KR20180042142A - Novel peptide and use thereof - Google Patents

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KR20180042142A
KR20180042142A KR1020170134647A KR20170134647A KR20180042142A KR 20180042142 A KR20180042142 A KR 20180042142A KR 1020170134647 A KR1020170134647 A KR 1020170134647A KR 20170134647 A KR20170134647 A KR 20170134647A KR 20180042142 A KR20180042142 A KR 20180042142A
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peptide
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rage
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이민형
이다희
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한양대학교 산학협력단
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Abstract

The present invention relates to a novel peptide and uses thereof, and more particularly, to a peptide having cell permeability, anticancer and/or anti-inflammatory activity and cell protection activity simultaneously under hypoxic conditions, a gene carrier containing the peptide, and a complex for gene therapy. The peptide of the present invention effectively inhibits a signal transduction system mediated by RAGE to have anticancer and anti-inflammatory therapeutic activity, and has an activity of preventing or treating ischemic diseases. Moreover, when the peptide of the present invention is used as a gene carrier, high efficiency of intracellular gene transfer and gene transfer to the nucleus is exhibited, and at the same time therapeutic effect on the peptide itself is exhibited, thereby having an excellent effect while being used as a medicine for gene therapy.

Description

신규 펩타이드 및 이의 용도{NOVEL PEPTIDE AND USE THEREOF}NOVEL PEPTIDE AND USE THEREOF < RTI ID = 0.0 >

본 발명은 신규 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 세포투과성, 항암 및/또는 항염 활성, 저산소 조건에서 세포보호 활성을 동시에 갖는 펩타이드, 이를 포함하는 유전자 전달체 및 유전자 치료용 복합체에 관한 것이다.The present invention relates to a novel peptide and its use, and more particularly to a peptide having cell permeability, anticancer and / or anti-inflammatory activity and cell protection activity simultaneously under hypoxic conditions, a gene carrier containing the peptide, and a complex for gene therapy.

최종당화산물 수용체(receptor for advanced glycation endproducts, RAGE)란 면역글로불린 계열의 막투과 단백질로서, 최종당화산물과 결합하는 능력을 보유한다. 또한, 최종당화산물(advanced glycation endproducts, AGE)은 체내 또는 체외에서 생성되며, 당화 반응(glycation)에 의해서 당류가 단백질과 결합함으로써 생성된다. 최종당화산물은 당뇨, 동맥경화, 만성 신장질환 및 알츠하이머병 등과 같은 다양한 퇴행성 질환의 발병 및 악화에 관여하는 핵심적 물질이며, 또한 노화 및 노화관련 질병들에도 폭 넓게 관여하는 것으로 알려져 있다.A receptor for advanced glycation endproducts (RAGE) is an immunoglobulin-based transmembrane protein that possesses the ability to bind to the final glycation end product. In addition, advanced glycation endproducts (AGEs) are produced in the body or in vitro, and are produced by the glycation of saccharides by binding to proteins. The final glycation products are a key substance involved in the onset and aggravation of various degenerative diseases such as diabetes, atherosclerosis, chronic kidney disease and Alzheimer's disease, and are widely known to be involved in aging and aging-related diseases.

수용체인 RAGE와 그에 대한 리간드인 AGE 사이의 상호작용은 염증관련 유전자들의 활성화를 촉진하는 것으로 잘 알려져 있으며(Nawroth PP et al., Diabetes-associated sustained activation of the transcription factor nuclear factor-kappaB, Diabetes 50(12): 2792-2808), 당뇨병 환자 등 다양한 환자군에서 RAGE의 수준이 높게 관찰되는 것으로부터, RAGE가 이러한 질병들에서 염증 유발에 핵심적인 역할을 수행하는 것으로 보고되고 있고, 더 나아가 일부 암들의 발병에도 관여하는 것으로 알려져 있다.The interaction between the receptor RAGE and its ligand, AGE, is well known to promote activation of inflammatory genes (Nawroth PP et al., Diabetes-associated sustained activation of the transcription factor nuclear factor-kappaB, Diabetes 50 12): 2792-2808), and RAGE levels are high in various patient groups such as diabetic patients, RAGE has been reported to play a key role in inflammation induction in these diseases, and furthermore, Is also known to be involved.

따라서, RAGE에 의한 다양한 질병 발병을 억제하기 위한 노력의 일환으로서, RAGE에 결합함으로써 RAGE에 의한 신호전달과정을 억제하기 위한 연구들이 보고된 바 있다. 예를 들어, 대한민국 공개특허공보 제2013-0082474호에서는, RAGE의 막투과 도메인 및 세포질 도메인이 결여된 sRAGE(가용성 RAGE)를 사용하여 이를 유효성분으로 포함하는 심근염 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하고자 하였다. 또한, RAGE에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하는 기술도 공지된 바 있다(예를 들어, 항-RAGE 항체로서, abcam사로부터의 제품명 ab89911 항체).Thus, as part of efforts to suppress the onset of various diseases caused by RAGE, studies have been reported to inhibit RAGE-mediated signal transduction by binding to RAGE. For example, Korean Patent Laid-Open Publication No. 2013-0082474 discloses a pharmaceutical composition for preventing or treating myocarditis comprising sAGE (soluble RAGE) lacking the transmembrane domain and cytoplasmic domain of RAGE as an active ingredient . In addition, techniques using an antibody that specifically binds RAGE are also known (for example, as anti-RAGE antibody, ab89911 antibody from abcam).

그러나, 전술한 기술들은 큰 분자량을 갖는 거대 단백질들에 기반한 것으로서, 상대적으로 그 안정성이 떨어질 뿐만 아니라, 동물 세포에서 생산을 수행하여야 하는 특성상 생산성도 매우 떨어진다는 문제점을 갖는다. 또한, 전술한 기술들은 모두 RAGE의 신호전달과정만을 억제하기 위한 것으로서, 단백질 치료제로서의 기능 이외에 다른 기능을 보유하고 있지 않다.However, the above-described techniques are based on large proteins having large molecular weights, and they have a problem that their stability is relatively lowered, and productivity is also very low due to the characteristics of production in animal cells. In addition, all of the above-mentioned techniques are intended to suppress only the signal transduction of RAGE and do not have any other function than the protein therapeutic agent.

관련하여, 대한민국 공개특허공보 제2011-0136504호에서는 RAGE 수용체 표적 펩타이드에 뇌질환 치료제 또는 뇌질환 진단시약을 결합시킴으로써, 뇌질환 치료제 등의 뇌로의 이행을 촉진하기 위한 유전자 치료용 복합체를 개시하고 있다. 그러나, 이러한 기술 역시 RAGE 수용체 표적 펩타이드를 약물 운반체로 사용할 수 있다는 가능성만을 제시하고 있을 뿐, 안정적인 복합체 형성을 위한 기반기술을 제시하고 있지는 못한 실정이다.Korean Patent Laid-Open Publication No. 2011-0136504 discloses a complex for gene therapy for promoting the transition to the brain of a brain disease treatment agent or the like by binding a therapeutic agent for brain disease or a diagnostic agent for brain disease to a RAGE receptor target peptide . However, this technique also shows the possibility that RAGE receptor target peptide can be used as a drug carrier, and does not provide a base technology for stable complex formation.

이에, 효과적으로 RAGE 리간드의 결합을 막아 RAGE 신호전달과정 억제를 도모할 뿐만 아니라, 대상 질병을 효과적으로 치료할 수 있는 질병 치료용 유전자를 부가적으로 도입하여 복합적 치료 효과를 야기하고, 더 나아가 최종 복합체의 안정성을 획기적으로 개선하기 위한 연구/개발이 시급한 실정이다.Thus, it is possible to effectively inhibit the binding of the RAGE ligand to inhibit the RAGE signal transduction process, and to additionally introduce a disease-treating gene capable of effectively treating the target disease, resulting in a combined therapeutic effect. Further, Research and development is urgently needed to dramatically improve the quality of life.

본 발명은 상기 문제점을 해결하고자 하는 것으로, RAGE에 의해서 매개되는 신호전달 체계를 효과적으로 방해하여 항암 및 항염 활성을 가지며, RAGE 결합 및 엔도시토시스에 의하여 세포막을 투과할 수 있고, 세포핵으로 유입 효율이 우수한 펩타이드에 관한 것이다.It is an object of the present invention to solve the above problems, and it is an object of the present invention to provide a medicament for effectively inhibiting the signal transduction system mediated by RAGE and having anticancer and anti-inflammatory activity, permeability of the cell membrane by RAGE binding and endocytosis, It relates to excellent peptides.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드가 더욱 우수한 핵지향성을 가지는바 유전자를 세포핵으로 효과적으로 전달할 수 있는 유전자 전달체 및 유전자 치료를 위한 복합체에 관한 것이다.The present invention also relates to a gene carrier and a complex for gene therapy which are capable of effectively transferring a gene having a nuclear orientation to the nucleus, more effectively, into the nucleus of the peptide.

이에, 본 발명은 상기 과제를 해결하기 위해,Accordingly, in order to solve the above problems,

서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 제공한다.A peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 염증 또는 암 치료용 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for treating inflammation or cancer comprising the peptide.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 허혈성 질환 치료용 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for treating ischemic diseases comprising the peptide.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 유전자 전달체를 제공한다.The present invention also provides a gene carrier comprising the peptide.

또한, 본 발명은 상기 유전자 전달체를 포함하는 유전자 전달용 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for gene transfer comprising the gene carrier.

또한, 본 발명은 상기 유전자 전달체를 포함하는 유전자 전달용 조성물을 제공한다. The present invention also provides a composition for gene transfer comprising the gene carrier.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드 및 유전자를 포함하는 유전자 치료용 복합체를 제공한다. The present invention also provides a gene therapy complex comprising the peptide and the gene.

또한, 본 발명은 상기 복합체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.The present invention also provides a pharmaceutical composition comprising the complex.

본 발명의 펩타이드는 RAGE에 의해 매개되는 신호전달 체계를 효과적으로 저해하여 허혈성 질환과 항암 및 항염에 대한 치료 활성을 가지고, 상기 펩타이드를 유전자 전달체로 활용하는 경우 세포 내 유전자 전달 및 세포핵으로 유전자의 전달 효율 높음과 동시에 RAGE 수용체 결합하여 펩타이드 자체의 치료효과를 함께 가지므로, 상기 펩타이드를 포함한 치료제로서 우수한 효과를 갖는다.The peptide of the present invention effectively inhibits the signal transduction system mediated by RAGE and has therapeutic activity against ischemic diseases, anti-cancer and anti-inflammation. When the peptide is used as a gene carrier, And RAGE receptor binds simultaneously with the peptide. Therefore, it has an excellent effect as a therapeutic agent containing the peptide.

도 1a, 도 1b 및 도 1c는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 RAGE 결합 펩타이드의 발현 및 정제 결과를 나타내는 것으로, 1a는 본 발명 펩타이드를 발현하는 벡터의 구조를 나타내고, 1b는 니켈 킬레이트 친화 크로마토그래피를 이용한 정제의 프로필을 나타내며, 1c는 박테리아(레인 1) 용출물과 정제된 RBP 펩타이드(레인 2)의 겔 분석 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 RAGE 결합 펩타이드 및 양이온 고분자의 복합체를 형성하는 반응식을 나타낸다.
도 3a, 3b 및 3c는 본 발명의 펩타이드, 펩타이드-가교제, 펩타이드-양이온 고분자의 물리적 특성을 비교한 결과를 나타낸다.
도 4a 및 4b는 본 발명의 펩타이드-양이온 고분자 결합체의 세포 독성 결과를 확인한 것으로, 4a는 뇌종양 세포 C6, 4b는 폐표피세포 L2에 대한 세포독성 결과를 나타낸다. PEI(또는 PEI 1:1)는 DNA와 PEI 질량비가 1:1 인 경우를 의미하고, PEI-RBP 1:2, 1:3, 1:4 또는 1:5는 DNA와 PEI-RBP 질량비가 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 또는 1:5 임을 의미한다.
도 5a, 5b 및 5c는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 펩타이드 및 펩타이드 복합체의 물리적 특성을 나타낸다. x축에서 PEI는 DNA와 PEI 1:1 (질량비)를 의미하고, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 또는 1:5는 DNA와 PEI-RBP 질량비가 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 또는 1:5 임을 의미한다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 펩타이드 복합체의 유전자 전달 효율을 나타낸다. PEI 1:1은 DNA와 PEI의 1:1 질랑비 처리군을 의미하고, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:7 또는 1:9는 각각 DNA와 PEI-RBP 질량비 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:7 또는 1:9 처리군을 의미한다.
도 7a 및 7b는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 펩타이드 복합체의 RAGE가 과발현 상태에서 전달 효율을 나타낸다. DNA는 전달대상 유전물질, 도 7a에서 PR4는 본 발명의 RBP-PEI 복합체를 의미한다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 펩타이드의 RAGE 수용체 결합여부를 확인한 결과를 나타낸다. PEI는 PEI 단독 처리군, PEI-RBP는 RBP를 선처리 하지 않고 PEI-RBP/DNA 복합체를 처리한 처리군을 의미하며, +RBP/PEI-RBP는 RBP를 먼저 세포에 처리하여, RAGE와 우선 결합시키고 PEI-RBP/DNA 복합체를 처리한 처리군을 의미한다.
도 9a, 9b, 9c 및 9d는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 펩타이드의 항염증 효과를 염증성 사이토카인 감소 여부로 확인한 결과를 나타낸다. Control은 아무 처리도 하지 않은 대조군이고, LPS는 LPS에 의한 염증 유발군(염증 유발 후 아무 처리도 하지 않은 대조군), 1㎍, 3㎍ 또는 5 ㎍는 LPS로염증 유발하고 RBP 펩타이드 1㎍, 3㎍ 또는 5 ㎍을 처리한 처리군을 의미한다.
도 10a, 10b 및 10c 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 펩타이드의 항염증 효과를 폐세척액 내의 염증성 사이토카인 변화로 확인한 결과를 나타낸다. Control은 아무 처리도 하지 않은 대조군이고, LPS는 LPS에 의한 염증 유발군(염증 유발 후 아무 처리도 하지 않은 대조군), 1㎍, 3㎍ 또는 5 ㎍는 LPS로염증 유발하고 RBP 펩타이드 1㎍, 3㎍ 또는 5 ㎍을 처리한 처리군을 의미한다.
도 11a, 11b 및 11c는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 펩타이드의 항염증 효과를 폐조직 내의 염증성 사이토카인 변화로 확인한 결과를 나타낸다. Control은 아무 처리도 하지 않은 대조군이고, LPS는 LPS에 의한 염증 유발군(염증 유발 후 아무 처리도 하지 않은 대조군), 3㎍ 또는 10 ㎍는 LPS로염증 유발하고 RBP 펩타이드 3㎍ 또는 10 ㎍을 처리한 처리군을 의미한다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 펩타이드의 항염증 효과를 Hematoxylin 과 Eosin 염색에 의해 확인한 결과를 나타낸다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 펩타이드의 항염증 효과를 RAGE knockdown에 의해 확인한 결과를 나타낸다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 펩타이드의 항염증 효과를 폐조직 IHC 염색으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 15a 및 15b는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 펩타이드의 NK-kb 저해 효과를 효과 확인한 결과를 나타낸다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 고분자-펩타이드 복합체의 RAGE 수용체 결합여부를 확인한 결과를 나타낸다.
도 17a 및 도 17b는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 고분자-펩타이드 복합체의 RAGE 수용체에 경쟁적 결합여부를 확인한 결과를 나타낸다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 유전자-고분자-펩타이드 복합체 유전자 전달에 따른 항종양 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 펩타이드 및 펩타이드-고분자의 혈관생성억제효과를 확인한 결과이다.
도 20a 및 20b 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 펩타이드 및 펩타이드-고분자의 뇌종양세포에 대한 항종양 효과를 확인 결과이다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 펩타이드 및 펩타이드-고분자의 RAGE 신호전달 저해 효과를 확인한 결과이다.
도 22는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 펩타이드 및 펩타이드-고분자의 VEGF의 발현을 감소시키는 항-혈관생성효과를 확인한 결과이다.
도 23은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 펩타이드 및 펩타이드-고분자의 뇌종양에서 사이토카인의 분비 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 24는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 펩타이드 및 펩타이드-고분자의 a-smooth muscle actin의 발현 감소에 따른 항-혈관생성효과를 확인한 결과이다.
도 25a 내지 25d는 본 발명에 따른 RAGE 결합 펩타이드를 대량으로 생산하기 위한 발현벡터의 개략적인 구조 (a 및 b), 펩타이드의 정제 결과를 나타낸 그래프 (c) 및 SDS-PAGE를 통한 RAGE 결합 펩타이드의 확인 결과 (d)를 나타낸 도면이다. 도 25d 에서 1은 정상 대장균 단백질 추출액, 2는 RBP 발현 촉진 후 단백질 추출액, 및 3은 정제된 단백질군을 의미한다.
도 26는 서열번호 1의 RAGE 결합 펩타이드가 RAGE에 결합함으로써 S100B에 의한 TNF-α 방출을 억제하는지를 확인하는 실험에 대한 결과를 도시한 그래프이다.
도 27은 서열번호 1의 RAGE 결합 펩타이드가 RAGE에 결합함으로써 S100B에 의한 VEGF 생성을 억제하는지를 확인하는 실험에 대한 결과를 도시한 그래프이다.
도 28는 본 발명의 일 실시예에 따른 RAGE 결합 펩타이드, 루시퍼라아제를 암호화하는 DNA 및 폴리에틸렌이민을 포함하는 복합체를 제조하는 과정을 개략적으로 도시한 도면이다.
도 29는 아가로오스 겔 상에서 DNA와 RAGE 결합 펩타이드의 중량비에 따른 이동도, 및 DNA, RAGE 결합 펩타이드 및 폴리에틸렌이민의 중량비에 따른 이동도를 측정하기 위해서 겔 지연 분석을 수행한 결과를 도시한 것이다.
도 30a는 다양한 비율의 DNA : 폴리에틸렌이민 중량비를 갖는 복합체들에 대한 상대 루시퍼라아제 단위를 측정한 결과를 도시한 그래프이고, 도 30b는 다양한 비율의 DNA : RAGE 결합 펩타이드 : 폴리에틸렌이민 중량비를 갖는 복합체들에 대한 상대 루시퍼라아제 단위를 측정한 결과를 도시한 그래프이다.
도 31은 DNA + RAGE 결합 펩타이드 복합체, DNA + 폴리에틸렌이민 복합체, 및 DNA + RAGE 결합 펩타이드 + 폴리에틸렌이민 복합체 각각의 크기 및 표면 전하를 측정한 결과를 도시한 그래프이다.
도 32는 C6 신경교모세포종 세포주를 사용한 형질전환감염 실험을 통해서, 본 발명에 따른 약물 복합체의 유전자 전달 효율을 루시퍼라아제 분석 방법을 사용하여 다른 약물전달체와 비교 평가한 결과를 도시한 그래프이다.
도 33는 C6 신경교모세포종 세포주를 사용한 형질전환감염 실험을 통해서, 본 발명에 따른 약물 복합체의 세포 내 독성을 MTT 분석방법을 사용하여 다른 약물전달체와 비교 평가한 결과를 도시한 그래프이다.
도 34a 내지 34e는 HSV-TK 유전자와 다양한 유전자 전달체와의 복합체를 사용하여 C6 신경교모세포종 세포주를 사용한 형질전환감염 실험을 통해서, 본 발명에 따른 약물 복합체의 암세포 사멸 효과를 비교 평가한 결과를 도시한 그래프이다.
도 35a 및 35b는 각각 다양한 복합체로 C6 신경교모세포종 세포주가 주입된 동물 모델을 처리한 후 전체 뇌 조직 중 종양의 백분율을 나타낸 그래프와, 실제 뇌 조직에 대한 관찰 사진이다.
도 36a 및 36b는 본 발명의 일 실시예에 따라 HMGB1으로 유도된 염증에 대한 RBP 펩타이드의 항염증 효과를 확인한 그래프이다. Control은 아무 처리도 하지 않은 대조군이고, HMGB1 wild type은 HMGB1에 의한 염증 유발군 pEmpty only는 아무 단백질도 발현하지 않는 플라스미드 처리한 실험군, RBP only는 RBP 펩타이드 2㎍ 처리한 실험군을 의미한다.
도 37a 및 37b는 본 발명의 일 실시예에 따라, RBP의 RAGE 발현 억제효과를 확인한 결과를 나타내는 것으로, 37a는 유세포 분석 결과를 나타내고, 37b는 공초첨 현미경 분석결과를 나타낸다.
도 38은 본 발명의 일 실시예에 따라 RBP에 의한 신경세포 사멸 효과를 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타낸다.1a, 1b and 1c show the expression and purification results of a RAGE-binding peptide prepared according to an embodiment of the present invention, wherein 1a represents the structure of a vector expressing the peptide of the present invention, 1b represents a nickel chelate-affinity 1c shows the results of gel analysis of the bacterial (lane 1) eluate and the purified RBP peptide (lane 2).
Figure 2 shows a reaction scheme for forming a complex of a RAGE-binding peptide and a cationic polymer of the present invention.
Figures 3a, 3b and 3c show the physical properties of peptides, peptide-crosslinking agents and peptide-cationic polymers of the present invention.
FIGS. 4A and 4B show cytotoxicity results of the peptide-cationic polymer conjugate of the present invention. In FIG. 4a, brain tumor cells C6 and 4b show cytotoxicity against lung epithelial cell L2. PEI-RBP 1: 2, 1: 3, 1: 4 or 1: 5 means that the mass ratio of DNA and PEI-RBP is 1: : 1, 1: 2, 1: 3, 1: 4 or 1: 5.
Figures 5A, 5B, and 5C illustrate the physical properties of the peptide and peptide complexes prepared in accordance with one embodiment of the present invention. 1: 1, 1: 2, 1: 3, 1: 4 or 1: 5 means that the mass ratio of DNA and PEI-RBP is 1: 1, 1: : 2, 1: 3, 1: 4, or 1: 5.
6 shows the gene transfer efficiency of the peptide complex prepared according to one embodiment of the present invention. 1: 1, 1: 3, 1: 4, 1: 5, 1: 7, or 1: 9 of DNA and PEI were treated with DNA And PEI-RBP mass ratios of 1: 1, 1: 2, 1: 3, 1: 4, 1: 5, 1: 7 or 1: 9.
FIGS. 7A and 7B show transfer efficiencies of the peptide complexes prepared according to one embodiment of the present invention in the overexpressed state of RAGE. FIG. DNA is the target genetic material to be transferred, and PR4 in Fig. 7A means the RBP-PEI complex of the present invention.
FIG. 8 shows the results of confirming binding of RAGE receptor to peptides prepared according to one embodiment of the present invention. PEI was treated with PEI alone, PEI-RBP was treated with PEI-RBP / DNA complex without priming RBP, + RBP / PEI-RBP was treated with RBP first, And treated with PEI-RBP / DNA complex.
FIGS. 9A, 9B, 9C and 9D show the anti-inflammatory effects of the peptides prepared according to one embodiment of the present invention as a result of confirming the reduction of inflammatory cytokines. 1 μg, 3 μg, or 5 μg induced inflammation with LPS, and 1 μg of RBP peptide, 3 μg / ml, was used as a control. Or < RTI ID = 0.0 > 5 < / RTI >
FIGS. 10A, 10B and 10C show the anti-inflammatory effects of the peptides prepared according to one embodiment of the present invention as a result of inflammatory cytokine changes in the lung washings. 1 μg, 3 μg, or 5 μg induced inflammation with LPS, and 1 μg of RBP peptide, 3 μg / ml, was used as a control. Or < RTI ID = 0.0 > 5 < / RTI >
FIGS. 11A, 11B, and 11C show the anti-inflammatory effects of peptides prepared according to one embodiment of the present invention as a result of inflammatory cytokine changes in pulmonary tissues. Control was a control group without any treatment. LPS was induced by LPS (control group without any treatment after inflammation), 3 ㎍ or 10 ㎍ induced inflammation with LPS and treated with 3 ㎍ or 10 ㎍ of RBP peptide Means one treatment group.
FIG. 12 shows the anti-inflammatory effect of peptides prepared according to an embodiment of the present invention by hematoxylin and Eosin staining.
FIG. 13 shows the anti-inflammatory effect of peptides prepared according to one embodiment of the present invention by RAGE knockdown.
FIG. 14 shows the result of confirming the anti-inflammatory effect of peptides prepared according to one embodiment of the present invention by pulmonary tissue IHC staining.
15A and 15B show the results of confirming the effect of the NK-kb inhibitory effect of the peptides prepared according to one embodiment of the present invention.
FIG. 16 shows the results of confirming the binding of a polymer-peptide complex prepared according to an embodiment of the present invention to a RAGE receptor.
FIGS. 17A and 17B show results of confirming competitive binding of a polymer-peptide complex prepared according to an embodiment of the present invention to a RAGE receptor.
FIG. 18 shows the results of confirming the antitumor effect of gene-polymer-peptide complex gene transfer according to an embodiment of the present invention.
FIG. 19 shows the results of confirming the anti-angiogenic effect of peptides and peptide-polymers prepared according to an embodiment of the present invention.
20a and 20b The results of confirming the antitumor effect of the peptides and the peptide-polymer prepared according to an embodiment of the present invention on brain tumor cells.
FIG. 21 shows the results of confirming the RAGE signal transduction inhibitory effect of peptides and peptide-polymers prepared according to an embodiment of the present invention.
FIG. 22 shows the result of confirming the anti-angiogenic effect of reducing the expression of VEGF in peptides and peptide-polymers prepared according to an embodiment of the present invention.
23 shows the results of confirming the inhibitory effect of peptides and peptide-polymers prepared according to an embodiment of the present invention on the secretion of cytokines in brain tumors.
24 shows the anti-angiogenic effects of peptides and peptide-polymers prepared according to an embodiment of the present invention upon the decrease of the expression of a-smooth muscle actin.
25a to 25d are schematic diagrams (a and b) of an expression vector for mass production of a RAGE-binding peptide according to the present invention, a graph (c) showing a result of purification of the peptide, and a graph (D). Fig. 25D, 1 denotes a normal E. coli protein extract, 2 denotes a protein extract after promoting RBP expression, and 3 denotes a purified protein group.
26 is a graph showing the results for an experiment to confirm whether the RAGE binding peptide of SEQ ID NO: 1 inhibits TNF-a release by S100B by binding to RAGE.
FIG. 27 is a graph showing the results of an experiment to confirm whether the RAGE-binding peptide of SEQ ID NO: 1 inhibits VEGF production by S100B by binding to RAGE.
28 is a view schematically showing a process for producing a complex comprising a RAGE-binding peptide, DNA encoding luciferase, and polyethyleneimine according to an embodiment of the present invention.
29 shows the results of performing gel delay analysis on the agarose gel in order to measure the mobility according to the weight ratio of DNA and RAGE binding peptide and the mobility according to the weight ratio of DNA, RAGE binding peptide and polyethyleneimine .
30A is a graph showing the results of measurement of relative luciferase units for complexes having various ratios of DNA: polyethylene imine weight ratio, and FIG. 30B is a graph showing the results of measuring relative luciferase units for complexes having various ratios of DNA: RAGE binding peptide: polyethyleneimine Lt; RTI ID = 0.0 > luciferase < / RTI > units.
31 is a graph showing the results of measurement of the size and surface charge of each of DNA + RAGE binding peptide complex, DNA + polyethyleneimine complex, and DNA + RAGE binding peptide + polyethyleneimine complex.
FIG. 32 is a graph showing the results of comparative evaluation of the gene transfer efficiency of the drug complex according to the present invention with other drug carriers using a luciferase assay method through a transfection experiment using a C6 glial cell line.
FIG. 33 is a graph showing the results of comparative evaluation of intracellular toxicity of a drug complex according to the present invention with other drug carriers using an MTT assay through a transfection experiment using a C6 glioblastoma cell line. FIG.
34A to 34E show the results of comparative evaluation of the cancer cell killing effect of the drug complex according to the present invention through a transfection infection experiment using a C6 glioblastoma cell line using a complex of an HSV-TK gene and various gene carriers Graph.
35A and 35B are photographs showing the percentage of tumors in whole brain tissue after treating an animal model in which C6 glial cell line was injected into various complexes, and actual brain tissue images.
36A and 36B are graphs showing anti-inflammatory effects of RBP peptide against inflammation induced by HMGB1 according to an embodiment of the present invention. Control was an untreated control group, HMGB1 wild type was inflammation induced by HMGB1, pEmpty only was a plasmid-treated group in which no protein was expressed, and RBP only was an experimental group treated with 2 μg of RBP peptide.
FIGS. 37A and 37B show the results of confirming the inhibitory effect of RBP on RAGE expression according to an embodiment of the present invention, in which 37a shows the results of flow cytometry and 37b shows the results of empirical microscopy analysis.
FIG. 38 shows the result of analysis of RBP-induced neuronal cell death by flow cytometry according to an embodiment of the present invention.

본 발명에서는 특정 서열을 통해 표적 특이적 결합력과 생리 활성을 갖는 신규한 펩타이드 및 상기 펩타이드를 포함하는 유전자 전달체 및 유전자 치료용 복합체를 제공하고자 한다. In the present invention, a novel peptide having a target specific binding force and a physiological activity through a specific sequence and a gene carrier and a gene therapeutic complex comprising the peptide are provided.

또한, 상기 펩타이드, 유전자 전달체 또는 복합체를 포함하는 조성물을 제공하고자 한다. 상기 조성물은 유전자 전달, 유전자 치료 또는 약제학적 조성물 일 수 있다. Also provided is a composition comprising the peptide, gene carrier or complex. The composition may be a gene delivery, a gene therapy, or a pharmaceutical composition.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본 발명은 서열번호 1의 서열로 이루어진 펩타이드를 제공한다.The present invention provides a peptide consisting of the sequence of SEQ ID NO: 1.

서열번호 1: KLKEKYEKDIAAYRAKGKPDAAKKGVVKAEKSKKKKEC SEQ ID NO: 1: KLKEKYEKDIAAYRAKGKPDAAKKGVVKAEKSKKKKEC

본 발명의 펩타이드는 RAGE 수용체 특이적으로 결합하는 것으로, RAGE는 적어도 하나 이상의 리간드를 갖는 면역글로불린상과(immunoglobulin superfamily)의 막관통 수용체이다. The peptide of the present invention specifically binds to the RAGE receptor, and RAGE is a transmembrane receptor of an immunoglobulin superfamily having at least one ligand.

본 발명의 펩타이드는 RAGE 수용체 특이적 결합할 수 있고, 항염 및 항암 활성을 가지며, RAGE 수용체에 결합하여 세포 내 유입이 가능한 세포투과성 펩타이드 일 수 있다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 저산소 조건에서 RAGE의 발현을 억제함으로써 염증을 억제하는 효과를 가지며, 저산소 조건에서 세포의 사멸을 억제하는 세포사멸 억제능을 갖는다. The peptide of the present invention may be a cell permeable peptide capable of specifically binding to RAGE receptor, having anti-inflammatory and anticancer activity, and capable of binding to RAGE receptor and allowing intracellular entry. In addition, the peptide of the present invention has an effect of suppressing inflammation by inhibiting the expression of RAGE under hypoxic conditions, and has the ability to inhibit apoptosis which inhibits cell death under hypoxic conditions.

또한, 본 발명의 펩타이드는 다른 유전자와 함께 결합하여 유전자 전달체로 사용될 수 있고, 이 경우, 종래 다른 RAGE 수용체 특이적 펩타이드와 비교해서 유전자를 세포핵으로 전달시키는 효과가 현저히 우수한 특성을 갖는다. In addition, the peptide of the present invention can be used as a gene carrier by binding together with another gene. In this case, the peptide has remarkably excellent effect of transferring the gene to the nucleus as compared with other RAGE receptor-specific peptides.

상기 펩타이드는 본 발명의 기술분야에서 통상적인 방법에 의하여 합성 및 생산 될 수 있다. 일 예로, 하기 실시예에서 서술하고 있는 바와 같이, 우선 RAGE에 결합하는 펩타이드를 발현하는 유전자 염기서열을 확보한 이후에, 이를 이용하여 상기 유전자 염기서열의 대량 생산을 위한 발현벡터를 제작하고, 박테리아를 이용한 펩타이드의 대량 생산을 가능케 하였다.The peptides can be synthesized and produced by a conventional method in the technical field of the present invention. For example, as described in the following examples, an expression vector for mass production of the above-mentioned gene sequence is prepared by first securing a gene base sequence expressing a peptide binding to RAGE, To enable the mass production of the peptide.

본 발명의 일 측면에서, 상기 서열번호 1의 서열로 이루어진 펩타이드는 특정 수용체에 특이적으로 결합하는 성질을 가지고, 이를 통해 세포 내로 유입될 수 있으므로, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 유전자 전달체를 제공한다. In one aspect of the present invention, the peptide comprising the sequence of SEQ ID NO: 1 has a property of specifically binding to a specific receptor and can be introduced into cells through the peptide. Therefore, the present invention provides a gene carrier comprising the peptide do.

본 발명에 있어서 "유전자 전달체"란 외부의 유전자가 목적 세포 또는 부위에 전달되게 하는 것을 의미한다. 본 발명의 펩타이드는 대상 유전자와 결합된 형태로, RAGE 수용체에 특이적으로 결합할 수 있고, 상기 수용체에 결합하여 엔도시토시스 등에 의하여 세포 내 유입될 수 있으므로, 세포 내로 목적한 유전자를 효과적으로 전달 할 수 있다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 세포 내로 전달된 유전자를 세포핵으로 전달/유입시키는 효과도 우수하여, 유전자 전달체로 사용되는 경우 더욱 효과적으로 유전자 치료효과를 나타낼 수 있다는 장점이 있다. In the present invention, the term "gene carrier" means that an external gene is delivered to a target cell or site. Since the peptide of the present invention can bind specifically to the RAGE receptor in a form bound to the gene of interest and bind to the receptor and enter the cell by endocytosis or the like, . In addition, the peptide of the present invention has an excellent effect of transferring / transferring a gene transferred into a cell into a nucleus, and thus has an advantage of being able to exhibit a gene therapy effect more effectively when it is used as a gene carrier.

상기 유전자와 펩타이드의 결합은 화학 및 물리적 결합을 모두 포함하는 의미이며, 일 예로 정전기적 인력에 의한 결합 일 수 있다. The binding of the gene to the peptide includes both chemical and physical binding, and may be binding by electrostatic attraction, for example.

본 발명에 있어서 "유전자"는 세포 내에서 발현 시 약리 또는 생물학적 활성을 나타내고 본 발명의 펩타이드와 결합할 수 있는 것이라면 종류에 상관없이 본 발명에 포함되며, 구체적으로 유전자 또는 그 단편, 및 폴리뉴클레오타이드 등을 모두 포함하며, 상기 예에 제한되지 않는다.In the present invention, "gene" is included in the present invention regardless of the kind, as long as it exhibits pharmacological or biological activity when expressed in a cell and can bind to the peptide of the present invention. Specifically, the gene includes a gene or a fragment thereof and a polynucleotide And is not limited to the above example.

바람직하게, 상기 유전자는 대상 질병에 치료 효과를 나타낼 수 있는 치료용 유전자 일 수 있다. 본 발명에서 치료용 유전자란 세포 내에서 발현 시 치료 또는 예방 효과를 나타낼 수 있는 폴리펩티드를 암호화 할 수 있는 유전자(폴리뉴클레오타이드 서열)를 의미한다. 상기 치료용 유전자는 본 발명의 전달체에 포함될 수 있는 것이라면 대상 질병의 종류의 제한되지 않으며, 유전자의 발현을 위한 별도의 프로모터 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 치료용 유전자는 단독으로 또는 둘 이상이 포함될 수 있다. 일 예로 허혈성 질환 치료용, 암 치료용 또는 염증 치료용 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. Preferably, the gene may be a therapeutic gene capable of exhibiting a therapeutic effect on the target disease. In the present invention, a therapeutic gene means a gene (polynucleotide sequence) capable of encoding a polypeptide capable of exhibiting a therapeutic or preventive effect when expressed in a cell. As long as the therapeutic gene is included in the carrier of the present invention, the type of the target disease is not limited and may include a separate promoter for gene expression. The therapeutic gene may be used singly or in combination of two or more. Examples include, but are not limited to, genes for treating ischemic diseases, for treating cancer, or for treating inflammation.

본 발명의 용어, "치료"는 본 발명에 따른 유전자 전달체 또는 조성물의 투여로 질병 또는 질환의 억제, 병증의 호전 또는 경감과 같이 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미하며, 병증이 억제되거나 발 병을 지연시키는 "예방"을 포함하는 의미이다. The term "treatment" of the present invention refers to all actions that advantageously modify, such as inhibition of disease or disease, improvement or alleviation of pathology by administration of a gene carrier or composition according to the present invention, And "prevention"

본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 펩타이드가 허혈성 질환 치료용, 암 치료 또는 염증 치료용 유전자와 결합하여 치료제로 사용되는 경우 단일 치료법에 의해서 충분히 치료 효과를 달성 할 수 없는 허혈성 질환, 염증성 질환 및 암 질환에서, 본 발명의 펩타이드에 의한 세포 사멸억제, 허혈성 질환 완화, 개선 또는 치료, 항암/항염 효과와 치료용 유전자의 치료효과의 복합적인 작용을 통해서 더욱 우수한 질병의 치료 효과를 달성할 수 있음을 실험적으로 확인하였다.In one embodiment of the present invention, when the peptide of the present invention is used as a therapeutic agent in combination with a gene for treating ischemic diseases, cancer treatment or inflammation, ischemic diseases, inflammatory diseases In diseases and cancer diseases, it is possible to achieve a therapeutic effect of a more excellent disease through a complex action of suppressing apoptosis by the peptide of the present invention, alleviating, ameliorating or treating ischemic diseases, and curative effect of anti-cancer / anti- The results are shown in Fig.

상기 치료용 유전자는 암 세포 내에서 발현 시 치료 효과를 나타내는 암치료 유전자 일 수 있고, 구체적으로 약제감수성 유전자(drug-sensitizing gene), 종양 억제인자 유전자(tumor suppressor gene), 항원성 유전자(antigenic gene), 사이토카인 유전자(cytokine gene), 세포독성 유전자(cytotoxic gene), 세포증식 억제 유전자(cytostatic gene), 친-세포사멸 유전자(pro-apoptotic gene) 및 항신생 혈관 생성 유전자(anti-angiogenic gene)를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 암 치료용 유전자는 더욱 구체적으로, 일 예로 HSV-TK 유전자, PTEN 유전자, PDCD4 유전자 및 APC 유전자로 이루어진 군에서 선택된 것 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 기술분야에 있어서 암의 개선, 예방, 또는 치료할 수 있는 것으로 알려진 것이면 모두 포함하여 사용될 수 있다.The therapeutic gene may be a cancer-treating gene that exhibits a therapeutic effect when expressed in a cancer cell, and specifically includes a drug-sensitizing gene, a tumor suppressor gene, an antigenic gene A cytokine gene, a cytotoxic gene, a cytostatic gene, a pro-apoptotic gene and an anti-angiogenic gene. But is not limited thereto. The cancer treatment gene may be, for example, selected from the group consisting of the HSV-TK gene, the PTEN gene, the PDCD4 gene, and the APC gene, but is not limited thereto. In the technical field of the present invention, , ≪ / RTI > prevention, or treatment of the disease.

상기 염증 치료용 유전자는 HO-1 유전자, 아디포넥틴 (adiponectin) 유전자 및 TGF-β 유전자로 이루어진 군에서 선택된 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 기술분야에 있어서 염증의 개선, 예방, 또는 치료할 수 있는 것으로 알려진 것이면 모두 포함하여 사용될 수 있다. 또한, 상기 유전자는 1종 이상의 유전자가 결합되어 전달 될 수 있다. The gene for treating inflammation may be selected from the group consisting of the HO-1 gene, the adiponectin gene and the TGF-beta gene, but is not limited thereto. In the technical field of the present invention, Or all that is known to be treatable. In addition, the gene may be delivered by binding one or more genes.

상기 허혈성 질환 치료용 유전자는 본 발명의 기술분야에 있어서 허혈성 질환의 개선, 예방, 또는 치료할 수 있는 것으로 알려진 것이면 모두 포함하여 사용될 수 있다. 허혈성 질환 치료용 유전자는 일 예로 혀관내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor), 섬유아세포성장인자(fibroblast growth factor) 또는 HO-1(Heme oxygenase-1)가 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The gene for treating ischemic diseases may be used as long as it is known to be capable of improving, preventing or treating ischemic diseases in the technical field of the present invention. Examples of genes for treating ischemic diseases include, but are not limited to, vascular endothelial growth factor, fibroblast growth factor, or HO-1 (Heme oxygenase-1).

또한, 본 발명의 유전자 전달체는 양이온성 고분자를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 유전자 전달체가 양이온성 고분자를 더 포함하는 경우 유전자와 더욱 강한 결합의 복합체를 형성할 수 있어, 복합체의 안정성을 높여 주어, 유전자 전달의 효율이 현저히 상승하는 효과가 있다. In addition, the gene carrier of the present invention may further include a cationic polymer. When the gene carrier of the present invention further comprises a cationic polymer, it is possible to form a complex of a stronger binding with the gene, thereby enhancing the stability of the complex, thereby remarkably increasing the efficiency of gene transfer.

상기"양이온성 고분자"는 폴리-L-라이신, 폴리(N-에틸-4-비닐피리디늄 브로마이드), 폴리에틸렌이민, 키토산, 폴리(디메틸아미노에틸 메틸아크릴레이트) 및 폴리아미도아민으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 일 수 있고, 바람직하게는 폴리에틸렌이민 일 수 있다. The "cationic polymer" is selected from the group consisting of poly-L-lysine, poly (N-ethyl-4-vinylpyridinium bromide), polyethyleneimine, chitosan, poly (dimethylaminoethylmethylacrylate) And may be one or more, preferably polyethyleneimine.

상기 고분자로 폴리에틸렌이민을 사용하는 경우, 생체 적합성 및 복합체 전달 후 분해 가능성 등을 고려할 때, 상기 고분자는 1kDA 내지 40kDA, 또는 2 내지 30 kDA의 크기를 갖는 것일 수 있다. 상기 범위를 만족하는 고분자를 포함하는 유전자 전달체의 경우 유전자와의 결합력이 더욱 우수하여, 안정한 복합체를 형성 할 수 있어, 유전자 치료 시 효과적으로 사용될 수 있다. When polyethyleneimine is used as the polymer, the polymer may have a size of 1 kDA to 40 kDA, or 2 to 30 kDA, considering biocompatibility and decomposability after the complex delivery. In the case of a gene carrier containing a polymer that satisfies the above range, the binding ability with a gene is more excellent, and a stable complex can be formed, and thus it can be effectively used in gene therapy.

특히, 상기 고분자가 PEI인 경우, 본 발명의 복합체는 PEI에 포함된 1차 아민의 수에 따라, 펩타이드의 수가 달리하여 포함할 수 있다. 일 예로, 2kDA의 PEI의 경우 1 내지 19개의 펩타이드를 포함할 수 있고, 25kDA의 PEI의 경우 1 내지 213개의 펩타이드를 포함할 수 있다. In particular, when the polymer is PEI, the complex of the present invention may contain different numbers of peptides depending on the number of primary amines contained in PEI. As an example, it may contain 1 to 19 peptides in the case of 2 kDA of PEI, and 1 to 213 peptides in the case of 25 kDA of PEI.

상기 유전자 전달체는 바람직하게는 양이온성 고분자와 상기 펩타이드가 결합된 컨쥬게이션 형태 일 수 있다. 상기 결합은 링커를 이용하여 결합된 것 일 수 있고, 이황화 결합을 포함할 수 있다. 본 발명의 유전자 전달체에서 펩타이드 및 양이온성 고분자가 이황화 결합으로 결합된 경우, 세포 내로 유입되었을 때, pH가 낮은 엔도좀 내의 환경에서 상기 이황화 결합의 분해를 통해 고분자와 펩타이드 사이의 분리를 통해 복합체가 분해되어, 유전자의 핵 내 전달 효율을 더욱 높여주는 효과가 있다. The gene carrier may preferably be a conjugation form in which the cationic polymer and the peptide are combined. The bond may be bonded using a linker, and may include a disulfide bond. When a peptide and a cationic polymer are bound to a disulfide bond in a gene carrier of the present invention, the complex may be separated by separation between the polymer and the peptide through degradation of the disulfide bond in the environment of the low-pH endosome, And the effect of transferring the gene into the nucleus is further enhanced.

본 발명의 펩타이드와 양이온성 고분자의 결합에 사용되는 링커는 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 것이면, 결합되는 고분자의 종류에 따라서 본 발명에 포함되어 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 사용될 수 있는 링커는 SPDP(succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate), SIA(succinimidyl iodoacetate)및 SMCC(succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate)로 이루어진 군에서 선택된 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. The linker used for binding the peptide of the present invention to the cationic polymer may be included in the present invention depending on the type of the polymer to which the linker is commonly used in the technical field of the present invention. Specifically, the linker that can be used in the present invention is a group consisting of succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionate, SIA (succinimidyl iodoacetate) and succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane- But it is not limited thereto.

일 실시예에 따라, 본 발명의 펩타이드와 폴리에틸렌이민(PEI)의 결합에 SPDP를 사용할 수 있다. According to one embodiment, SPDP can be used for the binding of the peptides of the present invention to polyethyleneimine (PEI).

일 실시예에 따라, 양이온성 고분자로 25kDA의 PEI를 포함하는 경우, 상기 유전자 전달체는 양이온성 고분자와 본 발명 펩타이드를 1 : 2 내지 10 몰비(molar ratio)로 포함할 수 있고, 바람직하게는 1 : 3 내지 5의 몰비로 포함할 수 있다. 상기 범위를 만족하는 경우, 유전자 전달체로서 안정성 향상되고, 세포독성이 낮아 유전자 전달체로서 더욱 우수한 효과를 갖는다. 특히, 상기 범위를 만족하는 유전자 전달체의 경우, 본 발명의 종양세포와 정상세포 모두에서 종래 사용되던 비바이러스성 벡터인 PEI를 단독으로 사용하는 것보다 세포독성이 낮음을 확인하여, 상기 몰비를 갖는 경우 유전자 전달체로서 더욱 우수한 효과를 가짐을 확인하였다.According to one embodiment, when the cationic polymer includes PEI of 25 kDa, the gene carrier may include the cationic polymer and the peptide of the present invention in a molar ratio of 1: 2 to 10, preferably 1 : 3 to 5 molar ratio. When the above-mentioned range is satisfied, stability as a gene carrier is improved, and cytotoxicity is low, so that the gene carrier has a more excellent effect as a gene carrier. In particular, in the case of the gene carrier satisfying the above-mentioned range, it was confirmed that cytotoxicity was lower than that of PEI, which is a non-viral vector conventionally used in both tumor cells and normal cells of the present invention, It has been confirmed that it has a more excellent effect as a gene carrier.

상기 유전자 전달체는 유전자 전달 또는 치료를 위해 약제학적으로 허용 가능한 담체 등의 성분과 함께 사용될 수 있는바, 본 발명은 이러한 측면에서 상기 유전자 전달체를 포함하는 유전자 전달용 조성물을 제공한다. 상기 유전자 전달용 조성물은 본 발명의 펩타이드 또는 펩타이드 및 양이온성 고분자를 포함하는 유전자 전달체 외에, 유전자 전달을 위해 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 포함할 수 있는 성분을 더 포함할 수 있다. The gene carrier may be used together with components such as a pharmaceutically acceptable carrier for gene delivery or treatment, and the present invention provides a composition for gene transfer comprising the gene carrier. The composition for gene transfer may further comprise a component that can be ordinarily included in the technical field of the present invention for gene transfer, in addition to the peptide or peptide of the present invention and a gene carrier comprising a cationic polymer.

또한, 본 발명의 다른 측면에 있어서, 본 발명은 상기 펩타이드; 또는 상기 펩타이드를 포함하는 유전자 전달체;를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. In another aspect of the present invention, the present invention provides a peptide comprising the peptide; Or a gene carrier comprising the peptide.

상기 유전자 전달체에 대해서는 상술한 바에 따른다. The above gene carriers are as described above.

상기 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 약제학적 활성을 갖는 유효성분을 추가로 포함할 수 있다. 상기 약제학적 활성을 갖는 유효성분은 치료학적 유효량으로 포함될 수 있다. 본 명세서에서 용어 "치료학적 유효량"은 상기 약리학적 효과를 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.The composition may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier and / or an active ingredient having a pharmacological activity. The active ingredient having the aforementioned pharmacological activity may be contained in a therapeutically effective amount. As used herein, the term "therapeutically effective amount" means an amount sufficient to achieve the pharmacological effect.

본 발명의 약제학적 조성물은 그 질병의 종류에 상관없이 적용될 수 있다. 구체적으로 본 발명의 조성물은 추가로 포함되는 다양한 약제학적 유효성분에 따라 적용되는 질병에 다양하게 적용될 수 있으므로, 상기 유전자 전달체를 포함하는 조성물은 질병의 종류에 제한없이 다양한 용도로 적용될 수 있다. 상기 약제학적 유효성분은 그 종류에 제한되지 않고, 본 발명의 유전자 전달체와 함께 조성물에 포함되거나, 본 발명의 유전자 전달체에 포함되는 형태로 조성물에 포함될 수 있고, 일 예로 치료용 뮤전자 일 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물은 그 질병이 종류에 상관없이 모두 본 발명에 포함된다. The pharmaceutical composition of the present invention can be applied regardless of the type of the disease. Specifically, since the composition of the present invention can be applied to various diseases to be applied according to various pharmaceutical active ingredients, the composition including the gene carrier can be applied to various kinds of diseases without limitation. The pharmaceutical active ingredient is not limited to the kind, and may be included in the composition together with the gene carrier of the present invention or included in the gene carrier of the present invention, and may be, for example, a therapeutic mu electron . Accordingly, the pharmaceutical composition comprising the peptide of the present invention is included in the present invention regardless of the kind of the disease.

본 발명의 약제학적 조성물은 질병의 종류에 제한 받지 않으나, 본 발명의 펩타이드가 RAGE 수용체에 특이적으로 결합하여, 암 또는 염증 관련 신호 전달을 방해하여, 암 또는 염증을 치료하는 효과를 갖는바, 항암 또는 항염증 치료에 유용할 수 있다. 특히, 추가적으로 포함하는 약제학적 유효성분과 함께 유전자 전달체인 펩타이드의 항암 또는 항염 활성 효과도 얻을 수 있어, 복합적인 기전이 작용하는 항암 및/항염의 치료에 더욱 우수한 효과를 나타낼 수 있다. The pharmaceutical composition of the present invention is not limited to the kind of disease but the peptide of the present invention specifically binds to RAGE receptor and inhibits cancer or inflammation related signal transmission and has an effect of treating cancer or inflammation, May be useful for the treatment of cancer or anti-inflammation. Particularly, in addition to the pharmacologically active ingredient, which is additionally contained, an anticancer or anti-inflammatory activity effect of a peptide as a gene transfer can be obtained, and thus it can exert an excellent effect in the treatment of anti-cancer and /

조성물은 상기 유전자와 유전자 전달체를 1 : 2초과의 중량비로 포함할 수 있고, 바람직하게는 유전자 : 유전자 전달체를 1 : 4초과 내지 10이하의 중량비로 포함할 수 있다. 상기 범위를 만족하는 경우, 세포로의 유전자 전달 효율이 현저하게 높아짐을 본 발명의 일 실시예를 통해 확인 하였다. The composition may contain the gene and the gene transporter at a weight ratio of more than 1: 2, and preferably the gene: gene transporter at a weight ratio of more than 1: 4 to less than 10. When the above range is satisfied, it has been confirmed through one embodiment of the present invention that gene transfer efficiency into cells is remarkably increased.

본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 상기 펩타이드는 RAGE에 의하여 매개되는 신호전달 경로를 효과적으로 방해하여 암 또는 염증의 치료에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 펩타이드 또는 상기 유전자 전달체를 포함하는 염증 또는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. In yet another aspect of the present invention, the peptide can be used to treat cancer or inflammation by effectively interfering with the signal transduction pathway mediated by RAGE. Accordingly, the present invention provides a composition for preventing or treating inflammation or cancer comprising the peptide or the gene carrier.

상기 조성물은 통상적으로 질병의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물에 포함될 수 있는 담체 및 기타성분을 포함할 수 있다. The compositions may include carriers and other ingredients that may be included in pharmaceutical compositions for the treatment or prevention of disease.

또한, 상기 조성물은 본 발명의 펩타이드 외에 항암 또는 항염 활성을 갖는 유효성분을 더 포함할 수 있다. In addition, the composition may further comprise an active ingredient having anti-cancer or anti-inflammatory activity in addition to the peptide of the present invention.

본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 상기 펩타이드 및 유전자를 포함하는 유전자 치료용 복합체 형대로 존재할 수 있다. 따라서, 본 발명은 이러한 측면에서, 상기 펩타이드 및 유전자를 포함하는 유전자 치료용 복합체를 제공한다. In another aspect of the present invention, the present invention may exist in a form of a complex for gene therapy comprising the peptide and the gene. Accordingly, the present invention provides, in this aspect, a gene therapy complex comprising the peptide and the gene.

본 발명의 유전자 치료용 복합체는 RAGE에 특이적으로 결합하여 신호 전달을 차단함으로써 항염 및 항암 활성을 갖는 본 발명의 펩타이드와 세포 내로 운반되어 생리적 효과를 나타내는 유전자를 동시에 포함하므로, 한 번의 처치를 통해 다양하고 복합적인 경로의 치료효과를 동시에 발휘 할 수 있어 유전자 치료 시 우수한 효과를 갖는다. Since the gene therapeutic complex of the present invention specifically binds to RAGE and blocks signal transduction, the peptide of the present invention having anti-inflammatory and anticancer activities and the gene which is transported into cells and exhibits a physiological effect are contained at the same time, It can exert the therapeutic effects of various and complex pathways at the same time and has excellent effects in gene therapy.

상기 복합체는 양이온성 고분자를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 복합체가 양이온성 고분자를 더 포함하는 경우 펩타이드 및 유전자와 더욱 안정적인 복합체를 형성할 수 있어 세포 내로 고효율 전달이 가능하다는 장점이 있다. The complex may further include a cationic polymer. When the complex of the present invention further comprises a cationic polymer, it can form a more stable complex with a peptide and a gene, thereby enabling high-efficiency delivery into cells.

상기 펩타이드, 유전자 및 양이온성 고분자에 관한 사항은 상기 기재와 중복되는바, 이를 준용하여 적용될 수 있다. The matters relating to the peptide, the gene, and the cationic polymer are the same as those described above, and can be applied mutatis mutandis.

상기 복합체에서 유전자는 양이온성 고분자 및/또는 펩타이드와 물리적 또는 화학적으로 결합될 수 있고, 그 결합의 구체적인 종류는 결합되는 유전자 및 고분자의 종류에 따라 상이할 수 있고, 바람직한 일 예로 정전기적 인력에 의하여 결합된 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In the complex, the gene may be physically or chemically bound to the cationic polymer and / or the peptide, and the specific kind of the bond may be different depending on the type of the gene and the polymer to be bound. Preferably, But is not limited thereto.

상기 유전자 치료용 복합체는 양이온성 고분자와 본 발명 펩타이드를 1 : 2 내지 10 몰비(molar ratio)로 포함하는 것 일 수 있다. 상기 범위를 만족하는 경우, 복합체의 안정성 향상되고, 세포독성이 낮아 유전자 치료시 부작용을 줄이면서, 더욱 우수한 치료 효과를 가질 수 있다.The complex for gene therapy may include a cationic polymer and a peptide of the present invention in a molar ratio of 1: 2 to 10. When the above range is satisfied, the stability of the complex is improved and cytotoxicity is low, so that it is possible to have a more excellent therapeutic effect while reducing adverse effects in gene therapy.

본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 양이온성 고분자가 25kDA PEI인 경우, 양이온성 고분자 : 펩타이드를 1 : 2 내지 5의 몰비로 포함할 수 있고, 이 경우 종양세포와 정상세포 모두에서 종래 사용되던 비바이러스성 벡터인 PEI를 단독으로 사용하는 유전자 치료제 보다 세포독성이 더욱 낮음을 확인 하였다.According to one embodiment of the present invention, when the cationic polymer is 25 kDa PEI, the cationic polymer: peptide may be contained in a molar ratio of 1: 2 to 5, and in this case, It was confirmed that the cytotoxicity was lower than that of a gene therapeutic agent using PEI alone as a nonviral vector.

상기 복합체에서 펩타이드의 고분자의 결합은, 다른 명시적인 기재가 없는 한, 상기 유전자 전달체에 기재된 바를 준용하여 적용될 수 있으며, 그 외 본 기술분야의 통상적인 방법에 따를 수 있다. The binding of the polymer of the peptide in the complex may be applied in accordance with the method described in the above gene carrier, unless otherwise stated, and may be performed according to a conventional method in the art.

본 발명자들은 거듭된 연구를 통해서, 본 발명의 펩타이드와 유전자의 함량비가 적당한 비율로 조절되면 더욱 안정적이고 단단한 복합체를 형성할 수 있으며, 결과적으로 우수한 유전자 전달 효율을 달성할 수 있다는 사실을 밝혀냈는바, 바람직하게는 상기 펩타이드는 상기 유전자 1 중량부에 대해서 4 중량부 내지 10 중량부의 함량으로 포함될 수 있다. 상기 펩타이드의 함량이 4 중량부 미만인 경우에는 형성되는 복합체의 안정성 및 유전자 전달 효율이 떨어진다는 문제점이 있으며, 10 중량부를 초과하는 경우에도 유전자 전달 효율이 떨어진다는 문제점이 있어서 바람직하지 않다. 따라서, 상기 범위를 만족하는 유전자 전달용 복합체의 경우, 체 내에서 유전자를 타겟 세포로 전달 및 세포 내 유입 효율이 더욱 높아, 유전자 치료 시 더욱 우수한 치료 효과를 갖는다. The inventors of the present invention have found through repeated studies that a more stable and firm complex can be formed when the content ratio of the peptide and the gene of the present invention is adjusted at an appropriate ratio, The peptide may be contained in an amount of 4 to 10 parts by weight based on 1 part by weight of the gene. When the amount of the peptide is less than 4 parts by weight, stability of a complex to be formed and gene transfer efficiency are poor. When the peptide content is more than 10 parts by weight, there is a problem that gene transfer efficiency is lowered. Therefore, in the case of the gene transfer complex satisfying the above-mentioned range, the gene is transferred into the target cell in the body and the efficiency of intracellular introduction is higher, and thus it has a more excellent therapeutic effect in gene therapy.

또한, 상기 유전자와 상기 양이온성 고분자의 함량비 역시 안정적인 복합체 형성 및 고효율의 유전자 전달에 중요한 영향을 미치는 바, 바람직하게는 상기 양이온성 고분자는 상기 질병 치료용 유전자 1 중량부에 대해서 1 중량부 내지 30 중량부의 함량으로 포함될 수 있다. 양이온성 고분자의 함량이 1 중량부 미만인 경우에는 상기 양이온성 고분자에 의해서 형성되는 복합체 표면의 양전하 분포의 정도가 미약하여 세포 내 전달 효율이 떨어진다는 문제점이 있으며, 30 중량부를 초과하는 경우에는 유전자 전달 효율이 떨어질 수 있다는 문제점이 있어서 바람직하지 않다. 따라서, 상기 범위를 만족하는 전달용 복합체의 경우, 체 내 환경에서 복합체의 결합이 더욱 잘 유지되므로 타겟부위까지 유전자를 더욱 잘 전달할 수 있어, 우수한 치료효과를 갖는다. In addition, the content ratio of the gene and the cationic polymer also has an important influence on stable complex formation and high-efficiency gene transfer. Preferably, the cationic polymer is used in an amount of 1 part by weight to 1 part by weight, 30 parts by weight. When the content of the cationic polymer is less than 1 part by weight, the degree of positive charge distribution on the surface of the composite formed by the cationic polymer is insufficient and the efficiency of intracellular delivery is decreased. When the amount is more than 30 parts by weight, There is a problem that the efficiency may be lowered. Therefore, in the case of the delivery complex satisfying the above-mentioned range, the binding of the complex is better maintained in the body environment, so that the gene can be more efficiently transferred to the target site, and the therapeutic effect is excellent.

또한, 상기 유전자 전달용 복합체 E는 유전자 전달용 조성물은 유전자와; 양이온성 고분자 및 펩타이드 복합체를를 1 : 4 초과의 중량비, 바람직하게는 1 : 5 이상의 중량비로 포함할 수 있고, 상기 범위를 만족하는 복합체는 유전자 전달 효율이 높고, 체내 독성이 낮아, 유전자 치료제로서 더욱 우수한 치료효과를 갖는다. In addition, the gene transfer complex E includes a gene; The cationic polymer and the peptide complex can be contained in a weight ratio of more than 1: 4, preferably 1: 5 or more, and the complex satisfying the above range has high gene transfer efficiency, low toxicity in the body, And has an excellent therapeutic effect.

상기 복합체에 포함되는 유전자는 그 종류에 상관없이, 본 발명의 펩타이드 및/또는 양이온성 고분자와 결합을 형성할 수 있는 것이라면 모두 포함하는 의미이다. 일 예로, 상기 유전자는 치료용 유전자 일 수 있고, 더욱 구체적으로 항암 또는 항염증 유전자일 수 있다. The gene contained in the complex is meant to include any gene capable of forming a bond with the peptide and / or the cationic polymer of the present invention regardless of the kind thereof. In one example, the gene may be a therapeutic gene, and more specifically, may be an anti-cancer or anti-inflammatory gene.

본 발명의 일 측면에서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 포함하는 염증 또는 암의 개선 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.In one aspect of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition for improving or treating inflammation or cancer comprising a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

또한, 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 포함하는 허혈성 질환 개선 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.Also provided is a pharmaceutical composition for improving or treating ischemic diseases comprising a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

본 발명의 치료용 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체, 아쥬반트 등을 포함하는 다른 구성을 더 포함할 수 있고, 본 발명의 복합체의 효과를 저해하지 않는 수준에서 화합물, 단백질과 같은 별도의 약학적 활성성분 또는 생리학적 유효성분을 더 포함할 수 있다. The therapeutic composition of the present invention may further comprise other constituents including a pharmaceutically acceptable carrier, adjuvant and the like, and may be in the form of a separate pharmaceutical preparation such as a compound or protein at a level that does not inhibit the effect of the complex of the present invention May further comprise an active ingredient or a physiologically active ingredient.

본 발명의 일 실시예에서 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 정상 상태 또는 저산소 상태에서 염증 유발된 세포에 처리한 경우, 염증성 사이토 카인의 발현을 억제함을 확인하였다. 따라서, 암 또는 염증 질환의 치료에 본 발명의 펩타이드가 유효성분으로 이용될 수 있음을 확인 하였다.In one embodiment of the present invention, it was confirmed that when the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 was treated with inflammation-induced cells in a normal or hypoxic state, the expression of the inflammatory cytokine was inhibited. Therefore, it has been confirmed that the peptide of the present invention can be used as an effective ingredient in the treatment of cancer or inflammatory diseases.

본 발명의 염증 질환은 염증 반응에 의하여 나타나는 질환을 모두 포함하는 것으로 그 종류에 제한되지 않는다. 일 예로 만성폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 기도 과민성 질환(airways hyper-responsiveness), 폐혈성 쇼크(septic shock), 사구체 신염, 염증성 장질환, 크론병(Crohn's disease) 또는 궤양잘록창자염(ulcerative colitis) 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. The inflammatory disease of the present invention includes all diseases caused by an inflammatory reaction and is not limited to the kind. For example, chronic obstructive pulmonary disease, airways hyper-responsiveness, septic shock, glomerulonephritis, inflammatory bowel disease, Crohn's disease, or ulcerative colitis ulcerative colitis. < / RTI >

본 발명의 허혈성 질환(ischemic disease)은 혈류의 정지, 혈량의 감소 혈관의 이상 또는 다른 요인에 의하여 조직에 산소의 공급이 저하되어 발생하는 저산소 조건에 의하여 나타나는 증상 또는 질환을 의미한다. 저산소 조건이 계속되는 경우 세포의 손상 또는 조직의 괴사가 일어나는 것을 의미하며, 특히 저산소 상태에 가장 민감한 신경세포의 괴사 등을 의미한다. The ischemic disease of the present invention refers to a symptom or a disease caused by a hypoxic condition caused by a decrease in blood supply, a decrease in blood volume, or a decrease in supply of oxygen to tissues due to other factors or other factors. Continuous hypoxia means that the cells are damaged or necrosis of the tissue occurs, and in particular, the necrosis of the nerve cell, which is most sensitive to the hypoxic state, is implied.

본 발명의 일 실시예에서, 서열번호 1로 이루어진 펩타이드를 저산소 상태에서 신경세포에 처리하는 경우, 신경세포의 사멸을 억제하는 효과를 갖는 것을 확인 하였는 바, 허혈성 질환의 치료에 본 발명의 펩타이드가 유효성분으로 이용될 수 있음을 확인 하였다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 저산소 상태에서 과발현이 일어나 염증을 유발하여 세포 손상을 더 심화시킬 수 있는 RAGE(Receptor for Advanced Glycation End products) 수용체의 발현을 억제하는 효과를 동시에 가져, 신경세포를 더욱 효과적으로 보호할 수 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 펩타이드는 저산소 상태에서 세포사멸을 억제함으로써 허혈성 질환을 치료 또는 개선할 수 있는 바, 이와 관련된 질환이라면 그 부위 또는 종류에 관계없이 모두 본 발명에 포함될 수 있다. In one embodiment of the present invention, it has been confirmed that the peptide consisting of SEQ ID NO: 1 has an effect of inhibiting the death of neuronal cells when the neuron is treated with hypoxic condition. As a result, It was confirmed that it can be used as an active ingredient. In addition, the peptide of the present invention has an effect of inhibiting the expression of RAGE (Receptor for Advanced Glycation End products) receptors that overexpresses in hypoxic conditions and induces inflammation to further intensify cell damage, It is possible to protect it. Therefore, the peptide of the present invention can treat or ameliorate an ischemic disease by inhibiting apoptosis in a hypoxic state, and any diseases related thereto can be included in the present invention regardless of its site or species.

상기 허혈성 질환은 예를 들어 허혈성 심장질환, 허혈성 뇌질환, 허혈성 창자질환 또는 허혈성 신경질환 일 수 있다. 바람직하게는 허혈성 심장질환 또는 허혈성 뇌질환일 수 있다. 더욱 구체적인 질환의 예로, 심근 허혈, 원발성 심장정지, 협심증, 허혈성 심장질환에 의한 심부전, 부정맥, 뇌경색, 허혈성 뇌출혈 또는, 피질하 죽상경화성 뇌병증(subcortical atherosclerotic encephalopathy)를 포함하며, 이에 한정되는 것은 아니다. The ischemic disease may be, for example, ischemic heart disease, ischemic brain disease, ischemic bowel disease or ischemic neurological disease. Preferably ischemic heart disease or ischemic brain disease. Examples of more specific diseases include, but are not limited to, myocardial ischemia, primary cardiac arrest, angina pectoris, heart failure due to ischemic heart disease, arrhythmia, cerebral infarction, ischemic cerebral hemorrhage, or subcortical atherosclerotic encephalopathy.

또한, 본 발명은 허혈성 질환에서 세포의 사멸을 억제하는 효과를 갖는다는 측면에서, 서열번호 1의 펩타이드를 포함하는 세포 보호용 또는 세포 사멸 억제용 약학 조성물일 수 있다. In addition, the present invention may be a pharmaceutical composition for protecting cells or inhibiting apoptosis comprising the peptide of SEQ ID NO: 1 from the viewpoint of having an effect of inhibiting cell death in ischemic diseases.

본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 본 명의 펩타이드는 고분자와의 복합체 또는 다른 유전자와 복합체 형태로 상기 약학 조성물에 포함될 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 유전자 치료용 복합체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. In another aspect of the present invention, the peptide of the present invention may be incorporated into the pharmaceutical composition in the form of a complex with a polymer or in the form of a complex with another gene. Accordingly, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising the gene therapeutic complex.

상기 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체, 아쥬반트 등을 포함하는 다른 구성을 더 포함할 수 있고, 본 발명의 복합체의 효과를 저해하지 않는 수준에서 화합물, 단백질과 같은 별도의 약학적 활성성분 또는 생리학적 유효성분을 더 포함할 수 있다. The composition may further comprise other constituents, including pharmaceutically acceptable carriers, adjuvants, and the like, and may contain additional pharmaceutically active ingredients, such as a compound, protein, or physiologically active substance, at a level that does not interfere with the effectiveness of the conjugate of the present invention And may further comprise a pharmaceutically active ingredient.

상기 담체 또는 아쥬반트 등을 포함하는 기타 구성은 약제학적으로 허용 가능한 물질이라면, 본 기술분야의 통상적인 수준에서 본 발명에 적용될 수 있다. Other constituents, including the carrier or adjuvant, etc., may be applied to the present invention at a conventional level in the art, provided that it is a pharmaceutically acceptable substance.

이하, 상기 펩타이드 및 유전자 전달체에 기재된 내용은 본 발명의 명세서에서 별도로 기재하지 않는 한, 약학 조성물과 유전자 치료용 복합체에 적용될 수 있으며, 기타 본 발명의 속하는 기술분야에서 약제학적으로 이용될 수 있는 구성의 경우, 통상적인 수준에서 본 발명에 포함될 수 있다. Hereinafter, the contents described in the above peptide and gene carrier may be applied to pharmaceutical compositions and complexes for gene therapy, unless otherwise specified in the specification of the present invention. In addition, in the present invention, , It can be included in the present invention at a usual level.

이하, 본 발명을 제조예 및 실험예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명은 다양한 변경이 가해질 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 이하에서 기술하는 특정 실시예 및 설명은 본 발명을 특정한 개시 형태로 한정하려는 것이 아니다. 본 발명의 범위는 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Production Examples and Experimental Examples. The following Examples and Experiments are intended to illustrate the invention, but since the invention can be variously modified and can take various forms, the specific examples and the explanations set forth below are intended to illustrate the invention without limiting it thereto. I do not want to. It is to be understood that the scope of the present invention includes all modifications, equivalents, and alternatives falling within the scope and spirit of the present invention.

[[ 실시예Example ]]

[[ 제조예Manufacturing example 1]  One] RAGERAGE 결합  Combination 펩타이드의Of peptide 제조 Produce

1-1. RBP 발현 및 정제 1-1. RBP expression and purification

유전자 재조합을 통하여 RAGE 특이적 결합능을 갖는 펩타이드(RBP, 아미노산 서열: KLKEKYEKDIAAYRAKGKPDAAKKGVVKAEKSKKKKEC)를 발현하는 유전자를 제조하였다. RBP의 cDNA(서열번호 2)를 human embryonic kidney 293세포의 total RNA를 주형으로 하여, RT-PCR을 통하여 얻었다. 프라이머의 염기순서는 다음과 같다. 5'-GTATGCTAGCAAGCTGAAGGAAAAATACGAAAAGG-3', reverse (Xho1), underlined) 5'-ACCGCTCGAGACATTCCTTCTTTTTCTTGCTTTTTTC-3'. RBP cDNA를 pET21a의 NheI과 XhoI자리 사이에 클로닝하여 pET21a-RBP를 제조하였다. 이를 BL21 박테리아에 이입하였다. 이를 박테리아에서 발현하기 위하여 박테리아를 LB배지, 37℃에서 18시간 배양한 후, 광학 밀도(optical density)가 0.6~0.8이 될 때까지 배양하였다. 이후, 500 uM의 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 추가한 후, 6시간 동안 4℃에서 배양하였다. 배양된 세포는 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCL, 10 mM 이미다졸(imidazole), 6 M 요소(Urea)를 포함한 용액에서 초음파 (8 x 25 burst)를 이용하여 파쇄하였다. RBP 펩타이드는 니켈 킬레이트 친화 크로마토그래피를 이용하여 이미다졸 농도 구배에 따라 정제하였다. 니켈 킬레이트 컬럼(ProBond resin, Invitrogen, Carlsbad, CA)에 박테리아 단백질을 로딩하고, 각각 50, 100, 150, 200 mM의 이미다졸을 포함한 용출 버퍼(elution buffer; 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCL, 6 M 요소)를 순차적으로 적용하여 용출(elution)하였다. 정제된 RBP 펩타이드는 SDS-PAGE를 통하여 확인한 후, 이하 실험에 사용하였다. A gene expressing a peptide (RBP, amino acid sequence: KLKEKYEKDIAAYRAKGKPDAAKKGVVKAEKSKKKKEC) having a RAGE-specific binding potency was prepared through gene recombination. The cDNA of RBP (SEQ ID NO: 2) was obtained by RT-PCR using the total RNA of 293 cells of human embryonic kidney as a template. The order of the bases of the primers is as follows. 5'-GTAT GCTAGC AAGCTGAAGGAAAAATACGAAAAGG-3 ', reverse (Xho1), underlined) 5'-ACCG CTCGAG ACATTCCTTCTTTTTCTTGCTTTTTTC-3'. RBP cDNA was cloned between NheI and XhoI sites of pET21a to prepare pET21a-RBP. This was transferred to BL21 bacteria. The bacteria were cultured in an LB medium at 37 ° C for 18 hours and then until optical density of 0.6-0.8. Then, 500 μM of IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) was added, followed by culturing at 4 ° C. for 6 hours. The cultured cells were disrupted using ultrasound (8 x 25 burst) in solutions containing 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, and 6 M Urea. The RBP peptide was purified according to the imidazole concentration gradient using nickel chelate affinity chromatography. Bacterial proteins were loaded onto a nickel chelate column (ProBond resin, Invitrogen, Carlsbad, CA) and elution buffer (elution buffer; 50 mM NaH 2 PO 4 , 300 mM NaCl , 6 M elements) were sequentially applied and elution was performed. Purified RBP peptides were identified by SDS-PAGE and used in the following experiments.

도 1a, 1b 및 1c에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 펩타이드는 100mM의 이미다졸 농도에서 용출 되었으며, 10kDa 이하의 크기를 가지고 있음을 확인하였다.As shown in Figs. 1A, 1B, and 1C, the peptides of the present invention were eluted at an imidazole concentration of 100 mM and confirmed to have a size of 10 kDa or less.

[[ 제조예Manufacturing example 2]  2] RAGERAGE 결합  Combination 펩타이드Peptides 및 양이온 고분자를 포함하는 유전자 전달체 및 유전자 복합체의 제조 And production of gene carriers and gene complexes containing cationic polymers

도 2의 반응식에 따라 RBP-PEI 전달체를 제조하였다. The RBP-PEI carrier was prepared according to the reaction scheme of FIG.

구체적으로 PEI(Polyethyleimmine, Sigma Aldrich)를 pH 8.0의 인산완충액(Phosphate buffer)에 녹이고, 4배의 몰비를 가진 SPDP(N-Succinimidyl 3-(20pyridyl-dithio) propionate, Pierce)를 포함하는 DMSO와 37℃에서 1.5시간 반응시켰다. 반응 혼합물을 Spectra/Por dialysis tube(MWCO 2000)를 이용해 4℃에서 12시간 투석했다. 이후 용액을 침전시키고 상층액 만을 얻어 건조시켰다. 얻어진 PEI-SPDP를 제조예 1에서 얻은 RBP 펩타이드와 PBS에서 12시간 반응 시켰다. 반응 혼합물을 Spectra/Por dialysis tube(MWCO 12000)를 이용해 4℃에서 12시간 투석했다. 이후 동결건조하여 흰색 고체의 생성물을 얻었다.Specifically, PEI (Polyethyleimmine, Sigma Aldrich) was dissolved in phosphate buffer (pH 8.0) and DMSO containing SPDP (N-Succinimidyl 3- (20pyridyl-dithio) propionate, Pierce) Lt; 0 > C for 1.5 hours. The reaction mixture was dialyzed at 4 < 0 > C for 12 hours using a Spectra / Por dialysis tube (MWCO 2000). Thereafter, the solution was precipitated and only the supernatant was dried. The obtained PEI-SPDP was reacted with the RBP peptide obtained in Preparation Example 1 in PBS for 12 hours. The reaction mixture was dialyzed at 4 < 0 > C for 12 hours using a Spectra / Por dialysis tube (MWCO 12000). Thereafter, the product was lyophilized to obtain a white solid product.

2-1. 고분자, 고분자-링커 및 고분자-RBP의 비교 2-1. Comparison of Polymers, Polymer-Linkers and Polymer-RBPs

상기 제조예 1에서 합성된 펩타이드를 이용하여 도 2의 반응식에 따라 제조되는 출발물질, 중간체 및 최종 생성물의 특성을 비교하였다. The peptides synthesized in Preparation Example 1 were used to compare the characteristics of starting materials, intermediates and final products prepared according to the reaction scheme of FIG.

구체적으로, PEI와 PEI-SPDP, RBP-PEI를 이용해 펩타이드 검출을 SDS-PAGE를 이용해 출발물질, 중간체 그리고 복합체(PEI (5ug), RBP (1,2,3,4 및 5 ug) PEI-SPDP (5ug) 및 RBP-PEI (5ug))의 특성을 비교하였다. 또한, 유전물질(루시퍼라아제 유전자; pSV-Luc)과 출발물질, 중간체, 생성물을 각각 다양한 무게비로 복합체를 형성(유전물질 1ug : PEI-SPDP 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 또는 1ug; 유전물질 1ug : PEI 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 또는 1ug, 유전물질 1ug : 0.5, 1, 1.5, 2 또는 2.5ug)하여, 겔 지연 분석을 실시하였다. 복합체는 30분 동안 형성시켰고, 사용된 아가로스 겔은 1% 였다. Specifically, peptide detection using PEI, PEI-SPDP and RBP-PEI was carried out by SDS-PAGE using PEI (5 ug), RBP (1,2,3,4 and 5 ug) PEI-SPDP (5 ug) and RBP-PEI (5 ug)). (Genetic material 1 ug: PEI-SPDP 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 or 1 ug), 1 ug of the genetic material (luciferase gene: pSV-Luc) and starting material, : PEI 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 or 1 ug, 1 ug of the genetic material: 0.5, 1, 1.5, 2 or 2.5 ug). The complex was formed for 30 minutes and the agarose gel used was 1%.

도 3a에 나타난 바와 같이 레인 1번의 PEI와 2번의 PEI-SPDP에서는 펩타이드가 검출되지 않았으며, 8번의 PEI-RBP의 경우 3 내지 7번의 RBP와 같은 크기의 펩타이드가 검출되었다. 이를 통해 RBP-PEI 펩타이드가 잘 합성되었고, 그 양은 RBP-PEI 5ug 대비 1ug 수준 임을 알 수 있다. As shown in FIG. 3A, peptides were not detected in lane 1 PEI and 2 PEI-SPDP, and peptides in the same size as RBP 3 to 7 in 8 PEI-RBP were detected. The RBP-PEI peptide was synthesized well, and the amount of RBP-PEI peptide was 1 ug compared to 5 ug of RBP-PEI.

도 3b에 나타낸 바와 같이 PEI는 유전물질과 무게비로 0.2 ㎍에서부터 DNA와 복합체를 형성 할 수 있으며, SPDP가 함께 복합체를 형성하는데 큰 차이가 없음을 알 수 있다. As shown in FIG. 3B, it can be seen that PEI can form a complex with DNA from 0.2 μg in terms of genetic material and weight ratio, and there is no significant difference in the formation of a complex with SPDP.

도 3c에 나타낸 바와 같이, RBP-PEI의 경우 DNA와의 무게비 1.5 이상에서 복합체를 형성할 수 있다. 이 점으로 보아 출발물질 PEI와 PEI-RBP는 그 특성이 다르고 다른 물질임을 알 수 있다.As shown in FIG. 3C, in the case of RBP-PEI, a complex can be formed at a weight ratio of 1.5 or more to DNA. From this point of view, it can be seen that the starting materials PEI and PEI-RBP have different characteristics and are different materials.

2-2. 세포독성 확인2-2. Cytotoxicity check

본 발명의 고분자-펩타이드 결합체의 세포독성을 확인 하고자, 유전물질(루시퍼라아제 유전자; pSV-Luc)과 고분자-펩타이드의 중량비를 달리하여 복합체를 제조하고, 상기 각 복합체를 뇌종양 세포 C6와 폐표피세포 L2(Korean Cell Line Bank, 서울대학교)에 각각 처리하여 생존능을 확인 하였다. In order to confirm the cytotoxicity of the polymer-peptide conjugate of the present invention, a complex was prepared by varying the weight ratio of the genetic material (Luciferase gene: pSV-Luc) and the polymer-peptide, and each complex was divided into brain tumor C6, And cell L2 (Korean Cell Line Bank, Seoul National University).

구체적으로, 각각의 세포를 5 x 104 cell/well의 개수로 웰에 심고, 24시간 배양하였다. FBS가 없는 배지에서 DNA 0.5ug의 고정값에서 각 전달체(carrier; PEI 또는 PEI-RBP)의 무게비(DNA:carrier = 1 : 2, 3, 4, 또는 5)로 복합체를 첨가하여 4시간동안 반응시켰고, 이후 24시간 배양하였다. 배양 후, 40ul의 5mg/ml MTT 용액(3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-disphenyltetrazoliumbromide, Pierce)을 처리 하고 4시간 동안 37℃에서 배양하였다. MTT를 포함하는 배지를 제거한 후 100ul DMSO를 각 웰에 처리하여 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다.Specifically, each of the cells was planted in a number of 5 x 10 4 cells / well and cultured for 24 hours. In a medium without FBS, the conjugate was added at a fixed value of 0.5 ug of DNA with carrier (PEI or PEI-RBP) weight ratio (DNA: carrier = 1: 2, 3, 4 or 5) Lt; / RTI > for 24 hours. After incubation, 40ul of 5mg / ml MTT solution (3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyltetrazolium bromide, Pierce) was treated and cultured at 37 ° C for 4 hours. After removing medium containing MTT, 100 ul of DMSO was added to each well and absorbance was measured at 570 nm using a microplate reader.

도 4a 및 4b에 나타낸 바와 같이, RBP-PEI 전달체의 경우 종래에 비바이러스성 전달체로 사용된 PEI 단독 처리군 보다 종양세포 및 일반세포 모두에서 더 낮은 세포독성을 나타냄을 확인 하였다. As shown in FIGS. 4A and 4B, it was confirmed that the RBP-PEI carrier showed lower cytotoxicity in both tumor cells and general cells than the PEI alone treatment group conventionally used as a non-viral carrier.

2-3. 크기 및 제타전위 확인 2-3. Size and zeta potential identification

본 발명의 유전자 전달체가 유전자와 복합체를 형성하여 세포 내로 잘 유입되기 위해서는 적당한 크기와 양성 제타전위를 갖는 것이 필요한바, RBP-PEI 전달체의 유전자와의 결합 중량비에 따른 복합체의 크기 및 제타 전위를 확인 하였다.It is necessary that the gene carrier of the present invention has a proper size and positive zeta potential in order to form a complex with a gene and to flow well into cells. The size and zeta potential of the complex according to the binding weight ratio with the gene of the RBP- Respectively.

구체적으로 전달체(carrier)인 PEI와 PEI-RBP 각각을 DNA 1ug 고정값에서 다양한 무게비(DNA:carrier = 1 : 2, 3, 4, 또는 5)로 복합체를 형성시켰다. 입자의 크기와 제타전위는 Zetasizer Nano ZS 시스템(Malvern instruments, Malvern)을 이용해 측정하였다.Specifically, the carrier PEI and PEI-RBP were each complexed with 1 ug of DNA at various weight ratios (DNA: carrier = 1: 2, 3, 4, or 5). Particle size and zeta potential were measured using a Zetasizer Nano ZS system (Malvern instruments, Malvern).

도 5a, 5b 및 5c에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 전달체 모두 + 전위와 함께 800nm 미만의 크기를 나타냈고, 특히 유전자와 전달체의 중량비가 1 : 3 내지 5일 때, 높은 제타전위 값과 200nm 미만의 크기를 나타내는바 상기 중량비에서 세포 내로 전달에 더욱 우수한 효과를 갖는 전달체를 제조할 수 있음을 확인 하였다. As shown in Figs. 5A, 5B, and 5C, all of the carriers of the present invention exhibited a size of less than 800 nm together with the + potential, and particularly when the weight ratio of the gene and the carrier was 1: 3 to 5, It was confirmed that a carrier having a better effect on the delivery into the cells at the above weight ratio can be produced.

2-4. 세포 전달 효율 확인 2-4. Confirm cell transfer efficiency

유전자와 전달체의 중량비에 따른 세포 내 유전자 전달 효율에 영향이 있는지 확인 하기 위한 실험을 실시 하였다. Experiments were carried out to determine whether there is an effect on the intracellular gene transfer efficiency depending on the weight ratio of the gene and the carrier.

구체적으로 각각의 세포를 1 x 105 cell/well의 개수로 심고, 24시간 배양하였다. FBS가 없는 배지에서 루시퍼라아제(Luciferase) DNA 1ug의 고정값에서 각 전달체의 무게비(DNA:carrier = 1 : 1~9)로 형성한 복합체를 4시간동안 전달하였고 이후 24시간 배양하였다. 배지 제거 후, 2번 PBS를 이용해 세척하였다. 리포터 라이시스 버퍼(reporter lysis buffer) 120ul를 처리 후 10분간 상온에서 반응시키고, 세포를 추출하여 침전시켜 상층액을 얻었다. 루시퍼라아제(Luciferase) 활성도는 Luminometer(Berthold detection system GmbH, Pforzheim)를 이용하여 측정하였다.Specifically, each cell was seeded at 1 × 10 5 cells / well and cultured for 24 hours. In a medium without FBS, the complex formed with a weight ratio of each carrier (DNA: carrier = 1: 1 to 9) at a fixed value of 1 ug of Luciferase DNA was transferred for 4 hours and then cultured for 24 hours. After the medium was removed, the cells were washed with PBS 2. 120ul of reporter lysis buffer was added and reacted at room temperature for 10 minutes. Cells were extracted and precipitated to obtain supernatant. Luciferase activity was measured using a Luminometer (Berthold detection system GmbH, Pforzheim).

도 6에 나타낸 바와 같이, 전달체에 의한 세포 내 유전자 전달 효율이 우수하며, 특히 유전자와 RBP-PEI 전달체의 중량비가 1:5 이상 일 때, 우수한 전달 효율을 나타냄을 확인 하였다. As shown in FIG. 6, it was confirmed that the intracellular gene transfer efficiency by the transporter was excellent, and particularly when the weight ratio of the gene to the RBP-PEI transporter was 1: 5 or more.

또한, RBP와 RBP-PEI 컨쥬게이션을 이용하여 RAGE 수용체 결합에 의한 세포 내 유입 효율을 확인 하였다. In addition, the efficiency of intracellular entry by RAGE receptor binding was confirmed using RBP and RBP-PEI conjugation.

구체적으로 각각의 세포를 1 x 105 cell/well의 개수로 웰에 심고, 24시간 배양하였다. FBS가 없는 배지에서 RBP를 2배, 10배를 사전 처리하여 4시간 동안 배양하였다. 이후, 루시퍼라아제(Luciferase) DNA 1ug의 고정값에서 각 전달체의 무게비율별로 형성한 복합체를 4시간동안 전달 후 24시간 배양하였다. 배지 제거 후, 2번 PBS를 이용해 세척하였다. 리포터 라이시스 버퍼(reporter lysis buffer) 120ul 처리 후 10분간 상온에서 반응시킨 후, 셀을 추출하여 침전시켜 상층액을 얻었다. 루시퍼라아제(Luciferase) 활성도는 Luminometer(Berthold detection system GmbH, Pforzheim)를 이용하여 측정하였다.Specifically, each cell was seeded into wells at a number of 1 × 10 5 cells / well and cultured for 24 hours. RBP was pre-treated twice and 10 times in FBS-free medium for 4 hours. Then, the complex formed by the weight ratio of each carrier at a fixed value of 1 ug of luciferase DNA was transferred for 4 hours and cultured for 24 hours. After the medium was removed, the cells were washed with PBS 2. After 120 uL of reporter lysis buffer, the cells were reacted at room temperature for 10 min. Then, the cells were extracted and precipitated to obtain supernatant. Luciferase activity was measured using a Luminometer (Berthold detection system GmbH, Pforzheim).

또한, 각각의 세포를 1 x 105 cell/well의 개수로 심고, 각각 저산소와 정상 산소 상태에서 24시간 배양하였다. 상기와 같은 방법으로 복합체 전달 후 실험 진행하였다. Each cell was seeded at a density of 1 × 10 5 cells / well and cultured in hypoxic and normal oxygen conditions for 24 hours. Experiments were carried out after the complex delivery in the same manner as described above.

도 7a 및 7b에 나타낸 바와 같이, RBP를 사전처리하지 않은 처리군(7a의 No RBP, 7b의 PEI-RBP)에서 유전자 전달효율이 더 높게 나타났는바, 본 발명의 RBP 펩타이드가 RAGE 수용체를 통해서 세포 내로 이동하는 것을 알 수 있다. 또한, 종래 비바이러스성 유전자 전달체인 PEI만을 이용하는 것과 비교하여 RBP-PEI 유전자 전달체가 더욱 높은 유전자 전달 효율을 가짐을 확인 하였다. 특히, 유전자와 전달체가 1 : 5 이상의 중량비로 결합된 경우 안정한 복합체의 형성에 의하여 전달효율이 더욱 우수해짐을 알 수 있다. 또한, 도7b 에 나타낸 바와 같이 정상상태 보다, 저산소 상태(hypoxia)에서 RAGE가 과발현 되었을 때, RBP-PEI 전달체에 의하여 유전자 전달 효율이 증가하였는바, RGAE 과발현 상태에서, 본 발명의 유전자 전달체를 이용하는 경우 더욱 높은 유전자 전달 효과를 가짐을 확인하였다. As shown in FIGS. 7A and 7B, the gene transfer efficiency was higher in the non-RBP-treated group (No RBP of 7a and PEI-RBP of 7b), indicating that the RBP peptide of the present invention It can be seen that it migrates into the cell. In addition, it was confirmed that the RBP-PEI gene transporter has a higher gene transfer efficiency than the conventional non-viral gene transfer PEI only. In particular, when the gene and the carrier are bound at a weight ratio of 1: 5 or more, the transmission efficiency is further improved by forming a stable complex. In addition, as shown in FIG. 7B, when RAGE was overexpressed in a hypoxia state than in a normal state, the gene transfer efficiency was increased by the RBP-PEI transporter. As a result, in the RGAE overexpressed state, It was confirmed that it has a higher gene transfer effect.

[[ 제조예Manufacturing example 3]  3] RAGERAGE 결합  Combination 펩타이드Peptides , 양이온 고분자 및 유전자 포함하는 복합체의 제조, Preparation of a complex containing a cationic polymer and a gene

3-1. 3-1. RAGERAGE 결합  Combination 펩타이드의Of peptide 대량 생산을 위한 시스템 구축 및  System construction for mass production and RBPRBP 생산 production

HMGB1 DNA를 주형으로 하여, 94 ℃에서 30초 동안 DNA 변성, 52 ℃에서 30초 동안 프라이머 결합, 및 72 ℃에서 30초 동안 DNA 합성을 수행하는 조건에 의해서 PCR 반응을 수행함으로써, 서열번호 1의 RAGE 결합 펩타이드를 암호화하는 서열번호 2의 DNA 서열을 대량으로 제작하였다.A PCR reaction was carried out using HMGB1 DNA as a template and under conditions of DNA denaturation at 94 DEG C for 30 seconds, primer binding at 52 DEG C for 30 seconds, and DNA synthesis at 72 DEG C for 30 seconds, A large amount of the DNA sequence of SEQ ID NO: 2 encoding the RAGE binding peptide was prepared.

이어서, 상기와 같이 제작된 서열번호 2의 DNA 서열과, T7 프로모터 및 lac 오퍼레이터를 구비하고 6-Histidine tag를 발현하는 pET-21a 벡터를 Nhe I/Xho I 제한효소로 처리함으로써 RAGE 결합 펩타이드의 발현을 위한 발현 벡터를 제작하였다.Then, the pET-21a vector containing the DNA sequence of SEQ ID NO: 2 and the T7 promoter and lac operator and expressing the 6-histidine tag was treated with Nhe I / Xho I restriction enzyme to express the RAGE-binding peptide Were prepared.

도 25c 및 25d에 나타낸 바와 같이, 펩타이드의 정제 결과 및 SDS-PAGE를 통한 RAGE 결합 펩타이드가 잘 합성 되었음을 확인 하였다. As shown in FIGS. 25C and 25D, purification results of the peptides and RAGE-binding peptides through SDS-PAGE were confirmed to be well synthesized.

3-2. 복합체의 제조 3-2. Manufacture of Composites

3-1에 따라서 제조된 RAGE 결합 펩타이드, 루시퍼라아제를 암호화하는 DNA 및 폴리에틸렌이민을 사용하여 복합체를 제조하였다. 도 28에는 복합체의 제조 과정을 개략적으로 도시하였는바, 먼저 루시퍼라아제 DNA 및 RAGE 결합 펩타이드를 소정 비율로 혼합해준 다음, 15 분 경과 후에 폴리에틸렌이민 (분자량 2kDa)을 소정 비율로 혼합해주고, 30분 동안 복합체 형성 시간을 부여하였다.A complex was prepared using the RAGE binding peptide prepared according to 3-1, DNA encoding luciferase, and polyethyleneimine. 28, a lysophosphatase DNA and a RAGE-binding peptide were mixed at a predetermined ratio. After 15 minutes, polyethyleneimine (molecular weight: 2 kDa) was mixed at a predetermined ratio, and after 30 minutes Lt; / RTI >

전술한 바와 같이 제조된 RAGE 결합 펩타이드와 DNA의 복합체를 아가로오스 겔 상에서 전기영동시켰으며, 겔 상에서의 DNA 이동 변화를 겔 지연 분석 (gel retardation assay)을 통해서 분석하였다. 또한, RAGE 결합 펩타이드 및 DNA에 양이온성 고분자로서 폴리에틸렌이민 (분자량 2kDa)을 추가하여 동일한 분석을 수행하였으다. 도 29에는 DNA와 RAGE 결합 펩타이드의 중량비에 따른 이동도, 및 DNA, RAGE 결합 펩타이드 및 폴리에틸렌이민의 중량비에 따른 이동도를 측정한 결과를 도시하였다.The complex of RAGE-binding peptide and DNA prepared as described above was electrophoresed on an agarose gel, and the change in DNA migration on the gel was analyzed through a gel retardation assay. In addition, the same analysis was performed by adding polyethyleneimine (molecular weight 2 kDa) as a cationic polymer to RAGE-binding peptide and DNA. FIG. 29 shows mobility of DNA and RAGE-binding peptide according to the weight ratio, and mobility according to the weight ratio of DNA, RAGE-binding peptide and polyethyleneimine.

도 29를 참조하면, DNA : RAGE 결합 펩타이드의 중량비가 1 : 4 이상이 되는 경우, 단단한 복합체가 형성됨을 확인할 수 있고, 이에 더해서 폴리에틸렌이민(PEI)이 추가되는 경우 더욱 단단한 복합체가 형성됨을 알 수 있다.29, when the weight ratio of DNA: RAGE binding peptide is 1: 4 or more, it can be confirmed that a rigid complex is formed, and in addition, a harder complex is formed when polyethyleneimine (PEI) is added have.

더 나아가, DNA : RAGE 결합 펩타이드 : 폴리에틸렌이민 복합체의 최적 전달 비율을 도출하기 위해서 루시퍼라아제 (luciferase) 분석을 수행하였다. 이는, 루시퍼라아제 유전자를 사용하여 수행하였는 바, 복합체를 통해서 전달된 루시퍼라아제 유전자의 발현은 루시퍼라아제 단백질의 생성을 야기하고, 전달 효율에 다른 루시퍼라아제 단백질의 차이를 루시퍼라아제의 기질인 루시페린으로 처리해 주었을 때 발생하는 빛의 세기 차이를 분석하였다.Further, luciferase assays were performed to derive the optimal delivery ratio of DNA: RAGE binding peptide: polyethyleneimine complexes. This was carried out using the luciferase gene, and the expression of the luciferase gene transferred through the complex caused the production of luciferase protein, and the difference in the luciferase protein differing in the transfection efficiency was confirmed by the expression of luciferase The difference in intensity of light when treated with luciferin, a substrate, was analyzed.

도 30a에는 DNA 중량에 대해서 각각 0배, 10배, 15배, 20배, 25배, 30배의 폴리에틸렌이민을 가해준 경우의 복합체들에 대한 상대 루시퍼라아제 단위 (relative luciferase unit, RLU)를 측정한 결과를 도시하였다. 도 30a를 참조하면, DNA : 폴리에틸렌이민의 중량비가 1 : 20 이상이 되는 경우 높은 RLU가 측정됨을 알 수 있고, 중량비 1: 20 근방에서 가장 높은 RLU가 측정됨을 알 수 있다.FIG. 30A shows the relative luciferase unit (RLU) for the complexes when 0, 10, 15, 20, 25 and 30 times of polyethyleneimine was added to the DNA weight, respectively The measurement results are shown. Referring to FIG. 30A, it can be seen that a high RLU is measured when the weight ratio of DNA: polyethyleneimine is 1:20 or more, and the highest RLU is measured at a weight ratio of 1:20.

또한, DNA : 폴리에틸렌이민의 최적 중량비로 도출된 1 : 20 중량비 복합체에 RAGE 결합 펩타이드를 첨가한 복합체들의 RLU를 측정한 결과를 도 30b에 도시하였다. 도 30b를 참조하면, DNA : RAGE 결합 펩타이드 : 폴리에틸렌이민의 중량비가 대략 1 : 8 : 20 내외인 경우에 가장 최적의 전달 성능을 나타냄을 알 수 있다.30B shows the results of measuring the RLU of complexes in which a RAGE binding peptide is added to a 1:20 weight ratio complex derived from the optimum weight ratio of DNA: polyethyleneimine. Referring to FIG. 30B, it can be seen that the most optimal delivery performance is shown when the weight ratio of DNA: RAGE binding peptide: polyethyleneimine is about 1: 8: 20.

한편, DNA + RAGE 결합 펩타이드 복합체, DNA + 폴리에틸렌이민 복합체, 및 DNA + RAGE 결합 펩타이드 + 폴리에틸렌이민 복합체 각각의 크기 및 표면 전하를 측정하였으며, 그 결과를 도 31에 도시하였다. On the other hand, the size and surface charge of the DNA + RAGE binding peptide complex, DNA + polyethyleneimine complex, and DNA + RAGE binding peptide + polyethyleneimine complex were measured, and the results are shown in FIG.

도 31에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 유전자 치료용 복합체는 직경 100 ~ 150 nm의 크기 및 양의 제타 포텐셜을 갖는 바, 세포 내로 전달되기에 적합한 크기 및 전기적 특성을 갖는다는 사실을 알 수 있다.As shown in FIG. 31, it can be seen that the gene therapeutic complex according to the present invention has a size and a positive zeta potential of 100-150 nm in diameter, and has suitable size and electrical characteristics to be delivered into cells .

[[ 시험예Test Example 1]  One] RAGERAGE 결합  Combination 펩타이드(RBP)의Of peptide (RBP) 효과 확인 Check the effect

시험예Test Example 1-1.  1-1. RBP의RBP's RAGERAGE 수용체  Receptor 결합여부Whether or not it 확인 Confirm

제조예 1에 따라 제조된 펩타이드가 RAGE 수용체에 결합하여, RAGE 신호 전달을 차단하는 역할을 할 수 있는지 확인하는 실험을 실시하였다. Experiments were conducted to confirm that the peptide prepared according to Preparation Example 1 could bind to the RAGE receptor and play a role in blocking RAGE signal transduction.

구체적으로 264.7 세포에 LPS를 처리하여 염증을 유도하였다. 4시간 후 본 발명의 펩타이드(RBP)를 각각 1, 3, 5㎍씩 처리한 후에 RAGE antibody(Abcam)을 이용해 형광표지하고, 형광의 변화를 확인하였다. 대조군은 염증 유도하지 않은 세포이고, LPS는 LPS 처리 후 펩타이드 미처리군, 그리고 각각 펩타이드 1, 3, 5㎍ 처리군으로 나누어 실험을 실시하였다.Specifically, 264.7 cells were treated with LPS to induce inflammation. After 4 hours, the peptide (RBP) of the present invention was treated with 1, 3, and 5 쨉 g of each, followed by fluorescence labeling using RAGE antibody (Abcam), and the change of fluorescence was confirmed. The control group was the non-inflammatory cell, and the LPS was divided into the untreated group after LPS treatment and the treated group with 1, 3, and 5 μg of peptide, respectively.

도 8에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 제조된 RAGE 결합 펩타이드(RBP)는 RAGE 수용체에 잘 결합됨을 확인 하였다. As shown in FIG. 8, the RAGE-binding peptide (RBP) prepared in the present invention was found to bind well to the RAGE receptor.

시험예Test Example 1-2.  1-2. RBP의RBP's 항염효과 확인 Confirm anti-inflammatory effect

제조예 1의 펩타이드가 RAGE의 결합하여 항염효과를 나타내는지 확인하였다. It was confirmed whether the peptide of Preparation Example 1 exhibited anti-inflammatory effect by binding of RAGE.

구체적으로, 264.7 세포에 LPS 8ng을 처리하여 염증을 유발하였다. 4시간 후에 본 발명의 펩타이드를 각각 1, 3, 5 ㎍씩 처리하였고 24시간 후에 각각 처리군의 배지를 회수하여, ELISA 분석을 실시하였다. 대조군은 염증 유도하지 않은 세포이고, LPS는 LPS 처리 후 펩타이드 미처리군, 그리고 각각 펩타이드 1, 3, 5㎍ 처리군으로 나누어 실험을 실시하였고, ELISA 분석은 TNF-a, IL-6, IL-1β ELISA kit (eBioscience)를 사용하하였으며, TNF-a, IL-6 수준을 측정하여 도 9a 및 9b에 나타내었다. Specifically, 264.7 cells were treated with 8ng LPS to induce inflammation. After 4 hours, the peptides of the present invention were treated with 1, 3, and 5 쨉 g, respectively. After 24 hours, the medium of each treatment group was recovered and subjected to ELISA analysis. The control group was the non-inflammatory cell, and the LPS was divided into the untreated peptide group and the peptide treated groups 1, 3 and 5 μg respectively. The ELISA analysis showed that TNF-a, IL-6, ELISA kit (eBioscience) was used. TNF-a and IL-6 levels were measured and shown in FIGS. 9a and 9b.

또한, 상기와 동일한 방법으로 LPS 대신 HMGB1을 처리한 후 TNF-a, IL-6 수준을 측정하여, 도 9c 및 9d에 나타내었다. In addition, HMGB1 was treated in place of LPS in the same manner as above, and levels of TNF-a and IL-6 were measured and shown in FIGS. 9c and 9d.

도 9a, 9b, 9c 및 9d에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 RBP 펩타이드는 LPS, HMGB1에 의한 염증을 일으키는 사이토카인을 감소시키는 효과를 가지며, 특히 5㎍ 이상 처리된 경우, 그 효과가 더욱 유의한 것을 확인 하였다. As shown in FIGS. 9A, 9B, 9C and 9D, the RBP peptide of the present invention has an effect of reducing cytokines that cause inflammation by LPS and HMGB1, and particularly when treated with 5 μg or more, Respectively.

시험예Test Example 1-3.  1-3. InIn -- vivovivo 활성 확인  Verify Active

마우스 ALI 모델에서 본 발명의 RBP에 의한 항염 효과 확인하였다. The anti-inflammatory effect of RBP of the present invention was confirmed in the mouse ALI model.

구체적으로, BALB/c 마우스에 아무처리도 하지 않은 개체를 대조군으로 하였고, LPS 20ug만 처리한 군을 음성대조군(LPS)으로 하였고, LPS와 함께 본 발명의 RBP를 처리한 실험군을 처리량에 3ug 또는 10 ug으로 나누어 실험군으로 설정하였다. 실험군의 경우, LPS 20ug과 RBP 3 ug 또는 10 ug을 동시에 기관내주사법을 이용하여 마우스에 처리하였다. 모든 실험군 및 대조군은 24시간 후, 안락사하여 폐세척액과 폐조직을 채취하였다.Specifically, a group treated with no treatment of BALB / c mice was used as a control group, a group treated with 20ug of LPS alone was used as a negative control (LPS), and an experimental group treated with RBP of the present invention together with LPS was administered with 3ug And 10 ug, respectively. For the experimental group, mice were treated with 20 ug of LPS and 3 ug or 10 ug of RBP at the same time using trachea internalization. All experimental and control groups were euthanized 24 hours later and lung tissue and lung tissue were collected.

1-3-1. 1-3-1. 폐세척액Lung cleaning fluid 및  And 폐조직에서의In lung tissue 사이토카인 변화 분석 Analysis of cytokine changes

ELISA kit(E-Bioscience, San Diego, CA, 미국)를 이용하여 사이토카인의 변화를 측정하였다. ELISA kit 제조사의 사용방법설명서를 따라 시행하였다.Changes in cytokines were measured using an ELISA kit (E-Bioscience, San Diego, Calif., USA). The ELISA kit was used according to the instructions of the manufacturer.

폐세척액(BAL fluid)을 채취하여 사이토카인의 변화를 도 10a, 10b 및 10c에 나타내었다. 도 10a, 10b 및 10c에 나타낸 바와 같이, 폐세척액 내에서 염증을 유발하는 사이토카인들이 LPS를 처리함에 따라 증가함을 확인했다. 이때 RBP를 처리하게 되면 사이토카인들의 분비량이 줄어드는 것을 확인하였고, 이는 RBP의 농도가 증가함에 따라 더 감소하는 경향을 나타내고 있음을 확인 하였다. 이를 통해 본 발명에 따른 RBP의 항염증 효과가 동물 단위에서도 작용하는 것을 확인하였다. Changes in cytokines obtained by collecting BAL fluid are shown in FIGS. 10A, 10B, and 10C. As shown in FIGS. 10a, 10b, and 10c, it was confirmed that inflammation-inducing cytokines in the lung lavage fluid increased with the treatment of LPS. At this time, it was confirmed that the amount of cytokines secreted by RBP treatment decreased, and it was confirmed that the concentration of RBP decreased further as the concentration of RBP increased. Thus, it was confirmed that the anti-inflammatory effect of RBP according to the present invention also works in animal units.

또한, 폐조직 내에서의 염증성 사이토카인을 확인해본 결과, 도 11a, 11b 및 11c에 나타낸 바와 같이, 마찬가지로 폐조직 내에서 염증을 유발하는 사이토카인들이 LPS를 처리함에 따라 증가함을 확인했다. 이때, RBP를 처리하게 되면 사이토카인들의 분비량이 줄어드는 것을 확인하여, 본 발명의 RBP가 항염증 효과를 가짐을 알 수 있었고, 이는 RBP의 농도가 증가함에 따라 더 감소하는 경향을 나타내고 있다. 이를 통해 RBP로 인한 항염증 효과가 동물 단위에서도 작용하는 것을 알 수 있다.Further, by confirming the inflammatory cytokine in the lung tissue, it was confirmed that as shown in FIGS. 11A, 11B, and 11C, similarly, inflammation-inducing cytokines in the lung tissue increase as LPS is treated. At this time, confirming that the secretion amount of cytokines decreased when RBP was treated, it was found that RBP of the present invention had an anti-inflammatory effect, and this tendency was further decreased as the concentration of RBP increased. This suggests that the anti-inflammatory effect of RBP also acts in animal units.

1-3-2. 폐 조직에서 1-3-2. In lung tissue RBP의RBP's 항-염증 효과의 조직학적 분석 Histological analysis of anti-inflammatory effects

RBP주입된 마우스의 폐 부위를 4% 파라포름알데하이드 용액으로 고정하고, H&E 염색에 의하여 폐 부위를 분석하였다. The lungs of RBP injected mice were fixed with 4% paraformaldehyde solution and analyzed by H & E staining.

구체적으로 채취한 폐 조직을 파라핀으로 고정하고, 조직을 5 ㎛ 두께로 절단하여, 헤마톡실린(Hematoxylin) 과 에오신(Eosin)을 이용하여 염색하여, 변화를 관찰하였다. 결과를 도 12에 나타내었다. The specimens were fixed with paraffin, the tissue was cut into 5 ㎛ thick, and stained with hematoxylin and eosin to observe the changes. The results are shown in Fig.

도 12에 나타낸 바와 같이, LPS 만 처리한 그룹에서 폐 조직 내에 폐포벽이 두꺼워지고 면역 세포의 증가로 인한 염증이 유발 된 것을 볼 수 있다. 그러나, RBP를 처리한 경우, LPS로 유도된 염증 반응이 완화되어, 폐포벽의 두께 등이 대조군과 비슷해 지는 것을 확인 하였다. 이로써 본 발명의 RBP 펩타이드가 항염증 효과를 가짐을 알 수 있다.As shown in FIG. 12, it can be seen that in the group treated with LPS alone, the lung wall becomes thicker and the inflammation due to the increase of immune cells is induced. However, when RBP was treated, the inflammatory reaction induced by LPS was alleviated, and the thickness of the alveolar wall became similar to that of the control group. Thus, it can be seen that the RBP peptide of the present invention has an anti-inflammatory effect.

1-3-3. 1-3-3. RAGERAGE 넉다운(knockdown)에On knockdown 따른  Following RBP의RBP's 효과 확인 Check the effect

RAGE의 양적인 변화는 면역염색법을 이용하여 시행하였다. RBP를 처리한 군과 처리하지 않은 군에 각각 RAGE 항체를 처리하고, RAGE 항체에 형광을 띤 항체를 결합시켜 RAGE의 양적변화를 감지하였다.Quantitative changes of RAGE were performed using immunostaining. RAGE and RAGE were treated with RAGE antibody and RAGE antibody, respectively, to detect the quantitative change of RAGE.

도 13에 나타낸 바와 같이 대조군 대비 RAGE의 양이 LPS 처리시 증가하였고 RBP를 처리함에 따라 RAGE의 양이 감소하는 것을 확인 하였다. 이로써 RBP가 RAGE에 결합하는 것을 알 수 있다. As shown in FIG. 13, the amount of RAGE was increased in the LPS treatment and the amount of RAGE was decreased in the RBP treatment. This shows that RBP binds to RAGE.

1-3-4. 폐 조직에서 1-3-4. In lung tissue RBP의RBP's 효과 확인 Check the effect

RBP주입된 마우스의 폐 부위를 IHC 염색으로 분석하였다. Histag는 갈색으로 검출되었다. 구체적으로 파라핀에 고정된 조직을 5um의 두께로 썰고 anti-his tag antibody(Bethyl)를 이용하여 IHC(Immunohistochemistry) 염색을 하고, 변화를 관찰하였다. 그 결과를 도 14에 나타내었다. The lung area of RBP injected mice was analyzed by IHC staining. Histag was detected as brown. Specifically, tissues fixed to paraffin were cut to a thickness of 5 μm and stained with IHC (Immunohistochemistry) using anti-his tag antibody (Bethyl), and the changes were observed. The results are shown in Fig.

도 14에 나타낸 바와 같이, 대조그룹과 LPS에서는 갈색 신호가 검출되지 않았고, RBP를 처리한 그룹에서만 갈색의 Histag가 관찰됨을 확인하였다. 또한 갈색 신호가 세포 윤곽에 있는 것으로 보아 본 발명의 펩타이드(RBP)가 세포막에 존재하는 RAGE에 결합해 있음을 확인 하였다. As shown in FIG. 14, no brown signal was detected in the control group and LPS, and only brown Histag was observed in the group treated with RBP. In addition, it was confirmed that the peptide of the present invention (RBP) binds to RAGE present in the cell membrane because the brown signal is present on the cell contour.

1-3-5. 1-3-5. RBP의RBP's NKNK -- kbkb 저해 효과 확인  Confirmation of inhibitory effect

본 발명의 제조예 1에서 합성된 RBP의 NK-kb 저해 효과를 확인하였다. 구체적으로 264.7 세포(Korean Cell Line Bank)에 LPS와 RBP를 각각 5 ug로 24 시간 동안 처리한 후, 상기 세포를 회수하여, 핵 추출 키트(kit)를 이용하여 핵을 추출하였다. NK-kb p65 전사 인자(Abcam) 분석을 수행하였고, NF-kb 항체(Santacruz)를 이용해 NK-Fb를 형광표지하고 세포내 위치를 확인하였다. 그 결과를 도 15a 및 도 15b에 나타내었다. The NK-kb inhibitory effect of RBP synthesized in Production Example 1 of the present invention was confirmed. Specifically, 264.7 cells (Korean Cell Line Bank) were treated with LPS and RBP at 5 ug for 24 hours, respectively, and the cells were recovered and extracted with a nuclear extraction kit. NK-kb p65 transcription factor (Abcam) analysis was performed. NK-Fb was fluorescently labeled with NF-kb antibody (Santacruz) and its intracellular location was confirmed. The results are shown in Figs. 15A and 15B.

도 15a 에 나타낸 바와 같이 NF-kb가 LPS 처리군에서 활성화 되어 핵내로 이동된 것에 반해, RBP 처리군에서 NF-kb가 세포질 내에 존재 하는 것을 확인하였다. 이는 RBP로 인해 염증 및 암세포 성장에 관여하는 NF-kb의 활성이 감소하는 것을 의미한다. 마찬가지로 도15b에 나타낸 바와 같이 NF-kb의 활성이 RBP 처리시 대조군의 수준으로 감소하였음을 확인하였다.As shown in FIG. 15A, it was confirmed that NF-kB was present in the cytoplasm in the RBP-treated group, whereas NF-kB was activated in the LPS-treated group and moved into the nucleus. This means that the activity of NF-kB involved in inflammation and cancer cell growth is decreased due to RBP. Similarly, as shown in FIG. 15B, it was confirmed that the activity of NF-kB decreased to the level of the control group at the time of RBP treatment.

1-3-6. 1-3-6. HMGB1HMGB1 유도된 염증에 대한  For induced inflammation RBPRBP 펩타이드의Of peptide 항염증 효과 확인 Identify anti-inflammatory effects

염증반응에 관여하는 쥐의 대식세포(Raw 264.7, ATCC; American Type Culture Collection)를 12개의 웰(well)을 가진 세포배양 플레이트를 기준으로 하나의 웰(well) 당 10 만개의 세포를 심은(seeding) 후, DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium, Welgene)에서 24 시간 동안 배양하였다. 배양 후, 염증 유도 단백질인 HMGB1을 4 ㎍/well 처리하여 4시간 배양해서 염증반응을 유도하였다. 그 후, 상기 배지에 아무 단백질도 발현하지 않는 플라스미드 (pEmpty, pSI; Promega, Madison, WI)를 한 well 당 0.5 ㎍ 처리한 실험군(pEmpty only)과 제조예 1의 RBP를 한 well 당 2 ㎍을 처리한 실험군(RBPonly)으로 나누어 20시간 배양하였다. 그 후, 세포의 배양배지에 대하여, 대표적인 염증성 사이토카인인 TNF-α와 IL-6의 양을 측정하기 위한, TNF-α 와 IL-6 ELISA 키트(Invitrogen)를 이용해서 효소면역분석법(ELISA)을 수행하였다. 그 결과를 도 36a 및 36b에 나타내었다.(Raw 264.7, American Type Culture Collection (ATCC)), which is involved in the inflammatory response, was cultured on a cell culture plate with 12 wells, seeding 100,000 cells per well ), And then cultured in DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium, Welgene) for 24 hours. After culturing, HMGB1, an inflammation inducing protein, was treated with 4 ㎍ / well for 4 hours to induce an inflammatory reaction. (PEmpty, pSI; Promega, Madison, WI) treated with 0.5 [mu] g per well and 2 [mu] g per well of RBP of Preparation Example 1 were added to the medium (RBPonly) and cultured for 20 hours. Then, enzyme immunoassay (ELISA) was performed on the culture medium of the cells using TNF-α and IL-6 ELISA kit (Invitrogen) for measuring the amount of TNF-α and IL-6, which are representative inflammatory cytokines, Respectively. The results are shown in Figs. 36A and 36B.

도 36a 및 36b에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 RBP는 항염증 효과를 가짐을 알 수 있다.As shown in Figs. 36A and 36B, the RBP of the present invention has an anti-inflammatory effect.

[[ 시험예Test Example 2] 유전자 전달체를 이용한 유전자 치료 복합체의 효과 확인 2] Confirmation of the effect of gene therapy complex using gene carrier

시험예Test Example 2-1.  2-1. PEIPEI -- RBP의RBP's RAGERAGE 수용체  Receptor 결합여부Whether or not it 확인 Confirm

제조예 1에 따라 제조된 펩타이드-PEI 복합체가 RAGE 수용체에 결합하여, RAGE 신호 전달을 차단하는 역할을 할 수 있는지 확인하는 실험을 실시하였다. An experiment was carried out to confirm whether the peptide-PEI complex prepared according to Preparation Example 1 could bind to the RAGE receptor and block the RAGE signal transduction.

구체적으로 C6 세포RBPPEI-RBP를 DNA와 결합시켜 복합체를 만들 처리하였다. 이후 RAGE antibody(Abcam)을 이용해 형광표지하고, 관찰하였다. Specifically, the C6 cell RBPPEI-RBP was bound to DNA to form a complex. Then, RAGE antibody (Abcam) was fluorescently labeled and observed.

도 16에 나타낸 바와 같이, RBP 처리시 RAGE의 양이 감소하고 이는 PEI와 결합된 PEI-RBP에서도 동일한 효과를 보이고 있다. 이를 통해 RAGE의 신호를 차단하고 있음을 확인하였다.As shown in FIG. 16, the amount of RAGE decreases in the RBP processing, which shows the same effect in PEI-RBP combined with PEI. This confirms that RAGE signals are blocked.

시험예Test Example 2-2.  2-2. 항암효과Anticancer effect 효과 확인  Check the effect

RAGE는 HMGB1 단백질을 포함하는 다양한 리간드들과 결합하여 면역 시스템을 활성화시키며, 이는 곧 암세포의 성장을 일으키게 된다. 따라서, 본 발명의 RBP 및 PEI-RBP 복합체 처리시 다른 리간드들과의 결합을 막아 상호작용을 억제하여 항암 활성을 가지는지 확인 하였다. RAGE binds to a variety of ligands, including the HMGB1 protein, to activate the immune system, which in turn leads to the growth of cancer cells. Therefore, it was confirmed that the RBP and PEI-RBP complexes of the present invention inhibit the interaction with other ligands to inhibit the interaction and have anticancer activity.

구체적으로, C6 세포에 HMGB1을 5 ㎍ 와 RBP를 각 5, 10 ㎍을 처리하였다. 24시간 후 배지를 채취하여 VEGF ELISA kit(Pepprotech)를 이용해 분석을 진행하였다. 마찬가지로, HMGB1 wt 5 ㎍; RBP 10 ㎍; 1 ㎍ 의 DNA와 복합체를 형성한 PEI; 그리고 1 ㎍ 의 DNA와 복합체를 형성한 PEI-RBP 각각을 처리하고, 24시간 후 배지를 채취하여 VEGF ELISA를 시행하였다.Specifically, C6 cells were treated with 5 μg of HMGB1 and 5 μg / ml of RBP, respectively. After 24 hours, the medium was collected and analyzed using a VEGF ELISA kit (Pepprotech). Similarly, HMGB1 wt 5 [mu] g; RBP 10 [mu] g; PEI complexed with 1 ug of DNA; Then, PEI-RBP complexed with 1 μg of DNA was treated and VEGF ELISA was performed after 24 hours.

도 17a 및 도 17b에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 RBP가 RAGE 리셉터가 다른 리간드들과 결합하는 것을 경쟁적으로 막아, 상호작용을 억제할 수 있음을 확인 하였다. 또한, RBP가 PEI에 결합되어도 그 기능이 유지되고 있음을 확인하였다.As shown in Figs. 17A and 17B, it was confirmed that the RBP of the present invention can competitively inhibit binding of the RAGE receptor with other ligands, and can inhibit the interaction. In addition, it was confirmed that the function of RBP is retained even when it is bound to PEI.

또한, 뇌종양 세포에서 세포의 사멸을 유도하는 자살유전자(pHSV-TK)를 이용하여 항암효과를 확인하였다. 뇌종양 세포를 뇌에 이식한 동물 모델에 pHSV-TK/PEI-RBP 복합체를 뇌정위 장치를 이용하여 투여 하였다. In addition, anti-cancer effect was confirmed by using suicide gene (pHSV-TK) which induces cell death in brain tumor cells. An animal model transplanted with brain tumor cells into the brain was administered with the pHSV-TK / PEI-RBP complex using a brain-sparing device.

도 18에 나타낸 바와 같이, 종래 유전자 전달체로 사용되는 PEI를 단독으로 이용하는 것보다 더 높은 세포사멸 유도 효율을 보였고, 치료효과를 갖지 않는 DNA를 전달한 것과 비교하여, 전달체 자체의 독성은 PEI 단독보다 낮으나, 전달 효율은 본 발명의 전달체가 더 우수함을 확인할 수 있다. As shown in Fig. 18, compared with the case where PEI used as a conventional gene carrier was used alone, the induction efficiency of inducing apoptosis was higher than that of PEI alone, and the toxicity of the carrier itself was lower than that of PEI alone , It can be confirmed that the delivery efficiency of the carrier of the present invention is superior.

시험예Test Example 2-3. 항-혈관형성 효과 확인  2-3. Confirming anti-angiogenic effects

본 발명의 펩타이드 및 펩타이드-고분자 복합체가 항-혈관형성 효과를 갖는지 확인하였다.It was confirmed that the peptide of the present invention and the peptide-polymer complex had an anti-angiogenic effect.

구체적으로 C6 세포에 RBP 10 ㎍, HMGB1 wt 5 ㎍, DNA 1 ㎍과 각각 1:1, 1:5 무게비의 PEI(1 ㎍), PEI-RBP(5 ㎍)를 4시간 동안 처리하고, 24시간 후에 배지를 채취해 마트리젤(Matrigel, BD science) 위에 배양된 혈관표피세포(HUVEC,Lonza)에 처리하였다. 4시간 후 Calcein AM(Corning)으로 형광표지하여 혈관생성정도를 확인하였고, 그 결과를 도 19에 나타내었다. Specifically, C6 cells were treated with PEI (1 μg) and PEI-RBP (5 μg) at a weight ratio of 1: 1 and 1: 5 respectively to 10 μg of RBP, 5 μg of HMGB1 wt and 1 μg of DNA for 4 hours, Afterwards, the medium was harvested and treated with vascular epidermal cells (HUVEC, Lonza) cultured on Matrigel (BD science). After 4 hours, the cells were fluorescently labeled with Calcein AM (Corning) to confirm the degree of angiogenesis. The results are shown in FIG.

도 19에 나타낸 바와 같이 대조군 대비 HMGB1 wt의 경우 혈관 생성이 촉진 되었고 RBP와 PEI-RBP에서 혈관생성이 억제된 것을 알 수 있다. 이를 통해 RBP 암세포에 대해 항-혈관생성효과를 가지고 있음을 확인하였다.As shown in FIG. 19, HMGB1 wt stimulated angiogenesis and inhibited angiogenesis in RBP and PEI-RBP compared with the control group. Thus, it was confirmed that RBP cancer cells had an anti - angiogenic effect.

시험예Test Example 2-4.  2-4. GBMCPD 동물모델에서 항-종양 효과 확인 Identifying anti-tumor effects in animal models

뇌종양세포 C6를 SD Rat에 1x105 의 개수로 뇌정위주사를 통해 뇌종양 모델을 제작하였다. 7일 후 RBP 5 ㎍; 1 ㎍의 pDNA와 각각 1:1, 1:5 무게비의 1 ㎍의 PEI; 그리고 5 ㎍의 PEI-RBP를 각각 처리하였다. 7일 후 안락사하여, 뇌조직을 채취 및 고정하였다. 다양한 표지자로 염색하여 항종양효과를 확인 하였다. 식염수만 처리한 군을 대조군으로 하였다.Brain tumor cells C6 were plated in SD rats at a dose of 1 × 10 5 to prepare a brain tumor model. RBP 5 ㎍ after 7 days; 1 [mu] g of pDNA and 1 [mu] g of PEI in a weight ratio of 1: 1 and 1: 5, respectively; And 5 μg of PEI-RBP, respectively. Seven days later, euthanasia was performed, and brain tissue was collected and fixed. The antitumor effect was confirmed by staining with various markers. The control group was treated with saline alone.

2-4-1. 2-4-1. PEIPEI -- RBP의RBP's 항종양 효과 확인  Antitumor effect confirmation

파라핀 고정된 뇌조직을 7 μm의 두께로 절단하여 TUNEL assay kit(Promega)를 이용해 뇌종양세포의 사멸 정도를 확인하였고, 그 결과를 도 20a 및 20b에 나타내었다.Paraffin-fixed brain tissue was cut to a thickness of 7 μm and the degree of brain tumor cell death was confirmed using the TUNEL assay kit (Promega). The results are shown in FIGS. 20a and 20b.

도 20a 및 20b에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비해 RBP와 PEI-RBP에서 암세포의 사멸 정도가 확연히 늘어난 것으로 RBP의 항암효과를 확인하였다. As shown in FIGS. 20A and 20B, the cancer cell death rate of RBP and PEI-RBP was significantly increased compared to that of the control group, confirming the anti-cancer effect of RBP.

2-4-2. 2-4-2. RAGERAGE 신호전달 저해 효과 확인  Identification of inhibition of signal transduction

파라핀 고정된 뇌조직을 7 μm의 두께로 절단한 후, RAGE antibody(Abcam)을 이용하여 형광표지함으로 RAGE의 감소정도를 확인하였고, 그 결과를 도 21에 나타내었다. After cutting the paraffin-embedded brain tissue to a thickness of 7 μm, the degree of decrease of RAGE was confirmed by fluorescence labeling using RAGE antibody (Abcam). The result is shown in FIG.

도 21에 나타낸 바와 같이, 대조군과 PEI에 비해 RBP가 들어간 군에서는 RAGE의 형광신호가 감소했고 이를 통해 RAGE의 신호전달이 저해되었음을 확인하였다.As shown in FIG. 21, RAGE fluorescence signals were decreased in the RBP-containing group compared with the control group and PEI, thereby confirming that RAGE signaling was inhibited.

2-4-3. 2-4-3. VEGFVEGF 효과 확인  Check the effect

RAGE는 그 리간드와의 결합으로 종양조직의 성장을 촉진시키는 사이토카인들을 분비시킴으로, 본 발명의 펩타이드(RBP) 또는 PEI-RBP의 처리시 종양조직에서 VEGF 발현을 감소시킬 수 있는지 확인 하였다. 구체적으로 파라핀 고정된 뇌조직을 7 μm의 두께로 절단한 후, VEGF antibody(Santacruz)를 이용하여 염색 후 VEGF의 분비 정도를 확인하였고, 그 결과를 도 22 및 뇌종양 조직에서 VEGF 발현양을 확인한 결과를 도 23에 나타내었다. RAGE secreted cytokines that promote growth of tumor tissue by binding with its ligand, thus confirming that treatment of the peptide (RBP) or PEI-RBP of the present invention can reduce VEGF expression in tumor tissues. Specifically, paraffin-fixed brain tissue was cut to a thickness of 7 μm, and the degree of secretion of VEGF was determined after staining using VEGF antibody (Santacruz). The results were as shown in FIG. 22 and in the amount of VEGF expression in brain tumor tissues Is shown in Fig.

도 22에 나타낸 바와 같이, VEGF의 발현 양이 RBP와 PEI-RBP에서 감소한 것을 확인 하였으며, 이를 통해 RBP가 혈관생성인자인 VEGF의 발현을 감소시키는 항-혈관생성효과를 가지고 있음을 확인하였다.As shown in FIG. 22, it was confirmed that the expression level of VEGF was decreased in RBP and PEI-RBP, and it was confirmed that RBP had an anti-angiogenic effect of reducing the expression of VEGF, an angiogenic factor.

도 23에 나타낸 바와 같이, RBP 또는 RBP-PEI 처리한 뇌종양 조직에서 VEGF 발현양이 현저하게 감소하는 것을 확인 하였는바, 본 발명의 펩타이드는 뇌종양에서 사이토카인의 분비 억제 효과를 가지며, 고분자와 결합하여도 상기 효과에 영향을 받지 않음을 확인하였다. As shown in FIG. 23, the amount of VEGF expression significantly decreased in RBP or RBP-PEI-treated brain tumor tissues. As a result, the peptide of the present invention has cytokine secretion inhibitory effect in brain tumors, Were not affected by the above effects.

2-4-4. a-2-4-4. a- smoothsmooth musclemuscle actin에to actin 미치는 영향 확인  Identify the impact

구체적으로 파라핀 고정된 뇌조직을 7 μm의 두께로 절단한 후, a-smooth muscle actin(Abcam)를 이용하여 염색 후 a-smooth muscle actin의 분비 정도를 확인하였고, 그 결과를 도 24에 나타내었다. Specifically, paraffin-fixed brain tissue was cut to a thickness of 7 μm, and the degree of secretion of a-smooth muscle actin was confirmed after staining with a-smooth muscle actin (Abcam). The results are shown in FIG. 24 .

도 24에 나타낸 바와 같이 a-smooth muscle actin의 발현 양이 RBP와 PEI-RBP에서 감소한 것을 확인 하였으며, 이를 통해 RBP가 혈관에서 발현되는 a-smooth muscle actin의 발현을 감소시키는 항-혈관생성효과를 가지고 있음을 확인하였다. As shown in FIG. 24, the expression level of a-smooth muscle actin was decreased in RBP and PEI-RBP, indicating that RBP reduced the expression of a-smooth muscle actin in blood vessels Respectively.

[[ 시험예Test Example 3]  3] 제조예Manufacturing example 3-1의 복합체의 효과 확인  Confirming the effect of 3-1 complex

시험예3Test Example 3 -1. 본 발명에 따른 유전자 치료용 복합체의 유전자 전달 효율 비교-One. Comparison of gene transfer efficiency of the gene therapy complex according to the present invention

C6 신경교모세포종 세포주를 사용한 형질전환감염 실험을 통해서, 본 발명에 따른 유전자 치료용 복합체의 루시퍼라아제 유전자 전달 효율을 루시퍼라아제 분석 방법을 사용하여 다른 약물전달체와 비교 평가하였으며, 그 결과를 도 8에 도시하였다. 도 33을 참조하면, 유전자 단독 (naked) 전달 효율과 비교할 때에, RAGE 결합 펩타이드와의 복합체 (RBP)는 전달 효율의 증가가 거의 관찰되지 않았고, 분자량 2 kDa의 폴리에틸렌이민과의 복합체 (PEI 2 kDa)는 약간 전달 효율 증가가 관찰되었으나, 유전자 + RAGE 결합 펩타이드 + 폴리에틸렌이민 복합체 (RBP + PEI 2 kDa)의 경우는 유전자가 RAGE 결합 펩타이드와 결합된 경우, 또는 폴리에틸렌이민과 결합된 경우에 비해서 더욱 향상된 전달 효율을 나타내었다.The results of the transfection experiments using C6 neuroblastoma cell line showed that the gene transfer efficiency of the gene therapy complex according to the present invention was compared with other drug delivery vehicles using the luciferase assay, Respectively. 33, there was little increase in the transfer efficiency of the complex (RBP) with the RAGE-binding peptide when compared with the naked transfection efficiency, and a complex with polyethyleneimine having a molecular weight of 2 kDa (PEI 2 kDa ), But the gene + RAGE binding peptide + polyethylenimine complex (RBP + PEI 2 kDa) was more improved when the gene was bound to the RAGE binding peptide or when it was conjugated with the polyethyleneimine Respectively.

시험예Test Example 3-2.  3-2. RAGERAGE 결합  Combination 펩타이드에To peptides 의한 암 유발 신호전달 경로의 방해 확인 Of Cancer-Induced Signal Transduction Pathways

S100B는 공지된 RAGE 리간드이며, RAGE에 결합하여 TNF-α 방출을 촉진하는 것으로 알려져 있는 바, 실시예 1에서 제작된 RAGE 결합 펩타이드가 RAGE에 결합함으로써 S100B에 의한 TNF-α 방출을 억제하는지를 확인하는 실험을 진행하였다. Raw 264.7 대식세포에 대해서, 아무런 리간드도 처리하지 않은 경우 (대조군), 서열번호 1에 따른 RAGE 결합 펩타이드만을 처리한 실험군 (RBP), S100B만을 처리한 실험군 (S100B), S100B와 서열번호 1에 따른 RAGE 결합 펩타이드를 함께 처리한 실험군 (S100B + RBP), S100B와 우혈청 알부민을 처리한 실험군 (S100B + BSA) 각각의 TNF-α 방출 정도를 측정하였으며, 그 결과를 도 2에 도시하였다.S100B is a known RAGE ligand and is known to bind RAGE and promote TNF- [alpha] release, confirming whether the RAGE binding peptide produced in Example 1 inhibits TNF- [alpha] release by S100B by binding to RAGE The experiment was carried out. (RBP) treated with only the RAGE-binding peptide according to SEQ ID NO: 1, the test group treated with S100B alone (S100B), the test group treated with S100B and SEQ ID NO: 1 (S100B + RBP) treated with RAGE-binding peptide and S100B and bovine serum albumin (S100B + BSA) were measured. The results are shown in FIG.

도 26를 참조하면, 공지된 TNF-α 방출 촉진 인자인 S100B를 처리하였을 경우의 TNF-α 방출 정도에 비해서 (S100B), 서열번호 1에 따른 RAGE 결합 펩타이드를 함께 처리하였을 경우 (S100B + RBP)에 현저히 감소되는 것을 확인할 수 있었다.26, when the RAGE-binding peptide according to SEQ ID NO: 1 was treated (S100B + RBP) in comparison with the degree of TNF-α release in the case of treatment with the known TNF-α release promoting factor S100B, Which was significantly reduced.

또한, S100B와 서열번호 1에 따른 RAGE 결합 펩타이드를 C6 신경교모세포종 세포주에 처리한 후, VEGF ELISA를 사용하여 혈관생성 억제 효과를 평가하였다. 아무런 리간드도 처리하지 않은 경우 (대조군), 서열번호 1에 따른 RAGE 결합 펩타이드만을 처리한 실험군 (RBP), S100B와 서열번호 1에 따른 RAGE 결합 펩타이드를 함께 처리한 실험군 (S100B + RBP), S100B와 우혈청 알부민을 처리한 실험군 (S100B + BSA) 각각의 VEGF 생성 정도를 측정하였으며, 그 결과를 도 27에 도시하였다.In addition, RAGE-binding peptides according to S100B and SEQ ID NO: 1 were treated with C6 glioblastoma cell line, and the effect of angiogenesis inhibition was evaluated using VEGF ELISA. (RBP) treated with only the RAGE-binding peptide according to SEQ ID NO: 1, the test group (S100B + RBP) treated with S100B and the RAGE-binding peptide according to SEQ ID NO: 1, The degree of VEGF production in each of the experimental groups treated with the serum albumin (S100B + BSA) was measured, and the results are shown in Fig.

도 27을 참조하면, S100B만을 처리하였을 경우의 VEGF 생성 정도에 비해서 (S100B), 서열번호 1에 따른 RAGE 결합 펩타이드를 함께 처리하였을 경우 (S100B + RBP)에 현저히 감소되는 것을 확인할 수 있었다.Referring to FIG. 27, it was confirmed that the degree of VEGF production when S100B alone was treated (S100B) and the case of RAGE-binding peptide according to SEQ ID NO: 1 (S100B + RBP) were significantly decreased.

시험예3Test Example 3 -3. 본 발명에 따른 유전자 치료용 복합체의 세포 내 독성 비교-3. Intracellular toxicity of the gene therapeutic complex according to the present invention

C6 신경교모세포종 세포주를 사용한 형질전환감염 실험을 통해서, 본 발명에 따른 유전자 치료용 복합체의 세포 내 독성을 MTT 분석방법을 사용하여 비교 평가하였으며, 그 결과를 도 34에 도시하였다. The intracellular toxicity of the gene therapy complex according to the present invention was compared and evaluated by MTT assay through the transfection experiment using the C6 glioblastoma cell line. The results are shown in Fig.

도 33에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 유전자 치료용 복합체 (RBP + PEI 2kDa)는 분자량 25 kDa의 폴리에틸렌이민 또는 리포펙타민을 사용한 복합체보다 월등하게 낮은 세포 독성을 나타낸다는 점을 알 수 있다.As shown in FIG. 33, it can be seen that the gene therapy complex (RBP + PEI 2 kDa) according to the present invention shows significantly lower cytotoxicity than the complex using polyethyleneimine or lipofectamine having a molecular weight of 25 kDa.

시험예3Test Example 3 -4. 본 발명에 따른 유전자 치료용 복합체의 복합치료 효과 확인-4. Confirmatory effect of complex treatment of gene therapy complex according to the present invention

암치료 유전자로서 공지된 활성을 갖는 HSV-TK 유전자를 다양한 유전자 전달체와 복합체를 형성하여 C6 신경교모세포종 세포주에 형질전환감염시킨 후, 간시클로비르 (ganciclovir)가 첨가된 배지 (10 ㎍/ml)에서 배양한 후, 아넥신 V 분석방법을 사용하여 세포사멸 효율을 평가하였다.The HSV-TK gene having known activity as a cancer treatment gene was complexed with various gene carriers and transformed into C6 glioblastoma cell line. Then, HSV-TK gene was transfected in a medium supplemented with ganciclovir (10 g / ml) After incubation, cell death efficiency was assessed using Annexin V assay.

도 34a 내지 34e에는 각각 HSV-TK 유전자만을 사용한 대조군 (34a), 분자량 2 kDa의 폴리에틸렌이민과 HSV-TK 유전자와의 복합체를 사용한 실험군 (34b), 본 발명에 따른 유전자 치료용 복합체로서 서열번호 1의 RAGE 결합 펩타이드, 분자량 2 kDa의 폴리에틸렌이민, 및 HSV-TK 유전자의 복합체를 사용한 실험군 (34c), 분자량 25 kDa의 폴리에틸렌이민과 HSV-TK 유전자와의 복합체를 사용한 실험군 (34d), 및 상용 유전자 전달체인 리포펙타민과 HSV-TK 유전자와의 복합체를 사용한 실험군 (34e)에 대한 암세포 사멸 효과를 그래프로 도시하였다.34A to 34E show a control group (34a) using only the HSV-TK gene, an experimental group (34b) using a complex of a polyethyleneimine having a molecular weight of 2 kDa and an HSV-TK gene, An experimental group (34c) using a complex of a RAGE-binding peptide of molecular weight 2 kDa, a complex of HSV-TK gene (34c), a group of polyethyleneimine with a molecular weight of 25 kDa and a HSV- The cancer cell killing effect on the experimental group (34e) using the complex of trans-chain lipofectamine and the HSV-TK gene is shown in a graph.

도 34a 내지 34e를 참조하면, 본 발명에 따른 유전자 치료용 복합체는, 분자량 2 kDa의 폴리에틸렌이민과 HSV-TK 유전자와의 복합체를 사용한 실험군 (34b) 보다 높은 암세포 사멸 효과를 나타내며, 또한, 상용 유전자 전달체인 리포펙타민을 사용한 경우 (34e)와 유사한 정도의 암세포 사멸 효과를 나타냄을 알 수 있다.34A to 34E, the gene therapeutic complex according to the present invention exhibits a higher cancer cell killing effect than the experimental group (34b) using a complex of a polyethyleneimine having a molecular weight of 2 kDa and a HSV-TK gene, (34e) in the case of using the carrier chain lipofectamine.

시험예Test Example 3-5. 동물 모델에서의 본 발명에 따른 복합체의 복합치료 효과 확인 3-5. Confirmatory effect of the complex according to the present invention in an animal model

암치료 유전자로서 공지된 활성을 갖는 HSV-TK 유전자를 다양한 유전자 전달체와 복합체를 형성하여 C6 신경교모세포종 세포주가 주입된 동물 모델(Sprague dawley rat, male, 7 weeks)에 처리한 후, 대조군에는 식염수를, 1ug의 pHSV-TK와 각 그룹의 최적비율에서 복합체를 30분간 형성하였고 뇌정위주사를 통해 처리하였다. 7일간 매일 간시클로비르(ganciclovir)를 복강 내 주사로 투여하였다. 동물 모델에서의 항암 효과는 동물의 뇌 조직을 이용한 Nissl 염색에 의해서 평가하였다. 복합체는 1회 뇌정위 장치를 이용하여 뇌종양 조직에 직접 투여하였으며, 각 복합체는 1 ㎍의 DNA에 각각 1:1, 1:5 무게비의 1 ㎍ PEI, 5 ㎍ PEI-RBP를 혼합하여 복합체를 구성하였다. The HSV-TK gene having known activity as a cancer treatment gene was treated with an animal model (Sprague dawley rat, male, 7 weeks) injected with a C6 glioblastoma cell line to form a complex with various gene carriers, , 1 μg of pHSV-TK and the optimal ratio of each group were formed for 30 minutes and treated with brain scintigraphy. The ganciclovir was administered intraperitoneally every day for 7 days. The anticancer effect in animal models was evaluated by Nissl staining using animal brain tissue. The complexes were directly administered to brain tumor tissues using a single intratracheal device. Each complex was composed of 1 μg of DNA mixed with 1 μg of PEI and 5 μg of PEI-RBP at a weight ratio of 1: 1 and 1: 5, respectively Respectively.

도 35a 및 35b에는 각각 다양한 복합체로 처리한 후 전체 뇌 조직 중 종양의 백분율을 나타낸 그래프와, 실제 뇌 조직 관찰 사진을 도시하였다. 도 36a 및 36b를 참조하면, 본 발명에 따른 복합체 (TK/RBP/PEI 2 kDa)를 사용하여 치료 유전자를 전달한 경우에, 분자량 2 kDa의 폴리에틸렌이민 전달체만을 사용한 경우 또는 분자량 25 kDa의 폴리에틸렌이민 전달체를 사용한 경우에 비해서 더욱 우수한 암 성장 억제 효과를 나타냄을 알 수 있다.FIGS. 35A and 35B are graphs showing the percentage of tumors in the entire brain tissue after treatment with various complexes, respectively, and photographs of actual brain tissue observation. 36A and 36B, when the therapeutic gene is delivered using the complex (TK / RBP / PEI 2 kDa) according to the present invention, only a polyethyleneimine carrier having a molecular weight of 2 kDa or a polyethyleneimine carrier having a molecular weight of 25 kDa It can be seen that the cancer growth inhibiting effect is more excellent than that in the case of using

[[ 시험예Test Example 4]  4] RBPRBP 펩타이드의Of peptide 신경세포 보호효과 확인 Confirm nerve cell protection effect

4-1. 저산소 상태에서 RBP의 항염증 효과4-1. Anti-inflammatory effect of RBP in hypoxic condition

쥐의 신경세포 (Neuro 2a, ATCC; American Type Culture Collection)를 12개의 웰(well)을 가진 세포배양 플레이트를 기준으로 웰(well) 당 10만개의 세포를 심은(seeding) 후 DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium, Welgene)에서 24시간 동안 배양하였다. 정상상태에서 아무 처리도 하지 않은 대조군(Control, Nomoxia)과 저산소 상태에서 아무 처리도 하지 않은 대조군(Coantrol, Hypoxia) 그리고 저산소 상태에서 RBP 2 ㎍을 처리한 RBP 실험군으로 나누어 RAGE 발현 여부를 확인 하였다. 저산소 (Hypoxia) 조건은 산소 농도를 1 %로 유지시키고 24시간 동안 배양하였다. 그 후, RAGE에 특이적으로 결합하는 항체 (Rabbit Anti-RAGE antibody, Abcam)를 1차 항체로 사용하여 30분 이상 저온 상태에서 반응을 시키고, 형광물질이 결합된 항체 (Anti-rabbit IgG antibody conjugated alexa 488, Thermo Fisher Scientific)를 2차 항체로 사용하여 빛을 차단하여 30분 반응시켰다. 그 후, 유세포분석기와 공초점 현미경을 통해 RAGE 감소를 정량적 및 정성적으로 분석하였다. Mouse neural cells (ATCC; American Type Culture Collection) were seeded with 100,000 cells per well on a 12-well cell culture plate, and then cultured in DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium, Welgene) for 24 hours. RAGE was expressed in a control group (Control, Nomoxia), a control group (Coantrol, Hypoxia) and a group of RBP treated with 2 ㎍ of RBP under hypoxic conditions. Hypoxia conditions were maintained at 1% oxygen concentration for 24 h. Then, the reaction was carried out at a low temperature for 30 minutes or longer using an antibody (Rabbit Anti-RAGE antibody, Abcam) specifically binding to RAGE as a primary antibody, and the antibody was conjugated with anti-rabbit IgG antibody conjugated alexa 488, Thermo Fisher Scientific) was used as a secondary antibody and reacted for 30 minutes with blocking of light. Thereafter, RAGE reduction was quantitatively and qualitatively analyzed by flow cytometry and confocal microscopy.

도 37a 및 37b에 나타낸 바와 같이, 쥐의 신경세포에서 RAGE가 저산소 상태에서 과발현 됨을 알 수 있고, 본 발명의 RBP 펩타이드를 처리하는 경우 저산소 상태에서도 RAGE의 발현을 효과적으로 차단할 수 있음을 확인하였다. As shown in FIGS. 37A and 37B, RAGE was overexpressed in rat neurons in the hypoxic state, and it was confirmed that RAGE expression can be effectively blocked even in a hypoxic state when the RBP peptide of the present invention is treated.

4-2. RBP의 신경세포 보호효과4-2. Protection effect of RBP on neurons

쥐의 신경세포 (Neuro 2a, ATCC; American Type Culture Collection)를 12개의 웰(well)을 가진 세포배양 플레이트를 기준으로 웰(well) 당 10만개의 세포를 심은(seeding) 후 DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium, Welgene)에서 24시간 동안 배양하였다. 정상상태에서 아무 처리도 하지 않은 대조군(Control, Nomoxia)과 저산소 상태에서 아무 처리도 하지 않은 대조군(Coantrol, Hypoxia) 그리고 저산소 상태에서 RBP 2 ㎍을 처리한 RBP 실험군(RBP only)으로 나누어 세포사멸억제효과를 확인 하였다. 저산소 (Hypoxia) 조건은 산소 농도를 1 %로 유지시키고 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 전용 긁개(scraper)를 이용하여 세포를 띄어내어 1.7 ml 마이크로튜브에 옮겼다. 원심분리기를 이용하여 세포를 가라앉힌 후(1,300 rpm, 3 min, 4℃), 상층액을 제거하고 차가운 PBS로 세포를 부유시켰다. 이 과정을 두 번 반복하여 세포를 세척하였다. 다시 상층액인 PBS를 제거하고 Annexin V 키트(PE annexin V apoptosis detection kit, BD biosciences) 에 포함된 10x 결합 버퍼(binding buffer)를 증류수로 1/10 희석한 1x 결합버퍼(binding buffer)로 만들어 이를 가지고 세포를 부유시켰다. 그 후, 상기 세포에 키트에 포함된 PE-annexin V와 7-AAD 시약을 각각 5 μL씩 처리를 하고 빛을 차단하여 15분 반응시켰다. 반응이 끝나면 유세포 분석기(flow cytometry) 전용 튜브에 세포를 옮기고 유세포분석을 실시하였다.Mouse neural cells (ATCC; American Type Culture Collection) were seeded with 100,000 cells per well on a 12-well cell culture plate, and then cultured in DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium, Welgene) for 24 hours. (Coantrol, Hypoxia) and RBP (RBP only) treated with 2 ㎍ of RBP in a hypoxic state were used for control of cell death (control, Nomoxia) The effect was confirmed. Hypoxia conditions were maintained at 1% oxygen concentration for 24 h. The cells were then removed using a dedicated scraper and transferred to a 1.7 ml microtube. The cells were centrifuged (1,300 rpm, 3 min, 4 ° C) and the supernatant was removed and the cells were suspended in cold PBS. This process was repeated twice to wash the cells. The supernatant of PBS was removed and the 10x binding buffer contained in the Annexin V kit (BD annexin V apoptosis detection kit, BD biosciences) was diluted 1/10 with distilled water to make a 1x binding buffer. The cells were suspended. Then, the cells were treated with 5 μL each of PE-annexin V and 7-AAD reagent contained in the kit, followed by 15 minutes of blocking with light. At the end of the reaction, the cells were transferred to a flow cytometry tube and analyzed for flow cytometry.

도 38에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 RBP 펩타이드를 처리하는 경우 저산소 상태에서 쥐의 신경세포 사멸을 억제할 수 있음을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 RBP 펩타이드는 신경세포를 보호하는 효과, 특히 저산소 상태에서 신경세포의 사멸을 억제할 수 있어, 허혈성 질환의 치료에 사용될 수 있음을 확인하였다. As shown in FIG. 38, it can be seen that when the RBP peptide of the present invention is treated, neuronal cell death can be suppressed in a hypoxic state. Therefore, it has been confirmed that the RBP peptide of the present invention can inhibit neuronal cell death, in particular, hypoxia, and thus can be used for the treatment of ischemic diseases.

<110> IUCF-HYU (Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University) <120> NOVEL PEPTIDE AND USE THEREOF <130> P17U10C1288 <150> KR 10-2016-0134514 <151> 2016-10-17 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RAGE binding peptide <400> 1 Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala Ala Tyr Arg Ala Lys 1 5 10 15 Gly Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val Lys Ala Glu Lys Ser 20 25 30 Lys Lys Lys Lys Glu Cys 35 <210> 2 <211> 126 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RAGE binding peptide <400> 2 gctagcaagc tgaaggaaaa atacgaaaag gatattgctg cctacagagc taaaggaaaa 60 cctgatgcag cgaaaaaggg ggtggtcaag gctgaaaaga gcaagaaaaa gaaggaatgt 120 ctcgag 126 <110> IUCF-HYU (Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University) <120> NOVEL PEPTIDE AND USE THEREOF <130> P17U10C1288 <150> KR 10-2016-0134514 <151> 2016-10-17 <160> 2 <170> KoPatentin 3.0 <210> 1 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RAGE binding peptide <400> 1 Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala Ala Tyr Arg Ala Lys   1 5 10 15 Gly Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val Lys Ala Glu Lys Ser              20 25 30 Lys Lys Lys Lys Glu Cys          35 <210> 2 <211> 126 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RAGE binding peptide <400> 2 gctagcaagc tgaaggaaaa atacgaaaag gatattgctg cctacagagc taaaggaaaa 60 cctgatgcag cgaaaaaggg ggtggtcaag gctgaaaaga gcaagaaaaa gaaggaatgt 120 ctcgag 126

Claims (11)

서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 펩타이드.A peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 포함하는 염증 또는 암 치료용 조성물. 1. A composition for treating inflammation or cancer comprising a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. 제2항에 있어서, 치료용 유전자를 더 포함하는 염증 또는 암 치료용 조성물. 3. The composition for treating inflammation or cancer according to claim 2, further comprising a therapeutic gene. 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 포함하는 허혈성 질환 치료용 조성물.A composition for treating ischemic diseases comprising a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. 제4항에 있어서, 치료용 유전자를 더 포함하는 허혈성 질환 치료용 조성물. The composition for treating ischemic diseases according to claim 4, further comprising a therapeutic gene. 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 포함하는 유전자 전달체A gene carrier comprising a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 제6항에 있어서,
양이온성 고분자를 더 포함하는 유전자 전달체. The method according to claim 6,
A gene carrier further comprising a cationic polymer. 제6항에 있어서,
상기 양이온성 고분자는 폴리-L-라이신, 폴리(N-에틸-4-비닐피리디늄 브로마이드), 폴리에틸렌이민, 키토산, 폴리(디메틸아미노에틸 메틸아크릴레이트) 및 폴리아미도아민으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 유전자 전달체.The method according to claim 6,
Wherein the cationic polymer is selected from the group consisting of poly-L-lysine, poly (N-ethyl-4-vinylpyridinium bromide), polyethyleneimine, chitosan, poly (dimethylaminoethylmethylacrylate) , A gene carrier. 제7항에 있어서,
상기 양이온성 고분자와 펩타이드는 링커를 통해 이황화 결합으로 컨쥬게이션 된 것인, 유전자 전달체.8. The method of claim 7,
Wherein the cationic polymer and the peptide are conjugated to a disulfide bond through a linker. 제6항의 유전자 전달체를 포함하는 유전자 전달용 조성물. A composition for gene transfer comprising the gene carrier of claim 6. 제10항에 있어서,
상기 조성물은 전달 대상인 유전자를 더 포함하고,
상기 유전자와 유전자 전달체를 1 : 4 초과의 중량비로 포함하는 것인, 유전자 전달용 조성물.11. The method of claim 10,
Wherein the composition further comprises a gene to be delivered,
Wherein the gene and the gene carrier are contained in a weight ratio of more than 1: 4.
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