ovarian cancer cells, hybrids and multicellular spheroids of breast cancer cells were prepared, respectively.
퓨전을 위하여 한 웰당 각 세포들을 1×106씩 투입하였다. 자궁암세포(HeLa)의 경우에는 FBS 10%, PS 1%가 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)을 배양액으로 사용하였으며, 난소암세포(Ovarian)는 FBS(Fetal bovine serum) 10%, PS(Peak serum) 1%가 포함된 F-12(Ham's F-12 Nutrient Mixture)를 사용하였고, 멀티셀룰라 스페로이드에는 이들을 1:1로 섞어서 자궁암세포(HeLa)와 난소암세포(Ovarian)를 배양하였다.For fusion, 1 × 10 6 cells were added per well per well. In the case of uterine cancer cells (HeLa), DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) containing 10% FBS and 1% PS was used as a culture medium. Ovarian cancer cells (Ovarian) were treated with 10% FBS (Fetal bovine serum) ) And 1% (1: 1) of the mixture were used to culture uterine cancer cells (HeLa) and ovarian cancer cells (Ovarian) in a multicellular steroid.
또한 FBS 10%, PS 1%가 포함된 DMEM/F-12(Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)에 교아종세포(U87MG)와 유방암세포(MCF)를 배양하였다. 하이드로젤 마이크로웰에서 자궁암세포(HeLa)와 난소암세포(Ovarian), 교아종세포(U87MG)와 유방암세포(MCF)를 온도 37℃와 CO2 5%로 유지되는 인큐베이터(incubator) 안에서 각각 3일 동안 배양하였다.(U87MG) and breast cancer cells (MCF) were cultured in DMEM / F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12) containing 10% FBS and 1% (HeLa), ovarian cancer cells (Ovarian), hybrids (U87MG), and breast cancer cells (MCF) were incubated in an incubator maintained at 37 ° C and 5% CO 2 for 3 days Lt; / RTI >
실시예 3. 광열 치료 효과의 확인 및 조건 최적화Example 3. Identification of photothermal therapy effect and optimization of conditions
상기 실시예 2에 따라 마이크로웰에서 배양된 지름 75, 150 및 300 μm의 퓨전 종양 스페로이드를 4웰 플레이트에 각각 배치하여 하루 동안 배양한 뒤 실리카-금-독소루비신 나노입자를 통하여 광열 치료를 실시하였다.Fusion tumor spleods of 75, 150 and 300 μm in diameter cultured in microwells according to Example 2 were placed in 4-well plates, cultured for one day, and subjected to photothermal treatment through silica-gold-doxorubicin nanoparticles .
실리카-금-독소루비신 나노입자의 제조 방법은 다음과 같다. 유리 바이알에 증류수 2 ㎖, 암모니아 용액(ammonium hydroxide solution, NH4OH) 0.2 ㎖, 테트라에틸 올쏘실리케이트(Tetraethyl orthosilicate, TEOS) 0.8 ㎖ 및 에탄올 8 ㎖을 우유빛 색깔이 될 때까지 반응시킨 후, 원심분리를 통해 분리하여 실리카를 얻을 수 있었다.The preparation method of silica-gold-doxorubicin nanoparticles is as follows. 2 ml of distilled water, 0.2 ml of ammonia solution (NH 4 OH), 0.8 ml of tetraethyl orthosilicate (TEOS) and 8 ml of ethanol were reacted to a milky color, The silica was separated by separation.
이후 실리카, 폴리에틸렌이민(Polyethyleneimine, PEI) 과 금의 혼합용액(1:5)을 섞고 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 그 다음, 0.3몰의 수산화나트륨(NaOH) 용액을 떨어뜨리고 3 내지 24시간 동안 반응시켰다. 마지막으로 에탄올로 워싱하여 원심분리를 통해 할로우 메조포러스 실리카 나노입자를 얻었다.Then, silica, polyethyleneimine (PEI) and gold mixed solution (1: 5) were mixed and reacted at room temperature for 30 minutes. Then, 0.3 mol of sodium hydroxide (NaOH) solution was dropped and allowed to react for 3 to 24 hours. Finally, the hollow mesoporous silica nanoparticles were obtained by centrifugation by washing with ethanol.
독소루비신 용액에 이 입자를 첨가하여 반응한 후 증류수로 워싱하고 원심분리를 통해 완성된 입자를 상온에 건조하여 얻었다. NH4OH, NaOH, TEOS, PEI 및 에탄올은 Sigma Aldrich Korea에서 구입하였다.The particles were added to the doxorubicin solution, reacted, washed with distilled water, and centrifuged to obtain the dried particles at room temperature. NH 4 OH, NaOH, TEOS, PEI and ethanol were purchased from Sigma Aldrich Korea.
또한 대조군으로서 난소암세포, 자궁암세포, 교아종세포 및 유방암세포를 각각 3일 동안 배양하여 NIR(near infrared) 파장 808 nm, 전류 3 A, 전력 4.265 W 조건으로 광열 치료하고 멀티셀룰라 스페로이드에서도 마찬가지 조건에서 치료되는 것을 확인하였다. 이에 따라 서로 다른 종류의 퓨전 종양 스페로이드에 대한 치료 조건을 각각 최적화할 수 있음을 확인하였다.As a control, ovarian cancer cells, uterine cancer cells, squamous cell carcinoma cells and breast cancer cells were cultured for 3 days, respectively, and photothermal treatment was carried out at a wavelength of 808 nm, current 3 A, power 4.265 W at NIR (near infrared) . Thus, it was confirmed that the treatment conditions for different types of fusion tumor spoloids can be optimized, respectively.
본 발명에서는 실리카-금-독소루비신 나노입자를 세포 미디엄과 섞어 세포 내로 흡수(uptake)시키고, 광열 치료를 위한 농도를 최적화하였다. 광열 치료를 위한 온도를 각 실리카-금-독소루비신 나노입자 농도(0, 0.25, 0.50 및 0.75 mg / 50 μl) 및 시간 변화에 따른 온도 그래프로 나타내어 확인하였다. 결과적으로 500 μl의 세포 미디엄에 0.50 mg / 50 μl 농도로 실리카-금-독소루비신 나노입자를 포함하는 조건에서 광열 치료 조건을 최적화하였다.In the present invention, the silica-gold-doxorubicin nanoparticles were mixed with a cell medium to uptake them into cells, and the concentration for the photothermal treatment was optimized. The temperature for photothermal therapy was determined by plotting the concentration of each silica-gold-doxorubicin nanoparticle (0, 0.25, 0.50 and 0.75 mg / 50 μl) and the temperature over time. As a result, photothermal therapy conditions were optimized in the presence of silica-gold-doxorubicin nanoparticles at a concentration of 0.50 mg / 50 μl in a cell medium of 500 μl.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다. Having described specific portions of the present invention in detail, those skilled in the art will appreciate that these specific embodiments are merely preferred embodiments and that the scope of the present invention is not limited thereby. something to do. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
Claims (4)
Co-culturing at least two or more cells in a microwell having an internal volume and a three-dimensional internal shape corresponding to the volume and shape of the multi-cellulosperoid to be finally obtained, ).
2. The method according to claim 1, wherein the mixed culture comprises at least one tumor cell; ≪ / RTI > and a normal cell.
3. The method of claim 2, wherein the tumor cells are selected from the group consisting of ovarian cancer cells, uterine cancer cells, glioblastoma cells, breast cancer cells, melanoma cells, lung cancer cells, ) Cells, hepatocarcinoma cells, ulcarcinoma cells, tongue cancer cells, pancreatic cancer cells, prostate cancer cells, renal cell carcinoma cells, cancer cells, cancer of a bone cell, testis cancer cell, mesothelioma cell, gastric adenocarcinoma cell, lymphoma cell, encephaloma cell, colon cancer cell and bladder cancer cancer cells. < RTI ID = 0.0 > 21. < / RTI >
(a) 감광액(Photoresist)이 패턴화된 기판 위에 고분자 수지를 열경화시켜 몰드를 제조하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)의 몰드 위에 고분자 섬유 및 프리 폴리머를 코팅하여 마이크로웰을 광경화시키는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)의 몰드로부터 광경화된 마이크로웰을 분리하는 단계.
2. The method of claim 1, wherein the microwell is produced by a manufacturing method comprising the steps of:
(a) thermally curing a polymer resin on a patterned photoresist to produce a mold;
(b) photocuring the microwell by coating the polymeric fiber and the prepolymer on the mold of step (a); And
(c) separating the photo-cured microwell from the mold of step (b).
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