KR20180057097A - 유방암 환자의 예후 예측 방법 - Google Patents

유방암 환자의 예후 예측 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유방암 환자의 예후 예측방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 유방암 환자의 예후 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 하기 단계를 포함하는 유방암 예후 예측방법: (a) 유방암 환자로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 시료 또는 환자 정보로부터 MMP11(matrix metallopeptidase 11)의 mRNA 발현 수준, CD2(cluster of differentiation 2)의 mRNA 발현수준을 측정하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 선택되어 측정된 유전자의 mRNA 발현수준을 표준화 하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계에서 표준화된 유전자의 발현수준을 조합하여 유방암의 예후를 예측하는 단계로서, 상기 MMP11의 과발현은 나쁜 예후인 것으로, CD2의 과발현은 좋은 예후인 것으로 유방암 예후를 예측하는 단계를 포함하는 유방암 환자의 예후 예측 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 유방암 환자의 향후 전이, 재발 또는 전이성 재발 여부에 대한 예후를 보다 정확하게 예측할 수 있는 효과가 있고, 특히 예후가 매우 불량한 HER2형 유방암에 대한 예후 예측력이 매우 뛰어나 향후 유방암 치료의 방향에 대한 단서를 제시하는 목적으로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

유방암 환자의 예후 예측 방법 {Methods for predicting risk of recurrence of breast cancer patients}
본 발명은 유방암 환자의 예후 예측방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 유방암 환자의 예후 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 하기 단계를 포함하는 유방암 예후 예측방법: (a) 유방암 환자로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 시료 또는 환자 정보로부터 MMP11(matrix metallopeptidase 11)의 mRNA 발현 수준, CD2(cluster of differentiation 2)의 mRNA 발현수준을 측정하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 선택되어 측정된 유전자의 mRNA 발현수준을 표준화 하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계에서 표준화된 유전자의 발현수준을 조합하여 유방암의 예후를 예측하는 단계로서, 상기 MMP11의 과발현은 나쁜 예후인 것으로, CD2의 과발현은 좋은 예후인 것으로 유방암 예후를 예측하는 단계를 포함하는 유방암 환자의 예후 예측 방법에 관한 것이다.
유방암은 상당한 외래성 질병으로, 에스트로겐 수용체(ER) 또는 프로게스테론 수용체(PR), 및 HER2(human epidermal growth factor receptor 2)를 포함한 호르몬 수용체의 발현 상태에 따라 루미날 A, 루미날 B, HER2 및 삼중음성 유방암(TNBC)의 네 종류의 아형으로 구분이 되고 있다. 각각의 유방암 아형들은 구분되는 분자적 특징을 지니고 있으며, 각각의 아형들은 서로 다른 예후를 보여준다. 즉, 루미날 A형은 가장 좋은 예후를 보이며, HER2 및 TNBC 아형은 가장 좋지 않은 예후를 나타내는 것으로 알려져 있다. 유방암의 치료는 분자 아형 및 환자의 예후에 의존적이기 때문에, 적절한 치료방법을 확립하기 위해서는 각각의 분자 아형에 해당하는 특정한 예후 예측용 바이오마커를 선정하는 것이 매우 중요하다.
유전자 발현에 기반을 둔 접근법은 예후 예측에 상당히 유용한 정보를 제공해 주고 있으며, 동결된 또는 포르말린 고정된 파라핀 포매(FFPE)샘플에서의 복합 유전자 발현 프로파일링 기법에 기반을 둔 상업적인 어세이들은 ER-양성인 유방암에 대해서 개발이 되어 있다. 그러나, 증식-관련 유전자에 기반을 두고 있고 복합 유전자 발현 특징을 이용하는 어세이들은 어느 정도의 한계를 지니고 있다. 뿐만 아니라, 임상적인 결과의 다양한 복합 유전자 예측인자에 기반을 둔 상업적 키트들은 오직 호르몬 수용체 양성인 유방암 아형에 대해서만 예후 예측이 가능하며, 호르몬 수용체 음성인 유방암 아형에 대한 상업적 키트는 존재하지 않는다.
2,100명 이상의 환자에서 얻은 공중이 이용 가능한 마이크로 어레이 자료의 메타-분석에 의하면, 유방암 환자의 임상 결과와 연관이 되어 있는 중요한 생리학적 과정들은 유방암의 분자 아형에 따라 달라진다는 것을 보여주고 있다(Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research 14 (16):5158-5165). 상기 연구에서는 서로 다른 생리학적 과정(증식, 종양 침범/전이, 면역 반응, 혈관 신생, 아폽토시스 표현형, ER 및 HER2 시그널링)들을 대표하는 7 종류의 프로토-타입 유전자를 선정하였고(AURKA, PLAU, STAT1, VEGF, CASP3, ESR1 및 ERBB2), 각각의 유방암 아형을 갖는 환자의 임상적 변수 및 재발 없는 생존기간과 상기 7 종의 유전자와의 연관성을 평가하였다. 그 결과, 증식 관련된 유전자는 ER+/HER2- 인 아형에 대해서만 예후 예측력을 나타냈으며, 종양 침범, 면역 반응 등과 관련된 유전자는 ER-/HER2- 또는 ER-/HER2+ 인 아형에 대해서만 예후 예측력을 나타내는 한계를 보여주었다.
예후 예측용 유전자 또는 재발 또는 호르몬 수용체 음성(HR-)인 유방암에서의 원격 전이를 예측하는 유전자 특징을 보고하고 있는 최근의 연구에서는 면역반응과 관련된 유전자들은 주로 HR- 유방암 환자의 좋은 임상 결과와 관련이 되어 있다는 것을 추가적으로 보고하고 있다 (Breast Cancer Res 12 (5):R85. doi:10.1186/bcr2753, Genome biology 8 (8):R157. doi:gb-2007-8-8-r157 [pii], Breast Cancer Res 10 (4):R73. doi:10.1186/bcr2138). 그러나 이러한 결과들은 주로 유전자 발현 마이크로 어레이 데이터에 기반을 두고 있는 것이며, 이러한 대부분의 예후 예측용 유전자 또는 유전적 특성들은 추후 검증이 수행되지 않았다.
따라서, 유방암의 분자적 아형에 따른 예후를 보다 정확하게 예측하고 현 시점에서의 적절한 치료방법을 현명하게 선택하기 위하여 보다 정확한 예후 예측 인자와 예측 모델을 확립하는 것이 필요하다.
1. 한국등록특허 10-1421326호: 유방암 예후 예측을 위한 조성물 및 이를 포함하는 키트. 2. 한국등록특허 10-1287600호: 초기유방암의 예후 예측용 유전자 및 이를 이용한 초기유방암의 예후예측 방법. 3. 한국공개특허 10-2014-0125239호: 조기유방암 예후 예측 진단용 유전자 마커 및 이의 용도. 4. 한국공개특허 10-2014-0071946호: 유방암 전이의 진단, 예후 및 치료 방법.
이에, 본 발명자들은 다량의 FFPE 조직 샘플에 대한 정량적 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(qRT-PCR)을 수행함으로써 16 종의 예후 예측용 유전자 후보군의 발현을 평가하였고, 이를 일반적인 임상병리학적 인자들과 분자 아형에 따라 구분된 819명의 유방암 환자의 원격 전이 위험성과의 연관성을 분석하였다. 그 결과, 유의적인 예후 예측 인자들에 기반을 둔, 유방암 분자 아형에 따른 원격 전이의 위험성을 예측하기 위한 유전적 또는 임상병리학적 인자들을 선정하였고, 이를 바탕으로 유방암 환자의 원격전이 예후 예측용 모델을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 유방암 환자의 예후 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 하기 단계를 포함하는 유방암 예후 예측방법을 제공하는 것이다:
(a) 유방암 환자로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 시료 또는 환자 정보로부터 MMP11(matrix metallopeptidase 11)의 mRNA 발현 수준, CD2(cluster of differentiation 2)의 mRNA 발현수준을 측정하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 선택되어 측정된 유전자의 mRNA 발현수준을 표준화 하는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계에서 표준화된 유전자의 발현수준을 조합하여 유방암의 예후를 예측하는 단계로서, 상기 MMP11의 과발현은 나쁜 예후인 것으로, CD2의 과발현은 좋은 예후인 것으로 유방암 예후를 예측하는 단계.
본 발명의 다른 목적은 유방암 환자의 예후 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 하기 단계를 포함하는 유방암 예후 예측방법을 제공하는 것이다:
(a) 유방암 환자로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 시료로부터 예후 예측용 유전자인 MMP11(matrix metallopeptidase 11), CD2(cluster of differentiation 2) 및 표준화용 유전자인 CTBP1 (C-terminal-binding protein 1), CUL1 (cullin 1), UBQLN1 (Ubiquilin-1)의 mRNA 발현수준을 측정하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 측정된 예후 예측용 유전자(target) 및 표준화용 유전자의 mRNA 발현수준을 하기 식 1에 대입하여 예후 예측용 유전자의 발현수준을 표준화(△Cq) 하는 단계
[식 1]
△Cq_target=((Cq_CTBP1 + Cq_CUL1 + Cq_UBQLN1)/3) - Cq_target+30;
(d) 상기 (c) 단계에서의 표준화값을 하기 식 2에 대입하여 위험지수(risk score)를 계산하는 단계
[식 2]
위험지수(Risk score) = a×△Cq_MMP11 + b×△Cq_CD2
(상기 식 2에서 a는 0.15 내지 0.76이고, 상기 b는 -0.81 내지 -0.15임); 및
(e) 상기 (d) 단계에서 계산된 위험지수가 높을수록 예후가 좋지 않은 것으로 예후를 예측하는 단계.
본 발명의 다른 목적은 MMP11 및 CD2 유전자의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 유방암 환자의 예후 예측용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 MMP11 및 CD2 유전자의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 유방암 환자의 예후 예측용 키트를 제공하는 것이다.
상기한 본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 유방암 환자의 예후 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 하기 단계를 포함하는 유방암 예후 예측방법을 제공한다:
(a) 유방암 환자로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 시료 또는 환자 정보로부터 MMP11(matrix metallopeptidase 11)의 mRNA 발현 수준, CD2(cluster of differentiation 2)의 mRNA 발현수준을 측정하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 선택되어 측정된 유전자의 mRNA 발현수준을 표준화 하는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계에서 표준화된 유전자의 발현수준을 조합하여 유방암의 예후를 예측하는 단계로서, 상기 MMP11의 과발현은 나쁜 예후인 것으로, CD2의 과발현은 좋은 예후인 것으로 유방암 예후를 예측하는 단계.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 유방암 환자의 예후 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 하기 단계를 포함하는 유방암 예후 예측방법을 제공한다:
(a) 유방암 환자로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 시료로부터 예후 예측용 유전자인 MMP11(matrix metallopeptidase 11), CD2(cluster of differentiation 2) 및 표준화용 유전자인 CTBP1 (C-terminal-binding protein 1), CUL1 (cullin 1), UBQLN1 (Ubiquilin-1)의 mRNA 발현수준을 측정하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 측정된 예후 예측용 유전자(target) 및 표준화용 유전자의 mRNA 발현수준을 하기 식 1에 대입하여 예후 예측용 유전자의 발현수준을 표준화(△Cq) 하는 단계
[식 1]
△Cq_target=((Cq_CTBP1 + Cq_CUL1 + Cq_UBQLN1)/3) - Cq_target+30;
(d) 상기 (c) 단계에서의 표준화값을 하기 식 2에 대입하여 위험지수(risk score)를 계산하는 단계
[식 2]
위험지수(Risk score) = a×△Cq_MMP11 + b×△Cq_CD2
(상기 식 2에서 a는 0.15 내지 0.76이고, 상기 b는 -0.81 내지 -0.15임); 및
(e) 상기 (d) 단계에서 계산된 위험지수가 높을수록 예후가 좋지 않은 것으로 예후를 예측하는 단계.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 MMP11 및 CD2 유전자의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 유방암 환자의 예후 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 MMP11 및 CD2 유전자의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 유방암 환자의 예후 예측용 키트를 제공한다.
이하 본 발명에 대해 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 유방암 환자의 예후 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 하기 단계를 포함하는 유방암 예후 예측방법을 제공한다:
(a) 유방암 환자로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 시료 또는 환자 정보로부터 MMP11(matrix metallopeptidase 11)의 mRNA 발현 수준, CD2(cluster of differentiation 2)의 mRNA 발현수준을 측정하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 선택되어 측정된 유전자의 mRNA 발현수준을 표준화 하는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계에서 표준화된 유전자의 발현수준 및 환자의 연령으로 이루어진 군에서 둘 이상을 조합하여 유방암의 예후를 예측하는 단계로서, 상기 MMP11의 과발현은 나쁜 예후인 것으로, CD2의 과발현은 좋은 예후인 것으로 유방암 예후를 예측하는 단계.
본 발명에서 “예후”란 유방암 치료 중 또는 치료 후 병의 진행경과를 의미하는 것으로, 바람직하게는 치료 후 병의 진행경과를 의미할 수 있으며, 총 생존율(overall survival), 무병생존률(disease free survival) 또는 무원발성전이생존율(distant metastasis free survival)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 “병의 진행경과”란 암의 완치, 재발, 전이 또는 전이성 재발을 포함하는 개념이며, 보다 더 바람직하게는 전이성 재발을 의미하나 이에 제한되는 것은 아니다. 이 중에서 전이성 재발 예후의 예측(또는 예후의 진단)은 원발성 종양을 제거하기 위해 유방 적출술을 받은 환자에게서 향후 유방암이 재발할 가능성이 있는지 여부를 미리 판단할 수 있기 때문에 유방암 치료의 방향에 대한 단서를 제시할 수 있다는 점에서 매우 의미가 있는 작업이라 할 수 있다.
본 발명에서의 상기 “전이성 재발”은 치료 전 유방암의 발생 부위 및/또는 동측 유방 및/또는 반대 측 유방 내의 부위에 전이된 국소 전이성 재발과 폐, 간, 뼈, 림프절, 피부, 뇌와 같은 원격 부위에 전이되어 발생하는 원격 전이성 재발을 포함하는 개념이다. 바람직하게는, 본 발명에서 상기 전이성 재발은 원격 전이성 재발을 의미한다.
본 발명에서 상기“전이성 재발”이란 초기 치료 후, 최소한 하나의 유방 종양에서 유래된 변형된, 즉 암세포가 그 종양에서 분리되어 종양과 떨어진 위치(이하 "원격 부위"라 한다)에서 암으로 계속 성장하는 것을 말한다. 상기 원격 부위는 예를 들면 하나 이상의 림프절 내일 수 있으며, 이들은 이동성이거나 고정되어 있을 수 있고, 상기 종양에 대해 동측이거나 반대 측일 수 있으며, 쇄골위이거나 겨드랑이 등에 있는 것일 수 있다.
유방암의 예후 예측은 주로 종양의 크기(T), 림프절 주변부로의 전이 상태(N) 및 다른 기관으로의 원격 전이(distant metastasis)(M)를 평가하는 수술 후의 질병의 병기(stage)(TNM 병기)에 의해 결정된다. TNM 병기에 따라 분류된 환자의 예후 예측은 동일한 병기에서도 서로 다르다. 즉, 동일한 병기의 유방암에서도 예후 예측은 에스트로겐 또는 프로게스테론 수용체(ER 또는 PR)의 발현여부 및 HER2(human epidermal growth factor receptor 2)의 과발현 여부 또는 유전자의 증폭에 의해 결정될 수 있다. 동일한 병기의 유방암이라 할지라도 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체 또는 HER2의 발현여부에 따라 병태 및 예후가 현저히 달라지기 때문에, 이를 명확히 구분한 후 치료방법을 구체적으로 설정하는 것이 필요하다.
따라서, 최근에는 유전자 및 분자생물학적으로 유방암의 특성을 분류하며(표 1), 아형에 따라 치료에 따른 결과 및 예후도 다르다고 보고하여, 수술적 방법이나 항암화학요법의 선택에 지표로 사용된다.
Figure pat00001
본 발명에서 상기 유방암은 그 분자아형을 구분하지 않으나, 바람직하게는 HER2형 유방암이다. 일반적으로 HER2가 과발현되어 있는 유방암 환자가 그렇지 않은 환자보다 예후가 불량한 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 예후 예측 방법에서는 HER2형 유방암 환자의 예후를 보다 정확하게 예측함으로써, 좋지 않은 예후에 대비하여 효과적인 치료전략을 세우는 데 유용하게 이용될 수 있다.
이하에서는 본 발명에서 유방암 예후 예측방법의 각 단계를 보다 상세히 설명한다.
(a) 유방암 환자로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계;
본 발명에서 상기 생물학적 시료는 유방암 환자의 유방암 조직일 수 있다. 상기 유방암 조직에는 일부 정상 세포도 포함되어 있을 수 있으며, 바람직하게는 암세포를 포함하는 유방암 조직의 포르말린 고정 파라핀 포매(formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE) 시료, 신선한 조직(fresh tissue) 및 동결 조직으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
(b) 상기 (a) 단계의 시료 또는 환자 정보로부터 MMP11(matrix metallopeptidase 11)의 mRNA 발현 수준, CD2(cluster of differentiation 2)의 mRNA 발현수준을 측정하는 단계;
본 발명의 일실시예에서 본 발명자들은 유방암의 분자 아형에 따라 16종의 유전자 후보군의 발현, 통상적인 임상병리학적 인자들 및 임상 결과와의 연관성에 대해 단변량 및 다변량 분석을 수행하였다. 그 결과, 상기 MMP11 또는 CD2의 mRNA 발현수준이 유방암 환자의 예후와 유의성 있는 연관성을 나타낸다는 것을 확인하였다.
한편, 본 발명은 유방암의 예후를 예측하기 위하여 MMP11(matrix metallopeptidase 11)의 mRNA 발현 수준, CD2(cluster of differentiation 2)의 mRNA 발현수준으로 이루어진 예후 예측 인자들을 조합하는 것을 특징으로 한다. 즉, MMP11 및 CD2의 mRNA 발현수준 조합을 평가함으로써 유방암 환자의 예후를 예측하는 것을 특징으로 한다.
상기 각 유전자는 당업계에 공지된 각 유전자의 서열 또는 각 유전자의 동의어(synonym)의 서열, 바람직하게는 인간에서 유래된 각 유전자의 서열일 수 있으며, 더 바람직하게는 MMP11 (Gene ID: 4320) 및 CD2 (Gene ID: 914)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
각 유전자에 대한 동의어 및 그 서열은 GeneBank에서 검색할 수 있다.
본 발명에서 상기 mRNA 발현 수준을 측정하는 방법은 당업계에서 유전자의 발현 수준을 측정하기 위해 수행되는 모든 방법을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 마이크로어레이, PCR(polymerase chain reaction), RT-PCR, 정량적 RT-PCR(qRT-PCR), 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR), 노던 블롯(northern blot), DNA 칩 및 RNA 칩으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 대상 유전자의 발현 수준의 측정은 바람직하게는 대상 유전자의 발현량의 검출, 더 바람직하게는 대상 유전자의 발현량의 정량적인 검출이다. 발현량의 검출을 위해서 시료 조직 내에서의 mRNA 분리 및 mRNA에서의 cDNA 합성과정이 필요할 수 있다. mRNA의 분리를 위해서는 당업계에 공지된 시료에서의 RNA 분리 방법이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 시료는 FFPE 시료이므로 FFPE 샘플에 적합한 mRNA의 분리방법일 수 있다. cDNA 합성과정은 mRNA를 주형으로 하여 이루어지는 당업계에 공지된 cDNA 합성 방법이 이용될 수 있다. 바람직하게 본 발명의 유방암 예후 예측 마커의 발현 수준 측정은 FFPE 시료에서의 mRNA 발현의 정량적 검출이므로 FFPE 시료에 대한 mRNA 분리방법 및 실시간 RT-qPCR (real time reverse transcription quantitative polymerase chain reaction) 방법에 의한 측정일 수 있다.
또한, 본 발명에서 대상 유전자의 발현 수준의 측정은 당업계에 공지된 방법에 따라 수행될 수 있으나, 리포터 형광 염료 및/또는 ??쳐 (quencher) 형광 염료로 표지된 프로브를 사용한 광학적 정량 분석 시스템에 의해서 측정될 수 있다. 상기 측정은 상업적으로 판매되는 장비, 예를 들어, ABIPRISM 7700™ Sequence Detection System™, Roche Molecular Biochemicals Lightcycler 및 이에 부속되는 소프트웨어 등의 시스템에 의해서 이루어질 수 있다. 이와 같은 측정 데이터는 측정값 또는 역치 사이클 (Cq 또는 Ct)로서 표현될 수 있다. 측정된 형광값이 처음으로 통계학적으로 유의한 것으로 기록될 때의 지점이 역치 사이클이며, 이는 검출 대상이 PCR 반응의 주형으로써 존재하는 초기값에 반비례하여 나타나므로 역치 사이클 값이 작은 경우 정량적으로 더 많은 검출 대상이 존재하는 것을 나타낸다.
(c) 상기 (b) 단계에서 선택되어 측정된 유전자의 mRNA 발현수준을 표준화 하는 단계;
본 발명에서의 검출 대상 유전자의 발현 수준은 대상 환자 또는 시료에 따라 전체적인 유전자 발현량 또는 발현 수준에 차이가 있을 수 있으므로 표준화가 필요하다. 표준화는 기본 발현량 또는 발현 수준의 차이를 나타낼 수 있는 유전자의 발현량 또는 발현 수준과의 차이를 통해 이루어지며, 바람직하게는 CTBP1 (C-terminal-binding protein 1), CUL1 (cullin 1) 및 UBQLN1(Ubiquilin-1)로 이루어진 군에서 하나 내지 세 개의 유전자의 발현량 (또는 복수의 유전자가 선별된 경우 이들 발현량의 평균)을 측정한 후, 이에 대한 MMP11 및/또는 CD2의 상대적인 발현값으로 나타낸다.
(d) 상기 (c) 단계에서 표준화된 유전자의 발현수준을 조합하여 유방암의 예후를 예측하는 단계로서, 상기 MMP11의 과발현은 나쁜 예후인 것으로, CD2의 과발현은 좋은 예후인 것으로 유방암 예후를 예측하는 단계.
본 발명에서 상기 “나쁜 예후”란 치료 후 암의 전이, 재발 또는 전이성 재발의 확률이 큰 고위험군을 의미하는 것이며, “좋은 예후”란 전이, 재발 또는 전이성 재발의 확률이 낮은 저위험군을 의미한다. 바람직하게는 “나쁜 예후”란 암의 전이, 재발 또는 전이성 재발의 확률이 큰 고위험군을 의미하며, “좋은 예후”란 전이, 재발 또는 전이성 재발의 확률이 낮은 저위험군을 의미한다.
본 발명에서 상기 MMP11의 과발현은 나쁜 예후와 밀접한 상관성이 있으며, CD2의 과발현은 좋은 예후와 밀접한 상관성이 있다. 따라서, 상기 MMP11, CD2의 발현을 조합함으로써 유방암의 예후를 보다 정확하게 예측할 수 있다.
본 발명은 또한 유방암 환자의 예후 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 하기 단계를 포함하는 유방암 예후 예측방법을 제공한다:
(a) 유방암 환자로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 시료로부터 예후 예측용 유전자인 MMP11(matrix metallopeptidase 11), CD2(cluster of differentiation 2) 및 표준화용 유전자인 CTBP1 (C-terminal-binding protein 1), CUL1 (cullin 1), UBQLN1 (Ubiquilin-1)의 mRNA 발현수준을 측정하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 측정된 예후 예측용 유전자(target) 및 표준화용 유전자의 mRNA 발현수준을 하기 식 1에 대입하여 예후 예측용 유전자의 발현수준을 표준화(△Cq) 하는 단계
[식 1]
△Cq_target=((Cq_CTBP1 + Cq_CUL1 + Cq_UBQLN1)/3) - Cq_target+30;
(d) 상기 (c) 단계에서의 표준화값을 하기 식 2에 대입하여 위험지수(risk score)를 계산하는 단계
[식 2]
위험지수(Risk score) = a×△Cq_MMP11 + b×△Cq_CD2
(상기 식 2에서 a는 0.15 내지 0.76이고, 상기 b는 -0.81 내지 -0.15임); 및
(e) 상기 (d) 단계에서 계산된 위험지수가 높을수록 예후가 좋지 않은 것으로 예후를 예측하는 단계.
상기 (a) 및 (b) 단계에 대해서는 전술한 바와 동일하다.
(c) 상기 (b) 단계에서 측정된 예후 예측용 유전자( target ) 및 표준화용 유전자의 mRNA 발현수준을 하기 식 1에 대입하여 예후 예측용 유전자의 발현수준을 표준화(△C q) 하는 단계
[식 1]
△C q _target=((C q _ CTBP1 + C q _ CUL1 + C q _ UBQLN1 )/3) - C q _target+30;
본 발명에서 상기 MMP11 및 CD2 유전자의 Cq값은 3종의 표준화용 유전자의 발현 수준에 의해 표준화된 상대적인 발현값을 나타낸다. 각 유전자의 상대적인 발현값은 표준화용 유전자 3종의 평균 Cq값 사이의 차이와 각 시료에서의 표적(MMP11 또는 CD2) Cq 값에 기초하여 하기 식에 따라 계산이 된다.
△Cq_target=((Cq_CTBP1 + Cq_CUL1 + Cq_UBQLN1)/3) - Cq_target+30
상기“Cq”값이란 qPCR 결과 표적으로 한 유전자 서열의 산물이 일정량 증폭되어 측정되는 형광이 임계값에 도달하였을 때의 cycle 수를 의미한다. 따라서 Cq값이 작을수록 표적의 산물이 많으며, Cq값이 클수록 표적의 산물이 적다.
(d) 상기 (c) 단계에서의 표준화값을 하기 식 2에 대입하여 위험지수(risk score)를 계산하는 단계
[식 2]
위험지수(Risk score) = a×△C q _ MMP11 + b×△C q _ CD2
(상기 식 2에서 a는 0.15 내지 0.76이고, 상기 b는 -0.81 내지 -0.15임);
본 발명의 일실시예에서는 유방암 환자들의 임상 결과를 지배하는 2가지 주요 생물학적 특징인 면역 활성화 및 세포 증식에 관련된 유전자들 중 Cox 회귀 분석에서 통계적 유의(p<0.05)를 갖는 유전자를 예후와 관련된 유전자 대상으로 선정하였다. 또한, 각 유전자의 다변량 분석결과를 바탕으로, 3종의 표준화용 유전자의 발현 수준 평균값에 의해 표준화된 2종의 예후 예측용 유전자(MMP11 및 CD2)의 상대적인 발현 수준의 조합에 의해 위험지수(10년 내 원격전이 발생의 분자적 예측 지수)를 계산하였다. 각 변수에서의 계수는 Cox 모델로부터 얻었으며, 하기 식에 따라 원격 전이를 예측하기 위해 위험지수(risk score)는 계수들의 선형결합으로써 규정하였다:
위험지수(Risk score) = a×△Cq_MMP11 +b×△Cq_CD2
(상기 a는 0.15 내지 0.76, b는 -0.81 내지 -0.15임)
상기 유전자는 각각에 해당하는 계수와의 선형 조합을 통해 예후 예측 점수를 계산한다. MMP11 유전자는 양의 계수를 CD2 유전자는 음의 계수를 가진다. 각 계수는 생존분석 결과 계산된 계수값의 95% 신뢰구간 범위내에서 적용되며, 바람직하게는 교차검증을 통해 도출된 각 계수의 점추정값이 사용된다.
Figure pat00002
상기 위험지수 계산식에서 △Cq_MMP11 또는 △Cq_CD2 에는 상기 (c) 단계에서 표준화한 값이 대입된다.
(e) 상기 (d) 단계에서 계산된 위험지수가 높을수록 예후가 좋지 않은 것으로 예후를 예측하는 단계;
본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 유방암 예후 예측방법에서 위험군 분류의 정확도를 평가하는 변수인 민감도(sensitivity)와 특이도(specificity)의 합이 최대가 되는 지점을 산출한 결과, 상기 [식 2]에 따라 계산된 수치값이 0.53를 초과하는 경우에는 나쁜 예후인 것으로(전이 고위험군), -0.53 이하인 경우 좋은 예후인 것으로(전이 저위험군) 판단할 수 있었다.
본 발명에서 상기 “민감도(sensitivity)”란 전이된 환자 중 검사 결과에서 고위험군인 비율을 의미하며, 상기 “특이도(specificity)”는 무 전이 환자 중 검사 결과에서도 저위험군인 비율을 의미한다.
본 발명의 일실시예에서는 본 발명의 예후 예측 모델의 유의성을 평가하기 위하여, HER2 아형인 환자를 두 그룹으로 구분하였다. 즉, 본 발명에서 개발된 위험 지수(risk score)에 따라 유방암 환자를 고위험군과 저위험군으로 구분하고, 상기 양 그룹의 무원격전이(distant metastasis-free) 개연성을 비교한 결과 유방 적출수술 후 10년 뒤에 무원격전이 생존의 개연성이 고위험군에서 56.07%로 저위험군의 87.70%와 비교해 현저히 낮게 나타났다 (P-value<0.001). 즉, 본 발명의 예후 예측 모델에 따라 고위험군으로 분류된 환자 집단에서는 10년 내 원격 전이가 발생할 개연성이 44.93%로 저위험군의 12.30%와 비교해 현저하게 높았다는 것을 의미한다. 한편, 고위험군과 저위험군 사이에 임상적 특징들을 분석해 보면, 큰 차이가 관찰되지 않는 것으로 나타났다. 즉, 임상 변수들 단독으로는 HER2 아형 유방암 환자에서 원격 전이 고위험군 또는 저위험군을 구분할 수 없었지만, 본 발명에 따른 예후 예측 모델은 원격 전이에 대한 고위험군과 저위험군으로 환자를 구분함에 있어서 매우 유용하다는 것을 알 수 있었다.
본 발명의 다른 일실시예에서는 Harrell's c-index를 이용하여 본 발명의 위험 지수와 종래 임상병리학적 인자들의 예후 예측력을 비교하였다. 본 발명의 예후 예측 모델은 다른 예후 예측 인자 또는 임상병리학적 인자만을 기초로 한 모델과 비교해 c-index 값이 현저히 높아 원격 전이의 위험을 예측하는 효과가 매우 뛰어나다는 것을 확인하였다.
즉, 본 발명의 상기 식 1 및 식 2에 의한 유방암 예후 예측 모델은 광범위한 임상시료를 대상으로 분석을 하여 선정된 예후 예측용 유전자와, 관련 임상정보를 분석하여 산출된 것으로 그 예후 예측력이 종래 임상정보 기반의 모델 등 타 모델보다 현저히 우수하다. 더욱이, 본 발명의 예후 예측모델은 유방암의 분자 아형을 구분하여 적용하였을 때, HER2형 유방암 환자의 예후를 예측하는데 매우 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 MMP11 및 CD2 유전자의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 유방암 환자의 예후 예측용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 CTBP1, CUL1 및 UBQLN1 유전자의 발현량을 측정하는 제제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 유전자의 발현량을 측정하는 제제는 MMP11 및 CD2 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP,dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.
본 발명의 프라이머는 타겟 핵산에 어닐링 되어 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 타겟 핵산에 상보적인 서열을 형성하는 연장 프라이머(extension primer)일 수 있으며, 이는 고정화 프로브가 어닐링 되어 있는 위치까지 연장되어 프로브가 어닐링 되어 있는 부위를 차지한다.
본 발명에서 이용되는 연장 프라이머는 타겟 핵산의 제1위치에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 용어 “상보적”은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다. 본 명세서에서, 프라이머 서열과 관련하여 사용되는 용어, “실질적으로 상보적인 서열”은 완전히 일치되는 서열뿐만 아니라, 특정 서열에 어닐링하여 프라이머 역할을 할 수 있는 범위 내에서, 비교 대상의 서열과 부분적으로 불일치되는 서열도 포함되는 의미이다.
프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정되지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다. 용어 “어닐링”또는 “프라이밍”은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.
프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 상술한 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 이러한 프라이머의 디자인은 상술한 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.
본 발명은 또한 MMP11 및 CD2 유전자의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 유방암 환자의 예후 예측용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 MMP11 및 CD2 유전자의 PCR에 의한 증폭이 가능한 프라이머쌍 이외에 PCR 반응, 시료에서의 RNA 분리 및 cDNA의 합성에 사용되는 당 업계에 공지된 도구 및/또는 시약을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 필요에 따라 각 성분들을 혼합하는데 사용될 튜브, 웰 플레이트 및 사용방법을 기재한 지시자료 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 유방암의 예후와 유의한 상관성을 나타내는 2종의 유전자를 이용한 유방암 예후 예측방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법을 통해 유방암 환자의 향후 전이, 재발 또는 전이성 재발 여부에 대한 예후를 보다 정확하게 예측할 수 있는 효과가 있고, 특히 예후가 매우 불량한 HER2형 유방암에 대한 예후 예측력이 매우 뛰어나 향후 유방암 치료의 방향에 대한 단서를 제시하는 목적으로 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 HER2 아형 유방암 환자를 본 발명에 따른 예후 예측 모델에 따라 고위험군(high-risk) 및 저위험군(low-risk)으로 분류한 후 무원격전이 생존율(distant metastasis-free survival, DMFS)의 Kaplan-Meier plot을 나타낸 도면이다.
도 2는 Harrell's c-index를 이용하여 본 발명에 따른 위험 지수와 종래 임상병리학적 인자들의 예후 예측력을 비교한 결과이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실험방법>
1. 실험 검체
1995년 1월부터 2002년 12월까지 림프절과 함께 종양 절제술을 받은 유방암 환자의 FFPE 조직 검체 997개를 수득하였다. 종양 1기 내지 3기 환자가 포함되었으며, 이 환자들은 유방절제술이나 유방 보존술을 받은 후 방사선 치료, 항암 치료 또는 호르몬 치료를 단독, 또는 병용으로 처리 받았다. 또한 FFPE 검체를 얻은 동일한 환자에게서 50개의 동결 조직 시료를 수득하였다. 염증 흔적을 보이는 시료, 50%의 지방을 포함하고 있는 시료 또는 총 시료를 기준으로 도관과 소엽이 30% 미만인 시료들은 실험에 사용하지 않았다. 환자의 나이, 종양의 크기, 림프절의 상태, 병리학적 병기, 치료의 종류 및 치료의 결과를 포함하는 임상병리학적 정보를 파악하기 위해 각각의 환자들의 진료 기록을 검토하였다. 유방암의 분자 아형은 루미날 A형(ER+ 또는 PR+/HER2-), 루미날 B형(ER+ 또는 PR+/HER2+), HER2(ER-/PR-/HER2+)으로 분류하였다.
2. 예후 예측용 유전자 후보군의 선정
본 발명자는 이전 연구에서, 공개된 유전자 발현 마이크로어레이 데이터를 이용하여 초기 유방암 환자의 예후와 관련이 되어 있는 384종의 유전자를 선별한 바 있다(Breast cancer research and treatment 132 (2):499-509. doi:10.1007/s10549-011-1626-8). 이 유전자 후보군들은 생리학적 기능에 따라 크게 두 그룹으로 카테고리화 되었다: 증식-관련 유전자(p-gene) 및 면역 반응-관련 유전자(i-gene).
이 유전자 후보군들로부터, 다음의 기준을 만족하는 30 종의 유전자를 1차적으로 선별하였다:
(1) 증식(proliferation) 또는 면역 반응(immune response)과 높은 연관성을 보일 것;
(2) 시료 간에 높은 변동성을 나타낼 것(큰 사분편차);
(3) 높은 평균 발현 값을 나타낼 것.
그 다음으로 qRT-PCR 결과를 기초로, FFPE 시료와 동결 조직 사이에 이들의 발현이 높은 연관성을 나타내는 16종의 유전자를 선별하였다. 이 16종의 유전자는 10종의 증식 관련 유전자(p-gene, AURKA, CCNB2, FOXM1, MKI67, MMP11, PTTG1, RACGAP1, RRM2, TOP2A 및 UBE2C) 및 6종의 면역 반응-관련 유전자(i-gene, BTN3A2, CCL19, CD2, CD52, HLA.DPA1, 및 TRBC1)를 포함한다.
3. qRT-PCR
Arcturus kit(Life technologies, Grand Island, NY, USA)를 이용하여 동결 조직으로부터 RNA를 추출하였다. 또한, Tissue preparation system(Siemens AG, Munich, Germany)를 이용하여 FFPE 조직 시료로부터 RNA를 추출하였다. qRT-PCR은 LightCycler 480 system(Roche applied science)과 QuantiFast Multiplex RT-PCR Kit(Qiagen Hilden, Germany)을 이용하여 수행하였다. 시약을 자동 분배기를 통해 384-웰 플레이트에 분주하였다. qRT-PCR용 PCR 프라이머와 프로브를 하기 표 2에 나타내었다.
　 유전자

약어		 유전자 설명 Forward Primer Sequence Probe
　 Reverse Primer Sequence
증식-관련 유전자
1 AURKA Aurora kinase A CAGGGCTGCCATATAACCTGAC
(서열번호 1)		 GCTGCCCT
(서열번호 39)
CACCTGCTGAGTAAAACAAAT
(서열번호 2)
2 CCNB2 Cyclin B2 TTGGGAGAACCCTCAGCTCT
(서열번호 3)		 CTCAGGCA
(서열번호 40)
GTTTATGGACTGCAAAACCT
(서열번호 4)
3 FOXM1 Forkhead box M1 AAGCACATTGCCAAGCCAGGC
(서열번호 5)		 AGGCTGGA
(서열번호 41)
CAGGGAAAGGTTGTGGCGG
(서열번호 6)
4 MKI67 Antigen identified by monoclonal antibody Ki-67 CAGAATGAGAGCTCCCAGCCT
(서열번호 7)		 GAGGAGAG
(서열번호 42)
TGCATGAGAACCTTCGCACTC
(서열번호 8)
5 MMP11 Matrix metallopeptidase 11 (stromelysin 3) GACAGAAGAGGTTCGTGCTT
(서열번호 9)		 CGCTGGGA
(서열번호 43)
AACTGCCATGGGAACCGA
(서열번호 10)
6 PTTG1 Pituitary tumor-transforming 1 CAGGCACCCGTGTGGTTGC
(서열번호 11)		 CTGAAGCT
(서열번호 44)
ATCTAAGGCTTTGATTGAAGG
(서열번호 12)
7 RACGAP1 Rac GTPase activating protein 1 pseudogene GCTGCCATGTACCAAGCTGT
(서열번호 13)		 GCCCCAGG
(서열번호 45)
TCTCTGCAAGTGAATCATGAG
(서열번호 14)
8 RRM2 Ribonucleotide reductase M2 TGGGAATCCCTGAAACCC
(서열번호15 )		 AAAGCCA
(서열번호 46)
GAACTTCTTGGCTAAATCGC
(서열번호 16)
9 TOP2A Topoisomerase (DNA) II alpha 170kDa AAGAGTCATTCCACGAATAACCAT
(서열번호 17)		 GCCTCTGA
(서열번호 47)
GAGGGCTTCCTTCAGTATTT
(서열번호 18)
10 UBE2C Ubiquitin-conjugating enzyme E2C AAAAGGCTACAGCAGGAGC
(서열번호 19)		 GGGAAGGC
(서열번호 48)
AGCTGCTCCATGGATGGTC
(서열번호 20)
면역-관련 유전자
1 BTN3A2 Butyrophilin subfamily 3 member A2 CTTCAAGCCTGGTGAGGA
(서열번호 21)		 CAAGGTGG(서열번호 49)
TTTTCTGCAGTCTATTTTTCC
(서열번호 22)
2 CCL19 Chemokine (C-C motif) ligand 19 ACTTCCACTACCTTCTCATCAAG
(서열번호 23)		 GTGCCTGC(서열번호 50)
GGCGGCCCCTCAGTGTGGT
(서열번호 24)
3 CD2 CD2 molecule ACTGCTCGTTTTCTATATCA
(서열번호 25)		 GAGGAGTC(서열번호 51)
TCCAGCTCCTCATCATTTCT
(서열번호 26)
4 CD52 CD52 molecule TCCTCCTACTCACCATCAGCCT
(서열번호 27)		 TCCTGGTT(서열번호 52)
TCGTTTTGTCCTGAGAGTCC
(서열번호 28)
5 HLA - DPA1 Major histocompatibility complex, class II, DP alpha 1 GGACCCTGTGAAATACTGTAAAG
(서열번호 29)		 ACAGAAGAG(서열번호 53)
CAGCTGGAGTTCAGATCTCT
(서열번호 30)
6 TRBC1 T cell receptor beta constant 1 CAGCAAGGGGTCCTGTCTG
(서열번호 31)		 TGGCAGACA(서열번호 54)
AAGAGAAAGGATTTCTGAAGG
(서열번호 32)
표준화용 유전자
1 CTBP1 C-terminal binding protein 1 CCTTGGGCATCATCGGA
(서열번호 33)		 GCCCCACG(서열번호 55)
GTTGAAGCCGAAGGCCTT
(서열번호 34)
2 CUL1 Cullin 1 AGTACTGAATTCTTGCAGCAGA
(서열번호 35)		 GCAGAGGC(서열번호 56)
TCTTCGTTGTTCCTCAAGCAGAC
(서열번호 36)
3 UBQLN1 Ubiquilin 1 GAAATCCTCAGCTTCAAGAACA
(서열번호 37)		 TTGGGAGC(서열번호 57)
TGACATTGCTGATAGTGTATCA
(서열번호 38)
4. qRT-PCR 데이터의 표준화(normalization)
16종의 후보군 유전자의 qRT-PCR 데이터를 표준화 하기에 적합한 표준화용 유전자를 선별하기 위해, 5종의 표준화용 유전자의 발현 수준 또한 평가하였다. 표준화용 유전자는 3종류의 신규한 표준화용 유전자(UBQLN1, CUL1 및 CTBP1) 및 2종의 통상적인 표준화용 유전자(TBP 및 HMBS)를 포함한다.
우선, 상기 5종의 표준화용 유전자와 16종의 예후 예측용 유전자 후보군의 발현 수준을 FFPE 시료 및 동결 시료로부터 qRT-PCR을 이용해 평가하였다. 5종의 표준화용 유전자 중에서 3종의 유전자(CTBP, CUL1 및 UBQLN1)가 16종의 예후 예측용 후보군 유전자와 상대적으로 유사한 정도의 발현 수준을 나타내었으며, 동결시료 및 FFPE 시료 간에도 우수한 연관성을 나타내었다.
926개의 FFPE 시료에서 평가하였을 때, 이 유전자들은 다른 2종의 유전자와 비교해 상대적으로 적은 Cq 값 손실(CTBP1: 25 손실값, CUL1: 89 손실값, UBQLN1: 15 손실값)을 나타내었다. 또한, 이 유전자들은 하기 표 2에 나타낸 바와 같이 유전자의 발현에 있어서 상호간에 높은 연관성을 나타내었다(피어슨 계수 > 0.79).
Figure pat00003
뿐만 아니라, R package NormqPCR에서 시행되어 있는 geNorm 및 NormFinder 알고리즘을 이용한 분석에서 CTBP1 , CUL1 및 UBQLN1이 가장 안정한 3종의 유전자로 평가되었다(표 4). 따라서, 상기 3종의 유전자를 16종의 예후 예측용 유전자 후보군 표준화용 유전자로 선정하였다.
Figure pat00004
각 유전자의 Cq값은 3종의 표준화용 유전자의 발현 수준에 의해 표준화된 상대적인 발현값을 나타낸다. 각 유전자의 상대적인 발현값은 표준화용 유전자 3종의 평균 Cq값 사이의 차이와 각 시료에서의 표적 Cq 값에 기초하여 계산이 된다.
△Cq_target=((Cq_CTBP1 + Cq_CUL1 + Cq_UBQLN1)/3) - Cq_target+30
5. 단변량 및 다변량 분석
시험 검체들의 임상병리학적 특성들은 기술적인 통계학을 이용하여 요약하였다. 무원격전이 생존(distant metastasis-free survival, DMFS)은 원발성 종양 수술을 한 날로부터 원격 전이가 발생한 날까지의 시간으로 정의된다. 총 생존(overall survival, OS)은 원발성 종양 수술을 한 날로부터 사망 시점 또는 마지막 조사 시점까지의 기간으로 정의된다. 무병생존(disease-free survival, DFS)은 원발성 종양 수술을 한 날로부터 재발(국소 영역 재발 및 원발성 전이 또는 모든 원인에 의한 사망을 포함)을 한 날까지의 기간을 계산한다.
임상병리학적 인자들 또는 유전자 발현과 임상 결과와의 연관성은 95%의 신뢰구간(confidence intervals, CIs)을 나타내는 Cox 비례 위험 모델에서 유래한 위험비 배급(hazard ratios, HRs)를 이용하여 평가하였다.
결측이 발생한 Cq값은 qRT-PCR 결측치 처리법(Bioinformatics (2014) 30 (16): 2310-2316, 2014 doi:10.1093/bioinformatics/btu239)을 사용하여 결측치를 대체하여 분석에 사용하였다. 원격전이 가능성은 Kaplan-Meier 방법에 의해 산정되었으며, log-rank 검정을 통해 두 위험군 간 무원격전이 생존확률의 차이의 유의성을 확인하였다. P value가 0.05 미만인 경우에 통계학적으로 유의성 있는 차이로 인정하였으며, 모든 통계학적 분석은 R 3.2.0(http://r-project.org)을 이용하여 수행하였다.
6. 임상적 및 분자적 데이터를 이용한 예후 예측 모델의 개발
다변량 분석결과를 바탕으로, HER2 아형에서의 원격 전이 위험을 예측하기 위한 예후 예측 모델을 개발하였다. 3종의 표준화용 유전자의 발현 수준 평균값에 의해 표준화된 2종의 예후 예측용 유전자의 상대적인 발현 수준에 의해 위험지수(10년 내 원격전이 발생의 분자적 예측 변수)를 계산하였다. 각 변수에서의 계수는 Cox 모델로부터 얻었으며, 하기 식에 따라 원격 전이를 예측하기 위해 위험지수(risk score)는 계수들의 선형결합으로써 규정하였다:
위험지수(Risk score) = 0.45×△Cq_MMP11 - 0.48×△Cq_CD2
위험지수가 높다는 것은 원격전이의 위험이 높다는 것을 의미한다. 원격전이 위험이 높은 환자와 낮은 환자를 구분하기 위한 위험지수의 경계값은 0.53이며, 이 수치는 민감도와 특이도의 합이 최대인 값이다. 어느 환자의 시료에서 위험 지수가 0.53 이상이 나온다면, 해당 환자는 고위험군에 해당하며, 그렇지 않다면 저위험군에 해당하는 것으로 판단할 수 있다.
7. 예후 예측 모델과 통상적인 임상병리학적 인자들과의 비교
임상병리학적 인자 단독에 기초한 원격전이에 대한 위험을 계산하기 위해 노팅험 예후 예측지수(Nottingham prognostic index, NPI) 점수를 이용하였다. NPI 점수는 다음과 같이 계산하였다:
0.2 ×종양크기(cm) + 종양 등급 + 임파절 상태
본 발명에서 사용된 시료들 각각의 NPI 예후 예측 수치를 계산하였고, 이를 네 그룹으로 구분하였다:
2~2.4: 매우 좋음, 2.4~3.4: 좋음, 3.4~5.4: 보통, 5.4초과: 나쁨
예후 예측력을 비교하고, 각각의 예후 예측 모델의 능력을 평가하기 위해 Harrell's concordance index(c-index)를 계산하였다.
<실험결과>
1. 환자의 특징
997개의 조직 시료 중에서, 조직학적으로 부적격인 시료 또는 양이 충분하지 않은 시료는 RNA 추출에서 제외되었으며, 또한 추출된 RNA의 양이 부족한 시료도 qRT-PCR 분석에서 제외시켰다. qRT-PCR을 수행하여 총 926개의 FFPE 시료에서 유전자 발현을 분석하였다. 926개의 시료 중에서 qRT-PCR 결과가 충분하지 않은 시료를 한번 더 제외시켜 총 819개의 유방암 환자 시료가 본 연구에 사용되었다.
환자의 평균 연령은 47.3세이었고(23.8세~81.2세 범위), 평균 종양 크기는 2.8cm이었다. 51.6%(423/819)의 환자가 림프절 음성인 반면에, 396개의 환자 샘플은 림프절 양성이었다. 림프절 음성이란 겨드랑이 림프절에 종양이 포함되지 않은 것을 의미하며, 림프절 양성이란 겨드랑이 림프절이 종양이 포함된 것을 의미한다. 86.3%(707/819)의 환자가 화학요법 치료를 받았다. 분자 아형에 따른 유방암 환자의 임상병리학적 특성에 관한 자세한 정보를 하기 표 5에 나타내었다.
　 Total 　 Luminal A Luminal B HER2 TNBC
(n=819) (n=410) (n=112) (n=105) (n=192)
　 n(%) 　 n(%) n(%) n(%) n(%)
평균연령 47.3 　 47.3 45.5 52.8 46
(최소-최대) (23.8-81.2) (25.2-80.5) (26.0-77.4) (24.3-77.8) (23.8-81.2)
연령 (years)
<50 486 (59.3%) 241 (58.8%) 76 (67.9%) 43 (41.0%) 126 (65.6%)
>=50 333 (40.7%) 169 (41.2%) 36 (32.1%) 62 (59.0%) 66 (34.4%)
종양크기 (cm)
<=2 325 (39.7%) 183 (44.6%) 39 (34.8%) 32 (30.5%) 71 (37.0%)
2-5 438 (53.5%) 204 (49.8%) 65 (58.0%) 63 (60.0%) 106 (55.2%)
>5 56 (6.8%) 23 (5.6%) 8 (7.1%) 10 (9.5%) 15 (7.8%)
림프절 전이
Negative 423 (51.6%) 203 (49.5%) 45 (40.2%) 59 (56.2%) 116 (60.4%)
Positive 396 (48.4%) 207 (50.5%) 67 (59.8%) 46 (43.8%) 76 (39.6%)
pN
0 423 (51.7%) 203 (49.5%) 45 (40.2%) 59 (56.2%) 116 (60.4%)
1 214 (26.1%) 112 (27.3%) 40 (35.7%) 22 (21.0%) 40 (20.8%)
2 97 (11.8%) 51 (12.4%) 16 (14.3%) 11 (10.5%) 19 (9.9%)
3 85 (10.4%) 44 (10.7%) 11 (9.8%) 13 (12.4%) 17 (8.9%)
병리학적 병기
I 204 (24.9%) 113 (27.6%) 17 (15.2%) 20 (19.0%) 54 (28.1%)
II 417 (50.9%) 197 (48.0%) 64 (57.1%) 58 (55.2%) 98 (51.0%)
III 198 (24.2%) 100 (24.4%) 31 (27.7%) 27 (25.7%) 40 (20.8%)
조직학적 등급
1 93 (11.4%) 77 (18.8%) 8 (7.1%) 4 (3.8%) 4 (2.1%)
2 300 (36.6%) 199 (48.5%) 37 (33.0%) 24 (22.9%) 40 (20.8%)
3 366 (44.7%) 123 (30%) 59 (52.7%) 66 (62.9%) 118 (61.5%)
Unknown 60 (7.3%) 11 (2.7%) 8 (7.1%) 11 (10.5%) 30 (15.6%)
핵 등급
1 81 (9.9%) 60 (14.6%) 7 (6.3%) 2 (1.9%) 12 (6.3%)
2 402 (49.1%) 256 (62.4%) 55 (49.1%) 35 (33.3%) 56 (29.2%)
3 307 (37.5%) 81 (19.8%) 46 (41.1%) 65 (61.9%) 115 (59.9%)
Unknown 29 (3.5%) 13 (3.2%) 4 (3.6%) 3 (2.9%) 9 (4.7%)
호르몬 요법
No 301 (36.8%) 21 (5.1%) 11 (9.8%) 96 (91.4%) 173 (90.1%)
Yes 508 (62.0%) 379 (92.4%) 101 (90.2%) 9 (8.6%) 19 (9.9%)
Unknown 10 (1.2%) 10 (2.4%) 0 (0.0%) 0 (0.0%) 0 (0.0%)
화학치료
No 110 (13.4%) 68 (16.6%) 14 (12.5%) 14 (13.3%) 14 (7.3%)
Yes 707 (86.3%) 342 (83.4%) 97 (86.6%) 90 (85.7%) 178 (92.7%)
Unknown 2 (0.3%) 0 (0.0%) 1 (0.9%) 1 (1.0%) 0 (0.0%)
방사선 치료
No 352 (43.0%) 162 (39.5%) 50 (44.6%) 59 (56.2%) 81 (42.2%)
Yes 465 (56.8%) 247 (60.2%) 61 (54.5%) 46 (43.8%) 111 (57.8%)
Unknown 2 (0.2%) 1 (0.2%) 1 (0.9%) 0 (0.0%) 0 (0.0%)
Abbreviations: HER2 , human epidermal growth factor receptor 2; TNBC , triple-negative breast cancer ; pT , pathologic tumor size ; pN , pathologic nodal status
819개의 시료 중에서 상당수는 루미날 A형(50%) 및 루미날 B형(13.7%)과 같은 호르몬 수용체 양성(HR+)인 종양 아형이었다. HER2형은 12.8%, 삼중음성 유방암(TNBC)는 23.4% 이었다. 루미날 A형은 1과 2의 조직학적 등급이 많았으며, 반면에 HER2형과 삼중음성 유방암은 3등급의 조직학적 등급이 많았다. HER2형의 나이 중간값은 52.8세(24.3~77.8)로 다른 유방암 분자 아형이 46.0세에서 47.3세의 중간 나이대인 것에 비해 더 나이 많은 사람에게서 발생함을 알 수 있었다. 그리고 유방암의 분자 아형에 따른 암의 크기는 서로 유사한 분포를 가지고 있었다.
2. 분자 아형에 따른 단변량 분석
유방암 아형과 무원격전이 생존, 무질병 생존, 전체 생존을 포함하는 환자의 생존과의 연관성에 대해 Kaplan-Meier 분석을 수행하였다. 최대 관찰기간은 수술 후 19.46년이었으며, 이러한 기간 동안 HER2형(HR-/HER2+)은 다른 아형에 비해 나쁜 예후를 보이는 경향이 있었지만 통계적으로 유의하지는 않았다. 하지만 수술 후 5년 기간을 한정지었을 때, 전체 생존율(OS)과 무질병 생존율(DFS)에서 HER2형과 다른 아형간에 통계적으로 유사한 차이를 확인할 수 있었다. 루미날 A형(HR+/HER2-)은 가장 예후가 좋았으며, 뒤따라 루미날 B형(HR+/HER2+), 삼중음성 유방암(TNBC), 마지막으로 HER2형 순이었다.
본 발명자들은 유방암의 분자 아형에 따라 16종의 유전자 후보군의 발현, 통상적인 임상병리학적 인자들 및 임상 결과와의 연관성에 대해 분석하였다. 무원격전이 생존(DMFS)에 대한 평균 관찰 기간은 9.67년(0.04년~19.46년 범위)이었다. 5년, 10년 및 15년 동안 무원격전이 생존한 비율은 각각 79.3%, 74.3% 및 70.0% 이었다.
단변량 분석 결과, 림프절 양성 여부는 HER2 유방암 아형을 제외한 유방암의 분자 아형과 관계없이 높은 원격 전이 위험과 연관성이 있는 것으로 확인되었다(표 6, 표 7).
Figure pat00005
Figure pat00006
흥미롭게도, 원격 전이 위험에 대한 종양 크기의 영향은 루미날 A형 및 TNBC 아형을 포함한 HER2 음성인 유방암(Luminal A, TNBC subtype)에서 유의적인 것으로 나타났으며, HER2 양성인 유방암 (Luminal B, HER2 subtype)에 대해서는 유의적이지 않은 것으로 확인되었다.
16개의 유전자 발현과 원격 전이와의 연관성은 유방암의 분자 아형에 따라 다르게 나타났다. 16개의 예후 예측용 유전자 후보군 중에서, 대부분의 증식-관련 유전자들이 루미날 A형 유방암에서 DMFS와 유의적인 연관성을 나타냈다. 증식-관련 유전자 9종(AURKA, CCNB2, FOXM1, MK167, MMP11, RACGAP1, RRM2, TOP2A, 및 UBE2C)의 높은 발현은 상기 아형에서 높은 원격 전이 위험과 유의성 있는 연관성을 나타내었다(표 8, 표 9).
Figure pat00007
Figure pat00008
3종의 증식-관련 유전자(MMP11 , RRM2 및 UBE2C)는 루미날 B형 유방암의 DMFS와 유의적인 연관성을 나타내었다. HER2 아형에서는 MMP11 및 2종의 면역반응-관련 유전자(BTN3A2 및 CD2)가 임상 결과와 유의적인 연관성을 나타내었다. MMP11의 발현이 높을수록 원격 전이의 위험성이 증가하였고(HR, 1.57; 95% CI, 1.16-2.13; P = 0.003), 반면에 BTN3A2(HR, 0.56; 95% CI, 0.35-0.88; P = 0.013) 및 CD2(HR, 0.61; 95% CI, 0.44-0.85; P = 0.004)의 높은 발현은 예후가 좋은 결과와 연관이 있는 것으로 나타났다(표 7).
DFS 및 OS에 대한 단변량 분석 결과는 DMFS의 결과와 유사하게 나타났다. 임상 변수들과 관련하여, 림프절 전이 정도는 HER2 유방암 아형을 제외한 모든 유방암 아형에서 DFS와 연관이 있는 것으로 나타났다. 반면에 종양의 크기는 루미날 A형과 삼중음성 유방암을 포함하는 HER2 음성 유방암에서만 DFS와 유의성을 나타내었다. OS에서는 HER2 음성 유방암(루미날 A형과 삼중음성 유방암)만이 림프절 전이 상태와 암의 크기와 관련성이 있었다. 반대로 HER2 양성 유방암(루미날 B형과 HER2 유방암)에서는 임상 변수들과 OS의 연관성을 확인할 수 없었다.
DMFS와 마찬가지로, DFS 또는 OS와 유의적인 연관성을 나타내는 유전자는 유방암의 분자 아형에 의존적이었으며, 그 종류도 DMFS와 유사했다. 또한, 면역반응-관련 유전자의 발현과 양호한 결과와의 유의적인 상관관계는 DMFS에서와 같이 HER2 아형에서만 관찰이 되었다. CD2는 HER2 유방암 아형에서만 DFS와 연관되어 있다고 확인되었으며, BTN3A2 , CD2, TRBC2는 HER2 유방암 아형에서 OS와 연관되어 있음을 나타내었다.
림프절에 따른 각 아형에서 DFS와 OS에 연관된 유전자 분석 시, 림프절 상태에 따라 연관된 유전자가 약간 다른 것을 확인할 수 있었다.
3. 분자 아형에 따른 다변량 분석
단변량 분석에서 유의적인 것으로 확인된 임상적 및 유전적 변수들 중에서 각 유방암 아형에 독립적인 예후 예측 인자를 선별하기 위하여 단계별 (stepwise) 다변량 분석(multivariate analysis)을 수행하였다. DMFS에 대한 HR 및 95% CIs를 표 10 및 표 11에 나타내었다.
Figure pat00009
Figure pat00010
단변량 분석 결과 DMFS에 유의한 임상병리학적 인자가 확인되지 않고 예후 유전자 MMP11 , BTN3A2 , CD2, TRBC2만 유의하게 확인되었던 HER2 유방암은 다변량 분석 결과 MMP11(HR, 1.49; 95% CI, 1.08-2.04; P =0.014) 및 CD2(HR, 0.66; 95% CI, 0.47-0.94; P =0.022)가 DMFS에 대한 통계학적인 유의성이 있음을 확인하였다. 이러한 결과는 MMP11과 CD2의 발현이 HER2 유방암 아형에서의 독립적인 예후인자임을 증명한다. HER2 유방암 아형을 제외한 다른 유방암 아형에서는 림프절 전이 정도가 독립적인 음성 예후 인자로 파악되었다. 또한 MKI67와 TOP2A는 루미날 A 아형에서 DMFS에 대해 유의한 인자였으며, MMP11은 루미날 B 아형 임계적으로 유의성(marginally significant)을 보임을 확인하였다.
DFS에서는 MMP11 (HR, 1.46; 95% CI, 1.11-192, P=0.006)와 TOP2A (HR, 0.62; 95% CI, 0.41-0.94, P=0.024)가 HER2 아형에서의 예후와의 연관성이 확인되었다. HER2 아형에서 OS의 독립된 예후 인자로는 MMP11 (HR, 1.47; 95% CI, 1.05-2.06, P=0.025)과 BTN3A2 (HR, 0.56; 95% CI, 0.34-0.92; P=0.023)가 확인되었다.
4. HER2 아형 유방암에서 원격 전이에 대한 위험 모델의 예후 예측력
MMP11 및 CD2의 유전자 발현이 HER2 아형 유방암 환자에서 원격 전이에 대한 독립적인 예후 예측 인자라는 것을 보여준 상기 다변량 분석 결과에 기초하여, HER2 아형에서 원격전이 위험을 예측하기 위한 예후 예측 모델을 확립하였다.
본 발명의 예후 예측 모델의 유의성을 평가하기 위하여, HER2 아형인 환자를 두 그룹으로 구분하였다. 즉, 본 발명의 예후 예측 모델에 따라 개발된 상기 “실험방법 6”에 기재된 위험 지수(risk score)를 이용하여 환자군을 고위험군과 저위험군으로 구분하고, 상기 양 그룹의 DMFS 확률을 비교하였다.
Kaplan-Meier 곡선에 의하면, 10년 내 DMFS 확률이 고위험군에서 56.07%로 저위험군의 87.70%와 비교해 현저히 낮았으며, 두 그룹 간 생존확률의 차이는 유의하였다(p<0.001, 도 1). 즉, 고위험군은 10년 내 원격 전이율이 44.93%로 저위험군의 12.30%와 비교해 현저하게 높았다는 것을 의미한다. 또한 Cox 비례 위험 모델을 통해 저위험군에 대한 고위험군의 위험비를 도출한 결과 HR 4.62 (1.87-11.41)로 저위험군에 비해 높은 원격전이 위험이 있음이 관찰되었다. 위험고위험군과 저위험군 사이에 임상적 특징들을 분석해 보면, 큰 차이가 관찰되지 않았다(표 12).
　　 저위험군 고위험군 P values
검체 수 52 52 　
나이 (median) 51.6 51.3 0.883a
암의 크기 ( mean ) 3.01 3.05 0.909a
암의 크기 0.409b
<=2cm 15 17
2-5cm 30 32
>5cm 7 3
화학치료 1.000b
No 7 6
Yes 45 45
NA 0 1
Lymph node 0.844b
Negative 30 28
Positive 22 24
pN 0.971b
0 30 28
1 11 11
2 5 6
3 6 7
병리학적 병기 0.973b
I 10 10
II 29 28
III 13 14
조직학적 등급 0.290c
1 1 3
2 10 13
3 38 28
NA 3 8
NPI 0.342c
1 2 5
2 13 14
3 27 17
4 7 8
　 NA 3 8 　
a: Student's t-test; b: Chi-square test; c: Fisher's exact test
Abbreviations:
NPI,Nottingham prognostic index,
P values of less than 0.05 are marked in bold.
상기 결과를 통해 임상 변수들 단독으로는 HER2 아형 유방암 환자에서 원격 전이 고위험군 또는 저위험군을 구분할 수 없지만, 본 발명에 따른 예후 예측 모델은 원격 전이에 대한 고위험군과 저위험군으로 환자를 구분함에 있어서 매우 유용하다는 것을 알 수 있었다.
Harrell's c-index를 이용하여 본 발명에 따른 위험 지수와 종래 임상병리학적 인자들의 예후 예측력을 비교하였다. 본 발명에 따른 모델은 c-index가 0.694로 가장 높아 다른 예후 예측 인자 또는 임상병리학적 인자만을 기초로 한 모델과 비교해 원격 전이의 위험을 예측하는 효과가 매우 뛰어나다는 것을 알 수 있었다(도 2).
이상과 같이, 본 발명에 따른 예후 예측 모델은 임상적 변수만을 기초로 한 통상적인 모델과 비교해 원격 전이의 위험을 예측하는 효과가 월등히 우수하다는 것을 알 수 있으며, 일반적인 임상병리학적 인자들보다 더 유의성 있는 예후 예측 정보들을 제공해 준다는 것을 알 수 있다.
본 발명은 유방암의 예후와 유의한 상관성을 나타내는 2종의 유전자를 이용한 유방암 예후 예측방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법을 통해 유방암 환자의 향후 전이, 재발 또는 전이성 재발 여부에 대한 예후를 보다 정확하게 예측할 수 있는 효과가 있고, 특히 예후가 매우 불량한 HER2형 유방암에 대한 예후 예측력이 매우 뛰어나 향후 유방암 치료의 방향에 대한 정보를 제공하는 목적으로 유용하게 사용할 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 우수하다.
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cagaatgaga gctcccagcc t 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human MKI67 primer reverse <400> 8 tgcatgagaa ccttcgcact c 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human MMP11 primer forward <400> 9 gacagaagag gttcgtgctt 20 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human MMP11 primer reverse <400> 10 aactgccatg ggaaccga 18 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human PTTG1 primer forward <400> 11 caggcacccg tgtggttgc 19 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human PTTG1 primer reverse <400> 12 atctaaggct ttgattgaag g 21 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human RACGAP1 primer forward <400> 13 gctgccatgt accaagctgt 20 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human RACGAP1 primer reverse <400> 14 tctctgcaag tgaatcatga g 21 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human RRM2 primer forward <400> 15 tgggaatccc tgaaaccc 18 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human RRM2 primer reverse <400> 16 gaacttcttg gctaaatcgc 20 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human TOP2A primer forward <400> 17 aagagtcatt ccacgaataa ccat 24 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human TOP2A primer reverse <400> 18 gagggcttcc ttcagtattt 20 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human UBE2C primer forward <400> 19 aaaaggctac agcaggagc 19 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human UBE2C primer reverse <400> 20 agctgctcca tggatggtc 19 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human BTN3A2 primer forward <400> 21 cttcaagcct ggtgagga 18 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human BTN3A2 primer reverse <400> 22 ttttctgcag tctatttttc c 21 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CCL19 primer forward <400> 23 acttccacta ccttctcatc aag 23 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CCL19 primer reverse <400> 24 ggcggcccct cagtgtggt 19 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CD2 primer forward <400> 25 actgctcgtt ttctatatca 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CD2 primer reverse <400> 26 tccagctcct catcatttct 20 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CD52 primer forward <400> 27 tcctcctact caccatcagc ct 22 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CD52 primer reverse <400> 28 tcgttttgtc ctgagagtcc 20 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human HLA-DPA1 primer forward <400> 29 ggaccctgtg aaatactgta aag 23 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human HLA-DPA1 primer reverse <400> 30 cagctggagt tcagatctct 20 <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> 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<400> 48 gggaaggc 8 <210> 49 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human BTN3A2 probe <400> 49 caaggtgg 8 <210> 50 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CCL19 probe <400> 50 gtgcctgc 8 <210> 51 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CD2 probe <400> 51 gaggagtc 8 <210> 52 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CD52 probe <400> 52 tcctggtt 8 <210> 53 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human HLA-DPA1 probe <400> 53 ggaccctgtg aaatactgta aag 23 <210> 54 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human TRBC1 probe <400> 54 tggcagaca 9 <210> 55 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CTBP1 probe <400> 55 gccccacg 8 <210> 56 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CUL1 probe <400> 56 gcagaggc 8 <210> 57 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human UBQLN1 probe <400> 57 ttgggagc 8

Claims (13)

  1. 유방암 환자의 예후 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 하기 단계를 포함하는 유방암 예후 예측방법:
    (a) 유방암 환자로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계의 시료 또는 환자 정보로부터 MMP11(matrix metallopeptidase 11)의 mRNA 발현 수준, CD2(cluster of differentiation 2)의 mRNA 발현수준을 측정하는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계에서 선택되어 측정된 유전자의 mRNA 발현수준을 표준화 하는 단계; 및
    (d) 상기 (c) 단계에서 표준화된 유전자의 발현수준을 조합하여 유방암의 예후를 예측하는 단계로서, 상기 MMP11의 과발현은 나쁜 예후인 것으로, CD2의 과발현은 좋은 예후인 것으로 유방암 예후를 예측하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 유방암은 HER2(human epidermal growth factor receptor 2) 아형(subtype)인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 예후는 원격전이(distant metastasis) 발생여부인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 표준화는 CTBP1 (C-terminal-binding protein 1), CUL1 (cullin 1) 및 UBQLN1 (Ubiquilin-1)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 표준유전자의 발현 수준에 대한 상대적인 발현값을 산출하는 것에 의해서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 시료는 환자의 암세포를 포함하는 조직의 포르말린 고정 파라핀 포매(formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE) 시료, 신선한 조직(fresh tissue) 및 동결 조직으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 유전자의 발현량을 측정하기 위한 방법은 마이크로어레이, PCR(polymerase chain reaction), RT-PCR, 정량적 RT-PCR(qRT-PCR), 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR), 노던 블롯(northern blot), DNA 칩 및 RNA 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 방법인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 유방암 환자의 예후 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 하기 단계를 포함하는 유방암 예후 예측방법:
    (a) 유방암 환자로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계의 시료로부터 예후 예측용 유전자인 MMP11(matrix metallopeptidase 11), CD2(cluster of differentiation 2) 및 표준화용 유전자인 CTBP1 (C-terminal-binding protein 1), CUL1 (cullin 1), UBQLN1 (Ubiquilin-1)의 mRNA 발현수준을 측정하는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계에서 측정된 예후 예측용 유전자(target) 및 표준화용 유전자의 mRNA 발현수준을 하기 식 1에 대입하여 예후 예측용 유전자의 발현수준을 표준화(△Cq) 하는 단계
    [식 1]
    △Cq_target=((Cq_CTBP1 + Cq_CUL1 + Cq_UBQLN1)/3) - Cq_target+30;
    (d) 상기 (c) 단계에서의 표준화값을 하기 식 2에 대입하여 위험지수(risk score)를 계산하는 단계
    [식 2]
    위험지수(Risk score) = a×△Cq_MMP11 + b×△Cq_CD2
    (상기 식 2에서 a는 0.15 내지 0.76이고, 상기 b는 -0.81 내지 -0.15임); 및
    (e) 상기 (d) 단계에서 계산된 위험지수가 높을수록 예후가 좋지 않은 것으로 예측하는 단계.
  8. 제7항에 있어서, 상기 (e) 단계의 수치가 -0.53를 초과하는 경우 예후가 좋지 않은 것으로, -0.53 이하인 경우 예후가 좋은 것으로 예측하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. MMP11 및 CD2 유전자의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 유방암 환자의 예후 예측용 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 조성물은 CTBP1, CUL1 및 UBQLN1 유전자의 발현량을 측정하는 제제를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 상기 발현량을 측정하는 제제는 MMP11 및 CD2 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍인 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. MMP11 및 CD2 유전자의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 유방암 환자의 예후 예측용 키트.
  13. 제12항에 있어서, 상기 조성물은 CTBP1, CUL1 및 UBQLN1 유전자의 발현량을 측정하는 제제를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
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