KR20180079233A - Method for preparation of catechol derivatives by using tyrosinase derived from burkholderia thailandensis and application thereof - Google Patents

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Abstract

An object of the present invention is to develop a technique capable of producing a catechol type structural substance with high productivity and yield. The present invention relates to a method for manufacturing catechol type structural substance from a monophenol type structural substance using tyrosinase. More particularly, the present invention relates to a manufacturing method characterized in that the tyrosinase is tyrosinase derived from Burkholderia thailandensis, and the manufacturing is carried out under acidic conditions of pH 1.5 to 6.5.

Description

버크홀데리아 타일란덴시스 유래 티로시나아제를 이용한 카테콜형 구조 물질의 제조 방법 및 그의 응용{METHOD FOR PREPARATION OF CATECHOL DERIVATIVES BY USING TYROSINASE DERIVED FROM BURKHOLDERIA THAILANDENSIS AND APPLICATION THEREOF}TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for producing a catechol-type structural substance using Burkholderia tylandense-derived tyrosinase,

본 발명은 버크홀데리아 타일란덴시스 유래 티로시나아제를 이용한 카테콜형 구조 물질의 제조 방법 및 그의 응용에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing a catechol-type structural material using Burkholderia tylandense-derived tyrosinase and its application.

티로시나아제는 모노페놀형 구조 물질(예, L-tyrosine)을 카테콜형 구조 물질로 수산화하는 일차 수산화 반응(monophenolase activity)과, 모노페놀형 구조 물질에서 생변환된 카테콜형 구조 물질을 멜라닌 색소 전구체인 퀴논형 물질(quinonic compounds)로 산화시키는 이차 산화 반응(dipehnolase activity)을 연속하여 진행한다. 보통 유산소 조건하, 모노페놀형의 pKa 이상의 염기성 pH 조건에서는 카테콜형 구조 물질이 쉽게 자연 산화되어 퀴논형 물질을 형성하게 된다. 상기 퀴논형 물질은 라디칼을 형성하여 빠르게 멜라닌을 형성하고, 생성된 멜라닌 색소는 안정적인 구조체로 자외선 영역의 빛을 차단하는 기능을 가진다. 티로시나아제는 두 개의 구리 이온을 활성부위 주변 여섯 개의 히스티딘(histidine) 아미노산으로 붙잡고 있으며, 그 두 개의 구리 이온 간의 거리는 구리를 포함하는 카테콜 옥시다제(catechol oxidase)와 다른 티로시나아제 군 안에서 일정하게 보존되어 있다. 티로시나제는 산소의 유무에 따라, 또한 두 개의 구리 사이에 결합한 산소 원자 개수에 따라, 디옥시 형태(deoxy-tyrosinase), 옥시 형태(oxy-tyrosinase) 및 메트 형태(met-tyrosinase)의 세 가지의 형태로 구분된다. Tyrosinase has been reported to have a monophenolase activity in which a monophenol-type structural substance (e.g., L-tyrosine) is hydrolyzed with a catechol-type structural substance, and a melamine dye precursor And a second oxidation reaction (diphenolase activity) which oxidizes to quinonic compounds. Under anaerobic conditions, the catechol-type structural material is easily oxidized naturally to form a quinone-type material under basic pH of monophenol type pKa or higher. The quinone-type material rapidly forms melanin by forming radicals, and the resulting melanin dye has a function of blocking light in the ultraviolet region with a stable structure. Tyrosinase captures two copper ions as six histidine amino acids around the active site, and the distance between the two copper ions is controlled by the catechol oxidase containing copper and the constant . Tyrosinase has three forms of deoxy-tyrosinase, oxy-tyrosinase and met-tyrosinase depending on the presence or absence of oxygen and depending on the number of oxygen atoms bonded between the two copper atoms Respectively.

디옥시 형태(deoxy-tyrosinase)는 두 구리 이온 사이 산소를 포함하지 않은 형태이며, 산소가 공급되지 않으면, 수산화 반응 및 산화 반응을 할 수 없는 비활성체이다. Deoxy-tyrosinase is an inactive form that does not contain oxygen between two copper ions and can not undergo hydroxylation or oxidation unless oxygen is supplied.

공기 중 산소가 용매에 해리되거나 과산화수소가 공급되면 디옥시 형태의 두 개의 구리 이온 사이에 산소 분자(O2) 하나를 잡게 되고, 그 형태를 옥시 형태(oxy-tyrosinase)라 한다. 이 옥시 형태에 모노페놀의 산소원자가 구리 이온 한 개에 결합하면, 티로시나아제의 일차 수산화 반응이 시작된다. When oxygen in the air dissociates to solvent or hydrogen peroxide is supplied, one oxygen molecule (O 2 ) is caught between two copper ions of the deoxy form, and the form is called oxy-tyrosinase. When the oxygen atom of the monophenol binds to one copper ion in this oxy form, the primary hydroxylation reaction of tyrosinase begins.

상기 일차 수산화 반응으로, 산소 분자 결합이 깨지며 하나의 산소 원자가 오르토 위치 탄소와 결합을 하며 수산화기가 삽입되고, 티로시나아제 두 구리 사이에는 하나의 산소 원자만이 남아있게 된다. 이 형태를 메트 형태라 한다. 이 때 카테콜형 구조 물질과 메트-티로시나아제는 분리되고, 두 구리 사이의 산소 원자 하나는 이루고 있는 각도를 재배열하며, 이차 산화 반응을 준비한다. 위에서 언급한 것처럼 메트 형태는 카테콜형 구조 물질을 산화 시킬 수 있지만, 모노페놀형의 수산화 반응에는 참여하지 않는다. 그러므로, 옥시-티로시나아제의 모노페놀형 구조 물질의 산화 반응 후, 생성된 카테콜형 구조 물질이 메트-티로시나아제에 의해 산화되지 못할 경우, 메트-티로시나아제는 디옥시-티로시나아제로 변환되지 못해 축적되게 되며 티로시나아제는 비활성화된다. In the primary hydroxylation reaction, the oxygen molecule bonds are broken, one oxygen atom bonds with the ortho position carbon, the hydroxyl group is inserted, and only one oxygen atom remains between the two tyrosinase residues. This form is called a mat shape. At this time, the catechol-type structural material and met-tyrosinase are separated, and the oxygen atoms between the two copper atoms are rearranged to prepare a secondary oxidation reaction. As mentioned above, the met form can oxidize the catechol type structure material, but does not participate in the monophenol type hydroxylation reaction. Therefore, when the resulting catechol-type structural material can not be oxidized by the met-tyrosinase after the oxidation reaction of the monophenol-type structural material of oxy-tyrosinase, the met-tyrosinase is oxidized by deoxy- tyrosinase It is not converted and is accumulated, and tyrosinase is inactivated.

대개 일차 수산화 반응의 반응 속도 (Vmax_mono) 보다 이차 산화 반응의 속도 (Vmax_di) 가 10 배 가량 크기 때문에 중간 생성물인 카테콜형 구조 물질을 축적하기에 어려움이 있다. 그러므로, 이 연속적 산화반응의 중간 물질(첫번째 산화반응의 생성물)인 카테콜형 구조 물질 생산을 위해 티로시나아제의 첫번째와 두번째 산화반응속도 비율을 조절하기 위한 효소공학적 연구가 많이 진행되고 있다(비특허문헌 1). It is difficult to accumulate the intermediate product catechol type structure material because the rate (V max_di ) of the secondary oxidation reaction is generally about 10 times larger than the reaction rate (V max_mono ) of the primary hydroxylation reaction. Therefore, many enzymatic engineering studies have been conducted to control the ratio of the first and second oxidation reaction rates of tyrosinase for the production of the catechol type structural material, the intermediate of this continuous oxidation reaction (the product of the first oxidation reaction) Document 1).

모노페놀형 구조 물질의 일차 수산화 반응 생성물인 카테콜형 구조 물질들은 항산화, 항암, 항염증 또는 항바이러스 효과 등에 있어서 좋은 생리활성을 나타낸다고 보고되어 있으며, 그 효과가 모노페놀형 구조 물질보다 높은 것으로 보고되어 있다. 예컨대, 카테콜형 구조 물질의 일종인 3-하이드록시 플로레틴(3-hydroxy phloretin)의 경우, 플로레틴 보다 항산화 효능이 더 우수하고 콜레스테롤 축적을 저해하는 성질이 있어 동맥경화, 파킨슨병 등을 유발할 수 있는 지질 과산화를 저해하는 것으로 잘 알려져 있다(비특허문헌 2). 또한, 폴리페놀 파이토케미컬(polyphenolic phytochemical) 중에서도 다이드제인 및 제니스테인은 콩에 존재하는 아이소플라본으로, 특이적 위치에 수산화가 된 3'-오르토하이드록시 다이드제인 및 3'-오르토하이드록시 제니스테인은 콩 발효식품에 존재한다고 알려져 있으며, 항산화 기능 및 항암 기능을 가지고 있는 것으로 알려져 있다(비특허문헌 6, 7). 당화 물질인 제니스틴 및 다이드진 또한 위치 특이적 수산화에 의하여 항산화성 기능이 향상되는 것으로 알려져 있다(비특허문헌 8). 그 밖에도, 다양한 식물에서 함유하고 있는 퀘르세틴(quercetin), 올리브 오일에 함유된 하이드록시티로졸(hydroxytyrosol), 포도에 함유된 아스트린진(astringin) 등 카테콜형 물질은 모노페놀형 물질에 비해 더 강한 항산화 능력을 가지고 있다. 따라서 카테콜형 구조 물질들은 식품 첨가제나 치료제의 원료로 각광받고 있으며 생물학적 기술을 이용한 생산 방법에 대한 연구가 지속적으로 진행되어 왔다(비특허문헌 3, 4). The catechol-type structural materials, which are the primary hydroxylation products of monophenol-type structural materials, have been reported to exhibit good physiological activities in antioxidant, anti-cancer, anti-inflammatory or antiviral effects and its effect is reported to be higher than that of monophenol type structural materials have. For example, 3-hydroxy phloretin, a type of catechol-type structural substance, is more effective than phloretin in antioxidative activity and inhibits cholesterol accumulation, resulting in arteriosclerosis and Parkinson's disease Is known to inhibit lipid peroxidation (Non-Patent Document 2). Among polyphenolic phytochemicals, daidzein and genistein are isoflavones present in soybean, and 3'-orthohydroxydidzein and 3'-orthohydroxygenesteen, which are hydroxylated at specific positions, It is known to be present in soybean fermented foods and is known to have antioxidant and anticancer functions (Non-Patent Documents 6 and 7). Geneticin and daidzin, which are glycogen materials, are also known to enhance antioxidative function by site-specific hydrolysis (Non-Patent Document 8). In addition, catechol-type substances such as quercetin in various plants, hydroxytyrosol in olive oil, astringin in grapes, etc., It has strong antioxidant ability. Therefore, catechol-type structural materials are attracting attention as raw materials for food additives and therapeutic agents, and researches on production methods using biological techniques have been continuously carried out (Non-Patent Documents 3 and 4).

카테콜형 구조 물질의 생합성에 있어서의 문제점은 앞서 언급한 것처럼 대부분의 카테콜형 구조 물질은 불안정하여, 중성 이상의 pH 에서 쉽게 산화되어 라디칼 형성 물질인 퀴논형 물질로 변성된다는 것이다(비특허문헌 5). 또한 기존 보고된 티로시나아제의 경우 pH 6 내지 pH 9 에서 활성이기 때문에 이들 티로시나아제를 이용하여 카테콜형 구조 물질을 생성하는 경우 효소에 의한 두번째 산화 반응과 관계 없이 용존 산소에 의해서도 쉽게 산화되어 버리는 문제점이 있다. 또한, 대부분의 식물은 다양한 종류의 폴리페놀을 다량으로 함유하고 있으므로, 폴리페놀 물질을 쉽게 구할 수 있으나, 폴리페놀 물질의 모노페놀 구조에 위치 특이적인 오르토 수산화 반응은 화학적 합성이 어렵다는 문제점이 있다. 따라서, 유용한 카테콜형 구조 물질을 효율적으로 생산할 수 있는 기술이 요망된다.The problem with the biosynthesis of the catechol-type structural material is that as described above, most of the catechol-type structural materials are unstable and easily oxidized at a pH of neutral or higher to be converted into a quinone-type substance as a radical-forming substance (Non-Patent Document 5). In addition, since the previously reported tyrosinase is active at pH 6 to pH 9, when the tyrosinase is used to produce a catechol-type structural substance, it is easily oxidized by dissolved oxygen regardless of the second oxidation reaction by the enzyme There is a problem. In addition, although most plants contain a large amount of various types of polyphenols, polyphenol materials can be easily obtained. However, the ortho-hydroxylation reaction that is specific to the monophenol structure of polyphenol materials has a problem that chemical synthesis is difficult. Therefore, there is a need for a technique capable of efficiently producing a useful catechol structure material.

한국 특허 공개 제10-2013-0092168호Korean Patent Publication No. 10-2013-0092168 한국 특허 공개 제10-2015-0001169호Korean Patent Publication No. 10-2015-0001169

Goldfeder, M., Kanteev, M., Adir, N. and Fishman, A. (2013) Influencing the monophenolase/diphenolase activity ratio in tyrosinase BBA-Proteins and Proteomics. 1834:629-633. Goldfeder, M., Kanteev, M., Adir, N. and Fishman, A. (2013) Influencing the monophenolase / diphenolase activity ratio in tyrosinase BBA-Proteins and Proteomics. 1834: 629-633. Mylonas C, Kouretas D, Lipid peroxidation and tissue damage, In Vivo, 1999, 13(3), 295-309 Mylonas C, Kouretas D, Lipid peroxidation and tissue damage, In Vivo, 1999, 13 (3), 295-309 Tim Ridgway et al., Antioxidant action of novel derivatives of the apple-derived flavonoid phloridzin compared to oestrogen: relevance to potential cardioprotective action, Biochem Soc Trans, 1997, 25, 160S Tim Ridgway et al., Antioxidant action of novel derivatives of the apple-derived flavonoid phloridzine compared to oestrogen: relevance to potential cardioprotective action, Biochem Soc Trans, 1997, 25, 160S Regioselective Hydroxylation of trans-Resveratrol via Inhibition of Tyrosinase from Streptomyces avermitilis MA4680 [ACS Chem. Biol., 2012, 7 (10), pp 1687-1692] Regioselective Hydroxylation of trans-Resveratrol via Inhibition of Tyrosinase from Streptomyces avermitilis MA4680 [ACS Chem. Biol., 2012, 7 (10), pp 1687-1692) Nina Schweigert. Et al., Chemical properties of catechols and their molecular modes of toxic action in cells, from microorganisms to mammals, Environmental Microbiology, 2001, 3(2), 81 Nina Schweigert. Et al., Chemical properties of catechols and their molecular modes of toxic action in cells, from microorganisms to mammals, Environmental Microbiology, 2001, 3 (2), 81 DE Lee. Et al., 7,3',4'-Trihydroxyisoflavone, a Metabolite of the Soy Isoflavone Daidzein, Suppresses Ultraviolet B-induced Skin Cancer by Targeting Cot and MKK4, Journal of Biological Chemistry, 2011, 286, 14246-14256 DE Lee. Et al., 7,3 ', 4'-Trihydroxyisoflavone, a Metabolite of the Soy Isoflavone Daidzein, Suppresses Ultraviolet B-induced Skin Cancer by Targeting Cot and MKK4, Journal of Biological Chemistry, 2011, 286, 14246-14256 S.Isonishi. Et al., Differential regulation of the cytotoxicity activity of paclitaxel by orobol and platelet derived growth factor in human ovarian carcinoma cells, Oncology Reports, 2007, 18, 195-201 S.Isonishi. Et al., Differential regulation of the cytotoxicity activity of paclitaxel by orobol and platelet derived growth factor in human ovarian carcinoma cells, Oncology Reports 2007, 18, 195-201 Chaing CM, Et al., Improving Free Radical Scavenging Activity of Soy Isoflavone Glycosides Daidzin and Genistin by 3'-Hydroxylation Using Recombinant Escherichia coli, Molecules, 2016, 21(12), E1723 Chaing CM, et al., Improving Free Radical Scavenging Activity of Soy Isoflavone Glycosides Daidzin and Genistin by 3'-Hydroxylation Using Recombinant Escherichia coli, Molecules, 2016, 21 (12), E1723

본 발명의 목적은 모노페놀형 구조 물질로부터 카테콜형 구조 물질을 합성하는데 있어, 높은 생산성과 수율로 카테콜형 구조 물질을 생산할 수 있는 기술을 개발하기 위한 것이다. 특히, 본 발명자들은 산성 조건에 특화된 티로시나아제를 이용하여 기능성 카테콜형 구조 물질을 효과적으로 생산하고자 하였다.An object of the present invention is to develop a technique capable of producing a catechol-type structural material with high productivity and yield in the synthesis of a catechol-type structural material from a monophenolic structural material. In particular, the present inventors intend to effectively produce a functional catechol-type structural substance using tyrosinase specialized for acidic conditions.

이에 본 발명자들은 상기한 과제를 해결하기 위하여, NCBI 데이터베이스에서 미생물 유래 천여개의 티로시나아제를 분류하여, 기존 많이 보고된 방선균(S. avermitilis) 유래 티로시나아제와 바실러스 메가테리움(B. megaterium) 유래 티로시나아제와 유전학적으로 많이 상이한 버크홀데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 유래 티로시나아제를 선별하고, 이를 E. coli내에서 생산하였다(도 1 참조).In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have classified thousands of microorganism-derived tyrosinase genes in the NCBI database, and found that tyrosinase derived from S. avermitilis and B. megaterium , The tyrosinase derived from Burkholderia thailandensis , which is very different from the genetically derived tyrosinase, was selected and produced in E. coli (see Fig. 1).

연구 결과, 버크홀데리아 타일란덴시스 유래 티로시나아제(BT_ty)는 최적 pH 조건이 pH 1.5 내지 6.5 로 완벽한 산성 조건이며, 중성 이상의 pH조건에서는 반응성이 완벽히 억제된다. 또한, 생성물의 pka 값 이하인 산성 조건에서는 카테콜형 구조 물질의 자동 산화반응이 저해되어, 일차 수산화 반응 생성물인 카테콜형 구조 물질이 보호된다는 점을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다. As a result of the study, tyrosinase (BT_ty) derived from Burkholderia tylandense was completely acidic at an optimum pH of 1.5 to 6.5, and was completely inhibited at pH above neutral. Further, it has been found that, under acidic conditions below the pka value of the product, the autoxidation reaction of the catechol-type structural material is inhibited and the catechol-type structural material, which is the primary hydroxylation product, is protected.

구체적으로, 본 발명은 Specifically, the present invention provides

(1) 티로시나아제를 이용하여, 모노페놀형 구조 물질로부터 카테콜형 구조 물질을 제조하는 방법으로서, 상기 티로시나아제는 버크홀데리아 타일란덴시스 유래 티로시나아제이고, 상기 제조는 pH 1.5 내지 6.5 의 산성 조건에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조 방법에 관한 것이다. (1) A method for producing a catechol-type structural material from a monophenol type structural material using tyrosinase, wherein the tyrosinase is tyrosinase derived from Burkholderia tylendansis, Lt; RTI ID = 0.0 > acidic < / RTI > conditions.

(2) 상기 제조는 바람직하게 pH 3.5 내지 6.0 의 산성 조건에서 이루어질 수 있다. (2) The preparation is preferably carried out under acidic conditions of pH 3.5 to 6.0.

(3) 상기 모노페놀형 구조 물질로부터 카테콜형 구조 물질이 생성되는 일차 수산화 반응의 속도(Vmax_mono)와 카테콜형 구조 물질로부터 퀴논형 물질이 생성되는 이차 산화 반응의 속도(Vmax_di)의 비율(Vmax_mono/Vmax_di)이 0.8 이상일 수 있다. (3) a ratio (Vmax_mono / Vmax_mono) of the rate (Vmax_mono) of the primary hydroxylation reaction from which the catechol type structural material is generated from the monophenol type structural material to the rate (Vmax_di) Vmax_di) may be 0.8 or more.

(4) 상기 제조 방법은 (a) 생성된 카테콜형 구조 물질을 전이금속이온 또는 붕소이온으로 배위 결합시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. (4) The production method may further include (a) a step of coordinating the resulting catechol-type structural material with a transition metal ion or boron ion.

(5) 상기 붕소이온은 붕소산일 수 있다. (5) The boron ion may be boronic acid.

(6) 상기 제조 방법은 하기 (b) 및 (c) 단계 중 하나 이상의 단계를 추가로 포함할 수 있다:(6) The method may further comprise one or more of the following steps (b) and (c):

(b) 티로시나아제의 과산화반응에 의해 생성된 퀴논형 구조 물질을, 환원력을 도입하여, 카테콜형 구조 물질로 환원시키는 단계; (b) reducing the quinone type structural material produced by the peroxidation reaction of tyrosinase to a catechol type structure material by introducing a reducing power;

(c) 환원력을 도입하여, 메트-티로시나아제를 활성화시키는 단계. (c) introducing a reducing power to activate the met-tyrosinase.

(7) 상기 환원력이 전기화학, NADH, NADPH, 아스코빅산, 시스테인, p-쿠마릭산, 히드록실아민, 카테콜, 피로갈롤 및 카페인산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것으로부터 제공될 수 있다. (7) The reducing power may be selected from the group consisting of electrochemical, NADH, NADPH, ascorbic acid, cysteine, p- coumaric acid, hydroxylamine, catechol, pyrogallol and caffeic acid.

(8) 상기 모노페놀형 구조 물질은 티로신 아미노산, 티로솔, 레스베라트롤, 다이드제인, 제니스테인, 아피제닌, 플로레틴, 페놀, 파라-쿠마릭산, 파라-니트로페놀, 파라-크레졸, 파라-비닐페놀, 오르소-아미노페놀, 세파드록식, 아목실린 및 노카르디신으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. (8) The pharmaceutical composition according to any one of (1) to (5), wherein the monophenol-type structural substance is selected from the group consisting of tyrosine amino acid, tyrosol, resveratrol, daidzein, genistein, apigenin, floretine, phenol, para-coumaric acid, para-nitrophenol, , Ortho-aminophenol, cephadoxime, amoxycillin, and nocardine.

(9) 상기 카테콜형 구조 물질은 루테올린, 3-하이드록시프롤레틴, 3'-오르토하이드록시다이즈제인, 오로볼, 피스아타놀, 수산화 티로솔, 도파(dopa), 카페익산, 3,4-디하이드록시니트로벤젠, 3,4-디하이드록시톨루엔 및 3,4-디하이드록시스티렌으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.(9) The catechol-type structure material is at least one selected from the group consisting of luteolin, 3-hydroxyproline, 3'-orthohydroxydizane, ourobole, pisatanol, tyrosol, 4-dihydroxynitrobenzene, 3,4-dihydroxytoluene, and 3,4-dihydroxystyrene.

(10) 상기 모노페놀형 구조 물질은 플로레틴이고, 상기 카테콜형 구조 물질은 3-하이드록시 플로레틴일 수 있다. (10) The monophenolic structure material may be floretine, and the catechol structure material may be 3-hydroxyfloretin.

(11) 상기 모노페놀형 구조 물질은 플로레진이고, 상기 카테콜형 구조 물질은 3-하이드록시 플로레진일 수 있다. (11) The monophenolic structure material may be a florescent, and the catechol structure material may be 3-hydroxyfluorene.

(12) 상기 모노페놀형 구조 물질은 다이드제인(daidzein), 플로레틴(phloretin), 캠페롤(kaempfereol), 나린제닌(naringenin), 레스베라트롤(resveratrol), 다이드진(daidzin), 제니스테인(genistein), 글리시틴(glycitin), 폴리다틴(polydatin), 노토파긴(nothofagin), 티로졸(tyrosol) 및 시네프린(synephrine)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.(12) The above monophenol-type structural substance may be selected from the group consisting of daidzein, phloretin, kaempfereol, naringenin, resveratrol, daidzin, genistein ), Glycitin, polydatin, nothofagin, tyrosol, and synephrine. ≪ RTI ID = 0.0 >

(13) 상기 카테콜형 구조 물질은 3'-하이드록시 다이드제인, 3-하이드록시 플로레틴, 퀘르세틴(quercetin), 에리오딕티올(eriodictyol), 피세아타놀(piceatannol), 3'-하이드록시 다이드진, 3'-하이드록시 제니스테인, 3'-하이드록시 글리시틴, 아스트린진(astringin), 아스팔라틴(aspalathin), 3-하이드록시 티로졸 및 에피네프린(ephinephrine)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.(13) The catechol-type structural material as described in any one of (1) to (3) above, wherein the catechol-type structural substance is a 3'hydroxyidade, 3-hydroxyfloretin, quercetin, eriodictyol, piceatannol, (3-hydroxysterine, 3'-hydroxyglycitin, astringin, aspalathin, 3-hydroxytriazole, and ephinephrine) .

본 발명은 산성 조건에 특화된 버크홀데리아 타일란덴시스 유래 티로시나아제(BT_ty)를 이용한 기능성 카테콜형 구조 물질의 제조 및 그의 응용에 관한 것으로, 높은 생산성과 수율로 카테콜형 구조 물질을 생산할 수 있는 장점이 있다. 그 결과 기존에 추출이나 유기화학적 합성이 어려웠던 카테콜형 구조 물질의 대량 생산을 가능케 하여, 그 생리학적 효능 실험에 이바지할 수 있다.The present invention relates to the production of a functional catheter type structural material using tyrosinase (BT_ty) derived from Burkholderia tylendansis, which is specialized for acidic conditions, and its application, and has an advantage of being able to produce a catechol type structure material with high productivity and yield . As a result, it is possible to mass-produce catechol-type structural materials, which have been difficult to extract or synthesize in advance, and contribute to the physiological efficacy experiments.

또한, 본 발명은 폴리페놀 물질의 모노페놀 구조에 위치 특이적인 오르토 수산화 반응을 통해, 강한 항산화 능력을 가진 카테콜형 구조 물질을 생산할 수 있다.In addition, the present invention can produce a catechol-type structural material having a strong antioxidative ability through a site-specific ortho-hydroxylation reaction to the monophenol structure of the polyphenol material.

도 1 은 미생물 유래 천여개의 티로시나아제의 서열 기반으로 작성한 분기도(cladogram)이다.
도 2 는 실험예 1 에 따라 발현된 버크홀데리아 타일란덴시스 유래 티로시나아제(BT_ty)를 확인하기 위한 SDS-PAGE 분석 결과이다.
도 3 은 실험예 2 에서 pH 에 따른 티로시나아제의 활성을 확인하기 위하여 모노페놀형 구조 물질으로부터 형성된 멜라닌 형성을 확인한 도이다.
도 4 은 실험예 2 에서 도출된 L-티로신 및 L-dopa에 대한 티로시나아제의 속도를 나타낸 표이다.
도 5 는 실험예 3 에서 버크홀데리아 타일란덴시스 유래 티로시나아제(BT_Ty)를 이용한 멜라닌 생성 반응에 사용된 폴리페놀 비당체(aglycone) 및 폴리페놀 배당체(glycone)을 나타낸 것이다.
도 6 은 실험예 3 에서 기질에 따른 멜라닌 형성 반응을 비교한 결과이다.
도 7 은 실험예 3 에서 당화 기질에 대한 티로시나아제의 상대적인 활성도를 비교한 결과이다.
도 8 는 버크홀데리아 타일란덴시스 유래 티로시나아제(BT_ty)를 이용하여 플로레틴으로부터 3-히드록시 플로레틴을 생성하는 반응의 모식도이다.
도 9 은 실험예 4 에서 제조된 3-하이드록시 플로레틴의 정성적 분석 결과이다.
도 10 은 실험예 4 에서 플로레틴과 3-하이드록시 플로레틴의 분리를 확인하기 위한 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용한 정량적 분석 결과이다.
도 11 은 실험예 4 에서 반응 조건에 따른 기질로부터 반응산물로의 전환율을 확인하기 위한 3-하이드록시 플로레틴 생성 양상을 나타낸 도이다.
도 12 는 실험예 5 에서 플로레틴 및 3-하이드록시 플로레틴의 생성을 확인하기 위한 기체 크로마토그래피(GC)/질량분석(MS) 결과이다.
도 13 은 실험예 6 에서 캠페롤(kaempferol)과 퀘르세틴(quercetin)의 생성을 확인하기 위한 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 결과이다.
도 14 는 실험예 6 에서 버크홀데리아 타일란덴시스 유래 티로시나아제(BT_Ty)를 이용한 캠페롤의 퀘르세틴으로 전환 양상을 나타낸 결과이다.
도 15 는 실험예 7 에서 레스베라트롤(resveratrol)으로부터 피세아타놀(piceatannol)을 생성하는 반응의 모식도(a), 피세아타놀의 생성 양상(b) 및 레스베라트롤과 피세아타놀을 확인하기 위한 기체 크로마토그래피(GC)/질량분석(MS) 결과((c)~(f))이다.
도 16 은 실험예 8 에서 나린제닌(naringenin)으로부터 에리오딕티올(eriodictiol)을 생성하는 반응의 모식도(a), 에리오딕티올의 생성 양상(b) 및 나린제닌과 에리오딕티올을 확인하기 위한 기체 크로마토그래피(GC)/질량분석(MS) 결과((c)~(f))이다.
도 17 은 실험예 9 에서 다이드제인(daidzein)으로부터 3'-하이드록시 다이드제인(3'-ODI)을 생성하는 반응의 모식도 및 3'-ODI 의 생성 양상을 나타낸 도이다.
도 18 은 실험예 9 에서 다이드진(daidzin)으로부터 3'-하이드록시 다이드진을 생성하는 반응의 모식도 및 3'-하이드록시 다이드진의 생성 양상을 나타낸 도이다.
도 19 는 실험예 9 에서 제니스틴(genistin)으로부터 3'-하이드록시 제니스틴을 생성하는 반응의 모식도 및 3'-하이드록시 제니스틴의 생성 양상을 나타낸 도이다.
도 20 은 실험예 10 에서 다이드진(daidzin)으로부터 3'-하이드록시 다이드진을 생성하는 반응의 모식도 및 다이드진과 3'-하이드록시 다이드진을 확인하기 위한 액체 크로마토그래피(LC)/질량 분석(MS) 결과이다.
도 21 은 실험예 10 에서 제니스틴(genistin)으로부터 3'-하이드록시 제니스틴을 생성하는 반응의 모식도 및 제니스틴과 3'-하이드록시 제니스틴을 확인하기 위한 액체 크로마토그래피(LC)/질량 분석(MS) 결과이다.
도 22 는 실험예 11 에서 글리시틴(glycitin)으로부터 3'-하이드록시 글리시틴을 생성하는 반응의 모식도 및 3'-하이드록시 글리시틴의 생성 양상을 나타낸 도이다.
도 23 은 실험예 12 에서 글리시틴으로부터 3'-하이드록시 글리시틴을 생성하는 반응의 모식도 및 글리시틴과 3'-하이드록시 글리시틴을 확인하기 위한 액체 크로마토그래피(LC)/질량 분석(MS) 결과이다.
도 24 는 실험예 13 에서 폴리다틴(polydatin)으로부터 3-하이드록시 폴리다틴을 생성하는 반응의 모식도 및 3-하이드록시 폴리다틴의 생성 양상을 나타낸 도이다.
도 25 는 실험예 14 에서 폴리다틴으로부터 3-하이드록시 폴리다틴을 생성하는 반응의 모식도 및 폴리다틴과 3-하이드록시 폴리다틴을 확인하기 위한 액체 크로마토그래피(LC)/질량 분석(MS) 결과이다.
도 26 은 실험예 15 에서 노토파긴(nothofagin)으로부터 3-하이드록시 노토파긴을 생성하는 반응의 모식도 및 3-하이드록시 노토파긴의 생성 양상을 나타낸 도이다.
도 27 은 실험예 16 에서 노토파긴으로부터 3-하이드록시 노토파긴을 생성하는 반응의 모식도 및 노토파긴과 3-하이드록시 노토파긴을 확인하기 위한 액체 크로마토그래피(LC)/질량 분석(MS) 결과이다.Fig. 1 is a sequence diagram based on the sequence of a thousand microbial tyrosinases.
FIG. 2 is a result of SDS-PAGE analysis for identifying tyrosinase (BT_ty) derived from Burkholderia tylandensece expressed in Experimental Example 1. FIG.
FIG. 3 is a graph showing the formation of melanin formed from a monophenol-type structural material in order to confirm the activity of tyrosinase according to pH in Experimental Example 2. FIG.
Fig. 4 is a table showing the rate of tyrosinase for L-tyrosine and L-dopa derived in Experimental Example 2. Fig.
FIG. 5 shows the polyphenol aglycone and polyphenol glycone used in the melanin production reaction using tyrosinase (BT_Ty) derived from Burkholderia tylandense in Experimental Example 3. FIG.
FIG. 6 shows the result of comparing the melanin formation reaction according to the substrate in Experimental Example 3. FIG.
FIG. 7 shows the results of comparing the relative activity of tyrosinase to glycated substrate in Experimental Example 3. FIG.
8 is a schematic diagram of a reaction for producing 3-hydroxyfructin from floretine using Burkholderia tylandense-derived tyrosinase (BT_ty).
9 is a result of qualitative analysis of 3-hydroxyflorethyne prepared in Experimental Example 4. Fig.
FIG. 10 is a result of quantitative analysis using high performance liquid chromatography (HPLC) to confirm the separation of phloretin and 3-hydroxyflorethine in Experimental Example 4. FIG.
11 is a graph showing the 3-hydroxyflorethyne production pattern for confirming the conversion of the substrate to the reaction product according to the reaction conditions in Experimental Example 4. FIG.
12 is a gas chromatography (GC) / mass spectrometry (MS) result for confirming the production of phloretin and 3-hydroxyfloretin in Experimental Example 5.
13 is a high performance liquid chromatography (HPLC) result for confirming the production of kaempferol and quercetin in Experimental Example 6. Fig.
Fig. 14 shows the results of conversion of camphorol to quercetin using tyrosinase (BT_Ty) derived from Burkholderia tylandensece in Experimental Example 6. Fig.
FIG. 15 is a schematic view (a) of reaction for producing piceatannol from resveratrol in Experimental Example 7, a formation pattern (b) of fisethanol, and a gas chromatograph for confirming resveratrol and fisethanol (GC) / mass spectrometry (MS) results ((c) - (f)).
16 is a schematic diagram (a) of a reaction for producing an eriodictiol from naringenin in Experimental Example 8, a formation pattern (b) of an erodic thiol and a gas for identifying a naringenin and an erodic thiol (GC) / mass spectrometry (MS) results ((c) to (f)).
FIG. 17 is a schematic diagram of a reaction for generating a 3'-hydroxydidase (3'-ODI) from daidzein in Experimental Example 9 and a diagram showing the formation pattern of 3'-ODI.
FIG. 18 is a schematic diagram showing a reaction scheme for generating 3'-hydroxydadezine from daidzin in Experimental Example 9 and a diagram showing the formation pattern of 3'-hydroxydadezine. FIG.
19 is a schematic diagram of a reaction for generating 3'-hydroxygenenistin from genistin and a generation pattern of 3'-hydroxygenicnistin in Experimental Example 9. FIG.
20 is a schematic diagram of a reaction for generating 3'-hydroxydadezine from daidzin in Experimental Example 10 and liquid chromatography (LC) for identifying daidzin and 3'- / Mass spectrometry (MS).
21 is a schematic diagram of a reaction for producing 3'-hydroxygenenistin from genistin in Experimental Example 10 and a liquid chromatography (LC) / mass spectrometry (MS) result for confirming genistin and 3'- to be.
22 is a schematic diagram of a reaction for producing 3'-hydroxyglycitin from glycitin in Experimental Example 11 and a diagram showing the formation pattern of 3'-hydroxyglycitin.
23 is a schematic diagram of a reaction for producing 3'-hydroxyglycitin from glycitin in Experimental Example 12 and a liquid chromatogram (LC) / mass for confirming glycitin and 3'-hydroxyglycitin Analysis (MS) results.
24 is a schematic diagram of a reaction for producing 3-hydroxypolydatine from polydatin in Experimental Example 13 and a diagram showing the formation pattern of 3-hydroxypolydatin.
25 is a schematic diagram of the reaction for producing 3-hydroxypolydatine from polyadin in Experimental Example 14 and a liquid chromatography (LC) / mass spectrometry (MS) for confirming polyadin and 3-hydroxypolydatine .
26 shows a schematic diagram of the reaction for producing 3-hydroxynotopaglyine from nothofagin in Experimental Example 15 and a diagram showing the formation pattern of 3-hydroxyoxotryptin.
27 is a schematic diagram of a reaction for producing 3-hydroxy isotopegin from notopaggin in Experimental Example 16 and a liquid chromatography (LC) / mass spectrometry (MS) result for confirming notopaggin and 3-hydroxy isopagidine .

이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 본 발명은 다양한 형태로 변경되어 구현될 수 있으며, 여기에서 설명하는 구현예에 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in detail. However, it should be understood that the present invention may be embodied in many other specific forms without departing from the spirit or essential characteristics thereof.

본 발명은 티로시나아제(효소)를 이용하여, 모노페놀형 구조 물질(기질)로부터 카테콜형 구조 물질을 제조하는 방법으로서, 상기 티로시나아제는 버크홀데리아 타일란덴시스 유래 티로시나아제(BT_ty)이고, 상기 제조가 pH 1.5 내지 pH 6.5 의 산성 조건에서 이루어지는 것을 특징으로 한다. The present invention relates to a method for producing a catechol-type structural substance from a monophenol-type structural substance (substrate) using tyrosinase (enzyme), wherein the tyrosinase is a tyrosinase derived from Burkholderia tylendansis (BT_ty) , And the preparation is carried out under an acidic condition of pH 1.5 to pH 6.5.

버크홀데리아 타일란덴시스 유래 티로시나아제(BT_ty)는 다른 폴리프로필렌옥시다아제(PPO)와는 달리 pH 1.5 내지 pH 6.5 의 최적 반응 조건을 갖는다. 버크홀데리아 타일란덴시스 유래 티로시나아(BT_ty)를 효소로서 이용하면, 낮은 pH 조건 에서 모노페놀형 기질로부터 버크홀데리아 타일란덴시스 유래 티로시나아제를 발현시킬 수 있다. 그 결과 모노페놀형 기질에서 일차 수산화 반응 후 생성된 카테콜형 생성물이 안정적으로 보존될 수 있으므로, 높은 생산성과 수율로 카테콜형 구조 물질을 제조하는 것이 가능해진다. Unlike other polypropylene oxidase (PPO), Burkholderia tylandense-derived tyrosinase (BT_ty) has an optimum reaction condition of pH 1.5 to pH 6.5. When tyrosinase (BT_ty) derived from Burkholderia tylandense is used as an enzyme, tyrosinase derived from Burkholderia tylandensece can be expressed from a monophenol type substrate under low pH conditions. As a result, the catechol-type product produced after the primary hydroxylation reaction in the monophenol-type substrate can be stably stored, making it possible to produce the catechol-type structural material with high productivity and yield.

티로시나아제에 의한 일차 수산화 반응(모노옥시게나아제 활성)은 탄소-수소 결합 내에 산소 원자를 도입하는데 촉매화하는 티로시나아제 효소반응을 의미하며 수산화 잔기를 생성한다. 티로시나아제 이차 산화 반응(디옥시게나아제 활성)은 카테콜형 구조 물질에서 산소에 결합된 수소와 전자를 제거하여 벤조퀴논 형태로 촉매화하는 티로시나아제 효소반응을 의미한다. The primary hydroxylation reaction (monooxygenase activity) by tyrosinase means a tyrosinase enzyme reaction catalyzing the introduction of oxygen atoms into carbon-hydrogen bonds and produces hydroxyl moieties. The tyrosinase secondary oxidation reaction (dioxygenase activity) refers to a tyrosinase enzyme reaction catalyzing the removal of hydrogen and electrons bound to oxygen in the catechol-type structural material to form benzoquinone.

이와 관련하여, 본 발명은 모노페놀형 구조 물질로부터 카테콜형 구조 물질이 생성되는 일차 수산화 반응의 속도(Vmax_mono)와 카테콜형 구조 물질로부터 퀴논형 물질이 생성되는 이차 산화 반응의 속도(Vmax_di)의 비율(Vmax_mono/Vmax_di)이 0.8 이상이다. 또한 본 발명은 상기 반응 속도가 기존 보고된 티로시나아제보다 10 배 이상 높으므로 카테콜형 구조 물질을 산업적으로 활용하는 것을 가능케한다. In this connection, the present invention relates to a method for producing a catechol-type structural material in which a ratio (Vmax_mono) of a primary hydroxylation reaction in which a catechol-type structural material is produced from a monophenol type structural material and a rate (Vmax_di) (Vmax_mono / Vmax_di) is 0.8 or more. In addition, since the reaction rate is 10 times or more higher than that of the previously reported tyrosinase, the present invention makes it possible to industrially utilize the catechol-type structure material.

앞서 언급한 바와 같이 버크홀데리아 타일란덴시스 유래 티로시나아제(BT_ty)는 pH 1.5 내지 pH 6.5 에서 활성이고 중성 이상의 pH 에서는 비활성이다. 따라서, 상기 제조는 pH 1.5 내지 pH 6.5 의 산성 조건에서 이루어질 수 있고, 보다 바람직하게는 pH 3.5 내지 pH 6.0 의 산성 조건에서 이루어질 수 있다. 이처럼 버크홀데리아 타일란덴시스 유래 티로시나아제(BT_ty)는 산성조건에서만 멜라닌 색소를 형성하기에, 버크홀데리아 타이란덴시스 유래 티로시나아제를 기질과 함께 사용하면 pH 지시제(indicator)로서의 활용이 가능하다. As mentioned above, Burkholderia tylandense-derived tyrosinase (BT_ty) is active at pH 1.5 to pH 6.5 and is inactive at pH above neutral. Thus, the preparation can be carried out under acidic conditions of pH 1.5 to 6.5, more preferably in acidic conditions of pH 3.5 to pH 6.0. As described above, tyrosinase (BT_ty) derived from Burkholderia tylandense forms melanin pigment only under acidic conditions. Therefore, when tyrosinase derived from Burkholderia tyranidensis is used together with a substrate, it is utilized as a pH indicator This is possible.

상기 제조는 10 ~ 70 의 온도 범위에서, 8 내지 30 시간 동안 반응되는 것이 바람직하다. The preparation is carried out in a temperature range of 10 to 70, for 8 to 30 hours Is preferably reacted.

추가로, 본 발명의 제조 방법은, (a) 생성된 카테콜형 구조 물질을 전이금속이온 또는 붕소이온으로 배위 결합시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 붕소이온은 붕소산일 수 있다. 예컨대, 붕소산을 사용하는 경우, 붕소산과 카테콜형 물질 간의 붕소 에스터 결합에 의해 3-하이드록시 플로레틴이 타이로시나아제의 다이페놀레이즈 반응으로부터 보호되어 반응산물이 산화되지 않고 안정하게 유지된다. 따라서, 원하는 카테콜형 구조 물질을 보다 높은 수율로 수득할 수 있다. Further, the production method of the present invention may include (a) coordinating the resulting catechol-type structural material with a transition metal ion or a boron ion. The boron ion may be a boronic acid. For example, when boric acid is used, 3-hydroxyfloretin is protected from the diphenolase reaction of thiocyanate by boronic ester bonding between boronic acid and catechol-type material, and the reaction product is stably maintained without being oxidized. Thus, the desired catechol structure material can be obtained in higher yield.

추가로, 본 발명의 제조 방법은 하기 (b) 및 (c) 단계 중 하나 이상의 단계를 추가로 포함할 수 있다:In addition, the production process of the present invention may further comprise one or more of the following steps (b) and (c):

(b) 티로시나아제의 과산화반응에 의해 생성된 퀴논형 구조 물질을, 환원력을 도입하여, 카테콜형 구조 물질로 환원시키는 단계; (b) reducing the quinone type structural material produced by the peroxidation reaction of tyrosinase to a catechol type structure material by introducing a reducing power;

(c) 환원력을 도입하여, 메트-티로시나아제를 활성화시키는 단계.(c) introducing a reducing power to activate the met-tyrosinase.

이 때, 상기 환원력은 전기화학, NADH, NADPH, 아스코빅산, 시스테인, p-쿠마릭산, 히드록실아민, 카테콜, 피로갈롤 및 카페인산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것으로부터 제공되는 것일 수 있다. In this case, the reducing power may be one selected from the group consisting of electrochemical, NADH, NADPH, ascorbic acid, cysteine, p- coumaric acid, hydroxylamine, catechol, pyrogallol and caffeic acid.

상기와 같이 (b) 퀴논형 물질을 효과적으로 카테콜형 구조 물질로 환원시키거나, (c) 티로시나아제를 다시 활성화 시키는 단계를 추가적으로 포함함으로써, 원하는 카테콜형 구조 물질을 보다 높은 수율로 수득할 수 있다. By further including the steps of (b) reducing the quinone-type material effectively to the catechol-type structural material, or (c) reactivating the tyrosinase, the desired catechol structure material can be obtained in higher yield .

본 발명에서 버크홀데리아 타일란덴시스 유래 티로시나아제(BT_ty)는 티로시나아제 그 자체뿐만 아니라 티로시나아제가 발현된 미생물(전세포)을 이용하는 경우도 포함한다. In the present invention, Burkholderia tylandense-derived tyrosinase (BT_ty) includes not only tyrosinase itself but also microorganisms (all cells) expressing tyrosinase.

본 발명에서 모노페놀형 구조 물질(기질)로는, 티로신 아미노산(tyrosin)과 티로솔(tyrosol)과, 레스베라트롤(resveratrol)과 같은 스틸벤(stilbene) 계열, 다이드제인(daidzein), 제니스테인(genistein), 아피제닌(apigenine), 플로레틴(phloretin) 및 플로레진(phlorezin) 과 같은 플라본(flavonone)/이소플라본(isoflavone) 계열, 이 밖에 페놀(phenol), 파라-쿠마릭산(para-coumaric acid), 파라-니트로페놀(para-nitrophenol), 파라-크레졸(para-cresol), 파라-비닐페놀(para-vinylphenol), 오르소-아미노페놀(ortho-aminophenol), 그리고 세파드록실(cefadroxil), 아목실린(amoxicillin), 노카르디신(nocardicin)과 같은 페놀형 항생제 등을 이용할 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다. Examples of the monophenol-type structural substance (substrate) in the present invention include stilbene series such as tyrosine amino acid (tyrosin), tyrosol and resveratrol, daidzein, genistein, Flavonone / isoflavone series such as apigenine, phloretin and phlorezin, phenol, para-coumaric acid, Para-nitrophenol, para-cresol, para-vinylphenol, ortho-aminophenol, and cefadroxil, amoxycillin, phenolic antibiotics such as amoxicillin and nocardicin, and the like, but the present invention is not limited thereto.

또한, 본 발명에서 모노페놀형 구조 물질(기질)로는, 모노페놀 구조를 갖는 폴리페놀 물질로서, 다이드제인(daidzein), 플로레틴(phloretin), 캠페롤(kaempfereol), 나린제닌(naringenin), 레스베라트롤(resveratrol), 다이드진(daidzin), 제니스테인(genistein), 글리시틴(glycitin), 폴리다틴(polydatin), 노토파긴(nothofagin), 티로졸(tyrosol) 및 시네프린(synephrine) 등을 이용할 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the monophenol-type structural substance (substrate) is preferably a polyphenol substance having a monophenol structure, such as daidzein, phloretin, kaempfereol, naringenin, But not limited to, resveratrol, daidzin, genistein, glycitin, polydatin, nothofagin, tyrosol, and synephrine. But is not limited thereto.

본 발명에서 카테콜형 구조 물질은, 모노페놀형 구조티로신 물질에 오르토 특이적으로 수산화된 물질로서, 루테올린(luteolin), 3-하이드록시프롤레틴 (3-hydroxyphloretin, 3'-ODI), 오로볼(orobol) 과 같은 수산화 플라본(flavonone)/이소플라본(isoflavone) 계열, 피스아타놀(piceatannol) 과 같은 수산화 스틸벤(stilbene) 계열, 수산화 티로솔(hydroxyltyrosol), 도파(dopa), 카페익산(caffeic acid), 3,4-디하이드록시니트로벤젠(3,4-dihydroxynitrobenzene), 3,4-디하이드록시톨루엔(3,4-dihydroxytoluene), 3,4-디하이드록시스티렌(3,4-dihydroxystyrene) 등이 있다. 바람직하게는 위에 나열한 바람직한 모노페놀형 구조 물질들이 오르토 특이적 수산화된 형태로서, 차례대로, 피스아타놀, 카페익산, 3'-ODI, 오로볼, 3,4-디하이드록시니트로벤젠(3,4-dihydroxynitrobenzene), 3,4-디하이드록시톨루엔(3,4-dihydroxytoluene), 3,4-디하이드록시스티렌(3,4-dihydroxystyrene), 루테올린, 3-하이드록시프롤레틴(3-hydroxyphloretin) 등이 있고, 이에 제한되는 것은 아니다. In the present invention, the catechol-type structure material is a substance that is ortho-specifically hydroxylated to a monophenol-type structure tyrosine substance, such as luteolin, 3-hydroxyphloretin, 3'-ODI, such as the flavonone / isoflavone series such as orobol, stilbene series such as piceatannol, hydroxyltyrosol, dopa, caffeic acid, acid, 3,4-dihydroxynitrobenzene, 3,4-dihydroxytoluene, 3,4-dihydroxystyrene (3,4-dihydroxystyrene) ). Preferably, the preferred monophenol-type structural materials listed above are ortho-specific hydroxylated forms, which in turn are selected from the group consisting of Pisatanol, caffeic acid, 3'-ODI, orolol, 3,4- dihydroxynitrobenzene (3, 4-dihydroxynthrobenzene, 3,4-dihydroxytoluene, 3,4-dihydroxystyrene, luteolin, 3-hydroxyphloretin ), And the like, but are not limited thereto.

또한, 본 발명에서 카테콜형 구조 물질은, 폴리페놀의 모노페놀 구조에 오르토 특이적으로 수산화된 물질로서, 3'-하이드록시 다이드제인, 3-하이드록시 플로레틴, 퀘르세틴(quercetin), 에리오딕티올(eriodictyol), 피세아타놀(piceatannol), 3'-하이드록시 다이드진, 3'-하이드록시 제니스테인, 3'-하이드록시 글리시틴, 아스트린진(astringin), 아스팔라틴(aspalathin), 3-하이드록시 티로졸 및 에피네프린(ephinephrine) 등이 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.Also, in the present invention, the catechol-type structure material is a substance which is ortho-specifically hydroxylated to the monophenol structure of polyphenol, and includes 3'-hydroxyidadein, 3-hydroxyfloretin, quercetin, 3'-hydroxyanisole, 3'-hydroxyglycitin, astringin, aspalathin, 3'-hydroxystearin, 3'- , 3-hydroxytriazole and ephinephrine, but are not limited thereto.

한편, 폴리페놀 물질의 모노페놀 구조에 위치 특이적인 오르토 수산화 반응은, 구연산 나트륨 완충 용액(sodium citrate buffer), 구연산 인산 나트륨 완충 용액(citric phosphate buffer), 아세트산 나트륨 완충 용액(sodium acetate buffer), 아세트산 암모늄 완충 용액(ammonium acetate buffer)에서 진행할 수 있다. 완충 용액의 농도는 10 mM 내지 100 mM 이 바람직하고, 폴리페놀 물질(기질)의 농도는 버크홀데리아 타일란덴시스 유래 티로시나아제(BT_ty) 100 nM 일 때, 5 mM 이하가 바람직하다.On the other hand, the position-specific ortho-hydroxylation reaction to the monophenol structure of the polyphenol substance can be carried out by using a citric acid buffer solution, a citric acid buffer solution, a sodium citrate buffer solution, a sodium acetate buffer solution, Ammonium acetate buffer. The concentration of the buffer solution is preferably 10 mM to 100 mM, and when the concentration of the polyphenol substance (substrate) is 100 nM of tyrosinase derived from Burkholderia tylandensece (BT_ty), it is preferably 5 mM or less.

또한, 상기 오르토 수산화 반응은 L-아스코르브산(ascorbic acid)를 첨가하여 진행할 수 있다. L-아스코르브산은 티로시나아제의 2 차 수산화 반응(hydroxylation) 및 자연 산화 반응에 의하여 생성되는 퀴논형 물질을 다시 디페놀형 물질로 돌릴 수 있으며, 여기서 L-아스코르브산은 산화 방지제(환원제)이면서 티로시나아제의 활성 억제제(2차 반응 억제제)로 작용하게 된다. 또한, L-아스코르브산은 메트(met) 형태의 티로시나아제를 디옥시로 환원 시켜주는 환원제로서 작용할 수도 있다(비특허문헌 2). L-아스코르브산 이외에 히드록시아민(hydroxylamine)을 첨가하여 오르토 수산화 반응을 진행할 수도 있다.The ortho-hydroxylation can be carried out by adding L-ascorbic acid. L-ascorbic acid can be further converted into a diphenol-type material by the secondary hydroxylation and natural oxidation of tyrosinase, wherein the L-ascorbic acid is an antioxidant (reducing agent) Acting as an inhibitor of the activity of a secondary (secondary inhibitor). In addition, L-ascorbic acid may act as a reducing agent for reducing tyrosinase in met form to dioxy (Non-Patent Document 2). Hydroxylamine may be added in addition to L-ascorbic acid to proceed the ortho-hydroxylation reaction.

또한, 상기 오르토 수산화 반응은 pH 1.5 내지 pH 6.5 의 산성 조건에서 진행될 수 있고, 보다 바람직하게는 pH 3.5 내지 pH 6.0 의 산성 조건에서 진행될 수 있다.In addition, the ortho-hydroxylation reaction can be carried out under acidic conditions of pH 1.5 to 6.5, more preferably in acidic conditions of pH 3.5 to pH 6.0.

한편, 본 발명은 버크홀데리아 타일란덴시스 유래 티로시나아제(BT_ty)를 이용하여 플로레틴 또는 플로레진을 유용한 카테콜형 구조 물질로 변환시킬 수 있다는 점에서도 그 의의가 있다. 플로레틴과 플로레진은 값싼 사과나무의 잎과 사과 과육 껍질에 풍부하게 존재하는 디하이드로칼콘(dihydrochalcone)의 일종으로 항산화 및 항노화 효능이 뛰어난 것으로 알려져 있는데(비특허문헌 1), 이것의 수산화기 유도체인 3-히드록시 플로레틴은 플로레틴 보다 항산화 효능이 더 우수하고 콜레스테롤 축적을 저해하는 성질이 있어 동맥경화, 파킨슨병 등을 유발할 수 있는 지질 과산화를 저해하는 작용을 하는 것으로 알려져 있다(비특허문헌 2).즉, 본 발명을 이용하면 사과(껍질, 잎) 과즙과 같은 산성 반응 조건에서, 값싼 재료인 사과(껍질, 입)로부터 화학적 합성이 어려운 3-하이드록시 플로레틴 및 3-하이드록시 플로레진을 경제적으로, 산업적 규모로 생산 가능하게 된다.On the other hand, the present invention is also significant in that it is possible to convert floretine or floresin into a useful catechol-type structural substance by using Burkholderia tylandense-derived tyrosinase (BT_ty). Floretin and floresin are known as dihydrochalcone which is abundant in leaves of apple trees and apple peel shells, and is known to be excellent in antioxidative and anti-aging effects (Non-Patent Document 1) 3-Hydroxyfloretin, which is more effective than phloretin in antioxidative activity and inhibits cholesterol accumulation, is known to inhibit lipid peroxidation which may cause arteriosclerosis and Parkinson's disease 2). That is, when the present invention is used, it is possible to obtain 3-hydroxyfloretin and 3-hydroxyphosphine which are difficult to chemically synthesize from cheap apples (shells and mouths) under acidic reaction conditions such as apple (peel, The resin can be produced economically and industrially.

또한, 본 발명은 버크홀데리아 타일란덴시스 유래 티로시나아제(BT_ty)를 이용하여 여러 폴리페놀 비당체 물질 중 선택적으로 제니스테인(genistein), 다이드제인(daidzein), 플로레틴(phloretin), 캠페롤(kaempferol)과 그 당화 구조인 다이드진(daidzin), 제니스틴(genistin), 글리시틴(glycitin), 폴리다틴(polydatin), 플로리진(phlorizin), 노토파긴(nothofagin) 에 대해 오르토 특이적 수산화 반응을 진행 할 수 있다. 이 밖에도, 올리브오일에 있는 티로졸(tyrosol), 감귤 껍질에 풍부한 시네프린(synephrine)과 같은 페놀형 구조 물질에 대해 오르토 특이적 수산화 반응을 진행할 수 있다. The present invention also relates to a method for the production of genistein, daidzein, phloretin, camphorol, and the like from among various polyphenolic nonglycoside materials using Burkholderia tylandense-derived tyrosinase (BT_ty) specific hydrolysis of kaempferol and its glycosylation structures daidzin, genistin, glycitin, polydatin, phlorizin, and nothofagin, The reaction can proceed. In addition, ortho-specific hydroxylation reactions can be carried out on phenolic structures such as tyrosol in olive oil and synephrine in citrus peels.

즉, 본 발명을 이용하면 폴리페놀 비당체(다이드제인, 플로레틴, 캠페롤, 나린제닌, 레스베라트롤), O-폴리페놀 배당체(다이드진, 제니스테인, 글리시틴, 폴리다틴), C-폴리페놀 배당체(노토파긴), 페닐에타노이드(티로졸), 알칼로이드(시네프린)가 함유된 식물 추출물을 산성 반응 조건에서 별다른 추출 과정 없이 선택적으로 수산화 반응을 진행하여, 수용액상에서 불안정한 오르토-수산화 폴리페놀 물질만을 안정적으로 생산 가능하게 된다.That is, when the present invention is used, the polyphenol antigens (daidzein, floretin, camphorol, naringenin, resveratrol), O- polyphenol glycosides (daidzin, genistein, glycitin, The plant extracts containing polyphenol glycosides (notopaggin), phenylethanoids (tyrosoles) and alkaloids (cinefrin) undergo selective hydrolysis without acid extraction and hydroxylation in aqueous solution to give unstable ortho-hydroxide Only the polyphenol material can be stably produced.

이하에서는 하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the following examples are for the purpose of illustrating the present invention and are not intended to limit the scope of the present invention.

실험예 1: 버크홀데리아 타일란덴시스 유래 티로시나아제(BT_ty)의 발현EXPERIMENTAL EXAMPLE 1 Expression of Tyrosinase (BT_ty) Derived from Burkholderia tylendansis

버크홀데리아 타일란덴시스 유래 티로시나아제(BT_ty) 유전자가 삽입된 pET28a 벡터를 E. coli BL21에 형질전환 하고 LB 고체 배지에 도포하여 얻은 콜로니를 50 ㎍/mL Kanamycin이 첨가된 LB 액체 배지 3 mL에 접종하여 37 진탕 배양기에서 8시간 배양하였다. 계대배양을 위해 LB 액체 배지 50 mL에 50 ㎍/mL Kanamycin과 종균 배양액 500 ㎕를 첨가하여 37 진탕 배양기에서 배양하였다. A colony obtained by transforming E. coli BL21 into pET28a vector in which the tyrosinase gene (BT_ty) gene derived from Burkholderia tylandercis was transformed and applied to LB solid medium was dissolved in 3 mL of LB liquid medium supplemented with 50 μg / mL kanamycin And cultured in a 37-shaking incubator for 8 hours. For subculture, 50 ㎍ / mL kanamycin and 500 종 of seed culture were added to 50 mL of LB liquid medium and cultured in a 37 shaking incubator.

D600(optical density at 600 nm)가 약 0.6에 도달하면 0.02 mM IPTG 또는 0.2 mM IPTG 와, 1 mM CuSO4를 첨가한 후 18, 30℃, 37에서 20시간 동안 단백질 과발현을 유도하였다. 단백질을 수득하기 위해 4,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 세포를 수확하였고 50 mM pH 8 Tris-HCl 완충용액 5 mL을 첨가하여 세포를 세척하였다. 여기에 다시 50 mM pH 8 Tris-HCl 완충용액 5 mL을 넣은 후 초음파 파쇄기(Vibra&cell, USA)를 이용하여 세포 파쇄를 수행하였다. 세포 파쇄액을 1.7 mL 튜브에 분주하고 16,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 단백질을 포함하는 세포 추출액을 얻었다. When D 600 (optical density at 600 nm) reached about 0.6, protein overexpression was induced at 18, 30 ° C and 37 for 20 hours after addition of 0.02 mM IPTG or 0.2 mM IPTG and 1 mM CuSO 4 . Cells were harvested by centrifugation at 4,000 rpm for 10 min to obtain proteins, and cells were washed by adding 5 mL of 50 mM pH 8 Tris-HCl buffer. Then, 5 mL of 50 mM Tris-HCl buffer solution was added thereto, followed by cell disruption using an ultrasonic disrupter (Vibra & cell, USA). The cell lysate was dispensed into a 1.7 mL tube and centrifuged at 16,000 rpm for 30 minutes to obtain a cell extract containing the protein.

수득된 세포 추출액에 대하여 SDS-PAGE 분석을 통하여 단백질 크기와 발현량을 확인한 결과를 도 2 에 나타내었다. 도 2 를 통하여 확인할 수 있는 바와 같이, 0.02 mM IPTG 보다 0.2mM IPTG 에서, 그리고 18°C 의 발현 온도에서 버크홀데리아 타일란덴시스 유래 티로시나아제(BT_ty)가 보다 잘 발현되었음을 확인할 수 있었다. The obtained cell extract was subjected to SDS-PAGE analysis to confirm the protein size and expression level, and the result is shown in FIG. As can be seen from FIG. 2, it was confirmed that Burkholderia tylandense-derived tyrosinase (BT_ty) was more expressed at 0.2 mM IPTG than 0.02 mM IPTG and at an expression temperature of 18 ° C.

실험예 2: 버크홀데리아 타일란덴시스 유래 티로시나아제(BT_ty)를 이용한, 모노페놀형 구조 물질의 수산화 반응의 최적화 조건 확인Experimental Example 2: Determination of optimization conditions for the hydroxylation reaction of a monophenol type structural material using tyrosinase (BT_ty) derived from Burkholderia tylandense

효소로서 기존 보고된 아가리쿠스 비스포루스 (Agaricus bisporus) 유래 티로시나아제, 바실러스(B. megaterium) 유래 티로시나아제, 방선균(S. avermitilis) 유래 티로시나아제와, 상기 실험예 1 에서 제조된 본 발명의 버크홀데리아 타일란덴시스 유래 티로시나아제(BT_ty) 각각을 사용하여 모노페놀형 구조 물질인 L-티로시나아제의 수산화 반응 및 산화 반응을 진행하였다. 도 3 을 참조하면, 본 발명의 버크홀데리아 타일란덴시스 유래 티로시나아제(BT_ty) 를 사용하는 반응의 경우, 기존 보고된 다른 티로시나아제와는 대조적으로, 낮은 pH 에서만 L-티로시나아제를 산화하여 멜라닌을 형성하는 것을 확인하였다. 특히 버크홀데리아 타일란덴시스 유래 티로시나아제(BT_ty)의 최적 반응 산도는 pH 5 전후인 것으로 확인되었다. Tyrosinase derived from Agaricus bisporus, tyrosinase derived from B. megaterium, tyrosinase derived from S. avermitilis, and the present invention prepared in Experimental Example 1, (BT_ty) derived from Burkholdereria tylendensis were subjected to the hydroxylation and oxidation of L-tyrosinase, a monophenol-type structural substance. Referring to FIG. 3, in the case of the reaction using tyrosinase (BT_ty) derived from Burkholderia tylannicans according to the present invention, L-tyrosinase was inhibited only at low pH in contrast to other previously reported tyrosinase It was confirmed that melanin was formed by oxidation. In particular, the optimum reaction acidity of tyrosinase (BT_ty) derived from Burkholderia tylandense was confirmed to be around pH 5.

또한, 상기 실험을 바탕으로, 바실러스 메가테리움(B. megaterium) 유래 티로시나아제, 방선균(S. avermitilis) 유래 티로시나아제, 및 본 발명의 버크홀데리아 타일란덴시스 유래 티로시나아제(BT_ty)의, L-티로시나아제와 L-dopa에 대한 속도를 각각 구하여 도 4 에 나타내었다. 도 4 에 나타난 바와 같이, 본 발명의 버크홀데리아 타일란덴시스 유래 티로시나아제(BT_ty)를 사용한 경우, 기존 보고된 다른 티로시나아제를 사용한 경우에 비하여, L-티로시나아제와 L-dopa 에 대한 속도가 10배 가량 큰 것으로 확인된다. 이는 본 발명의 버크홀데리아 타일란덴시스 유래 티로시나아제(BT_ty)를 효소로 이용하여 모노페놀형 구조 물질로부터 카테콜형 구조 물질을 제조하는 경우 기존에 보고된 티로시나아제를 효소로 이용하는 경우에 비해 반응 속도가 현저히 향상됨을 의미한다. Based on the above experiment, tyrosinase derived from B. megaterium, tyrosinase derived from S. avermitilis, and tyrosinase (BT_ty) derived from Burkholderia tylandensece of the present invention, Of L-tyrosinase and L-dopa, respectively, are shown in FIG. As shown in FIG. 4, when tyrosinase (BT_ty) derived from Burkholderia tylannicans according to the present invention was used, L-tyrosinase and L-dopa It is confirmed that the speed is about 10 times larger. When the catechol-type structural material is prepared from the monophenol type structural material using the tyrosinase derived from Burkholderia tylandense (BT_ty) according to the present invention as an enzyme, the tyrosinase activity of the tyrosinase Which means that the reaction rate is significantly improved.

또한, 도 4 을 참조하면, 본 발명의 버크홀데리아 타일란덴시스 유래 티로시나아제(BT_ty)를 이용하는 경우, 모노페놀형 구조 물질로부터 카테콜형 구조 물질이 생성되는 일차 수산화 반응의 속도(Vmax_mono)와 카테콜형 구조 물질로부터 퀴논형 물질이 생성되는 이차 산화 반응의 속도(Vmax_di)의 비율(Vmax_mono/Vmax_di)이 0.8 이상인 것으로 확인된다.
Further, referring to FIG. 4, when tyrosinase (BT_ty) derived from Burkholderia tylannicides of the present invention is used, The ratio (Vmax_mono / Vmax_di) of the rate (Vmax_mono) of the primary hydroxylation reaction in which the catechol type structural material is produced from the monophenol type structural material and the rate (Vmax_di) of the secondary oxidation reaction in which the quinone type substance is generated from the catechol type structure material is 0.8 Or more.

실험예 3: 폴리페놀 비당체 및 폴리페놀 배당체의 수산화 반응 통한 하이드록시 폴리페놀의 제조Experimental Example 3: Preparation of hydroxypolyphenol through hydroxylation reaction of polyphenolic oligosaccharide and polyphenol glycoside

효소로서 버크홀데리아 타일란덴시스 유래 티로시나아제(BT_Ty), 바실러스 메가테리움 유래 티로시나아제(BM_Ty) 및 스트렙토마이세스 아벌미틸리스 유래 티로시나아제(SA_Ty)를 이용하여, 폴리페놀 비당체 7 개와 폴리페놀 배당체 4 개에 대한 티로시나아제의 기질 특이성을 비교하였다. 상기 반응에서 사용된 폴리페놀 비당체 및 폴리페놀 배당체는 도 5 에 나타내었다. 반응이 진행되면 멜라닌 생성에 의한 색변화를 확인할 수 있으므로, 하이드록시 폴리페놀의 생성을 정성적으로 확인할 수 있으며, 멜라닌 형성 반응 비교 결과를 도 6 에 나타내었다. 도 6 을 참고하면, 버크홀데리아 타일란덴시스 유래 티로시나아제(BT_ty)는 제니스테인(genistein), 캠페롤(kaempferol) 및 퀘르세틴(quercetin)을 제외한 나머지 8 개 기질에 대하여 강한 활성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.Using tyrosinase (BT_Ty) derived from Burkholderia tylandense as an enzyme, tyrosinase (BM_Ty) derived from Bacillus megaterium and tyrosinase (SA_Ty) derived from Streptomyces avamitillis, Seven polyphenol glycosides and four substrate specificities of tyrosinase were compared. The polyphenolic oligosaccharides and polyphenol glycosides used in this reaction are shown in FIG. As the reaction progresses, the color change due to melanin formation can be confirmed, so that the production of hydroxypolyphenol can be qualitatively confirmed, and the result of the melanin formation reaction is shown in FIG. Referring to FIG. 6, it was confirmed that tyrosinase (BT_ty) derived from Burkholderia tylandercis has strong activity against the remaining 8 substrates except genistein, kaempferol and quercetin I could.

또한, 티로시나아제의 폴리페놀 배당체에 대한 상대적 반응성으로 기질 특이성을 비교하여, 도 7 에 나타내었다. 구체적으로, 당화 기질에 대한 상대적 반응성을 멜라닌 형성을 통해 비교하였고, 그 결과 BM_Ty 및 SA_Ty 에 비하여 BT_Ty 의 폴리페놀 배당체에 대한 선택적 활성이 높은 것을 확인할 수 있었다.
In addition, the substrate specificity was compared with the relative reactivity of tyrosinase to the polyphenol glycoside, and it is shown in Fig. Specifically, the relative reactivity to glycated substrates was compared through melanogenesis, and as a result, BT_Ty was found to have a higher selectivity for polyphenol glycosides than BM_Ty and SA_Ty.

실험예 4: 플로레틴의 수산화 반응 통한 3-하이드록시 플로레틴의 제조Experimental Example 4: Preparation of 3-hydroxyflorethine through hydroxylation reaction of phloretin

효소로서 버크홀데리아 타일란덴시스 유래 티로시나아제(BT_ty)를 이용하여, 사과(열매 또는 잎)에 존재하는 플로레틴으로부터 3-하이드록시 플로레틴을 제조하였다. 상기 반응의 모식도는 도 8 에 나타내었다. 3-Hydroxyfloretin was produced from phloretin present in apple (fruit or leaf) using tyrosinase (BT_ty) derived from Burkholderia tylandense as an enzyme. A schematic diagram of the reaction is shown in Fig.

이 때 효소(BT-ty) 및 기질(플로레틴) 모두를 첨가한 반응(#3)과 함께, 대조군으로서 효소(BT-ty)를 첨가하지 않은 반응(#1) 및 기질(플로레틴)을 첨가하지 않은 반응(#2)을 함께 실시하여, 도 9 에 나타내었다. 도 9 를 참조하면, 효소 또는 기질을 첨가하지 않은 두 대조군의 경우 멜라닌 생성에 의한 색 변화를 확인할 수 없었으나, 효소와 기질 모두를 첨가한 반응의 경우 멜라닌에 의한 색 변화를 육안으로 확인할 수 있었다. At this time, the reaction (# 3) in which both the enzyme (BT-ty) and the substrate (floretine) were added and the reaction (# 1) in which no enzyme (BT-ty) The reaction (# 2) not added was carried out together and is shown in Fig. 9, no change in color due to melanin production was observed in the case of two control groups to which no enzyme or substrate was added, but the change in color due to melanin could be visually confirmed in the case of addition of both an enzyme and a substrate .

또한, 생성물인 3-하이드록시 플로레틴을 HPLC를 이용하여 정량적으로 분석한 결과를 도 10 에 나타내었다. 도 10 에서 확인되는 바와 같이, 플로레틴은 14. 5분, 3-하이드록시 플로레틴은 8분에서 각각 용출되었다.
Further, the result of quantitative analysis of the product 3-hydroxyfloretin using HPLC was shown in FIG. As seen in Fig. 10, phloretin eluted at 14. 5 minutes and 3-hydroxyfloretin eluted at 8 minutes, respectively.

한편, 반응 조건에 따른 기질로부터 반응산물로의 전환율을 확인하기 위하여, 플로레틴 1 mM 및 BT-ty 1 μM 를 (a) pH 6 50 mM 시트릭산 (Na-citrate) 완충용액 5 mL 및 (b) pH 6 500 mM 보레이트 완충용액 5 mL 각각에 녹인 후, L-아스코르브산(LAA)를 넣고 반응을 진행시켰다. 상기 반응의 시간에 따른 3-하이드록시 플로레틴의 생성 양상을 비교하여 도 11 에 나타내었다. 시트릭산 완충용액의 경우, 타이로시나아제의 두 번째 산화 반응에 의해 생성된 3-하이드록시 플로레틴이 퀴논형으로 전환되며 시간이 지나면서 사라지는 경향을 보임을 확인하였다(도 11(a) 참조). 보레이트 완충용액 반응의 경우, 붕소산과 카테콜형 물질 간의 붕소 에스터 결합에 의해 3-하이드록시 플로레틴이 타이로시나아제의 다이페놀레이즈 반응으로부터 보호되어 반응산물이 산화되지 않고 안정하게 유지됨을 확인하였다(도 11(b) 참조). 결과적으로, 반응 9시간째에 1 mM의 플로레틴이 거의 100%의 수율로 3-하이드록시 플로레틴으로 전환되는 것으로 나타났다.
1 ml of phloretin and 1 μM of BT-ty were mixed with 5 ml of 50 mM Na-citrate buffer solution (pH 6) and 5 ml of (b) ) pH 6 After dissolving in 5 mL of 500 mM borate buffer, L-ascorbic acid (LAA) was added and the reaction proceeded. The formation patterns of 3-hydroxyfloretin with respect to the time of the above reaction are compared and shown in Fig. In the case of the citric acid buffer solution, it was confirmed that the 3-hydroxyfructin produced by the second oxidation reaction of tyrosinase was converted into a quinone form and showed a tendency to disappear over time (see FIG. 11 (a)) ). In the case of the borate buffer solution reaction, it was confirmed that 3-hydroxyflorethine was protected from the diphenolase reaction of thiocyanate by the boronic ester bonding between the boronic acid and the catechol-type substance, and the reaction product was stably maintained without being oxidized 11 (b)). As a result, at the 9th hour of reaction, 1 mM of floretine was found to be converted to 3-hydroxyflorethine in a yield of almost 100%.

실험예 5: 반응물 분석을 통한 3-하이드록시 플로레틴의 생성 확인 Experimental Example 5: Confirmation of production of 3-hydroxyflorethyne by analyzing reactants

상기 실험예 4 와 관련하여, 반응액에 효소를 처리한 직후(0 h), 그리고 반응 시작 4시간 후(4 h)에 샘플을 채취하여 GC/MS로 반응산물을 분석한 결과를 도 12 에 나타내었다. 도 12 에서 (a) 와 (c)는 샘플의 크로마토그래피를 나타내고, (b) 와 (d)는 질량 스펙트럼(mass spectra)을 나타낸다. (a) 및 (c) 에서 11.81분의 peak은 기질 플로레틴이고, 13.02분의 peak 는 반응산물인 3-하이드록시 플로레틴이다. With respect to Experimental Example 4, the reaction solution was sampled immediately after the enzyme treatment (0 h) and 4 hours after the start of the reaction (4 h), and the reaction products were analyzed by GC / MS. Respectively. 12 (a) and 12 (c) show chromatograms of the sample, and (b) and (d) show the mass spectra. In (a) and (c), the 11.81 min peak is the substrate floretine and the 13.02 min peak is the reaction product, 3-hydroxyflorethyne.

도 12 를 참조하면, 반응 4시간 후 플로레틴은 사라지고 3-하이드록시 플로레틴이 생성되었음을 확인할 수 있으며. 플로레틴의 두 mass peak은 m/z가 각각 562.87, 547.97 (TMS ether moiety 에서 메틸기 하나가 제거된 형태)이며 3-하이드록시 플로레틴은 651.01, 636.15 이다.
Referring to FIG. 12, after 4 hours of reaction, the floretine disappeared and 3-hydroxyfructin was produced. The two mass peaks of the phloretin are 562.87 and 547.97 (in which the methyl group is removed from the TMS ether moiety) at m / z and 651.01 and 636.15 for 3-hydroxyfloretin, respectively.

실험예 6: 캠페롤(kaempferol)의 수산화 반응을 통한 3'-하이드록시 캠페롤(퀘르세틴)의 생성Experimental Example 6: Production of 3'-hydroxy camphorol (quercetin) by hydroxylation of camphorol

효소로서 버크홀데리아 타일란덴시스 유래 티로시나아제(BT_ty)를 이용하여, 캠페롤로부터 3'-하이드록시 캠페롤, 즉 퀘르세틴(quercetin)을 제조하였다. 3'위치에 위치특이적인 수산화반응이 진행됨을 정량적으로 분석하기 위하여 HPLC 를 사용하였고, 이를 도 13 에 나타내었다. 도 13 을 참고하면, 기질인 캠페롤은 21 분대에서, 생성물인 퀘르세틴은 11분에서 용출된 것을 확인할 수 있었다.3'-hydroxy camphorol, that is, quercetin, was prepared from camphorol using tyrosinase (BT_ty) derived from Burkholderia tylandense as an enzyme. HPLC was used to quantitatively analyze the progress of the site-specific hydroxylation reaction at the 3 'position, which is shown in FIG. Referring to FIG. 13, it was confirmed that the camperol as the substrate was eluted at 21 minutes and the product quercetin was eluted at 11 minutes.

또한, 반응 조건에 따른 기질의 생성물로의 전환 수율을 알아보기 위하여 구연산 나트륨 완충 용액을 사용하고, L-아스코르브산을 첨가하여 시간에 따른 퀘르세틴의 생성 양상을 확인하였다. 캠페롤의 퀘르세틴으로의 전환 양상을 도 14 에 나타내었으며, 전환 수율 4.7 % 로 퀘르세틴이 생성되었다.
In order to investigate the yield of conversion of the substrate to the product according to the reaction conditions, the formation of quercetin was confirmed with time using sodium citrate buffer solution and L-ascorbic acid. The conversion pattern of camphorol to quercetin is shown in Fig. 14, and quercetin was produced at a conversion yield of 4.7%.

실험예 7: 레스베라트롤(resveratrol)의 수산화 반응을 통한 3'-하이드록시 레스베라트롤(피세아타놀)의 제조Experimental Example 7: Preparation of 3'-hydroxy resveratrol (fisethanol) through hydroxylation of resveratrol

효소로서 버크홀데리아 타일란덴시스 유래 티로시나아제(BT_ty)를 이용하여, 레스베라트롤로부터 3'-하이드록시 레스베라트롤, 즉 피세아타놀(piceatannol)을 제조하였다. 구체적으로, 구연산 나트륨 완충 용액을 사용하고, L-아스코르브산을 첨가하여 시간에 따른 피세아타놀의 생성 양상을 확인하였다. pH 5.0, 50 mM 구연산 나트륨 완충 용액 1mL 에서 효소 100 nM, 기질 1 mM 으로 반응을 진행한 결과를 도 15 에 나타내었으며, 도 15 b 를 참고하면, 전환 수율 약 50 % 로 산물인 피세아타놀이 생성된 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 15 의 (b) 는 샘플의 크로마토그래피로서 반응 5 시간 후 레스베라트롤은 사라지고 피세아타놀이 생성되었음을 확인할 수 있다. 도 15 에서 (c) 는 효소를 처리한 직후 (Oh) 샘플의 크로마토그래피를 나타내고, (d) 는 반응 시작 300 분 후(5h) 샘플의 크로마토그래피를 나타내고, (e) 및 (f) 는 질량 스펙트럼을 나타낸다. (c) 에서 10.45 분의 peak 는 기질 레스베라트롤이고, (d) 에서 12.15 분의 peak 는 생성물 피세아타놀이다. 레스베라트롤의 mass peak 는 m/z 가 444.20 이고, 피세아타놀의 mass peak 는 m/z 가 532.23 이다.
3'-hydroxy resveratrol, i.e., piceatannol, was prepared from resveratrol using tyrosinase (BT_ty) derived from Burkholderia tylandense as an enzyme. Concretely, by using sodium citrate buffer solution and adding L-ascorbic acid, the formation pattern of plasmaanol was observed over time. The reaction was carried out in 1 ml of a pH 5.0, 50 mM sodium citrate buffer solution at 100 nM of the enzyme and 1 mM of the substrate. The result is shown in Fig. 15. Referring to Fig. 15b, It was confirmed that it was generated. 15 (b) shows the chromatogram of the sample. After 5 hours of the reaction, the resveratrol disappears and the physiatranol is generated. (D) shows the chromatogram of the sample (5h) after 300 minutes from the start of the reaction, and (e) and (f) show the mass Lt; / RTI > In (c), the peak at 10.45 min is the substrate resveratrol, and at (d) the peak at 12.15 min is the product phytaatanol. The mass peak of resveratrol is 444.20 m / z and the mass peak of pisethanol is m / z 532.23.

실험예 8: 나린제닌(naringenin)의 수산화 반응을 통한 3'-하이드록시 나린제닌(에리오딕티올)의 제조Experimental Example 8: Preparation of 3'-hydroxynarinegen (eredic thiol) through hydroxylation reaction of naringenin

효소로서 버크홀데리아 타일란덴시스 유래 티로시나아제(BT_ty)를 이용하여, 나린제닌로부터 3'-하이드록시 나린제닌, 즉 에리오딕티올(eriodictyol)을 제조하였다. 구체적으로, 구연산 나트륨 완충 용액을 사용하고, L-아스코르브산을 첨가하여 시간에 따른 에리오딕티올의 생성 양상을 확인하였다. pH 5.0, 50 Mm 구연산 나트륨 완충 용액 1mL 에서 효소 100 nM, 기질 1 mM 으로 반응을 진행한 결과를 도 16 에 나타내었으며, 도 16 (b) 를 참고하면, 전환 수율 약 10 % 로 산물인 에리오딕티올이 생성된 것을 확인할 수 있었다.3'-Hydroxynergenin, i.e., eriodictyol, was prepared from Naringenin using Burkholderia tylandense-derived tyrosinase (BT_ty) as an enzyme. Concretely, using sodium citrate buffer solution, L-ascorbic acid was added to observe the formation of erodic thiol with time. The reaction was carried out in 1 ml of a pH 5.0, 50 Mm sodium citrate buffer solution at 100 nM of the enzyme and 1 mM of the substrate. The results are shown in FIG. 16. Referring to FIG. 16, It was confirmed that thiol was formed.

또한, 도 16 의 (b) 는 샘플의 크로마토그래피를 나타내고, 도 16 의 (c) 는 효소를 처리한 직후(0h) 샘플의 크로마토그래피를 나타내고, (d) 는 반응 시작 300분 후(5h) 샘플의 크로마토그래피를 나타내고, (e) 및 (f) 는 질량 스펙트럼을 나타낸다. (c) 에서 12.52 분의 peak 는 기질 나린제닌이고, (d) 에서 13.64 분의 peak 는 생성물 에리오딕티올이다. 레스베라트롤의 mass peak 는 m/z 가 473.15 이고, 피세아타놀의 mass peak 는 m/z 가 576.22 이다.
16 (b) shows the chromatogram of the sample, Fig. 16 (c) shows the chromatography of the sample immediately after the enzyme treatment (0 h) (E) and (f) show the mass spectrum. In (c), the peak at 12.52 min is the substrate naringenin, and at (d) the peak at 13.64 min is the product eryodic thiol. The resveratrol mass peak has a m / z of 473.15 and the mass peak of pisethanol has a m / z of 576.22.

실험예 9: 다이드제인(daidzein), 다이드진(daidzin) 및 제니스틴(genistin)의 수산화 반응 통한 3'-하이드록시 다이드제인(3'-ODI), 3'-하이드록시 다이드진 및 3'-하이드록시 제니스틴의 제조Experimental Example 9: Synthesis of 3'-hydroxydadezine (3'-ODI), 3'-hydroxydadezine and 3'-hydroxydadezine through the hydroxylation reaction of daidzein, daidzin and genistin Preparation of 3'-Hydroxygenystyne

효소로서 버크홀데리아 타일란덴시스 유래 티로시나아제(BT_ty)를 이용하여, 콩에 다량 존재하는 아이소플라본 물질인 다이드제인과 당화체인 다이드진 및 제니스틴의 3'-위치에 위치특이적 수산화 반응이 진행됨을 HPLC 를 이용하여 정량적으로 분석하였고, 그 결과를 도 17 내지 19 에 나타내었다. Using the tyrosinase derived from Burkholderia tylendansis (BT_ty) as an enzyme, it is possible to carry out a position-specific hydroxylation reaction at the 3'-position of daidzein, which is an isoflavone substance present in a large amount in soybean, This progress was quantitatively analyzed using HPLC and the results are shown in Figures 17-19.

반응 조건에 따른 기질의 생성물로의 전환 수율을 알아보기 위하여, 구연산 나트륨 완충 용액을 사용하고, L-아스코르브산을 첨가하여 pH 5.0, 50 Mm 구연산 나트륨 완충 용액 1mL 에서 효소 100 nM, 기질 1 mM 으로 반응을 진행하였으며, 시간에 따른 3'-하이드록시 다이드제인, 3'-하이드록시 다이드진 및 3'-하이드록시 제니스틴의 생성 양상을 확인하였다.To determine the conversion yield of the substrate to the product according to the reaction conditions, 100 nM of enzyme and 1 mM of substrate were added to 1 mL of 50 mM sodium citrate buffer solution at pH 5.0 using sodium citrate buffer solution and L-ascorbic acid The reaction was carried out, and the formation patterns of 3'-hydroxy deidzine, 3'-hydroxy deazepine and 3'-hydroxyoxygennistine were confirmed over time.

도 17 에서 확인되는 바와 같이, 다이드제인으로부터 3'-하이드록시 다이드제인의 전환 수율은 38% 에서 더 이상의 반응이 진행되지 않았으며, 도 18 에서 확인되는 바와 같이, 다이드진의 반응에서 반응 1 시간 후 기질인 다이드진이 모두 소모되었고, 3'-하이드록시 다이드진이 전환 수율 87.3 % 로 생성되었다. 또한, 도 19 에서 확인되는 바와 같이, 제니스틴의 반응에서 반응 1 시간 후에 기질인 제니스틴이 모두 소모되지 않았고, 3'-하이드록시 제니스틴이 전환 수율 46.5 % 로 생성되었다.
As can be seen in Fig. 17, the conversion yield of 3'-hydroxydidadein from daidzein did not proceed further at 38%, and as shown in Fig. 18, the reaction in the daidzin reaction After one hour, all of the substrate daidzin was consumed and 3'-hydroxyidazin was produced with a conversion yield of 87.3%. In addition, as shown in Fig. 19, in the reaction of the genistin, after 1 hour of the reaction, the substrate, genistein, was not consumed and 3'-hydroxygenestynine was produced with a conversion yield of 46.5%.

실험예 10: 반응물의 LC/MS 분석을 통한 3'-하이드록시 다이드진 및 3'-하이드록시 제니스틴의 생성 확인Experimental Example 10: Confirmation of production of 3'-hydroxyidene and 3'-hydroxygenenistin by LC / MS analysis of the reaction product

상기 실험예 9 와 관련하여, 다이드진을 기질로 첨가한 반응액에 효소를 처리한 직후(O h), 그리고 반응 시작 1 시간 후 (1 h)에 샘플을 채취하여 LC/MS 로 반응산물을 분석한 결과를 도 20 에 나타내었다. 도 20 에서 (a) 는 효소를 처리한 직후(Oh) 샘플의 크로마토그래피를 나타내고, (b) 는 반응 시작 1 시간후 (1h) 샘플의 크로마토그래피를 나타내고, (c) 와 (d) 는 질량 스펙트럼(mass spectra)를 나타낸다. (a) 에서 8.21분의 peak 는 기질 다이드진이고, (b) 에서 8.04 분의 peak 는 반응산물인 3'-하이드록시 다이드진이다. With respect to Experimental Example 9, a sample was taken immediately after the enzyme treatment (O h) and 1 hour after the start of the reaction (1 h) in the reaction solution containing daidzin as a substrate, and the reaction product The results of the analysis are shown in FIG. (A) shows the chromatogram of the sample immediately after the enzyme treatment (Oh), (b) shows the chromatogram of the sample 1 h after the start of the reaction, (Mass spectra). (a), the peak of 8.21 min is the substrate dide jean, and the peak of 8.04 min in (b) is the reaction product, 3'-hydroxy dideazine.

도 20 을 참조하면, 반응 1 시간 후 다이드진은 사라지고 3'-하이드록시 다이드진이 생성되었음을 확인할 수 있으며, 다이드진의 mass peak 는 m/z 가 417.12 이고, 3'-하이드록시 다이드진은 m/z 가 433.08 이다.Referring to FIG. 20, it can be seen that daidzin disappeared after 1 hour of reaction and 3'-hydroxyidadezin was generated. The mass peak of daidzin was 417.12 at m / z, and 3'-hydroxydadezin The m / z is 433.08.

또한, 제니스틴을 기질로 첨가한 반응액에 효소를 처리한 직후(O h), 그리고 반응 시작 1 시간 후 (1 h)에 샘플을 채취하여 LC/MS 로 반응산물을 분석한 결과를 도 21 에 나타내었다. 도 21 에서 (a) 는 효소를 처리한 직후(Oh) 샘플의 크로마토그래피를 나타내고, (b) 는 반응 시작 1 시간후 (1h) 샘플의 크로마토그래피를 나타내고, (c) 와 (d) 는 질량 스펙트럼(mass spectra)를 나타낸다. (a) 에서 9.4분의 peak 는 기질 제니스틴이고, (b) 에서 8.63 분의 peak 는 반응산물인 3'-하이드록시 제니스틴이다. In addition, the reaction solution containing the genistin as a substrate was sampled immediately after the enzyme treatment (O h) and 1 hour after the start of the reaction (1 h), and the reaction products were analyzed by LC / MS. Respectively. (A) shows the chromatography of the sample immediately after the enzyme treatment (Oh), (b) shows the chromatogram of the sample 1 h after the start of the reaction (c) (Mass spectra). The peak at 9.4 min in (a) is the substrate zenithin, and the peak at 8.63 min in (b) is the reaction product 3'-hydroxygenestn.

도 21 을 참조하면, 반응 1 시간 후 3'-하이드록시 제니스틴이 생성되었음을 확인할 수 있으며, 제니스틴의 mass peak 는 m/z 가 433.11 이고, 3'-하이드록시 제니스틴은 m/z 가 449.07 이다.
Referring to FIG. 21, it can be seen that 3'-hydroxygenicnistin was produced after 1 hour of reaction, and the mass peak of genistin was 433.11 at m / z and 449.07 at 3'-hydroxygenicnistin.

실험예 11: 글리시틴(glycitin)의 수산화 반응 통한 3'-하이드록시 글리시틴의 제조Experimental Example 11: Preparation of 3'-hydroxyglycitin through hydroxylation reaction of glycitin

폴리페놀 배당체인 글리시틴을 기질로 첨가한 반응에서 3'-위치에 위치특이적인 수산화 반응이 진행됨을 HPLC 를 사용하여 정량적으로 확인하였고, 그 결과를 도 22 에 나타내었다. 반응 조건에 따른 기질의 생성물로의 전환 수율을 알아보기 위하여, 구연산 나트륨 완충 용액을 사용하고, L-아스코르브산을 첨가하여 시간에 따른 3'-하이드록시 글리시틴의 생성 양상을 확인하였다. pH 5.0, 50 Mm 구연산 나트륨 완충 용액 1mL 에서 효소 100 nM, 기질 1 mM 으로 반응을 진행하였고, 도 22 를 통하여 확인할 수 있는 바와 같이, 반응 1 시간 후에 기질인 글리시틴이 모두 소모되었고, 3'-하이드록시 글리시틴이 전환 수율 80.9 % 로 생성되었다.
The progress of the position-specific hydroxylation reaction at the 3'-position in the reaction of glycitin, which is a polyphenol glycoside, as a substrate was quantitatively confirmed using HPLC, and the results are shown in FIG. In order to investigate the conversion yield of the substrate to the product according to the reaction conditions, the formation of 3'-hydroxyglycitin was observed with time using sodium citrate buffer solution and L-ascorbic acid. The reaction was carried out with 100 nM of enzyme and 1 mM of substrate in 1 mL of pH 5.0, 50 Mm sodium citrate buffer solution. As can be seen from FIG. 22, the substrate glycitin was consumed after 1 hour of reaction, - hydroxyglycitin was produced with a conversion yield of 80.9%.

실험예 12: 반응물의 LC/MS 분석을 통한 3'-하이드록시 글리시틴의 생성 확인Experimental Example 12: Confirmation of production of 3'-hydroxyglycitin by LC / MS analysis of the reaction product

상기 실험예 11 과 관련하여, 반응액에 효소를 처리한 후(0 h), 그리고 반응 시작 1시간 후에 샘플을 채취하여 LC/MS로 반응산물을 분석한 결과를 도 23 에 나타내었다. (a) 는 효소를 처리한 직후 (Oh) 샘플의 크로마토그래피를 나타내고, (b) 는 반응 시작 1 시간후 (1h) 샘플의 크로마토그래피를 나타내고, (c)와 (d)는 질량 스펙트럼(mass spectra)을 나타낸다. (a) 에서 8.33분의 peak은 기질 글리시틴이며. (b)에서 7.84분의 peak 는 반응산물인 3'-하이드록시 글리시틴을 나타낸다. 도 23 을 참조하면, 반응 1시간 후 3'-하이드록시 글리시틴이 검출됨을 확인할 수 있고, 글리시틴의 mass peak은 m/z가 447.12 이고, 3'-하이드록시 글리시틴의 mass peak 는 m/z 가 463.10 이다.
With respect to Experimental Example 11, the reaction solution was treated with enzyme (0 h), and after 1 hour from the start of the reaction, a sample was collected and the reaction product was analyzed by LC / MS. (a) shows the chromatogram of the sample immediately after the enzyme treatment (Oh), (b) shows the chromatogram of the sample 1 h after the start of the reaction, (c) and (d) show the mass spectrum spectra. In (a), the peak at 8.33 min is the substrate glycityine. (b), the peak of 7.84 min represents the reaction product 3'-hydroxyglycitin. 23, it was confirmed that 3'-hydroxyglycitin was detected after 1 hour of reaction. The mass peak of glycitin was 447.12 at m / z, and the mass peak of 3'-hydroxyglycitin Lt; / RTI > is 463.10.

실험예 13: 폴리다틴(polydatin)의 수산화 반응 통한 3-하이드록시 폴리다틴(아스트린진)의 제조Experimental Example 13: Preparation of 3-hydroxypolydatin (astrinin) through hydroxylation reaction of polydatin

폴리페놀 배당체인 폴리다틴을 기질로 첨가하고, 효소로서 버크홀데리아 타일란덴시스 유래 티로시나아제(BT_ty)를 이용한 반응에서, 3- 위치에 위치특이적 수산화 반응이 진행됨을 HPLC 을 사용하여 정량적으로 분석하였고, 그 결과를 도 24 에 나타내었다. 구체적으로, 반응 조건에 따른 기질의 생성물로의 전환 수율을 알아보기 위하여, 구연산 나트륨 완충 용액을 사용하고, L-아스코르브산을 첨가하여 시간에 따른 아스트린진(astringin) 생성 양상을 확인하였다. pH 5.0, 50 Mm 구연산 나트륨 완충 용액 1mL 에서 효소 100 nM, 기질 1 mM 으로 반응을 진행하였고, 도 24 를 통하여 확인할 수 있는 바와 같이, 반응 20 분 이내에 기질인 폴리다틴이 모두 소모되었고, 아스트린진이 전환 수율 78.6 % 로 생산되었다.
It was confirmed by HPLC that the position-specific hydroxylation proceeds at the 3-position in the reaction using polyadin, a polyphenol glycoside, as a substrate and tyrosinase (BT_ty) derived from Burkholderia tylandense as an enzyme, quantitatively And the results are shown in Fig. Specifically, to determine the yield of conversion of the substrate to the product according to the reaction conditions, the formation of astringin with time was confirmed by adding sodium citrate buffer solution and adding L-ascorbic acid. The reaction was carried out in 1 ml of 50 mM sodium citrate buffer solution at pH 5.0, 100 nM of the enzyme and 1 mM of the substrate. As can be seen from FIG. 24, all of the substrate polyadatins were consumed within 20 minutes of reaction, The conversion yield was 78.6%.

실험예 14: 반응물의 LC/MS 분석을 통한 3-하이드록시 폴리다틴(아스트린진)의 생성 확인Experimental Example 14: Confirmation of production of 3-hydroxypolydatin (astrinin) by LC / MS analysis of the reaction product

상기 실험예 13 과 관련하여, 반응액에 효소를 처리한 후(0 h), 그리고 반응 시작 1시간 후에 샘플을 채취하여 LC/MS로 반응산물을 분석한 결과를 도 25 에 나타내었다. (a) 는 효소를 처리한 직후(Oh) 샘플의 크로마토그래피를 나타내고, (b) 는 반응 시작 1 시간후 (1h) 샘플의 크로마토그래피를 나타내고, (c)와 (d)는 질량 스펙트럼(mass spectra)을 나타낸다. (a) 에서 8.94분의 peak 는 기질 폴리다틴을 나타내고, (b) 에서 8.45분의 peak 는 반응산물 아스트린진(astringin)을 나타낸다. 도 25 로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 반응 1시간 후 아스트린진이 검출됨을 확인할 수 있고. 폴리다틴의 mass peak은 m/z 가 390.11 이며 아스트린진의 mass peak 는 m/x 가 407.09이다.
With respect to Experimental Example 13, the reaction solution was treated with enzyme (0 h), and after 1 hour from the start of the reaction, a sample was collected and the reaction product was analyzed by LC / MS. (a) shows the chromatogram of the sample immediately after the enzyme treatment (Oh), (b) shows the chromatogram of the sample 1 h after the start of the reaction, (c) and (d) show the mass spectrum spectra. The peak at 8.94 min in (a) represents the substrate polyatatin and the peak at 8.45 min in (b) represents the reaction product astringin. As can be seen from Fig. 25, it can be confirmed that astrinine was detected after 1 hour of reaction. The mass peak of polydatine is 390.11 m / z and the mass peak of astrinine is 407.09 m / x.

실험예 15: 노토파긴(nothofagin)의 수산화 반응 통한 3-하이드록시 노토파긴(아스팔라틴)의 제조Experimental Example 15: Preparation of 3-hydroxynotopagin (asphalatin) through hydroxylation reaction of nothofagin

폴리페놀 배당체인 노토파긴을 기질로 첨가하고, 효소로서 버크홀데리아 타일란덴시스 유래 티로시나아제(BT_ty)를 이용한 반응에서, 3 위치에 위치특이적 수산화 반응이 진행됨을 HPLC 을 사용하여 정량적으로 분석하였고, 그 결과를 도 26 에 나타내었다. 구체적으로, 반응 조건에 따른 기질의 생성물로의 전환 수율을 알아보기 위하여, 구연산 나트륨 완충 용액을 사용하고, L-아스코르브산을 첨가하여 시간에 따른 아스팔라틴(aspalathin) 생성 양상을 확인하였다. pH 5.0, 50 Mm 구연산 나트륨 완충 용액 1mL 에서 효소 100 nM, 기질 1 mM 으로 반응을 진행하였고, 도 26 를 통하여 확인할 수 있는 바와 같이, 반응 60분 후 아스팔라틴이 전환 수율 75.7 % 로 생성되었다.
It was quantitatively analyzed using HPLC to analyze the progress of the position-specific hydroxylation reaction at the 3-position in the reaction using Notopagin, a polyphenol glycoside, as a substrate and using tyrosinase (BT_ty) derived from Burkholderia tylandense as an enzyme And the results are shown in Fig. Specifically, to determine the conversion yield of the substrate to the product according to the reaction conditions, the formation of aspalathin was observed with time using sodium citrate buffer solution and L-ascorbic acid. As shown in FIG. 26, asphalatin was produced at a conversion yield of 75.7% after 60 minutes of reaction. The reaction was carried out in 1 ml of pH 5.0, 50 Mm sodium citrate buffer solution at 100 nM of the enzyme and 1 mM of the substrate.

실험예 16: 반응물의 LC/MS 분석을 통한 3-하이드록시 노토파긴(아스팔라틴)의 생성 확인Experimental Example 16: Confirmation of production of 3-hydroxyisothiopagine (asphalatin) by LC / MS analysis of the reaction product

상기 실험예 15 와 관련하여, 노토파긴을 기질로 첨가한 반응액에, 효소로서 버크홀데리아 타일란덴시스 유래 티로시나아제(BT_ty)를 처리하고 45 분 후에 샘플을 채취하여 LC/MS 로 반응산물을 분석하였고, 그 결과를 도 27 에 나타내었다. (a) 는 샘플의 크로마토그래피를 나타내고, (b) 및 (c) 는 질량 스펙트럼(mass spectra)를 나타낸다. (a) 에서 17.84 분의 peak 는 기질인 노토파긴을 나타내고, 13.81 분의 peak 는 반응산물인 아스팔라틴(aspalathin)을 나타낸다. 도 27 로부터 아스팔라틴이 검출되는 것을 확인할 수 있으며, 노토파긴의 mass peak 는 m/z 가 390.11 이고, 아스팔라틴의 mass peak 는 m/z 가 407.09 이다.
In relation to Experimental Example 15, tyrosinase-derived tyrosinase (BT_ty) as an enzyme was treated with a reaction solution to which notopagain was added as a substrate. 45 minutes later, a sample was taken and the reaction product And the results are shown in FIG. (a) shows the chromatogram of the sample, and (b) and (c) show the mass spectra. In (a), the peak at 17.84 min represents the substrate notopaggin and the peak at 13.81 min represents the reaction product, aspalathin. From FIG. 27, it can be seen that asphalatin is detected, and the mass peak of notopargine is m / z = 390.11 and the mass peak of asphalatin is m / z = 407.09.

Claims (13)

티로시나아제를 이용하여, 모노페놀형 구조 물질로부터 카테콜형 구조 물질을 제조하는 방법으로서, 상기 티로시나아제는 버크홀데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 유래 티로시나아제이고, 상기 제조는 pH 1.5 내지 pH 6.5 의 산성 조건에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조 방법.A method for producing a catechol-type structural material from a monophenol type structural material using tyrosinase, wherein the tyrosinase is tyrosinase derived from Burkholderia thailandensis , lt; RTI ID = 0.0 > pH < / RTI > 6.5. 제 1 항에 있어서,
모노페놀형 구조 물질로부터 카테콜형 구조 물질이 생성되는 일차 수산화 반응의 속도(Vmax_mono)와 카테콜형 구조 물질로부터 퀴논형 물질이 생성되는 이차 산화 반응의 속도(Vmax_di)의 비율(Vmax_mono/Vmax_di)이 0.8 이상인 것을 특징으로 하는 제조 방법.The method according to claim 1,
The ratio (Vmax_mono / Vmax_di) of the rate (Vmax_mono) of the primary hydroxylation reaction in which the catechol structure material is generated from the monophenol type structure material and the rate (Vmax_di) of the secondary oxidation reaction in which the quinone type material is generated from the catechol type structure material is 0.8 Or more. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 제조가 pH 3.5 내지 pH 6.0 의 산성 조건에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조 방법. 3. The method according to claim 1 or 2,
Wherein said preparation is carried out under acidic conditions of pH 3.5 to 6.0. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
(a) 생성된 카테콜형 구조 물질을 전이금속이온 또는 붕소이온으로 배위 결합시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.3. The method according to claim 1 or 2,
(a) further comprising the step of coordinating the resulting catechol-type structural material with a transition metal ion or boron ion. 제 4 항에 있어서,
상기 붕소이온은 붕소산인 것을 특징으로 하는 제조 방법.5. The method of claim 4,
Wherein the boron ion is a boronic acid. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
하기 (b) 및 (c) 단계 중 하나 이상의 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법:
(b) 티로시나아제의 과산화반응에 의해 생성된 퀴논형 구조 물질을, 환원력을 도입하여, 카테콜형 구조 물질로 환원시키는 단계;
(c) 환원력을 도입하여, 메트-티로시나아제를 활성화시키는 단계. 3. The method according to claim 1 or 2,
Further comprising at least one of the following steps (b) and (c):
(b) reducing the quinone type structural material produced by the peroxidation reaction of tyrosinase to a catechol type structure material by introducing a reducing power;
(c) introducing a reducing power to activate the met-tyrosinase. 제 6 항에 있어서,
상기 환원력이 전기화학, NADH, NADPH, 아스코빅산, 시스테인, p-쿠마릭산, 히드록실아민, 카테콜, 피로갈롤 및 카페인산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것으로부터 제공되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.The method according to claim 6,
Wherein the reducing power is provided from the group consisting of electrochemistry, NADH, NADPH, ascorbic acid, cysteine, p- coumaric acid, hydroxylamine, catechol, pyrogallol and caffeic acid. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
모노페놀형 구조 물질이 티로신 아미노산, 티로솔, 레스베라트롤, 다이드제인, 제니스테인, 아피제닌, 플로레틴, 플로레진, 페놀, 파라-쿠마릭산, 파라-니트로페놀, 파라-크레졸, 파라-비닐페놀, 오르소-아미노페놀, 세파드록식, 아목실린 및 노카르디신으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법. 3. The method according to claim 1 or 2,
Wherein the monophenol-type structural substance is selected from the group consisting of tyrosine amino acids, tyrosol, resveratrol, daidzein, genistein, apigenin, florethine, floresin, phenol, para-coumalic acid, para-nitrophenol, para- ≪ / RTI > aminophenol, ortho-aminophenol, cephadoxime, amoxycillin and nocardine. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
카테콜형 구조 물질이 루테올린, 3-하이드록시프롤레틴, 3'-오르토하이드록시다이드제인, 오로볼, 피스아타놀, 수산화 티로솔, 도파(dopa), 카페익산, 3,4-디하이드록시니트로벤젠, 3,4-디하이드록시톨루엔 및 3,4-디하이드록시스티렌으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.3. The method according to claim 1 or 2,
Wherein the catechol type structure material is selected from the group consisting of luteolin, 3-hydroxyproline, 3'-orthohydroxydadeazine, ourobole, pisatanol, thiosol hydroxide, dopa, Dihydroxytoluene, 3,4-dihydroxystyrene, 3,4-dihydroxytoluene and 3,4-dihydroxystyrene. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 모노페놀형 구조 물질이 플로레틴(phloretin)이고, 상기 카테콜형 구조 물질이 3-하이드록시 플로레틴인 것을 특징으로 하는 제조 방법.3. The method according to claim 1 or 2,
Wherein the monophenol structure material is phloretin and the catechol structure material is 3-hydroxyfloretin. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 모노페놀형 구조 물질이 플로레진(phlorezin)이고, 상기 카테콜형 구조 물질이 3-하이드록시 플로레진인 것을 특징으로 하는 제조 방법.3. The method according to claim 1 or 2,
Wherein the monophenol type structural material is phlorezin and the catechol type structural material is 3-hydroxyfluorene. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 모노페놀형 구조 물질이 다이드제인(daidzein), 플로레틴(phloretin), 캠페롤(kaempfereol), 나린제닌(naringenin), 레스베라트롤(resveratrol), 다이드진(daidzin), 제니스테인(genistein), 글리시틴(glycitin), 폴리다틴(polydatin), 노토파긴(nothofagin), 티로졸(tyrosol) 및 시네프린(synephrine)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.3. The method according to claim 1 or 2,
Wherein said monophenol-type structural material is selected from the group consisting of daidzein, phloretin, kaempfereol, naringenin, resveratrol, daidzin, genistein, Wherein the method is selected from the group consisting of glycitin, polydatin, nothofagin, tyrosol and synephrine. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 카테콜형 구조 물질이 3'-하이드록시 다이드제인, 3-하이드록시 플로레틴, 퀘르세틴(quercetin), 에리오딕티올(eriodictyol), 피세아타놀(piceatannol), 3'-하이드록시 다이드진, 3'-하이드록시 제니스테인, 3'-하이드록시 글리시틴, 아스트린진(astringin), 아스팔라틴(aspalathin), 3-하이드록시 티로졸 및 에피네프린(ephinephrine)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.3. The method according to claim 1 or 2,
Wherein the catechol-type structure material is a 3'-hydroxydeidase selected from the group consisting of 3-hydroxyfloretin, quercetin, eriodictyol, piceatannol, 3'- Is selected from the group consisting of 3'-hydroxyanisthrin, 3'-hydroxyanisthrin, 3'-hydroxyglycitin, astringin, aspalathin, 3-hydroxytriazole and ephinephrine How to.
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