KR20180064316A

KR20180064316A - Improved purification method of recombinant protein

Info

Publication number: KR20180064316A
Application number: KR1020170165901A
Authority: KR
Inventors: 김민영; 박형준; 김대진; 정성엽
Original assignee: 한미약품 주식회사
Priority date: 2016-12-05
Filing date: 2017-12-05
Publication date: 2018-06-14
Also published as: WO2018105982A1

Abstract

The present invention relates to a method for purifying recombinant protein from recombinant Escherichia coli without containing a modified product at a high yield and high purity without a separate activation process. More specifically, the present invention relates to a method for purifying recombinant protein from recombinant Escherichia coli expressing the recombinant protein in a periplasm in a high yield and high purity.

Description

Improved purification method of recombinant protein < RTI ID = 0.0 >

본 발명은 재조합 단백질을 페리플라즘 내에서 발현하는 재조합 대장균으로부터 재조합 단백질을 고수율 및 고순도로 정제하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for purifying a recombinant protein from a recombinant E. coli expressing a recombinant protein in a periplasm in high yield and high purity.

다양한 치료제로 사용될 수 있는 다양한 단백질 치료 의약품 들은 재조합 단백질로 제조하는 연구뿐만 아니라 이의 임상에로의 적용 및 상용화가 계속되고 있다.A variety of protein therapeutics that can be used as various therapeutic agents are being applied not only to recombinant proteins but also to their clinical applications and commercialization.

이 중 재조합 단백질 중 한 예인, 인간 성장 호르몬은 191개의 아미노산 잔기로 구성된 분자량 약 21,500 달톤의 단백질 호르몬이다. 상기 인간 성장 호르몬은 인간 뇌하수체에서 추출 정제된 이후, 많은 연구가 진행되어 왔다. 예를 들어, 벡트 등은 사람에 대한 인간 성장 호르몬의 대사 효과 등을 처음 연구하였으며, 라벤은 임상시험을 통해 인간 성장 호르몬이 뇌하수체성 왜소증의 치료 효과가 있음을 밝혔으며 현재까지 이러한 왜소증 치료에 사용되어 오고 있다. 최근 인간 성장 호르몬은 터너 증후군(Turner's Syndrome)의 치료에도 사용되고 있으며, 그 적응증이 확대되고 있는 추세이다.One of the recombinant proteins, human growth hormone, is a protein hormone with a molecular weight of about 21,500 daltons consisting of 191 amino acid residues. Since human growth hormone has been extracted and purified from human pituitary gland, much research has been conducted. For example, Vect et al. First studied the metabolic effects of human growth hormone in humans, and Raben found that human growth hormone has a therapeutic effect on pituitary dwarfism through clinical trials. Is coming. Recently, human growth hormone has been used for the treatment of Turner's Syndrome, and its indication is expanding.

이러한 유용성에도 불구하고, 종래 인간 성장 호르몬은 사람의 뇌하수체에서 직접 추출 정제하는 방법에 의해 얻을 수 있었으므로 생산량이 매우 제한되었다. 이에 따라, 인간 성장 호르몬을 유전자 재조합 방법으로 대량생산하는 방법이 시도되었다. 고델 등이 처음으로 유전자 재조합 방법으로 인간 성장 호르몬을 생산한 바 있으나, 이 호르몬은 천연형 인간 성장 호르몬과 비교할 때 N-말단에 메티오닌 잔기가 하나 더 붙어있는 192개 아미노산으로 구성되어 있으며, 이로 인해 항체 생성률의 증가 등의 부작용이 우려되고 있다. 따라서 인체 내에서 발현되는 것과 동일한 기능을 가지는 천연형 인간 성장 호르몬의 개발이 요구되고 있다.Despite this usefulness, conventional human growth hormone was obtained by a method of direct extraction and purification from human pituitary gland, so production was very limited. Accordingly, a method of mass-producing human growth hormone by gene recombination has been attempted. Gordel et al. Produced human growth hormone by the first recombinant method. However, this hormone is composed of 192 amino acids with one additional methionine residue at the N-terminus as compared to the native human growth hormone, There is a concern about side effects such as an increase in the antibody production rate. Therefore, development of a natural type human growth hormone having the same function as that expressed in the human body is required.

천연형 인간 성장 호르몬을 얻기 위해, 국제특허 공개공보 제 WO86/01229 호에는 N-말단에 메티오닌이 붙은 인간 성장 호르몬에 디펩티딜 아미노펩티데이즈 I을 처리하여 메티오닌을 제거하는 방법이 개시되어 있으나, 이 방법은 메티오닌을 제거하기 위한 공정이 더 추가되는 단점이 있다. 또한 유럽 특허 제55942호, 제20142호 및 제114695호에는 대장균에서 세포외 발현을 이용한 천연형 인간 성장 호르몬의 제조 방법이 개시되어 있는데, 이 방법들은 그 발현량이 적은 단점이 있다. 또한 효모를 이용하여 천연형 인간 성장 호르몬을 생산하는 방법도 보고된 바 있으나, 이 방법에도 원치 않는 당쇄화의 우려가 있다.In order to obtain natural human growth hormone, International Patent Publication No. WO 86/01229 discloses a method for removing methionine by treating dipeptidyl aminopeptidase I with a human growth hormone having N-terminal methionine attached thereto. However, There is a disadvantage in that a process for removing methionine is further added. European Patent Nos. 55942, 20142 and 114695 disclose a method for producing natural human growth hormone using extracellular expression in Escherichia coli. However, these methods have a disadvantage in that their expression amounts are small. In addition, a method of producing natural human growth hormone by using yeast has been reported, but there is also a fear of undesired sugar chain in this method.

특히, 균체 내 생산 방법을 이용한 인간 성장 호르몬의 생산은 숙주 세포 또는 배양 물질에 유래하는 불순물에 의해 오염될 수 있어 고순도 의약품을 정제하기 위해서는 까다로운 정제 공정을 거쳐야 한다. 뿐만 아니라, 대장균을 숙주로 사용하는 경우 대부분의 인간 성장 호르몬은 불용성 물질로 세포질 내에 축적되므로 리폴딩 공정을 거쳐 활성화된 형태로 얻어야 하므로 매우 비효율적이다. 특히 이 공정 중에 부분적으로 환원된 상태, 분자간 이황화 결합체 또는 잘못된 이황화 결합체 등이 유발되어 이들을 다시 제거하여야 하는 어려움이 있으며, 역가의 손실이 많고, 미스 폴딩(misfolding) 같은 원치 않는 변이체의 제거가 매우 어렵게 된다. 또한 번역 개시부인 N-말단에 메티오닌이 부가된 형태로 생산되고, 생산 공정에서 이를 제거하는 것은 매우 어려우며 이로 인한 역가 및 수율의 손실이 있다.In particular, the production of human growth hormone using an intracellular production method may be contaminated with impurities derived from host cells or cultured materials, and a refined purification process must be performed in order to purify high purity pharmaceuticals. In addition, when E. coli is used as a host, most of human growth hormone is accumulated in the cytoplasm as an insoluble substance, so it must be obtained in an activated form through a refolding process, which is very inefficient. Particularly, in this process, a partially reduced state, an intermolecular disulfide bond, or an incorrect disulfide bond is generated and it is difficult to remove them again. There is a large loss of activity, and it is very difficult to remove unwanted mutants such as misfolding do. Also, it is produced in a form in which methionine is added to the N-terminal of translation initiation part, and it is very difficult to remove it in the production process, resulting in loss of potency and yield.

한편, 페리플라즘으로의 분비 생산 방법을 이용한 인간 성장 호르몬의 생산은 N-말단에 메티오닌이 없는 천연형 인간 성장 호르몬을 가용화 형태로 얻을 수 있다. 또한, 페리플라즘 내의 단백질 양이 전체 세포질 내의 단백질에 비해 상대적으로 적은 10% 미만이므로 훨씬 더 용이하게 정제할 수 있으며, 세포를 파쇄하는 공정이 불필요하게 되므로 세포질 내에 존재하는 당류 및 핵산류 등의 오염을 최소화하는 장점이 있다.On the other hand, the production of human growth hormone by the secretion production method in the periplasm can be obtained in the form of solubilized native human growth hormone having no methionine at the N-terminal. In addition, since the amount of protein in the periplasm is relatively less than 10% as compared with the protein in the whole cytoplasm, it can be purified much more easily and the process of disrupting cells becomes unnecessary, so that saccharides and nucleic acids There is an advantage of minimizing contamination.

그러나 페리플라즘 내에서의 단백질 생산은 발현량이 상대적으로 낮아 산업화에 어려움이 있다. 특히, 페리플라즘으로의 단백질 고 발현 시 발현 세포 외막의 불안정성에 의해 정제 전 삼투 충격 등의 전처리 시 세포 자체의 파열로 인한 페리플라즘 내 발현된 재조합 단백질의 특정한 정제가 어려울 수 있으므로, 발현된 단백질을 고수율 및 고순도로 정제할 수 있는 효율적인 방법이 여전히 요구되고 있다.However, the protein production in the periplasm has a relatively low expression level, which makes industrialization difficult. Particularly, due to the instability of the expressed extracellular membrane during the high expression of the protein in the periplasm, it may be difficult to perform specific purification of the recombinant protein expressed in the periplasm due to rupture of the cell itself in pretreatment such as pre-purification osmotic shock, Effective methods for purifying proteins at high yield and high purity are still required.

본 발명의 목적은 재조합 대장균으로부터 페리플라즘 내로 발현된 목적하는 재조합 단백질을 고수율 및 고순도로 정제하는 방법을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a method for purifying a desired recombinant protein expressed in a periplasm from a recombinant E. coli with high yield and high purity.

본 발명을 구현하는 하나의 양태는 재조합 대장균으로부터 페리플라즘 내로 발현된 목적하는 재조합 단백질을 고수율 및 고순도로 정제하는 방법이다.One embodiment of the present invention is a method for purifying a desired recombinant protein expressed in a periplasm from a recombinant E. coli with high yield and high purity.

하나의 구체예에서 상기 정제 방법은 (i) 목적하는 재조합 단백질을 페리플라즘 내로 발현하는 분리된 재조합 대장균 균체에 수크로즈가 함유된 완충용액을 가한 후, 원심분리 또는 마이크로필터를 수행하여 세포 침전물을 수득하고, 상기 세포 침전물에 수크로즈가 함유된 완충용액에 비해 삼투압이 낮은 용액을 처리하여, 페리플라즘 단백질을 포함하는 추출액을 수득하는 단계; (ii) 상기 (i) 단계에서 수득한 추출액에 염 또는 카오트로픽 제제 (chaotropic agent)를 첨가하여 원심분리 또는 마이크로필터를 수행하여 페리플라즘 단백질을 포함하는 상등액을 수득하는 단계; (iii) 상기 (ii) 단계에서 수득한 상등액을 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피에 적용하여, 목적하는 재조합 단백질을 포함하는 분획물을 용출하는 단계; 및 (iv) 상기 (iii) 단계의 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피에서 용출된 분획물을 이온 교환 크로마토그래피에 적용하는 단계를 포함하는, 목적하는 재조합 단백질의 정제 방법일 수 있다.In one embodiment, the purification method comprises (i) adding a buffer solution containing sucrose to the separated recombinant E. coli cells expressing the desired recombinant protein in a periplasm, followed by centrifugation or microfiltering, And treating the cell precipitate with a solution having a lower osmotic pressure than the buffer solution containing sucrose to obtain an extract containing the periplasmic protein; (ii) adding a salt or chaotropic agent to the extract obtained in the step (i) and centrifuging or microfiltering to obtain a supernatant containing the periplasmic protein; (iii) applying the supernatant obtained in step (ii) to hydrophobic interaction column chromatography to elute a fraction containing the desired recombinant protein; And (iv) applying the fraction eluted in the hydrophobic interaction column chromatography of step (iii) to an ion exchange chromatography.

다른 하나의 구체예에서, 상기 정제 방법은 (1) 목적하는 재조합 단백질을 페리플라즘 내로 발현하는 분리된 재조합 대장균 균체에 카오트로픽 제제 (chaotropic agent)가 함유된 완충용액을 가하여, 페리플라즘 단백질을 포함하는 추출액을 수득하는 단계; (2) 상기 (1) 단계에서 수득한 추출액을 원심분리 또는 마이크로필터를 수행하여 페리플라즘 단백질을 포함하는 상등액을 수득하는 단계; (3) 상기 (2) 단계에서 수득한 상등액을 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피에 적용하여, 목적하는 재조합 단백질을 포함하는 분획물을 용출하는 단계; 및 (4) 상기 (3) 단계의 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피에서 용출된 분획물을 이온 교환 크로마토그래피에 적용하는 단계를 포함하는, 목적하는 재조합 단백질의 정제 방법일 수 있다.In another embodiment, the purification method comprises the steps of (1) adding a buffer solution containing chaotropic agent to the separated recombinant E. coli cells expressing the desired recombinant protein in a periplasm, &Lt; / RTI > (2) centrifuging or microfiltering the extract obtained in the step (1) to obtain a supernatant containing the periplasmic protein; (3) applying the supernatant obtained in the step (2) to hydrophobic interaction column chromatography to elute a fraction containing the desired recombinant protein; And (4) applying the fraction eluted in the hydrophobic interaction column chromatography of step (3) to an ion exchange chromatography.

하나의 구체예에서, 상기 정제 방법의 (i) 단계는 (a) 목적하는 재조합 단백질을 페리플라즘 내로 발현하는 재조합 대장균을 배양한 후 원심분리 또는 마이크로필터를 수행하여 균체를 수득하는 단계; 및 (b) 분리된 재조합 대장균 균체에 수크로즈가 함유된 완충용액을 가한 후, 원심분리 또는 마이크로필터를 수행하여 세포 침전물을 수득하고, 상기 세포 침전물에 수크로즈가 함유된 완충용액에 비해 삼투압이 낮은 용액을 처리하여, 페리플라즘 단백질을 포함하는 추출액을 수득하는 단계에 의해 수행되는 것을 특징으로 한다. In one embodiment, step (i) of the purification method comprises: (a) culturing the recombinant E. coli expressing the desired recombinant protein in a periplasm, followed by centrifugation or microfiltering to obtain the cells; And (b) adding a buffer solution containing sucrose to the separated recombinant Escherichia coli cells, followed by centrifugation or microfiltering to obtain a cell precipitate, and comparing the cell precipitate with a buffer solution containing sucrose, And then treating the lower solution to obtain an extract containing the periplasmic protein.

앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 정제방법으로서, 상기 수크로즈가 함유된 완충용액에 비해 삼투압이 낮은 용액은 증류수인 것을 특징으로 한다.A purification method according to any one of the preceding embodiments, characterized in that the solution having a lower osmotic pressure than that of the buffer solution containing sucrose is distilled water.

앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 정제방법으로서, 상기 정제 방법의 (ii) 단계의 염 또는 카오트로픽 제제 (chaotropic agent)를 첨가하는 단계는, 원심분리 또는 마이크로필터 수행시 세포 응집력을 증가시키는 단계인 것을 특징으로 한다. 상기 세포 응집력을 증가시키는 단계는 세포 침전물의 응집력이 증가하여 원심분리나 마이크로 필터를 수행 시 상등액의 탁도를 감소시키는 것일 수 있다. Wherein the step of adding the salt or chaotropic agent of step (ii) of the purification method is a step of increasing the cell cohesive force during centrifugation or microfiltering . The step of increasing the cohesion of the cells may increase the cohesion of the cell precipitate and reduce the turbidity of the supernatant during centrifugation or microfiltering.

앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제제방법으로서, 상기 정제방법의 (1) 단계의 카오트로픽 제제 (chaotropic agent)를 첨가하는 단계는, 페리플라즘내 단백질을 추출하는 단계로 카오트로픽 제제에 의해 세포 외벽의 파쇄 혹은 변형을 일으켜 페리플라즘 단백질을 추출하는 단계이며, 상기 (i) 단계와 유사한 수득율을 보일 수 있다. The preparation method according to any one of the preceding embodiments, wherein the step of adding the chaotropic agent of step (1) of the purification method is a step of extracting proteins in the periplasm, , And the yield of the periplasmic protein is similar to that of the step (i).

이와 같은 세포 응집력 증가는 세포 유래 불순물을 보다 용이하게 펠렛으로 제거할 수 있는 장점과 페리플라즘 내로 발현된 단백질의 특정한 추출을 향상시키는 것일 수 있다.Such an increase in cell cohesion may facilitate the removal of cell-derived impurities more easily with pellets and improve the specific extraction of proteins expressed in the periplasm.

앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 정제방법으로서, 상기 염 또는 카오트로픽 제제는 50 mS/cm ~ 300 mS/cm 전도도를 갖는 것을 특징으로 한다.The purification method according to any one of the preceding embodiments, wherein the salt or chaotropic agent has a conductivity of 50 mS / cm to 300 mS / cm.

앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 정제방법으로서, 상기 염 또는 카오트로픽 제제는 염화나트륨, 황산나트륨, 황산암모늄, 황산바륨, 황산칼슘, 황산마그네슘, 탄산수소나트륨, 탄산나트륨, 염화암모늄, 플루오르화나트륨, 아질산나트륨, 인산칼슘, 황화나트륨, 염화바륨, 염화칼슘, 브로민화마그네슘, 탄산칼슘, 황산칼륨, 아세트산 나트륨, 시트르산나트륨, 브로민화나트륨, 티오시안산 나트륨, 인산나트륨, 소듐 디옥시콜레이트, 아세트산 암모늄, 탄산수소암모늄, 염화 암모늄, Tris-HCl, 트리스 인산염, NP-40(Nonidet P-40), 루브롤 PX(Lubrol PX), 옥틸 글루코시드, 트윈80, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌이민, 아세톤, 트리톤 X-100, 구아니딘-염산 (Gu-HCl), 우레아, 염화 칼륨, 암모늄 설페이트, 부탄올, 에탄올, 과염소산 리튬(Lithium perchlorate), 아세트산 리튬(Lithium acetate), 염화마그네슘, 염화알루미늄 (AlCl₃), 페놀, 프로판올, SDS (Sodium dodeceyl sulfate), 또는 티오요소 (Thiourea)인 것을 특징으로 한다.Wherein the salt or chaotropic agent is selected from the group consisting of sodium chloride, sodium sulfate, ammonium sulfate, barium sulfate, calcium sulfate, magnesium sulfate, sodium bicarbonate, sodium carbonate, ammonium chloride, sodium fluoride, sodium nitrite , Calcium phosphate, sodium sulfide, barium chloride, magnesium bromide, calcium carbonate, potassium sulfate, sodium acetate, sodium citrate, sodium bromide, sodium thiocyanate, sodium phosphate, sodium dioxycholate, ammonium acetate, hydrogen carbonate Ammonium chloride, ammonium chloride, Tris-HCl, trisphosphate, NP-40 (Nonidet P-40), Lubrol PX, octyl glucoside, Tween 80, polyethylene glycol, polyethyleneimine, acetone, Triton X- Guanidine hydrochloride (Gu-HCl), urea, potassium chloride, ammonium sulfate, butanol, ethanol, lithium perchlorate, lithium acetylacetonate tate, magnesium chloride, aluminum chloride (AlCl ₃ ), phenol, propanol, SDS (sodium dodecyl sulfate), or thiourea.

앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 정제방법으로서, 상기 염은 염화나트륨이며, 상기 카오트로픽 제제는 구아니딘-염산 (Gu-HCl)인 것을 특징으로 한다.Wherein the salt is sodium chloride and the chaotropic agent is guanidine hydrochloride (Gu-HCl).

앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 정제방법으로서, 상기 정제 방법의 (ii) 단계의 염 또는 카오트로픽 제제는 전도도가 50 mS/cm ~ 300 mS/cm을 갖도록 투입하는 것을 특징으로 한다.The purification method according to any one of the preceding embodiments, wherein the salt or the chaotropic agent of step (ii) of the purification method is characterized in that it has a conductivity of 50 mS / cm to 300 mS / cm.

다른 하나의 구체예에서, 상기 정제 방법의 (1) 단계는 (a) 목적하는 재조합 단백질을 페리플라즘 내로 발현하는 재조합 대장균을 배양한 후 원심분리 또는 마이크로필터를 수행하여 균체를 수득하는 단계; 및 (b) 분리된 재조합 대장균 균체에 카오트로픽 제제 (chaotropic agent)가 함유된 완충용액을 가하여, 페리플라즘 단백질을 포함하는 추출액을 수득하는 단계에 의해 수행되는 것을 특징으로 한다.In another embodiment, step (1) of the purification method comprises (a) culturing a recombinant E. coli expressing the desired recombinant protein in a periplasm, followed by centrifugation or microfiltering to obtain a cell; And (b) adding a buffer solution containing the chaotropic agent to the separated recombinant E. coli cells to obtain an extract containing the periplasmic protein.

앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 정제방법으로서, 상기 정제 방법 (1)의 카오트로픽 제제는 50 mS/cm ~ 300 mS/cm 전도도를 갖는 것을 특징으로 한다.The purification method according to any one of the preceding embodiments, wherein the chaotropic agent of the purification method (1) has a conductivity of 50 mS / cm to 300 mS / cm.

앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 정제방법으로서, 상기 정제 방법 (1)의 카오트로픽 제제는 트윈80, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌이민, 트리톤 X-100, 구아니딘-염산 (Gu-HCl), 우레아, 암모늄 설페이트, SDS (Sodium dodeceyl sulfate), 또는 티오요소 (Thiourea)인 것을 특징으로 한다.Wherein the chaotropic preparation of the purification method (1) is selected from the group consisting of Tween 80, polyethylene glycol, polyethyleneimine, Triton X-100, guanidine hydrochloride (Gu-HCl), urea, ammonium sulfate , Sodium dodecyl sulfate (SDS), or thiourea.

앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 정제방법으로서, 상기 정제 방법 (1)의 카오트로픽 제제는 구아니딘-염산 (Gu-HCl)인 것을 특징으로 한다.The purification method according to any one of the preceding embodiments, wherein the chaotropic agent of the purification method (1) is guanidine hydrochloride (Gu-HCl).

앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 정제방법으로서, 상기 재조합 단백질은 호르몬, 사이토카인, 인터루킨, 인터루킨 결합 단백질, 효소, 항체, 성장인자, 전사조절인자, 혈액인자, 백신, 구조단백질, 리간드 단백질 또는 수용체, 세포표면항원 또는 수용체 길항물질인 것을 특징으로 한다.The method of any one of the preceding embodiments wherein the recombinant protein is selected from the group consisting of a hormone, a cytokine, an interleukin, an interleukin binding protein, an enzyme, an antibody, a growth factor, a transcriptional regulator, a blood factor, a vaccine, , A cell surface antigen or a receptor antagonist.

앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 정제방법으로서, 상기 재조합 단백질은 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1), 글루카곤, GIP(Gastric inhibitory polypeptide), 옥신토모듈린, 제닌(Xenin), 인슐린, CCK(Cholecystokinin) 아밀린(amylin), 가스트린(gastrin), 그렐린(ghrelin), PYY(peptide YY) 등과 같이 위나 장에서 혈당과 체중을 조절하는 인크레틴류(incretins); 렙틴(Leptin), 아디포넥틴(adiponectin), 아디포린(adipolin), 아페린(apelin), 카르토넥틴(cartonectin)과 같이 지방질(adipose)에서 분비되는 아디포카인류(adipokines); 키스펩틴(Kisspeptin), 네스파틴-1(Nesfatin-1)과 같이 뇌에서 분비되는 뉴로펩타이드류(neuropeptides); 이리신(Irisin), 마이오넥틴(myonectin), 데코린(decorin), 폴리스타틴(follistatin), 머슬린(musclin)과 같이 근육(muscle)에서 분비되는 펩타이드 혹은 단백질류; 혈관작동성장펩타이드(Vasoactive intestinal peptide), 나트륨이뇨펩타이드류(natriuretic peptides), 호중구 증가 인자(G-CSF), 인간 성장 호르몬(hGH), 에리스로포이에틴(EPO), 성장 호르몬 방출 호르몬, 성장 호르몬 방출 펩타이드, 인터페론, 인터페론 수용체, 지프로테인 관련수용체(G protein-coupled receptor), 인터루킨류, 인터루킨 수용체, 효소류, 인터루킨 결합 단백질, 사이토카인 결합 단백질, 마크로파지 활성인자, 마크로파지 펩타이드, B 세포인자, T 세포인자, 단백질 A, 알러지 억제인자, 세포 괴사 당단백질, 면역독소, 림포독소, 종양 괴사인자, 종양 억제인자, 전이 성장인자, 알파-1 안티트립신, 알부민, α-락트알부민, 아포리포단백질-E, 고 당쇄화 적혈구 생성인자, 안지오포에이틴류, 헤모글로빈, 트롬빈, 트롬빈 수용체 활성 펩타이드, 트롬보모듈린, 혈액인자 Ⅶ, Ⅶa, Ⅷ, Ⅸ, 및 XIII, 플라즈미노젠 활성인자, 피브린-결합 펩타이드, 유로키나제, 스트렙토키나제, 히루딘, 단백질 C, C-반응성 단백질, 레닌 억제제, 콜라게나제 억제제, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 혈소판 유래 성장인자, 상피세포 성장인자, 표피세포 성장인자, 안지오스타틴, 안지오텐신, 골 형성 성장인자, 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌, 아트리오펩틴, 연골 유도인자, 엘카토닌, 결합조직 활성인자, 조직인자 경로 억제제, 여포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 신경 성장인자, 부갑상선 호르몬, 릴랙신, 씨크레틴, 소마토메딘, 인슐린 유사 성장인자, 부신피질 호르몬, 콜레시스토키닌, 췌장 폴리펩타이드, 가스트린 방출 펩타이드, 코티코트로핀 방출인자, 갑상선 자극호르몬, 오토탁신, 락토페린, 미오스타틴, 세포표면항원, 바이러스 유래 백신 항원, 단일클론 항체, 다중클론 항체 및 항체 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.Wherein the recombinant protein is selected from the group consisting of glucagon-like peptide-1 (GLP-1), glucagon, Gastric inhibitory polypeptide (GIP), oxytomodulin, Xenin, insulin, CCK Cholecystokinin: incretins that regulate blood sugar and body weight in the stomach or intestine, such as amylin, gastrin, ghrelin, and PYY (peptide YY); Adipokines secreted from adipose, such as leptin, adiponectin, adipolin, apelin, and cartonectin; Neuropeptides secreted in the brain, such as Kisspeptin, Nesfatin-1; Peptides or proteins secreted in muscle, such as Irisin, myonectin, decorin, follistatin, musclin; (G-CSF), human growth hormone (hGH), erythropoietin (EPO), growth hormone releasing hormone, growth hormone releasing peptide, Interferon receptor, interferon receptor, G protein-coupled receptor, interleukins, interleukin receptor, enzymes, interleukin binding protein, cytokine binding protein, macrophage activator, macrophage peptide, B cell factor, T cell factor, Protein A, allergic inhibitor, cytotoxic protein, immunotoxin, lymphotoxin, tumor necrosis factor, tumor suppressor, metastatic growth factor, alpha-1 antitrypsin, albumin, alpha-lactalbumin, apolipoprotein-E, Angiopoietins, hemoglobin, thrombin, thrombin receptor activating peptide, thrombomodulin, blood factor VII, A protein inhibitor, a collagenase inhibitor, a superoxide dismutase, a fibrin-binding peptide, an urokinase, a streptokinase, a hirudin, a protein C, Anatrophin, angiotensin, osteogenic growth factor, osteogenesis promoting protein, calcitonin, atriepeptin, cartilage inducer, elctatonin, connective tissue activator, tissue factor A progestin receptor antagonist, a pathway inhibitor, a follicle stimulating hormone, a luteinizing hormone, a luteinizing hormone releasing hormone, a nerve growth factor, a parathyroid hormone, a lilacsin, a cicletin, a somatomedin, an insulin like growth factor, a corticosteroid, a cholecystokinin, a pancreatic polypeptide, Releasing peptide, corticotropin releasing factor, thyroid stimulating hormone, autotaxin, lactoferrin, myostatin, cell surface antigen , Virus derived vaccine antigens, characterized in that is selected from monoclonal antibodies, polyclonal antibodies and antibody fragments in the group consisting of.

앞선 구체예중 어느 하나에 따른 정제방법으로서, 상기 재조합 단백질은 인간 성장 호르몬, 인터페론-알파, 과립구 콜로니자극인자, 적혈구 생성인자, 혈액인자, 인슐린, 옥신토모듈린, 글루카곤-유사 펩타이드류, 엑센딘류 및 각각의 유도체인 것을 특징으로 한다.The method of any one of the preceding embodiments, wherein the recombinant protein is selected from the group consisting of human growth hormone, interferon-alpha, granulocyte colony stimulating factor, erythropoietic factor, blood factor, insulin, oxytomodulin, glucagon-like peptides, And derivatives thereof.

앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 정제방법으로서, 상기 재조합 단백질은 인간 성장 호르몬인 것을 특징으로 한다.The purification method according to any one of the preceding embodiments, wherein the recombinant protein is a human growth hormone.

앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 정제방법으로서, 상기 정제 방법의 (iii) 단계 또는 (3) 단계의 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피는 1회 혹은 2회 수행되는 것을 특징으로 한다. 그 예로, 2회 일 수 있으나, 정제 수율을 높일 수 있는 한 제한되지 않는다.The purification method according to any one of the preceding embodiments, wherein the hydrophobic interaction column chromatography in step (iii) or (3) of the purification method is performed once or twice. For example, it may be two times, but is not limited as long as the purification yield can be increased.

앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 정제방법으로서, 2회 이상 수행시 상기 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피는 각각 서로 다르거나, 동일한 작용기의 수지를 이용하는 것을 특징으로 한다.In the purification method according to any one of the above-mentioned specific embodiments, the hydrophobic interaction column chromatography is carried out two or more times, wherein the hydrophobic interaction column chromatography is characterized in that resins having the same or different functional groups are used.

앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 정제방법으로서, 상기 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피 수지의 작용기가 페닐(phenyl), 옥틸(octyl), (이소)프로필((iso)propyl), 부틸(butyl) 및 에틸(ethyl)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나인 것을 특징으로 한다.Wherein the functional group of the hydrophobic interaction column chromatography resin is selected from the group consisting of phenyl, octyl, (iso) propyl), butyl and ethyl (ethyl). < / RTI >

앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 정제방법으로서, 상기 정제 방법의 (iv) 단계 또는 (4) 단계의 이온 교환 크로마토그래피 수지의 작용기가 메틸설포네이트 (S), 설포프로필 (SP), 카르복시메틸 (CM), 설포에틸 (SE) 및 폴리아스파르트산（Poly aspartic acid)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나인 것을 특징으로 한다.The purification method according to any one of the preceding embodiments wherein the functional group of the ion exchange chromatography resin of step (iv) or step (4) of the purification method is selected from the group consisting of methyl sulfonate (S), sulfopropyl (SP), carboxymethyl CM), sulfoethyl (SE), and polyaspartic acid (Poly aspartic acid).

앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 정제방법으로서, 상기 정제 방법의 (iv) 단계 또는 (4) 단계의 이온 교환 크로마토그래피 수지의 작용기가 쿼터너리암모늄 (Q), 쿼터너리아미노에틸 (QAE), 디에틸아미노에틸 (DEAE), 폴리에틸렌이민 (PEI), 디메틸아미노메틸(DMAE), 및 트리메틸아미노에틸 (TMAE)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나인 것을 특징으로 한다.The purification method according to any one of the preceding embodiments, wherein the functional group of the ion exchange chromatography resin of step (iv) or step (4) of the purification method is selected from the group consisting of quaternary ammonium (Q), quaternary aminoethyl (QAE) Is one selected from the group consisting of ethylaminoethyl (DEAE), polyethyleneimine (PEI), dimethylaminomethyl (DMAE), and trimethylaminoethyl (TMAE).

본 발명의 방법에 따르면 별도의 활성화 공정 없이 간단하면서도 고수율 및 고순도로 인체 내에서 발현되는 것과 동일한 기능을 가지는 재조합 단백질, 그 예로 천연형 인간 성장 호르몬 등을 얻을 수 있다. 특히 본 발명의 방법에 따르면, 대장균 내에서 발현되는 재조합 단백질의 변형체들, 그 예로 인간 성장 호르몬의 변형체들이 효율적으로 제거된다.According to the method of the present invention, it is possible to obtain a recombinant protein having the same function as that expressed in the human body in a simple but high yield and high purity without a separate activation step, for example, a natural type human growth hormone. In particular, according to the method of the present invention, variants of recombinant proteins expressed in E. coli, such as variants of human growth hormone, are efficiently removed.

도 1은 정제된 인간 성장 호르몬 단백질의 SDS-PAGE 결과를 보여주는 사진이다 (a: 대조군인 소마트로핀(Somatropin), b: 정제된 성장 호르몬 시료 (rhGH).
도 2는 정제된 인간 성장 호르몬의 역상 고압 크로마토그래피를 수행한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 3은 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피인, 프로필(Poly HI-Propyl, Avantor사) 컬럼 크로마토그래피를 보여주는 그래프이다.
도 4는 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피인, 음이온(SourceQ, GE사) 컬럼 크로마토그래피를 보여주는 그래프이다.Fig. 1 is a photograph showing the results of SDS-PAGE of purified human growth hormone protein (a: a control group Somatropin, b: a purified growth hormone sample (rhGH).
Figure 2 is a graph showing the results of reversed phase high pressure chromatography of purified human growth hormone.
Figure 3 is a graph showing the profile (Poly HI-Propyl, Avantor) column chromatography, which is hydrophobic interaction column chromatography.
4 is a graph showing the anion (SourceQ, GE Co.) column chromatography, which is anion exchange column chromatography.

본 발명을 실시하기 위한 보다 구체적인 내용을 설명하면 다음과 같다. 한편, 본원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없다.More specific details for carrying out the present invention are as follows. On the other hand, each description and embodiment disclosed herein can be applied to each other description and embodiment. That is, all combinations of the various elements disclosed herein are within the scope of the present invention. Further, the scope of the present invention can not be said to be limited by the following detailed description.

본 발명을 구현하기 위한 하나의 양태로서, 재조합 대장균으로부터 페리플라즘 내로 발현된 목적하는 재조합 단백질을 고수율 및 고순도로 정제하는 방법을 제공한다.As one embodiment for implementing the present invention, there is provided a method for purifying a desired recombinant protein expressed in a periplasm from a recombinant E. coli with high yield and high purity.

하나의 구체예에서, 상기 정제 방법은 (i) 목적하는 재조합 단백질을 페리플라즘 내로 발현하는 분리된 재조합 대장균 균체에 수크로즈가 함유된 완충용액을 가한 후, 원심분리 또는 마이크로필터를 수행하여 세포 침전물을 수득하고, 상기 세포 침전물에 수크로즈가 함유된 완충용액에 비해 삼투압이 낮은 용액을 처리하여, 페리플라즘 단백질을 포함하는 추출액을 수득하는 단계; (ii) 상기 (i) 단계에서 수득한 추출액에 염 또는 카오트로픽 제제 (chaotropic agent)를 첨가하여 원심분리 또는 마이크로필터를 수행하여 페리플라즘 단백질을 포함하는 상등액을 수득하는 단계; (iii) 상기 (ii) 단계에서 수득한 상등액을 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피에 적용하여, 목적하는 재조합 단백질을 포함하는 분획물을 용출하는 단계; 및 (iv) 상기 (iii) 단계의 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피에서 용출된 분획물을 이온 교환 크로마토그래피에 적용하는 단계를 포함하는, 목적하는 재조합 단백질의 정제 방법일 수 있다.In one embodiment, the purification method comprises the steps of (i) adding a buffer solution containing sucrose to the separated recombinant E. coli cells expressing the desired recombinant protein in a periplasm, followed by centrifugation or microfiltering, Obtaining a precipitate and treating the solution having a lower osmotic pressure than the buffer solution containing sucrose in the cell precipitate to obtain an extract containing the periplasmic protein; (ii) adding a salt or chaotropic agent to the extract obtained in the step (i) and centrifuging or microfiltering to obtain a supernatant containing the periplasmic protein; (iii) applying the supernatant obtained in step (ii) to hydrophobic interaction column chromatography to elute a fraction containing the desired recombinant protein; And (iv) applying the fraction eluted in the hydrophobic interaction column chromatography of step (iii) to an ion exchange chromatography.

상기 (ii) 단계에서 염 또는 카오트로픽 제제를 첨가하는 단계는 추출액 내의 세포 응집력을 증가시킬 뿐 아니라, 상등액의 탁도를 낮추어, 단백질의 정제 수율을 높일 수 있다.The step of adding the salt or the chaotropic agent in the step (ii) not only increases cell cohesion in the extract, but also lowers the turbidity of the supernatant, thereby increasing the purification yield of the protein.

이와 같은 정제 방법은 (i) 재조합 단백질을 페리플라즘내로 발현하는 재조합 대장균을 배양한 후 원심분리하여 세포 침전물을 얻고, 상기 세포 침전물에 수크로즈등의 당류가 함유된 완충용액을 가한 후 원심분리하여 세포 침전물을 얻고 이 세포 침전물에 증류수를 가하여 페리플라즘 단백질을 얻고, (ii) 염화나트륨 등의 염 혹은 카오트로픽 시료을 투입하고 원심분리하여 페리플라즘 단백질을 포함하는 상등액을 얻고, (iii) 상기 (ii)에서 얻은 상등액을 소수성 상호작용 및 (iv) 이온 교환 크로마토그래피를 차례로 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질의 정제 방법에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다(제 1 정제방법).Such purification methods include (i) culturing a recombinant Escherichia coli expressing a recombinant protein in a periplasm, followed by centrifugation to obtain a cell precipitate, adding a buffer solution containing saccharides such as sucrose to the cell precipitate, centrifuging (Ii) a salt such as sodium chloride or a chaotropic sample is added and centrifuged to obtain a supernatant containing a periplasmic protein; and (iii) a supernatant containing the periplasmic protein is obtained, (ii) performing hydrophobic interaction with the supernatant obtained in (ii), and (iv) ion-exchange chromatography in this order, Way).

다른 하나의 구체예에서 상기 다른 정제 방법은 (1) 목적하는 재조합 단백질을 페리플라즘 내로 발현하는 분리된 재조합 대장균 균체에 카오트로픽 제제가 함유된 완충용액을 가하여, 페리플라즘 단백질을 포함하는 추출액을 수득하는 단계; (2) 상기 (1) 단계에서 수득한 추출액을 원심분리 또는 마이크로필터를 수행하여 페리플라즘 단백질을 포함하는 상등액을 수득하는 단계; (3) 상기 (2) 단계에서 수득한 상등액을 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피에 적용하여, 목적하는 재조합 단백질을 포함하는 분획물을 용출하는 단계; 및 (4) 상기 (3) 단계의 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피에서 용출된 분획물을 이온 교환 크로마토그래피에 적용하는 단계를 포함하는, 목적하는 재조합 단백질의 정제 방법일 수 있다(제2 정제방법).In another embodiment, the above other purification method comprises the steps of (1) adding a buffer solution containing a chaotropic agent to the separated recombinant Escherichia coli cells expressing the desired recombinant protein in a periplasm, adding an extract containing the periplasmic protein ; (2) centrifuging or microfiltering the extract obtained in the step (1) to obtain a supernatant containing the periplasmic protein; (3) applying the supernatant obtained in the step (2) to hydrophobic interaction column chromatography to elute a fraction containing the desired recombinant protein; And (4) applying the fraction eluted in the hydrophobic interaction column chromatography of step (3) to an ion exchange chromatography (second purification method).

본 발명의 정제방법은 수크로즈가 함유된 완충용액을, 재조합 단백질을 페리플라즘 내로 발현하는 분리된 대장균 균체에 가하고 원심분리 후, 증류수를 가하여 페리플라즘 단백질을 포함하는 추출액을 수득 후, 염 또는 카오트로픽 제제를 첨가하여 원심분리하는 단계를 포함하는 방법 (제1 정제방법) 또는 재조합 단백질을 페리플라즘 내로 발현하는 분리된 대장균 균체에 카로트로픽 제제가 함유된 완충용액을 가하여 페리플라즘 단백질을 포함하는 추출액을 수득하는 단계를 포함하는 방법 (제2 정제 방법)에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the purification method of the present invention, the buffer solution containing sucrose is added to the separated Escherichia coli cells expressing the recombinant protein in the periplasm, centrifuged, and distilled water is added to obtain an extract containing the periplasmic protein, Or chaotropic agent (first purification method), or by adding a buffer solution containing the cholotropic agent to the separated Escherichia coli cells expressing the recombinant protein in a periplasm, to prepare a periplasmic protein (A second purification method), which comprises the step of obtaining an extract containing the compound of the present invention.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명에 사용되는 재조합 대장균은 본 발명의 목적상 목적하는 재조합 단백질을 페리플라즘내로 발현하는 것으로, 분비 서열과 목적하는 단백질이 융합된 융합 단백질을 코딩하는 융합 유전자를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 재조합 대장균이다. 그 예로, 인간 성장 호르몬이 융합된 융합 단백질을 코딩하는 융합 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 재조합 대장균일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.For the purpose of the present invention, the recombinant E. coli to be used in the present invention expresses a desired recombinant protein in a periplasm, which is transformed into an expression vector containing a fusion gene encoding a fusion protein in which the secretion sequence and the desired protein are fused Lt; / RTI > For example, the human growth hormone may be recombinant Escherichia coli transformed with an expression vector containing a fusion gene encoding a fused fusion protein, but is not limited thereto.

상기 재조합 대장균은 대장균의 열안정성 엔테로톡신 II의 변형된 분비 서열과 인간 성장 호르몬이 융합된 발현 벡터로 형질전환된 대장균에서 발현될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 구체적으로, 본 발명의 다양한 목적하는 재조합 단백질과 열안정성 엔테로톡신 II의 변형된 분비 서열과 같은, 융합된 목적하는 재조합 단백질을 페리플라즘으로 이동시킬 수 있는 다양한 분비 서열과 목적하는 재조합 단백질이 융합된 것일 수 있다. 그 예로 서열번호: 1의 분비 서열일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.The recombinant E. coli can be expressed in, but is not limited to, Escherichia coli transformed with an expression vector in which a modified secretory sequence of thermostable enterotoxin II of E. coli is fused with a human growth hormone. Specifically, various secretion sequences capable of transferring the fused recombinant protein of interest to the periplasm, such as the various desired recombinant proteins of the present invention and modified secretion sequences of thermostable enterotoxin II, . For example, it may be a secretion sequence of SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.

상기 재조합 단백질은 호르몬, 사이토카인, 인터루킨, 인터루킨 결합 단백질, 효소, 항체, 성장인자, 전사조절인자, 혈액인자, 백신, 구조단백질, 리간드 단백질 또는 수용체, 세포표면항원 또는 수용체 길항 물질 등 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구제적으로, 상기 재조합 단백질은 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1), 글루카곤, GIP(Gastric inhibitory polypeptide), 옥신토모듈린, 제닌(Xenin), 인슐린, CCK(Cholecystokinin) 아밀린(amylin), 가스트린(gastrin), 그렐린(ghrelin), PYY(peptide YY) 등과 같이 위나 장에서 혈당과 체중을 조절하는 인크레틴류(incretins); 렙틴(Leptin), 아디포넥틴(adiponectin), 아디포린(adipolin), 아페린(apelin), 카르토넥틴(cartonectin)과 같이 지방질(adipose)에서 분비되는 아디포카인류(adipokines); 키스펩틴(Kisspeptin), 네스파틴-1(Nesfatin-1)과 같이 뇌에서 분비되는 뉴로펩타이드류(neuropeptides); 이리신(Irisin), 마이오넥틴(myonectin), 데코린(decorin), 폴리스타틴(follistatin), 머슬린(musclin)과 같이 근육(muscle)에서 분비되는 펩타이드 혹은 단백질류; 혈관작동성장펩타이드(Vasoactive intestinal peptide), 나트륨이뇨펩타이드류(natriuretic peptides), 호중구 증가 인자(G-CSF), 인간 성장 호르몬(hGH), 에리스로포이에틴(EPO), 성장 호르몬 방출 호르몬, 성장 호르몬 방출 펩타이드, 인터페론, 인터페론 수용체, 지프로테인 관련수용체(G protein-coupled receptor), 인터루킨류, 인터루킨 수용체, 효소류, 인터루킨 결합 단백질, 사이토카인 결합 단백질, 마크로파지 활성인자, 마크로파지 펩타이드, B 세포인자, T 세포인자, 단백질 A, 알러지 억제인자, 세포 괴사 당단백질, 면역독소, 림포독소, 종양 괴사인자, 종양 억제인자, 전이 성장인자, 알파-1 안티트립신, 알부민, α-락트알부민, 아포리포단백질-E, 고 당쇄화 적혈구 생성인자, 안지오포에이틴류, 헤모글로빈, 트롬빈, 트롬빈 수용체 활성 펩타이드, 트롬보모듈린, 혈액인자 Ⅶ, Ⅶa, Ⅷ, Ⅸ, 및 XIII, 플라즈미노젠 활성인자, 피브린-결합 펩타이드, 유로키나제, 스트렙토키나제, 히루딘, 단백질 C, C-반응성 단백질, 레닌 억제제, 콜라게나제 억제제, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 혈소판 유래 성장인자, 상피세포 성장인자, 표피세포 성장인자, 안지오스타틴, 안지오텐신, 골 형성 성장인자, 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌, 아트리오펩틴, 연골 유도인자, 엘카토닌, 결합조직 활성인자, 조직인자 경로 억제제, 여포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 신경 성장인자, 부갑상선 호르몬, 릴랙신, 씨크레틴, 소마토메딘, 인슐린 유사 성장인자, 부신피질 호르몬, 콜레시스토키닌, 췌장 폴리펩타이드, 가스트린 방출 펩타이드, 코티코트로핀 방출인자, 갑상선 자극호르몬, 오토탁신, 락토페린, 미오스타틴, 세포표면항원, 바이러스 유래 백신 항원, 단일클론 항체, 다중클론 항체 및 항체 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.The recombinant protein may be a hormone, a cytokine, an interleukin, an interleukin binding protein, an enzyme, an antibody, a growth factor, a transcription regulator, a blood factor, a vaccine, a structural protein, a ligand protein or receptor, a cell surface antigen or a receptor antagonist , But is not limited thereto. Relatively, the recombinant protein may be selected from the group consisting of glucagon-like peptide-1 (GLP-1), glucagon, Gastric inhibitory polypeptide (GIP), oxytomodulin, Xenin, insulin, CCL (cholecystokinin) amylin, Incretins, which regulate blood glucose and body weight in the stomach or intestine, such as gastrin, ghrelin, and PYY (peptide YY); Adipokines secreted from adipose, such as leptin, adiponectin, adipolin, apelin, and cartonectin; Neuropeptides secreted in the brain, such as Kisspeptin, Nesfatin-1; Peptides or proteins secreted in muscle, such as Irisin, myonectin, decorin, follistatin, musclin; (G-CSF), human growth hormone (hGH), erythropoietin (EPO), growth hormone releasing hormone, growth hormone releasing peptide, Interferon receptor, interferon receptor, G protein-coupled receptor, interleukins, interleukin receptor, enzymes, interleukin binding protein, cytokine binding protein, macrophage activator, macrophage peptide, B cell factor, T cell factor, Protein A, allergic inhibitor, cytotoxic protein, immunotoxin, lymphotoxin, tumor necrosis factor, tumor suppressor, metastatic growth factor, alpha-1 antitrypsin, albumin, alpha-lactalbumin, apolipoprotein-E, Angiopoietins, hemoglobin, thrombin, thrombin receptor activating peptide, thrombomodulin, blood factor VII, A protein inhibitor, a collagenase inhibitor, a superoxide dismutase, a fibrin-binding peptide, an urokinase, a streptokinase, a hirudin, a protein C, Anatrophin, angiotensin, osteogenic growth factor, osteogenesis promoting protein, calcitonin, atriepeptin, cartilage inducer, elctatonin, connective tissue activator, tissue factor A progestin receptor antagonist, a pathway inhibitor, a follicle stimulating hormone, a luteinizing hormone, a luteinizing hormone releasing hormone, a nerve growth factor, a parathyroid hormone, a lilacsin, a cicletin, a somatomedin, an insulin like growth factor, a corticosteroid, a cholecystokinin, a pancreatic polypeptide, Releasing peptide, corticotropin releasing factor, thyroid stimulating hormone, autotaxin, lactoferrin, myostatin, cell surface antigen , It may be selected from the virus derived vaccine antigens, monoclonal antibodies, polyclonal antibodies and antibody fragments in the group consisting of.

보다 구체적으로, 상기 재조합 단백질은 인간 성장 호르몬, 인터페론-알파, 과립구 콜로니자극인자, 적혈구 생성인자, 혈액인자, 인슐린, 옥신토모듈린, 글루카곤-유사 펩타이드류, 엑센딘류 및 각각의 유도체일 수 있으며, 그 예로, 인간 성장 호르몬일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.More specifically, the recombinant protein may be a human growth hormone, an interferon-alpha, a granulocyte colony stimulating factor, an erythropoietic factor, a blood factor, an insulin, an oxytomodulin, a glucagon-like peptide, an exendin, , For example, human growth hormone, but are not limited thereto.

상기 재조합 대장균의 페리플라즘 내로 목적하는 재조합 단백질, 그 예로 인간 성장 호르몬과 같은 재조합 단백질을 발현시키기 위하여, 상기 재조합 대장균을 박토-트립톤, 효모추출물, NaCl, phosphate buffer, trace metal, 글루코스, MgCl₂ 등이 첨가된 발효조에서 발효할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 박토-효모추출물과 글루코스를 투입하여 유가식 배양(fed-batch) 할 수 있다. 이러한 배지 조성은 재조합 대장균의 고농도 배양과 대장균에서 재조합 단백질의 페리플라즘에로의 고발현에 적합하며 이외에도 일반적인 재조합 대장균에서 재조합 단백질을 발현할 수 있는 배양 방법은 제한없이 포함된다.In order to express a recombinant protein such as human growth hormone in the periplasm of the recombinant E. coli, the recombinant E. coli was transformed with a bacto-tryptone, yeast extract, NaCl, phosphate buffer, trace metal, glucose, MgCl _The fermentation can be performed in a fermenter to which ₂ is added, but is not limited thereto. It can also be fed-batch fed with bark-yeast extract and glucose. Such a medium composition is suitable for high-concentration cultivation of recombinant E. coli and high expression of recombinant proteins in E. coli to periplasm. In addition, culturing methods capable of expressing recombinant proteins in general recombinant E. coli are not limited.

본원에서 용어, "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본원의 배양 과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 방법에 있어서, 상기 미생물을 배양하는 단계는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 본원의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 에스케리키아속 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 구체적으로는 본원의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.As used herein, the term "cultivation" means growing the microorganism under moderately controlled environmental conditions. The culturing process of the present invention can be carried out according to a suitable culture medium and culture conditions known in the art. Such a culturing process can be easily adjusted by those skilled in the art depending on the strain to be selected. In the above method, the step of culturing the microorganism is not particularly limited, but may be carried out by a known batch culture method, continuous culture method, fed-batch culture method and the like. The medium used for culturing the microorganism of the present invention and other culture conditions may be any medium used for culturing Escherichia genus microorganisms, without any particular limitation. Specifically, microorganisms of the present invention may be cultured in a suitable carbon source, nitrogen source, , Inorganic compounds, amino acids, and / or vitamins, etc. under aerobic conditions while controlling the temperature, pH, and the like.

본원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스, 만니톨, 소르비톨 등과 같은 탄수화물; 당 알코올, 글리세롤, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 알코올; 유기산, 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체 적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있다.Examples of the carbon source include carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose, maltose, mannitol, sorbitol and the like; Alcohols such as sugar alcohols, glycerol, pyruvic acid, lactic acid, citric acid and the like; But are not limited to, amino acids such as organic acids, glutamic acid, methionine, lysine, and the like. In addition, natural organic nutrients such as starch hydrolyzate, molasses, black strap molasses, rice winter, casserole, sugar cane residue and corn steep liquor can be used, specifically glucose and sterilized pretreated molasses Converted molasses), and the like, and other suitable carbon sources can be used without limitation. These carbon sources may be used alone or in combination of two or more.

상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.Examples of the nitrogen source include inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, ammonium carbonate, and ammonium nitrate; An organic nitrogen source such as amino acids such as glutamic acid, methionine, glutamine and the like, peptone, NZ-amine, meat extract, yeast extract, malt extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, fish or its degradation products, defatted soybean cake, Can be used. These nitrogen sources may be used alone or in combination of two or more, but the present invention is not limited thereto.

상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.Such personnel may include potassium phosphate, potassium phosphate, or corresponding sodium-containing salts, and the like. Examples of the inorganic compound include sodium chloride, calcium chloride, magnesium chloride, iron sulfate, manganese sulfate, calcium carbonate, and the like, but may also include amino acids, vitamins and / or suitable precursors. These media or precursors may be added to the culture in a batch or continuous manner, but are not limited thereto.

본원에서, 미생물의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다.In the present application, compounds such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid, sulfuric acid and the like can be added to the culture in a suitable manner during the culture of the microorganism to adjust the pH of the culture. In addition, foaming can be suppressed by using a defoaming agent such as fatty acid polyglycol ester during the culture. Also, in order to maintain the aerobic state of the culture, oxygen or oxygen-containing gas may be injected into the culture, or nitrogen, hydrogen or carbon dioxide gas may be injected without injecting gas to maintain anaerobic and microorganism conditions.

배양물의 온도는 30℃ 내지 40℃일 수 있으며, 보다 구체적으로는 35℃ 내지 37℃일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 배양 기간은 원하는 유용 물질의 생성량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 35 시간 내지 45 시간일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.The temperature of the culture may be from 30 캜 to 40 캜, more specifically from 35 캜 to 37 캜, but is not limited thereto. The incubation period may be continued until the desired amount of useful substance is obtained, and may be, but is not limited to, 35 hours to 45 hours.

상기 재조합 대장균은 아미노 말단에 추가의 메티오닌이 첨가되지 않은 천연형 인간 성장 호르몬과 같은 다양한 목적하는 재조합 단백질을 페리플라즘으로 분비한다. 이렇게 얻어진 재조합 대장균 배양액을 원심분리하여 세포 침전물을 얻는다. The recombinant E. coli secretes a variety of desired recombinant proteins, such as natural type human growth hormone, to which no additional methionine is added at the amino terminus, as a periplasm. The cultured recombinant E. coli thus obtained is centrifuged to obtain cell precipitate.

이 세포 침전물에 수크로즈가 함유된 완충용액을 가한 후 원심분리하여 세포 침전물을 얻고 이 세포 침전물에 수크로즈가 함유된 완충용액에 비해 삼투압이 낮은 용액, 그 예로 증류수를 가한 후 원심분리 또는 마이크로 필터를 수행하여 페리플라즘 단백질을 포함하는 상등액을 얻는다. 상기 수크로즈가 함유된 완충용액에 비해 삼투압이 낮은 용액은 그 예로, 증류수일 수 있으나, 삼투압에 의해 페리플라즘 단백질을 추출할 수 있는 용액은 제한 없이 포함된다. 이 과정에서 인간 성장 호르몬 등 목적하는 재조합 단백질을 포함한 페리플라즘 단백질들이 삼투압에 의해 추출된다.A buffer solution containing sucrose is added to the cell precipitate, followed by centrifugation to obtain a cell precipitate. A solution having a lower osmotic pressure than the buffer solution containing sucrose in the cell precipitate, for example, distilled water is added and centrifuged or microfiltered To obtain a supernatant containing the periplasmic protein. A solution having a lower osmotic pressure than the buffer solution containing sucrose is, for example, distilled water, but the solution capable of extracting the periplasmic protein by osmotic pressure is not limited. In this process, periplasmic proteins including the desired recombinant proteins, such as human growth hormone, are extracted by osmotic pressure.

구체적으로 세포는 수크로즈가 함유된 완충용액, 예를 들어 10% 내지 30% 수크로즈가 함유된 완충용액의 처리로 인해 수축되었다가 증류수 처리로 인해 팽창하며 이로 인해 세포막을 통해 추출된다. 상기 삼투압 추출에는 수크로즈 이외에 아세톤, 부탄올과 같은 유기용매를 사용할 수도 있으나, 이에 제한되지 않는다.Specifically, the cells are contracted due to treatment with buffer solution containing sucrose, for example, 10% to 30% sucrose, and expanded due to distilled water treatment, thereby extracting through the cell membrane. In addition to sucrose, an organic solvent such as acetone or butanol may be used for the osmotic pressure extraction, but the present invention is not limited thereto.

추출액에 염화나트륨 등의 염이나 카오트로픽 제제를 투입하고 원심분리 혹은 마이크로 필터를 수행하여 페리플라즘 단백질이 포함된 상등액을 얻을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.A supernatant containing the periplasmic protein can be obtained by adding a salt such as sodium chloride or a chaotropic agent to the extract and performing centrifugation or microfiltering, but the present invention is not limited thereto.

하나의 구체예에서, 본 발명의 정제 방법의 (ii) 단계의 염 또는 카오트로픽 제제 (chaotropic agent)를 첨가하는 단계는, 원심분리 또는 마이크로필터 수행시 세포 응집력을 증가시키는 단계인 것을 특징으로 한다. 상기 세포 응집력을 증가시키는 단계는 세포 침전물의 응집력이 증가하여 원심분리나 마이크로 필터를 수행 시 상등액의 탁도를 감소시키는 것일 수 있다.In one embodiment, the step of adding a salt or a chaotropic agent of step (ii) of the purification method of the present invention is characterized in that it is a step of increasing cell cohesion during centrifugation or microfiltering . The step of increasing the cohesion of the cells may increase the cohesion of the cell precipitate and reduce the turbidity of the supernatant during centrifugation or microfiltering.

상기 염 또는 카오트로픽 제제는 50 mS/cm ~ 300 mS/cm 전도도, 구체적으로 100 mS/cm ~ 200 mS/cm 전도도, 보다 구체적으로 150 mS/cm ~ 250 mS/cm를 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The salt or chaotropic agent may have a conductivity of 50 mS / cm to 300 mS / cm, specifically 100 mS / cm to 200 mS / cm, more specifically 150 mS / cm to 250 mS / cm, It is not limited.

상기 정제 방법의 (ii) 단계의 염 또는 카오트로픽 제제는 전도도가 50 mS/cm ~ 300 mS/cm, 구체적으로 100 mS/cm ~ 200 mS/cm, 보다 구체적으로 150 mS/cm ~ 250 mS/cm을 갖도록 투입하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The salt or chaotropic agent of step (ii) of the purification method has a conductivity of 50 mS / cm to 300 mS / cm, specifically 100 mS / cm to 200 mS / cm, more specifically 150 mS / cm to 250 mS / cm. < / RTI >

염화나트륨은 1 M 내지 3 M일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이에 의해 세포 침전물의 응집성이 증가하여 원심분리나 마이크로 필터 후 상등액의 탁도가 감소한다. 이는 세포 유래 불순물을 보다 용이하게 펠렛으로 제거할 수 있는 장점과 페리플라즘에 발현된 단백질의 특정한 추출을 향상 시키는 효과가 있다. 또한, 세포 침전물의 응집성 향상은 재조합 단백질을 페리플라즘으로 발현한 세포의 외막 (outer membrane) 의 안정성, 발현 상태와 상관없이 일정하게 정제를 위한 삼투 충격 (Osmotic shock) 등의 전처리가 가능하며 그에 따른 수율 향상을 기대할 수 있다.Sodium chloride may be 1 M to 3 M, but is not limited thereto. As a result, cohesiveness of the cell precipitate is increased, and the turbidity of the supernatant after centrifugation or microfiltering is reduced. This has the advantage of being able to more easily remove the cell-derived impurities as pellets and the effect of improving the specific extraction of proteins expressed in the periplasm. In addition, the coagulability of the cell precipitate can be pre-treated such as Osmotic shock for constant purification regardless of the stability and expression state of the outer membrane of the cells expressing the recombinant protein with the periplasm, The yield can be expected to be improved.

세포 침전물의 응집성 향상을 위한, 염 또는 카오트로픽 제제는 구체적으로는 염화나트륨 이외에 구아니딘 염산(Gu-HCl), 우레아 (urea), 염화 칼륨, 암모늄 설페이트, 부탄올, 에탄올, 과염소산 리튬(Lithium perchlorate), 아세트산 리튬(Lithium acetate), 염화마그네슘, 페놀, 프로판올, SDS (Sodium dodeceyl sulfate), 및 티오요소 (Thiourea) 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.Specific examples of the salt or chaotropic agent for improving the cohesion of cell precipitates include guanidine hydrochloride (Gu-HCl), urea, potassium chloride, ammonium sulfate, butanol, ethanol, lithium perchlorate, But are not limited to, lithium acetate, magnesium chloride, phenol, propanol, sodium dodecyl sulfate (SDS), and thiourea.

구체적으로, 상기 염 또는 카오트로픽 제제는 추출물 내의 세포 응집성을 향상시킬 수 있는 물질은 제한없이 포함되며, 그 예로, 염화나트륨, 황산나트륨, 황산암모늄, 황산바륨, 황산칼슘, 황산마그네슘, 탄산수소나트륨, 탄산나트륨, 염화암모늄, 플루오르화나트륨, 아질산나트륨, 인산칼슘, 황화나트륨, 염화바륨, 염화칼슘, 브로민화마그네슘, 탄산칼슘, 황산칼륨, 아세트산 나트륨, 시트르산나트륨, 브로민화나트륨, 티오시안산 나트륨, 인산나트륨, 소듐 디옥시콜레이트, 아세트산 암모늄, 탄산수소암모늄, 염화 암모늄, Tris-HCl, 트리스 인산염, NP-40(Nonidet P-40), 루브롤 PX(Lubrol PX), 옥틸 글루코시드, 트윈80, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌이민, 아세톤, 트리톤 X-100, 구아니딘-염산 (Gu-HCl), 우레아, 염화 칼륨, 암모늄 설페이트, 부탄올, 에탄올, 과염소산 리튬(Lithium perchlorate), 아세트산 리튬(Lithium acetate), 염화마그네슘, 염화알루미늄 (AlCl3), 페놀, 프로판올, SDS (Sodium dodeceyl sulfate), 또는 티오요소 (Thiourea)일 수 있다.Specifically, the salt or chaotropic agent includes, without limitation, substances capable of enhancing cell cohesiveness in the extract. Examples of the salt or chaotropic agent include sodium chloride, sodium sulfate, ammonium sulfate, barium sulfate, calcium sulfate, magnesium sulfate, sodium hydrogen carbonate, sodium carbonate Calcium carbonate, potassium sulfate, sodium acetate, sodium citrate, sodium bromide, sodium thiocyanate, sodium phosphate, sodium chloride, sodium chloride, sodium chloride, Tris-HCl, Tris Phosphate, NP-40 (Nonidet P-40), Lubrol PX, Octyl Glucoside, Tween 80, Polyethylene Glycol, Polyethyleneimine, acetone, Triton X-100, guanidine hydrochloride (Gu-HCl), urea, potassium chloride, ammonium sulfate, butanol, ethanol, Lithium (Lithium perchlorate), lithium acetate (Lithium acetate), magnesium chloride, aluminum chloride (AlCl3), phenol, propanol, (dodeceyl Sodium sulfate) SDS, or thiourea (Thiourea) may be.

본 발명의 용어 "염"은 양이온과 음이온이 정전기적 인력에 의해 결합하고 있는 형태의 물질인 염 중에서도 상기 세포 응집성을 향상시킬 수 있는 형태의 염을 의미한다. 통상적으로 금속염, 유기염기와의 염, 무기산과의 염, 유기산과의 염, 염기성 또는 산성 아미노산과의 염 등이 될 수 있다. 예를 들어, 금속염으로는 알칼리 금속염(나트륨염, 칼륨염 등), 알칼리 토금속염(칼슘염, 마그네슘염, 바륨염 등), 알루미늄염 등이 될 수 있고; 유기염기와의 염으로는 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린, 2,6-루티딘, 에탄올아민, 트리에탄올아민, 시클로헥실아민, 디시클로헥실아민, N,N-디벤질에틸디아민 등과의 염이 될 수 있으며; 무기산과의 염으로는 염산, 브롬화수소산, 질산, 황산, 인산 등과의 염이 될 수 있고; 유기산과의 염으로는 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프탈산, 푸마르산, 옥살산, 타르타르산, 말레인산, 시트르산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 등과의 염이 될 수 있으며; 염기성 아미노산과의 염으로는 아르기닌, 라이신, 오르니틴 등과의 염이 될 수 있고; 산성 아미노산과의 염으로는 아스파르트산, 글루탐산 등과의 염이 될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The term "salt" of the present invention means a salt capable of improving the cell cohesiveness among salts, which is a substance in which cations and anions are bound by electrostatic attraction. It may be a metal salt, a salt with an organic base, a salt with an inorganic acid, a salt with an organic acid, a salt with a basic or an acidic amino acid, and the like. For example, the metal salt may be an alkali metal salt (sodium salt, potassium salt, etc.), an alkaline earth metal salt (calcium salt, magnesium salt, barium salt, etc.), an aluminum salt and the like; Examples of salts with organic bases include salts with triethylamine, pyridine, picoline, 2,6-lutidine, ethanolamine, triethanolamine, cyclohexylamine, dicyclohexylamine, N, ; The salt with inorganic acid may be a salt with hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid and the like; Salts with organic acids may be salts with formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, phthalic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid and the like; Salts with basic amino acids may be salts with arginine, lysine, ornithine and the like; The salt with an acidic amino acid may be a salt with an aspartic acid, glutamic acid or the like, but is not limited thereto.

그 예로, 상기 염은 염화나트륨이며, 상기 카오트로픽 제제는 구아니딘-염산 (Gu-HCl)일 수 있다.For example, the salt may be sodium chloride and the chaotropic agent may be guanidine hydrochloride (Gu-HCl).

페리플라즘 단백질을 추출하는 또 하나의 구체예에서 세포 침전물에 카오트로픽 제제가 함유된 완충용액을 가하여 페리플라즘 단백질을 추출하고, 원심분리 또는 마이크로 필터를 수행하여 페리플라즘 단백질을 포함하는 상등액을 얻을 수 있다. In another embodiment of extracting the periplasmic protein, the periplasmic protein is extracted by adding a buffer solution containing the chaotropic agent to the cell precipitate, centrifuged or microfiltered to obtain a supernatant containing the periplasmic protein Can be obtained.

상기 정제 방법의 (2) 단계의 카오트로픽 제제는 전도도가 50 mS/cm ~ 300 mS/cm, 구체적으로 100 mS/cm ~ 200 mS/cm, 보다 구체적으로 150 mS/cm ~ 250 mS/cm을 갖도록 투입하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The chaotropic agent of step (2) of the above purification method has a conductivity of 50 mS / cm to 300 mS / cm, specifically 100 mS / cm to 200 mS / cm, more specifically 150 mS / cm to 250 mS / cm But the present invention is not limited thereto.

다른 또 하나의 구체예에서 상기 정제 방법의 (2) 단계에서 페리플라즘 단백질을 추출하기 위한 카오트로픽 제제는 구아니딘 염산(Gu-HCl) 이외에 우레아 (urea), 염화 칼륨, 암모늄 설페이트, SDS (Sodium dodeceyl sulfate), 및 티오요소 (Thiourea) 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In another embodiment, the chaotropic agent for extracting the periplasmic protein in step (2) of the above purification method is selected from the group consisting of urea, potassium chloride, ammonium sulfate, sodium sulphate (SDS) in addition to guanidine hydrochloride dodecyl sulfate, thiourea, and the like may be used, but the present invention is not limited thereto.

구체적으로, 페리플라즘내의 단백질을 추출시킬 수 있는 카오트로픽 제제는 제한없이 포함되며, 그 예로, 염화나트륨, 황산나트륨, 황산암모늄, 황산바륨, 황산칼슘, 황산마그네슘, 탄산수소나트륨, 탄산나트륨, 염화암모늄, 플루오르화나트륨, 아질산나트륨, 인산칼슘, 황화나트륨, 염화바륨, 염화칼슘, 브로민화마그네슘, 탄산칼슘, 황산칼륨, 아세트산 나트륨, 시트르산나트륨, 브로민화나트륨, 티오시안산 나트륨, 인산나트륨, 소듐 디옥시콜레이트, 아세트산 암모늄, 탄산수소암모늄, 염화 암모늄, Tris-HCl, 트리스 인산염, NP-40(Nonidet P-40), 루브롤 PX(Lubrol PX), 옥틸 글루코시드, 트윈80, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌이민, 아세톤, 트리톤 X-100, 구아니딘-염산 (Gu-HCl), 우레아, 염화 칼륨, 암모늄 설페이트, 부탄올, 에탄올, 과염소산 리튬(Lithium perchlorate), 아세트산 리튬(Lithium acetate), 염화마그네슘, 염화알루미늄 (AlCl3), 페놀, 프로판올, SDS (Sodium dodeceyl sulfate), 또는 티오요소 (Thiourea)일 수 있다.Specifically, the chaotropic agent capable of extracting proteins in the periplasm is not limited, and examples thereof include sodium chloride, sodium sulfate, ammonium sulfate, barium sulfate, calcium sulfate, magnesium sulfate, sodium hydrogen carbonate, sodium carbonate, ammonium chloride, Calcium carbonate, potassium sulfate, sodium acetate, sodium citrate, sodium bromide, sodium thiocyanate, sodium phosphate, sodium dioxycholate, sodium phosphate, sodium nitrite, sodium nitrite, sodium phosphate, sodium sulfide, barium chloride, calcium chloride, magnesium bromide, , Ammonium acetate, ammonium hydrogencarbonate, ammonium chloride, Tris-HCl, trisphosphate, NP-40 (Nonidet P-40), Lubrol PX, octyl glucoside, Tween 80, polyethylene glycol, polyethyleneimine, acetone Triton X-100, guanidine hydrochloride (Gu-HCl), urea, potassium chloride, ammonium sulfate, butanol, ethanol, lithium perchlorate, Set may be a lithium (Lithium acetate), magnesium chloride, aluminum chloride (AlCl3), phenol, propanol, (dodeceyl Sodium sulfate) SDS, or thiourea (Thiourea).

구체적으로 세포는 구아니딘-염산(Gu-HCl)이 함유된 완충용액, 예를 들어 0.5M 내지 3 M 구아니딘-염산(Gu-HCl)이 함유된 완충용액의 처리로 인해 페리플라즘내의 단백질이 추출된다. 상기 카오트로픽 제제에 의한 추출에는 구아니딘-염산(Gu-HCl) 이외에 우레아, 염화 칼륨, 암모늄 설페이트, SDS (Sodium dodeceyl sulfate), 또는 티오요소 (Thiourea) 같은 제제를 포함한 완충용액을 사용할 수도 있으나, 이에 제한되지 않는다.Specifically, the cells are treated with a buffer solution containing guanidine hydrochloride (Gu-HCl), for example, a buffer solution containing 0.5 M to 3 M guanidine-hydrochloric acid (Gu-HCl) do. In addition to guanidine hydrochloride (Gu-HCl), buffers containing preparations such as urea, potassium chloride, ammonium sulfate, SDS (sodium dodecyl sulfate), or thiourea may be used for the extraction by the chaotropic agent, It is not limited.

앞선 구체예 중 어느 하나의 정제방법에서, 상기 정제 방법의 (iii) 단계 또는(3) 단계의 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피는 1회 혹은 2회 수행되는 것을 특징으로 한다. 그 예로, 2회 일 수 있으나, 정제 수율을 높일 수 있는 한 제한되지 않는다. In the purification method according to any one of the preceding embodiments, the hydrophobic interaction column chromatography in step (iii) or (3) of the purification method is performed once or twice. For example, it may be two times, but is not limited as long as the purification yield can be increased.

상기 수행되는 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피는 각각 서로 다르거나, 2회 이상 수행시 동일한 작용기의 수지를 이용하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The hydrophobic interaction column chromatography performed may be different from each other, but may be performed using a resin having the same functional group, but not limited thereto.

구체적으로, 상기 페리플라즘 단배질을 포함하는 상등액을 수득한 이후, 이어서 소수성 상호작용 컬럼 제1 크로마토그래피, 소수성 상호작용 컬럼 제2 크로마토그래피 및 이온 교환 컬럼 크로마토그래피를 차례로 수행하여 고순도의 재조합 재조합 단백질을 정제 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.Specifically, after obtaining a supernatant containing the above-mentioned periplasmic fraction, hydrophobic interaction column first chromatography, hydrophobic interaction column second chromatography and ion-exchange column chromatography are successively carried out in order to obtain high purity recombinant recombinant Proteins can be purified, but are not limited thereto.

상기 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피 수지의 작용기가 페닐(phenyl), 옥틸(octyl), (이소)프로필((iso)propyl), 부틸(butyl) 및 에틸(ethyl)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.Wherein the functional group of the hydrophobic interaction column chromatography resin is selected from the group consisting of phenyl, octyl, isopropyl (propyl), butyl and ethyl (ethyl) But is not limited thereto.

구체적으로, 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피에는 페닐 작용기를 갖는 컬럼을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 크로마토그래피 조건으로는 pH를 6.0 내지 9.0의 범위, 구체적으로는 6.5 내지 9.0, 더 구체적으로는 7.0 내지 9.0, 더 구체적으로는 7.0 내지 8.5, 더 구체적으로 pH 7.5 내지 8.5의 범위로 유지하면서, 염의 농도가 500 mM 이하인 완충용액으로 용출할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.Specifically, hydrophobic interaction column chromatography can use, but not limited to, a column having a phenyl group. Chromatographic conditions include maintaining the pH in the range of 6.0 to 9.0, specifically 6.5 to 9.0, more specifically 7.0 to 9.0, more specifically 7.0 to 8.5, and more specifically, pH 7.5 to 8.5. The buffer solution may be eluted with a buffer solution having a concentration of 500 mM or less, but is not limited thereto.

상기 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피에는 프로필 작용기를 갖는 컬럼을 사용할 수 있으며, 크로마토그래피 조건으로는 pH를 6.0 내지 9.0의 범위, 구체적으로는 6.5 내지 9.0, 더 구체적으로는 7.0 내지 9.0, 더 구체적으로는 7.0 내지 8.5, 더 구체적으로는 pH 7.5 내지 8.5의 범위로 유지하면서, 염의 농도가 2 M 이하인 완충용액으로 용출할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The hydrophobic interaction column chromatography may use a column having a propyl group. As the chromatography conditions, the pH may be in the range of 6.0 to 9.0, specifically in the range of 6.5 to 9.0, more specifically in the range of 7.0 to 9.0, But can be, but not limited to, a buffer solution having a salt concentration of 2 M or less, while maintaining the pH in the range of 7.0 to 8.5, more specifically in the range of 7.5 to 8.5.

앞선 구체예 중 어느 하나의 정제방법에서, 상기 정제 방법의 (iv) 단계 또는(4) 단계의 이온 교환 크로마토그래피 수지의 작용기가 메틸설포네이트 (S), 설포프로필 (SP), 카르복시메틸 (CM), 설포에틸 (SE) 및 폴리아스파르트산（Poly aspartic acid)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 쿼터너리암모늄(Q), 쿼터너리아미노에틸 (QAE), 디에틸아미노에틸 (DEAE), 폴리에틸렌이민 (PEI), 디메틸아미노메틸(DMAE), 및 트리메틸아미노에틸 (TMAE)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나일 수 있다.In the purification method of any one of the preceding embodiments, the functional group of the ion exchange chromatography resin of step (iv) or step (4) of the purification method is methylsulfonate (S), sulfopropyl (SP), carboxymethyl ), Sulfoethyl (SE), and polyaspartic acid (polyaspartic acid), but the present invention is not limited thereto. It is also possible to choose from the group consisting of quaternary ammonium (Q), quaternary aminoethyl (QAE), diethylaminoethyl (DEAE), polyethyleneimine (PEI), dimethylaminomethyl (DMAE), and trimethylaminoethyl Can be one of the following.

구체적으로, 상기 이온 교환 컬럼 크로마토그래피에는 Q 작용기를 갖는 컬럼을 사용할 수 있으며, 크로마토그래피 조건으로는 pH를 6.0 내지 9.0의 범위, 구체적으로는 6.5 내지 9.0, 더 구체적으로는 7.0 내지 9.0, 더 구체적으로는 7.0 내지 8.5, 더 구체적으로는 pH 7.0 내지 8.0의 범위로 유지하면서, 염의 농도가 200 mM 이하인 완충용액으로 용출할 수 있으나, 이제 제한되지 않는다.Specifically, a column having a Q-functional group may be used for the ion-exchange column chromatography. As the chromatography conditions, the pH may be in the range of 6.0 to 9.0, specifically 6.5 to 9.0, more specifically 7.0 to 9.0, Can be eluted with a buffer solution having a salt concentration of 200 mM or less while maintaining the pH in the range of 7.0 to 8.5, more specifically in the range of 7.0 to 8.0.

본 발명의 방법에 따르면, 디아미네이션(deamination) 등이 일어난 변이체들이 효율적으로 제거된 목적하는 재조합 단백질을 고수율 및 고순도로 얻을 수 있다. 구체적으로, 상기 재조합 단백질은 인간 성장 호르몬일 수 있으며, 기존의 대한민국 등록 특허인 제10-0443890호에서 개시된 방법보다 정제 수율이 1.5배 내지 3배 이상 증가하는 효과의 우수성을 확인하였다.According to the method of the present invention, a desired recombinant protein from which mutations such as deamination are efficiently removed can be obtained with high yield and high purity. Specifically, the recombinant protein may be a human growth hormone, and the superiority of the effect of increasing the purification yield 1.5 to 3 times more than the method disclosed in the existing Korean registered patent No. 10-0443890 was confirmed.

이하 본 발명을 하기 예에 의해 보다 상세히 설명한다. 다만, 하기 예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것일 뿐, 하기 예에 의해 본 발명의 범주가 제한되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the following examples are intended to illustrate the present invention only, and the scope of the present invention is not limited by the following examples.

실시예1Example 1 : : 수크로즈가Sucrose 함유된 Contained 완충용액을The buffer solution 이용한 인간 성장 호르몬 단백질 정제방법 1 Method for purifying human growth hormone protein 1

실시예 1-1: 재조합 대장균에서의 발현을 통한 인간 성장 호르몬 단백질의 제조 Example 1-1 Preparation of Human Growth Hormone Protein by Expression in Recombinant Escherichia coli

대장균의 열안정성 엔테로톡신 II의 변형된 분비 서열 (MKKTIAFLLA SMFVFSIATN AYA, 서열번호 1)과 대표적인 재조합 단백질의 일종인 인간 성장 호르몬이 융합된 발현 벡터로 형질전환된 대장균 BL21(DE3) 균주를 멸균 LB배지(박토-트립톤 10 g/l, 박토-효모 추출물 5 g/l, NaCl 10 g/l) 1리터가 들어있는 2리터 플라스크에 접종하여 종균 배양하였다. 이 배양액을 박토-트립톤, 효모추출물, NaCl, 인산 완충용액 (phosphate buffer), 미량의 금속(trace metal), 글루코스, MgCl₂ 등이 첨가된 50리터 발효기에서 배양하였다. pH 6.7에서 배양 시작 후 pH가 6.8이 되면 유가 배양(fed-batch)을 시작하였다. 박토-효모추출물 100 g/l와 글루코스 385 g/l를 투입하였고, OD가 70~80에 도달하면 박토-효모추출물 140 g/l와 글루코스 264 g/l를 투입하여 최종 42~45시간 발효하였다. 발효가 종료된 후, 발효액을 12,300g로 원심 분리하여 균체를 얻고 -70 ℃에 보관하였다.Escherichia coli strain E. coli BL21 (DE3) transformed with the modified secretion sequence (MKKTIAFLLA SMFVFSIATN AYA, SEQ ID NO: 1) of the thermostable enterotoxin II and the expression vector fused with human growth hormone, which is a typical recombinant protein, (10 g / l of bacto-tryptone, 5 g / l of bacto-yeast extract, 10 g / l of NaCl) were inoculated in a 2-liter flask. The culture was incubated in a 50 liter fermentor supplemented with bacto-tryptone, yeast extract, NaCl, phosphate buffer, trace metals, glucose, MgCl ₂ and the like. After starting the culture at pH 6.7, the fed-batch was started when the pH reached 6.8. 100 g / l of bacto-yeast extract and 385 g / l of glucose were added. When the OD reached 70 to 80, 140 g / l of bacto-yeast extract and 264 g / l of glucose were added and fermentation was performed for 42 to 45 hours . After the fermentation was completed, the fermentation broth was centrifuged at 12,300 g to obtain cells, which were stored at -70 ° C.

본 실시예 1-1에서 발현 및 생산된 인간 성장호르몬은 발현 벡터 내에 연결된 분비 서열에 의해서 재조합 대장균의 페리플라즘에 존재하게 된다. 이하, 페리플라즘 내에 존재하는 인간 성장호르몬은 페리플라즘 단백질이라 지칭한다.The human growth hormone expressed and produced in the present Example 1-1 is present in the periplasm of the recombinant E. coli by the secretion sequence linked to the expression vector. Hereinafter, the human growth hormone present in the periplasm is referred to as a periplasmic protein.

실시예1Example 1 -2: -2: 페리플라즘Periplasm 단백질 추출 (단계 1) Protein extraction (step 1)

상기 실시예 1-1에서 얻은 대장균 균체 10 g을 상온의 완충용액(20% 수크로즈, 1 mM EDTA, 30 mM 트리스, pH 7.5) 150 ㎖에 가하고 90분 동안 교반한 후, 12,300 g으로 연속 원심분리하여 펠렛을 수거하였다. 이 펠렛에 다시 4~8 ℃의 증류수 150 ㎖을 가한 후, 4~8 ℃에서 1 시간 동안 교반하였다. 이후 염화나트륨을 투입하여 약 2 M (전도도 약 100~200 mS/cm) 농도가 되게 한 후, 12,300 g으로 연속 원심분리하여 펠렛 (pellet)을 제거하고, 페리플라즘 단백질이 포함된 상등액을 수거하였다. 상등액을 0.2 ㎛ 필터를 이용하여 필터링 (filtering)을 수행하였다. 상기 염화나트륨 대신 카오트로픽 제제 (구아니딘-염산 등)을 투입할 수 있으며, 농도는 약 2 M (전도도 약 150~250 mS/cm) 이 되게 하였다. 이후 원심분리하여 상등액을 수거하는데 염화나트륨보다 세포의 응집력이 높아져 상층액의 탁도가 낮은 결과를 얻었다. 이는 세포 유래 불순물을 보다 용이하게 펠렛으로 제거할 수 있는 장점과 페리플라즘에 발현된 단백질의 추출을 향상시키는 효과가 있다. 구아니딘-염산을 사용했을 경우, 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피를 수행하기 위해 염을 제거하는 단계를 추가적으로 수행하였다.10 g of the E. coli cells obtained in Example 1-1 was added to 150 ml of a buffer solution (20% sucrose, 1 mM EDTA, 30 mM Tris, pH 7.5) at room temperature and stirred for 90 minutes, The pellets were collected and separated. This pellet was further added with 150 ml of distilled water at 4 to 8 ° C, and then stirred at 4 to 8 ° C for 1 hour. Thereafter, sodium chloride was added to adjust the concentration to about 2 M (conductivity about 100-200 mS / cm), and then the pellet was removed by continuous centrifugation at 12,300 g, and the supernatant containing the periplasmic protein was collected . The supernatant was filtered using a 0.2 μm filter. A chaotropic preparation (guanidine hydrochloride, etc.) can be added instead of the sodium chloride, and the concentration is about 2 M (conductivity is about 150 to 250 mS / cm). After centrifugation, the supernatant was collected, and the cell cohesion was higher than that of sodium chloride, resulting in lower turbidity of the supernatant. This has the advantage of being able to remove the cell-derived impurities more easily with pellets and the effect of improving the extraction of proteins expressed in the periplasm. When guanidine-hydrochloric acid was used, a step of removing the salt was further performed to perform hydrophobic interaction column chromatography.

실시예Example 1-3: 소수성 상호작용 1-3: Hydrophobic interaction 컬럼column 제1 크로마토그래피 (단계 2) First chromatography (step 2)

상기 실시예 1-2에서 얻은 상등액으로 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피인, 부틸-세파로스 패스트 플로우(Butyl-Sepharose fast flow, GE사, 미국) 컬럼 크로마토그래피를 다음과 같이 수행하였다.The Butyl-Sepharose fast flow (GE, USA) column chromatography, which is a hydrophobic interaction column chromatography with the supernatant obtained in Example 1-2, was carried out as follows.

상등액을 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피용 완충용액 1 (2.2 M 염화나트륨, 50 mM 트리스, pH 8.0)로 미리 평형화된 부틸-세파로스 컬럼(10×24 mm, Pall사, 미국)에 흡착시킨 후 흡착되지 않은 단백질을 동일 완충용액으로 충분히 세척하여 제거하고, 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피용 용출용액 (10 mM 트리스, pH 8.0)를 단계적으로 가하여 용출시켰다.The supernatant was adsorbed onto a butyl-Sepharose column (10 x 24 mm, Pall, USA) pre-equilibrated with buffer solution 1 for hydrophobic interaction column chromatography (2.2 M sodium chloride, 50 mM Tris, pH 8.0) Proteins were washed away with the same buffer well, and eluted with hydrophobic interaction column chromatography eluting solution (10 mM Tris, pH 8.0) in a stepwise manner.

실시예Example 1-4: 소수성 상호작용 1-4: Hydrophobic interaction 컬럼column 제2 크로마토그래피 (단계 3) Second chromatography (step 3)

상기 실시예 1-3에서 얻은 분획으로, 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피인, 프로필(Poly HI-Propyl, Avantor사, 미국) 컬럼 크로마토그래피를 다음과 같이 수행하였다.The fraction obtained in Example 1-3 was subjected to hydrophobic interaction column chromatography using a poly (HI-Propyl, Avantor, USA) column chromatography as follows.

실시예 1-3에서 얻은 분획에 5 M 염화나트륨 용액을 투입하여 분획의 염화나트륨 농도가 2 M이 되게 하였다. 이후 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피용 완충용액 2 (2 M 염화나트륨, 50 mM 트리스, pH 8.0)으로 미리 평형화된 프로필 컬럼(10×28 mm, Pall사, 미국)에 흡착시킨 후 흡착되지 않은 단백질을 동일 완충용액으로 충분히 세척하여 제거하고 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피용 용출용액 (10 mM 트리스, pH 8.0)을 단계적으로 가하여 용출시켰다. 용출된 분획들을 전기영동 분석하여 인간 성장 호르몬의 순도가 95% 이상인 분획을 수집하였다.A 5 M sodium chloride solution was added to the fraction obtained in Example 1-3 so that the sodium chloride concentration of the fraction became 2M. The adsorbed proteins were then adsorbed on a propyl column (10 × 28 mm, Pall, USA) previously equilibrated with buffer solution 2 for hydrophobic interaction column chromatography (2 M sodium chloride, 50 mM Tris, pH 8.0) Washed thoroughly with buffer solution, and eluted with a stepwise elution solution (10 mM Tris, pH 8.0) for hydrophobic interaction column chromatography. The eluted fractions were analyzed by electrophoresis and fractions having a purity of human growth hormone of 95% or more were collected.

실시예Example 1-5: 음이온 교환 1-5: Anion exchange 컬럼column 크로마토그래피 (단계 4) Chromatography (step 4)

상기 실시예 1-4에서 얻은 분획으로, 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피인, 음이온(Source Q, GE사, 미국) 컬럼 크로마토그래피를 다음과 같이 수행하였다.Anion (Source Q, GE, USA) column chromatography, which was anion exchange column chromatography, was performed as follows for the fractions obtained in Example 1-4.

실시예 1-4에서 얻은 분획을 Sephadex G25 컬럼(GE사, 미국)을 이용하여 10 mM 트리스 (pH 7.5) 버퍼로 교환하였다. 버퍼 교환된 시료를 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피용 완충용액 1(10 mM 트리스, pH 7.5)으로 미리 평형화된 음이온 컬럼(15×13 mm, Pall사, 미국)에 투입하여 흡착시킨 후 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피용 완충용액 2(10 mM 트리스, 0.25 M 염화나트륨, pH 7.5)로 단계적으로 가하여 용출시켰다.The fractions obtained in Example 1-4 were exchanged with a 10 mM Tris (pH 7.5) buffer using a Sephadex G25 column (GE, USA). The buffer-exchanged sample was loaded on an anion column (15 x 13 mm, Pall, USA) pre-equilibrated with buffer solution 1 (10 mM Tris, pH 7.5) for anion exchange column chromatography, adsorbed and then subjected to anion exchange column chromatography (10 mM Tris, 0.25 M sodium chloride, pH 7.5).

실시예Example 1-6: 인간 성장 호르몬의 순도 확인 (단계 5) 1-6: Identification of Purity of Human Growth Hormone (Step 5)

상기 실시예 1-5에서 최종 용출된 분획을 SDS-PAGE (12% NuPAGE, Novex사, 미국)로 전기영동 분석하여 인간 성장 호르몬의 순도를 분석하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.The fractions finally eluted in Example 1-5 were subjected to electrophoresis analysis by SDS-PAGE (12% NuPAGE, Novex, USA) to analyze the purity of human growth hormone. The results are shown in FIG.

도 1의 결과인 SDS-PAGE 상에서 a는 대조군인 소마트로핀 (Somatropin, Pfizer사, 미국)이며, b는 정제된 인간 성장 호르몬 이다. 정제된 인간 성장 호르몬은 SDS-PAGE 상에서 대조군인 소마트로핀과 동등 이상의 순도를 나타내었다.On the SDS-PAGE result of Fig. 1, a is a control group somatropin (Pfizer, USA) and b is a purified human growth hormone. The purified human growth hormone showed a purity comparable to that of the control group, somatropin, on SDS-PAGE.

또한 역상 고압 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 컬럼 (Vydac 214TP54)을 이용하여 순도를 분석하였다. 역상 고압 컬럼 크로마토그래피는 유럽 약전(European Pharmacopia)의 방법에 따라 수행하였으며, 그 결과는 도 2에 나타내었다. 도 2에서 알 수 있듯이, 순도는 97.8%를 나타내었다.The purity was also analyzed using a reversed phase high pressure liquid chromatography (RP-HPLC) column (Vydac 214TP54). Reverse phase high pressure column chromatography was performed according to the method of European Pharmacopia and the results are shown in FIG. As can be seen from Fig. 2, the purity was 97.8%.

실시예Example 2: 2: 카오트로픽Chaotropic 제제가 함유된 Agent-containing 완충용액을The buffer solution 이용한 인간 성장 호르몬 단백질의 정제방법 2 Purification method of human growth hormone protein 2

실시예 2-1: 재조합 대장균에서의 발현을 통한 인간 성장 호르몬 단백질의 제조 Example 2-1: Production of Human Growth Hormone Protein by Expression in Recombinant Escherichia coli

실시예 1-1과 같이 인간 성장호르몬을 발현 및 생산하였으며 이는 발현 벡터 내에 연결된 분비 서열에 의해서 재조합 대장균의 페리플라즘에 존재하게 된다. 이하, 페리플라즘 내에 존재하는 인간 성장호르몬은 페리플라즘 단백질이라 지칭한다.Human growth hormone was expressed and produced as in Example 1-1, which is present in the periplasm of recombinant E. coli by the secretion sequence linked to the expression vector. Hereinafter, the human growth hormone present in the periplasm is referred to as a periplasmic protein.

실시예Example 2-2: 2-2: 페리플라즘Periplasm 단백질 추출 (단계 1) Protein extraction (step 1)

상기 실시예 2-1에서 얻은 대장균 균체 2 g을 상온의 완충용액(2 M 구아니딘-염산, 30 mM 트리스, pH 7.0, 전도도 131 mS/cm) 15 ㎖에 가하고 4~8 ℃에서 4 시간 동안 교반한 후, 12,300 g으로 연속 원심분리하여 펠렛 (pellet)을 제거하고, 페리플라즘 단백질이 포함된 상등액을 수거하였다. 상등액을 0.2 ㎛ 필터를 이용하여 필터링 (filtering)을 수행하였다. 필터링을 수행한 상등액을 Sephadex G25 컬럼(GE사, 미국)을 이용하여 10 mM 트리스 (pH 7.5) 버퍼로 교환하였다.2 g of the E. coli cells obtained in Example 2-1 was added to 15 ml of a buffer solution (2 M guanidine hydrochloride, 30 mM Tris, pH 7.0, conductivity: 131 mS / cm) at room temperature and stirred at 4 to 8 ° C for 4 hours Then, the pellet was removed by continuous centrifugation at 12,300 g, and the supernatant containing the periplasmic protein was collected. The supernatant was filtered using a 0.2 μm filter. The filtered supernatant was replaced with 10 mM Tris (pH 7.5) buffer using a Sephadex G25 column (GE, USA).

실시예Example 2-3: 소수성 상호작용 2-3: Hydrophobic interaction 컬럼column 크로마토그래피 (단계 2) Chromatography (step 2)

상기 실시예 2-2에서 얻은 상등액으로, 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피인, 프로필(Poly HI-Propyl, Avantor사, 미국) 컬럼 크로마토그래피를 다음과 같이 수행하였다.The hydrophobic interaction column chromatography, Poly (HI-Propyl, Avantor, USA) column chromatography, was used as the supernatant from Example 2-2 as follows.

실시예 2-2에서 얻은 상등액을 5 M 염화나트륨 용액을 투입하여 상등액의 염화나트륨 농도가 2.2 M이 되게 하였다. 이후 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피용 완충용액 1(2.2 M 염화나트륨, 50 mM 트리스, pH 8.0)으로 미리 평형화된 프로필 컬럼(10×28 mm, Pall사, 미국)에 흡착시킨 후 흡착되지 않은 단백질을 동일 완충용액으로 충분히 세척하여 제거하고 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피용 용출용액 (10 mM 트리스, pH 8.0)를 단계적으로 가하여 용출시켰다. 프로필 컬럼 크로마토그래피는 도 3에 나타내었다.The supernatant obtained in Example 2-2 was put into a 5 M sodium chloride solution so that the sodium chloride concentration of the supernatant was 2.2 M. The adsorbed protein was then adsorbed on a propyl column (10 × 28 mm, Pall, USA) previously equilibrated with buffer solution 1 for hydrophobic interaction column chromatography (2.2 M sodium chloride, 50 mM Tris, pH 8.0) Washed thoroughly with buffer solution, and eluted with a stepwise elution solution (10 mM Tris, pH 8.0) for hydrophobic interaction column chromatography. The profile column chromatography is shown in Fig.

실시예Example 2-4: 음이온 교환 2-4: Anion exchange 컬럼column 크로마토그래피 (단계 3) Chromatography (step 3)

상기 실시예 2-3에서 얻은 분획으로, 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피인, 음이온(Source Q, GE사, 미국) 컬럼 크로마토그래피를 다음과 같이 수행하였다.As the fraction obtained in Example 2-3, anion (Source Q, GE, USA) column chromatography, which is anion exchange column chromatography, was carried out as follows.

실시예 2-3에서 얻은 분획을 Sephadex G25 컬럼(GE사, 미국)을 이용하여 10 mM 트리스 (pH 7.5) 버퍼로 교환하였다. 버퍼 교환된 시료를 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피용 완충용액 1(10 mM 트리스, pH 7.5)으로 미리 평형화된 음이온 컬럼(15×13 mm, Pall사)에 투입하여 흡착시킨 후 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피용 완충용액 2(10 mM 트리스, 0.25 M 염화나트륨, pH 7.5)로 단계적으로 가하여 용출시켰다. 실시예 2-4에서 수행한 음이온 컬럼 크로마토그래피는 도 4에 나타내었다.The fractions obtained in Example 2-3 were exchanged with a 10 mM Tris (pH 7.5) buffer using a Sephadex G25 column (GE, USA). The buffer-exchanged sample was loaded on an anion column (15 x 13 mm, Pall) pre-equilibrated with buffer solution 1 (10 mM Tris, pH 7.5) for anion exchange column chromatography, adsorbed, and then subjected to buffering for anion exchange column chromatography Solution 2 (10 mM Tris, 0.25 M sodium chloride, pH 7.5). The anion column chromatography performed in Example 2-4 is shown in Fig.

실시예Example 2-5 인간 성장 호르몬의 순도 확인 (단계 4) 2-5 Identification of Purity of Human Growth Hormone (Step 4)

상기 실시예 2-4에서 최종 용출된 분획을 역상 고압 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 컬럼 (Vydac 214TP54)을 이용하여 순도를 분석하였으며, 순도는 96.0%이었다.The fraction eluted in the above Example 2-4 was analyzed for purity using a reverse phase high pressure liquid chromatography (RP-HPLC) column (Vydac 214TP54), and the purity was 96.0%.

상기와 같은 결과들은 페리플라즘 내로 분비 발현시키는 재조합 단백질 발현 시스템인 대장균 발현 시스템을 이용하여 재조합 단백질을 제조하는 방법에 있어서, 페리플라즘 단백질을 포함하는 상등액 또는 균체에 염 또는 카오트로픽 제제를 첨가하여, 상등액 내에 존재하는 세포의 응집력을 증가시키는 단계를 포함하는 본 발명의 정제 방법이 기존의 재조합 단백질을 정제하는 방법에 비해 고 수율 및 고순도로 재조합 단백질을 정제하는 방법임을 시사하는 것이다.As a result, the recombinant protein expression system of the recombinant protein expression system which expresses the recombinant protein into the periplasm, is characterized in that a salt or chaotropic agent is added to the supernatant or cells containing the periplasmic protein And the step of increasing the cohesion of the cells present in the supernatant is a method of purifying the recombinant protein with high yield and high purity as compared with the method of purifying the existing recombinant protein.

더욱이, 본 발명의 방법은 수크로스등을 포함하는 완충용액을 이용하거나, 직접 카오트로픽제제를 이용하는 방법 모두에 있어서 효과적으로 정제할 수 있는 공정을 확립하였음을 시사하는 것이다. 아울러, 별도의 재결합(refolding)과정 없이도, 생체 내에서 활성을 갖는 온전한(intact) 단백질을 수득하는 것이 가능함을 시사하는 것이다.Furthermore, the method of the present invention suggests that a process can be effectively purified in both buffer solutions containing sucrose and the like, or using direct chaotropic agents. Furthermore, it is possible to obtain an intact protein having activity in vivo without a separate refolding step.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.From the above description, it will be understood by those skilled in the art that the present invention may be embodied in other specific forms without departing from the spirit or essential characteristics thereof. In this regard, it should be understood that the above-described embodiments are to be considered in all respects as illustrative and not restrictive. The scope of the present invention should be construed as being included in the scope of the present invention without departing from the scope of the present invention as defined by the appended claims.

<110> HANMI PHARM. CO., LTD. <120> Improved purification method of recombinant protein <130> KPA161624-KR-P1 <150> KR 10-2016-0164620 <151> 2016-12-05 <150> KR 10-2017-0126421 <151> 2017-09-28 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> secretory peptide <400> 1 Met Lys Lys Thr Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe Ser 1 5 10 15 Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala 20 <110> HANMI PHARM. CO., LTD. <120> Improved purification method of recombinant protein <130> KPA161624-KR-P1 <150> KR 10-2016-0164620 <151> 2016-12-05 <150> KR 10-2017-0126421 <151> 2017-09-28 <160> 1 <170> KoPatentin 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> secretory peptide <400> 1 Met Lys Lys Thr Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe Ser 1 5 10 15 Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala 20

Claims

(i) a buffer solution containing sucrose is added to the separated recombinant Escherichia coli cells expressing the desired recombinant protein in the periplasm, followed by centrifugation or microfiltering to obtain a cell precipitate, Treating a solution having a lower osmotic pressure than that of the buffer solution containing the cross to obtain an extract containing the periplasmic protein;
(ii) adding a salt or chaotropic agent to the extract obtained in the step (i) and centrifuging or microfiltering to obtain a supernatant containing the periplasmic protein;
(iii) applying the supernatant obtained in step (ii) to hydrophobic interaction column chromatography to elute a fraction containing the desired recombinant protein; And
(iv) applying the fraction eluted in the hydrophobic interaction column chromatography of step (iii) to an ion exchange chromatography.

(1) obtaining an extract containing a periplasmic protein by adding a buffer solution containing a chaotropic agent to the separated recombinant Escherichia coli cells expressing the desired recombinant protein in the periplasm;
(2) centrifuging or microfiltering the extract obtained in the step (1) to obtain a supernatant containing the periplasmic protein;
(3) applying the supernatant obtained in the step (2) to hydrophobic interaction column chromatography to elute a fraction containing the desired recombinant protein; And
(4) applying the fraction eluted in the hydrophobic interaction column chromatography in the step (3) to an ion exchange chromatography.

The method of claim 1, wherein step (i)
(a) culturing a recombinant Escherichia coli expressing a desired recombinant protein in a periplasm, followed by centrifugation or microfiltering to obtain cells; And
(b) A buffer solution containing sucrose is added to the separated recombinant E. coli cells, followed by centrifugation or microfiltering to obtain a cell precipitate. The cell precipitate has a lower osmotic pressure than the buffer solution containing sucrose Treating the solution to obtain an extract containing the periplasmic protein.

4. The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the solution having a lower osmotic pressure than that of the sucrose-containing buffer solution is distilled water.

The method according to claim 2, wherein a buffer solution containing the chaotropic agent is added to extract proteins in the periplasm.

The method according to claim 1, wherein the step of adding salt or chaotropic agent of step (ii) is a step of increasing cell cohesive force during centrifugation or microfiltering.

The method of claim 1, wherein the salt or chaotropic agent has a conductivity of 50 mS / cm to 300 mS / cm.

3. The method of claim 2, wherein the chaotropic agent has a conductivity of 50 mS / cm to 300 mS / cm.

The composition of claim 1 wherein the salt or chaotropic agent is selected from the group consisting of sodium chloride, sodium sulfate, ammonium sulfate, barium sulfate, calcium sulfate, magnesium sulfate, sodium bicarbonate, sodium carbonate, ammonium chloride, sodium fluoride, sodium nitrite, calcium phosphate, Sodium carbonate, sodium thiocyanate, sodium phosphate, sodium deoxycholate, ammonium acetate, ammonium hydrogen carbonate, ammonium chloride, Tris < RTI ID = 0.0 > P-40, Lubrol PX, Octyl Glucoside, Tween 80, Polyethylene Glycol, Polyethylene Imine, Acetone, Triton X-100, Guanidine Hydrochloride (Gu- HCl), urea, potassium chloride, ammonium sulfate, butanol, ethanol, lithium perchlorate, lithium acetate, magnesium chloride, aluminum chloride (AlCl3), phenol, propanol, sodium dodecyl sulfate (SDS), and thiourea.

The chaotropic agent according to claim 2, wherein the chaotropic agent is selected from the group consisting of Tween 80, polyethylene glycol, polyethyleneimine, Triton X-100, guanidine hydrochloride (Gu-HCl), urea, ammonium sulfate, sodium dodecyl sulfate (SDS) Thiourea).

The method of claim 1, wherein the salt is sodium chloride and the chaotropic agent is guanidine hydrochloride (Gu-HCl).

3. The method of claim 2, wherein the chaotropic agent is guanidine hydrochloride (Gu-HCl).

The recombinant protein of claim 1 or 2, wherein the recombinant protein is selected from the group consisting of a hormone, a cytokine, an interleukin, an interleukin binding protein, an enzyme, an antibody, a growth factor, a transcription regulator, a blood factor, a vaccine, Surface antagonist or receptor antagonist.

The recombinant protein of claim 1 or 2, wherein the recombinant protein is selected from the group consisting of glucagon analog peptide-1 (GLP-1), glucagon, Gastric inhibitory polypeptide (GIP), oxytomodulin, Xenin, insulin, CCK (Cholecystokinin) Incretins, which regulate blood glucose and body weight in the stomach or intestine, such as amylin, gastrin, ghrelin, and PYY (peptide YY); Adipokines secreted from adipose, such as leptin, adiponectin, adipolin, apelin, and cartonectin; Neuropeptides secreted in the brain, such as Kisspeptin, Nesfatin-1; Peptides or proteins secreted in muscle, such as Irisin, myonectin, decorin, follistatin, musclin; (G-CSF), human growth hormone (hGH), erythropoietin (EPO), growth hormone releasing hormone, growth hormone releasing peptide, Interferon receptor, interferon receptor, G protein-coupled receptor, interleukins, interleukin receptor, enzymes, interleukin binding protein, cytokine binding protein, macrophage activator, macrophage peptide, B cell factor, T cell factor, Protein A, allergic inhibitor, cytotoxic protein, immunotoxin, lymphotoxin, tumor necrosis factor, tumor suppressor, metastatic growth factor, alpha-1 antitrypsin, albumin, alpha-lactalbumin, apolipoprotein-E, Angiopoietins, hemoglobin, thrombin, thrombin receptor activating peptide, thrombomodulin, blood factor VII, A protein inhibitor, a collagenase inhibitor, a superoxide dismutase, a fibrin-binding peptide, an urokinase, a streptokinase, a hirudin, a protein C, Anatrophin, angiotensin, osteogenic growth factor, osteogenesis promoting protein, calcitonin, atriepeptin, cartilage inducer, elctatonin, connective tissue activator, tissue factor A progestin receptor antagonist, a pathway inhibitor, a follicle stimulating hormone, a luteinizing hormone, a luteinizing hormone releasing hormone, a nerve growth factor, a parathyroid hormone, a lilacsin, a cicletin, a somatomedin, an insulin like growth factor, a corticosteroid, a cholecystokinin, a pancreatic polypeptide, Releasing peptide, corticotropin releasing factor, thyroid stimulating hormone, autotaxin, lactoferrin, myostatin, cell surface antigen The method, to virus-derived vaccine antigen, is selected from a monoclonal antibody, polyclonal antibodies and antibody fragments in the group consisting of.

14. The method of claim 13, wherein the recombinant protein is selected from the group consisting of human growth hormone, interferon-alpha, granulocyte colony stimulating factor, erythropoietin, blood factor, insulin, oxytomodulin, glucagon-like peptides, exendins, , Way.

3. The method of claim 1 or 2, wherein said recombinant protein is a human growth hormone.

3. The method of claim 1 or 2, wherein the hydrophobic interaction column chromatography is performed once or twice.

18. The method of claim 17, wherein the two times of hydrophobic interaction column chromatography each use resins of different functional groups.

The method of claim 1 or 2, wherein the functional group of the hydrophobic interaction column chromatography resin is selected from the group consisting of phenyl, octyl, (iso) propyl, butyl, and ethyl ). &Lt; / RTI >

3. The process of claim 1 or 2, wherein the functional group of the ion exchange chromatography resin is selected from the group consisting of methylsulfonate (S), sulfopropyl (SP), carboxymethyl (CM), sulfoethyl (SE) and poly aspartic acid acid). < / RTI >

The method of claim 1 or 2, wherein the functional group of the ion exchange chromatography resin is selected from the group consisting of quaternary ammonium (Q), quaternary aminoethyl (QAE), diethylaminoethyl (DEAE), polyethyleneimine (PEI) Methyl (DMAE), and trimethylaminoethyl (TMAE)).