KR20180077370A

KR20180077370A - OsAGPL4 유전자를 이용한 웅성불임 벼의 제조방법, 벼의 웅성불임 유도용 조성물 및 웅성불임 벼

Info

Publication number: KR20180077370A
Application number: KR1020160181064A
Authority: KR
Inventors: 전종성; 이상규; 엄준섭; 안진흥
Original assignee: 경희대학교 산학협력단
Priority date: 2016-12-28
Filing date: 2016-12-28
Publication date: 2018-07-09
Also published as: KR101902655B1

Abstract

본 발명은 OsAGPL4 유전자를 이용한 웅성불임 벼의 제조방법, 벼의 웅성불임 유도용 조성물 및 웅성불임 벼에 관한 것이다. 구체적으로는 벼에서 OsAGPL4 유전자의 발현을 억제하는 단계를 포함하는 웅성불임 벼의 제조방법, 모본인 OsAGPL4 유전자의 발현이 억제된 벼(T1) 및 부본인 웅성 가임의 벼(T1)와 교배시키는 단계를 추가로 포함하는 웅성불임 계통 벼(T2)의 제조방법, OsAGPL4 유전자의 발현을 억제하는 제제를 포함하는 벼의 웅성불임 유도용 조성물, OsAGPL4 유전자의 발현이 억제된 웅성불임 벼, OsAGPL4 유전자 발현여부를 판단하는 단계를 포함하는 벼의 웅성불임성을 확인하는 방법, OsAGPL4 유전자의 발현이 억제된 웅성불임 계통 벼에서, OsAGPL4 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 벼의 임성 회복 방법, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 OsAGPL4 유전자를 포함하는 벼의 임성 회복용 조성물, 및 후보물질을 처리한 벼에서 OsAGPL4 유전자의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는, 벼의 웅성불임 유도제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 웅성불임 벼의 제조방법은 벼에서 발현하는 유전자인 OsAGPL4 유전자의 발현을 억제하여 웅성불임 벼를 제조하는 것이 가능하다. 이를 통해 웅성불임 벼를 유도하는 것이 가능하며, 웅성불임 벼의 제조가 가능한 신규 유전자를 발견하였기 때문에 보다 다양한 방법으로 웅성불임 벼를 생산하는 것이 가능하게 되었다.

Description

OsAGPL4 유전자를 이용한 웅성불임 벼의 제조방법, 벼의 웅성불임 유도용 조성물 및 웅성불임 벼{Preparation method of male sterility rice using OsAGPL4 gene, composition for inducing male sterility of rice and male sterility rice}

본 발명은 OsAGPL4 유전자를 이용한 웅성불임 벼의 제조방법, 벼의 웅성불임 유도용 조성물 및 웅성불임 벼에 관한 것이다. 구체적으로는 벼에서 OsAGPL4 유전자의 발현을 억제하는 단계를 포함하는 웅성불임 벼의 제조방법, 모본인 OsAGPL4 유전자의 발현이 억제된 벼(T1) 및 부본인 웅성 가임의 벼(T1)와 교배시키는 단계를 추가로 포함하는 웅성불임 계통 벼(T2)의 제조방법, OsAGPL4 유전자의 발현을 억제하는 제제를 포함하는 벼의 웅성불임 유도용 조성물, OsAGPL4 유전자의 발현이 억제된 웅성불임 벼, OsAGPL4 유전자 발현여부를 판단하는 단계를 포함하는 벼의 웅성불임성을 확인하는 방법, OsAGPL4 유전자의 발현이 억제된 웅성불임 계통 벼에서, OsAGPL4 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 벼의 임성 회복 방법, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 OsAGPL4 유전자를 포함하는 벼의 임성 회복용 조성물, 및 후보물질을 처리한 벼에서 OsAGPL4 유전자의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는, 벼의 웅성불임 유도제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

벼는 국내는 물론 전 세계의 3분의 1이상의 나라에서 주식으로 삼고 있는 쌀의 생산식물로서 경제적으로 중요한 농작물 중 하나이다. 이 작물의 생산량 증대를 위해 웅성불임 도입을 통한 F1 하이브리드 생산은 모든 세계 연구자가 주목하고 있는 기술개발이다. 벼에서도 세포질웅성불임(CMS) 방식이 가능하나 생산비용이나 실제로 이용면에서는 현실적이지 못하고 유전자 조작에 의한 웅성불임 형질전환체 개발 방식에는 타페튬(tapetum) 특이적 프로모터를 이용하면서 외부 독성유전자(박테리아 또는 식물체 유전자)를 이용하여 선택적인 수술조직의 사멸을 유도함으로써 웅성불임을 만드는 방법이 이용되고 있다.

수술은 꽃 식물의 웅성 생식기관으로 타페튬, 엔도세시움(endothecium), 결합조직, 관다발 조직 등의 다수 조직으로 구성되며 꽃가루의 생산을 담당한다. 수술의 발달과정은 수술의 형태가 확립되고 마이크로스포어(microspore) 모세포가 감수분열하여 테트라드의 마이크로스포어를 형성하는 제1기와, 꽃가루와 수술이 분화되고 조직 퇴화, 열개(dehiscence) 및 꽃가루 방출이 일어나는 제2기로 구분되는데, 이러한 발달과정에 관여하는 다양한 유전자 중 일부만이 수술 특이적으로 발현된다.

그 예로서 대한민국 공개특허 제2005-0075170호(이하 이를 ‘특허문헌 1’이라 칭함)는 ‘벼 수술 특이적 발현 시스테인 프로테아제 유전자, 상기 유전자의 수술 특이적 발현 프로모터, 상기 유전자의 발현 억제를 이용한 웅성불임 도입벼의 생산방법’에 관한 것이다. 상기 특허문헌 1에서는 시스테인 프로테아제 유전자가 수술 특이적으로 발현됨에 관한 내용이 개시되어 있으며, 이로 인해 상기 시스테인 프로테아제 유전자를 이용하여 웅성불임 벼의 제조가 가능함이 개시되어 있습니다.

또한 대한민국 공개특허 제2009-0069397호(이하 이를 ‘특허문헌 2’라 칭함)는 ‘불투명 심백배유 발현과 웅성불임을 유발시키는 다면발현성을 갖는 식물체의 ＵＧＰａｓｅ１ 유전자’에 관한 것이다. 상기 특허문헌 2에서는 ＵＧＰａｓｅ１ 유전자가 벼의 웅성불임에 관여하는 내용이 개시되어 있다.

이러한 특허문헌 1 및 특허문헌 2에 개시된 유전자 이외에도 많은 유전자가 벼에서 발현될 것으로 예상되나, 이에 관여하는 유전자는 아직 소수의 유전자만이 발견된 실정이다.

또한 대한민국 등록특허 제0780486호(이하 이를 ‘특허문헌 3’이라 칭함)에는 ‘벼 OsAGPL1 유전자, OsAGPL3 유전자 또는 OsAGPL4 유전자 및 상기 유전자로 형질전환된 식물’에 관한 것이다. 상기 특허문헌 3에서는 상기 OsAGPL4 유전자로 웅성불임의 유도가 가능함에 관하여는 어떠한 개시 또는 암시조차 되어 있지 않다.

그러므로 보다 다양한 유전자가 벼에서 발현됨을 발견하고, 이를 벼의 웅성불임에 도입하는 것이 가능함에도 불구하고, 이에 관한 연구는 현재 많이 부족한 실정이다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 벼에서 발현하는 유전자를 발견하고, 이를 웅성불임에 도입하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 벼에서 발현하면서 화분 발달에 관여하는 OsAGPL4 유전자를 확인하고, 이를 이용하여 웅성불임이 유도된 벼를 제조하는 것이 가능함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

특허문헌 1: 대한민국 공개특허 제2005-0075170호 특허문헌 2: 대한민국 공개특허 제2009-0069397호 특허문헌 3: 대한민국 등록특허 제0780486호

본 발명의 주된 목적은 벼에서 OsAGPL4 유전자의 발현을 억제하는 단계를 포함하는 웅성불임 벼의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 모본인 OsAGPL4 유전자의 발현이 억제된 벼(T1), 및 부본인 웅성 가임의 벼(T1)와 교배시키는 단계를 추가로 포함하는 웅성불임 계통 벼(T2)의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 OsAGPL4 유전자의 발현을 억제하는 제제를 포함하는 벼의 웅성불임 유도용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 OsAGPL4 유전자의 발현이 억제된 웅성불임 벼를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 OsAGPL4 유전자 발현여부를 판단하는 단계를 포함하는 벼의 웅성불임성을 확인하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 OsAGPL4 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 벼의 웅성 불임성 확인용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 OsAGPL4 유전자의 발현이 억제된 웅성불임 계통 벼에서, OsAGPL4 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 벼의 임성 회복 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 OsAGPL4 유전자를 포함하는 벼의 임성 회복용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 후보물질을 처리한 벼에서 OsAGPL4 유전자의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 벼의 웅성불임 유도제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 웅성불임이 유도된 벼를 제조하기 위하여 다양한 연구를 수행하던 중, OsAGPL4이 화분 발달에 관여하는 유전자임을 확인하고, OsAGPL4 유전자의 발현을 억제하여 웅성불임 벼를 제조할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

이처럼 벼에서 OsAGPL4 유전자의 발현을 억제하여 웅성불임 벼의 제조가 가능하다는 사실은 지금까지 전혀 알려지지 않았고, 본 발명자에 의하여 최초로 규명되었다.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 벼에서 OsAGPL4 유전자의 발현을 억제하는 단계를 포함하는, 웅성불임 벼의 제조방법을 제공한다.

상기 웅성불임 벼의 제조방법은 벼에서 OsAGPL4 유전자의 발현을 억제시켜 화분 생성양을 감소시켜 벼의 웅성불임을 유도하는 것이다.

본 발명에서 용어 “벼”는 학명이 Oryza sativa L.이며, 일년생 초본식물이고, 본 발명에서의 벼에는 자포니카(Japonica)형, 인디카(Indica)형 및 자바니카(Javanica)형으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

본 발명에서 용어, “OsAGPL4”는 서열번호 1로 표시되는 유전자를 의미할 수 있으나, 이와 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석될 수 있다. 상기 실질적인 동일성은 서열번호 1의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 더욱 구체적으로 70%의 상동성, 더더욱 구체적으로 80%의 상동성, 가장 구체적으로 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 또는 상기 유전자는 서열번호 1의 유전자가 코딩하는 단백질 OsAGPL4과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 코딩하는 유전자를 의미할 수 있다.

본 발명에서 용어, “웅성불임”은 웅성기관의 형태적 또는 기능적 이상 때문에 수분, 수정, 종자현상이 이루어지지 않는 현상을 의미하며, 환경적인 일시적 변이로서 발현하는 경우와 유전형질로서 발현하는 경우가 있으나, 본 발명에서의 웅성불임은 유전형질로서 유도되는 것일 수 있다. 특히, 본 발명에서의 웅성불임은 화분 생산에 관여하는 핵의 OsAGPL4 유전자의 발현을 억제하여 유도되는 것일 수 있다.

본 발명에서 상기 단계는 OsAGPL4 유전자의 1 이상의 일부 염기를 치환 또는 결실하여 이루어지는 것일 수 있다. 예를 들어 전장 DNA 중 10%, 구체적으로는 0.01% 이상의 염기를 치환 또는 결실하여 이루어지는 것일 수 있다.

또한 상기 단계는 T-DNA 삽입에 의해 이루어지는 것일 수 있다. 본 발명에서의 T-DNA는 OsAGPL4 유전자의 인트론 또는 엑손에 삽입되는 것일 수 있다. 예를 들어 상기 T-DNA 삽입 벼의 T2 자손에 대한 유전자형 분석결과에 따르면 다음 세대에 동일-분리(co-segregation)되며, OsAGPL4 유전자에 T-DNA가 삽입된 돌연변이체 중 동형접합체를 포함하는 식물은 화분 발달에 있어 전체적으로 심각한 지연을 보이면서 웅성불임 벼가 제조될 수 있다. 즉, 상기 웅성불임 벼는 비정상적인 화분 발달을 보여, 수술이 매우 적은 수의 화분을 포함하고 있을 수 있다. 또한 본 발명에서 상기 T-DNA가 OsAGPL4 유전자에 삽입되는 위치는 특별한 제한이 있는 것은 아니며, 구체적인 일 실시예에 의하면 9번째 엑손에 삽입되는 것일 수 있다(도 2). 또한 본 발명의 일 실시예에 의하면 CRISPR/CAS 방법을 이용하여 OsAGPL4 돌연변이체를 제작하는 것이 가능한데, 본 발명의 일 실시예에서는 4번째 엑손에 1 또는 2개의 염기서열이 삽입되는 것일 수 있다(도 2).

또한 상기 단계는 T-DNA와 같은 식물 게놈내 삽입이 가능한 외래 유전자 외에도, TOS17과 같은 내생 트랜스포존을 이용하거나 엑스레이(X-ray)나 감마레이(gamma-ray) 등을 주사하여 돌연변이를 유발하거나, RNAi 또는 안티센스 방법을 이용하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

일예로 상기 방법은 모본인 OsAGPL4 유전자의 발현이 억제된 벼, 및 부본인 웅성 가임의 벼와 교배시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이와는 반대로 부본이 OsAGPL4 유전자의 발현이 억제된 벼, 및 모본인 웅성 가임의 벼와 교배시키는 단계를 추가로 포함하게 되면 웅성불임의 벼를 제조할 수 없다.

다른 양태로서, 본 발명은 모본인 OsAGPL4 유전자의 발현이 억제된 벼(T1), 및 부본인 웅성 가임의 벼(T1)와 교배시키는 단계를 포함하는, 웅성불임 계통 벼(T2)의 제조방법을 제공한다.

상기 모본인 OsAGPL4 유전자의 발현이 억제된 벼(T1)와 부본인 웅성 가임의 벼(T1)를 교배시켜야 웅성불임 계통의 벼(T2)를 제조할 수 있으며, 이와 반대로 부본이 OsAGPL4 유전자의 발현이 억제된 벼(T1)와 모본인 웅성 가임의 벼(T1)를 교배시키는 경우에는 웅성불임 계통의 벼(T2)를 제조할 수 없다.

상기 교배에서 교배 방법은 가장 일반적으로 벼 교배 육종에 가장 많이 사용하는 절영법을 이용하여 진행한다.

다른 양태로서, 본 발명은 OsAGPL4 유전자의 발현을 억제하는 제제를 포함하는, 벼의 웅성불임 유도용 조성물을 제공한다.

상기 제제는 OsAGPL4 유전자 또는 mRNA에 직접 또는 간접적으로 결합하여 OsAGPL4 의 발현을 억제할 수 있는 물질을 의미한다.

예를 들어 상기 제제는 OsAGPL4 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 siRNA, shRNA, miRNA, 및 안티센스 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 즉, 상기 siRNA, shRNA, miRNA, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 OsAGPL4 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하여 OsAGPL4 단백질 합성을 위한 번역을 억제할 수 있다.

다른 양태로서, 본 발명은 OsAGPL4 유전자의 발현이 억제된, 웅성불임 벼를 제공한다.

상기 벼는 자포니카(Japonica)형, 인디카(Indica)형 및 자바니카(Javanica)형으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으며 모든 벼 품종에 적용 가능하다.

상기 벼의 웅성불임은 가역적인 것일 수 있다. 즉, 상기 웅성불임의 벼의 임성은 정상적인 OsAGPL4 유전자의 도입에 의해서 회복될 수 있다.

다른 양태로서, 본 발명은 OsAGPL4 유전자 발현여부를 판단하는 단계를 포함하는, 벼의 웅성불임성을 확인하는 방법을 제공한다.

상기 OsAGPL4 유전자의 발현여부를 판단하여 그 발현이 억제된 경우 벼의 웅성불임성을 확인할 수 있다.

상기 판단하는 단계는 상기 OsAGPL4 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하여 이루어지는 것일 수 있다.

상기 유전자의 mRNA 수준은 별도의 제제를 이용하여 측정할 수 있다. 상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 예를 들어 상기 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 상기 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시될 수 있다.

상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 방법은 RT-PCR, 정량 실시간 PCR(quantified real time PCR), 경쟁적 RT-PCR(Competitive RTPCR), 실시간 RT-PCR(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블럿팅(Northern blotting), DNA 칩 분석법일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 단백질의 수준은 별도의 제제를 이용하여 측정할 수 있다. 상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 예를 들어 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

상기 "항체"는 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질성 분자를 의미한다. 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있다. 뿐만 아니라, 인간화 항체 등의 특수 항체를 포함할 수도 있다. 아울러, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 될 수 있다.

상기 "앱타머"는 단일 가닥 올리고 뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 말한다. 상기 앱타머는 그 염기서열에 따라 다양한 3차원 구조를 가질 수 있으며, 항원-항체 반응과 같이 특정 물질에 대하여 높은 친화력을 가질 수 있다. 앱타머는 소정의 표적 분자에 결합함으로써 소정의 표적 분자의 활성을 저해할 수 있다. 본 발명의 앱타머는 RNA, DNA, 변형된(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 그 형태가 직쇄상 또는 환상(環狀)일 수 있으나 이들에 한정되지 않는다.

상기 단백질의 수준을 측정하는 방법은 웨스턴 블럿(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트 면역 전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학염색 법(immunohistochemical staining), 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence),

면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS(fluorescenceactivated cell sorter analysis) 및 단백질 칩 분석법(protein chip technology assay) 등의 방법을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

다른 양태로서, 본 발명은 OsAGPL4 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 벼의 웅성 불임성 확인용 조성물을 제공한다.

상기 제제는 상기 OsAGPL4 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 또는 프로브 일 수 있다.

상기 제제는 상기 OsAGPL4 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머 일 수 있다.

다른 양태로서, 본 발명은 OsAGPL4 유전자의 발현이 억제된 웅성불임 계통 벼에서, OsAGPL4 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는, 벼의 임성 회복 방법을 제공한다.

일예로 상기 단계는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 OsAGPL4 유전자를 포함하는 벡터를 벼에 형질전환시켜 벼의 임성 회복을 유도할 수 있다.

구체적으로, 상기 단계는 서열번호 1의 유전자와 액틴 프로모터, 사이토크롬 C, 유비퀴틴 프로모터 (ubiquitin(ubi) promoter (Pubi)) 등과 같은 식물에서 작용가능한 강프로모터를 작동가능하게 연결키거나, 적절한 위치에 인핸서와 서열번호 1의 유전자를 포함하는 DNA 단편을 삽입하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

다른 양태로서, 본 발명은 OsAGPL4 유전자를 포함하는, 벼의 임성 회복용 조성물을 제공한다.

상기 OsAGPL4 유전자는 서열번호 1로 표시되는 유전자를 의미할 수 있으나, 이와 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석될 수 있다. 상기 실질적인 동일성은 서열번호 1의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 더욱 구체적으로 70%의 상동성, 더더욱 구체적으로 80%의 상동성, 가장 구체적으로 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 또는 상기 유전자는 서열번호 1의 유전자가 코딩하는 단백질 OsAGPL4과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 코딩하는 유전자를 의미할 수 있다.

다른 양태로서, 본 발명은 후보물질을 처리한 벼에서 OsAGPL4 유전자 또는 그의 단백질의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는, 벼의 웅성불임 유도제의 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 발현양을 측정하는 방법은 상기한 것과 같다.

상기 방법은 상기 측정된 발현량이, 후보물질을 처리하지 않은 벼의 발현량에 비하여 감소한 경우, 상기 후보물질은 벼의 웅성불임 유도제로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 웅성불임 벼의 제조방법은 벼에 유전자인 OsAGPL4 유전자의 발현을 억제하여 웅성불임 벼를 제조하는 것이 가능하다. 이를 통해 웅성불임 벼를 유도하는 것이 가능하며, 웅성불임 벼의 제조가 가능한 신규 유전자를 발견하였기 때문에 보다 다양한 방법으로 웅성불임 벼를 생산하는 것이 가능하게 되었다. 본 OsAGPL4 유전자 활성을 조절한 웅성불임 계통의 경우 환경의 영향을 거의 받지 않고 안정적으로 이용할 수 있기 때문에 세포질 유전자적 웅성불임 계통과 온도 및 일장감응성 핵 유전자 웅성불임 계통을 대체할 것으로 기대된다.

도 1은 ADP-glucose pyrophosphorylase Large subunit의 발현 양상을 통해서 4개의 ADP-glucose pyrophosphorylase Large Subunit 유전자 중 OsAGPL4가 화분 발달의 전체 단계 중 후기에만 특이적으로 발현하는 것을 확인한 전기영동사진이다.
도 2는 OsAGPL4 기능 상실 돌연변이체들의 T-DNA 삽입 위치 및 CRISPR/CAS 방법으로 유도한 돌연변이 발생 모식도이다.
도 3은 (a)는 야생형, (b)는 OsAGPL4 heterozygote, (c)는 osagpl4 -2 homozygote (d)는 osagpl4 -3 homozygote의 요오드 염색 결과를 보여주는 사진이다. 또한 사진 안쪽에 삽입된 사진은 꽃가루 핵 염색 결과이며, 흰 화살표는 generative nucleus, 붉은 화살표는 vegetative nucleus 이다.
도 4는 야생형, osagpl4 -2/ osagpl4 -2 및 osagpl4 -3/ osagpl4 -3의 ADP-glucose pyrophosphorylase 활성을 측정한 것이다.
도 5는 야생형, osagpl4 -2/ osagpl4 -2 및 osagpl4 -3/ osagpl4 -3의 성숙한 화분을 수집하여 전분의 함량을 측정함으로써, ADP-glucose pyrophosphorylase 활성을 측정한 것이다.

이하 본 발명을 하기 예에 의해 상세히 설명한다. 다만, 하기 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 하기 예에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 재료 및 방법

<실시예 1-1: 식물재료>

온실 재배 자포니카(japonica) 벼(품종명: 동진벼) 야생형 및 돌연변이체를 실험에 사용하였다. 벼를 온실에서 명암주기가 14/10 이고 습도가 대략 80% 조건에서 낮에는 30℃로, 밤에는 20℃의 온도에서 재배하였다. RT-PCR을 위하여 야생형 벼로부터 꽃밥(anther)을 각각 다른 발달 단계에서 회수하였다.

<실시예 1-2: RT-PCR 분석>

전장 RNA는 Trizol 시약을 사용하여 추출하였다. 그리고 역전사는 iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 수행하여 전장 RNA로부터 1가닥 cDNA를 합성하였다. 벼 유비퀴틴5(ubiquitin 5; OsUBQ5, LOC_Os01g22490) 유전자는 cDNA의 상대적인 양을 정량하기 위해 내부 대조군으로서 증폭되었다. 상기 프라이머들은 게놈 DNA 혼입을 배제하기 위하여 각 유전자의 적어도 하나의 인트론을 포함하는 부위 안에서 디자인되었다. 표 1은 RT-PCR에 사용된 프라이머 서열을 나타내는 것이다.

		서열	서열번호
OsAGPL1	Forward	TTCCTTTTCTTGATCTCTCTTCTA	서열번호 2
OsAGPL1	Reverse	CTCCTGACAAGATTAAAATGTGTT	서열번호 3
OsAGPL2	Forward	AGAGGTTGATGGAAAGATTGAATA	서열번호 4
OsAGPL2	Reverse	CTGATCTCCACACAAGATTACAAC	서열번호 5
OsAGPL3	Forward	GCTAATAAACCAATGTACACATCA	서열번호 6
OsAGPL3	Reverse	GATGACTAATCCATCTGCAATTAT	서열번호 7
OsAGPL4	Forward	GATATGGGAACTTTTGGTTTG	서열번호 8
OsAGPL4	Reverse	TGCAGTTTTCTACTTTCGTTG	서열번호 9
OsUBQ5	Forward	GACTACAACATCCAGAAGGAGTC	서열번호 10
OsUBQ5	Reverse	TCATCTAATAACCAGTTCGATTTC	서열번호 11

<실시예 1-3: osagpl4 T-DNA 삽입 돌연변이체의 제작>

osagpl4 -1 돌연변이 대립유전자를 벼 T-DNA 삽입 시퀀스 데이터베이스(Jeon et al., 2000; An et al., 2003; Jeong et al., 2006; http://www.postech.ac.kr/life/pfg/risd/index.html)로부터 확인하였다. 게놈 DNA는 간단한 mini-prep(Chen and Ronald, 1999) 방법을 사용하여 벼의 어린 잎으로부터 분리하였다. 화분을 정교한 파이펫의 팁을 이용하여 현미경 하에서 옮겼다. 그리고 이의 게놈 DNA 템플릿으로 활용하기 위해 PCR 튜브에서 작은 막대를 사용하여 분쇄하였다. T-DNA 삽입으로 인한 유전자형은 osagpl4 -1에 대한 LF1/LR1 및 LR1/G1 프라이머 세트를 사용하여 게놈 DNA PCR 분석에 의해 결정하였다. 상기 사용된 프라이머들의 서열은 표 2에 표시되었다.

프라이머 이름	서열	서열번호
LF1	TGCATATGTTAAATCATCCACGGTTTTAT	서열번호 12
LR1	ACCAATAACAGAGCGATCAACACTACATT	서열번호 13
G1	ATCCAGACTGAATGCCCACA	서열번호 14

<실시예 1-4: 역교배>

역교배를 위해, OsAGPL4 / osagl4 - 1를 자포니카 cv. Ilpum 야생형 벼와 교배하였다. 교배된 계통의 유전자형은 상기 T-DNA 삽입을 위해 사용한 프라이머와 동일한 프라이머 세트(표 2)를 사용하여 PCR 함으로써 결정하였다.

<실시예 1-5: CRISPR/Cas을 사용한 OsAGPL4 돌연변이의 제작>

효과적인 프로토스페이서 근접 모티프(PAM, protospacer adjacent motif)을 발견하고, off-target을 회피하기 위해, 본 발명자들은 CRISPR 다이렉트 프로그램(Naito et al., 2015; http://crispr.dbcls.jp/)을 사용하여 가능한 표적 서열을 스크리닝하였다. 디자인된 가이드 RNA(5’-GCAGTTCCTGTGGCTATTTG-3’, 서열번호 15)를 GatewayTM 시스템(Miao et al., 2013)을 사용하여 시작 벡터인 pOs-sgRNA로 클로닝시키고, pH-Ubi-cas9-7 최종 벡터로 클로닝시켰다. 이의 결과물인 벡터로 Agrobacterium 매개(Jeon et al., 2000)에 의해 자포니카 벼 cv. Dongjin을 형질전환시켰다. 형질전환 식물의 목표 PAM 위치의 서열을 확인하였다. 이러한 CRISPR/Cas를 이용하여 OsAGPL4의 4번째 엑손에 1개 또는 2개의 염기서열이 삽입된 돌연변이체들은 각각 osagpl4-2 또는 osagpl4-3으로 각각 명명하였다.

<실시예 1-6: 전분의 측정>

벼 잎 100㎎과 화분을 포함할 정도로 성숙한 꽃밥 3㎎은 각각 12주 연령의 벼 및 벼의 성숙한 꽃으로부터 분리하였다. 비용해성인 전분을 에탄올 불용분획에서 NAD(P)H 결합 효소 테스트 (Lee et al., 2008)을 사용하여 측정하였다. 상기 측정된 대사물질의 함량은 수취한 잎의 무게를 기준으로 정규화하였다.

<실시예 1-7: AGP 활성의 측정>

화분(3 mg)이 포함된 꽃밥을 50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 5% 글리세롤, 5 mM EDTA, 5 mM DTT, 1 x 단백질가수분해효소 억제제 및 1 mM PMSF를 포함하는 100㎕의 용균 버퍼에 재현탁시켰다. 이러한 샘플은 4℃, 5분의 시간 동안, 1,000g에서 원심분리하여 튜브 바닥에 수집하였다. 수집된 샘플은 그 후 얼음위 1.5 mL의 튜브 안에서 막자를 활용하여 분쇄하였다. 그리고 Sonic Dismembrator(Model 100, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA,)를 사용하여 5초 동안 2번 초음파 처리하였다. 용해된 단백질은 15,000 g에서 10분 동안, 4°C의 온도로 원심분리에 의해 수득하였다. 그리고 이를 효소 활성 분석에 사용하였다. AGP 활성은 Hwang et al.(2007)에서 기술된 바와 같이 전분 합성(ADP-Glc formation)을 통해 직접 측정하였다. 구체적으로 상기 반응은 30℃에서 40분 동안 100 mM HEPES-NaOH (pH 8.0), 5 mM DTT, 10 mM MgCl₂, 2 mM ATP, 5 mM 3-phosphoglycerate, 0.15 units/reaction inorganic pyrophosphatase (Sigma), 0.4 mg/mL BSA, 2 mM [14C] Glc-1-P (517 dpm/nmol)를 포함하는 용액 0.1 mL에서 수행하였다. [¹⁴C] ADP-Glc 형성물은 Tri-Carb 2100TR Liquid Scintillation Counter(PerkinElmer, Boston, MA, USA)를 사용하여 측정하였다.

<실시예 1-8: 화분 염색 및 광학 현미경분석>

화분의 핵을 염색하기 위하여, 화분을 65℃에서 1시간 동안 4 ng/mL Hoechst 33342(Sigma, St. Louis, MO, USA)를 포함하는 포스페이트-버퍼 식염수에서 배양하였다. 화분내 전분은 10 % (v/v) Lugol 용액(Sigma)으로 염색하였다. 핵 및 전분이 염색된 화분은 각각 Olympus BX61 현미경으로 UV 및 백색광 하에서 모니터링하였다.

<실시예 1-9: 투과전자현미경(Transmission electron microscopy) 분석>

발달과정 중 성숙단계에서의 화분을 3% glutaraldehyde를 포함하는 인산염 버퍼에 고정시켰다. 그 후 2% osmium tetroxide를 사용하여 후속 고정시켰다. 탈수 후 샘플을 Spurr의 저점성 포매 혼합물에 위치시켰다. 얇은 절편(40?60 nm 두께)을 2.5% 우라닐 아세테이트 및 2.5% 구연산 납염 수용성 용액으로 염색시켰다. 그리고 이를 전자현미경(Tecnai G2 Spirit (FEI Co., Hillsboro, OR, USA))을 이용하여 관찰하였다.

실시예 2: 벼 유래 OsAGPL4 유전자의 화분 발달 단계 별 발현 분석

상기 실시예 1-2와 같이 RT-PCR을 수행한 후, 이에 의해 합성된 DNA를 화분 발달 단계별로 관찰하였다. ADP-glucose pyrophosphorylase Large Subunit 유전자들의 발현을 화분 발달 단계, 즉 전분이 합성되는 발달 단계 후기에만 발현양이 특히 향상하는 것을 확인할 수 있었으며, 이러한 결과는 Genevestigator database의 결과와 일치하는 것임을 확인하였다(도 1). 이는 OsAGPL4가 화분 합성에 중요할 수 있다는 것을 시사하는 것이다.

실시예 3: OsAGPL4 돌연변이체 제작

실시예 1-3 및 실시예 1-5의 방법을 이용하여 OsAGPL4 돌연변이체 제작 준비를 하였다. 이와 같은 제작 준비 후, 벼의 OsAGPL4에 T-DNA를 삽입하여 야생형 OsAGPL4 유전자의 기능을 상실시킨 1개의 OsAGPL4 돌연변이체를 제작하였으며, 이를 osagpl4-1이라 명명하였다. 또한 CRISPR/Cas를 이용하여 OsAGPL4의 4번째 엑손에 1개 또는 2개의 염기서열이 삽입된 돌연변이체들은 각각 osagpl4 -2 또는 osagpl4-3으로 각각 명명하였다(도 2). 이중 T-DNA 삽입은 구체적으로 Ti 플라스미드 바이너리 벡터(binary vector) pGA2144 (Jeon et al., The Plant Journal (2000) 22(6), 561-570)와 벼 세포(동진벼의 종자에서 유도된 캘러스)를 공배양시켜 T-DNA를 식물체 내로 삽입시켰다. osagpl4 -1은 9번째 엑손에 T-DNA 삽입을 포함한다.

실시예 4: OsAGPL4 돌연변이체를 포함한 웅성불임 계통 벼(T2)의 제조

상기 실시예 3에 의해 제조된 OsAGPL4 돌연변이체(T1)을 자가수분시켜 T2 자손을 생성하였다. 그 결과 야생형(WT):이형접합(heterozygote):동형접합(hemozygote)의 비율이 정상적인 분리비인 1:2:1로 나타나지 않고 1:1:0으로 나타났다. 이는 전형적인 불임 계통의 후대 유전형 분리이므로, OsAGPL4가 불임을 유발하는 기능을 가질 것으로 예측하였다. 표 3은 T2에서 관찰된 비율(%) / 예측된 비율(%) 및 관찰된 식물수 / 예측된 식물 수를 나타내는 것이다.

T1	T2
	관찰된 비율(%) / 예측된 비율(%) 관찰된 식물수 / 예측된 식물 수
OsAGPL4 / osagpl4 -1	OsAGPL4 / OsAGPL4	OsAGPL4 / osagpl4 -1	osagpl4 -1/ osagpl4 -1
	48.5 / 25 50 / 103	51.5 / 50 53 / 103	0 / 25 0 / 103

실시예 5: OsAGPL4 / osagpl4 웅성불임 표현형 검증

OsAGPL4 / osagpl4 계통의 웅성불임 표현형 검증을 위하여 실시예 1-4에 의해 역교배를 수행한 이후, 후대 종자의 유전형을 확인한 결과, 부본이 OsAGPL4/osagpl4 이고 모본이 OsAGPL4 / OsAGPL4 인 경우에는 후대에 돌연변이 유전형이 나타나지 않았다. 반면, 부본이 OsAGPL4 / OsAGPL4 이고 모본이 OsAGPL4/osagpl4인 경우에만 야생형(WT):이형접합(heterozygote):동형접합(hemozygote)의 비율이 웅성불임 계통의 분리비인 1:1:0의 분리비를 보이는 것을 확인할 수 있었다(표 4). 이에 따라 OsAGPL4 유전자는 웅성불임을 유도하는 기능을 나타냄을 확인하였다.

역교배 대상		역교배 결과
부본	모본	관찰된 비율(%) / 예측된 비율(%)) 관찰된 식물수 / 예측된 식물 수
OsAGPL4 / osagpl4 -1	OsAGPL4 / OsAGPL4	OsAGPL4 / OsAGPL4	OsAGPL4 / osagpl4 -1
		100 / 50 87 / 87	0 / 50 0 / 87
OsAGPL4 / OsAGPL4	OsAGPL4 / osagpl4 -1	OsAGPL4 / OsAGPL4	OsAGPL4 / osagpl4 -1
		48.4 / 50 45 / 93	51.4 / 50 48 / 93

한편, osagpl4 -1 계통은 자가수정으로 동형접합체를 생산하지 못하는 반면, CRISPR/CAS 방법을 이용한 osagpl4 -2 또는 osagpl4 -3 계통은 형질전환 당대에서 동형접합체를 분리할 수 있었다. 이를 이용하여 OsAGPL4 / osagpl4 -1, osagpl4-2/osagpl4-2 및 osagpl4 -3/ osagpl4 -3 계통의 화분의 전분의 양을 요오드 염색한 결과, 야생형(도 3의 (a))은 모든 화분에서 많은 전분이 염색됐지만 OsAGPL4/osagpl4-1(도 3의 (b))계통의 화분은 50%의 화분만이 염색됐다. 또한 osagpl4-2/osagpl4-2(도 3의 (c)), osagpl4 -3/ osagpl4 -3(도 3의 (d))은 모든 화분이 염색되지 않은 것을 확인하였다(도 3). 이를 통하여 OsAGPL4 기능 상실 돌연변이체들은 화분의 전분 부족으로 인해 웅성불임 표현형을 나타냄을 확인하였다. 또한 도 4는 야생형, osagpl4 -2/ osagpl4 -2 및 osagpl4 -3/ osagpl4 -3의 ADP-glucose pyrophosphorylase 활성을 측정한 것이며, 도 5는 야생형, osagpl4 -2/ osagpl4 -2 및 osagpl4-3/osagpl4-3의 성숙한 화분을 수집하여 전분의 함량을 측정함으로써, ADP-glucose pyrophosphorylase 활성을 측정한 것이다. 그 결과 도 4를 통해 osagpl4-2/osagpl4-2 및 osagpl4 -3/ osagpl4 - 3는 야생형과 비교하여 각각 18.6% 및 23%로 ADP-glucose pyrophosphorylase 활성이 감소함을 확인하였다. 또한 도 5를 통해 osagpl4 -2/ osagpl4 -2 및 osagpl4 -3/ osagpl4 - 3는 야생형과 비교하여 약 65% 가량 전분 함량이 감소하는 것을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> Preparation method of male sterility rice using OsAGPL4 gene, composition for inducing male sterility of rice and male sterility rice <130> KPA161099-KR <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 6783 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 tcccctcccc tctcctactc cgccaccttc gcccttctag aaccttcccg cgtccgccaa 60 tggcgacctg ctcgtgggcc gccaccacgg cggcggcggc gcccccccgc ccgcccgcca 120 ggtgccgctc gcgcgtcgcc gcgctccgcc gcacggccgc cgcctccgcc gccgccgcca 180 gctgcgtcct cgccgaagcg cccaaggggc tcaaggtagg tggctggcta gctccgtgtt 240 cgcgcgtgcg cgcgtgcgtg cgtgttggga ttgcgtgagc tgatctcctg tgcgttgggt 300 gcggattcat tggtttggtt ttgtgttttg gtgtgccaag gtggagcagg cggatgcggt 360 cgagccagcg gcggcggcgg cggcgcggag ggacgtgggg ccggacacgg tggcgtccat 420 catcctcggc ggcggcgccg gcacgcgcct cttccctctc acgcggacca gggccaagcc 480 cgcggtaatc aaatcacatt atcctttctt tacagtgttt acacgcacat ttcgtcatgc 540 atttgataag catttcattg gttgtgtgca atagtgggga tttcggttgc 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1440 tagttagcag gactgtacat gctgtaattc ttcacagttt tagaagttta ctttttgtca 1500 cgctaatcat caatattact tgtgaatatc ataatattgt attgcaaatt aacaagtaga 1560 caatacacgt ggatttccat atttaattga tgggtcagat gatgacatac acctctcata 1620 tttttttaaa atttgtgtca tctacttgca gtcgagcttc tgattttgga ttgatgaaga 1680 ctgacaagaa tggacgcatt actgattttc tcgaaaagcc caaggatgaa agcttgaaat 1740 caatggtata tgcctcttca ctgaatcaaa gacaaatgaa tactaaaaat tatttgttta 1800 cacatgttta aactgaattg ttacctgaaa aaggtgtaaa atgaatgcat tccatcacct 1860 ttaattgcat atgttaaatc atccacggtt ttattcacaa ggcttttgtt ttgcttttgt 1920 gaatgttatc tagattattg gagatttgtt ctttatttct ttatcattag ctcaatttcc 1980 ttgatttatt ggctctaacg aataagtttt taaataatct aagatattta ttaatgcagc 2040 aactagatat gggaactttt ggtttgcgcc cagaagttgc agatacatgc aaatacatgg 2100 cttcaatggg aatatatgta ttcaggactg atatcttgtt aagacttcta aggtaaatgc 2160 taatgattaa gactaaggta aattctaatg ataatatctc atgagcaatg ctttccttaa 2220 tcttggaaac taggtttgca tgataaataa atgttccagt tgcattgtag ttttatcttc 2280 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Claims

벼에서 OsAGPL4 유전자의 발현을 억제하는 단계를 포함하는, 웅성불임 벼의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 단계는 OsAGPL4 유전자의 일부 염기를 치환 또는 결실하여 이루어지는 것인, 웅성불임 벼의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 단계는 T-DNA 삽입에 의해 이루어지는 것인, 웅성불임 벼의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 방법은 모본인 OsAGPL4 유전자의 발현이 억제된 벼, 및 부본인 웅성 가임의 벼와 교배시키는 단계를 추가로 포함하는, 웅성불임 벼의 제조방법.
모본인 OsAGPL4 유전자의 발현이 억제된 벼(T1), 및 부본인 웅성 가임의 벼(T1)와 교배시키는 단계를 추가로 포함하는, 웅성불임 계통 벼(T2)의 제조방법.
OsAGPL4 유전자의 발현을 억제하는 제제를 포함하는, 벼의 웅성불임 유도용 조성물.
제6항에 있어서,
상기 제제는 OsAGPL4 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 siRNA, shRNA, miRNA, 및 안티센스 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 벼의 웅성불임 유도용 조성물.
OsAGPL4 유전자의 발현이 억제된, 웅성불임 벼.
제8항에 있어서,
상기 벼의 웅성불임은 가역적인 것인, 웅성불임 벼.
OsAGPL4 유전자 발현여부를 판단하는 단계를 포함하는, 벼의 웅성불임성을 확인하는 방법.
OsAGPL4 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 벼의 웅성 불임성 확인용 조성물.
제11항에 있어서,
상기 제제는 OsAGPL4 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 또는 프로브인 것인, 조성물.
제11항에 있어서,
상기 제제는 상기 OsAGPL4 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머인 것인, 조성물.
OsAGPL4 유전자의 발현이 억제된 웅성불임 계통 벼에서, OsAGPL4 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는, 벼의 임성 회복 방법.
제14항에 있어서,
상기 단계는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 OsAGPL4 유전자를 포함하는 벡터를 벼에 형질전환시켜 이루어지는 것인, 벼의 임성 회복 방법.
서열번호 1의 염기서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 OsAGPL4 유전자를 포함하는, 벼의 임성 회복용 조성물.
후보물질을 처리한 벼에서 OsAGPL4 유전자의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는, 벼의 웅성불임 유도제의 스크리닝 방법.
제17항에 있어서,
상기 방법은 상기 측정된 발현량이, 후보물질을 처리하지 않은 벼의 발현량에 비하여 억제할 경우, 벼의 웅성불임 유도제로 판단하는 단계를 추가로 포함하는, 벼의 웅성불임 유도제의 스크리닝 방법.