KR20180073512A - Hla 동형접합체의 제대혈단핵구세포 유래 인간전분화능세포를 이용한 연골세포 분화용 조성물 제조방법 - Google Patents

Hla 동형접합체의 제대혈단핵구세포 유래 인간전분화능세포를 이용한 연골세포 분화용 조성물 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 동형접합체의 CBMC-hiPSCs을 이용하여 개인맞춤형 재생 의학에 새로운 전략을 제공할 수 있는 연골세포 분화용 조성물 제조방법, 이로부터 분화된 연골세포 및 상기 연골세포 분화용 조성물 또는 연골분화세포를 포함하는 연골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 연골세포 분화용 조성물 제조방법을 통해 제조된 연골세포 분화용 조성물 또는 연골세포는 HLA 동형접합체로서, 연골이식에 적합한 유형의 연골세포 마커 유전자의 발현 수준이 높으므로 연골 관련 질환의 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

HLA 동형접합체의 제대혈단핵구세포 유래 인간전분화능세포를 이용한 연골세포 분화용 조성물 제조방법{Method for making composition for differentiating into chondrocyte using HLA-Homozygous CBMC-derived iPSCs composition}
본 발명은 동형접합체의 CBMC-hiPSCs을 이용하여 개인맞춤형 재생 의학에 새로운 전략을 제공할 수 있는 연골세포 분화용 조성물 제조방법, 이로부터 분화된 연골세포 및 상기 연골세포 분화용 조성물 또는 연골분화세포를 포함하는 연골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
관절연골은 탄력있는 백색조직으로써, 뼈의 끝부분을 감싸고 있으며 마찰로부터 뼈를 보호한다. 관절연골은 탄력있는 백색조직으로써, 뼈의 끝부분을 감싸고 있으며 마찰로부터 뼈를 보호한다. 연골은 대부분 연골세포와 다량의 세포외기질(ECM; extracellular matrix)이 풍부한 다양한 종류의 콜라겐, 프로티오글라이칸 및 유연한 섬유로 이루어져 있다. 연골세포는 세포외기질 조성물을 생산한다. 또한 열공(lacuna)이라는 작은 공간에 갇혀있기 때문에 연골이 손상되고 나면 연골세포의 이주 및 회복이 어렵게 된다. 게다가 연골은 무혈관 조직이기 때문에 영양공급을 위한 혈관이 존재하지 않는다. 연골의 무혈관은 줄기세포의 이주를 방해하며, 조직의 재생력을 감소시킨다. 이러한 특징들은 손상된 연골들이 자연스럽게 치유되는 것은 거의 불가능함을 의미한다. 따라서 체외에서 세포외기질을 생산할 수 있는 기능적인 연골세포를 생산하거나 이식을 위해 완전히 성장한 연골을 얻는 것이 중요하다.
연골 복원은 골수유래 중간엽 줄기세포(bone marrow-derived mesenchymal stem cells; BMCSs) 또는 자신의 무릎관절로부터 분리한 연골세포를 이식함으로써 이루어진다. BMSCs와 자가연골세포는 본래 연골세포로 분화할 수 있는 잠재력이 있기 때문에 연골형성시 다양한 장점이 있다. BMSC는 상대적으로 수득하기 용이하며 이미 류마티스성 관절염과 골관절염 등의 다양한 질병들의 세포 치료용 조성물로서 널리 사용되고 있다. 다만 분화속도가 늦고 불안정한 표현형 때문에 복원에 제한이 있다. BMSC와 자가연골세포 모두 체외에서 3 내지 4일 후 고유의 특성을 잃는 성향이 있다. 또한 BMSC의 생산 및 분화능은 환자의 나이와 병의 상태에 따라 달라진다는 점이 보고되었다. 자가연골세포의 경우에는 수득하는 과정에서 무릎관절의 손상이 불가피하다. 따라서, 연골 복원을 위한 새로운 세포 근원지가 요구된다.
성공적인 연골 이식을 위해서는 유리질 연골을 생산하는 것이 중요하다. 유리질 연골은 유연한 유형의 연골인데 대부분 2형 콜라겐으로 이루어져 있다. 오랜 연구를 통하여 이식된 연골세포는 비대연골세포로 분화되는 경향이 있다는 것이 밝혀졌는데, 이는 유리질 연골 보다 섬유연골과 유사한 형태의 원인이 된다. 세포기반의 치료요법이 병원에서 흔히 사용되고 있어도 BMSC와 자가연골세포가 성숙한 인간의 연골을 성공적으로 보수할 수 있는지 여부는 입증되지 않았다. 골연골의 접목을 통한 성숙한 연골 이식은 세포기반 치료 외에 심각하게 손상된 연골을 치료하는 다른 방법이 될 수 있다. 골연골 접목의 장점은 유리질 연골의 이식이라는 점이다. 관절의 건강한 연골의 한 부분을 손상된 부분에 이식한다. 동종이계 연골 이식은 동종이식의 성공여부에 영향을 미치는 면역거부의 위험이 있다. 그러나 골연골 접합(모자이크형성술; mosaicplasty)은 건강한 공여부위와 이식상태를 조건으로 한다. 이러한 제한들은 여전히 연골 재생에서 중요한 논점이 되고 있으며 추가적인 연구가 요구되고 있다.
인간유래전분화능줄기세포(hiPSCs)는 재생의학의 대체적인 세포 근원지로서 조명을 받았다. hiPSC의 발견은 다양한 질병의 약물 스크리닝 및 기계적 연구에서 새로운 전략을 제공하였다. 게다가, hiPSC는 관절연골과 같이 재생력에 한계가 있는 손상된 조직을 대체하기 위한 잠재적으로 관련있는 세포의 근원이다. BMSC와 자가연골세포와는 달리 hiPSC은 자기재생 능력 및 연골세포를 포함한 표적세포로의 분화능 때문에 강하게 추천된다. 적절한 배양환경에서 hiPSC는 연골 재생에 사용될수 있는 대체 근원으로서 강력한 잠재력을 가진다.
지난 재프로그래밍 프로토콜에서, 진피섬유아세포는 iPSC 생산에 사용되었다. 아직까지는 폭넓은 적용을 위해 이런 세포들을 얻기 위한 외과적 생체검사 절차의 기회가 제한된다. 진피섬유아세포는 외부 환경에 노출됨으로 인한 높은 유전적 돌연변이가 있음이 보고되었다. 혈구세포가 재프로그래밍을 위한 대체제로서 추천되었다. 섬유아세포와 비교하였을 때, 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cells; PBMCs)가 상대적으로 가능하다. 재프로그래밍은 PBMC를 이용한 다양한 시도로 성공하였다.
본 연구에서는 CBMC 유래 인간 iPSC(CBMC-hiPSCs)를 사용하여 실험하였다. 최근, CBMC-hiPSC를 심장근육세포와 간세포로 성공적으로 분화시켰다[비특허문헌 1, 2, 3]. 이전 연구에서는 마이크로질량 배양을 통한 연골형성에서 CBMC-hiPSC의 잠재능을 보여주었다. 그러나 이전 연구에도 불구하고 CBMC-hiPSC의 연골세포로의 분화 및 연골 재생 가능성에 대한 연구는 여전히 요구되고 있다. CBMC-hiPSC로부터 생산한 연골세포 펠렛(pellet)는 임상의 재생의학에서 사용될 수 있다. 상기 목표를 달성하기 위하여 연골 재생은 CBMC-hiPSC를 이용한 펠렛 배양으로 시도되었다. 생산된 CBMC-hiPSC는 배양체(embryoid body; EB)로 응집되고 중간엽 유사 성장세포는 젤라틴 배지에서 배양체에 접촉함으로써 촉진되었다. 연골세포 펠렛은 EB 성장세포를 이용하여 생산하였다.
여기에서, 우리는 연골 유사 연골세포 펠렛을 CBMC-hiPSC로부터 생산하는 방법에 대한 특징을 보고할 것이다. 이는 미래의 연골 재생을 위한 잠재적인 세포 근원을 나타낼 것이다.
두번째로, 유도전분화능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSCs)는 화합물이나 유전적 요소의 조합으로 여러 세포 근원지에서 얻을 수 있다. 배아줄기세포(ESCs)처럼 iPSC은 체외에서 무궁무진하게 활용될 수 있으며 분화하지 않고 다분화능 상태로 보존될 수 있다. 이들의 자기재생능에 더불어 이런 다분화능 세포들은 다양한 세포로 분화할 수 있다. iPSC의 발달은 개개인의 맞춤형 줄기세포의 생산에 대한 새로운 가능성을 열었다. 맞춤형 iPSC는 세포-기관 치료법의 질병 모델링 및 재생의학에 대한 상당한 잠재력을 갖고 있다. 생산된 iPSC는 공여자와 일배체형인 사람 백혈구 항원(human leukocyte antigen; HLA)을 갖고 있다. 따라서, 같은 면역 독자성을 갖고 있으므로 iPSC는 면역거부 없는 자가이식을 위한 이상적인 물질로 고려된다. 맞춤형 줄기세포 기초 의학이 가능함에도 불구하고, 하나의 임상 수준의 iPSC를 제조하는 것은 시간과 인력이 소요되며 비싸다. 전체 분화 과정 역시 같은 수준의 임상 관리가 필요하다. 따라서, 상기 문제들은 맞춤형 iPSC의 상용화에 제한한다.
따라서, 최소의 세포라인으로 인구의 많은 부분을 커버할 수 있는 대체적인 시스템이 필요하다. 이 대체적인 시스템은 많은 환자들에게 사용되었을 때 동종이식 거부반응의 위험이 낮아야 한다. 성공적인 기관 및 조혈줄기세포 이식의 역사는 HLA 유전자의 중요성을 확고히 하였으며 이는 개인의 면역 독자성과 직접적으로 관련있다. 2005년에 HLA-동형접합한 개인으로부터 ESC를 분리하여 저장하는 것을 요구되는 세포라인을 줄이기 위하여 추천되었다. 이 저장 시스템은 공여자들로부터 오직 하나의 HLA-A, -B 및 DRB1 일배체형과 동형접합인 세포만을 요구한다. 이 세가지 유전자 부분집합은 HLA 위치 및 거부 가능성을 줄이는데 가장 중요하다. 이 전략은 iPSC 저장의 정착에 적용되었다.
최근에, 다양한 나라에서 인구의 최대범위를 커버할 수 있는 동형접합 iPSC은행을 설립하려는 시도를 하였다. 최근 연구에서 동형접합 iPSC 은행의 모델은 캘리포니아의 다민족 및 혼혈 인구를 커버할 수 있었다. 다섯 가계(흑인/아프리카계 미국인, 아메리칸 인디언, 아시아인/태평양 섬 주민, 히스페닉계 및 백인/비히스페닉계)의 일배체형의 다양한 조합을 기반으로, 인구의 일치확률을 계산하였다. 모든 시스(일배체형 수준) 및 트랜스(유전자형 수준) 일치를 고려하였을 때, iPSC 일배체형 은행과 수용체 개체군 사이의 자세한 계산이 반영되어 모델이 생성되었다. 일본에서는 일찍이 24000의 인구 중에서 50명의 공여자가 90.7%의 일본 인구를 커버할 수 있다는 계산이 있었다. 일본의 더욱 최근 연구에서는 인구의 90%를 커버하기 위해서는 140명의 공여자가 필요하다고 계산하였다. 그러나, 상기 목적을 달성하기 위해서는 160,000명의 일본 지원자들을 스크리닝 해야 했다.
이에 본 발명자들은, 가톨릭조혈모세포은행의 데이터를 이용하여 한국인(남한) 인구를 최대로 커버할 수 있는 동형접합 HLA-A, -B 및 DRB1 유형을 분류하였다. 임상 수준의 iPSC 생산을 위하여 공여자로부터 CBMC와 PBMC를 얻어 우수의약품제조관리기준에 따라 재프로그래밍 되었다. 이 연구는 조사 및 임상을 위해 대한민국 정부로부터 지원받아 이루어진, 대한민국 첫 번째의 동형접합 iPS 세포라인에 대한 보고이다.
Li Y, Liu T, Van Halm-Lutterodt N, Chen J, Su Q, Hai Y: Reprogramming of blood cells into induced pluripotent stem cells as a new cell source for cartilage repair. Stem Cell Research & Therapy 2016, 7:1-11. Pham TL, Nguyen TT, Van Bui A, Nguyen MT, Van Pham P: Fetal heart extract facilitates the differentiation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells into heart muscle precursor cells. Cytotechnology 2016, 68:645-658. 3Stecklum M, Wulf-Goldenberg A, Purfurst B, Siegert A, Keil M, Eckert K, Fichtner I: Cell differentiation mediated by coculture of human umbilical cord blood stem cells with murine hepatic cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim 2015, 51:183-191. Guzzo RM, Scanlon V, Sanjay A, Xu RH, Drissi H: Establishment of human cell type-specific iPS cells with enhanced chondrogenic potential. Stem Cell Rev 2014, 10:820-829. Nejadnik H, Diecke S, Lenkov OD, Chapelin F, Donig J, Tong X, Derugin N, Chan RC, Gaur A, Yang F, et al: Improved approach for chondrogenic differentiation of human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev 2015, 11:242-253. Guzzo RM, Gibson J, Xu RH, Lee FY, Drissi H:Efficient differentiation of human iPSC-derived mesenchymal stem cells to chondroprogenitor cells. J Cell Biochem 2013, 114:480-490.
이에 본 발명자들은 제대혈단핵구세포유래 hiPSC(cord blood mononuclear cell-derived hiPSC; CBMC-hiPSC)의 자기재생능력 및 다분화능을 확인하고, 이를 이용하여 연골의 재생에 사용될 수 있는 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 제대혈단핵구세포유래 인간전분화능세포(CBMC-hiPSC)로부터 배양체(embryoid body)를 이용한 연골세포 분화용 조성물 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 연골세포 분화용 조성물의 제조방법으로부터 제조된 연골세포 분화용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 연골세포 분화용 조성물로부터 분화된 연골세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 연골세포 분화용 조성물을 이용한 연골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 연골세포를 이용한 연골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 연골세포 분화용 조성물 제조방법을 제공한다:
ⅰ) 제대혈단핵구세포유래 인간전분화능세포(CBMC-hiPSC)로부터 배양체(embryoid body)를 형성 및 수득하는 단계;
ⅱ) 상기 단계 ⅰ)의 배양체로부터 성장세포(embryoid body-derived outgrowth cell)를 형성 및 수득하는 단계; 및
ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 성장세포를 배양하여 연골세포 펠렛(chondrogenic pellet)을 수득하는 단계.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 ⅰ)의 제대혈단핵구세포유래 인간전분화능세포(CBMC-hiPSC)는 제대혈단핵구세포(cord blood mononuclear cell)를 리프로그래밍하여 얻을 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 리프로그래밍은 제대혈단핵구세포에 Yamanaka 펙터를 포함하는 센다이(sendai) 바이러스를 처리하여 전분화능세포로 유도하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 단계 ⅱ)의 성장세포는 젤라틴 배지에 배양체를 도말하여 형성하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 젤라틴 배지의 1㎠당 50~70개의 배양체를 도말하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 단계 ⅰ)의 제대혈단핵구유래 인간전분화능세포는 HLA 동형접합체(homozygote)인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 HLA 동형접합체의 유형은 한국인의 HLA 동형접합체의 유형인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 한국인의 HLA 동형접합체의 유형은 HLA-A*33, HLA-B*44 및 HLA-DRB1*13로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 연골세포 분화용 조성물의 제조방법으로부터 제조된 연골세포 분화용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 연골세포 분화용 조성물은 ACAN, COL2A1, COMP 및 SOX9으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 유전자 발현이 증가되는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 연골세포 분화용 조성물은 COL1A1 또는 COL10의 유전자 발현 수준이 COL2A1의 유전자 발현 수준 보다 낮은 것일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 연골세포 분화용 조성물로부터 분화된 연골세포를 제공할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 연골세포는 ACAN, COL2A1, COMP 및 SOX9으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 유전자 발현이 증가되는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 연골세포는 COL1A1 또는 COL10의 유전자 발현 수준이 COL2A1의 유전자 발현 수준 보다 낮은 것일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 연골세포 분화용 조성물 또는 연골세포를 포함하는 연골관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 연골 관련 질환은 루마티스성 관절염, 골관절염, 골연화증, 연골손상 및 연골결손으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
따라서, 본 발명의 연골세포 분화용 조성물 제조방법을 통해 제조된 연골세포 분화용 조성물 또는 연골세포는 HLA 동형접합체로서, 연골이식에 적합한 유형의 연골세포 마커 유전자의 발현 수준이 높으므로 연골 관련 질환의 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 3개의 CBMC-hiPSC의 라인 특성에 관한 결과로서, (a)은 생성된 CBMC-hiPSC 라인의 형태학적 결과이고 (b)은 CBMC-hiPSC이 알칼라인 포스파타제로 염색된 것을 보여주는 결과이며, (c)는 CBMC-hiPSC 라인에서 다능성 마커의 상대적인 발현결과이고, (d)는 생성된 CBMC-hiPSC 라인의 면역 형광 염색을 보여주는 이미지 결과이다.
도 2는 CBMC-hiPSCs를 이용한 연골 형성 펠렛 생성결과로, (a)은 연골 펠렛 생성의 도식이고,(b)는 CBMC-hiPSC의 형태학적 결과이며, (c)은 생성된 EB의 형태학적 결과이고, (d)는 젤라틴 코팅 배양 접시에 부착된 EB에서 유래된 성장 세포 의 이미지 결과이며, (e)는 연골 펠렛의 이미지를 보여주는 결과이다.
도 3은 CBMC-hiPSC로부터 생성 된 연골 형성 펠렛의 유전학적 특성으로, 10일, 20일 및 30일 동안 연골 형성 펠렛에서 COL2A1, ACAN, COMP 및 SOX9의 발현 수준을 보여주는 결과이다(*, +p<0.05, **, ++p<0.01, ***, +++ p<0.001).
도 4은 CBMC-hiPSC 유래 연골 형성 펠렛의 조직학적분석 결과로서, 10일, 20일 및 30일에 사프라닌 O(safranin O), 알시안 블루(alcian blue) 및 톨루이딘 블루(toluidine blue)로 염색 한 펠렛 이미지을 보여주는 결과이다.
도 5은 BMC-hiPSC 유래 연골 형성 펠렛의 면역조직학적분석 결과로서, (a)은 2형 콜라겐 및 아그리칸(aggrecan)에 대한 항체로 염색된 다양한 시점에서 수확한 펠렛의 이미지를 보여주는 결과이고, (b)은 1형 콜라겐에 대한 항체로 염색 된 펠렛 이미지를 보여주는 결과이다.
도 6은 CBMC-hiPSCs와 MSCs에서 유래 된 연골 형성 펠렛의 유전자 마커에 대한 추가 분석결과로서, (a)은 다양한 시점에서 섬유화 연골 대표 유전자인 COL1A1과 비대성 마커 인 COL10의 발현수준을 보여주는 결과이고, (b)는 10일, 20일 및 30일에 COL2A1 및 COL1A1의 비율을 보여주는 결과이고, (c)는 30 일째에 BMSC 및 CBMC-hiPSC 유래 연골성 펠렛에서 ACAN, COMP, COL2A1, SOX9, COL1A1 및 COL10의 상대적 발현을 보여주는 결과이다(*, +p<0.05, **, ++p<0.01, ***, +++p<0.001).
도 7은 본 발명의 CBMC 유래 iPSC로부터 분화된 연골 세포와, 종래 기술에 의한 말초혈 세포(peripheral blood cell, PBMC) 유래 iPSC로부터 분화된 연골 세포에서 연골 형성 관련 인자인 ACAN 및 CLO2A1의 발현 수준을 비교한 결과이다.
도 8은 우수의약품제조관리기준(good manufacturing practice;GMP) 등급 동종 접합 인간 배혈구 항원(HLA) 유도 다능성 줄기세포를 확인한 결과로서, (a)는 전체 GMP 등급 iPSC 생성 과정의 모식도(인간 백혈구항원 (HLA) 유형을 스크리닝하고 선택된 HLA 유형의 세포를 GMP시설로 옮긴 후, 시설내에서 세포를 iPSC로 재프로그램 한 후, 특성 분석을 위해 다양한 분석법을 통과 한 후 세포주를 확립함)이고, (b)는 생성된 동종 접합 IPSCs의 면역형광법의 염색 결과이고, (c)는 역전사 중합 효소 연쇄 반응을 통한 다능성 마커를 확인한 결과이고, (d)는 알칼라인 포스파타아제 염색 이미지 및 positive iPSC 콜로니의 콜론 개수 결과이며, (e)는 생성된 iPSC의 정상 핵형 결과이며, (f) 3배엽으로 분화된 iPSC의 면역형광법 염색결과이다.
방법
CBMC의 분리
CBMCs는 서울 성모 병원의 제대혈 은행에서 획득했다. 제대혈을 인산완충 식염수 (PBS)로 희석하고 피콜농도구배(Ficoll gradient)를 통해 850 xg에서 30 분간 원심 분리 하였다. CBMC를 수집, 세척 및 동결시켰다. 사용하기 전에 냉동 CBMC를 해동시키고 CC110 사이토카인 칵테일(STEMCELL)이 보충 된 StemSpan 배지(STEMCELL Technological, Vancouver, British Columbia, Canada)에 재현 탁했다. 재프로그램하기 전에 세포를 5 % CO2, 37℃에서 5일 동안 유지시켰다.
혈액샘플 및 윤리규정
서울 성모 병원 가톨릭 대학교의 기관 검토위원회(The institutional Review Board(IRB) of the Catholic University of Korea)는 본 연구를 승인했다.
센다이바이러스(sendai virus)를 이용한 리프로그램 (reprogramming)
리프로그래밍(reprogramming)이란 포유류의 발달과정동안에 후성유전학적 표시(epigenetic marks)가 변화되는 과정을 의미한다. 일반적으로 유도만능줄기세포 리프로그래밍은 체세포에 리프로그래밍에 필요한 인자를 인위적으로 과발현시켜 만능줄기세포를 유도해내는 기술을 의미한다. 상기 유전자를 과발현시키는 방법으로는 바이러스, 플라스미드 벡터, mRNA, 단백질 등이 있다.
CBMC를 3x105 농도로 24-웰 플레이트(well plate)에 도말(seeding)하였다. CytoTune-iPS 센다이 리프로그램 키트를 사용하여 리프로그래밍을 유도했다. 감염은 3x105 세포 감염 단위당 7.5의 다중성 감염으로 수행되었다. 바이러스 성분을 첨가 한 후 세포를 1,160 xg에서 35 ℃의 조건으로 30 분간 원심 분리 한 후 5 % CO2, 37 ℃에서 배양 하였다. 다음날 세포를 비트로넥틴(vitronectin; Life Technologies)으로 코팅된 12-웰 플레이트로 옮기고 1,160 xg, 35 ℃에서 10 분 동안 원심 분리하여 침전시켰다. 원심 분리 후 TeSR-E8 배지(STEMCELL)를 1:1의 비율로 첨가 하였다. 리프로그램 된 세포는 일일 배지 교환으로 TeSR-E8 배지에서 유지 및 확장되었다.
알칼라인포스파타제 (alkaline phosphatase )의 염색
염색하기에 충분히 큰 콜로니를 얻기 위해 2x103 농도로 비트로넥틴이 코팅된 6웰 플레이트(well plate)에 접종하고 5일 내지 7일 동안 팽창시켰다. 미분화 iPSC 콜로니의 염색은 알칼라인 포스파타아제 검출 키트(alkaline phosphatase detection kit ; Millipore, Billerica, MA, USA)를 사용하여 수행하였다. 세포를 0.05% Tween-20를 포함하는 PBS로 세척하고 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 2분간 고정하였다. Fast Red Violet, 나프톨 AS-BI 인산염 용액 (Naphthol AS-BI phosphate solution) 및 물을 2: 1: 1 비율로 혼합하여 염색 시약을 제조하였다. 세포를 PBST로 2 회 세척 하였다. 염색 용액 혼합물을 실온 (RT)에서 15 분 동안 처리 하였다. 인큐베이션 후, 세포를 PBST로 세척하고 PBS로 덮어 건조를 방지 하였다. 염색된 콜로니를 현미경으로 측정하였다.
면역세포화학 염색
염색하기에 충분히 큰 iPSC 콜로니를 얻기 위해 2x103 농도로 비트로넥틴이 코팅된 6 웰 플레이트에 접종하였다. 매일 iPSC 콜로니를 유도하기 위해 배지를 5~7 일 동안 세포를 확장시켰다. 확장 후, iPSCs는 PBS로 세척하고 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정시켰다. 세포를 0.1 % triton X-100(BIOSESANG)을 사용하여 10 분간 투과시켰다. 침윤 후, 2 % 소혈청 알부민(BSA; Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 함유하는 PBS(PBA)로 실온에서 30분 동안 세포를 차단하였다. 일차 항체를 하기의 희석 비율로 PBA에 희석 하였다; OCT4(1/100; Santa Cruz, CA, USA), KLF4(1/250; Abcam, Cambridge, UK), SOX2(1/100; BioLegend, San Diego, CA, USA), TRA-1-60(1/100; Millipore), TRA-1-81(1/100; Millipore) 및 SSEA4(1/200; Millipore). 일차 항체를 실온에서 2 시간 동안 배양 하였다. Alexa Fluor 594-(1/400; Life Technologies) 및 488- 접합 2차 항체 (1/400; Life Technologies)를 PBA로 희석하고 빛을 피하면서 실온에서 1시간 동안 배양 하였다. 세포를 세척하고 ProLong Antifade 장착 시약(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 사용하여 장착 하였다. 면역 형광 현미경으로 염색된 콜로니를 검출 하였다.
CBMC - iPSC 시료를 이용한 폴리메라이제 (polymerase) 연쇄 반응
5x105 iPSCs를 수확하고 -20 ℃에서 동결시켰다. Total mRNA는 Trizol (Life Technologies)을 사용하여 추출하였고 Revert Aid TM First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 cDNA를 합성 하였다. 합성된 cDNA를 이용하여 역전사 효소 중합 반응을 수행 하였다. 프라이머 서열은 하기 [표 1]과 같다.
실시간 RT-PCR에 사용 된 전위 표지자에 대한 프라이머 서열
Target Name Direction Primer Sequence Size
OCT3/4 Forward ACCCCTGGTGCCGTGAA 190
Reverse GGCTGAATACCTTCCCAAATA
SOX2 Forward CAGCGCATGGACAGTTAC 321
Reverse GGAGTGGGAGGAAGAGGT
NANOG Forward AAAGGCAAACAACCCACT 270
Reverse GCTATTCTTCGGCCAGTT
LIN28 Forward GTTCGGCTTCCTGTCCAT 122
Reverse CTGCCTCACCCTCCTTCA
DPPB5 Forward CGGCTGCTGAAAGCCATTTT 215
Reverse AGTTTGAGCATCCCTCGCTC
TDGF1 Forward TCCTTCTACGGACGGAACTG 140
Reverse AGAAATGCCTGAGGAAAGCA
GAPDH Forward GAATGGGCAGCCGTTAGGAA 414
Reverse GACTCCACGACGTACTCAGC
핵형분석( Karyotyping )
세포를 80%정도가 될 때까지 배양하였다. 염색체 해상도 첨가제 (Genial Genetic Solutions, Runcorn, UK)를 각 웰에 첨가 하였다. 배양 후 colcemid®를 30분 동안 처리 하였다. 세포를 수확하고 미리 예열된 저장액으로 용액으로 처리 하였다. 아세트산과 메탄올 용액을 1:3의 비율로 혼합한 혼합물로 고정하였다. 슬라이드는 트립신김사 분염법(trypsin-Giemsa banding technique)을 사용한 염색체 분석을 위해 준비되었다.
iPSC의 기능별 식별(Functional identification of iPSCs )
인간의 다능성 줄기 세포 기능 확인 키트(R&D, Minneapolis, MN, USA)를 구입하여 3개 배엽의 분화능을 평가 하였다. 실험 하루 전에 Cultrex PathClear BME(R & D)를 제조사의 지침에 따라 배양 접시에 코팅했다. 각 배아 층에 특이적인 배지를 준비하고 세포를 개별 배양 하였다. 분화 후, 세포를 PBS로 세척하고 4% 파라포름알데히드로 고정시켰다. 0.3 % Triton X-100 및 1 % PBA로 45분 동안 투과성 및 차단하였다. Otx2(1/10, 외배엽), Brachyury(1/10 중배엽) 및 Sox17(1/10, 내배엽)에 대한 항체를 희석시켰다. PBA에 현탁시키고 3 시간 동안 실온에서 배양 하였다.
일차 항체를 세척 한 후, 알렉사 플루오르 568 당나귀 항-염소 2차 항체 (1: 200; R & D)를 PBA로 희석하고 1 시간 동안 배양 하였다. 세포를 PBA로 세척하고, DAPI 용액을 실온에서 10 분 동안 처리 하였다. 세포를 세척하고 PBS로 덮었다. 염색 결과를 형광 현미경을 사용하여 확인하였다.
EB 유래 성장 세포 유도 ( EB -derived outgrowth cell induction)
CBMC-hiPSC를 확장시키고 2 x 106 세포를 제조 하였다. 세포를 Aggrewell 배지(STEMCELL)에 재현 탁하고 100-mm 배양 접시에 도말 하였다. 세포를 5% CO2, 37℃에서 하루동안 배양 하였다. 다음날, 배지를 TeSR-E8 배지로 바꾸고 세포를 6일 동안 팽창시켜 유지시켰다. 팽창 과정 후 EB를 수확하고 20% 태아 소 알부민 (FBS)을 함유하는 DMEM에 재현 탁하고 젤라틴 코팅 접시에 놓아서 성장 세포 를 유도 하였다. 연골 분화 전에 일주일 동안 세포를 37 ℃에서 5% CO2로 유지시켰다.
EB 유래 성장 세포를 이용한 연골 분화 ( Chondrogenic differentiation using EB -derived outgrowth cells)
EB로부터 유래 된 성장 세포 를 세척하고 배양접시로부터 분리 하였다. 40㎛ 셀 스트레이너 (Thermo Fisher Scientific)를 통과시켜 세포 덩어리를 제거 하였다. 단일 성장 세포를 계수하고 펠렛 당 3 x 105세포를 제조 하였다. 3 x 105개의 성장 세포를 연골 분화 배지 (DMEM, 20% knockout serum replacement, 1x non-essential amino acids, 1mM L-glutamine, 1% sodium pyruvate, 1% ITS+ Premix, 10-7M dexamethasone, 50 ㎛ ascorbic acid, 40 ㎍/mL L-proline, supplemented with 50ng/mL human bone morphogenetic protein 2 and 10ng/mL human transforming growth factor beta 3)에서 배양 되었고, 코니칼 튜브(conical tube)에 옮겨 졌다. 세포를 750 xg에서 5 분간 원심 분리 하였다. 생성된 펠렛을 30일간 유지하고 매일 배양액을 교체하였다. BMSC는 양성 대조군으로 사용되었다.
연골형성 펠렛의 조직학적 분석
펠렛을 4% 파라포름알데히드를 이용하여 실온에서 2시간 동안 고정시켰다. 한 층의 거즈를 카세트에 놓고 펠렛을 거즈에 옮겼다. 탈수는 에탄올 용액으로 순차적으로 수행되었다. 탈수 용액은 등급이 매겨진 에탄올과 자일렌(zylene, 덕산 순수 화학, 안산, 한국) 혼합물로 제거하고 파라핀은 하룻밤 동안 침투시켰다. 다음날 펠렛을 파라핀 블록에 고정시키고 마이크로톰을 이용하여 7㎛ 절편을 얻었다. 슬라이드를 60 ℃에서 2시간 동안 건조하였다. 절편을 2 사이클의 자일렌(zylene)으로 탈파라핀화 하였다. 절편은 감소하는 순차적인 에탄올 시리얼로 재수화하였고, 수돗물로 5분 동안 세척하였다.
알시안 블루(alcian blue) 염색을 위해 절편을 1% 알시안 블루 용액에서 30분간 배양하였다. 그 후에, 슬라이드를 세척하고, 1분 동안 뉴클리어패스레드(nuclear fast red)로 대조 염색하였다. 사프라닌 O(Safranin O) 염색은 바이게르트철헤마톡실린(weigert's iron hematoxylin)에서 슬라이드를 10분 동안 배양함으로써 수행되었다. 슬라이드를 세척하고 0.1% 사프라닌(Safranin O) 용액에서 5분 동안 배양 하였다.
톨루이딘 염색을 위해서는 절편을 톨루이딘 블루 용액에서 4분 동안 배양하였다. 염색 공정 후, 절편을 세척하고 증가하는 순차적 에탄올 시리즈에 통과시켰다. 에탄올을 2 사이클의 자일렌으로 제거하고 슬라이드를 VectaMountTM PermanentMountingMedium(VectorLaboratories)을 사용하여 고정시켰다. 현미경으로 염색을 확인 하였다.
면역조직화학
절편을 60 ℃에서 2시간 동안 건조시키고, 2 사이클의 자일렌으로 탈파라핀화 시켰다. 절편은 감소하는 순차적인 에탄올 시리얼로 재수화하였고, 수돗물로 5분 동안 세척하였다. 항원 비마스킹(unmasking)은 구연산염 완충액에서 15분 동안 배양하고 20분 동안 냉각시킴으로써 유도 되었다. 냉각 된 절편을 탈 이온수(DW)로 2회 세척 하였다. 내인성 퍼옥시다아제의 활성은 DW로 10분 동안 희석 된 3 % 과산화수소에서 섹션을 배양함으로써 차단되었다. 절편을 DW로 두 번 세척 한 후, 0.1% 트윈-20(TBST)을 함유하는 트리스 완충 식염수(TBS)을 사용하여 추가로 세척 하였다. 절편을 1% BSA를 함유하는 TBS로 실온에서 20분 동안 차단시켰다. 차단 용액으로 희석 한 1 차 항체를 절편에 첨가하고 4℃에서 밤새 배양 하였다. 일차 항체는 다음의 비율로 희석 하였다; 1형 콜라겐(1/100, Abcam), 2형 콜라겐(1/100, Abcam) 및 아그리칸(1/100, GeneTex, Irvine, CA, USA). 음성 대조군 슬라이드는 항체가 없는 동일한 양의 차단 용액으로 처리 하였다. 다음날, 절편을 TBST에서 각각 3분 동안 3회 세척하고, 2차 항체(1/200)를 실온에서 40분 동안 배양하였다. 절편을 TBST 및 ABC 시약으로 세척하고 30분 동안 배양 하였다. 슬라이드를 TBST로 3회 세척하고, DAB 용액 (Vector Laboratories)을 1분 동안 적용 하였다. 절편은 색이 씻겨 질 때까지 DW로 씻어 냈다. Mayer의 헤마톡실린(Mayer's hematoxylin)을 카운터 염색을 위해 1 분 동안 절편에 적용 하였다. 절편을 세척하고 증가하는 순차적 에탄올 시리즈를 통과시켰다. 에탄올을 2 사이클의 자일렌으로 제거하고 VectaMountTM Permanent Mounting Medium (Vector Laboratories)을 사용하여 슬라이드를 장착 하였다. 밝은 시야 현미경으로 염색을 확인 하였다.
연골형성펠렛의 폴리메라이제 (Polymerase) 반응
10 개의 연골 형성 펠렛을 각 시점에서 수확하고 -80 ℃에서 동결시켰다. 샘플을 액체 질소로 급속 동결시키고 막자로 분쇄하였다. 그라운드 펠렛 샘플을 mRNA 추출을 위해 트리졸(Trizol)과 함께 배양 하였다. 추출 된 mRNA로부터 cDNA를 합성하고, 연쇄 세포 특이적 마커에 대한 프라이머로 중합 효소 연쇄 반응을 수행 하였다. RT-PCR의 프라이머 서열은 표 2에 제시되어있다. 실시간 PCR의 프라이머 서열은 하기 [표 3]과 같다. 3배 실험(triplicate experiments)으로부터 얻은 평균 사이클의 임계값은 내부대조로써 GAPDH을 평균화하기 위한 유전자 발현을 계산하기 위하여 사용되었다.
RT-PCR에서 연골성 마커에 대한 프라이머의 서열
Target Name Direction Primer Sequence Size
SOX9 Forward GAACGCACATCAAGACGGAG 631
Reverse TCTCGTTGATTTCGCTGCTC
ACAN Forward TGAGGAGGGCTGGAACAAGTACC 349
Reverse GAGGTGGTAATTGCAGGGAACA
COL2A1 Forward TTCAGCTATGGAGATGACAATC 472
Reverse AGAGTCCTAGAGTGACTGAG
COMP Forward CAACTGTCCCCAGAAGAGCAA 588
Reverse TGGTAGCCAAAGATGAAGCCC
COL1A1 Forward CCCCTGGAAAGAATGGAGATG 148
Reverse TCCAAACCACTGAAACCTCTG
COL10 Forward CAGTCATGCCTGAGGGTTTT 196
Reverse GGGTCATAATGCTGTTGCCT
GAPDH Forward GAATGGGCAGCCGTTAGGAA 414
Reverse GACTCCACGACGTACTCAGC
RT-PCR에서 연골 성 마커에 대한 프라이머의 서열
Target Name Direction Primer Sequence Size
SOX9 Forward TTCCGCGACGTGGACAT 77
Reverse TCAAACTCGTTGACATCGAAGGT
ACAN Forward AGCCTGCGCTCCAATGACT 107
Reverse TAATGGAACACGATGCCTTTCA
COL2A1 Forward GGCAATAGCAGGTTCACGTACA 79
Reverse CGATAACAGTCTTGCCCCACTTA
COMP Forward AGCAGATGGAGCAAACGTATTG 76
Reverse ACAGCCTTGAGTTGGATGCC
COL1A1 Forward CCCCTGGAAAGAATGGAGATG 148
Reverse TCCAAACCACTGAAACCTCTG
COL10 Forward CAGTCATGCCTGAGGGTTTT 196
Reverse GGGTCATAATGCTGTTGCCT
결과
분리된 CBMC를 이용한 hiPSC의 생성
CBMC의 재프로그래밍은 Yamanaka 팩터를 포함하고 있는 센다이 바이러스를 이용하여 촉진되었다. Yamanaka 팩터는 다분화능을 유도할 수 있는 유전자이다. 형질도입 후 시간이 지나고, CBMC-hiPSC는 배아줄기세포와 유사한 콜로니를 형성했다(도 1a). CBMC-hiPSC는 동일한 세포 형태를 가진 세포 라인으로 정제되었다. 동일한 CBMC-hiPSC는 추가적인 특징분석을 위해 사용되었다. 확정된 CBMC-hiPSC는 알칼리 인산염으로 염색되었다(도 1b). OCT4, SOX2, NANOG, LIN28, KLF4 및 c-MYC를 포함한 다분화능 마커들의 발현도 측정하었다(도 1c). 모체 CBMC는 음성대조군으로 사용되었다. OCT4, SOX2, NANOG, LIN28의 발현은 CBMC-hiPSC에서 증가하였다. 그러나 KLF4와 c-MYC의 발현은 CBMC와 비교하여 CBMC-hiPSC에서 적었다. 전형적인 세포 표면 마커(SSEA4, OCT4, SOX2, KLF4, TRA-1-80 및 TRA-1-60)들은 면역화학적 분석으로 확인하였다(도 1d). 분화된 모든 세포 라인들은 다분화능의 표준이 되는 마커들을 발현하였다. CBMC-hiPSC가 재프로그래밍 과정을 거친 후에도 정상핵형를 유지하고 다양한 배엽세포로도 분화하는 것을 확인하였다. 이런 데이터들은 CBMC-hiPSC가 성공적으로 생성되었으며 다분화능을 갖고 있음을 의미한다.
CBMC - iPSCs의 연골 세포로의 분화
CBMC-iPSC의 연골 재생 능력을 확인하기 위해 EB 배양 및 성장 세포 유도를 통해 연골 분화를 수행하였다. 연골 분화 펠렛 생성 과정의 간단한 계획은 도 2a와 같다. 연골 부화를 위해 CBMC-iPSCs 콜로니를 준비했다(도 2b). CBMC-iPSCs는 확장되고 EB로 집합되었다(도 2c). EB는 며칠동안 확장되었고, 젤라틴 코이 배양 접시로 옮겨서 성장 세포로 유도되었다(2d). 성장 세포는 확장되고 연골세포 분화를 위해 단일 세포로 구분되었다. 2X106 iPSc를 이용하여, 수많은 연골 형성 펠렛을 얻었다. 분화 30일 후, 연골 형성 펠렛은 EB 성장 세포 를 사용하여 형성 되었다. 생성된 연골 형성 페렛은 3차원 회전 타원체 형태를 나타냈다. 상기의 내용을 통해, CBMC-hiPSCs가 연골 세포로 분화할 수 있으며, ECM 축적에 의해 회전 타원체 모양의 연골 모양을 형성 할 수 있음을 확인했다.
연골형성 펠렛의 연골유전자발현의 확인
이전의 과정을 통해, 연골 혈성 펠렛은 CBMC-hiPSC로부터 성공적으로 생성되었다. 또한 분화 된 세포는 ECM 성분을 합성하고, 연골 유사 특징을 나타내었다. Aggrecan (ACAN), 2형 콜라겐(COL2A1) 및 연골 올리고머 매트릭스 단백질 (COMP)와 같은 주요 ECM 구성 단백질의 발현을 10일, 20일 및 30일에 각각 확인하였다. 그 결과 ACAN, COL2A1 및 COMP의 발현이 증가되는 것을 확인하였다(도 3). Sox9(Sex-determining region Y-box 9)는 초기 연골 분화 마커 및 ECM 단백질의 유전자 발현을 조절하는 전사인자로 알려져 있다. 20일 후에 Sox9의 발현이 증가하였다. 즉, 생성된 연골성 펠렛의 유전적 특성을 확인하였다. 연골 유사 형태에 상응하여, 주요 ECM 성분 단백의 유전자 발현의 증가를 확인했다.
연골형성펠렛의 조직학적 특징
증가된 연골 형성 마커 발현의 확임함에 따라, CBMC-hiPSCs로 부터 생성된 연골성 펠렛의 단백질 수준을 조직학적 분석으로 평가 하였다(도 4). Safranin O, 알시안블루(alcian blue) 및 툴루이딘블루(toluidine blue) 염색은 연골에서 ECM 검출을 위해 사용되는 염색 방법이다. 상기의 염색결과, 분화 초기 단계(10일째)에서도 펠렛의 안쪽 부분에서 ECM의 축적을 확인하였다. 골소강(Lacunae)은 관절 연골에 나타나는 주요 특징 중에 하나이다. 비어있는 골소강 같은 수용량이 10일 후에 보였다. 그러나 크기는 분화가 진행됨에 따라 감소하였다. 분화 30일째, ECM이 수용량에 축적되면서, 관절연골(articular cartilage)안에 골소강 같이 보였다. 30일 째 염색의 강도는 거의 비슷했다.
연골의 품질은 ECM 단백질의 주요 타입에 결정된다. 따라서, 특정 단백질을 확인하는 것이 중요하다. 아그리칸(aggrecan) 및 2형 콜라겐 단백질은 ECM을 구성하는 주성분으로 알려져 있다. 2형 콜라겐은 유리질 연골을 나타내는 주요한 콜라겐 유형이다. 2형 콜라겐 및 아그리칸에 대한 항체를 연골 분화 펠렛에 염색하였다 (도 5a). 2형 콜라겐의 염색 강도는 MSC 대조군보다 CBMC-hiPSC 유래 연골 형성 펠렛에서 더 높았다. 이전 염색 결과에 상응하여, 아그리칸 및 2형 콜라겐은 30일째에 펠렛 안쪽에서 대부분 검출되었다. 섬유 연골의 주요한 특징은 1형 콜라겐의 높은 발현이다. 상기의 연골 형성 펠렛이 섬유성 연골의 우세한 특징을 가지지 않음을 확인하였다 (도 5b). 1형 콜라겐의 발현은 MSC 대조군 쥐보다 상대적으로 높았다. 그러나 발현은 일정한 수준을 유지 했으며, 분화 동안 크게 증가하지 않았다. CBMC-hiPSCs에서 생성된 연골 형성 펠렛은 30일 분화한 후 MSC에서 유래한 펠렛과 비슷한 품짐을 특징으로 한다. CBMC-hiPSCs에서 분화 된 연골 세포는 ECM 성분 단백질을 생산할 수 있었다. CBMC-hiPSC 유래 연골 형성 펠렛은 1형 콜라겐보다 2형 콜라겐의 발현이 높았다. 결론적으로 CBMC-hiPSCs가 유리질 연골의 특징과 유사한 연골 유사 특징을 생성 할 수 있음을 확인했다.
CBMC - hiPSCs 및 MSCs에서 유래한 연골 형성 펠렛의 유전자 마커 분석
콜라겐은 ECM을 구성하는 가장 풍부한 단백질이다. 콜라겐에는 여러 가지 종류가 있지만 1,2 및 10형 콜라겐은 주로 연골과 관련이 있다. 이전 실험에서, 조직학적 분석에 의해 1형 콜라겐 및 2형 콜라겐의 발현을 확인했다 (도 5a 및 도 5b). 상기의 결과를 바탕으로 1형 콜라겐(COL1A1) 유전자의 발현을 분석하였다(도 6a). 비대 연골에서 발현되는 우성 유형으로 알려진 단백질인 10형 콜라겐(COL10)의 유전자 발현도 분석했다. 조직 화학 염색으로 1형 콜라겐의 안정적인 발현을 확인했다. 그러나 COL1A1의 발현은 각 시점에서 감소했다. COL10의 발현은 분화 과정에서 변하지 않았다. 앞서 언급했듯이 2형 콜라겐의 비율은 연골 형성 펠렛의 결과 특성을 바꿀 수 있다. 이전의 유전자 발현 데이터를 사용하여, COL1A1에 대한 COL2A1의 유전자 발현 비율을 평가 하였다(도 6b). 총 증가율은 섬유 연골 유전자에 대한 초자연골 유전자의 발현이 높다는 것을 나타낸다. CBMC-hiPSC- 유래 연골 형성 펠렛을 30 일째 BMSC에서 생성 된 연골 형성 펠렛과 실시간 PCR을 이용하여 비교 하였다 (도 6c). 두 표본간에 ACAN 발현의 통계적 유의성은 없었다. COL2A1 및 SOX9의 발현은 BMSC 유래 펠렛에 비해 CBMC-hiPSC로부터 분화 된 연골 성 펠렛에서 유의하게 높았다. 그러나, COMP는 MSC 컨트롤 펠렛에서 높게 발현되었다. 섬유성 마커인 COL1A1의 발현은 MSC 컨트롤 펠렛에서도 더 높았다. 그러나 CBMC-hiPSC 유래 연골 형성 펠렛에서 비후성 마커 COL10의 발현은 현저하게 낮았다. 이러한 결과는 CBMC-hiPSC가 미래의 적용을 위한 연골 재생을 위한 잠재적 인 세포 공급원의 가능성을 강조한다.
고찰
관절과 관련된 질병, 외상 또는 트라우마로 인한 손상된 관절연골의 재생은 여전히 임상적 이슈이다. 이때, 인간 iPSC는 맞춤형 의약에 대한 새로운 가능성을 제공하고 있으므로, 다양한 신체의 줄기세포로부터 얻은 iPSC를 이용하여 연골형성과 관련된 연구가 이루어지고 있다.
우리는 Yamanaka 펙터를 포함하고 있는 센다이 바이러스 매개체를 이용하여 CBMC를 iPSC로 재프로그래밍 하였다(도 1a). 전 세계에 제대혈 은행 시스템이 존재하기 때문에, CBMC가 널리 활용되고 있다. 동종이계의 재생 의학 치료를 위한 제대혈 은행에서 iPSC 은행으로의 전환은 굉장한 잠재력과 가능성을 갖고 있다. HLA 표현형에 대한 데이터를 기초로 한 CBMC-기초 iPSC 은행 시스템은 동형접합 HLA 타입 iPSC의 세포라인 제작을 통해 세포치료를 위한 효율적인 전략을 제공할 수 있다. 동형접합 세포 라인은 최소한의 물질 또는 세포 라인을 활용한 치료에서 널리 활용될 수 있다. 이런 컨셉은 연골 재생에도 똑같이 적용될 수 있다. HLA-동형접합 iPSC 라인을 활용한 연골 생산은 동종이식시, 면역거부반응을 제거할 수 있다. 따라서 CBMC-iPSC의 사용은 장차 연골 이식에 있어 매우 효율적인 적용이다. 많은 보고서는 재프로그래밍에 사용되는 체세포의 기원은 발달능과 분화능에 영향을 줄 수 있다고 보고 있다. 이전 연구에서 마이크로질량 배양을 통한 연골형성에서 CBMC-iPSC의 잠재력을 나타냈다[비특허문헌 4]. 이는 하나의 CBMC-iPSC 라인과 두 개의 연골관절 유래 iPSC 라인으로 이루어 졌다. CBMC-iPSC가 연골 재생을 위한 이상적인 세포 근원지라는 점을 증명하기 위하여 추가적인 실험이 요구된다. 우리는 CBMC-iPSC(n=3)을 이용한 연골 분화를 시도하였으며 연골 재생의 가능성을 다양한 실험을 통하여 분석하였다. 추후 이식에의 적용을 위하여 연골 분화는 펠렛 배양을 통하여 이루어졌다.
분화단계에 우선하여, 생산된 CBMC-iPSC의 특징을 분석하였다. 분화되지 않은 줄기세포의 특징은 알칼리 인산염을 염색하여 확인하였다(도 1b). 다분화능 마커의 발현 증가는 면역화학 및 세포발생적 실험으로 확인하였다(도 1c and 1d). 모든 세포 라인은 각각의 배엽으로 분화할 수 있었으며, 정상 핵형을 나타냈다.
연골분화는 두가지 중요한 단계를 거쳐 수행된다: 중간엽 유사 성장세포의 유도 및 연골 펠렛 생성이다. hiPSC에서 생성된 성장세포들은 기능 및 분자적으로 자가 MSC와 유사하다는 것은 이전 연구에서 밝혀졌다[비특허문헌 5, 6]. 이들은 단층배양이나 EB 배양을 중간엽 유사 전구세포를 유도하기 위한 전분화단계로서 사용하였다. 그러나 단층배양을 통한 직접적인 분화는 EB를 이용한 경우에 비하여 시간이 소요되었다. 중간엽 유사 전구세포의 형태학 및 분화능은 세포 밀도에 따라 상당히 달랐다.
이들을 모두 고려하여, 우리는 중간엽 유사 성장세포를 유도하는데에 EB를 사용하였다(도 2a). 2×106 의 세포만을 사용하여 많은 양의 EB가 준비되었다(도 2b). 성장세포를 제조 및 확장하기 위하여 젤라틴 배지에 보존된 EB를 도말하였다. 1cm2 당 50-75 EB를 도말하는 것이 적당한 밀도의 성장세포를 위해 적절하다(도 2c). 연골 펠렛은 성장세포를 이용한 펠렛 배양을 통해 얻는다(도 2d). 이를 통해 전부 50-100의 펠렛을 얻을 수 있었다(도 2e). 그러나 생산된 연골 펠렛의 품질은 양 만큼이나 중요하다. ECM 단백질과 관련된 특정한 여러 유전자의 발현을 확인하였다(도 3c). ACAN은 ECM에서 응집하고 있는 프로티오글라이칸이며, 히알루로난(hyaluronan)과의 상호작용을 유도한다. COL2A1은 유리질 연골을 위한 기초적인 단백질로서 건강한 연골의 비대성 적인 특징을 나타낸다. ACAN과 COL2A1의 발현은 10일째 되는 날 확연히 증가하였다. 비콜라겐성 ECM인 COMP의 발현은 20일째 되는 날에 급격히 증가하였다. COMP의 과발현은 ACAN과 COL2A1의 수준을 증가시키지만 초기 연골 마커인 SOX9의 발현에는 영향이 없다고 보고되었었다. 그러나 우리 연구에서는, SOX9의 발현이 COMP와 같은 패턴으로 증가하였다. 연골을 특이적으로 염색하는 여러 방법으로 30일 째에 MSC로부터 생산된 연골만큼 ECM 구성물이 응집되어 있는 것을 확인하였다(도 4).
연골을 생산한 후에, 섬유연골로부터 유리질연골을 분리해내는 것이 중요하다. 섬유 또는 비대성 연골은 뼈로 분화하는 경향이 있는 더 성숙한 타입이다. CBMC-hiPSC로부터 생산된 연골 펠렛은 상대적으로 낮은 비대성 마커의 발현을 나타냈다(도 5, 도 6). 분화하는 동안 COL1A1의 발현은 COL2A1의 발현이 증가하는 것에 반해 감소하였다.
CBMC-hiPSC로부터 얻은 연골 펠렛과 BMSC로부터 얻은 펠렛을 30일째 되는 날 비교하였다(도 6c). COL2A1과 SOX9의 발현은 CBMC-hiPSC로부터 얻은 펠렛에서 눈에 띄게 증가하였다. 흥미롭게도, COMP의 발현은 BMSC에서 얻은 연골 펠렛에서 더 높았다. 게다가, COL1A1과 COL10의 발현은 BMSC에서 얻은 펠렛에서 증가하였다. COMP는 힘줄과 연골에 존재하는 중요한 단백질로 생각되었다. 이는 1형 콜라겐 소섬유의 표면을 장식하는 단백질로서, 1형 콜라겐과 12형 콜라겐을 직접적으로 연결하는 기능을 제공한다. 또한 연골 부상의 지표이기도 하다. 최근, COMP는 루마티스성 관절염이나 경피증 같이 높은 연골 회전률을 나타내는 여러 질병의 생물학적 마커로 고려되었다. 이는 CBMC-hiPSC가 섬유 또는 유리질 연골의 특징을 BMSC 유래 연골 펠렛에 비하여 적게 가질수도 있음을 의미한다.
우리는 CBMC-hiPSC를 이용하여 연골을 재생하는 경우 건강한 표현형을 나타내며 조직 재생과 이식시 고려될 수 있음을 확인하였다. 아직까지 더 짧은 분화시간이 적용을 위해서는 필요하다. 높은 유리질의 연골을 보증하기 위하여 추가적인 연구를 통해 관리 기준이 필요하며, 연골 이식을 위한 CBMC-hiPSC의 추가적인 적용 역시 필요하다.
CBMC 유래 iPSC로부터 분화된 연골 세포의 분화능 증가 효과 확인
본 발명자들은, 본 발명의 연골 세포 분화 방법에서 분화능이 개선될 수 있음을 확인하고자, 말초혈 세포(PBMC) 유래의 iPSC와 본 발명의 CBMC 유래의 iPSC를 사용하여 연골 세포 분화를 유도하였다. 분화 후 각각의 연골세포를 수득하여, 이로부터 연골 형성에 관련된 ACAN 및 COL2A1의 발현 수준을 확인하였다.
그 결과, 도 7에서 나타난 바와 같이 CBMC 유래의 연골세포에서 PMBC 유래 연골세포보다 ACAN 및 AOL2A1의 발현 수준이 약 6 내지 10배 증가하는 것을 확인하여, 이로부터 본 발명의 CBMC 유래 연골세포에서 연골 생성 효율이 증가함을 확인하였다.
제조한 iPSC가 동형 접합체인지 여부 확인
제조한 CMC-hiPSC가 동형 접합체(homozygote)인지 여부를 확인하기 위해, CMC 유래 iPSC의 세포주 3개에 대하여 Human Leukocyte Antigen(HLA)의 대립 유전자 유형을 분석하였다. 그 결과, 하기 [표 4] 내지 [표 6]에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 방법으로 제조한 CMC-hiPSC는 동형 접합체임을 확인하였다.
이에 따라, 본 발명의 CMC-iPSC를 이용하여 분화된 연골세포는 chondro beads의 형태로 사용하여 연골 조직을 제조할 수 있고, 이식 성공률이 높아질 수 있다.
HLA 검사 (SBT) 결과
HLA-A HLA-B HLA-C DRB1 DQB1 DPB1
CMC-hiPSC-
008		 *33:03(A33) *44:03(B44) - *13:02 - -
*33:03(A33) *44:03(B44) - *13:02 - -
HLA 검사 (SBT) 결과
HLA-A HLA-B HLA-C DRB1 DQB1 DPB1
CMC-hiPSC-
009		 *24:02(A24) *07:02(B7) - *01:01 - -
*24:02(A24) *07:02(B7) - *01:01 - -
HLA 검사 (SBT) 결과
HLA-A HLA-B HLA-C DRB1 DQB1 DPB1
CMC-hiPSC-
008		 *11:01(A11) *15:01(B62) - *04:06 - -
*11:01(A11) *15:01(B62) - *04:06 - -
iPSC 생성을 위해서는 한국 인구의 가장 높은 비율로 차지할 수 있는 동형 접합 유형을 선택했다. 그러나 한국인의 HLA 유형은 개인 정보 보호법으로 인해 기밀로 취급된다. 이에 본 연구에서는 카톨릭 조혈 모세포 은행에 보관된 법적으로 기증받은 CBMC의 HLA 유형 정보를 분석 했다. 하기 [표 7]과 같이, 상위 20위의 HLA 유형에 대한 정보를 얻었다. HLA-A * 33, HLA-B * 44 및 HLA-DRB1 * 13이 CBMC 은행 전체의 약 23.97 %를 차지하여 가장 빈번한 동형 접합체 HLA 유형이었다. 두 번째 빈번한 유형은 HLA-A * 33, HLA-B * 58, HLA-DRB1 * 13이었고, 추정 인구의 11.16 %를 기록했다. 상위 5 위 유형에서 HLA 유형의 적용 범위는 5 % 미만이었다. 3 가지 HLA 유형 중 HLA-A는 다른 2 가지 유형보다 상대적으로 집중된 경향을 보였다. 선택된 20 가지 HLA 유형 중 25 %는 * 33의 HLA-A 유형을 가지고 있었고 40 %는 * 02 유형을 가지고 있었다.
분류된 HLA 유형의 정보에 기초하여, 재조합을 위해 카톨릭 조혈 모세포 은행에서 9 개의 동형 접합체 세포가 선택되었다. 게다가 동종접합 HLA 타입을 지닌 4개의 PBMC sample을 선물로 얻었다. 하기 [표 8]과 같이, 총 13개의 세포 샘플 중 3 개가 HLA-A * 33, HLA-B * 44 및 HLA-DRB1 * 13의 HLA 유형을 가졌다. 수득 된 세포를 재 프로그래밍을 위해 카톨릭 세포 치료 연구소의 GMP 시설로 옮겼다. 야마나카 팩터(Yamanaka factors)를 처리 후, 무결점의 샘플을 분리하고 다양한 분석법으로 특성을 확인하였다. 생존율은 세포 부착에 기초하여 측정하였다. 다능성은 PCR 및 면역 형광법를 통해 확인되었다. 세포의 미분화상태는 알칼라인 포스파타제 염색으로 확인되었다. 핵형 분석과 짧은 염기 반복 분석(short tandem repeat assay)을 수행하여 정상적인 유전적 배경을 확인했다. 마지막으로, 각각의 배아층으로 분화를 통해 이들의 다중이 전이가 확인되고, 감염 테스트가 수행되었다. 이러한 과정을 거친 후에 모든 품질 관리 시험을 통과한 세포만 GMP 시설에 저장되었다(도 8a).
몇 가지 서브 클로닝 과정 후에, 모든 세포주는 iPSC의 적절한 형태를 보였다. 동형접하체 HLA-iPSCs는 다능성 마커의 양성발현을 보였다(도 8b 및 8d). 모든 세포는 계대 배양 동안 미분화를 상태를 유지했다(도 8c). 정상 핵형이 세포주에서 확인되었다(도 8e). 또한, 생성된 세포는 시험관내에서 세 개의 모든 배아층으로 분화할 수 있었다(도 8f 및 8g). 도 8에 개시된 데이터는 CMC-hiPSC-001 세포주의 데이터를 나타낸다.
동형 접합체 HLA-iPSCs의 생성은 개인화 된 재생 의학의 발전에 새로운 기회를 열었다. 요구되는 시간, 돈 및 인력을 줄임으로써 동형 접합성 HLA-iPSCs는 최소의 세포 공급원을 가진 많은 수의 환자를 치료할 수 있다. HLA 표현형 대립 유전자 빈도에 따라 후보 HLA 동형 접합 세포 유형을 선택하여 iPSC 자원 은행으로 보유 할 수 있다. 그러나 동형 접합체 세포는 빈번하게 발견되지 않으므로 인구 중 가장 많은 백분율을 차지하는 iPSC의 최소 또는 적절한 수를 추정하는 것이 중요하다.
결과적으로, 우리는 한국인 인구에서 동형접합 HLA 타입의 빈도수를 대체적인 방법으로 확정하였다. 우리는 처음으로 가톨릭세포치료사업단의 HLA 타입의 CBMC 라이브러리에 접속하였다. CBMC 은행을 통하여 은행에 보관되어 있는 HLA-동형접합 CBMC의 23.9%가 HLA-A*33, HLA-B44와 HLA-DRB1*13의 표현형을 나타냄을 확인하였다. 생산된 데이터를 통하여 동형접합 단일세포을 스크리닝하여 얻었고 세포를 iPSC로 얻기 위하여 재프로그래밍 하였다. HLA-A*33, HLA-B44와 HLA-DRB1*13의 세 동형접합 HLA-hiPSC이 생산되었다. 13개의 생산된 HLA-iPSC 라인은 높은 다분화능과 정상핵형을 가지고 있었으며 여러 오염 테스트를 통과하였다. 이는 한국인에서 한국인정부의 지원을 받아 한국인의 동형접합 HLA-iPSC 은행을 구축한 첫 번째 성과이다. 동형접합 HLA-iPSC는 성공적인 재생의학과 임상적인 줄기세포 치료를 위한 새로운 기회를 열 것이다.
Figure pat00001
Figure pat00002

Claims (17)

  1. ⅰ) 제대혈단핵구세포유래 인간전분화능세포(CBMC-hiPSC)로부터 배양체(embryoid body)를 형성 및 수득하는 단계;
    ⅱ) 상기 단계 ⅰ)의 배양체로부터 성장세포(embryoid body-derived outgrowth cell)를 형성 및 수득하는 단계; 및
    ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 성장세포를 배양하여 연골세포 펠렛(chondrogenic pellet)을 수득하는 단계;
    를 포함하는 연골세포 분화용 조성물 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단계 ⅰ)의 제대혈단핵구세포유래 인간전분화능세포(CBMC-hiPSC)는 제대혈단핵구세포(cord blood mononuclear cell)를 리프로그래밍하여 얻는 것을 특징으로 하는 연골세포 분화용 조성물 제조방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 리프로그래밍은 제대혈단핵구세포에 Yamanaka 펙터를 포함하는 센다이(sendai) 바이러스를 처리하여 전분화능세포로 유도하는 것을 특징으로 하는 연골세포 분화용 조성물 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 단계 ⅱ)의 성장세포는 젤라틴 배지에 배양체를 도말하여 형성하는 것을 특징으로 하는 연골세포 분화용 조성물 제조방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 젤라틴 배지의 1㎠당 50~70개의 배양체를 도말하는 것을 특징으로 하는 연골세포 분화용 조성물 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 단계 ⅰ)의 제대혈단핵구유래 인간전분화능세포는 HLA 동형접합체(homozygote)인 것을 특징으로 하는 연골세포 분화용 조성물 제조방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 HLA 동형접합체의 유형은 한국인의 HLA 동형접합체의 유형인 것을 특징으로 하는 연골세포 분화용 조성물 제조방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 한국인의 HLA 동형접합체의 유형은 HLA-A*33, HLA-B*44 및 HLA-DRB1*13로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 연골세포 분화용 조성물 제조방법.
  9. 제1항의 연골세포 분화용 조성물의 제조방법으로부터 제조된 연골세포 분화용 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 연골세포 분화용 조성물은 ACAN, COL2A1, COMP 및 SOX9으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 유전자 발현이 증가되는 것을 특징으로 하는 연골세포 분화용 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 상기 연골세포 분화용 조성물은 COL1A1 또는 COL10의 유전자 발현 수준이 COL2A1의 유전자 발현 수준 보다 낮은 것을 특징으로 하는 연골세포 분화용 조성물.
  12. 제9항의 연골세포 분화용 조성물로부터 분화된 연골세포.
  13. 제12항에 있어서, 상기 연골세포는 ACAN, COL2A1, COMP 및 SOX9으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 유전자 발현이 증가되는 것을 특징으로 하는 연골세포.
  14. 제12항에 있어서, 상기 연골세포는 COL1A1 또는 COL10의 유전자 발현 수준이 COL2A1의 유전자 발현 수준 보다 낮은 것을 특징으로 하는 연골세포.
  15. 제9항의 연골세포 분화용 조성물을 포함하는 연골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  16. 제12항의 연골세포를 포함하는 연골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 연골 관련 질환은 루마티스성 관절염, 골관절염, 골연화증, 연골손상 및 연골결손으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인 것을 특징으로 하는 연골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2022250477A1 (ko) * 2021-05-27 2022-12-01 차의과학대학교 산학협력단 Hla 동형접합 유도만능줄기세포 유래 신경전구세포를 포함하는 뇌졸중 예방 및 치료용 조성물

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