KR20180054439A

KR20180054439A - Methods for 3D Culturing of Cell

Info

Publication number: KR20180054439A
Application number: KR1020170143583A
Authority: KR
Inventors: 이재영; 장종욱; 박중건; 최고은
Original assignee: 광주과학기술원; 사회복지법인 삼성생명공익재단
Priority date: 2016-11-15
Filing date: 2017-10-31
Publication date: 2018-05-24

Abstract

The present invention relates to a microcapsule comprising alginic acid, a method for manufacturing the microcapsule, a three-dimensional culture method of stem cells using the microcapsule, and a use of the microcapsule for culturing stem cells. A micro-sized capsule structure capable of culturing stem cells three-dimensionally is formed of alginic acid or alginic acid modified with a peptide derived from an extracellular matrix, so that an effective culture with enhanced spatial and temporal efficiency, cellular activities, and mass production is possible compared to a two-dimensional culture where a commonly used culture dish is used.

Description

Methods for 3D Culturing of Cell < RTI ID = 0.0 >

본 발명은 알긴산을 포함하는 마이크로캡슐, 상기 마이크로캡슐의 제조방법, 상기 마이크로캡슐을 이용한 세포의 삼차원 배양 방법 및, 상기 마이크로캡슐의 세포 배양 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a microcapsule containing alginic acid, a method for producing the microcapsule, a three-dimensional culture method for cells using the microcapsule, and a cell culture use of the microcapsule.

줄기세포는 자기재생능력(self-renewal)과 분화능을 지니며, 다양한 생리활성물질(bioactive factors)를 분비하여 조직공학과 재생의학에 널리 사용되고 있다. 배아줄기세포(embryonic stem cells), 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells), 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cells) 등의 다양한 줄기세포를 이용한 활발한 응용 연구가 진행되고 있다. Stem cells have self-renewal and differentiation ability and secrete various bioactive factors and are widely used in tissue engineering and regenerative medicine. Actual application studies using various stem cells such as embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells, and mesenchymal stem cells are underway.

특히, 중간엽줄기세포는 골수, 지방 조직, 탯줄, 제대혈 등에서 분리되며, 지방세포, 골세포 또는 연골세포 등으로 분화할 수 있으며, 면역원성(immunogenicity)이 낮고 면역중재(immunomodulatory) 역할을 할 수 있다. 또한, 표면항원 중 CD73, CD90, CD105를 발현하고 CD34, CD45, CD14, CD11b, CD19, CD79a는 발현하지 않는다는 특징을 가지고 있다. In particular, mesenchymal stem cells are isolated from bone marrow, adipose tissue, umbilical cord, umbilical cord blood, etc., and can differentiate into adipocytes, osteocytes or chondrocytes, have low immunogenicity and can act as immunomodulatory agents have. In addition, it expresses CD73, CD90, CD105 and CD34, CD45, CD14, CD11b, CD19 and CD79a among the surface antigens.

이와 같이 다양한 줄기세포가 임상연구 및 상용화되기 위해서는 줄기세포의 증식이 필수적이며, 적절한 분화능 및 활성을 유지하면서 줄기세포의 배양을 통하여 증식되어야 한다. 그러나 증식의 조건이 부적절한 경우에는 줄기세포의 느린 생장속도, 자발적 분화시작, 분화능 감소 등의 문제가 있다.Stem cell proliferation is essential for clinical research and commercialization of a variety of stem cells, and it must be propagated through cultivation of stem cells while maintaining proper pluripotency and activity. However, when the conditions of proliferation are inadequate, there are problems such as a slow growth rate of stem cells, spontaneous differentiation, and reduced ability to differentiate.

일반적으로 사용되고 있는 줄기세포 배양법은 줄기세포를 플라스틱 배양접시나 플라스크에 배양배지를 넣고 배양하는 것으로, 주로 25, 75, 150, 225 cm²의 표면적을 가진 배양접시가 사용된다. 경도가 높은 플리스틱 상에 2차원 배양으로 이루어지며, 세포의 증식 후에는 일반적으로 트립신과 같은 효소로 줄기세포를 탈착 (detachmenet)하여 회수를 하여, 계대 또는 이용을 한다. A commonly used stem cell culture method involves culturing stem cells in a plastic culture dish or flask with a culture medium, and a culture dish having a surface area of 25, 75, 150, or 225 cm ² is mainly used. After the cell proliferation, the stem cells are generally detached by an enzyme such as trypsin, and recovered, and then transferred or used.

세포치료법이나 약물전달을 비롯한 임상응용을 위해서는 대량의 세포가 필요한데, 일반적인 배양방법으로 세포를 배양할 경우 많은 양의 배양접시나 플라스크를 사용하여야 한다. A large number of cells are required for clinical applications including cell therapy or drug delivery. When culturing cells by a general culture method, a large amount of culture dishes or flasks should be used.

그러나, 대량의 플라스크를 사용하게 될 경우에는 많은 노동을 기할 뿐 아니라(labor intensive) 플라스크 마다 가변성을 갖게 되며, 외부인자로 인한 오염 (contamination)의 가능성이 증가하게 되어 효율성이 매우 낮아서, 일반적인 배양방법은 대량생산에 적절한 정도로 세포를 증식하기에는 상대적으로 적합하지 않을 수 있다는 평가를 받고 있다. However, when a large amount of flask is used, not only a lot of labor is required but also the flask is variable in each flask and the possibility of contamination due to the outsider is increased, so that the efficiency is very low. And may be relatively inadequate to propagate the cells to an extent suitable for mass production.

또한, 배양접시나 플라스크에서의 배양은 2차원인 경도의 환경에서 줄기세포를 배양하여, 실제 생체 내에서 줄기세포가 증식하는 3차원의 연성의 환경과 차이가 있어 줄기세포의 변성을 유도할 위험성이 있다. In culture on a culture dish or a flask, the stem cells are cultured in a two-dimensional hardness environment, and there is a difference in the three-dimensional ductility environment in which the stem cells proliferate in vivo. Thus, the risk of inducing stem cell degeneration .

이에 따라, 줄기세포를 효율적, 안정적으로 배양하는 방법에 관한 기술의 개발은 시급하며, 산업적, 임상적으로도 줄기세포의 증식은 매우 중요한 파급효과를 가진다.Accordingly, it is urgent to develop a technique for culturing stem cells efficiently and stably, and the proliferation of stem cells has a very important ripple effect both industrially and clinically.

본 발명자들은 세포를 안정적이고 고효율로 배양하면서도 스케일-업(scale-up) 할 수 있는 배양 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. The present inventors have made extensive efforts to develop a culture method capable of scaling up the cells while stably and efficiently culturing the cells.

그 결과 알긴산을 포함하는 마이크로캡슐을 이용하여 세포를 배양하는 경우, 종래 알려진 배양방법들에 비해 고밀도 배양, 역가 유지, 배양 안정성, 스케일-업의 효율성 면에서 우수한 효과가 발휘됨을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다. As a result, it has been found that when cells are cultured using microcapsules containing alginic acid, superior effects are obtained in terms of high-density culture, retention of potency, stability of culture, and efficiency of scale-up compared to conventionally known culture methods, .

이에, 본 발명의 목적은 알긴산을 포함하는 마이크로캡슐을 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide microcapsules containing alginic acid.

본 발명의 다른 목적은 알긴산을 포함하는 마이크로캡슐 제조하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for producing microcapsules containing alginic acid.

본 발명의 또 다른 목적은 알긴산 마이크로캡슐을 이용한 세포의 삼차원 배양방법을 제공하는 것이다. It is still another object of the present invention to provide a three-dimensional culture method of cells using alginic acid microcapsules.

본 발명의 또 다른 목적은 알긴산 마이크로캡슐의 세포의 배양 용도에 관한 것이다.A further object of the present invention relates to the use of cells for the culture of alginic acid microcapsules.

본 발명은 기존의 세포의 배양법이 가지는 2차원 배양에 따른, 비효율성, 느린 증식속도, 산화스트레스와 같은 외부 유해환경에 의한 세포 활성 감소 위험 등의 문제점들을 해결하고자, 세포외기질 유래의 펩타이드로 변환된 천연고분자를 이용한 생체모방형의 삼차원 마이크로캡슐에 세포를 담지하여 고밀도, 고효율로 줄기세포를 배양하고 이를 손쉽게 회수하는 방법을 개발였다. The present invention aims to solve problems such as inefficiency, slow growth rate and risk of decreasing cell activity due to external harmful environment such as oxidative stress according to the two-dimensional culture of existing cell culture methods, It was developed a method of cultivating stem cells with high density and high efficiency by carrying cells on a biomimetic three-dimensional microcapsule using the converted natural polymer and easily recovering the stem cells.

이에, 본 발명이 달성하고자 하는 바는 알긴산 삼차원 마이크로캡슐 내부에서 세포를 고밀도로 담지하여 배양함으로써, 이때 담지 된 세포의 생장을 향상시키고 세포의 역가를 유지 및 용이하게 마이크로캡슐에서 분리 회수시킬 수 있도록 하여, 세포의 대량생산이 가능한 방법을 통해 생산 공정의 효율성을 증대시키는 것이다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide an alginate three-dimensional microcapsule in which cells are carried on a high density and cultured to improve the growth of the supported cells and to maintain the titer of the cells and to easily separate and recover the microcapsules Thereby increasing the efficiency of the production process through a method capable of mass production of cells.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본 발명의 일 양태는 알긴산을 포함하는 세포 배양용 마이크로캡슐에 관한 것이다.One aspect of the present invention relates to microcapsules for cell culture comprising alginic acid.

상기 알긴산은 세포외기질 유래 펩타이드로 치환되어 있는 것일 수 있다.The alginic acid may be substituted with an extracellular matrix-derived peptide.

상기 세포외기질 유래 펩타이드는 RGD 모티프, DGEA 모티프, REDV 모티프, IKVAV 모티프, VPGVG 모티프, YIGSR 모티프, KHIFSDDSSE 모티프 일 수 있으며, 예를 RGD 모티프인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. The extracellular matrix-derived peptide may be an RGD motif, a DGEA motif, a REDV motif, an IKVAV motif, a VPGVG motif, a YIGSR motif, or a KHIFSDDSSE motif, and may be, for example, an RGD motif.

상기 마이크로캡슐의 평균 직경은 30 um 이상, 40 um 이상, 50 um 또는 60 um 이상인 것일 수 있다. 또한, 상기 마이크로캡슐의 평균 직경은 1000 um 이하, 900 um 이하, 850 um 이하, 800 um 이하, 750 um 이하, 700 um 이하, 650 um 이하, 600 um 이하, 550 um 이하 또는 500 um 이하인 것일 수 있다.The microcapsules may have an average diameter of 30 μm or more, 40 μm or more, 50 μm or 60 μm or more. The average diameter of the microcapsules may be less than 1000 μm, less than 900 μm, less than 850 μm, less than 800 μm, less than 750 μm, less than 700 μm, less than 650 μm, less than 600 μm, less than 550 μm, or less than 500 μm have.

예를 들어, 상기 마이크로캡슐의 평균 직경은 30 내지 1000 um, 30 내지 900 um, 30 내지 850 um, 30 내지 800 um, 30 내지 7500 um, 30 내지 700 um, 30 내지 650 um, 30 내지 600 um, 30 내지 550 um, 30 내지 500 um, 40 내지 1000 um, 40 내지 900 um, 40 내지 850 um, 40 내지 800 um, 40 내지 7500 um, 40 내지 700 um, 40 내지 650 um, 40 내지 600 um, 40 내지 550 um, 40 내지 500 um, 50 내지 1000 um, 50 내지 900 um, 50 내지 850 um, 50 내지 800 um, 50 내지 7500 um, 50 내지 700 um, 50 내지 650 um, 50 내지 600 um, 50 내지 550 um, 50 내지 500 um , 60 내지 1000 um, 60 내지 900 um, 60 내지 850 um, 60 내지 800 um, 60 내지 7500 um, 60 내지 700 um, 60 내지 650 um, 60 내지 600 um, 60 내지 550 um, 60 내지 500 um 인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. For example, the microcapsules have an average diameter of 30 to 1000 μm, 30 to 900 μm, 30 to 850 μm, 30 to 800 μm, 30 to 7500 μm, 30 to 700 μm, 30 to 650 μm, 30 to 600 μm , 30 to 550 um, 30 to 500 um, 40 to 1000 um, 40 to 900 um, 40 to 850 um, 40 to 800 um, 40 to 7500 um, 40 to 700 um, 40 to 650 um, 50 to 800 mu m, 50 to 7500 mu m, 50 to 700 mu m, 50 to 650 mu m, 50 to 600 mu m, from 40 to 550 um, 40 to 500 um, 50 to 1000 um, 50 to 900 um, 50 to 850 um, , 50 to 550 um, 50 to 500 um, 60 to 1000 um, 60 to 900 um, 60 to 850 um, 60 to 800 um, 60 to 7500 um, 60 to 700 um, 60 to 650 um, 60 to 600 um , 60 to 550 μm, and 60 to 500 μm, but is not limited thereto.

상기 세포는 줄기세포인 것일 수 있다. 상기 줄기세포는 중간엽줄기세포(Mesenchymal Stem Cell), 혈액줄기세포, 신경줄기세포, 근육줄기세포, 심근줄기세포, 배아줄기세포 및 유도만능줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으며, 예를 들어, 중간엽줄기세포인 것일 수 있다. The cell may be a stem cell. The stem cells may be at least one selected from the group consisting of Mesenchymal Stem Cells, blood stem cells, neural stem cells, muscle stem cells, myocardial stem cells, embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, For example, it may be a mesenchymal stem cell.

본 발명의 다른 일 양태는 알긴산을 포함하는 마이크로캡슐 제조방법에 관한 것이다.Another aspect of the present invention relates to a method for producing microcapsules containing alginic acid.

알긴산 용액을 제조하는 알긴산 용액 제조 단계;A step of preparing an alginic acid solution to prepare an alginic acid solution;

세포 분산용액과 알긴산 용액을 혼합하는 혼합 단계;A mixing step of mixing the cell dispersion solution and the alginic acid solution;

마이크로캡슐을 형성하는 형성 단계.Formation steps to form microcapsules.

상기 알긴산 용액 제조 단계는 생리식염수 또는 배지에 알긴산염 또는 세포외기질 유래의 펩타이드로 치환된 알긴산염을 첨가하여 알긴산 용액을 제조하는 것일 수 있다.The alginate solution may be prepared by adding physiological saline or an alginate or alginate substituted with a peptide derived from an extracellular matrix to the medium to produce an alginate solution.

상기 세포외기질 유래 펩타이드는 RGD 모티프, DGEA 모티프, REDV 모티프, IKVAV 모티프, VPGVG 모티프, YIGSR 모티프, KHIFSDDSSE 모티프 일 수 있으며, 예를 RGD 모티프인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The extracellular matrix-derived peptide may be an RGD motif, a DGEA motif, a REDV motif, an IKVAV motif, a VPGVG motif, a YIGSR motif, or a KHIFSDDSSE motif, and may be, for example, an RGD motif.

상기 알긴산 용액은 알긴산염을 0.1 내지 10 중량 %, 0.1 내지 8 중량 %, 0.1 내지 6 중량 %, 0.1 내지 4 중량 %, 0.1 내지 2 중량 %, 0.5 내지 10 중량 %, 0.5 내지 8 중량 %, 0.5 내지 6 중량 %, 0.5 내지 4 중량 %, 0.5 내지 2 중량 %, 1 내지 10 중량 %, 1 내지 8 중량 %, 1 내지 6 중량 %, 1 내지 4 중량 % 또는 1 내지 2 중량 %, 예를 들어, 1.25 중량% 포함하는 것일 수 있다. 알긴산의 농도에 따라서 같은 가교용액에서 재료의 강도를 조절할 수 있으며, 상기 범위를 벗어나 너무 높은 농도의 용액의 경우 점성이 높아 바늘이 막힐 수 있으며, 너무 낮은 농도의 경우 가도가 낮아지는 문제점이 있으나, 상기의 알긴산 용액 농도에서 안정적인 마이크로 크기의 캡슐이 제조된다. The alginic acid solution may contain 0.1 to 10% by weight, 0.1 to 8% by weight, 0.1 to 6% by weight, 0.1 to 4% by weight, 0.1 to 2% by weight, 0.5 to 10% by weight, 0.5 to 8% by weight, 1 to 8% by weight, 1 to 6% by weight, 1 to 4% by weight or 1 to 2% by weight, for example, from 1 to 10% , 1.25% by weight. The strength of the material can be controlled in the same cross-linking solution depending on the concentration of alginic acid. If the concentration of the solution exceeds the above range, the viscosity of the solution is too high to clog the needle, Stable micro-sized capsules are prepared at the alginate solution concentration.

상기 마이크로캡슐 제조방법은 알긴산 용액 제조 단계 이 후에 알긴산 용액을 필터링하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.The microcapsule manufacturing method may further include a step of filtering the alginate solution after the alginate solution preparation step.

상기 필터링은 0.2 um의 주사기 필터로 필터링하는 것일 수 있으나, 이에 한되는 것은 아니다.The filtering may be, but is not limited to, filtering with a 0.2 um syringe filter.

상기 혼합 단계는 세포 분산용액 및 알긴산 용액을 1:0 내지 1:0의 부피, 예를 들어, 1:4의 부피로 혼합하는 것일 수 있으며, 혼합 비율에 따라 최종 세포 농도와 알긴산의 농도를 조절할 수 있다.The mixing step may be a mixing of the cell dispersion solution and the alginic acid solution in a volume of 1: 0 to 1: 0, for example, a volume of 1: 4, and adjusting the final cell concentration and the alginic acid concentration according to the mixing ratio .

상기 혼합 단계에서 세포 분산액과 알긴산 용액을 혼합한 혼합 용액에 포함된 세포의 농도는 10³ 내지 10⁹ cell/mL, 10⁴ 내지 10⁹ cell/mL, 10⁵ 내지 10⁹ cell/mL, 10³ 내지 10⁸ cell/mL, 10⁴ 내지 10⁸ cell/mL, 10⁵ 내지 10⁸ cell/mL, 10³ 내지 10⁷ cell/mL, 10⁴ 내지 10⁷ cell/mL 또는 10⁵ 내지 10⁷ cell/mL인 것일 수 있으며, 예를 들어, 1.0 X 10⁶ cell/mL인 것일 수 있다. 상기 범위보다 낮은 세포 농도에서는 캡슐화 후 세포의 생리활성이 낮고 생장이 매우 늦어지며, 상기범위보다 높은 경우에는 세포를 농축하기 어려우며 캡슐화 된 세포에게 영양분을 공급하기 어렵다.Concentration in the mixing stage the cells contained in the mixed solution of a mixture of cell dispersion and the alginic acid solution is 10 ³ to 10 ⁹ cell / mL, 10 ⁴ to 10 ⁹ cell / mL, 10 ⁵ to 10 ⁹ cell / mL, 10 ³ to 10 ⁸ cell / mL, 10 ⁴ to 10 ⁸ cell / mL, 10 ⁵ to 10 ⁸ cell / mL, 10 ³ to 10 ⁷ cell / mL, 10 ⁴ to 10 ⁷ cell / mL, or 10 ⁵ to 10 ⁷ cell / mL, for example, 1.0 × 10 ⁶ cells / mL. When the cell concentration is lower than the above range, the cell physiological activity after encapsulation is low and the growth is very slow. When the cell concentration is higher than the above range, it is difficult to concentrate the cells and it is difficult to supply nutrients to the encapsulated cells.

상기 세포 분산용액은 배양된 세포로부터 회수 및/또는 농축된 세포를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The cell dispersing solution may include, but is not limited to, cells recovered and / or concentrated from the cultured cells.

상기 형성 단계는 혼합 용액에 전압을 걸어주는 단계; 및 가교유도 용액을 첨가하는 단계;를 포함하는 것일 수 있다.Wherein the forming comprises: applying a voltage to the mixed solution; And a step of adding a crosslinking inducing solution.

상기 전압은 1 내지 16 kV, 1 내지 14 kV, 1 내지 12 kV, 1 내지 10 kV, 2 내지 16 kV, 2 내지 14 kV, 2 내지 12 kV, 2 내지 10 kV, 4 내지 16 kV, 4 내지 14 kV, 4 내지 12 kV, 4 내지 10 kV, 6 내지 16 kV, 6 내지 14 kV, 6 내지 12 kV, 6 내지 10 kV, 8 내지 16 kV, 8 내지 14 kV, 8 내지 12 kV 또는 8 내지 10 kV, 예를 들어, 10 kV인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.Wherein the voltage is between 1 and 16 kV, between 1 and 14 kV, between 1 and 12 kV, between 1 and 10 kV, between 2 and 16 kV, between 2 and 14 kV, between 2 and 12 kV, between 2 and 10 kV, between 4 and 16 kV, 14 kV, 4 to 12 kV, 4 to 10 kV, 6 to 16 kV, 6 to 14 kV, 6 to 12 kV, 6 to 10 kV, 8 to 16 kV, 8 to 14 kV, 8 to 12 kV, 10 kV, for example, 10 kV, but is not limited thereto.

상기 가교유도 용액의 첨가는 1 내지 10 mL/h, 1 내지 9 mL/h, 1 내지 8 mL/h, 1 내지 7 mL/h, 1 내지 6 mL/h, 2 내지 10 mL/h, 2 내지 9 mL/h, 2 내지 8 mL/h, 2 내지 7 mL/h, 2 내지 6 mL/h, 3 내지 10 mL/h, 3 내지 9 mL/h, 3 내지 8 mL/h, 3 내지 7 mL/h, 3 내지 6 mL/h, 4 내지 10 mL/h, 4 내지 9 mL/h, 4 내지 8 mL/h, 4 내지 7 mL/h, 4 내지 6 mL/h, 5 내지 10 mL/h, 5 내지 9 mL/h, 5 내지 8 mL/h, 5 내지 7 mL/h 또는 5 내지 6 mL/h의 유량으로 첨가하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 6 mL/h의 유량으로 첨가하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The addition of the crosslinking inducing solution may be carried out at a rate of 1 to 10 mL / h, 1 to 9 mL / h, 1 to 8 mL / h, 1 to 7 mL / h, 1 to 6 mL / h, H, 3 to 8 mL / h, 2 to 8 mL / h, 2 to 7 mL / h, 2 to 6 mL / h, 3 to 10 mL / h, H, 4 to 6 mL / h, 4 to 6 mL / h, 4 to 10 mL / h, 4 to 9 mL / h, 4 to 8 mL / h, h, 5 to 8 mL / h, 5 to 7 mL / h or 5 to 6 mL / h, for example, at a flow rate of 6 mL / h But the present invention is not limited thereto.

상기 가교유도 용액은 염화나트륨(NaCl), 및 염화바륨(BaCl₂), 염화칼슘(CaCl₂) 또는 염화스트론튬을 포함하는 수용액일 수 있다.The crosslinking inducing solution may be an aqueous solution containing sodium chloride (NaCl), and barium chloride (BaCl ₂ ), calcium chloride (CaCl ₂ ), or strontium chloride.

상기 염화나트륨은 0.05 내지 0.3 M, 0.05 내지 0.25 M, 0.05 내지 0.2 M, 0.1 내지 0.3 M, 0.1 내지 0.25 M 또는 0.1 내지 0.2 M의 농도인 것일 수 있으며, 예를 들어, 0.15 M 농도인 것일 수 있다. 상기의 농도 범위가 생리학적으로 세포의 생장과 활성에 적합하며, 상기 농도 범위 밖의 염화나트륨 용액에서는 세포의 활성이 낮아지며 점차 사멸에 이르게 된다.The sodium chloride may have a concentration of 0.05 to 0.3 M, 0.05 to 0.25 M, 0.05 to 0.2 M, 0.1 to 0.3 M, 0.1 to 0.25 M or 0.1 to 0.2 M, for example, a concentration of 0.15 M . The above range of concentration is physiologically suitable for the growth and activity of cells, and the activity of the cells is lowered in the sodium chloride solution outside the concentration range, and the cells are gradually killed.

상기 염화바륨, 염화칼슘 또는 염화스트론튬은 0.01 M 내지 0.1 M, 0.01 M 내지 0.09 M, 0.01 M 내지 0.08 M, 0.01 M 내지 0.07 M, 0.01 M 내지 0.06 M, 0.01 M 내지 0.05 M, 0.01 M 내지 0.04 M 또는 0.01 M 내지 0.03 M의 농도인 것일 수 있으며, 예를 들어, 0.02 M 농도인 것일 수 있다. 가교용액의 농도에 따라서 캡슐의 강도가 달라져, 원하는 분화의 방향에 따라서 가교용액의 농도를 달리할 수 있다. 상기 범위보다 낮은 농도에서는 캡슐 생성이 어려우며, 상기 범위 보다 높은 농도에서는 세포의 생존율이 낮아진다.The barium chloride, calcium chloride or strontium chloride may be used in an amount of 0.01 M to 0.1 M, 0.01 M to 0.09 M, 0.01 M to 0.08 M, 0.01 M to 0.07 M, 0.01 M to 0.06 M, 0.01 M to 0.05 M, 0.01 M to 0.04 M Or a concentration of 0.01 M to 0.03 M, for example, a concentration of 0.02 M. The strength of the capsule varies depending on the concentration of the crosslinking solution, and the concentration of the crosslinking solution can be varied depending on the direction of the desired differentiation. Capsule production is difficult at a concentration lower than the above range, and the cell viability is lowered at a concentration higher than the above range.

상기 형성 단계는 전기방사 장비(electrospraying systems), 이멀전 분산, 스프레이 또는 미세유체 조절시스템(microfluidic systems)을 통해 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 종래 공지된 모든 방법을 이용하여 제조 가능하다.The forming step may be performed through electrospraying systems, emulsion dispersing, spraying, or microfluidic systems, but is not limited thereto and can be manufactured using any method known in the art Do.

상기 형성 단계의 전압 및 유량 조절을 통해 알긴산을 포함하는 마이크로캡슐의 평균 직경을 조절할 수 있다.The average diameter of the microcapsules containing alginic acid can be controlled by controlling the voltage and the flow rate in the forming step.

예를 들어, 상기 마이크로캡슐의 평균 직경은 30 내지 1000 um, 30 내지 900 um, 30 내지 850 um, 30 내지 800 um, 30 내지 7500 um, 30 내지 700 um, 30 내지 650 um, 30 내지 600 um, 30 내지 550 um, 30 내지 500 um, 40 내지 1000 um, 40 내지 900 um, 40 내지 850 um, 40 내지 800 um, 40 내지 7500 um, 40 내지 700 um, 40 내지 650 um, 40 내지 600 um, 40 내지 550 um, 40 내지 500 um, 50 내지 1000 um, 50 내지 900 um, 50 내지 850 um, 50 내지 800 um, 50 내지 7500 um, 50 내지 700 um, 50 내지 650 um, 50 내지 600 um, 50 내지 550 um, 50 내지 500 um , 60 내지 1000 um, 60 내지 900 um, 60 내지 850 um, 60 내지 800 um, 60 내지 7500 um, 60 내지 700 um, 60 내지 650 um, 60 내지 600 um, 60 내지 550 um, 60 내지 500 um 인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.For example, the microcapsules have an average diameter of 30 to 1000 μm, 30 to 900 μm, 30 to 850 μm, 30 to 800 μm, 30 to 7500 μm, 30 to 700 μm, 30 to 650 μm, 30 to 600 μm , 30 to 550 um, 30 to 500 um, 40 to 1000 um, 40 to 900 um, 40 to 850 um, 40 to 800 um, 40 to 7500 um, 40 to 700 um, 40 to 650 um, 50 to 800 mu m, 50 to 7500 mu m, 50 to 700 mu m, 50 to 650 mu m, 50 to 600 mu m, from 40 to 550 um, 40 to 500 um, 50 to 1000 um, 50 to 900 um, 50 to 850 um, , 50 to 550 um, 50 to 500 um, 60 to 1000 um, 60 to 900 um, 60 to 850 um, 60 to 800 um, 60 to 7500 um, 60 to 700 um, 60 to 650 um, 60 to 600 um , 60 to 550 μm, and 60 to 500 μm, but is not limited thereto.

본 발명의 또 다른 일 양태는 다음 단계를 포함하는 줄기세포 삼차원 배양방법에 관한 것이다.Another aspect of the present invention relates to a stem cell three-dimensional culture method comprising the following steps.

알긴산을 포함하는 줄기세포 배양용 마이크로캡슐 준비 단계;Preparing a microcapsule for culturing stem cells containing alginic acid;

마이크로캡슐 내부에 줄기세포를 담지하는 담지 단계; 및A carrying step of carrying stem cells inside the microcapsule; And

줄기세포를 배양하는 배양 단계.A step of culturing stem cells.

상기 마이크로캡슐 준비 단계와 담지 단계는 동시에 이루어질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. The microcapsule preparing step and the supporting step may be performed simultaneously, but the present invention is not limited thereto.

상기 배양 단계는 염화나트륨(NaCl) 용액으로 마이크로캡슐을 세정하는 세정 단계 및 세포 배양액을 넣는 배양액 첨가 단계; 세포 배양접시에 옮기는 단계; 및 세포 배양기에서 배양하는 단계;를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The culturing step may include a washing step of washing the microcapsules with a sodium chloride (NaCl) solution and a culture medium adding a cell culture solution; Transferring to a cell culture dish; And culturing the cells in a cell culture incubator, but the present invention is not limited thereto.

상기 세포 배양액은 기본 세포배양액을 기반으로 FBS, 항생제-항균제(antibiotics-antimycotic)를 첨가한 것일 수 있으며, 예를 들어, MEM-알파 세포배양액에 10 % FBS, 1 % 항생제-항균제인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. The cell culture solution may be FBS, antibiotics-antimycotic, or the like, based on the basic cell culture medium. For example, the cell culture solution may be 10% FBS, 1% antibiotic-antimicrobial agent in MEM- , But is not limited thereto.

본 발명이 지니는 효과는, 생체환경을 모사하는 세포외기질이 부착된 마이크로수화겔에 세포를 담지하여 배양을 함으로써, 세포의 고농도 배양, 빠른 증식 속도의 유도, 세포의 안정적인 역가유지, 회수의 용이성을 향상시켜, 세포의 응용연구 및 임상적용에 필요한 세포의 증식을 효율적이고 안정적으로 구현할 수 있다.The effect of the present invention is that the cells are carried on a microhydroglobulin with an extracellular matrix attached thereto to cultivate the cells, thereby achieving high concentration of cells, induction of rapid proliferation rate, stable maintenance of cell activity, The cell proliferation necessary for cell application research and clinical application can be implemented efficiently and stably.

상기 마이크로캡슐을 이용하여 배양된 세포와 일반 배양법으로 배양된 세포와의 혈당 소모량, 세포의 수를 비교하여 세포의 생장속도를 비교하고, 줄기세포 마커(Stem cell marker)의 발현과 분화능 비교를 통해, 줄기세포의 역가 유지성을 시험하였고, 본 발명의 방법에 의해 효율적으로 중간엽 줄기세포를 배양할 수 있음을 규명하였다.The growth rate of the cells was compared by comparing the blood glucose consumption and the number of cells between the cells cultured using the microcapsules and the cells cultured by the ordinary culture method, and the expression of the stem cell marker (Stem cell marker) , Retention ability of stem cells was tested and it was confirmed that the mesenchymal stem cells can be efficiently cultured by the method of the present invention.

본 발명의 "알긴산을 포함하는 마이크로캡슐"은 알긴산 고분자를 주된 구성성분으로 포함하는 수십 내지 수백 마이크로미터의 평균 직경을 갖는 입자로서, 배양을 위한 세포가 내부에 담지된 상태의 입자를 의미하며, 편의를 위해 간단히 "알긴산 마이크로캡슐" 또는 "알긴산 캡슐"로 기재가능하고, 달리 기재하지 않는 한 모두 동일한 의미를 갖는 것으로 해석된다."Alginic acid-containing microcapsule" of the present invention means particles having an average diameter of several tens to several hundreds of micrometers including alginic acid polymer as a main constituent, For convenience, the term "alginic acid microcapsule" or "alginic acid capsule"

본 발명은 줄기세포를 알긴산 또는 세포외기질 유래의 펩타이드로 변형된 알긴산에 줄기세포를 담지 하는 마이크로캡슐 제조방법과 이의 줄기세포의 고농축 배양, 줄기세포 생장 속도 증대, 안정적인 활성유지, 회수에 관한 방법에 관한 것으로서 보다 상세하게는 줄기세포를 삼차원으로 배양할 수 있는 마이크로 크기의 캡슐구조를 알긴산 또는 세포외기질 유래의 펩타이드로 변형된 알긴산으로 형성하여, 일반적으로 사용되는 배양접시를 이용하는 이차원 배양에서보다 공간적, 시간적 효율성 증대, 세포 활성, 대량생산이 가능한 효율적 배양을 할 수 있다.The present invention relates to a method for producing microcapsules in which stem cells are carried on alginic acid modified with alginic acid or a peptide derived from an extracellular matrix, a method for culturing stem cells at high concentration, a method for increasing stem cell growth rate, More specifically, the present invention relates to a method of forming a micro-sized capsule structure capable of culturing stem cells three-dimensionally in alginic acid modified with alginic acid or a peptide derived from an extracellular matrix, It is possible to efficiently cultivate the cells, which can increase spatial and temporal efficiency, cell activity, and mass production.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 줄기세포의 고효율 생체모사 3차원 배양의 과정 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 알긴산 캡슐에 배양된 세포를 광학현미경으로 관찰한 사진이다.
도 3는 본 발명의 일 실시예에 따른 알긴산 캡슐에 배양된 세포를 광학현미경으로 관찰한 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 알긴산 캡슐에 배양된 세포를 Live/dead 염색하여 관찰한 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 일반적인 2차원 배양과 세포외기질 유래의 펩타이드로 치환된 알긴산에 담지 된 세포의 포도당 변화 및 소모량을 비교한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예예 따른 두 배양방법에서 회수된 세포의 수를 비교한 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 산화스트레스 하에서의 알긴산 캡슐에 담지 된 세포의 Live/dead 염색하여 관찰한 사진이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 산화스트레스 하에서의 알긴산 캡슐에 담지 된 세포의 Live/dead 염색하여 관찰한 그래프이다.FIG. 1 is a process diagram of high-efficiency biomimetic three-dimensional culture of stem cells according to an embodiment of the present invention.
FIG. 2 is a photograph of a cell cultured in an alginate capsule according to an embodiment of the present invention by an optical microscope. FIG.
FIG. 3 is a photograph of a cell cultured in an alginate capsule according to an embodiment of the present invention by an optical microscope.
FIG. 4 is a photograph of cells incubated in an alginate capsule according to an embodiment of the present invention, observed by Live / dead staining.
FIG. 5 is a graph comparing changes in glucose and consumption of cells loaded with alginic acid substituted with a peptide derived from an extracellular matrix in a general two-dimensional culture according to an embodiment of the present invention.
6 is a graph comparing the number of cells recovered in the two culturing methods according to one embodiment of the present invention.
FIG. 7 is a photograph showing live / dead staining of cells carried on alginate capsules under oxidative stress according to an embodiment of the present invention. FIG.
8 is a graph showing live / dead staining of cells carried on alginate capsules under oxidative stress according to an embodiment of the present invention.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, these examples are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited by these examples.

실시예 1. 세포외기질 유래의 펩타이드의 알긴산 부착Example 1 Alginate attachment of peptides derived from extracellular matrix

MES(2-(N-모르폴리노)에테인설폰산) 버퍼를 0.2 M로 희석한 뒤, 0.3 M 농도의 염화나트륨(NaCl)을 첨가하고 pH를 6.5로 적정하였다. 알긴산을 상기 버퍼에 1 중량%로 녹인 후, EDC(1-ethyl-3-(-3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride)와 NHS(N-hydroxysulfosuccinimide) 반응을 유도하기 위해 NHS와 EDC를 1:2 몰비로 넣어주었다. 그 다음, 알긴산 1g 당, 22 umol의 펩타이드를 넣어주고 24시간 동안 저어준 뒤, 3500 Da 사이즈의 멤브레인을 이용하여 4일 간 투석을 진행한 뒤 동결건조 시켰다. 알긴산에 세포의 인테그린과 상호작용할 수 있는 세포외기질 유래의 펩타이드를 EDC/NHS 반응을 통해 화학적으로 부착하였다.MES (2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid) buffer was diluted to 0.2 M, and then 0.3 M sodium chloride (NaCl) was added and the pH was titrated to 6.5. Alginic acid was dissolved in the buffer in an amount of 1 wt%, NHS and EDC were mixed at a 1: 2 molar ratio to induce NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) reaction with EDC (1-ethyl-3- (3- dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride) I put it. Then, 22 ol mol of peptide was added per 1 g of alginic acid, and the mixture was stirred for 24 hours. Then, dialysis was performed for 4 days using a membrane of 3500 Da size, followed by lyophilization. The peptides derived from extracellular matrix capable of interacting with integrins of cells to alginate were chemically attached via EDC / NHS reaction.

실시예 2. 줄기세포 담지된 알긴산 캡슐 제작Example 2. Production of stem cell-supported alginate capsule

증류수에 1.25 중량% 농도의 알긴산염 또는 세포외기질 유래의 펩타이드 (알지닌-글라이신-아스파르트산 (RGD))로 치환된 알긴산염을 첨가하여 알긴산 용액을 제조하고, 0.2 um 사이즈의 주사기 필터를 이용하여 필터링 하였다. 그 다음, 75 cm²의 플라스틱 세포배양접시에 세포를 4,000 내지 5000/cm²으로 접종한 뒤, 90 % 정도의 면적에 세포가 증식되었을 때, 배양된 세포를 0.05% 트립신-EDTA로 처리 후 1000 rpm에서 10분간 원심 분리하여, 마지막 세포의 농도가 1.0 X 10⁶ 세포/mL이 되도록 알긴산 용액과 1:4 부피비로 혼합하여 혼합용액을 제조하였다. An alginate solution was prepared by adding alginate to the distilled water at a concentration of 1.25% by weight or an alginate substituted with an peptide derived from an extracellular matrix (arginine-glycine-aspartic acid (RGD)) and using a 0.2 μm sized syringe filter Respectively. Then, cells were inoculated in a plastic cell culture dish of 75 cm ² at 4,000-5,000 / cm ^2, and when the cells were grown in an area of about 90%, the cultured cells were treated with 0.05% trypsin-EDTA, rpm for 10 minutes and mixed with alginic acid solution at a volume ratio of 1: 4 so that the final cell concentration would be 1.0 × 10 ⁶ cells / mL.

그 다음, 증류수에 0.15 M 농도의 염화나트륨(NaCl)과 0.02 M 농도의 염화바륨(BaCl₂)을 첨가하여 알길산 용액의 가교유도 용액을 제조하였다. Then, 0.15 M sodium chloride (NaCl) and 0.02 M barium chloride (BaCl ₂ ) were added to distilled water to prepare a crosslinking inducing solution of the alginic acid solution.

상기 혼합용액을 전기방사 장비를 이용하여 원하는 캡슐의 크기에 따라 1 내지 16 kV의 일정한 전압을 걸어주고, 가교유도 용액에 1 내지 10 mL/h의 정한 속도로 떨어지면서 이온성 가교결합이 일어나도록 유도하여, 내부에 세포가 담지 된 수화겔 캡슐을 제조하였다. The mixed solution is applied with a constant voltage of 1 to 16 kV according to the size of a desired capsule using an electrospinning apparatus, and the ionic cross-linking is carried out at a fixed rate of 1 to 10 mL / h in the crosslinking inducing solution To prepare a hydrogel capsule in which cells were carried.

공급된 전압과 유량(flow rate)에 따라 만들어지는 캡슐의 사이즈가 달라질 수 있으며, 500 um 보다 작은 사이즈의 캡슐이 만들어 지도록 27 G의 노즐을 이용하여 공급전압을 10 kV, 유량을 6 mL/h로 조절하였다. 상기 형성된 캡슐을 0.15 M 농도의 염화나트륨(NaCl) 용액으로 충분히 세정 후, 세포 배양액을 넣고 세포 배양접시에 옮긴 뒤 세포 배양기에서 배양하였다.The size of the capsules made according to the supplied voltage and flow rate can be varied. The supply voltage is 10 kV and the flow rate is 6 mL / h Lt; / RTI > The formed capsules were thoroughly washed with a 0.15 M sodium chloride solution, transferred to a cell culture dish, and cultured in a cell culture dish.

실시예 3. 배양액의 포도당 소모량 및 소모속도 비교Example 3. Comparison of Glucose Consumption and Consumption Rate of Culture Medium

본 발명의 방법(실시예)과 2차원 배양(비교예)에서 세포의 생장을 비교하였다. 구체적으로, 탯줄 유래의 인간중간엽 줄기세포 또는 상기 세포를 담지한 캡슐을 75 cm²의 플라스틱 플레이트에 배양하고 각각 동일한 배지 10 mL를 넣어 처음 48시간 동안 소모량 및 소모속도를 비교하였다.The cell growth was compared between the method of the present invention (example) and the two-dimensional culture (comparative example). Specifically, human umbilical cord mesenchymal stem cells or capsules carrying the cells were cultured on a plastic plate of 75 cm ² , and 10 mL of the same medium was added to each other to compare the consumed amount and the consumed rate for the first 48 hours.

넣어준 직후의 포도당량과 시간에 따른 변화를 관찰하여, 2차원 배양에서는 처음에 세포의 유도기(lag phase)처럼 포도당량의 소모량에 큰 변화가 없었고, 약 24 시간이 지난 시점에서부터 감소경향이 나타나기 시작하였다. 그에 반해 세포를 담지한 캡슐에서는 배양액 소모가 배양이 되면서 바로 시작되는 것을 확인할 수 있었다.Observation of changes in glucose amount and time immediately after inserting showed that there was no significant change in the amount of glucose consumed in the two-dimensional culture as in the case of the cell lag phase at first, and a decreasing tendency was observed after about 24 hours . On the other hand, it was confirmed that the capsules containing the cells started to be consumed immediately after culturing.

줄기세포의 효과적인 배양을 위해 세포를 세포외기질 유래의 펩타이드가 부착된 알긴산으로 전기스프레잉 시스템을 이용하여 마이크로캡슐화를 진행하였다.For the effective culture of stem cells, the cells were microencapsulated with alginic acid with peptides derived from extracellular matrix using an electric spraying system.

도 2 내지 4에서 확인할 수 있듯이, 캡슐화 전 후에 줄기세포의 생존율이 Live/dead 형광 염색을 하고, 이로부터 살아있는 세포 (녹색)와 죽은 세포 (빨간색)의 개수를 세고 통계를 내었을 때 활성을 가지는 세포의 비율이 90 %이상 유지됨을 확인 하였다. As can be seen in Figs. 2 to 4, the survival rate of stem cells after the encapsulation is subjected to Live / dead fluorescence staining, from which the numbers of living cells (green) and dead cells (red) Cell ratio was maintained at 90% or more.

기존의 배양플라스크에서의 2차원 배양법과는 달리 본 발명의 3차원 담지는 공간적으로 고밀도, 고효율 배양으로 세포의 대사과정을 활성화시킬 수 있다. 이에, 세포의 생장에 필수적인 배양액 내의 포도당의 농도를 관찰하여, 줄기세포의 대사과정을 비교하여, 그 결과를 도 5 및 표 1에 나타내었다.Unlike the two-dimensional culture method in conventional culture flasks, the three-dimensional deposition of the present invention can activate the metabolic processes of cells by spatially high density and high efficiency culture. Thus, the glucose concentration in the culture medium required for cell growth was observed, and the metabolic processes of the stem cells were compared. The results are shown in FIG. 5 and Table 1.

2D culture
(비교예)2D culture
(Comparative Example) 3D culture
(실시예)3D culture
(Example) Total glucose consumption for 48 hours (mg/dL)Total glucose consumption for 48 hours (mg / dL) 12.5 mg/dL12.5 mg / dL 88.5 mg/dL88.5 mg / dL

도 5에서 확인할 수 있듯이, 비교예는 접종 배양 후 초기 48시간 동안 포도당 12.5 mg/dL를 소모하였고, 실시예는 88.5 mg/dL를 소모하였으며, 실시예가 비교예에 비해 7배 정도의 빠른 포도당 소모를 보임을 확인하였다. 즉, 비교예는 48시간을 주기로 배지를 교환하여야 했으나, 실시예는 배양 배지 내 포도당이 빠르게 감소하여 약 5 내지 6시간 주기로 배양액을 교환하여야 했다.As can be seen in FIG. 5, the comparative example consumed 12.5 mg / dL of glucose for the initial 48 hours after the inoculation, the example consumed 88.5 mg / dL, and the example consumed 7 times faster glucose Respectively. That is, in the comparative example, the culture medium had to be changed every 48 hours, but in the example, glucose in the culture medium rapidly decreased and the culture medium had to be changed every 5 to 6 hours.

실시예 4: 알긴산 마이크로겔에 배양된 줄기세포 회수Example 4: Recovery of Stem Cells Cultured in Alginic Acid Microgel

50 mM EDTA를 생리식염수 ((pH 7) 기반으로 제조하여 알긴산의 탈가교(decrosslinking)에 이용하였다. 줄기세포가 포함된 캡슐에 상기 EDTA 용액을 첨가하여 37도에서 3~4분간 배양하여, 알긴산 캡슐이 충분히 탈가교(decrosslinking)되는 것을 확인할 수 있었다. 이후 용액을 원심분리를 이용하여 상층액을 제거하고 줄기세포 펠렛을 용이하게 얻을 수 있었으며, 생리식염수로 몇 번 세척해 준 뒤 줄기세포를 분산하여 배양, 보관, 응용을 진행하였다.50 mM EDTA was prepared based on physiological saline (pH 7) and used for decrosslinking of alginic acid. The capsules containing stem cells were added with the EDTA solution and cultured at 37 ° C for 3 to 4 minutes, After centrifuging the solution, the supernatant was removed and the stem cell pellet was easily obtained, and after washing several times with physiological saline, the stem cells were dispersed And cultured, stored and applied.

줄기세포가 알긴산에 내부에 담지되어 있어, 일반적으로 이용되는 트립신과 같은 효소의 사용 없이 알긴산을 EDTA용액으로 간단히 탈가교(decrosslinking)시키고 세포를 회수할 수 있었다. 이때, 생리식염수로 세척하여 알긴산과 EDTA성분을 제거할 수 있었다.Since stem cells are carried in alginic acid, it is possible to simply decrosslink the alginic acid to the EDTA solution and recover the cells without using an enzyme such as commonly used trypsin. At this time, alginic acid and EDTA components could be removed by washing with physiological saline solution.

실시예 5. 세포 담지 및 생장 속도Example 5. Cell Loading and Growth Rate

기존의 배양플라스크에서의 2차원 배양법과는 달리 본 발명의 세포외기질 펩타이드를 포함하는 수화겔 내의 3차원 담지 및 배양은 공간적으로 고밀도 배양, 세포 생장의 촉진이 가능하였다. 담지 전의 세포와 계대배양 중에 얻어진 줄기세포 수를 비교하여 세포 생장 속도와 증폭 비율을 비교하여, 그 결과를 도 6 및 표 2에 나타내었다. In contrast to the two-dimensional culture method in conventional culture flasks, the three-dimensional deposition and culture in the hydrogel containing the extracellular matrix peptide of the present invention enabled spatially high-density cultivation and cell growth promotion. The cell growth rate and the amplification rate were compared by comparing the number of stem cells obtained during the subculture with the number of stem cells obtained before the carrying, and the results are shown in FIG. 6 and Table 2.

2D culture
(비교예)2D culture
(Comparative Example) 3D culture
(실시예)3D culture
(Example) Day 0
(세포수 / ml)Day 0
(Number of cells / ml) 3.0 x 10⁵ 3.0 x 10 ⁵ 3.0 x 10⁶ 3.0 x 10 ⁶ Day 5
(세포수 / ml)Day 5
(Number of cells / ml) 2.4 x 10⁵ 2.4 x 10 ⁵ 3.0 x 1073.0 x 107

도 6 및 표 2에서 확인할 수 있듯이, 기존 배양플라스크에서의 2차원 배양은 초기 3 x 10⁵ 세포/mL의 농도로 접종하여 5일 후 약 3 x 10⁶ 세포/mL의 줄기세포를 얻을 수 있어, 2.2 일의 배가 시간(doubling time)을 보이는 것에 비해, 3차원 배양시에는 3 x 10⁶ 세포/mL의 농도로 초기배양이 가능하여 2일 후에 7 x 10⁶ 세포/mL의 줄기세포를 회수하였다. 이는, 초기 농도 기준으로 10배의 고밀도 배양이 가능한 것이며, 본 발명의 배양방법에 의해 배가 시간이 0.81 일로 2~3배 빠른 생장속도를 나타내었다.As can be seen from FIG. 6 and Table 2, the two-dimensional culture in the conventional culture flask was inoculated at an initial concentration of 3 × 10 ⁵ cells / mL, and after 5 days, about 3 × 10 ⁶ cells / mL of stem cells could be obtained , 2.2 days of doubling time. In 3-D culture, initial cultivation was possible at a concentration of 3 × 10 ⁶ cells / mL. After 2 days, 7 × 10 ⁶ cells / mL of stem cells were recovered Respectively. This is because it is possible to cultivate 10 times as high density as the initial concentration, and the growth rate is 2 to 3 times as fast as 0.81 days by the culture method of the present invention.

실시예 6. 산화스트레스 환경에서의 활성 시험Example 6. Activity test in an oxidative stress environment

알긴산 또는 세포외기질 유래의 펩타이드로 치환된 알긴산에 줄기세포를 마이크로캡슐화 한 뒤, 초기 하루 동안 일반 배양액에서 배양한 후, 과산화수소를 첨가하여 100 uM, 200 uM, 400 uM, 800 uM 등 H₂O₂ 농도가 배양액에 되도록 하여, 줄기세포를 과산화수소에 노출시키고, 24시간 뒤에 세포의 생존율을 확인하기 위해 Live/dead 염색을 하고 현미경으로 관찰하여, 그 결과를 도 7 내지 8 및 표 3에 나타내었다.Stem cells were microencapsulated in alginic acid substituted with alginic acid or peptides derived from an extracellular matrix, and then cultured in a normal culture medium for the first day. Then, hydrogen peroxide was added thereto, and H ₂ O ₂ was exposed to hydrogen peroxide. After 24 hours, stem cells were exposed to hydrogen peroxide, followed by Live / dead staining to observe cell viability, and observed with a microscope. The results are shown in FIGS. 7 to 8 and Table 3 .

H2O2 conc. (uM)H2O2 conc. (uM) 00 100100 200200 400400 800800 10001000 15001500 20002000 Viability (%)Viability (%) 99.9499.94 99.5399.53 9.279.27 96.6196.61 77.577.5 78.5978.59 64.0564.05 53.5453.54

도 7 내지 8 및 표 3에서 확인할 수 있듯이, 줄기세포의 배양 시, 외부환경의 변화에 따라 활성산소종과 같은 산화스트레스를 포함한 세포 활성에 악영향을 줄 수 있는 위험이 있다. 알긴산을 이용한 3차원 배양과 세포외기질 펩타이드가 부착된 알긴산의 사용으로 세포의 자가세포사멸 기작을 저감해줄 수 있는 신호를 보강하여 주어, 배양 중 줄기세포의 활성 (viability) 유지능을 향상시킬 수 있음을 확인하였다. 배양 중 과산화수소를 배양액에 첨가하여 산화스트레스 환경을 유도하였을 때에, 알긴산 또는 RGD 펩타이드가 부착된 알긴산을 이용하여 마이크로캡슐화로 배양한 줄기세포의 활성이 기존 플라스크에서 배양되는 줄기세포보다 우수한 활성 유지를 나타내었고, 세포외기질 펩타이드가 부착된 알긴산에서 배양 시 보다 우수한 결과를 나타내었다. 이는 3차원 배양, 하이드로젤의 의한 세포부분의 연성환경 구현, 국부적 고밀도 줄기세포배양, 세포외기질 펩타이드를 이용한 세포 내 활성유지 신호전달 체계의 활성화에 의한 것으로 판단된다.As shown in FIGS. 7 to 8 and Table 3, when stem cells are cultured, there is a risk of adversely affecting cell activity including oxidative stress such as reactive oxygen species according to changes in the external environment. Three-dimensional culture using alginate and alginate with an extracellular matrix peptide reinforce signals that can reduce the cell's self-apoptotic mechanism, thereby improving viability of the stem cells during culture Respectively. When the oxidative stress environment was induced by adding hydrogen peroxide to the culture medium during the culture, the activity of the stem cells cultured by microencapsulation with alginic acid or RGD peptide-adhered alginic acid was superior to the stem cells cultured in the conventional flask And showed better results when incubated with alginic acid with extracellular matrix peptide. It is considered that this is due to the activation of three - dimensional culture, the ductile environment of cell part by hydrogel, culture of localized high - density stem cell, and activation system of cellular activity using extracellular matrix peptide.

Claims

Microcapsules for cell culture containing alginic acid.

The microcapsule for cell culture according to claim 1, wherein the alginic acid is substituted with a peptide derived from an extracellular matrix.

The cell culture microcapsule according to claim 2, wherein the extracellular matrix-derived peptide is at least one selected from the group consisting of RGD motif, DGEA motif, REDV motif, IKVAV motif, VPGVG motif, YIGSR motif and KHIFSDDSSE motif. .

The microcapsule for cell culture according to claim 1, wherein the microcapsules have an average diameter of 30 to 1000 μm.

2. The microcapsule for cell culture according to claim 1, wherein the cell is a stem cell.

The stem cell according to claim 5, wherein the stem cell is at least one selected from the group consisting of mesenchymal stem cells, blood stem cells, neural stem cells, muscle stem cells, myocardial stem cells, embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells Microcapsules for cell culture.

The microcapsule for cell culture according to claim 1, wherein the microcapsules for cell culture carry cells.

A method for preparing microcapsules comprising alginic acid comprising the steps of:
A step of preparing an alginic acid solution to prepare an alginic acid solution;
Mixing a cell dispersion solution and an alginic acid solution to prepare a mixed solution;
Formation steps to form microcapsules.

9. The method according to claim 8, wherein the alginic acid is substituted with a peptide derived from an extracellular matrix.

[Claim 11] The method according to claim 9, wherein the extracellular matrix-derived peptide is at least one selected from the group consisting of RGD motif, DGEA motif, REDV motif, IKVAV motif, VPGVG motif, YIGSR motif and KHIFSDDSSE motif.

9. The method of claim 8, wherein the alginic acid solution comprises from 0.1 to 10% by weight of alginate.

9. The method of claim 8, wherein the mixed solution is prepared by mixing a cell dispersion solution and an alginic acid solution in a volume of 1: 4.

9. The method of claim 8, wherein the concentration of the cells contained in the mixed solution is 1.0 x 10 < ⁶ > cells / mL.

9. The method of claim 8, wherein the cell is a stem cell.

15. The method according to claim 14, wherein the stem cells are at least one selected from the group consisting of mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, neural stem cells, muscle stem cells, myocardial stem cells, embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells.

9. The method of claim 8, wherein the forming is performed with electrospraying systems, emulsion dispersion, spray, or microfluidic systems.

The method of claim 8, wherein the microcapsules have an average diameter of from 30 to 1000 μm.

A cell-based three-dimensional culture method comprising the steps of:
Preparing microcapsules for cell culture containing alginic acid;
A carrying step of carrying cells inside the microcapsule; And
A culture step in which the cells are cultured.

19. The method according to claim 18, wherein the microcapsule preparation step and the supporting step are performed simultaneously.

14. The method according to claim 13,
A cleaning step of cleaning the microcapsules with a sodium chloride (NaCl) solution;
Adding a culture medium containing a cell culture solution;
Transferring to a cell culture dish; And
Culturing in a cell culture incubator;
/ RTI > cell culture method, wherein the cell culture method comprises the steps of: