KR20180065473A - Reduced grapheneoxide based anionic substances carrier - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 환원된 산화그래핀 기반의 음이온성 물질의 전달체, 및 이의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a reduced oxidized graphene-based anionic material carrier, and a method of making the same.
세포 내 유전자 도입은 기능성 유전자의 도입을 통해 특정 세포 활성을 증폭 혹은 억제함으로써 세포 내 유전자, 단백질의 기능 및 활성부위, 세포 내 신호전달과정 등 복잡한 유전체, 단백질체의 생물학적 역할 규명뿐만 아니라 다양한 유전자 이상에 기인하는 유전적 질병 원인의 규명 및 치료에까지 다양한 방면에서 반드시 필요한 기술로 여겨진다.Intracellular gene transduction involves amplifying or inhibiting specific cellular activities through the introduction of functional genes, thereby identifying the biological roles of intracellular genes, protein functions and active sites, complex genomes such as intracellular signal transduction processes, protein bodies, It is considered to be a necessary technique in various aspects from the identification and treatment of genetic diseases caused by the disease.
유전자의 원활한 도입을 위해 유전자를 갖고 세포 내로 효과적으로 진입할 수 있는 전달체를 이용하게 되는데 이러한 전달체는 바이러스 벡터와 비바이러스 벡터 두 종류로 분류된다. 바이러스 벡터(vector)는 높은 유전자 도입 효율에도 불구하고 자체의 독성과 숙주 면역반응 유도 등 바람직한 전달체로서 한계를 보이고 있어 더욱 안전하면서도 세포 내 도입 효율이 우수한 비바이러스 벡터를 많이 이용하고 있으며 비바이러스 전달체는 주로 다양한 양이온성 지질, 고분자, 리포좀, 나노입자(금, 실리카, 탄소나노튜브 등) 등이 개발되어 실제로 표면 부착성 동물세포에 적용되고 있다.For the smooth introduction of the gene, the transporter can be used as a transporter which has a gene and can enter the cell efficiently. These transporters are classified into two types of viral and nonviral vectors. Despite the high efficiency of transfection, the viral vector has limitations as a desirable transporter such as its own toxicity and induction of host immune response. Therefore, nonviral vectors which are more safe and have better efficiency of intracellular introduction are widely used. Various cationic lipids, polymers, liposomes, nanoparticles (gold, silica, carbon nanotubes, etc.) have been developed and applied to surface-adherent animal cells.
최근, 탄소계 나노 입자 중 그래핀 및 그래핀 산화물은 독특한 기하학적 형태와 자체의 우수한 전기적, 열적 전도도, 생체적합성 등의 특성 등으로 약물전달 (drug delivery, 세포 이미징 (imaging), 광-열적 치료 (photothermal therapy), 바이오센서, 조직공학 등 다양한 의생명 응용 분야에서 이용 가능한 물질로서 새롭게 출현하여 많은 관심을 받고 있다.Recently, graphene and graphene oxide in carbon-based nanoparticles have been used for drug delivery (cell imaging, photo-thermal treatment) due to their unique geometric shape and their excellent electrical and thermal conductivity and biocompatibility photothermal therapy), biosensor, tissue engineering, and the like.
하지만, 그래핀 자체의 소수성 때문에 수용액 상태에서 응집현상이 일어나 수용액 상태에서 배양되는 세포에 바로 적용하기에 적합하지 않고, 그래핀 산화물 (GO) 은 자체의 친수성과 높은 생체적합성, 기능성 도입의 용이함에도 불구하고 유전물질과 바로 상호작용할 수 있는 관능기를 보유하고 있지 않을 뿐 아니라 독특하고 매력적인 특성을 갖는 환원형 그래핀으로의 환원과정에서 독성 환원제의 사용과 고온의 열처리 과정의 필요, 재현성의 부재, 대량생산의 어려움 등의 문제가 제기되고 있다.However, due to the hydrophobicity of graphene itself, it is not suitable for immediate application to cells cultured in aqueous solution due to the agglomeration phenomenon in the aqueous solution state. Graphene oxide (GO) has its hydrophilicity, high biocompatibility, Despite the fact that it does not have functional groups capable of directly interacting with the genetic material, the use of toxic reducing agents and the need for a high-temperature heat treatment process, the lack of reproducibility, the large amount And difficulties in production.
따라서, 환원형 그래핀 자체의 독특한 물성을 살리고, 용매 분산성을 유지하면서도 유전자와의 안정적인 친화성을 갖는 그래핀의 관능기 형성 방법에 관한 연구가 반드시 필요한 실정이다. Therefore, studies on a functional group formation method of graphene which has unique affinity of reduced graphene itself and which has stable affinity with a gene while maintaining solvent dispersibility is indispensable.
이에 본 발명자들은 수용액 상태에서 우수한 분산성을 유지하는 기능성 그래핀 제조를 위한 그래핀 표면처리에 관련 연구를 수행하던 중 그래핀 산화물의 카르복실 작용기에 양이온성고분자 및 친수성고분자를 공유결합한 상태에서 방사선을 조사하였을 때 그래핀이 환원되었음에도 재응집 없이 안정적인 분산성을 유지하였으며, 이를 유전자 전달체로 적용하여 세포내에 도입시켰을 때 도입된 유전자로부터 단백질이 성공적으로 발현됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the inventors of the present invention have conducted studies on the surface treatment of graphene for the production of functional graphene which maintains good dispersibility in an aqueous solution state. In the state of covalent bonding of cationic polymer and hydrophilic polymer to carboxyl functional group of graphene oxide, The present inventors completed the present invention by confirming that the protein was successfully expressed from the introduced gene when introduced into a cell by applying it as a gene delivery vehicle.
본 발명의 목적은 음이온성 물질의 전달체를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a carrier of an anionic material.
본 발명의 다른 목적은 상기 음이온성 물질의 전달체의 제조방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for producing the carrier of the anionic substance.
본 발명의 또 다른 목적은 세포내 유전자 전달체를 제공하는 것이다.Yet another object of the present invention is to provide an intracellular gene carrier.
본 발명의 다른 목적은 상기 세포내 유전자 전달체의 제조방법을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a method for producing the intracellular gene delivery system.
상기 목적을 달성하기 위하여,In order to achieve the above object,
본 발명은 환원된 산화그래핀(rGO, reduced Graphene Oxide)에 친수성고분자 및 양이온성고분자가 화학적으로 결합된 것을 특징으로 하는 음이온성 물질의 전달체를 제공한다.The present invention provides an anionic material carrier characterized in that a hydrophilic polymer and a cationic polymer are chemically bonded to reduced graphene oxide (rGO).
또한, 본 발명은 산화그래핀(GO, Graphene Oxide)이 포함된 수용액을 준비하는 단계(단계 1);In addition, the present invention provides a method of manufacturing a semiconductor device, comprising: preparing an aqueous solution containing graphene oxide (GO) (step 1);
상기 단계 1에서 준비한 산화그래핀(GO) 포함 수용액에 카르복실기와 결합을 이룰 수 있는 말단 작용기를 갖는 친수성고분자 및 양이온성고분자를 첨가하여, 산화그래핀에 존재하는 카르복실기와 상기 친수성고분자 및 양이온성고분자를 화학적으로 결합하는 단계(단계 2); 및The hydrophilic polymer and the cationic polymer having a terminal functional group capable of forming a bond with a carboxyl group are added to the aqueous solution containing the oxidized graphene (GO) prepared in the step 1, and the carboxyl group present in the oxidized graphene, the hydrophilic polymer and the cationic polymer (Step 2); And
상기 친수성고분자 및 양이온성고분자가 화학적으로 결합된 산화그래핀(GO)에 방사선을 조사하여, 친수성고분자 및 양이온성고분자가 화학적으로 결합되고 환원된 산화그래핀(rGO, reduced Graphene Oxide)으로 개질하는 단계(단계 3);(GO) chemically bonded to the hydrophilic polymer and the cationic polymer is irradiated with a radiation to chemically bond the hydrophilic polymer and the cationic polymer to each other to be modified with reduced graphene oxide (rGO) Step (step 3);
를 포함하는 상기 음이온성 물질의 전달체의 제조방법을 제공한다.And a method for producing the carrier of the anionic substance.
나아가, 본 발명은 상기 음이온성 물질의 전달체의 양이온성 고분자와 음이온성 유전자가 이온결합으로 결합된 것을 특징으로 하는 세포내 유전자 전달체를 제공한다.Furthermore, the present invention provides an intracellular gene delivery system characterized in that the cationic polymer and the anionic gene of the carrier of the anionic substance are bound by ionic bonding.
또한, 본 발명은 산화그래핀(GO, Graphene Oxide)이 포함된 수용액을 준비하는 단계(단계 1);In addition, the present invention provides a method of manufacturing a semiconductor device, comprising: preparing an aqueous solution containing graphene oxide (GO) (step 1);
상기 단계 1에서 준비한 산화그래핀(GO) 포함 수용액에 카르복실기와 결합을 이룰 수 있는 말단 작용기를 갖는 친수성고분자 및 양이온성고분자를 첨가하여, 산화그래핀에 존재하는 카르복실기와 상기 친수성고분자 및 양이온성고분자를 화학적으로 결합하는 단계(단계 2);The hydrophilic polymer and the cationic polymer having a terminal functional group capable of forming a bond with a carboxyl group are added to the aqueous solution containing the oxidized graphene (GO) prepared in the step 1, and the carboxyl group present in the oxidized graphene, the hydrophilic polymer and the cationic polymer (Step 2);
상기 단계 2에서 준비한 친수성고분자 및 양이온성고분자가 화학적으로 결합된 산화그래핀(GO)에 방사선을 조사하여, 친수성고분자 및 양이온성고분자가 화학적으로 결합되고 환원된 산화그래핀(rGO, reduced Graphene Oxide)으로 개질하는 단계(단계 3); 및The graphene (GO) chemically bonded to the hydrophilic polymer and the cationic polymer prepared in the step 2 is irradiated with a radiation to chemically bond the hydrophilic polymer and the cationic polymer to form a reduced graphene oxide (rGO) ) (Step 3); And
상기 단계 3에서 준비한 친수성고분자 및 양이온성고분자가 화학적으로 결합되고 환원된 산화그래핀(rGO, reduced Graphene Oxide)과 음이온성 유전자를 혼합하여, 상기 양이온성고분자와 음이온성 유전자가 이온결합을 형성하는 단계(단계 4);The hydrophilic polymer and the cationic polymer prepared in the step 3 are chemically bonded and mixed with reduced graphene oxide (rGO) and an anionic gene to form an ionic bond between the cationic polymer and the anionic gene Step (step 4);
를 포함하는 상기 세포내 유전자 전달체의 제조방법을 제공한다.The present invention provides a method for producing the intracellular gene delivery system.
본 발명에 따라 제조된 음이온성 물질(유전자, 단백질, 약물, 생체분자 등)의 전달체는 환원된 산화그래핀에 친수성고분자 및 양이온성고분자가 화학적으로 결합되어 있어, 상기 친수성고분자는 수용액 상태에서 분산성을 부여하는 역할을 하고, 상기 양이온성고분자는 음이온성 물질과 이온결합하는 역할을 함에 따라서, 유전자/단백질 발현 및 세포신호전달 기초연구뿐만 아니라 약물전달 (drug delively), 세포 이미징 (imaging), 광-열적 치료 (photothermal therapy), 바이오센서, 조직공학 등 다양한 의생명 산업 분야에 유용할 수 있다.The carrier of the anionic substance (gene, protein, drug, biomolecule, etc.) produced according to the present invention is chemically bonded to the reduced oxidized graphene by a hydrophilic polymer and a cationic polymer, And the cationic polymer ion-binds to the anionic substance. Therefore, the cationic polymer ion-binds to the anionic material, and therefore, it can be used for drug-deliv- ery, cell imaging, Photothermal therapy, biosensors, tissue engineering, and the like.
또한, 산화그래핀(GO)을 환원된 산화그래핀(rGO)으로 개질할 시에 방사선 조사를 이용하므로, 유해한 독성 환원제를 사용하지 않아 세포기반의 생물학적 연구에 적합한 효과가 있고, 고온의 열처리 과정이 배제되므로 에너지 절감을 기대할 수 있을 뿐 아니라 단순, 신속하면서도 친환경적인 공정을 제공할 수 있는 효과가 있다.Further, since the irradiation of the graphene oxide (GO) with the reduced graphene graphene (rGO) is carried out using radiation, harmful toxic reducing agents are not used, which is suitable for biological studies of cell-based biology. It is possible to expect not only energy savings but also a simple, fast and environmentally friendly process.
도 1은 본 발명에 따른 화학적 짝지움 반응과 방사선 환원 반응을 통한 그래핀 산화물로부터 환원형 그래핀 기반 나노 유전자 전달체 제조 순서도이다.
도 2는 세포 내 도입에 유리한 작은 시트 크기를 갖는 그래핀 산화물을 초음파조(sonication bath, Branson 8510) 처리 1시간과 탐침형 초음파(probe sonication, Ultrasonication processor, CP750) 처리 과정을 차례대로 적용한 용액을 3 μm 의 시린지 필터를 통과시켜 회수한 그래핀 산화물의 시트 크기를 확인하기 위해 시트크기를 확인할 수 있는 장비인 동적광산란 입도분석장비 (DLS,dynamic light scattering, DilateTM Nano)를 이용하여 시트크기를 측정한 결과이다.
도 3은 순수한 그래핀 산화물, 순수한 PEG-amine, 순수한 PEI 및 이들과 화학적 짝지움 반응을 통해 제조된 친수성 및 양이온성 고분자가 표면처리된 그래핀 산화물 나노 구조체(GO-PEG-PEI)의 푸리에 변환 적외선 분광분석 (FT-IR) 스펙트럼이다.
도 4는 PEG와 PEI로 표면처리된 그래핀 산화물 나노구조체(GO-PEG-PEI) 로부터 방사선 환원을 통해 제조된 환원형 그래핀 나노 유전자 전달체(rGO-PEG-PEI)의 전자선 조사 전 후 사진이다.
도 5는 상업화된 유전자 전달체인 Lipofectamine 2000과 본 발명의 실시예에서 제조된 환원형 그래핀 기반의 유전자 전달체를 이용한 유전자 도입 24시간 후 세포 배양 광학현미경 사진이다.
도 6은 상업화된 유전자 전달체인 Lipofectamine 2000과 본 발명의 실시예에서 제조된 환원형 그래핀 기반의 유전자 전달체를 이용한 녹색(pEGFP) 및 적색(pdsRED) 형광단백질 발현 플라스미드 유전자 도입 24시간 후 녹색 (GFP) 및 적색(RFP)형광 단백질의 발현 형광현미경 사진이다.FIG. 1 is a flowchart showing the preparation of a reduced graphene-based nano-gene delivery material from a graphene oxide by a chemical coupling reaction and a radiation reduction reaction according to the present invention.
FIG. 2 is a graph showing the results of a solution of graphene oxide having a small sheet size, which is advantageous for intracellular introduction, in a sonication bath (Branson 8510) for 1 hour and a probe sonication (Ultrasonication processor, CP750) To determine the sheet size of the graphene oxide recovered by passing through a 3 μm syringe filter, the sheet size was measured using Dynamic Light Scattering (DLS, Dynamic Light Scattering, Dilate ™ Nano) .
FIG. 3 shows the Fourier transform of a graphene oxide nanostructure (GO-PEG-PEI) surface treated with pure graphene oxide, pure PEG-amine, pure PEI, and hydrophilic and cationic polymers prepared through a chemical coupling reaction therewith Infrared spectroscopy (FT-IR) spectrum.
FIG. 4 is a photograph before and after electron beam irradiation of a reduced graphene nano-gene carrier (rGO-PEG-PEI) prepared by radiation reduction from a graphene oxide nanostructure surface-treated with PEG and PEI (GO-PEG-PEI) .
FIG. 5 is a photograph of a cell culture optical microscope after Lipofectamine 2000, which is a commercialized gene transfer, and the reduced graphene-based gene carrier prepared in the example of the present invention, 24 hours after the introduction of the gene.
FIG. 6 is a graph showing the fluorescence intensity of green (pGFP) and red (pdsRED) fluorescent protein expression plasmids introduced 24 hours after the introduction of the green (pgsFP) and red (pdsRED) fluorescent protein expression plasmid using the commercialized
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
음이온성Anionic 물질의 전달체 The carrier of matter
본 발명은 환원된 산화그래핀(rGO, reduced Graphene Oxide)에 친수성고분자 및 양이온성고분자가 화학적으로 결합된 것을 특징으로 하는 음이온성 물질의 전달체를 제공한다.The present invention provides an anionic material carrier characterized in that a hydrophilic polymer and a cationic polymer are chemically bonded to reduced graphene oxide (rGO).
상기 친수성 고분자는 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리알릴아민(poly(allylamine)), 폴리아크릴아미드(polyacrylamide) 등을 단독으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다.The hydrophilic polymer may be selected from the group consisting of polyethylene glycol (PEG), poly (allylamine), polyacrylamide, and the like.
상기 양이온성고분자는 가지형폴리에틸렌이민(BPEI), 선형폴리에틸렌이민(PEI), 폴리아미도아민(PAA), 폴리-L-라이신(PLL) 등을 사용할 수 있다.The cationic polymer may be branched polyethylenimine (BPEI), linear polyethyleneimine (PEI), polyamidoamine (PAA), poly-L-lysine (PLL) or the like.
상기 '화학적으로 결합'은 아마이드 결합 등과 같은 유기화학 반응을 모두 사용할 수 있다. 여기서, 산화그래핀(GO)에 존재하는 카르복실기와 화학결합을 형성할 수 있는 치환기가 상기 친수성고분자 및 양이온성고분자의 말단에 도입되어 있는 것을 특징으로 한다.The 'chemically bonded' may be an organic chemical reaction such as an amide bond. Here, a substituent capable of forming a chemical bond with the carboxyl group present in the oxidized graphene (GO) is introduced at the terminal of the hydrophilic polymer and the cationic polymer.
상기 음이온성 물질로는 유전자, 단백질, 약물, 생체분자 등을 사용할 수 있다.The anionic substance may be a gene, a protein, a drug, a biomolecule, or the like.
상기 전달체의 크기는 바람직하게는 10-1000 nm일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.The size of the carrier may be, but is not limited to, 10-1000 nm.
본 발명에 따른 음이온성 물질의 전달체는 GO(Graphene Oxide)에 비해서 rGO(reduced Graphene Oxide)로 환원하여 사용하는 것이 유리하다. 종래에 GO에 비해서 rGO의 전기적, 물리적 특성이 현저히 향상되는 것은 이미 잘 알려져 있다. 특히, 광-열적 치료(photothermal therapy)에 본 발명의 음이온성 물질의 전달체를 활용할 경우 유리한 효과가 극대화되는데, 광-열적 치료시에 열전도도와 광학적 특성이 향상되어 광(near-infrared, NIR) 자극으로 인한 음이온성 물질의 전달 능력이 향상되는 효과가 있다.The carrier of the anionic material according to the present invention is advantageously reduced to rGO (reduced graphene oxide) compared to GO (Graphene Oxide). It is well known that the electrical and physical properties of rGO are significantly improved compared to GO in the past. Particularly, when the anionic substance carrier of the present invention is used for photothermal therapy, the advantageous effect is maximized. In the photo-thermal treatment, the thermal conductivity and the optical property are improved, and the near-infrared (NIR) Thereby improving the ability of the anionic material to transfer.
또한, 전달체로서 GO에 비해 rGO를 사용할 경우에는 방향족 고리 부분이 rGO가 GO에 비해 더욱 소수성을 나타내기 때문에, 소수성 약물을 로딩할 시에 더욱 유리한 효과가 있을 수도 있다.In addition, when rGO is used as a carrier as compared to GO, the aromatic ring moiety may have a more advantageous effect in loading hydrophobic drugs because rGO is more hydrophobic than GO.
음이온성Anionic 물질의 전달체의 제조방법 Method of manufacturing a carrier of matter
본 발명은 산화그래핀(GO, Graphene Oxide)이 포함된 수용액을 준비하는 단계(단계 1);The present invention relates to a method of preparing an aqueous solution containing graphene oxide (GO) (step 1);
상기 단계 1에서 준비한 산화그래핀(GO) 포함 수용액에 카르복실기와 결합을 이룰 수 있는 말단 작용기를 갖는 친수성고분자 및 양이온성고분자를 첨가하여, 산화그래핀에 존재하는 카르복실기와 상기 친수성고분자 및 양이온성고분자를 화학적으로 결합하는 단계(단계 2); 및The hydrophilic polymer and the cationic polymer having a terminal functional group capable of forming a bond with a carboxyl group are added to the aqueous solution containing the oxidized graphene (GO) prepared in the step 1, and the carboxyl group present in the oxidized graphene, the hydrophilic polymer and the cationic polymer (Step 2); And
상기 친수성고분자 및 양이온성고분자가 화학적으로 결합된 산화그래핀(GO)에 방사선을 조사하여, 친수성고분자 및 양이온성고분자가 화학적으로 결합되고 환원된 산화그래핀(rGO, reduced Graphene Oxide)으로 개질하는 단계(단계 3);(GO) chemically bonded to the hydrophilic polymer and the cationic polymer is irradiated with a radiation to chemically bond the hydrophilic polymer and the cationic polymer to each other to be modified with reduced graphene oxide (rGO) Step (step 3);
를 포함하는 음이온성 물질의 전달체의 제조방법을 제공한다.The present invention also provides a method for producing an anionic material carrier.
본 발명에 따른 음이온성 물질의 전달체의 제조방법에 있어서, 상기 단계 1은 산화그래핀(GO, Graphene Oxide)이 포함된 용액을 준비하는 단계이다. In the method of preparing an anionic material carrier according to the present invention, step 1 is a step of preparing a solution containing graphene oxide (GO).
구체적으로, 본 단계 1에서는 생체내 또는 세포내 전달체로 사용하기 위해 산화그래핀을 10-1000 nm, 바람직하게는 10-500 nm 크기로 준비할 수 있고, 초음파 조사 조건 조절을 통해 산화그래핀의 크기를 조절할 수 있다. 상기 산화그래핀으로는 수용성 산화그래핀으로 시중에서 구매할 수 있는 것이라면 모두 사용할 수 있다.Specifically, in this step 1, it is possible to prepare graphene oxide having a size of 10-1000 nm, preferably 10-500 nm, for use as an in vivo or intracellular carrier, You can adjust the size. As the oxidized graphene, water soluble oxidized graphene can be used as long as it can be purchased commercially.
본 발명에 따른 음이온성 물질의 전달체의 제조방법에 있어서, 상기 단계 2는 상기 단계 1에서 준비한 산화그래핀(GO) 포함 용액에 카르복실기와 결합을 이룰 수 있는 말단 작용기를 갖는 친수성고분자 및 양이온성고분자를 첨가하여, 산화그래핀에 존재하는 카르복실기와 상기 친수성고분자 및 양이온성고분자를 화학적으로 결합하는 단계이다.In the method for preparing an anionic material carrier according to the present invention, the step 2 is a step of dissolving a hydrophilic polymer having a terminal functional group capable of forming a bond with a carboxyl group in a graphene oxide (GO) -containing solution prepared in the step 1 and a cationic polymer To chemically bond the carboxyl group present in the oxidized graphene to the hydrophilic polymer and the cationic polymer.
구체적으로, 상기 친수성고분자 및 양이온성고분자의 예는 상술한 바와 같다. 산화그래핀과 상기 친수성고분자 및 양이온성고분자의 화학결합을 형성하기 위한 시약으로는 1-에틸-3'-(3-디메틸아미노프로필)카보다이이미드(1-ethyl-3'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, EDC), N,N’-디이소프로필카르보디이미드(N,N’-diisopropylcarbondiimide, DIC), N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(N,N'- dicyclohexylcarbodiimide, DCC) 등을 사용할 수 있다.Specifically, examples of the hydrophilic polymer and the cationic polymer are as described above. As a reagent for forming a chemical bond between the graphene oxide and the hydrophilic polymer and the cationic polymer, 1-ethyl-3 '- (3-dimethyl-3' - (3-dimethylaminopropyl ) carbodiimide (EDC), N, N'-diisopropylcarbondiimide (DIC), N, N'-dicyclohexylcarbodiimide Can be used.
또한, 상기 친수성고분자 및 양이온성고분자는 수용성 용매에 용해한 다음 사용할 수 있고, 상기 수용성 용매로는 물, 메탄올, 에탄올 등을 단독으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다.The hydrophilic polymer and the cationic polymer may be dissolved in a water-soluble solvent and then used. The water-soluble solvent may be water, methanol, ethanol, etc., alone or in combination.
본 발명에 따른 음이온성 물질의 전달체의 제조방법에 있어서, 상기 단계 3은 상기 친수성고분자 및 양이온성고분자가 화학적으로 결합된 산화그래핀(GO)에 방사선을 조사하여, 친수성고분자 및 양이온성고분자가 화학적으로 결합되고 환원된 산화그래핀(rGO, reduced Graphene Oxide)으로 개질하는 단계이다.In the method of manufacturing an anionic material carrier according to the present invention, step 3 is a step of irradiating a graft oxide (GO) chemically bonded with the hydrophilic polymer and the cationic polymer to irradiate the hydrophilic polymer and the cationic polymer Is chemically bonded and modified with reduced graphene oxide (rGO).
구체적으로, 상기 방사선은 알파선, 베타선, 감마선, 전자선, 자외선, X-선 등을 사용할 수 있고, 바람직하게는 전자선 또는 감마선을 사용할 수 있다.Specifically, the radiation may be an alpha ray, a beta ray, a gamma ray, an electron ray, an ultraviolet ray, an X ray or the like, and preferably an electron ray or a gamma ray may be used.
상기 방사선은 1~10 kGy/min의 조사 선량율으로 총 50 ~ 200 kGy의 조사량을 조사하는 것이 바람직하다. 이때, 상기 조사 선량율이 1 kGy/min 보다 낮거나 총 조사량이 50 kGy 보다 낮을 경우 환원효율이 낮아 환원형 그래핀의 기대되는 전기적, 광학적 물성을 충족하지 못하는 문제가 있을 수 있고, 조사 선량율이 10 kGy/min 보나 높거나 총 조사량이 200 k㏉를 초과하는 경우, 과도한 짝지움 반응으로 과량의 고분자가 그래핀 표면에 존재하게 되어 환원형 그래핀 자체의 전기적, 광학적 물성을 기대할 수 없거나 전자선 조사량의 증가에도 더 이상 환원 효율에 변화가 없는 문제가 있을 수 있다.Preferably, the radiation is irradiated with a dose of 50 to 200 kGy at an irradiation dose rate of 1 to 10 kGy / min. If the irradiation dose rate is less than 1 kGy / min or the total irradiation amount is less than 50 kGy, there may be a problem that the reduction efficiency is low and the expected electrical and optical properties of the reduced graphene can not be satisfied. If the irradiation dose rate is 10 If kGy / min is high or the total dose is more than 200 kΩ, excess polymer is present on the graphene surface due to the excessive coupling reaction, so that the electrical and optical properties of the reduced graphene itself can not be expected, There may be a problem that the reduction efficiency is no longer changed.
세포내Intracellular 유전자 전달체 Gene carrier
본 발명은 상기 음이온성 물질의 전달체의 양이온성 고분자와 음이온성 유전자가 이온결합으로 결합된 것을 특징으로 하는 세포내 유전자 전달체를 제공한다.The present invention provides an intracellular gene carrier characterized in that cationic polymer and anionic gene of the carrier of the anionic substance are bound by ionic bonding.
상기 유전자는 플라스미드 DNA 벡터 등을 사용할 수 있고, 상기 플라스미드 DNA 벡터는 세포 내에 도입되어 특정 단백질을 (과)발현 혹은 발현 억제를 통해 세포의 생리활성(생존, 증식, 사멸, 분화 등)에 영향을 미칠 수 있는 기능을 갖는 shRNA, siRNA 벡터 및 기능성 유전자를 포함하고 있으면서 음전하를 띄고 있는 벡터라면 그 종류와 상관없이 사용할 수 있다.The gene may be a plasmid DNA vector, and the plasmid DNA vector may be introduced into the cell to affect the physiological activity (survival, proliferation, apoptosis, differentiation, etc.) of the cell through inhibition of expression or expression of a specific protein A shRNA having a function capable of carrying out, an siRNA vector, and a vector having a negative charge while containing a functional gene can be used irrespective of its type.
또한, 사용될 수 있는 세포주의 종류로는 인간 및 쥐 유래의 동물 세포주로써 섬유아세포, 각질세포, 암세포, 줄기세포 등이 있고, 주로 세포신호전달, 세포 간 상호작용, 세포 증식, 독성실험 등 세포생물학 연구에 많이 사용되는 NIH3T3(mouse fibroblast), L929(mouse fibroblast), HEK293(human embryonic kidney fibroblast), HaCaT(human keratinocyte), HepG2(human hepatocellular carcinoma), HeLa(human cervical cancer), MCF-7(breast cancer), HUVECs(human umbilical vein endothelial cells) 등 일반적인 유전자 도입(gene transfection)에 과정에 유리하도록 표면에 부착하여 배양되는 부착성 세포들을 사용하는 것이 바람직하다.Examples of cell lines that can be used include human and mouse-derived animal cell lines such as fibroblasts, keratinocytes, cancer cells, and stem cells, and mainly include cell signaling, cell-cell interactions, cell proliferation, (Human fibroblast), H9293 (human embryonic kidney fibroblast), HaCaT (human keratinocyte), HepG2 (human hepatocellular carcinoma), HeLa (human cervical cancer), MCF-7 cancer cells, and HUVECs (human umbilical vein endothelial cells), which are advantageous for gene transfection.
본 발명에 따른 세포내 유전자 전달체는 GO(Graphene Oxide)에 비해서 rGO(reduced Graphene Oxide)로 환원하여 사용하는 것이 유리하다. 종래에 GO에 비해서 rGO의 전기적, 물리적 특성이 현저히 향상되는 것은 이미 잘 알려져 있다. 특히, 광-열적 치료(photothermal therapy)에 본 발명의 세포내 유전자 전달체를 활용할 경우 유리한 효과가 극대화되는데, 광-열적 치료시에 열전도도와 광학적 특성이 향상되어 광(near-infrared, NIR) 자극으로 인한 유전자의 전달 능력이 향상되는 효과가 있다.The intracellular gene delivery according to the present invention is advantageous in that it is reduced to rGO (reduced graphene oxide) as compared to GO (Graphene Oxide). It is well known that the electrical and physical properties of rGO are significantly improved compared to GO in the past. Particularly, when the intracellular gene delivery system of the present invention is used for photothermal therapy, the advantageous effect is maximized. In the photo-thermal treatment, the thermal conductivity and the optical property are improved and the near-infrared (NIR) The gene transfer ability is enhanced.
세포내Intracellular 유전자 전달체의 제조방법 Method for producing gene carrier
본 발명은 산화그래핀(GO, Graphene Oxide)이 포함된 용액을 준비하는 단계(단계 1);The present invention relates to a method of preparing a solution containing graphene oxide (GO) (step 1);
상기 단계 1에서 준비한 산화그래핀(GO) 포함 용액에 카르복실기와 결합을 이룰 수 있는 말단 작용기를 갖는 친수성고분자 및 양이온성고분자를 첨가하여, 산화그래핀에 존재하는 카르복실기와 상기 친수성고분자 및 양이온성고분자를 화학적으로 결합하는 단계(단계 2);The hydrophilic polymer and the cationic polymer having a terminal functional group capable of binding to the carboxyl group are added to the oxidized graphene (GO) -containing solution prepared in the step 1, and the carboxyl group present in the oxidized graphene, the hydrophilic polymer and the cationic polymer (Step 2);
상기 단계 2에서 준비한 친수성고분자 및 양이온성고분자가 화학적으로 결합된 산화그래핀(GO)에 방사선을 조사하여, 친수성고분자 및 양이온성고분자가 화학적으로 결합되고 환원된 산화그래핀(rGO, reduced Graphene Oxide)으로 개질하는 단계(단계 3); 및The graphene (GO) chemically bonded to the hydrophilic polymer and the cationic polymer prepared in the step 2 is irradiated with a radiation to chemically bond the hydrophilic polymer and the cationic polymer to form a reduced graphene oxide (rGO) ) (Step 3); And
상기 단계 3에서 준비한 친수성고분자 및 양이온성고분자가 화학적으로 결합되고 환원된 산화그래핀(rGO, reduced Graphene Oxide)과 음이온성 유전자를 혼합하여, 상기 양이온성고분자와 음이온성 유전자가 이온결합을 형성하는 단계(단계 4);The hydrophilic polymer and the cationic polymer prepared in the step 3 are chemically bonded and mixed with reduced graphene oxide (rGO) and an anionic gene to form an ionic bond between the cationic polymer and the anionic gene Step (step 4);
를 포함하는 상기 세포내 유전자 전달체의 제조방법을 제공한다.The present invention provides a method for producing the intracellular gene delivery system.
본 발명에 따른 세포내 유전자 전달체의 제조방법에 있어서, 상기 단계 1 내지 3은 상술항 '음이온성 물질의 전달체의 제조방법'에서 상술한 바와 같다.In the method for producing an intracellular gene carrier according to the present invention, the above steps 1 to 3 are as described above in the above-mentioned 'method for preparing an anionic substance carrier'.
본 발명에 따른 세포내 유전자 전달체의 제조방법에 있어서, 상기 단계 4는 상기 단계 3에서 준비한 친수성고분자 및 양이온성고분자가 화학적으로 결합되고 환원된 산화그래핀(rGO, reduced Graphene Oxide)과 음이온성 유전자를 혼합하여, 상기 양이온성고분자와 음이온성 유전자가 이온결합을 형성하는 단계이다.In the method for preparing an intracellular gene carrier according to the present invention, the step 4 is a step in which the hydrophilic polymer and the cationic polymer prepared in the step 3 are chemically bonded and reduced with rGO (reduced Graphene Oxide) and an anionic gene And the cationic polymer and the anionic gene form an ionic bond.
구체적으로, 하나의 용기에 친수성고분자 및 양이온성고분자가 화학적으로 결합되고 환원된 산화그래핀(rGO)와 음이온성 유전자를 혼합하고, 30분 내지 5시간 동안 혼합하여 정전기적 결합을 유도할 수 있다.Specifically, a hydrophilic polymer and a cationic polymer are chemically bonded to one container, and the reduced graphene oxide (rGO) and the anionic gene are mixed and mixed for 30 minutes to 5 hours to induce electrostatic bonding .
상기 음이온성 유전자의 예는 '세포내 유전자 전달체'에서 상술한 바와 같다.An example of such an anionic gene is as described above in " intracellular gene carrier ".
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited by the following examples.
<< 실시예Example 1> 전자선을 이용한 환원형 1> Reduction type using electron beam 그래핀Grapina (( rGOrGO -PEG--PEG- BPEIBPEI ) 기반 유전자 전달체의 제조) -Based gene delivery
단계1: 세포내 도입에 적합한 크기(평균 시트크기 150 ~ 200 nm)를 갖는 그래핀 산화물 나노 시트 제조 및 화학적 짝지움 반응을 통한 친수성 고분자와 양전하성 고분자로 표면처리된 그래핀 산화물 나노 구조체(GO-PEG-PEI) 제조Step 1: Preparation of graphene oxide nanosheet having a size suitable for intracellular introduction (average sheet size 150-200 nm) and graphene oxide nanostructure surface-treated with hydrophilic polymer and positively charged polymer through chemical coupling reaction (GO -PEG-PEI) < / RTI >
증류수에 분산되어 있는 5 mg/mL의 그래핀 산화물을 (Graphene Oxide (GO), Graphene Supermarket)을 물로 희석하여 1.25 mg/mL 농도를 갖는 30 mL의 그래핀 산화물 용액을 만든 뒤 용액이 담긴 유리병이 물에 담지 된 상태로 초음파조(sonication bath, Branson 8510) 처리 1시간과 탐침형 초음파(probe sonication, Ultrasonication processor, CP750) 처리 과정을 차례대로 적용한 용액을 3 μm의 시린지 필터를 통과시켜 통과된 용액을 회수함으로써 약 150 ~ 200 nm 이하의 평균 시트 크기를 갖는 그래핀 산화물 용액을 제조하고 다음 반응을 위해 고무마개로 유리병의 막은 다음 30분간 질소 충진하였다.The graphene oxide (Graphene Oxide (GO), Graphene Supermarket) dispersed in distilled water was diluted with water to make 30 mL of graphene oxide solution with a concentration of 1.25 mg / mL. Then, The solution, in which the sonication bath (Branson 8510) for 1 hour and the probe sonication (Ultrasonication processor, CP750) were applied in this order, was passed through a 3 μm syringe filter The solution was recovered to prepare a graphene oxide solution having an average sheet size of about 150 to 200 nm or less, and the film of the glass bottle was filled with nitrogen gas for the next 30 minutes.
반응을 위해 먼저 증류수에 말단이 아민화된 PEG(amine-PEG)와 BPEI(branched Polyethyleneimine, 25 kDa, sigma aldrich)를 용해하여 각각 0.5 mg/mL 농도를 갖는 고분자 용액을 미리 준비한다. 이후 상기에서 만들어진 그래핀 산화물 용액 30 mL에 10 mg의 짝지움 반응 시약인 EDC와 10 mg의 NHS를 15 mL의 증류수에 녹여 미리 준비한 용액을 주사기를 이용하여 천천히 첨가하고 5시간 동안 교반하여 전-활성화 과정(pre-activation)을 수행하였다. 미리 만들어 놓은 amine-PEG용액 10 mL와 BPEI 용액 10 mL을 차례로 주사기를 이용하여 천천히 첨가하고 상온에서 24시간 동안 교반하면서 반응시켜 줌으로써 EDC/NHS 에 의한 짝지움 반응(그래핀 산화물(GO)의 COOH 그룹과 각 고분자들의 amine 그룹 사이에서의 아미드화 (Amidation) 반응)을 통해 친수성 고분자인 amine-PEG와 양전하성 고분자인 BPEI가 동시에 표면처리된 그래핀 산화물 나노 구조체(GO-PEG-PEI)를 제조하였다.For the reaction, PEG (amine-PEG) and BPEI (branched polyethyleneimine, 25 kDa, Sigma aldrich) are first dissolved in distilled water to prepare a polymer solution having a concentration of 0.5 mg / mL. Then, 10 mL of EDC and 10 mg of NHS were dissolved in 15 mL of distilled water, and the previously prepared solution was added slowly to the 30 mL of the prepared graphene oxide solution using a syringe and stirred for 5 hours, Pre-activation was performed. 10 mL of the amine-PEG solution prepared in advance and 10 mL of the BPEI solution were slowly added thereto by using a syringe, and the reaction was carried out at room temperature for 24 hours with stirring, whereby EDC / NHS coupling reaction (COOH of graphene oxide (GO-PEG-PEI), which is a surface-treated hydrophilic polymer, amine-PEG and a positively charged polymer, BPEI, through the amidation reaction between the group and the amine group of each polymer Respectively.
단계2Step 2 : 방사선 환원 반응을 통한 : Through radiation reduction reaction 그래핀Grapina 산화물 oxide 나노구조체(GO-PEG-PEI) 로부터From the nanostructure (GO-PEG-PEI) 환원형 그래핀 기반의 유전자 전달체(rGO-PEG-PEI) 제조 Production of reduced graphene-based gene delivery vehicle (rGO-PEG-PEI)
상기 단계 1에서 제조한 GO-PEG-PEI 용액을 에탄올과 50 vol% (1:1 부피비)로 혼합하고 전자선 조사장치 (10 MeV UELV-10-10S)를 이용하여 10 kGy/min의 선량율로 5분간 50 kGy 조사하였다. 친수성 및 양이온성 고분자가 표면처리된 그래핀 산화물 나노구조체(GO-PEG-PEI)가 방사선 조사를 통해 환원되었음에도 분산성이 우수함과 동시에 양이온성 고분자로 표면처리된 환원형 그래핀 기반의 유전자 전달체(rGO-PEG-PEI)를 제조하였다.The GO-PEG-PEI solution prepared in step 1 was mixed with ethanol at a volume ratio of 1: 1 (volume ratio) of 1: 1 and then irradiated with 10 kGy / min at a dose rate of 10 kGy / min using an electron beam irradiation apparatus (10 MeV UELV- 50 kGy for a minute. The graphene oxide nanostructure (GO-PEG-PEI) surface-treated with hydrophilic and cationic polymers was reduced by irradiation but the reduced graphene-based gene transporter surface treated with a cationic polymer rGO-PEG-PEI).
단계 3: 제조된 환원형 Step 3: The prepared reduced form 그래핀Grapina 기반 유전자 전달체( Based gene delivery system rGOrGO -PEG--PEG- PEIPEI )를 이용한 세포 내 유전자 도입 및 단백질 발현 확인) And confirmation of protein expression
상기 단계 2에서 제조된 환원형 그래핀 기반 유전자 전달체(rGO-PEG-PEI) 용액 20 μl에 1 μg의 pEGFP 및 pdsRED 플라스미드 DNA[녹색 및 적색 형광단백질(GFP, green fluorescence protein 및 RFP, red fluorescence protein)을 발현할 수 있는 플라스미드 DNA 벡터(pEGFP 및 pdsRED)]를 혼합하여 환원형 그래핀 유전자 전달체(rGO-PEG-PEI) 표면의 양이온성 고분자(BPEI)와 음이온성 플라스미드 DNA가 정전기적 상호작용에 의해 복합체를 형성하도록 20 분간 실온에서 보관한다.To 20 μl of the reduced graphene-based gene carrier (rGO-PEG-PEI) solution prepared in step 2, 1 μg of pEGFP and pdsRED plasmid DNA [green and red fluorescence protein (GFP, green fluorescence protein and RFP, red fluorescence protein (PEGFP and pdsRED) capable of expressing the plasmid DNA vector (rGO-PEG-PEI) on the surface of the reduced graphene gene carrier (rGO-PEG-PEI) was mixed with an anionic plasmid DNA ≪ / RTI > for 20 minutes to form a complex.
이후 35 mm 세포배양용 폴리스티렌 용기에 1 x 105 cells/mL의 농도로 24시간 배양 중인 H1299 세포를 간단히 PBS로 세척하고 그래핀 유전자 전달체-pDNA 복합체 용액을 세포 위에 고루 도포해준 후 추가적으로 500 μl의 FBS 혈청이 제외된 RPMI1640 배지(Serum-free medium)를 첨가하여 제조된 환원형 그래핀 기반 유전자 전달체와 플라스미드 DNA 복합체가 세포 안으로 도입되도록 배양한다. 5시간 후 다시 10% 혈청을 포함하는 일반적인 RPMI1640 성장 배지로 배지를 교체하고 24시간 ~ 48 시간 동안 배양한다. 유전자 도입 실험 중 세포의 배양은 항시 5% CO2 및 37℃ 가 유지되는 동물세포 배양기에서 이루어졌고 환원형 그래핀 기반 유전자 전달체(rGO-PEG-PEI)와 플라스미드 DNA 복합체의 세포 내 도입에 의한 녹색 및 적색 단백질 발현 여부는 형광현미경(Leica DMI 4000B)을 통해 관찰하였다.Then, H1299 cells cultured for 24 hours at a concentration of 1 × 10 5 cells / mL in a 35 mm cell culture polystyrene container were simply washed with PBS, and the graphene gene carrier-DNA complex solution was uniformly coated on the cells. Then, an additional 500 μl The reduced graphene-based gene transporter and plasmid DNA complex prepared by adding RPMI1640 medium in which FBS serum is excluded are cultured to introduce into a cell. After 5 hours, the medium is replaced with normal RPMI1640 growth medium containing 10% serum again and cultured for 24 hours to 48 hours. During the transfection experiments, the cells were cultured in an animal cell incubator maintained at 5% CO 2 and 37 ° C at all times. The cells were incubated with a reducing graphene-based gene carrier (rGO-PEG-PEI) And red protein expression were observed by fluorescence microscopy (Leica DMI 4000B).
<< 실시예Example 2> 전자선을 이용한 환원형 2> Reduction type using electron beam 그래핀Grapina (( rGOrGO -PEG--PEG- PEIPEI ) 기반 유전자 전달체의 제조) -Based gene delivery
실시예 1의 단계 1의 양이온성 고분자로 가지형 폴리에틸렌이민(BPEI, branched polyethyleneimine)을 선형 폴리에틸렌 이민(linear polyethyleneimine)으로 대체한 것을 제외하고는, 상기 실시예과 동일한 방법으로 수행하였다.The procedure of Example 1 was repeated except that branched polyethyleneimine (BPEI) was replaced with linear polyethyleneimine as the cationic polymer of Step 1 of Example 1.
<< 실시예Example 3> 전자선을 이용한 환원형 3> Reduction type using electron beam 그래핀Grapina (( rGOrGO -PEG--PEG- PAAPAA ) 기반 유전자 전달체의 제조) -Based gene delivery
실시예 1의 단계 1의 고분자로 가지형 폴리에틸렌이민(BPEI, branched polyethyleneimine)을 폴리아미도아민(PAA, polyamidoamine)으로 대체한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.The same procedure as in Example 1 was carried out except that polyethylenimine (BPEI) was replaced with polyamidoamine (PAA) as the polymer of Step 1 of Example 1.
<< 실시예Example 4> 전자선을 이용한 환원형 4> Reduction type using electron beam 그래핀Grapina (( rGOrGO -PEG-PLL) 기반 유전자 전달체의 제조-PEG-PLL) -based gene delivery system
실시예 1의 단계 1의 양이온성 고분자로 가지형 폴리에틸렌이민(BPEI, branched polyethyleneimine)을 폴리-L-라이신(PLL, poly-L-lysine)으로 대체한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.(Poly-L-lysine) instead of branched polyethylenimine (BPEI) as the cationic polymer of step 1 of Example 1, .
<< 실시예Example 5> 감마선을 이용한 환원형 5> Reduction type using gamma ray 그래핀Grapina (( rGOrGO -PEG--PEG- BPEIBPEI ) 기반 유전자 전달체의 제조) -Based gene delivery
실시예 1의 단계 2의 방사선 종류로 전자선을 감마선으로 대체한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.The procedure of Example 1 was repeated except that the electron beam was replaced with gamma ray as the kind of radiation in Step 2 of Example 1.
<< 실시예Example 6> 감마선을 이용한 환원형 6> Reduction type using gamma ray 그래핀Grapina (( rGOrGO -PEG--PEG- PEIPEI ) 기반 유전자 전달체의 제조) -Based gene delivery
실시예 2의 단계 2의 방사선 종류로 전자선을 감마선으로 대체한 것을 제외하고는 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 수행하였다.The procedure of Example 2 was repeated, except that the electron beam was replaced by gamma ray as the kind of radiation in Step 2 of Example 2.
<< 실시예Example 7> 감마선을 이용한 환원형 7> Reduction type using gamma ray 그래핀Grapina (( rGOrGO -PEG--PEG- PAAPAA ) 기반 유전자 전달체의 제조) -Based gene delivery
실시예 3의 단계 2의 방사선 종류로 전자선을 감마선으로 대체한 것을 제외하고는 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 수행하였다.Example 3 was carried out in the same manner as in Example 3, except that the electron beam was replaced with gamma ray as the kind of radiation in Step 2 of Example 3.
<< 실시예Example 8> 감마선을 이용한 환원형 8> Reduction type using gamma ray 그래핀Grapina (( rGOrGO -PEG-PLL) 기반 유전자 전달체의 제조-PEG-PLL) -based gene delivery system
실시예 4의 단계 2의 방사선 종류로 전자선을 감마선으로 대체한 것을 제외하고는 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 수행하였다.The same procedure as in Example 4 was carried out except that the electron beam was replaced with the gamma ray as the kind of radiation of Step 2 of Example 4. [
<< 실시예Example 9> 전자선을 이용한 환원형 9> Reduction type using electron beam 그래핀Grapina (( rGOrGO -- BPEIBPEI ) 기반 유전자 전달체의 제조) -Based gene delivery
실시예 1의 단계 1의 친수성 고분자인 말단 아민화-폴리에틸렌글리콜(amine-PEG)을 제외한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.The procedure of Example 1 was repeated, except that the terminal aminated polyethylene glycol (amine-PEG) which was the hydrophilic polymer of Step 1 of Example 1 was excluded.
<< 실시예Example 10> 전자선을 이용한 환원형 10> Reduction type using electron beam 그래핀Grapina (( rGOrGO -- PEIPEI ) 기반 유전자 전달체의 제조) -Based gene delivery
실시예 2의 단계 1의 친수성 고분자인 말단 아민화-폴리에틸렌글리콜(amine-PEG)을 제외한 것을 제외하고는, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 수행하였다.Was carried out in the same manner as in Example 2, except that the terminal aminated polyethylene glycol (amine-PEG) which was the hydrophilic polymer of Step 1 of Example 2 was excluded.
<< 실시예Example 11> 전자선을 이용한 환원형 11> Reduction type using electron beam 그래핀Grapina (( rGOrGO -- PAAPAA ) 기반 유전자 전달체의 제조) -Based gene delivery
실시예 3의 단계 1의 친수성 고분자인 말단 아민화-폴리에틸렌글리콜(amine-PEG)을 제외한 것을 제외하고는, 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 수행하였다.The procedure of Example 3 was repeated, except that the terminal aminated polyethylene glycol (amine-PEG) which was the hydrophilic polymer of Step 1 of Example 3 was excluded.
<< 실시예Example 12> 전자선을 이용한 환원형 12> Reduction type using electron beam 그래핀Grapina (( rGOrGO -PLL) 기반 유전자 전달체의 제조-PLL) -based gene delivery system
실시예 4의 단계 1의 친수성 고분자인 말단 아민화-폴리에틸렌글리콜(amine-PEG)을 제외한 것을 제외하고는, 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 수행하였다.The procedure of Example 4 was repeated, except that the terminal amine-polyethylene glycol (amine-PEG) which was the hydrophilic polymer of Step 1 of Example 4 was excluded.
<< 실시예Example 13> 감마선을 이용한 환원형 13> Reduction type using gamma ray 그래핀Grapina (( rGOrGO -- BPEIBPEI ) 기반 유전자 전달체의 제조) -Based gene delivery
실시예 5의 단계 1의 친수성 고분자인 말단 아민화-폴리에틸렌글리콜(amine-PEG)을 제외한 것을 제외하고는, 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 수행하였다.The procedure of Example 5 was repeated, except that the terminal aminated-polyethylene glycol (amine-PEG) which was the hydrophilic polymer of Step 1 of Example 5 was excluded.
<< 실시예Example 14> 감마선을 이용한 환원형 14> Reduction type using gamma ray 그래핀Grapina (( rGOrGO -- PEIPEI ) 기반 유전자 전달체의 제조) -Based gene delivery
실시예 6의 단계 1의 친수성 고분자인 말단 아민화-폴리에틸렌글리콜(amine-PEG)을 제외한 것을 제외하고는, 상기 실시예 6과 동일한 방법으로 수행하였다.The procedure of Example 6 was repeated, except that the terminal aminated polyethylene glycol (amine-PEG) which is the hydrophilic polymer of Step 1 of Example 6 was excluded.
<< 실시예Example 15> 감마선을 이용한 환원형 15> Reduction type using gamma ray 그래핀Grapina (( rGOrGO -- PAAPAA ) 기반 유전자 전달체의 제조) -Based gene delivery
실시예 7의 단계 1의 친수성 고분자인 말단 아민화-폴리에틸렌글리콜(amine-PEG)을 제외한 것을 제외하고는, 상기 실시예 7과 동일한 방법으로 수행하였다.The procedure of Example 7 was repeated except that the terminal aminated polyethylene glycol (amine-PEG) which was the hydrophilic polymer of Step 1 of Example 7 was excluded.
<< 실시예Example 16> 감마선을 이용한 환원형 16> Reduction type using gamma ray 그래핀Grapina (( rGOrGO -PLL) 기반 유전자 전달체의 제조-PLL) -based gene delivery system
실시예 8의 단계 1의 친수성 고분자인 말단 아민화-폴리에틸렌글리콜(amine-PEG)을 제외한 것을 제외하고는, 상기 실시예 8과 동일한 방법으로 수행하였다.The procedure of Example 8 was repeated, except that the terminal aminated-polyethylene glycol (amine-PEG) which was the hydrophilic polymer of step 1 of Example 8 was excluded.
상기 실시예 1-16에서 사용한 양이온성고분자 및 친수성고분자와 방사선 조사 조건을 하기 표 1에 정리하여 나타내었다.The cationic polymer and hydrophilic polymer used in Examples 1-16 and irradiation conditions are summarized in Table 1 below.
고분자 Cationic
Polymer
종류radiation
Kinds
선량율radiation
Dose rate
조사량
(kGy)radiation
Dose
(kGy)
전체적인 절차는 화학적 짝지움 반응과 방사선 환원 반응을 통한 그래핀 산화물로부터 환원형 그래핀 기반 나노 유전자 전달체(rGO-PEG-PEI) 제조 순서도 (도 1)에서 나타낸 바와 같다.The overall procedure is as shown in the flowchart of the production of the reduced graphene-based nano-gene carrier (rGO-PEG-PEI) from the graphene oxide through chemical coupling reaction and the radiation reduction reaction (FIG. 1).
<실험예 1> 세포 내 도입에 유리한 작은 시트 크기를 갖는 그래핀 산화물의 선별 확인Experimental Example 1 Selection of graphene oxide having a small sheet size favorable for intracellular introduction
실시예 1의 단계 1에서 세포내 도입이 유리하도록 작은 시트크기를 갖는 그래핀 산화물을 얻기 위해 증류수에 분산되어 있는 5 mg/mL의 그래핀 산화물을 (Graphene Oxide (GO), Graphene Supermarket)을 증류수로 희석하여 1.25 mg/mL 농도를 갖는 30 mL의 그래핀 산화물 용액을 만든 뒤 용액이 담긴 유리병이 물에 담지 된 상태로 초음파조(sonication bath, Branson 8510) 처리 1시간과 탐침형 초음파(probe sonication, Ultrasonication processor, CP750) 처리 과정을 차례대로 적용한 용액을 3 μm의 시린지 필터를 통과시켜 회수한 그래핀 산화물의 시트 크기를 확인하기 위해 시트크기를 확인할 수 있는 장비인 동적광산란입도분석장비(DLS,dynamic light scattering, DilateTM Nano)를 이용하여 시트크기를 측정하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.To obtain a graphene oxide having a small sheet size such that intracellular introduction is favorable in step 1 of Example 1, a 5 mg / mL graphene oxide (Graphene Oxide (GO), Graphene Supermarket) dispersed in distilled water was added to distilled water (Branson 8510) for 1 hour and a probe for ultrasound (Branson 8510) in the state that the glass bottle containing the solution was immersed in water. Sonication, Ultrasonication processor, CP750) was applied to the sample in order to confirm the sheet size of the graphene oxide recovered by passing the solution through a 3 μm syringe filter. The dynamic light scattering particle size analyzer (DLS , dynamic light scattering, Dilate TM Nano). The results are shown in FIG.
도 2에 나타난 바와 같이, 상기에 기술된 바와 같은 과정을 통해 평균 시트 크기가 200 nm 이하인 그래핀 산화물을 얻을 수 있었으며, 2번의 반복 실험에서 유사한 결과를 보여주고 있다.As shown in FIG. 2, graphene oxide having an average sheet size of 200 nm or less was obtained through the process described above, and the results were similar in two repeated experiments.
<실험예 2> 그래핀 산화물로부터 화학적 짝지움 반응을 통해 제조된 친수성 및 ≪ Experimental Example 2 > The hydrophilic and hydrophobic particles prepared through the chemical coupling reaction from the graphene oxide 양이온성Cationic 고분자가 The polymer 표면처리된Surface-treated 그래핀Grapina 산화물 나노 구조체(GO-PEG- The oxide nanostructure (GO-PEG- PEIPEI )의 푸리에 변환 적외선 분광분석 (FT-IR) ) Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR)
상기 실험예 1에서 얻어진 그래핀 산화물과 EDC/NHS 짝지움 반응 시약 및 아민(amine) 관능기를 갖는 친수성(amine-PEG) 및 양이온성 (PEI, polyethyleneimine) 고분자 존재 하에서 화학적 짝지움 반응을 수행하였고 그래핀 산화물 표면에 친수성 및 양이온성 고분자가 표면처리 되었는지 여부를 알아보기 위해 FT-IR (FT-IR, 제조사: Varian, 모델명: 640-IR)을 이용한 화학적 구조 분석을 수행하였고 그 결과를 도 3에 나타내었다.The chemical coupling reaction was carried out in the presence of a hydrophilic (amine-PEG) and a cationic (PEI, polyethyleneimine) polymer having an EDC / NHS coupling reaction reagent and an amine functional group obtained in Experimental Example 1, The chemical structure analysis using FT-IR (FT-IR, manufacturer: Varian, model name: 640-IR) was conducted to determine whether the surface of the pin oxide was surface-treated with hydrophilic and cationic polymers. Respectively.
도 3에 나타난 바와 같이, 최종적으로 제조된 그래핀 산화물 나노구조체의 스펙트럼에서 순수한 PEI에서 나타나는 특성 피크인 N-H (1560 cm- 1)와 C-N (1460 cm-1) 피크들이 동일하게 나타나는 것과 순수한 PEG에서 나타나는 특성 피크인 C-O-C (1063 - 1103 cm- 1)과 CH2 (1360 cm-1) 피크들이 동일하게 나타나는 것, 특히 순수한 그래핀 산화물에서의 COOH (carboxyl group, 1732 cm-1) 그룹의 피크 크기가 줄어들고 N-C=O (amide bond, 1638 cm-1) 피크가 새롭게 생성되는 것으로 보아 그래핀 산화물의 카르복실 그룹과 고분자들의 아민기 사이에서의 EDC/NHS 화학적 짝지움 반응으로 인해 성공적으로 PEG 및 PEI 가 표면처리된 그래핀 산화물 나노 구조체(GO-PEG-PEI)가 제조되었음을 확인할 수 있다.As shown in Figure 3, the finally prepared in the graphene oxide in pure PEI characteristic peaks in the spectrum of the nanostructure NH (1560 cm - 1) and the CN (1460 cm -1) peaks that appear in the same pure PEG The peaks of COC (1063 - 1103 cm - 1 ) and CH 2 (1360 cm - 1 ) appearing equally appear, especially the peak size of COOH (carboxyl group, 1732 cm -1 ) group in pure graphene oxide the shrinking NC = O (amide bond, 1638 cm -1) peaks are seen as being newly created Yes because of the EDC / NHS chemical mate erase reaction between an amine group of the carboxyl group and the polymer of the pin oxide successfully PEG and PEI (GO-PEG-PEI) having a surface-treated graphene oxide nanostructure can be confirmed.
<< 실험예Experimental Example 3> 방사선 환원 반응을 통한 친수성 및 3> hydrophilicity through radiation reduction reaction and 양이온성Cationic 고분자로 표면처리된 Polymer-surface treated 그래핀Grapina 산화물 나노구조체(GO-PEG- The oxide nanostructure (GO-PEG- PEIPEI )) 로부터from 환원형 Reduction type 그래핀Grapina 기반의 나노 유전자 전달체(rGO-PEG-PEI) 제조 확인 Confirmation of manufacture of nano gene carrier (rGO-PEG-PEI) based
화학적 짝지움 반응을 통해 제조된 친수성 및 양이온성 고분자가 표면처리된 그래핀 산화물 나노구조체(GO-PEG-PEI) 용액을 에탄올과 50 vol% (1:1 부피비)로 혼합하고 전자선 조사장치 (10 MeV UELV-10-10S)를 이용하여 10 kGy/min 의 선량율로 5분간 50 kGy 조사하여 환원 반응을 수행하였으며 그 결과를 도 4에 나타내었다.The graphene oxide nanostructure (GO-PEG-PEI) solution prepared by chemical coupling reaction and surface-treated with hydrophilic and cationic polymer was mixed with ethanol in 50 vol% (1: 1 volume ratio) MeV UELV-10-10S) at a dose rate of 10 kGy / min for 50 minutes at a dose of 50 kGy. The results are shown in FIG.
도 4에 나타난 같이, 고분자 표면처리된 그래핀 산화물 나노구조체 용액은 연한 갈색을 나타내는 반면 방사선 환원된 그래핀 나노구조체 용액은 검은색으로 변화하였으나 여전히 우수한 분산성을 유지하고 있음을 알 수 있다. 도 4의 용액 색깔 변화와 환원된 상태에서도 응집현상 없이 우수한 분산성을 보이는 현상으로부터 친수성 및 양이온성 고분자가 표면처리된 그래핀 산화물 나노구조체(GO-PEG-PEI)로부터 방사선 환원 반응을 통해 성공적으로 환원형 그래핀 기반의 유전자 전달체(rGO-PEG-PEI)가 제조되었음을 확인할 수 있다. As shown in FIG. 4, the graphene oxide nanostructure solution surface treated with polymer showed a light brown color, while the solution of grafted nano-structured solution reduced to black, but still maintained excellent dispersibility. From the phenomenon of good dispersion without agglomeration phenomenon even in the solution color change of FIG. 4 and the reduced state, the graphene oxide nanostructure (GO-PEG-PEI) having a hydrophilic and cationic polymer surface- It was confirmed that a reduced graphene-based gene carrier (rGO-PEG-PEI) was produced.
<< 실험예Experimental Example 4> 제조된 환원형 4> The reduced type 그래핀Grapina 기반의 유전자 전달체( Based gene delivery system rGOrGO -PEG--PEG- PEIPEI )의 세포 독성 확인) To determine cytotoxicity
화학적 짝지움 반응과 방사선 환원 반응을 통해 제조된 환원형 그래핀 기반의 유전자 전달체의 세포독성을 알아보기 위해 일반적으로 외부 유전자의 세포내 도입에 사용하는 상업화된 리포좀 기반의 Lipofectamine® 2000과 제조된 rGO-PEI-PEG를 유전자 전달체로 사용하여 유전자 세포 도입(transfection)을 수행하여 세포의 변화를 관찰하였으며 그 결과를 도 5에 나타내었다.Chemical pair Clear react with the radiation through the reduction reaction production of the reduced type yes to determine the cytotoxicity of the gene carrier of the pin based on the general manufacturing and a liposome-based
세포는 H1299 세포주를 사용하였다. 세포 도입 실험을 위해 35mm 세포배양용 폴리스티렌 용기에 1 x 105 cells/well의 농도로 도포하여 12시간 배양하고 상기 두 가지(Lipofectamine® 2000과 제조된 rGO-PEI-PEG) 종류의 유전자 전달체를 이용하여 pEGFP 플라스미드 DNA의 세포 도입(transfection) 24시간 후의 배양되고 있는 세포의 광학현미경((Leica DMI 4000B)사진을 통해 세포독성을 확인하였다.Cells were H1299 cell lines. For the cell introduction experiment, the cells were applied to a 35 mm cell culture polystyrene container at a concentration of 1 × 10 5 cells / well and cultured for 12 hours. Then, using the above two kinds of gene carriers (
도 5에 나타난 바와 같이, rGO-PEI-PEG를 유전자 전달체로 사용해도 특이적인 세포의 사멸은 관찰되지 않았고 상업화된 Lipofectamine® 2000과 비교하여 거의 차이가 없이 세포 성장상태가 양호한 것을 보아 제조된 rGO-PEG-PEI 유전자 전달체의 세포 독성은 거의 없는 것을 알 수 있다.As shown in FIG. 5, no specific cell death was observed even when rGO-PEI-PEG was used as a gene carrier, and the cell growth was good without any difference compared to commercialized
<< 실험예Experimental Example 5> 제조된 환원형 5> 그래핀Grapina 기반의 유전자 전달체( Based gene delivery system rGOrGO -PEG--PEG- PEIPEI )를 이용한 유전자 도입 및 형광단백질 발현 여부 확인) And confirmation of expression of fluorescent protein
제조된 환원형 그래핀 기반의 유전자 전달체(rGO-PEG-PEI)를 이용한 유전자 도입에 따른 및 형광단백질 발현 여부를 확인하기 위해 상기 실험예 4와 같이 유전자 도입 실험을 동일하게 수행하였으며 형광 단백질 발현 여부의 확인을 통해 유전자 도입 여부를 확인하고자 하였다. 사용된 유전자 전달체는 상용화된 Lipofectamine® 2000 및 제조된 rGO-PEG-PEI이며, 사용된 형광 단백질 유전자는 pEGFP 및 pdsRED 플라스미드 DNA[녹색 및 적색 형광단백질(GFP, green fluorescence protein 및 RFP, red fluorescence protein)을 발현할 수 있는 플라스미드 DNA 벡터(pEGFP 및 pdsRED)]였다. 세포의 배양은 항시 5% CO2 및 37℃ 가 유지되는 동물세포 배양기에서 이루어졌고 환원형 그래핀 기반 유전자 전달체와 플라스미드 DNA 복합체의 세포 내 도입에 의한 녹색 및 적색 단백질 발현 여부는 형광현미경(Leica DMI 4000B) 을 통해 관찰하였으며 그 결과를 도 6에 나타내었다.In order to confirm the expression of the fluorescent protein and the gene introduction by using the produced reduced graphene-based gene carrier (rGO-PEG-PEI), the gene introduction experiment was performed in the same manner as in Experimental Example 4, To confirm the introduction of the gene. The fluorescent protein gene used was pEGFP and pdsRED plasmid DNA [green and red fluorescence protein (GFP), green fluorescence protein (RFP) and red fluorescence protein), and the fluorescent protein gene used was commercialized
도 6에 나타난 바와 같이, rGO-PEG-PEI 유전자 전달체를 이용한 세포도입 실험 결과 상용화된 Lipofectamine® 2000을 이용한 결과와 마찬가지로 녹색 및 적색 형광 단백질 모두 잘 발현되어 발광하고 있음을 관찰할 수 있다. 따라서, 제조된 환원형 그래핀 기반의 유전자 전달체(rGO-PEG-PEI)는 플라스미드 DNA와 결합하여 복합체를 형성하고 성공적으로 세포내로 도입되어 단백질로 발현되었음을 확인할 수 있다.As shown in FIG. 6, as a result of the cell introduction experiment using the rGO-PEG-PEI gene transporter, it was observed that both the green and red fluorescent proteins were well expressed and luminesced as in the result using the commercialized
Claims (12)
Characterized in that the hydrophilic polymer and the cationic polymer are chemically bonded to the reduced graphene oxide (rGO).
상기 단계 1에서 준비한 산화그래핀(GO) 포함 수용액에 카르복실기와 결합을 이룰 수 있는 말단 작용기를 갖는 친수성고분자 및 양이온성고분자를 첨가하여, 산화그래핀에 존재하는 카르복실기와 상기 친수성고분자 및 양이온성고분자를 화학적으로 결합하는 단계(단계 2); 및
상기 친수성고분자 및 양이온성고분자가 화학적으로 결합된 산화그래핀(GO)에 방사선을 조사하여, 친수성고분자 및 양이온성고분자가 화학적으로 결합되고 환원된 산화그래핀(rGO, reduced Graphene Oxide)으로 개질하는 단계(단계 3);
를 포함하는 제1항의 음이온성 물질의 전달체의 제조방법.
Preparing an aqueous solution containing graphene oxide (GO) (step 1);
The hydrophilic polymer and the cationic polymer having a terminal functional group capable of forming a bond with a carboxyl group are added to the aqueous solution containing the oxidized graphene (GO) prepared in the step 1, and the carboxyl group present in the oxidized graphene, the hydrophilic polymer and the cationic polymer (Step 2); And
(GO) chemically bonded to the hydrophilic polymer and the cationic polymer is irradiated with a radiation to chemically bond the hydrophilic polymer and the cationic polymer to each other and to be modified with reduced graphene oxide (rGO) Step (step 3);
Lt; RTI ID = 0.0 > 1, < / RTI >
An intracellular gene carrier characterized in that the cationic polymer and the anionic gene of the carrier according to claim 1 are bound by ionic bonding.
상기 단계 1에서 준비한 산화그래핀(GO) 포함 수용액에 카르복실기와 결합을 이룰 수 있는 말단 작용기를 갖는 친수성고분자 및 양이온성고분자를 첨가하여, 산화그래핀에 존재하는 카르복실기와 상기 친수성고분자 및 양이온성고분자를 화학적으로 결합하는 단계(단계 2);
상기 단계 2에서 준비한 친수성고분자 및 양이온성고분자가 화학적으로 결합된 산화그래핀(GO)에 방사선을 조사하여, 친수성고분자 및 양이온성고분자가 화학적으로 결합되고 환원된 산화그래핀(rGO, reduced Graphene Oxide)으로 개질하는 단계(단계 3); 및
상기 단계 3에서 준비한 친수성고분자 및 양이온성고분자가 화학적으로 결합되고 환원된 산화그래핀(rGO, reduced Graphene Oxide)과 음이온성 유전자를 혼합하여, 상기 양이온성고분자와 음이온성 유전자가 이온결합을 형성하는 단계(단계 4);
를 포함하는 제3항의 세포내 유전자 전달체의 제조방법.
Preparing an aqueous solution containing graphene oxide (GO) (step 1);
The hydrophilic polymer and the cationic polymer having a terminal functional group capable of forming a bond with a carboxyl group are added to the aqueous solution containing the oxidized graphene (GO) prepared in the step 1, and the carboxyl group present in the oxidized graphene, the hydrophilic polymer and the cationic polymer (Step 2);
The graphene (GO) chemically bonded to the hydrophilic polymer and the cationic polymer prepared in the step 2 is irradiated with a radiation to chemically bond the hydrophilic polymer and the cationic polymer to form a reduced graphene oxide (rGO) ) (Step 3); And
The hydrophilic polymer and the cationic polymer prepared in the step 3 are chemically bonded and mixed with reduced graphene oxide (rGO) and an anionic gene to form an ionic bond between the cationic polymer and the anionic gene Step (step 4);
Lt; RTI ID = 0.0 > 3, < / RTI >
상기 친수성 고분자는 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리알릴아민(poly(allylamine)) 및 폴리아크릴아미드(polyacrylamide)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 음이온성 물질의 전달체.
The method according to claim 1,
Wherein the hydrophilic polymer is at least one selected from the group consisting of polyethylene glycol (PEG), poly (allylamine), and polyacrylamide.
상기 양이온성고분자는 가지형폴리에틸렌이민(BPEI), 선형폴리에틸렌이민(PEI), 폴리아미도아민(PAA) 및 폴리-L-라이신(PLL)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 음이온성 물질의 전달체.
The method according to claim 1,
Wherein the cationic polymer is at least one selected from the group consisting of branched polyethyleneimine (BPEI), linear polyethyleneimine (PEI), polyamidoamine (PAA) and poly-L-lysine (PLL) Carrier of matter.
상기 '화학적으로 결합'은 아마이드 결합인 것을 특징으로 하는 음이온성 물질의 전달체.
The method according to claim 1,
Wherein the 'chemically bonded' is an amide bond.
상기 음이온성 물질은 유전자, 단백질, 약물 또는 생체분자인 것을 특징으로 하는 음이온성 물질의 전달체.
The method according to claim 1,
Wherein the anionic material is a gene, a protein, a drug, or a biomolecule.
상기 전달체의 크기는 10-1000 nm인 것을 특징으로 하는 음이온성 물질의 전달체.
The method according to claim 1,
Wherein the size of the carrier is 10-1000 nm.
상기 세포내 유전자 전달체의 크기는 10-200 nm인 것을 특징으로 하는 전달체.
The method of claim 3,
Wherein the intracellular gene carrier is 10-200 nm in size.
상기 음이온성 물질의 전달체는 광-열적 치료(photothermal therapy)에 사용되는 것을 특징으로 하는 음이온성 물질의 전달체.
The method according to claim 1,
Wherein the anionic carrier is used for photothermal therapy. ≪ Desc / Clms Page number 24 >
상기 세포내 유전자 전달체는 광-열적 치료(photothermal therapy)에 사용되는 것을 특징으로 하는 세포내 유전자 전달체.The method of claim 3,
Wherein the intracellular gene delivery vehicle is used for photothermal therapy.
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|---|---|---|---|
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200048681A (en) * | 2018-10-30 | 2020-05-08 | 울산과학기술원 | Method of nano particle-graphene composite and the nano particle-graphene composite manufactured by the same |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20130112987A (en) * | 2012-04-03 | 2013-10-15 | 한국원자력연구원 | Gamma-ray-induced reduction method of graphene oxide and the fabrication of the manufactured graphene using the thereof |
| KR20160124279A (en) | 2015-04-16 | 2016-10-27 | 한국원자력연구원 | 2-aminoethyl methacrylate-grafted chitosan copolymer for gene deslivery using radiation technology and method for preparing the same |
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2016
- 2016-12-08 KR KR1020160166396A patent/KR101967660B1/en active IP Right Grant
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| KR20160124279A (en) | 2015-04-16 | 2016-10-27 | 한국원자력연구원 | 2-aminoethyl methacrylate-grafted chitosan copolymer for gene deslivery using radiation technology and method for preparing the same |
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| KR20200048681A (en) * | 2018-10-30 | 2020-05-08 | 울산과학기술원 | Method of nano particle-graphene composite and the nano particle-graphene composite manufactured by the same |
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