KR20180066312A - 반응표면분석법을 이용한 녹차와 애엽 혼합물의 최적 추출 방법 - Google Patents
반응표면분석법을 이용한 녹차와 애엽 혼합물의 최적 추출 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 녹차와 애엽 혼합물로부터 초음파 추출법을 이용하여 추출물을 추출함에 있어서, (a) 초음파 추출 조건으로서 녹차와 애엽의 혼합비(X1), 용매(mL)와 용질(g)의 비(X2) 및 추출시간(X3)을 등분하고 부호화하여 녹차와 애엽 혼합물의 추출물의 추출 계획을 수립하는 단계; 및 (b) 반응표면 분석법으로 각 추출 조건별 녹차와 애엽 혼합물의 추출물의 추출수율을 측정하는 단계를 포함하여 구성되는 초음파 추출법을 이용한 녹차와 애엽 혼합물의 추출물의 최적 추출 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 반응표면분석법을 이용한 녹차와 애엽 혼합물의 최적 추출 방법에 관한 것이다.
국민소득의 증가와 더불어 식생활 양식의 변화로 비만의 유병률이 점점 높아지고 있으며, 이로 인한 대사 증후군의 발병 및 사망률이 증가하고 있다. 비만은 과도하게 섭취된 에너지가 대사활동을 통해 소비된 후 지방조직에서 중성지방으로 축적되어 발생한다. 이러한 비만은 유전적, 영양적, 환경적 및 사회적 요인 등 다양한 원인들이 관여하는 것으로 알려져 있으며, 비만의 최대문제는 비만에 의해 발생되는 합병증이다. 또한, 통계청 추계에 따르면 대한민국은 고령화 속도의 증가로 인해 2020년에는 고령 인구 비율이 15.6%에 달하고 2030년에는 24.3% 이상으로 초고령사회로 진입할 것으로 예상되어지고 있으며, 이에 따라 건강관리 중요성과 만성질환의 예방관리를 위한 기능성식품의 중요성에 대한 인식이 더욱더 증가될 것으로 보인다. 기능성식품 소재의 선택은 안전성 문제로 식용근거가 있는 소재를 중심으로 인체에 대한 안전성과 생리적 효능을 갖고 있는 천연유래 소재를 선호하는 경향이 높아지고 있다. 질병은 치료되어야 한다는 과거의 사고방식이 변하여 현대인들 사이에서는 치료보다 예방이 우선시 되고 있으며, 편의 위주의 생활양식이 변함에 따라 천연소재로부터 유효성분을 추출하여 간편하게 이용할 수 있는 드링크류의 의약품이나 건강식품의 개발이 증가되고 있는 추세이다. 가공의 특성상 추출물은 특정 성분의 농축, 첨가 등이 용이하여 단일 소재보다는 여러 식물의 추출물을 혼합하여 혼합물에 의한 기능성을 높이고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다.
차나무(Camellia sinensis L.)의 어린잎을 다린 녹차는 에피카테킨(epicatechin), 에피카테킨 갈레이트(epicatechin gallate), EGCG(epigallocatechin-3-gallate) 등의 폴리페놀류를 다량 함유하고 있다. 녹차의 약리적 효과는 에피카테킨 계열 성분들과 관련 있으며, 200-300mg 녹차가 들어있는 차 한잔에는 50-80%의 EGCG가 존재하는 것으로 보고되었다. EGCG는 항산화, 항암, 항노화, 항당뇨, 항비만 등의 다양한 생리활성을 가지고 있어 많은 연구가 이루어지고 있다.
애엽은 국화과에 속하는 다년생 초목인 황해쑥(Artemisia argyi Lev. et Vant.), 쑥(Artemisia princeps Pampanini), 산쑥(Artemisia montana Pampani)의 어린 잎 및 줄기를 말하며, 예로부터 지혈, 진통, 염증, 폐경기 질환에 효능이 있어 널리 사용되어져 왔다. 애엽의 주요 성분으로는 유파틸린(eupatilin)과 자세오시딘(jaceosidin)이 있으며, 항암, 항당뇨, 항동맥경화 외에 NF-kB 신호전달과정을 억제시켜 항염증 효과를 가지는 것으로 보고되었다.
이와 같이 녹차와 애엽은 약용식품 소재로 생리활성 효능이 탁월하여 다양한 제품들이 생산되고 있는 반면, 제조공정의 관한 연구는 아직 미흡한 실정이다. 제품을 개발함에 있어서 우수한 생리활성 소재를 탐색하는 것만큼, 소재의 특징을 고려하여 적은 비용으로 다량의 유효성분을 추출할 수 있는 공정의 개선도 중요하다.
추출방법에는 열수 추출법, 에탄올과 같은 유기용매를 이용한 추출방법, 마이크로파 추출법, 초임계유체 추출법, 초음파 추출법 등이 있으며, 열수 추출법과 같이 물 또는 다른 용매를 이용하여 식물로부터 생리활성성분을 추출하는 것이 보편적이다. 이와 같은 방법은 긴 추출 시간이 요구되기 때문에 용매와 온도의 조건을 다르게 하여 추출시간을 단축시키거나 추출 효율을 높이기도 하지만 용매와 온도의 조건 만으로 얻을 수 있는 결과에는 한계가 있으며, 오히려 높은 온도는 폴리페놀류 등과 같은 유효성분을 파괴시켜 생리활성 및 수율을 감소시키기도 한다.
이에 본 발명에서는 초음파 진동에 의해 발생하는 공동현상(cavitation)을 이용하여 다양한 유용성분과 생리활성을 가지고 있는 녹차와 애엽의 혼합물에 대한 혼합비 및 추출조건을 최적화하기 위함에 있어 초음파를 지속적으로 가하는 조건에서 박스 벤켄 계획법(Box-Behnken design)을 바탕으로 녹차와 애엽의 혼합비, 용매와 용질의 비, 추출시간을 독립변수로 설정하여 추출수율의 측정을 통해 반응표면분석(Response surface methodology; RSM)으로 모니터링 하였다.
한편, 한국공개특허 제2015-0047814호에는 '반응표면법을 이용한 머위로부터 페타신 함유 추출물을 제조하는 방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1499875호에는 반응표면분석법으로 추출수율 및 추출 조건별 특정 성분의 함량변화를 측정하는 단계를 포함하고 있는 '초임계 유체를 이용한 미강유의 최적 추출 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 반응표면분석법을 이용한 녹차와 애엽 혼합물의 최적 추출 방법에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 녹차와 애엽의 혼합비, 용매와 용질의 비 및 추출시간을 독립변수로 하여, 각 독립변수들의 조건을 등분하고 부호화하여 추출 계획을 수립하고, 각 추출계획으로 녹차와 애엽 혼합물을 추출하고, 반응표면분석법을 이용하여 각 추출수율을 측정하여 추출수율이 가장 우수한 최적의 추출조건을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 녹차와 애엽 혼합물로부터 초음파 추출법을 이용하여 추출물을 추출함에 있어서, (a) 초음파 추출 조건으로서 녹차와 애엽의 혼합비(X1), 용매(mL)와 용질(g)의 비(X2) 및 추출시간(X3)을 등분하고 부호화하여 녹차와 애엽 혼합물의 추출물의 추출 계획을 수립하는 단계; 및 (b) 반응표면 분석법으로 각 추출 조건별 녹차와 애엽 혼합물의 추출물의 추출수율을 측정하는 단계를 포함하여 구성되는 초음파 추출법을 이용한 녹차와 애엽 혼합물의 추출물의 최적 추출 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 방법은 반응표면분석법을 이용하여 초음파 추출법을 통한 녹차와 애엽 혼합물의 추출조건을 최적화한 것으로, 녹차와 애엽의 혼합비 85.86:14.14(중량비), 용매와 용질의 비 92.73mL/g 및 추출시간 56.52분의 최적 추출조건을 제시하였다. 본 발명의 방법은 반응표면분석법을 통해 녹차와 애엽 혼합물의 추출효율이 보다 향상되었으며, 보다 표준화된 추출 방법을 제시할 수 있었다.
도 1은 초음파 세기에 따른 추출물의 항산화 활성을 분석한 것으로, A는 DPPH 라디칼 소거능을 보여주는 결과이며 B는 FRAP 활성을 보여주는 결과이다.
도 2는 녹차와 애엽 혼합 추출물의 다양한 온도 조건에서 시간별로 항산화 활성을 분석한 결과이다.
도 3은 박스-벤켄 계획법을 통해 계획된 각 추출시험별로 추출수율의 예측값과 실제값을 보여주는 결과이다.
도 4는 초음파 추출에 의한 추출수율에 있어서 추출 조건의 영향에 대한 반응표면을 도시한 그래프이다. mixture ratio, 녹차와 애엽의 혼합비; liquid to solid ratio, 용매와 용질의 비; extraction time, 추출시간.
도 5는 초음파 추출에 의한 추출수율에 있어서 추출 조건의 영향을 보여주는 등고선도(contour plot)이다. mixture ratio, 녹차와 애엽의 혼합비; liquid to solid ratio, 용매와 용질의 비; extraction time, 추출시간.
도 2는 녹차와 애엽 혼합 추출물의 다양한 온도 조건에서 시간별로 항산화 활성을 분석한 결과이다.
도 3은 박스-벤켄 계획법을 통해 계획된 각 추출시험별로 추출수율의 예측값과 실제값을 보여주는 결과이다.
도 4는 초음파 추출에 의한 추출수율에 있어서 추출 조건의 영향에 대한 반응표면을 도시한 그래프이다. mixture ratio, 녹차와 애엽의 혼합비; liquid to solid ratio, 용매와 용질의 비; extraction time, 추출시간.
도 5는 초음파 추출에 의한 추출수율에 있어서 추출 조건의 영향을 보여주는 등고선도(contour plot)이다. mixture ratio, 녹차와 애엽의 혼합비; liquid to solid ratio, 용매와 용질의 비; extraction time, 추출시간.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 녹차와 애엽 혼합물로부터 초음파 추출법을 이용하여 추출물을 추출함에 있어서,
(a) 초음파 추출 조건으로서 녹차와 애엽의 혼합비(X1), 용매(mL)와 용질(g)의 비(X2) 및 추출시간(X3)을 등분하고 부호화하여 녹차와 애엽 혼합물의 추출물의 추출 계획을 수립하는 단계; 및
(b) 반응표면 분석법으로 각 추출 조건별 녹차와 애엽 혼합물의 추출물의 추출수율을 측정하는 단계를 포함하여 구성되는 초음파 추출법을 이용한 녹차와 애엽 혼합물의 추출물의 최적 추출 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 추출 방법에 있어서, 상기 단계 (a)의 추출 조건은 구체적으로는, 녹차와 애엽의 혼합비가 중량비로 60%(녹차:애엽=60:40)~100%(녹차:애엽=100:0)인 혼합비(X1), 20~100mL/g의 용매(mL)와 용질(g)의 비(X2) 및 25~145분의 추출시간(X3)을 3등분하여 3단계의 부호 -1, 0, 1로 부호화하여 추출 계획을 수립하는 단계일 수 있고, 더욱 구체적으로는, 표 1에 기재된 것과 같이, 녹차 및 애엽의 혼합비(X1)는 녹차:애엽의 비가 60:40, 80:20 및 100:0인 경우를 각각 60, 80 및 100%로 놓고 3단계의 부호 -1, 0, 1로 부호화하였으며, 용매(mL)와 용질(g)의 비(X2)는 20mL/g, 60mL/g 및 100mL/g을 3단계의 부호 -1, 0, 1로 부호화하였으며, 추출시간(X3)은 25분, 85분 및 145분을 3단계의 부호 -1, 0, 1로 부호화하였다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 추출 방법에 있어서, 상기 추출 조건은 바람직하게는 녹차와 애엽의 혼합비가 중량비로 85~86:14~15의 혼합비(X1), 92.5~93.0mL/g의 용매(mL)와 용질(g)의 비(X2), 56~57분의 추출시간(X3)일 수 있으며, 가장 바람직하게는 녹차와 애엽의 혼합비가 중량비로 85.86:14.14의 혼합비(X1), 92.73mL/g의 용매(mL)와 용질(g)의 비(X2), 56.52분의 추출시간(X3)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 일 구현 예에 따른 추출 방법에 있어서, 상기 단계 (b)의 반응표면 분석법으로 각 추출 조건별 추출 수율을 측정하는 단계는,
전술한 단계 (a)의 추출 계획으로 녹차와 애엽 혼합물로부터 추출물을 추출하여 실험값을 얻는 단계(단계 1);
이차 회귀식 모델을 사용하여 상기 단계 1의 실험값으로 하기 수학식 1로 표시되는 모델을 도출하는 단계(단계 2);
하기 수학식 1로 표시되는 모델을 변량분석(ANOVA)하여 신뢰도를 입증하는 단계(단계 3);
상기 단계 3에서 신뢰도가 입증된 하기 수학식 1을 이용하여 반응표면등고선을 그리는 단계(단계 4); 및
상기 단계 4의 반응표면등고선에서 추출 조건을 찾아내는 단계(단계 5);를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
[수학식 1]
Y=28.2500+1.4375X1+3.8125X2-0.0625X3-1.1563X1 2-2.2813X2 2-0.2813X3 2-0.8125X1X2+0.1875X1X3-0.3125X2X3
(Y는 추출수율 예측값(%), X1은 녹차와 애엽의 혼합비, X2는 용매(mL)와 용질(g)의 비 및 X3은 추출시간을 의미)
용어 '반응표면분석법(response surface methodology, RSM)'은 최적화 실험계획법으로, 반응값에 영향을 주는 중요한 실험인자를 찾은 다음 소수의 중요인자를 활용하여 최적의 반응값을 찾는 분석법이다. 반응표면분석법은 최소의 실험횟수로부터 최대의 정보를 얻을 수 있는 실험계획법과 실험계획법에 의해 얻어진 실험 자료를 분석하여 복잡한 시스템의 성능을 이해하고 반응변수에 영향을 주는 유의한 요인효과들을 찾고 최적화하는데 사용된다. 여러 개의 인자 중 하나씩 각각 변화시켜 실험을 진행하는 전통적인 실험법인 1회 1인자(one factor at a time) 실험법에 의해 최적의 실험 조건을 찾기 어렵고 복합 공정에서 중요한 인자 간에 상호작용을 고려하지 못하고, 실험영역 전체를 균형 있게 판단하지 못하기 때문에 국지 최적점을 찾게 되는 문제점이 있다. 반응표면분석법은 전형적인 최적화 방법으로 일반적으로 여러 변수를 사용하여 최적 조건을 찾는 시스템으로 하나의 변수와 다른 변수들과의 상호작용으로 인한 효과를 측정하여 변수들의 최적 값을 확인할 수 있다.
반응표면분석법을 통한 본 발명의 녹차와 애엽 혼합물의 최적 추출 조건은 녹차와 애엽의 혼합비 85.86:14.14(중량비), 용매와 용질의 비 92.73mL/g, 추출시간 56.52분으로 확인되었으며, 추출수율의 최대값은 30.03%로 예측되었다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 실험 재료
본 실험에 사용한 녹차(Camellia sinensis L.)와 애엽(Artemisia argyi)은 각각 보성녹차(잎 부위)와 강화약쑥으로, 모두 동경종합상사 한약재유통에서 구매하여 사용하였다. 녹차와 애엽을 건조시킨 후, 각 건조물을 분쇄하여 40 메쉬 표준망에 통과시켜 실험에 사용하였다. 항산화 활성 및 총 페놀 함량 분석에 사용한 시약들은 탄산나트륨(Tedia Co., Ltd., 미국), 질산알루미늄(Wako Ltd., 중국), 수산화나트륨(Samchun pure chemical Co., Ltd., 한국)을 사용하였으며 폴린-시오칼토 시약(Folin-Ciocalteu's reagent), 갈산(gallic acid), 루틴, 아세트산칼륨(potassium acetate), (+)-카테킨(catechin), 과황산칼륨(potassium persulfate), 염화제2철(ferric chloride), 아세트산, DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl), ABTS(2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)), TPTZ(2,4,6-Tripyridyl-s-triazine) 등은 Sigma-Aldrich 사(미국)에서 구입하여 사용하였다.
2. 추출방법
녹차와 애엽 혼합물의 최적추출조건 설정을 위해 초음파 기기(Mujigae Co., Ltd, 한국)를 사용하여 지속적으로 초음파를 제공하였으며, 실험계획에 따라 녹차 및 애엽의 혼합비, 용매 용질의 비, 추출시간을 달리하여 증류수로 추출하였다. 추출한 추출물은 여과지(Whatman No. 3, Whatman, 영국)를 사용하여 여과한 후에 회전식 진공농축기(Tokyo Rikakikai Co., Ltd, 일본)와 동결건조기(Ilshinbiobase Co., Ltd, 한국)를 사용하여 농축 및 동결건조하여 추출수율(extraction yield, %)을 평가하였다.
3. 추출조건의 예비설정
추출조건의 예비설정에 필요한 기초실험으로서 초음파 세기와 온도에 따른 영향을 확인하였으며, 추출조건 최적화 실험의 기본조건으로 활용하였다. 초음파 세기에 따른 추출수율 결과는 녹차와 애엽의 혼합비를 1:1, 용매 용질의 비를 25배로 하여 25℃에서 25분간 서로 다른 초음파 세기(0, 25, 50, 75 및 100%)를 가하여 추출물의 항산화 활성을 평가함으로서 추출정도를 비교하였으며, 온도에 따른 영향을 확인하기 위해서 초음파를 처리하지 않고 각각 30, 50 및 70℃에서 1시간동안 3분 단위로 추출한 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성 지표를 비교하여 최적화 실험의 기본조건으로 활용하였다.
4. 총 페놀 함량 분석
총 페놀 함량은 폴린-시오칼토(Folin-Ciocalteau)의 방법을 변형하여 폴린-시오칼토 페놀 시약이 각 시료의 페놀성 화합물에 의해 환원된 결과 몰리브덴 청색으로 발색하는 것을 원리로 분석하였다. 각 시료 1mL에 2% 탄산나트륨(sodium carbonate) 용액 1mL와 10% 폴린-시오칼토 시약 1mL을 혼합하여 1시간 방치한 후 마이크로플레이트 리더기(Molecular Devices, Sunnyvale, 미국)로 750nm에서 흡광도를 측정하였으며, 갈산을 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 시료 내 페놀 함량을 계산하였다.
5. DPPH 라디칼 소거 활성 측정
전자공여능은 항산화 측정에 가장 많이 쓰이는 방법 중에 하나이다. 이 실험에서 사용되는 DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl)는 항산화 활성을 측정하기 위한 기질로 사용되며, 페놀, 플라보노이드와 같은 페놀성 물질에 대한 항산화작용의 지표로 알려져 있다. DPPH법은 자유 라디칼로 특유의 색을 나타나게 되나 전자나 수소원자에 의해 전자가 쌍이 되어 비라디칼이 되면 특유의 색이 사라지게 되는 DPPH의 화학적 성질을 이용한 방법이다. 각 시료 0.2mL에 에탄올을 사용하여 용해시킨 0.4mM DPPH 용액 0.8mL을 첨가하여 혼합한 뒤 10분 동안 반응시킨 후 마이크로플레이트 리더기를 사용하여 517nm에서 흡광도를 측정하였다.
6. FRAP(Ferric ion reducing antioxidant power) 측정
FRAP 방법은 Fe3+가 환원되어 Fe2+가 되어 TPTZ(2,4,6-Tripyridyl-s-triazine)와 결합하여 청색 계열의 색을 나타내어 환원력을 흡광도 값으로 나타내는 방법이다. 300mM 아세트산나트륨 버퍼(pH 3.6), 10mM TPTZ, 20mM FeCl·6H2O를 10:1:1로 혼합한 혼합용액 1.5mL에, 시료 50㎕ 및 증류수 150㎕를 혼합하여 37℃에서 4분간 반응시킨 후 마이크로플레이트 리더기를 사용하여 595nm에서 흡광도를 측정하였다.
7. 추출공정의 최적화를 위한 실험계획
녹차와 애엽 혼합물의 추출공정 최적화를 위해 박스 벤켄 계획법(Box Behnken design; 3 level 3 factor)을 이용하였으며, 추출공정에 영향을 주는 녹차 및 애엽의 혼합비(X1), 용매 용질의 비(X2), 추출시간(X3)을 독립변수로 설정하여 축 값을 포함한 3 수준(-1, 0, 1)에서 실험을 설계 하였다(표 1). 상기 독립변수 중에서 녹차 및 애엽의 혼합비는 녹차:애엽의 비가 60:40, 80:20 및 100:0인 경우를 각각 60, 80 및 100%로 표시하였다. 추출물의 결과는 추출수율을 종속변수로 하여 실험모델을 작성하고 모델식의 적합성을 평가하였다.
| 독립변수 | 부호 | 수준 | ||
| -1 | 0 | 1 | ||
| 혼합비(녹차 함량, %) | X1 | 60 | 80 | 100 |
| 용매 용질의 비(mL/g) | X2 | 20 | 60 | 100 |
| 추출시간(분) | X3 | 25 | 85 | 145 |
8. 추출수율 측정
추출수율은 추출물을 동결건조한 후, 추출원료 건물량에 대한 고형분의 수율로 나타내었다.
9. 통계분석
모든 실험결과는 3회 이상 반복하여 실시하였으며 SAS 9.2를 이용하여 one-way ANOVA 분석을 수행하였고 평균값의 통계적 유의성은 p<0.05 수준에서 검정하였으며, 실험 설계와 반응표면분석은 MiniTab 16(Minitab Inc., 미국)을 사용하였다. 반응표면분석은 독립변수 Xi와 Xj에 대한 종속변수 Y(추출수율)는 다음과 같은 2차 회귀식으로 나타내었으며, β0는 상수이고 βi, βii, βij는 회귀계수이다.
실시예 1. 추출조건에 따른 추출물의 품질특성 분석
초음파 세기에 따른 추출물의 변화를 확인하기 위하여 녹차와 애엽의 혼합비, 용매 용질의 비, 온도 및 시간을 동일하게 한 조건에서 초음파 세기만을 다르게 하여 추출한 결과, 총 페놀 함량과 DPPH 라디칼 소거능 및 FRAP에서 보여주는 항산화 활성 모두 초음파 세기가 증가함에 따라 함께 증가하였다(도 1 및 표 2).
| 초음파 세기(%) | 총 페놀 함량(mg GAE1)/g) |
| 0 | 24.42±0.22e) |
| 25 | 26.15±0.18c) |
| 50 | 25.25±0.18d) |
| 75 | 28.19±0.20b) |
| 100 | 30.14±0.13a) |
1) GAE: 갈산 등가, 3반복의 평균±표준편차 (p<0.05)
다음으로 온도에 따른 영향을 확인하기 위해서 초음파를 처리하지 않고 각각 30, 50 및 70℃에서 1시간동안 3분 단위로 추출한 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성을 평가하여 시간과 온도에 따른 추출물의 변화를 관찰하였다. 그 결과, 6분 이후부터는 동일시간 추출하였을 때 추출 온도가 높을수록 더 높은 항산화 활성을 나타내었으며, 추출 시간이 지나감에 따라 30℃ 조건에서는 항산화 활성이 계속 증가하는 반면, 50℃와 70℃의 온도 조건에서는 50분 이후부터 큰 변화를 보이지 않았다(도 2).
항산화 활성이 증가하는 것은 항산화와 관련된 유효성분의 추출속도 변화를 관찰할 수 있는 간접적인 지표로서 상기의 결과를 통하여 녹차 및 애엽 혼합물을 추출하는데 있어 초음파의 세기와 추출온도 및 시간이 추출조건에 있어 중요한 요인으로 작용하는 것을 확인하였다.
실시예 2. 박스 벤켄 계획법을 이용한 실험설계
녹차와 애엽의 추출조건을 최적화하기 위해서 MiniTab 소프트웨어를 통해 반응표면분석법을 사용하였다. 추출조건에 대한 실험계획은 박스 벤켄 계획법(Box-Behnken design)을 사용하였으며, 표 1과 같이 녹차 및 애엽의 혼합비(X1), 용매 용질의 비(X2), 추출시간(X3)을 녹차 및 애엽 혼합 추출공정에서의 중요 변수로 선택하여 각 독립변수를 -1, 0, 1의 3수준으로 부호화 하고 15구간의 추출실험을 설정하여 실험계획을 설계하였다(표 3).
| 실행 | 코드화된 변수 수준 | 추출수율 (%) | |||
| X1 | X2 | X3 | 예상값 | 실제값 | |
| 1 | 1 | -1 | 0 | 23.25 | 22.50 |
| 2 | 1 | 0 | 1 | 28.37 | 29.25 |
| 3 | 0 | 0 | 0 | 28.25 | 28.50 |
| 4 | 0 | -1 | -1 | 21.62 | 22.00 |
| 5 | -1 | 1 | 0 | 28.00 | 28.75 |
| 6 | 0 | 1 | -1 | 29.87 | 30.00 |
| 7 | 0 | 0 | 0 | 28.25 | 27.75 |
| 8 | -1 | 0 | -1 | 25.62 | 24.75 |
| 9 | 1 | 0 | -1 | 28.12 | 28.50 |
| 10 | 0 | 0 | 0 | 28.25 | 28.50 |
| 11 | -1 | -1 | 0 | 18.75 | 19.25 |
| 12 | -1 | 0 | 1 | 25.12 | 24.75 |
| 13 | 0 | -1 | 1 | 22.12 | 22.00 |
| 14 | 1 | 1 | 0 | 29.25 | 28.75 |
| 15 | 0 | 1 | 1 | 29.12 | 28.75 |
추출수율의 결과는 상기 표 3과 같고 결과를 이용한 반응모델식은 표 4에 나타내었다. 모델식은 박스 벤켄 계획법 모델에 실험 데이터를 맞추어 얻은 것이며, 반응(추출수율) 사이의 경험적 관계를 나타낸다. 다항식 모델의 일반적인 유효성 및 정확성을 암시하고 모델의 적합성을 나타내는 결정계수(R2) 값은 0.9747이였으며, 1% 이내의 유의수준에서 유의성이 인정되었다. 또한, 모델식에 각 실험조건을 대입하여 얻은 예상치는 도 3과 같이 시계열도를 통하여 실제값과 일치하는 것을 확인하였다.
| 반응 | 이차 회귀식 | R2 | p value |
| Y | Y=28.2500+1.4375X1+3.8125X2-0.0625X3-1.1563X1 2-2.2813X2 2-0.2813X3 2-0.8125X1X2+0.1875X1X3-0.3125X2X3 | 0.9747 | 0.002 |
Y, 추출수율; X1, 녹차 및 애엽의 혼합비; X2, 용매 용질의 비; X3, 추출시간.
모델의 적합성은 자료분석의 구성요소 중 필수적인 부분으로 표 5와 같이 분산분석(Analysis of variance, ANOVA)을 수행하여 반응모델의 적합성뿐만 아니라 각 항의 계수와 유의성에 대해 확인하였다.
| 소스 | DF | Seq SS | Adj SS | Adj MS | F* | 유의성(p) |
| 모델 | 9 | 158.808 | 158.808 | 17.645 | 21.39 | 0.002 |
| 일차항 | 3 | 132.844 | 132.844 | 44.281 | 53.67 | <0.0001 |
| 이차항 | 3 | 22.793 | 22.793 | 7.598 | 9.21 | 0.018 |
| 상호항 | 3 | 3.172 | 3.172 | 1.057 | 1.28 | 0.376 |
| X1 | 1 | 16.531 | 16.531 | 16.531 | 20.04 | 0.007 |
| X2 | 1 | 116.281 | 116.281 | 116.281 | 140.95 | <0.0001 |
| X3 | 1 | 0.031 | 0.031 | 0.031 | 0.04 | 0.853 |
| X1 2 | 1 | 3.536 | 4.936 | 4.936 | 5.98 | 0.058 |
| X2 2 | 1 | 18.965 | 19.215 | 19.215 | 23.29 | 0.005 |
| X3 2 | 1 | 0.292 | 0.292 | 0.292 | 0.35 | 0.578 |
| X1X2 | 1 | 2.641 | 2.641 | 2.641 | 3.20 | 0.134 |
| X1X3 | 1 | 0.141 | 0.141 | 0.141 | 0.17 | 0.697 |
| X2X3 | 1 | 0.391 | 0.391 | 0.391 | 0.47 | 0.522 |
| 잔차(residual) | 5 | 4.125 | 4.125 | 0.825 | - | - |
| 적합성 결여 | 3 | 3.750 | 3.750 | 1.250 | 6.67 | 0.133 |
| 순수오차 | 2 | 0.375 | 0.375 | 0.187 | - | - |
F: 분산비율.
그 결과, 일차항과 이차항은 유의적인 수준(p<0.05)을 보여주었으나 상호항은 통계적으로 유의하지 않아 독립변수 간의 상호작용은 이루어지지 않는 것으로 판단되었다(p>0.1). 일차항 중 X1과 X2의 유의성이 각각 0.007와 <0.0001로 본 실험의 반응모델에서 큰 중요도를 갖고 있으며, 특히 X2의 유의성은 0.0001보다 작은 값으로 F 값에 노이즈(noise)가 생길 확률이 1%도 되지 않는 높은 유의성을 보여주었다. 적합성 결여(lack of fit)는 반응모델에서 변수와 실험 요인의 함수 관계가 적절하게 설명되지 못하는 경우 유의성이 0.05보다 작은 값을 나타내며, 올바른 반응모델은 0.05보다 큰 값을 갖는다. 본 실험을 통해 얻어진 반응모델은 0.133의 유의성을 나타내어 분산분석 절차에서 얻어진 모델이 적절하다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3. 반응표면분석법을 이용한 녹차 및 애엽 혼합물의 최적추출조건
박스 벤켄 계획법에 따른 15개 구간에서 녹차 및 애엽 혼합물의 추출수율을 측정한 결과는 19.25~30.00%로 확인되었으며, MiniTab 16 프로그램을 이용하여 반응모델의 회귀방정식을 계산하였고 이 회귀방정식으로부터 각 변수의 최적화된 값을 얻었다. 최적화된 응답을 위해서 각각의 변수의 최적화된 값을 결정하고 변수들 간의 상호작용을 분석하여 3차원 반응표면과 2차원 등고선 그래프로 나타내었다(도 4 및 도 5). 초음파를 적용한 녹차 및 애엽 혼합물 추출시 추출시간의 수준을 0으로 고정하여 녹차와 애엽의 혼합비와 용매와 용질의 비에 따른 추출수율를 확인한 결과, 녹차의 함량과 추출용매의 양이 증가할수록 추출수율이 증가하는 것을 확인하였다. 반면, 녹차와 애엽의 혼합비 또는 용매와 용질의 비를 수준 0으로 고정하고 추출시간에 따른 추출수율을 확인한 결과, 추출시간은 결과에 큰 영향을 주지 않는 것으로 나타났다. 본 발명에서 MiniTab 16 프로그램을 사용하여 산출된 녹차 및 애엽 혼합물의 최적 추출조건은 녹차와 애엽의 혼합비 85.86%(즉, 녹차와 애엽의 혼합 중량비 85.86:14.14), 용매와 용질의 비 92.73mL/g, 추출시간 56.52분으로 확인되었으며, 추출수율의 최대값은 30.03%로 예측되었다.
Claims (4)
- 녹차와 애엽 혼합물로부터 초음파 추출법을 이용하여 추출물을 추출함에 있어서,
(a) 초음파 추출 조건으로서 녹차와 애엽의 혼합비(X1), 용매(mL)와 용질(g)의 비(X2) 및 추출시간(X3)을 등분하고 부호화하여 녹차와 애엽 혼합물의 추출물의 추출 계획을 수립하는 단계; 및
(b) 반응표면 분석법으로 각 추출 조건별 녹차와 애엽 혼합물의 추출물의 추출수율을 측정하는 단계를 포함하여 구성되는 초음파 추출법을 이용한 녹차와 애엽 혼합물의 추출물의 최적 추출 방법. - 제1항에 있어서, 상기 단계 (a)의 추출 조건은, 녹차와 애엽의 혼합비가 중량비로 60~100:0~40인 혼합비(X1), 20~100mL/g의 용매(mL)와 용질(g)의 비(X2) 및 25~145분의 추출시간(X3)을 3등분하여 3단계의 부호 -1, 0, 1로 부호화하여 추출 계획을 수립하는 단계로 구성되는 초음파 추출법을 이용한 녹차와 애엽 혼합물의 추출물의 최적 추출 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 추출 조건은 녹차와 애엽의 혼합비가 중량비로 85~86:14~15의 혼합비(X1), 92.5~93.0mL/g의 용매(mL)와 용질(g)의 비(X2), 56~57분의 추출시간(X3)인 것을 특징으로 하는 초음파 추출법을 이용한 녹차와 애엽 혼합물의 추출물의 최적 추출 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 단계 (b)의 반응표면 분석법으로 각 추출 조건별 추출 수율을 측정하는 단계는,
단계 (a)의 추출 계획으로 녹차와 애엽 혼합물로부터 추출물을 추출하여 실험값을 얻는 단계(단계 1);
이차 회귀식 모델을 사용하여 상기 단계 1의 실험값으로 하기 수학식 1로 표시되는 모델을 도출하는 단계(단계 2);
하기 수학식 1로 표시되는 모델을 변량분석(ANOVA)하여 신뢰도를 입증하는 단계(단계 3);
상기 단계 3에서 신뢰도가 입증된 하기 수학식 1을 이용하여 반응표면등고선을 그리는 단계(단계 4); 및
상기 단계 4의 반응표면등고선에서 추출 조건을 찾아내는 단계(단계 5);를 포함하는 초음파 추출법을 이용한 녹차와 애엽 혼합물의 추출물의 최적 추출 방법:
[수학식 1]
Y=28.2500+1.4375X1+3.8125X2-0.0625X3-1.1563X1 2-2.2813X2 2-0.2813X3 2-0.8125X1X2+0.1875X1X3-0.3125X2X3
(상기 수학식 1에 있어서, Y는 추출수율 예측값(%), X1은 녹차와 애엽의 혼합비, X2는 용매(mL)와 용질(g)의 비 및 X3은 추출시간을 의미한다.)
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| E601 | Decision to refuse application | ||
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