KR20180040107A - Small interfering RNA and Pharmaceutical Composition for Treatment of HPV related cancer comprising the same - Google Patents

Small interfering RNA and Pharmaceutical Composition for Treatment of HPV related cancer comprising the same Download PDF

Info

Publication number
KR20180040107A
KR20180040107A KR1020170130179A KR20170130179A KR20180040107A KR 20180040107 A KR20180040107 A KR 20180040107A KR 1020170130179 A KR1020170130179 A KR 1020170130179A KR 20170130179 A KR20170130179 A KR 20170130179A KR 20180040107 A KR20180040107 A KR 20180040107A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
mir
cancer
sirna
nucleic acid
rna interference
Prior art date
Application number
KR1020170130179A
Other languages
Korean (ko)
Other versions
KR102129852B1 (en
Inventor
지성욱
장은숙
Original Assignee
주식회사 인코드젠
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 인코드젠 filed Critical 주식회사 인코드젠
Publication of KR20180040107A publication Critical patent/KR20180040107A/en
Application granted granted Critical
Publication of KR102129852B1 publication Critical patent/KR102129852B1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

The present invention relates to RNA interference inducing nucleic acid for suppressing cancer caused by human papilloma virus (HPV) and, more specifically, relates to RNA interference inducing nucleic acid capable of efficiently treating cancer by having a sequence of 5′-end area of micro RNA (miRNA), which is able to be combined with messenger RNA (mRNA) of E6 or E7 gene of HPV, while having sequences of the remaining parts arranged complementarily with mRNA base of E6 or E7 of HPV for suppressing the expression. According to the present invention, the RNA interference inducing nucleic acid, which inversely uses a problem of the miRNA-like off-target effect, includes a base sequence of tumor control micro RNA in which 5′-end of the RNA interference inducing nucleic acid is able to be combined with mRNA of E6 or E7 of HPV, and thus, the present invention is capable of suppressing cancer by suppressing the expression of E6 or E7 of HPV as well as additionally suppressing cancer as cancer suppressing micro RNA, thereby maximizing a cancer elimination and suppression effect without an off-target side effect.

Description

RNA 간섭 유도 핵산 및 이를 포함하는 HPV 감염 유발 암의 치료용 약학 조성물 {Small interfering RNA and Pharmaceutical Composition for Treatment of HPV related cancer comprising the same}TECHNICAL FIELD [0001] The present invention relates to a pharmaceutical composition for the treatment of an RNA interference-inducing nucleic acid and an HPV-

본 발명은 인간 유두종 바이러스 (human papilloma virus; 이하, HPV) 감염에 의해서 발생된 암을 억제하기 위한 RNA 간섭 유도 핵산에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 HPV의 E6 또는 E7 유전자의 전령RNA (messenger RNA; mRNA)에 결합할 수 있는 마이크로RNA (microRNA; miRNA)의 5‘말단 영역의 서열을 가지면서 나머지 부분의 서열이 HPV의 E6 또는 E7의 mRNA 염기와 상보 배열하여 그 발현을 억제하여 암을 효율적으로 치료할 수 있는 RNA 간섭 (RNA interference) 유도 핵산에 관한 것이다.The present invention relates to an RNA interference-inducible nucleic acid for inhibiting cancer caused by infection with human papilloma virus (hereinafter referred to as HPV), and more particularly, to RNA interference-induced nucleic acid for suppressing cancer caused by infection with human papilloma virus (hereinafter referred to as HPV) mRNA), and the sequence of the 5'-terminal region of the microRNA (miRNA) capable of binding to the mRNA is complementary to that of the E6 or E7 mRNA of HPV to inhibit its expression, ≪ RTI ID = 0.0 > RNA interference < / RTI >

인간 유두종 바이러스(huma papilloma virus; 이하, HPV)는 약 8,000개의 염기서열을 가진 양성 악성 종양을 일으키는 작은 DNA 바이러스이다. 현재까지 유전체의 차이에 따라 100여개 이상의 HPV 아류형이 확인되었으며, 이러한 타입 중에서 고위험성 HPV 타입(예를 들면, HPV-16, 18, 31, 33, 35, 45, 51, 52 및 56)은 자궁경부암의 거의 90%에 관계하고 있다. HPV에 감염된 자궁경부암의 50% 이상은 HPV-16 타입이 관련이 있으며 다음으로 HPV-18(12%), HPV-45(8%), HPV-31(5%) 타입이 관련이 있다. 이렇듯 고위험성의 대부분을 차지하는 16, 18 타입 (HPV16, HPV18)은 자궁경부암 및 자궁경부이형화의 주된 요인이 되며, 더불어 다른 생식기, 머리, 목 편팡상피세포 감염 시 암을 일으킨다. 자궁경부암의 발병률은 침윤성의 경우 서서히 감소하고는 있지만, 개발도상국의 여성에게서는 가장 빈번하게 나타나며 여성암의 ~25%를 차지한다. Human papilloma virus (HPV) is a small DNA virus that causes benign malignant tumors with about 8,000 nucleotide sequences. Up to now, more than 100 HPV subtypes have been identified according to differences in genome. Among these types, HPV types 16, 18, It is associated with nearly 90% of cervical cancer. More than 50% of HPV-infected cervical cancers are associated with the HPV-16 type, followed by HPV-18 (12%), HPV-45 (8%) and HPV-31 (5%). These 16,18 types (HPV16, HPV18), which account for most of the high risk, are the main causes of cervical cancer and cervical dysplasia, and also cause cancer in other genital, head and neck cancers. The incidence of cervical cancer is gradually decreasing with invasiveness, but it is most frequently seen among women in developing countries and accounts for ~ 25% of female cancers.

HPV가 암을 일으키는 데는 2개의 발암성(oncogenic) 유전자인 E6와 E7이 매우 중요하며, 이들의 단백질은 모두 HPV를 매개로 한 세포의 불멸화 및 세포 형질 전환에 관계한다. 발암성 E6 단백질의 기능은 야생형의 p53 종양 억제 단백질에 결합하여 유비퀴틴(ubiquitin) 경로를 통하여 이를 분해시킨다. 이때 E6는 E6-AP(E6-associated protein)이라는 E3 유비퀴틴-단백질 리가아제(ubiquitin-protein ligase) 활성을 가지는 단백질에 결합하여 복합체를 형성하고, 이 복합체가 야생형 p53과 결합하여 유비퀴틴화시켜 p53을 분해하는 기작을 나타낸다. p53은 DNA 손상에 대해 반응하는 기능을 하므로, E6에 의해 p53이 분해되면 p53의 단백질 발현양이 현저하게 낮아지고, DNA 손상에 대해 대처하는 세포의 반응이 현저하게 떨어져 암으로 발생하기 수월해진다. 한편, E7 단백질은 직접 Rb 단백질과 결합하여 과-인산화를 유도한다. 이러한 HPV 유래의 단백질인 E6 또는 E7은 오로지 HPV에 감염된 암만을 죽일 수 있는 특정 타겟이기에 치료용 표적으로 주목을 받고 있으며, 실제로 HPV에 의해 유도된 암 치료에서 약물 표적으로 활용되고 있다.Two oncogenic genes, E6 and E7, are crucial for HPV to cause cancer, all of which are related to HPV-mediated cell immortalization and cell transformation. The function of the carcinogenic E6 protein binds to the wild type p53 tumor suppressor protein and degrades it through the ubiquitin pathway. At this time, E6 binds to E3-associated protein E3-ubiquitin-protein ligase (E6-associated protein) to form a complex, which binds to wild type p53 and ubiquitinates to form p53 It shows the decomposition mechanism. Since p53 is responsive to DNA damage, when p53 is cleaved by E6, the amount of protein expressed by p53 is remarkably lowered, and the cell response to cope with DNA damage is remarkably reduced and cancer is more likely to occur. On the other hand, E7 protein directly binds Rb protein and induces hyperphosphorylation. These HPV-derived proteins E6 or E7 have been attracting attention as therapeutic targets because they are a specific target that can kill only the HPV-infected cancer, and they are actually used as drug targets in cancer treatment induced by HPV.

RNA 간섭(RNA interference)은 특정 유전자의 발현을 억제하는 기술로 널리 사용되고 있으며, 특히 원하는 유전자의 전령RNA(mRNA)와 거의 완전상보결합을 할 수 있는 서열로 디자인하여 손쉽게 그 유전자의 발현을 전사 후 과정에서 억제할 수 있는 장점을 가지고 있다. 이러한 RNA 간섭을 유도하는 핵산으로는 약 21개 정도의 RNA 이중체로, 전형적으로는 19개의 이중나선 구조와 3’ 말단의 2개의 돌출부(overhang)로 구성된 siRNA(small interfering RNA)가 있다. 이때의 2개의 돌출부의 핵산은 주로 디옥시티민(deoxythymidine)을 사용한다. 또한 이외에도 마이크로RNA의 전구체인 헤어핀 구조로 만드는 shRNA(short hairpin RNA)도 RNA간섭 유도체로 널리 사용되고 있다. 최근에는 이러한 RNA간섭 현상을 활용하여, 특히 세포 내의 유전자가 아닌 외부에서의 유입된 유전자인 바이러스 유전자를 선택적으로 침묵시키기 위한 용도로 활발히 연구되고 있으며, 이를 통해 바이러스 및 바이러스에 의해 유도되는 질병을 억제할 수 있다는 것이 증명되었다. 특히 본 발명에서 대상으로 하고 있는 HPV 감염 유도 종양 중에서, 자궁경부암은 그 암 세포에서 E6와 E7의 유전자를 표적으로 하는 siRNA가 p53과 pRb의 축적을 일으켜 아폽토시스(apoptosis) 또는 세포노화를 일으키는 것이 밝혀졌다. 이는 HPV-16에 감염된 자궁경부암 세포주와 HPV-18에 감염된 세포주 모두 HPV의 E6 및 E7 암 유전자가 RNAi에 의해 선택적으로 발현이 억제되어 일어남을 알 수 있었다.RNA interference is widely used as a technique to inhibit the expression of a specific gene. In particular, it is designed as a sequence capable of almost completely complementary binding with a messenger RNA (mRNA) of a desired gene, It has the advantage of being suppressed in the process. Nucleic acids that induce such RNA interference include about 21 RNA duplexes, typically siRNA (small interfering RNA) consisting of 19 double helix structures and 2 overhangs at the 3 'end. At this time, the nucleic acid of the two protrusions mainly uses deoxythymidine. In addition, shRNA (short hairpin RNA), which is made into a hairpin structure that is a precursor of microRNA, is also widely used as an RNA interference derivative. Recently, it has been actively studied for the purpose of selectively silencing a viral gene, which is a gene introduced from the outside, rather than a gene in a cell, utilizing this phenomenon of RNA interference, thereby suppressing diseases induced by viruses and viruses It is proven that it can do. Among the HPV infection-inducing tumors of the present invention, cervical cancer has been shown to cause apoptosis or cell senescence by accumulating p53 and pRb in siRNA targeting E6 and E7 genes in cancer cells lost. This suggests that both HPV-16-infected cervical cancer cells and HPV-18-infected cell lines are selectively suppressed by RNAi for the E6 and E7 cancer genes of HPV.

하지만 이러한 RNA 간섭을 유도하여 유전자를 억제하는 기술의 피할 수 없는 단점으로, 다른 유전자도 비특이적으로 저해시키는 오프-타겟 현상이 있다. 이러한 오프-타겟 효과는 RNA간섭에서 가장 핵심적인 역할을 하는 아고너트(Argonaute) 단백질이 RNA 간섭을 유도하기 위해서 인위적으로 도입시킨 RNA 간섭 유도 핵산을 세포 내에 존재하는 마이크로RNA와 동일하게 취급하여 일어난다. 그래서 이를 마이크로RNA 유사 오프-타겟 효과(miRNA-like off-target effect)라고 부르고 있다. 마이크로RNA는 발단 위치(seed region; 5'말단의 2번째부터 7번째까지, 추가적으로 오프셋의 5’말단 기준 3번째부터 8번째도 존재함)의 염기 배열(base pairing)을 통하여 주로 타겟 유전자를 인식하여 그 발현을 저해하며, siRNA도 또한 같은 위치인 발단 위치의 서열에 의존적으로 오프-타겟이 일어난다. 발단 부분의 서열에 따라 적으면 수백개에서 많으면 약 1500개 정도의 유전자의 발현에 영향을 미치며, siRNA를 이용한 표현형 스크리닝 과정에서는 양성 hit중에 30%까지의 표현형이 이러한 오프-타겟으로 나타날 정도로 그 부작용이 심각하다. 따라서 RNA간섭을 이용한 유전자 억제에서는 항상 오프-타겟으로 인하여 발생되는 잘못된 연구결과 및 치료 부작용이 크게 염려되고 있다. 한편, 마이크로RNA는 ~20개정도의 작은 리보핵산으로 타겟 유전자 저해를 통해 여러 가지 생물학적 기능을 조절한다. 특히 몇몇의 마이크로RNA는 정상세포에는 많이 발현하다가, 암세포에서는 그 발현양이 현저하게 줄어드는 현상을 보이는데, 그 중 일부는 암을 억제하는 기능이 알려져 있다. 이렇게 암을 억제하는 마이크로RNA를 종양 억제 마이크로RNA (tumor suppressor miRNA)라 부르며, 이러한 마이크로RNA의 암 억제 기능을 활용한 치료가 활발히 연구되고 있다.However, there is an inevitable disadvantage of the technique of inducing such RNA interference and suppressing the gene, and there is an off-target phenomenon which nonspecifically inhibits other genes. This off-target effect occurs when the Argonaute protein, which plays a key role in RNA interference, treats the RNA interference inducing nucleic acid, which is artificially introduced to induce RNA interference, in the same way as the microRNA present in the cell. This is called the miRNA-like off-target effect. The microRNA is mainly recognized by the base pairing of the seed region (from the 2nd to the 7th of the 5 'end, and also from the 3rd to 8th from the 5' end of the offset) And the siRNA also undergoes off-target depending on the sequence of the initiation site, which is also the same position. In the phenotype screening process using siRNA, up to 30% of the phenotypes in the positive hits are expressed as off-targets, so that the adverse effects This is serious. Therefore, there is a great concern about the erroneous research results and side effects caused by off-target in gene suppression using RNA interference. On the other hand, microRNAs are small ribonucleotides of about 20 or so regulate various biological functions through targeted gene inhibition. In particular, some microRNAs are expressed in normal cells, and the expression level of cancer cells is remarkably decreased. Some of them are known to suppress cancer. Such cancer-suppressing microRNAs are referred to as tumor suppressor miRNAs, and therapies utilizing the suppression function of these microRNAs have been actively studied.

이에, 본 발명자들은 HPV가 감염되어 발생한 암세포에서 종양 발생과 유지에 중요한 역할을 하고 있는 HPV의 E6와 E7 유전자를 억제하기 위하여, RNA간섭을 통해 그 발현을 침묵시켜 암을 억제할 수 있는 RNA 간섭 유도 핵산을 개발하고자 하였으며, 동시에 이때 발생할 수 있는 마이크로RNA 유사 오프-타겟 현상을 역이용하고자 하였다. 즉, HPV의 E6/E7 전령RNA(mRNA)에 결합할 수 있는 마이크로RNA 중 종양 억제능을 지닌 마이크로RNA를 선별하고, 선별한 마이크로RNA의 5‘발단 서열(최소한 5'말단의 2번째부터 7번째까지를 포함. 추가적으로 오프셋의 5’말단 기준 3번째부터 8번째를 포함하는 것도 의미함)을 가지도록 디자인하여 siRNA를 제작한 후에, 이것이 E6/E7에 대한 siRNA이면서 암 억제 마이크로RNA로 동시에 작용하여 기존의 siRNA에 비해 유의하게 높은 암 억제 효과를 보인다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.In order to inhibit the E6 and E7 genes of HPV, which play an important role in tumorigenesis and maintenance in cancer cells caused by infection with HPV, the inventors of the present invention have found that the expression of RNA interference And to attempt to reverse the microRNA-like off-target phenomenon that may occur at this time. That is, microin RNAs having tumor-suppressing ability among the micro RNAs capable of binding to E6 / E7 messenger RNA (mRNA) of HPV are selected, and the 5 'start sequence of the selected microRNAs (at least 5' , Plus siRNAs designed to have the third through eighth bases at the 5'-end of the offset), which then acts simultaneously with siRNA for E6 / E7 and cancer-inhibiting microRNAs The present inventors have completed the present invention by confirming that they exhibit a significantly higher cancer inhibiting effect than existing siRNAs.

본 발명의 목적은 RNA 간섭 유도 핵산의 이중가닥 중 하나의 단일가닥이 miR-206, miR-1, miR-376a, miR-329, miR-497 및 miR-218로 구성된 군에서 선택되는 하나의 마이크로RNA의 염기서열의 일부를 포함하여 해당 종양 억제 마이크로RNA와 같이 작용하고, 동시에 전체 염기서열이 HPV의 E6 또는 E7의 mRNA와 상보적인 서열 조성을 가져 HPV의 E6/E7 유전자의 발현을 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산 및 이를 포함하는 HPV 감염으로 유발된 암의 치료용 RNA 전달 약학 조성물을 제공하는 것이다. It is an object of the present invention to provide a single microarray of RNA interference inducing nucleic acid wherein one single strand of the RNA interference inducing nucleic acid is single microarray selected from the group consisting of miR-206, miR-1, miR-376a, miR-329, miR- RNA interfering with the expression of the E6 / E7 gene of HPV, which has a sequence complementary to the mRNA of E6 or E7 of the HPV and acts as the corresponding tumor suppressor microRNA, including a part of the base sequence of the RNA, And to provide an RNA delivery pharmaceutical composition for the treatment of cancer induced by HPV infection comprising the same.

상기 목적을 달성하기 위하여, RNA 간섭 유도 핵산의 이중가닥 중 하나의 단일가닥이 miR-206, miR-1, miR-376a, miR-329, miR-497 및 miR-218로 구성된 군에서 선택되는 하나의 마이크로RNA의 염기서열을 포함하고 HPV의 E6와 E7 유전자의 발현을 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산을 제공한다. One of the double strands of the RNA interference inducing nucleic acid is selected from the group consisting of miR-206, miR-1, miR-376a, miR-329, miR-497 and miR-218 And the RNA interference-inducing nucleic acid that suppresses the expression of E6 and E7 genes of HPV.

본 발명에 있어서, 상기 RNA 간섭 유도 핵산의 이중가닥 중 하나의 단일가닥의 5’ 말단의 발단서열(seed region)은 miR-206, miR-1, miR-376a, miR-329, miR-497 및 miR-218로 구성되는 군에서 선택되는 하나의 마이크로RNA의 발단 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하고, 마이크로RNA의 발단서열로 정의되는 5’말단 기준 2번째부터 7번째의 염기 서열인 GGAAUG, UCAUAG, ACACAC, AGCAGC 또는 UGUGCU를 포함하는 6-8개의 연속된 염기서열일 수 있으며, 추가적으로 오프셋 6mer 발단서열(off-set 6me seed)인 GAAUGU, CAUAGA, CACACC, GCAGCA, GUGCUU를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the 5'-terminal seed region of a single strand of the double-stranded RNA interference-inducing nucleic acid may be miR-206, miR-1, miR-376a, miR-329, miR- miR-218, wherein the microRNA is selected from the group consisting of GGAAUG and UCAUAG, which are the second to seventh base sequences at the 5 'terminus defined as the initiation sequence of microRNAs, , ACACAC, AGCAGC, or UGUGCU, and additionally includes an off-set 6me seed sequence of GAAUGU, CAUAGA, CACACC, GCAGCA, and GUGCUU .

본 발명에 있어서, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 siRNA, miRNA, shRNA, DsiRNA, lsiRNA, ss-siRNA, piRNA, endosiRNA 및 asiRNA로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the RNA interference inducing nucleic acid may be selected from the group consisting of siRNA, miRNA, shRNA, DsiRNA, lsiRNA, ss-siRNA, piRNA, endosiRNA and asiRNA.

본 발명에 있어서, 상기 RNA 간섭 유도 핵산의 이중가닥 중 miRNA-206, miR-1, miR-376a, miR-329, miR-497 및 miR-218로 구성된 군에서 선택되는 하나의 마이크로RNA의 염기서열을 포함하는 단일가닥은 아고너트 단백질과 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the base sequence of one microRNA selected from the group consisting of miRNA-206, miR-1, miR-376a, miR-329, miR-497 and miR-218 among the double strands of the RNA interference- May be characterized by binding to an agonist protein.

본 발명에 있어서, 상기 RNA 간섭 유도 핵산의 이중가닥 중 miR-1 또는 miR-206의 염기서열을 포함하는 단일가닥은 그 표적으로 알려져 있는 PTK9 또는 ADAR1 유전자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, a single strand comprising the nucleotide sequence of miR-1 or miR-206 among the double strands of the RNA interference inducing nucleic acid may be characterized in that expression of the PTK9 or ADAR1 gene known as a target thereof is inhibited .

본 발명에 있어서, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 자궁경부암 세포의 사멸을 유도하고, 침윤 또는 전이를 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the RNA interference-inducing nucleic acid induces the death of cervical cancer cells and inhibits invasion or metastasis.

본 발명은 또한, 상기 RNA 간섭 유도 핵산 서열에 상응하는 DNA 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. The present invention also provides a vector comprising a DNA sequence corresponding to said RNA interference-inducible nucleic acid sequence.

본 발명은 또한, 상기 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 HPV의 감염으로 유발되는 암의 치료용 약학 조성물을 제공한다. The present invention also provides a pharmaceutical composition for the treatment of cancer induced by infection of HPV comprising the RNA interference inducing nucleic acid.

본 발명에 있어서, 상기 암은 자궁경부암, 질암(vagina cancer), 외음부암(vulva cancer), 항문암(anal cancer), 음경암(penis cancer), 편도암(tonsil cancer), 인두암(pharynx cancer), 후두암(larynx cancer), 머리와 목암(head & neck) 및 폐의 선암(lung adenocarcinoma)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, RNA 간섭을 유도하는 핵산은 18 내지 23개로 구성되는 뉴클레오티드의 가이드 가닥(guide strand) 및 상기 가이드 가닥에 상보적인 운반자 가닥(passenger strand)으로 이루어진 이중가닥인 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 21개의 뉴클레오티드로 구성될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 이때, 상기 이중가닥은 줄기-루프(stem-loop)의 헤어핀(hairpin) 구조를 가지는 핵산이 다이서(Dicer) 단백질에 의해 줄기부분이 가공되어 이중가닥 형태로 변형되는 것, 즉, shRNA가 가공되어 siRNA 형태를 이루는 것일 수 있으나, 이는 핵산 형태에 따라 달라질 수 있으므로 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 핵산은 일반적으로 3'말단에 2개의 뉴클레오티드 돌출부(overhang)를 갖는다. In the present invention, the cancer is selected from the group consisting of a cervical cancer, a vagina cancer, a vulva cancer, an anal cancer, a penis cancer, a tonsil cancer, a pharynx cancer ), Larynx cancer, head & neck, and lung adenocarcinoma. ≪ Desc / Clms Page number 2 > In the present invention, it is preferable that the nucleic acid inducing RNA interference is a double strand composed of a guide strand of a nucleotide composed of 18 to 23 nucleotides and a complementary carrier strand to the guide strand, But it is not limited thereto. At this time, the double-stranded nucleic acid is a nucleic acid having a stem-loop hairpin structure in which a truncated portion is processed by a Dicer protein to be transformed into a double-stranded form, that is, And may be an siRNA form, but it is not limited thereto since it may vary depending on the type of nucleic acid. In addition, the nucleic acid typically has two nucleotide overhangs at the 3 ' end.

RNA 간섭을 유도하는 핵산은 안티센스 올리고뉴클레오티드로 이루어진 가이드 가닥 및 이에 상보적인 센스 올리고뉴클레오티드인 운반자 가닥이 상보적으로 이중가닥으로 혼성화된 siRNA(small interfering RNA), 가이드 가닥 서열과 운반자 가닥 서열이 루프에 의해 연결된 스템-루프 구조의 단일 RNA 가닥인 shRNA(short hairpin RNA)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 siRNA는 siRNA 제조회사나 RNA 합성 회사에 의뢰하여 손쉽게 제작할 수 있고, 21nt 내외의 짧은 올리고머이기 때문에 일반적인 세포주에 형질도입이 수월하다. 따라서 RNA 간섭을 유도하는 핵산은 표적유전자의 발현을 손쉽게 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법 또는 유전자 치료(gene therapy)의 방법으로 제공된다.The nucleic acid that induces RNA interference includes a guiding strand composed of an antisense oligonucleotide and a complementary double stranded siRNA (small interfering RNA) that is a complementary sense oligonucleotide to the carrier strand, a guide strand sequence and a carrier strand sequence in a loop , And shRNA (short hairpin RNA), which is a single RNA strand of a stem-loop structure connected by a short hairpin RNA. The siRNA can be easily prepared by commissioning the siRNA manufacturer or the RNA synthesis company, and is easy to transduce into a general cell line since it is a short oligomer at around 21 nt. Therefore, the nucleic acid that induces RNA interference is easily provided by a gene knockdown method or gene therapy method because it can easily suppress the expression of a target gene.

상기 siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고, 스템-루프(stem-loop)의 구조를 이루는 헤어핀 구조를 가질 수 있는데, 이를 특히 shRNA(short hairpin RNA)라 지칭한다. 한편, 상기 이중사슬 또는 스템 부위는 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수도 있다. 전체 길이는 10 내지 80 염기, 바람직하게는 15 내지 60 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 40 염기이다. 또한, 상기 루프 영역은 서열에 특별한 의미가 없으며, 단지 센스 올리고뉴클레오티드와 안티센스 올리고뉴클레오티드를 적당한 간격으로 연결하기 위하여 3 ~ 10 정도의 염기가 있으면 가능하다. siRNA 말단 구조는 평활(blunt) 말단 또는 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3' 말단 돌출한 구조(protruding structure)와 5' 말단 쪽이 돌출한 구조가 모두 가능하고 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 예를 들어, 염기 수로는 1 내지 8 염기, 바람직하게는 2 내지 6 염기로 할 수 있으나, 가장 바람직하게는 다이서 단백질에 의해 잘린 형태의 특징이 2염기 돌출(overhang)이다. 또한, siRNA는 발암성 E6/E7 단백질의 발현억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들어, 한쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA분자 또는 인공의 RNA분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중사슬 RNA의 일방의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스템 루프형 구조일 수도 있다. 링커의 길이는 스템 부분의 쌍을 이루는 데 지장이 없는 길이면 특별히 한정되지 않는다.The siRNA is not limited to a complete pair of double-stranded RNAs paired with each other, and may have a hairpin structure that forms a stem-loop structure. Specifically, the siRNA may be a short hairpin RNA Quot; On the other hand, the double-chain or stem portion may include a non-paired portion due to a mismatch (the corresponding base is not complementary), a bulge (no base corresponding to one chain), or the like. The total length is 10 to 80 bases, preferably 15 to 60 bases, more preferably 20 to 40 bases. In addition, the loop region has no special significance in the sequence, and it is possible to have only about 3 to 10 bases in order to connect the sense oligonucleotide and the antisense oligonucleotide at appropriate intervals. The siRNA end-structure is both blunt or cohesive. The sticky end structure can be a protruding structure with a 3 'end and a protruding structure with a 5' end, and the number of protruding bases is not limited. For example, the base water may be from 1 to 8 bases, preferably from 2 to 6 bases, but most preferably is bi-base overhang characterized by a truncated form of the dicer protein. In addition, the siRNA can be added to a protruding part of one end in a range that can maintain the effect of suppressing the expression of the carcinogenic E6 / E7 protein, for example, a small RNA (for example, a natural RNA molecule such as tRNA, rRNA, Artificial < / RTI > RNA molecules). The siRNA terminal structure does not need to have a cleavage structure on both sides, and a stem loop structure in which one terminal region of double-stranded RNA is connected by linker RNA may be used. The length of the linker is not particularly limited as long as it does not interfere with the pairing of the stem portions.

본 발명에서 용어 ‘가이드 가닥(guide strand; antisense strand)’이란 상기 이중가닥 중 표적을 저해할 용도로 서열이 정해진 단일가닥 부분으로, 실질적으로 아고너트 단백질에 주로 결합하여, 아고너트 복합체가 표적 유전자를 인식하도록 가이드를 해주는 역할을 하며, 관심 있는 타겟 유전자 mRNA에 실질적으로 또는 100% 상보적인 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드로, 이에 따라 안티센스 가닥이라고도 불리우며, 예를 들면, siRNA, miRNA, shRNA, DsiRNA, lsiRNA, ss-siRNA, piRNA, endo-siRNA 또는 asiRNA 등의 핵산 서열과 전체 또는 일부 상보적일 수 있다. 용어 ‘운반자 가닥(passenger strand; sense strand)’이란 상기의 이중가닥 중 가이드 가닥과 이중가닥 구조를 이루어서, 가이드 가닥이 아고너트 단백질과 결합할 수 있도록 도와주는 운반자 역할을 하며, 표적 핵산과 실질적으로 또는 100% 동일한 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드로서, 이에 따라 센스 가닥이라고도 불리우며, 예를 들면, siRNA, miRNA, shRNA, DsiRNA, lsiRNA, ss-siRNA, piRNA, endo-siRNA 또는 asiRNA 등의 핵산 서열과 전체 또는 일부 동일한 폴리뉴클레오티드를 말한다.As used herein, the term 'guide strand (antisense strand)' refers to a sequence of single stranded portions that are designed to inhibit the target of the double strand, and substantially binds to the agonist protein so that the agonist complex binds to the target gene SiRNA, miRNA, shRNA, DsiRNA, siRNA, siRNA, miRNA, siRNA, siRNA, and the like, lsiRNA, ss-siRNA, piRNA, endo-siRNA or asiRNA. The term " passenger strand " refers to a double-stranded structure of the double-stranded double-stranded strand, which serves as a carrier to help guide strands bind to the arch protein, Or a polynucleotide having 100% identical nucleic acid sequence and is thus also referred to as a sense strand and includes nucleic acid sequences such as siRNA, miRNA, shRNA, DsiRNA, lsiRNA, ss-siRNA, piRNA, endo-siRNA or asiRNA, Or some identical polynucleotide.

본 발명에 있어서, HPV 감염에 의해 유발된 암은, 이에 제한되는 것은 아니나 자궁경부암, 질암(vagina cancer), 외음부암(vulva cancer), 항문암(anal cancer), 음경암(penis cancer), 편도암(tonsil cancer), 인두암(pharynx cancer), 후두암(larynx cancer), 머리와 목암(head & neck) 및 폐의 선암(lung adenocarcinoma)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 자궁경부암이다.In the present invention, cancers caused by HPV infection include, but are not limited to, cervical cancer, vagina cancer, vulva cancer, anal cancer, penis cancer, Cancer of the cervix may be selected from the group consisting of tonsil cancer, pharynx cancer, larynx cancer, head & neck and lung adenocarcinoma. .

상기 HPV 감염에 의해 유발된 암세포는 E6/E7 유전자를 발현하는 분리된 세포이거나 배양된 세포일 수 있고, 분리되지 않은 채로 포유동물 중에 포함될 수 있다. 포유동물의 예로는 비인간 포유동물(예컨대, 개, 고양이, 말, 돼지, 양, 소, 염소, 설치류; 햄스터, 마우스, 래트, 및 영장류) 및 인간을 들 수 있다. 본 발명에서는 E6/E7 유전자를 발현하는 HPV 감염과 관련된 암으로 HPV 18 감염으로는 HeLa 세포를 HPV16 감염으로는 SiHa 세포를 자궁경부암 세포로 사용하였다.The cancer cells induced by the HPV infection may be isolated cells expressing the E6 / E7 gene or cultured cells, and may be contained in the mammals without being separated. Examples of mammals include non-human mammals (e.g., dogs, cats, horses, pigs, sheep, cows, goats, rodents, hamsters, mice, rats, and primates) and humans. In the present invention, cancer associated with HPV infection expressing the E6 / E7 gene was used as HPV 18 infection, and HeLa cells was used as HPV 16 infection. SiHa cells were used as cervical cancer cells.

상기 발현벡터는 본 발명에서의 siRNA, shRNA 및 안티센스 올리고뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 발현할 수 있는 종래 알려진 어떠한 발현 벡터도 사용할 수 있다. 예컨대, Promega 제품으로 GeneClip™ U1 Hairpin Cloning System(Cat.#'s C8750, C8760, C8770, C8780, C8790), siLentGene™ U6 Cassette RNA Interference System(Cat.# C7800), T7 RiboMAX™ Express RNAi System(Cat.#P1700), siSTRIKE™ U6 Hairpin Cloning Systems(Cat.#'s C7890, C7900, C7910, C7920) 및 siLentGene™ -2 U6 Hairpin Cloning Systems(Cat.#'s C7860, C8060, C8070, C8080) 등을 사용할 수 있으며, Genscript 제품으로 pRNA-U6.1(Cat.#'s SD1201, SD1202, SD1207), pRNATin-H1.2(Cat.#'s SD1223, 1224) 및 pRNAH1.1/Adeno(Cat.# SD12009) 등을 사용할 수 있다.Any expression vector known in the art that is capable of expressing any one selected from the group consisting of siRNA, shRNA and antisense oligonucleotides in the present invention may be used as the expression vector. For example, the Promega products include the GeneClip ™ U1 Hairpin Cloning System (Cat. # 'S C8750, C8760, C8770, C8780, C8790), siLentGene ™ U6 Cassette RNA Interference System (Cat. # C7800), T7 RiboMAX ™ Express RNAi System # 7900, C7910, C7920) and siLentGene ™ -2 U6 Hairpin Cloning Systems (Cat. # 'S C7860, C8060, C8070, C8080) (Cat. # 'S SD1201, SD1202, SD1207), pRNATin-H1.2 (Cat. #' S SD1223, 1224) and pRNAH1.1 / Adeno (Cat. # # SD12009) can be used.

상기 조성물의 유효성분으로 포함된 siRNA, shRNA, 올리고뉴클레오티드 또는 발현벡터는 보통 약학적 조성물로서 투여된다. 상기 투여는 핵산이 원하는 in vitro 또는 in vivo에서 표적 세포로 도입되는, 통상적으로 사용되는 유전자 도입 기법에 의하여 수행될 수 있다. 이때, siRNA, shRNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 세포 내로 도입은 특별히 이에 제한되지 않으나, 직접 합성한 뒤, 숙주세포 내로 직접 함입되거나, 또는 siRNA, shRNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 세포 안에서 발현되도록 제조된 발현 벡터 또는 PCR-기반 발현카세트 등으로 세포를 형질전환 또는 감염(infection)시켜서 수행하는 것이 바람직하며, 발현벡터는 특별히 이에 제한되지는 않는다.The siRNA, shRNA, oligonucleotide or expression vector contained as an active ingredient of the composition is usually administered as a pharmaceutical composition. Such administration can be carried out by commonly used transfection techniques in which the nucleic acid is introduced into the target cell in a desired in vitro or in vivo manner. In this case, the introduction into the cell of the siRNA, shRNA or antisense oligonucleotide is not particularly limited, but may be an expression vector prepared directly after synthesis, directly introduced into the host cell, or siRNA, shRNA or antisense oligonucleotide, PCR-based expression cassette or the like, and the expression vector is not particularly limited thereto.

한편, 통상적으로 사용되는 표적 세포로의 유전자 도입 기법에는 칼슘 포스페이트, DEAE-덱스트란, 전기천공 및 미세주입법 및 바이러스 법이 포함된다(Graham FL 및 van der Eb AJ Virol. 52:456, 1973; McCutchan JH & Pagano JS J. Natl. Cancer Inst. 41:351, 1968; Chu G et al., Nucl. Acids Res. 15:1311, 1987; Fraley R et al., J. Biol. Chem. 255:10431, 1980; Capecchi MR, Cell 22:479, 1980). 뉴클레오티드를 세포 내로 도입하는 이러한 기법들에 최근 추가된 것은 양이온성 리포좀을 사용하는 것이다(Felgner PL et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:7413, 1987). 상업적으로 구입할 수 있는 양이온성 지질 제제는 예를 들면, Tfx50(Promega) 또는 Lipofectamin 2000(Life Technologies)이 있다. On the other hand, commonly used techniques for transfection into target cells include calcium phosphate, DEAE-dextran, electroporation and microinjection and viral methods (Graham FL and van der Eb AJ Virol. 52: 456, 1973; McCutchan JH & Pagano JS J. Natl. Cancer Inst. 41: 351, 1968; Chu G et al., Nucl. Acids Res. 15: 1311, 1987; Fraley R et al., J. Biol. 1980; Capecchi MR, Cell 22: 479, 1980). A recent addition to these techniques of introducing nucleotides into cells is the use of cationic liposomes (Felgner PL et al., Proc. Nat. Acad Sci. USA 84: 7413, 1987). Commercially available cationic lipid preparations include, for example, Tfx50 (Promega) or Lipofectamin 2000 (Life Technologies).

RNA간섭을 유도하는 핵산인, siRNA 또는 shRNA의 유효농도는 원하는 효과, 예를 들면 siRNA 또는 shRNA의 부재 하에서 검출되는 발현 수준에 비해 발암성 단백질인 E7/E7 유전자의 발현의 감소를 제공하기에 충분한 양이다. siRNA 또는 shRNA는 세포 하나 당 적어도 하나의 카피의 전달을 허용하는 양으로 도입될 수 있다. 이중 가닥 물질의 도입량이 많을수록(예컨대, 세포 하나당 5개 이상, 10 개 이상, 100개 이상, 500개 이상 또는 1000개 이상의 카피), 억제 효율이 더 높아질 수 있다.The effective concentration of siRNA or shRNA, which is a nucleic acid that induces RNA interference, is sufficient to provide a reduction in the expression of the E7 / E7 gene, which is a carcinogenic protein, compared to the expression level detected in the absence of the desired effect, e.g. siRNA or shRNA It is a quantity. The siRNA or shRNA can be introduced in an amount that allows delivery of at least one copy per cell. The greater the amount of double-stranded material introduced (e.g., at least 5, at least 10, at least 100, at least 500, or at least 1000 copies per cell), the greater the inhibition efficiency.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 자궁경부암세포(HeLa)의 HPV 18 발현 유전자중 마이크로RNA에 의해 결합되는 부분을 Ago HITS-CLIP 결과를 통해 분석하고, 여기에 결합하는 마이크로RNA중 종양 억제 기능을 가질 수 있는 마이크로RNA를 선별하기 위해서, 자궁경부암 세포주와 자궁경부암 환자 시료에서 측정된 마이크로RNA 발현 결과를 분석하였다. 그 결과, 일반 세포에 비해서 종양에서 그 발현이 저해되는 마이크로RNA인 miR-206, miR-1, miR-376a, miR-329, miR-497 및miR-218를 발견하였으며, 이 중에서 miR-206과 miR-1는 마이크로RNA로써 종양의 침윤과 전의를 막는 것으로 알려져 있고, 그 외의 마이크로RNA들은 해당 마이크로RNA의 발현에 따른 자궁경부암 환자의 생존분석(Survival analysis)과 실제 자궁경부암 세포주인 HeLa에서의 창상회복실험(wound healing assay)으로 종양 억제 효과가 있음을 확인하고 선별하였다. In a specific example of the present invention, a part of the HPV 18 expression gene of cervical cancer cells (HeLa), which is bound by microRNA, is analyzed through Ago HITS-CLIP results, and a microRNA In order to screen for possible microRNAs, we analyzed the microRNA expression levels measured in cervical cancer cell lines and cervical cancer patient samples. As a result, miR-206, miR-1, miR-376a, miR-329, miR-497 and miR-218 were found to be microRNAs that inhibit their expression in tumors compared to normal cells. It is known that miR-1 is a microRNA that inhibits tumor invasion and transcription. Other microRNAs are known to be involved in the survival analysis of cervical cancer patients due to the expression of the microRNAs and the wound healing in HeLa A wound healing assay was used to confirm tumor suppression.

miR-206과 miR-1은 같은 5‘ 발단 지역(seed region)을 가지므로 같은 표적을 인식하고 저해하여 동일한 암 억제 효과를 나타낼 것으로 여겨진다. 이에 따라 miR-1또는 miR-206이 결합하는 HPV의 E7 mRNA 부위의 서열을 기반으로 miR-1/206과 같이 작용할 수 있으면서도, E6/E7 mRNA에 완전하게 배열하여 HPV의 E6/E7 유전자 발현을 억제할 수 있는 서열(206/E7)을 siRNA 형태로 합성하였다. 또한 동일한 방법으로 miR-376a, miR-329, miR-497, miR-218의 발단 서열을 포함하여 해당 마이크로RNA와 유사하게 기능하면서 HPV의 E6/E7 유전자의 발현을 억제하는 siRNA를 디자인 하였다. 특히, HPV의 감염에서 종양 발생을 일으키는 고위험군인 16과 18 타입에 대해서 동일한 방법으로 siRNA를 디자인 하였으며, 해당 siRNA의 효과는 HPV 18 감염 자궁경부암 세포인 HeLa와 HPV 16 감염 자궁경부암 세포인 SiHa에서 검증하였다. 기존의 siRNA를 디자인 할 경우에는 이론상 모든 전령mRNA의 위치와 완전 상보염기배열 하도록 제작할 수 있지만, 이 중에서 어떤 부분이 가장 효율적일지 알 수 없어 모든 경우를 실험을 통해 조사하여 동정해야 한다. 하지만, 본 발명과 같이 RNA간섭을 유도하는 핵심 단백질인 아고너트가 결합하는 위치를 미리 파악하면, siRNA가 타겟팅 되었을 때 효율적으로 표적을 억제할 수 있는 위치를 손쉽게 결정 할 수 있다.Because miR-206 and miR-1 have the same 5 'seed region, they are expected to recognize and inhibit the same target and exhibit the same cancer suppression effect. Thus, it can act like miR-1/206 based on the sequence of the E7 mRNA region of HPV bound to miR-1 or miR-206, but it is completely aligned to E6 / E7 mRNA and expresses E6 / E7 gene of HPV The inhibitory sequence (206 / E7) was synthesized in the form of siRNA. In addition, siRNAs that inhibit the expression of the E6 / E7 gene of HPV, which functions similarly to the corresponding microRNAs including the initiation sequences of miR-376a, miR-329, miR-497 and miR- In particular, the siRNAs were designed in the same way for 16 and 18 types of high-risk HPV-infected tumors, and the effect of the siRNAs was tested in HPV 18 infected cervical carcinoma cells HeLa and HPV 16 infected cervical carcinoma cells SiHa Respectively. When designing existing siRNAs, it is theoretically possible to construct all messenger mRNA positions and complete complementary nucleotide sequences, but we can not know which part is most efficient, so all cases should be investigated and identified through experiments. However, by locating the binding site of the core protein, which is a core protein for inducing RNA interference, in advance, it is possible to easily determine the position where the target can be effectively inhibited when the siRNA is targeted.

HPV를 효율적으로 저해하기 위해서는 본 실시예에서 밝힌 바와 같이, siRNA를 HPV에 대한 아고너트 결합 위치를 표적으로 하게 디자인 하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 자궁경부암에서 발현이 억제되어 암 억제 마이크로RNA로 작용할 수 있는 마이크로RNA가 결합하는 위치를 표적으로 하며, 가장 바람직하게는 자궁경부암에서 낮게 발현되는 miR-206, miR-1, miR-376a, 또는 miR-329이 결합하는 위치를 표적으로 하는 것이 바람직하다. 추가적으로, 자궁경부암 환자에서 그 발현이 높았을 때 환자의 생존에서 좋은 예후를 보이는 miR-497, miR-218의 위치를 표적으로 하는 자궁경부암 치료용 RNA간섭물질의 서열을 상보적으로 디자인 하는 것이 바람직하다. In order to efficiently inhibit HPV, it is desirable to design siRNA to target the agonist binding site to HPV as described in the present embodiment, more preferably to suppress the expression in cervical cancer, It is desirable to target the site where the functional microRNAs bind and most preferably target sites where miR-206, miR-1, miR-376a, or miR-329, which are expressed low in cervical cancer, bind Do. In addition, it is desirable to complementarily design the sequence of RNA interference for cervical cancer treatment targeting miR-497, miR-218, which has a good prognosis in patient survival when its expression is high in patients with cervical cancer Do.

또한, 본 발명에 따른 siRNA는 마이크로RNA의 발단 서열(seed sequence)을 가지고 있으므로 기존에 모든 siRNA에서 일어나는 오프-타겟 효과가 본 발명자가 의도한 특정 마이크로RNA와 같이 일어나게 된다. 본 발명에 따른 siRNA는 암 억제 마이크로RNA와 동일한 발단 서열을 통해서 표적 유전자들을 억제하고, 이를 통해 암을 억제하는 기능을 나타낸다. 따라서 본 발명의 RNA간섭 유도 핵산은 HPV 유래 암세포를 억제하는 치료효과를 나타내기 위해서 HPV E6/E7 유전자를 억제하는 효율적인 siRNA로 작용할 뿐만 아니라, 암 억제 마이크로RNA로 동시에 작용한다. 또한, 기존의 siRNA에서 보였던 마이크로RNA 유사 오프-타겟 부작용에 대한 걱정 없이, 오히려 마이크로RNA의 발단 서열을 포함하여 이를 역이용할 수 있으므로, 암 사멸 및 억제 효과를 극대화할 수 있다는 점에 주목하여 본 RNA간섭 유도 핵산 발명을 완성하였다.In addition, since the siRNA according to the present invention has a seed sequence of microRNA, the off-target effect that occurs in all siRNAs conventionally occurs like specific microRNAs of the present inventors. The siRNA according to the present invention suppresses target genes through the same initiation sequence as that of the cancer-inhibiting microRNA, thereby suppressing cancer. Therefore, the RNA interference-inducing nucleic acid of the present invention not only functions as an efficient siRNA that suppresses the HPV E6 / E7 gene, but also acts as a cancer-suppressing microRNA in order to exhibit a therapeutic effect of suppressing HPV-derived cancer cells. In addition, since it is possible to reverse it including the initiation sequence of the microRNA without worrying about the microRNA-like off-target side effect seen in the existing siRNA, it is possible to maximize the cancer death and suppression effect, And completed the invention of interference-induced nucleic acid.

본 발명의 다른 실시예에서는, 206/E7 siRNA가 E6/E7 mRNA의 양을 줄여, p21의 발현을 증가시키는 효과를 보이고, 또한 자궁경부암세포(HeLa)의 사멸을 유도하여 암세포의 수를 줄이는 결과를 나타내는 것을 확인하였다. 이는 기존의 siRNA인 E7 siRNA보다 효과적으로 자궁암세포 사멸을 유도하는 것임을 밝힐 수 있었다. 또한 206/E7 siRNA는 miR-206과 같이 기능하여, miR-206의 표적으로 알려져 있는 PTK9, ADAR1 유전자의 mRNA를 감소시켰으며, 또한 전체 전사체에서도 miR-206의 발단 표적위치(seed site)를 가지고 있는 표적 mRNA를이 모두 206/E7 siRNA에 의해서 억제된다는 것을 RNA-Seq 분석을 통해 유전체 수준에서 확인하였다. 이러한 miR-206과 같은 유전자 억제 효과는 실제로 자궁경부암세포의 이동(migration)과 침윤(invasion)을 억제하고, 따라서 암 전이(metastasis)를 막을 수 있으며, 이를 통해 기존의 HPV 특이적 siRNA인 E7 siRNA보다 암 억제가 효과적인 것을 검증할 수 있었다.In another embodiment of the present invention, the 206 / E7 siRNA reduces the amount of E6 / E7 mRNA and increases the expression of p21, and also induces the death of cervical cancer cells (HeLa) . This suggests that E7 siRNA, which is an existing siRNA, induces uterine cancer cell death more effectively. In addition, 206 / E7 siRNA functioned like miR-206, reducing the mRNA of the PTK9 and ADAR1 genes known as miR-206 targets, and also the target site of miR-206 in all transcripts It was confirmed at the genome level by RNA-Seq analysis that the target mRNA that is present is inhibited by both 206 / E7 siRNA. Such miR-206 gene suppression effects can actually inhibit the migration and invasion of cervical cancer cells and thus prevent metastasis, thereby allowing the existing HPV-specific siRNA, E7 siRNA It was verified that cancer suppression is more effective.

본 발명의 다른 실시예에서는, 자궁경부암세포(HeLa)에 대한 이종이식 생쥐 종양모델을 사용하여 206/E7의 siRNA의 종양 억제 효과를 생체에서 평가하였으며, 이때 종양의 크기를 효과적으로 줄임을 알 수 있었다. 추가적으로 기존의 HPV siRNA인 E7 siRNA와 비교하여 평가하였을 때에도, E7 siRNA 보다 효과적으로 206/E7 siRNA기 자궁경부암을 생체에서 억제할 수 있음을 확인하였다.In another embodiment of the present invention, the tumor suppression effect of 206 / E7 siRNA was assessed in vivo using a xenograft mouse tumor model for cervical cancer cells (HeLa), which effectively reduced tumor size . In addition, when compared with E7 siRNA, which is a conventional HPV siRNA, it was confirmed that 206 / E7 siRNA-phase cervical cancer could be inhibited more effectively in vivo than E7 siRNA.

본 발명에 따른 RNA 간섭 유도 핵산은 마이크로RNA 유사 오프-타겟 효과(miRNA-like off-target effect)의 문제점을 역으로 활용하는 것으로, RNA 간섭 유도 핵산의 5‘말단 중 발단 지역(seed region)이 HPV의 E6 또는 E7의 mRNA와 결합할 수 있는 종양 억제 마이크로RNA의 염기서열을 포함함으로써, 표적인 HPV의 E6와 E7의 발현을 저해하여 암을 억제할 뿐만 아니라 암 억제 마이크로RNA로 작용하여 암을 억제하는 기능이 추가적으로 나타나게 되고, 이에 따라 오프-타겟 부작용 없이 암 사멸 및 억제 효과를 극대화할 수 있다.The RNA interference-inducing nucleic acid according to the present invention reversely exploits the problem of microRNA-like off-target effect, and the seed region of the RNA interference inducing nucleic acid at the 5 ' By containing the nucleotide sequence of tumor suppressor microRNA that can bind to E6 or E7 mRNA of HPV, it inhibits E6 and E7 expression of target HPV and inhibits cancer, Inhibiting function is additionally exhibited, thereby maximizing the effect of inhibiting cancer and inhibiting it without off-target side effects.

도1은 HPV 유발 종양 중 하나인 자궁경부암을 억제하기 위한 HPV 특이적 siRNA를 암 억제 마이크로RNA로도 작용하게 하는 본 발명을 도식화해서 나타낸 것이다.
도2는 자궁경부암세포(HeLa)의 HPV 전사체에 결합하는 마이크로RNA에 대한 Ago HITS-CLIP 분석 지도와 자궁암세포 및 환자 조직에서의 마이크로RNA 발현 변화에 대한 분석 결과를 나타낸 것이다.
도3은 도2에서 발굴한 마이크로RNA의 종양 억제 기능을 확인하기 위해, 그 발현에 따른 자궁경부암 환자의 생존분석 결과와 과발현시의 자궁경부암세포(HeLa)의 세포 수 측정 및 창상회복실험(wound healing assay) 결과를 나타낸 것이다.
도4는 HPV 16과 18의 감염에 의해 발생된 자궁경부암 세포인 HeLa와 SiHa에서의 E6, E7 mRNA를 타겟팅하면서 도2에서 발굴한 마이크로RNA의 발단 서열을 가질 수 있는 siRNA 서열에 대한 분석 및 RNA간섭 효과를 검증한 결과로서, 특히 HPV 18의 E6/E7 mRNA를 타겟팅하면서 miR-1과 miR-206의 5‘말단 발단 지역(seed region)의 서열을 포함하는 206/E7 siRNA와 그 E7 표적 유전자 억제 효과를 기존의 E7 siRNA와 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도5는 206/E7 siRNA의 E6와 E7 mRNA의 억제 효과, 이를 통한 p53의 표적 유전자인 p21의 mRNA 양 증가, 자궁경부암세포(HeLa)의 사멸 증대를 기존의 E7 siRNA와 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도6은 206/E7 siRNA가 miR-206과 같이 기능하여 알려진 표적의 mRNA를 억제하고, 자궁경부암 세포의 침윤성과 전이성을 기존의 siRNA보다 더 효과적으로 억제하는 비교 결과를 matriegel을 이용한 boyden chamber 실험과 창상회복실험(wound healing assay) 결과로 나타낸 것이다.
도7은 206/E7 siRNA를 자궁경부암(HeLa) 이종 이식 생쥐 종양 모델에 적용하였을 때, 기존의 E7 siRNA보다 생체에서 효과적으로 암을 억제하는 결과를 나타낸 것이다.FIG. 1 schematically illustrates the present invention in which an HPV-specific siRNA for inhibiting cervical cancer, which is one of the HPV-induced tumors, acts also as a cancer-inhibiting microRNA.
FIG. 2 shows the results of the Ago HITS-CLIP assay for microRNAs binding to HPV transcript of cervical cancer cells (HeLa) and the analysis of microRNA expression changes in uterine cancer cells and patient tissues.
FIG. 3 is a graph showing the survival analysis results of cervical cancer patients according to the expression of the microRNAs isolated in FIG. 2, the cell count of cervical cancer cells (HeLa) at the time of overexpression, healing assay.
FIG. 4 is a graph showing the results of analysis of siRNA sequences that can have an initiation sequence of microRNA extracted in FIG. 2 while targeting E6 and E7 mRNAs in HeLa and SiHa, which are cervical cancer cells caused by infection of HPV 16 and 18, As a result of verifying the interference effect, it was found that 206 / E7 siRNA containing the sequence of the 5'-terminal region of miR-1 and miR-206, targeting E6 / E7 mRNA of HPV 18 and its E7 target gene Inhibitory effect compared to existing E7 siRNA.
FIG. 5 shows the inhibitory effect of E6 and E7 mRNA of 206 / E7 siRNA, thereby increasing the amount of mRNA of p21, the target gene of p53, and the extinction of cervical cancer cells (HeLa) compared to existing E7 siRNA .
FIG. 6 shows the result of comparing 206 / E7 siRNA functioning as miR-206 to inhibit mRNA of a known target and inhibiting the invasiveness and metastasis of cancer cells more effectively than conventional siRNAs, using a matriegel- As shown in the results of a wound healing assay.
FIG. 7 shows that when 206 / E7 siRNA was applied to a cervical cancer (HeLa) xenograft mouse tumor model, the E7 siRNA effectively inhibited cancer in vivo.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .

[[ 실시예Example 1] One]

자궁경부암에서의 In cervical cancer HPV18HPV18 유전자에 대한  For the gene 마이크로RNAMicroRNA 표적 지도Target map 및  And 마이크로RNAMicroRNA 발현 분석  Expression analysis

HPV에 의해 유발된 암세포 내에서 자연적으로 존재하는 RNA간섭 유도 핵산인 마이크로RNA와 이에 대한 표적 결합을 매개하는 아고너트 단백질이 HPV 유전자의 어느 부분을 인식하여 결합하는지를 파악하기 위해서, 마이크로RNA와 전사체와의 결합 위치를 차세대염기서열 (next-generation sequencing)로 동정해내는 Ago HITS-CLIP 분석 중(Nature, 2009, 460 (7254): 479-86) HPV의 18 type에 의해 발생된 자궁경부암세포인 HeLa에서 수행된 실험을 대조군의 결과에서 분석하였다 (도 2A). Ago HITS-CLIP 실험은 HeLa 세포에 UV를 조사하여 RNA와 아고너트 단백질 사이에 공유결합을 유도시켜 단단하게 복합체를 형성하게 하고, 이 RNA-아고너트 복합체를 아고너트를 인식하는 항체를 이용하여 면역침강법으로 분리한 다음, 이로 인해 분리된 RNA를 차세대염기서열로 파악하는 방법으로, 이를 통해서 아고너트에 결합하는 마이크로RNA와 이를 통해 결합하는 표적 mRNA 내의 표적 위치를 정확하게 알 수 있다. 여기서 분석한 Ago HITS-CLIP의 대조군 실험 결과는 자궁경부암 세포인 HeLa를 약 1천만개씩 100cm 배양접시 2개에 배양 한 후, 아고너트 단백질을 인식하는 2개의 항체인 2A8와 7G1-1*(Nature, 2009, 460 (7254): 479-86)를 각각 사용하여 아고너트-RNA 복합체를 분리하여 얻어진 결과로, 서열분석 결과인 FASTQ 파일을 Bowtie 프로그램으로 HPV 18의 유전체 서열에 배열하여 2개의 항체에서 얻어진 결과가 일치하는 크러스터(cluster) 부분(Biological complexity; BC ≥ 2)을 중심으로 분석하였다. 그 결과, 아고너트-마이크로RNA 복합체는 HPV 유전체에서 주로 E7, E1, L1 유전자의 mRNA에 결합하고, 특히 암 유발 핵심 유전자인 E6/E7에서 E7 mRNA의 여러 지역이 마이크로RNA와 결합하는 것으로 분석되었다(도 2A). In order to determine which part of the HPV gene is recognized and bind to the microRNA, which is an RNA interference-inducing nucleic acid naturally present in cancer cells induced by HPV, and the agonist protein that mediates the target binding thereto, (Nature, 2009, 460 (7254): 479-86), which identifies the binding site of HPV with the next-generation sequencing in the Ago HITS-CLIP assay Experiments performed in HeLa were analyzed in the results of the control group (Figure 2A). The Ago HITS-CLIP experiment was performed by irradiating HeLa cells with UV light to induce covalent bond between RNA and agonist protein to form a complex, and this RNA-agonist complex was immunostained with an antibody recognizing an agonist This is a method of isolating the separated RNA by the sedimentation method and recognizing the separated RNA as a next-generation nucleotide sequence, thereby precisely recognizing the target position in the microRNA binding to the agonist and the target mRNA binding thereto. In the control experiment of Ago HITS-CLIP assay, cervical carcinoma cells, HeLa, were cultured in two 100-cm culture dishes of about 10 million cells. Then, two antibodies, 2A8 and 7G1-1 * (Nature , 2009, 460 (7254): 479-86) were used to isolate the agonist-RNA complexes. As a result, the FASTQ file of the sequence analysis was arranged in the genome sequence of HPV 18 using the Bowtie program, The obtained results were analyzed based on the cluster part (Biological complexity; BC ≥ 2). As a result, the agonist-microRNA complex binds mainly to the mRNAs of E7, E1 and L1 genes in the HPV genome, and in particular, several regions of E7 mRNA bind to microRNAs in E6 / E7, (Fig. 2A).

이렇게 HPV의 E7 부위에 결합하는 것으로 분석된 마이크로RNA 중에서, HPV 감염으로 인해 발생된 암을 억제하는 기능을 가질 수 있는 마이크로RNA를 선별하기 위해서, 자궁경부암에서의 마이크로RNA 발현을 조사하였다 (도 2B). 여기서 HPV 유인성 자궁경부암 환자의 조직과 정상조직에서의 마이크로RNA의 발현을 마이크로어래이(microarray)로 비교한 결과(Oncogene 2013 Jan 3;32(1):106-16, 도 2B의 왼쪽 도면의 1)와 차세대서열 분석을 통한 결과(BMC Biol 2010 May 11;8:58, 도 2B의 왼쪽 도면의 2)를 분석하였고, 추가적으로 HPV16 유래 자궁경부암 세포(CaSKI, SIHa, 20861, 201402; 도 2B의 왼쪽도면의 3)와 HPV18 유래 자궁경부암 세포인 HeLa에서의 마이크로RNA 발현 결과(Oncogene 2008 April 17;27(18):2575-2582; 도 2B의 왼쪽 도면의 4)를 분석하고, 이를 log2 비율(정상/암조직, N/T)로 정규화 시킨 후 계층적 크러스터링(hierarchical clustering)을 통해 heat map으로 나타내었다 (도 2B의 왼쪽 도면 그림). 또한 TCGA 데이터베이스(The cancer genome atlas, https://gdc-portal.nci.nih.gov/)에서 자궁경부암에서 유래된 마이크로RNA 발현을 miRNA-Seq로 분석한 124개 결과(2013년 3월 데이터 기준)를 추가하여, 중간값을 기준으로 miRNA-seq의 RPKM (Reads per kilobase per million total reads) 값을 log2로 정규화하여 통합 분석하였다 (도 2B의 오른쪽 도면 그림). 그 결과, miR-1과 miR-206이 모든 자궁경부암 세포에서 가장 낮게 발현되어 있으며, 추가적으로 miR-376a, miR-497, miR-218, miR-329등이 자궁경부암 환자의 조직에서 정상 조직보다 매우 낮게 발현됨을 발견하였다. 이렇게 자궁경부암 조직에서 낮아지는 마이크로RNA는 상대적으로 암을 억제하는 기능을 할 가능성이 높으며, 실제로 암 억제능을 가지는 것으로 알려진 miR-1 또는 miR-206은 암의 전이를 막는 것으로 이전에 보고 되었으며, 또한 본 실시예의 HeLa에서 분석한 마이크로RNA 결합 지도 (도 2A)를 통해 HPV18의 발암 유전자인 E7에 발단 위치(seed region)를 매개로 결합한다는 사실을 확인하였다. 추가적으로 miR-376a, miR-329도 자궁경부암 환자에서 그 발현이 낮으면서, 동시에 HPV18의 E7 유전자에 발단 위치를 통해 결합한다는 사실을 통해 억제 마이크로RNA로 작용할 수 있다는 점을 발견하였다.Among these microRNAs that were analyzed to bind to the E7 region of HPV, microRNA expression in cervical cancer was investigated in order to select microRNAs capable of inhibiting cancer caused by HPV infection (Fig. 2B ). Here, microarray expression of microRNAs in tissues and normal tissues of HPV-inducible cervical cancer patients was compared (Oncogene 2013 Jan 3; 32 (1): 106-16, 1 in the left drawing of FIG. 2B) (BMC Biol 2010 May 11; 8: 58, 2 on the left hand side of FIG. 2B) were further analyzed, and HPV16-derived cervical cancer cells (CaSKI, SIHa, 20861, 201402; (Oncogene 2008 April 17; 27 (18): 2575-2582; 4 on the left-hand side of FIG. 2B) in HeLa, HPV18-derived cervical cancer cell, Cancer tissue, N / T) and then expressed as a heat map through hierarchical clustering (left drawing in FIG. 2B). In addition, 124 results from miRNA-Seq analysis of microRNA expression from cervical cancer in the TCGA database (The cancer genome atlas, https://gdc-portal.nci.nih.gov/) ), And the value of RPKM (Read per kilobase per million total reads) of miRNA-seq was normalized to log2 based on the median value (FIG. 2B, right drawing). As a result, miR-1 and miR-206 are the lowest expression levels in all cervical cancer cells. In addition, miR-376a, miR-497, miR-218 and miR- Lt; / RTI > Thus, microRNAs that are down-regulated in cervical cancer tissues are likely to have a relatively cancer-suppressing function. In fact, miR-1 or miR-206, which is known to have cancer inhibiting ability, has been previously reported to prevent cancer metastasis The microRNA-binding map (FIG. 2A) analyzed by HeLa of the present example confirmed that it binds E7, a carcinogenic gene of HPV18, through the seed region. In addition, we found that miR-376a and miR-329 also act as inhibitory microRNAs in mice with low expression in cervical cancer patients and at the same time binding to the E7 gene of HPV18 through the initiation site.

[실시예 2][Example 2]

자궁경부암 억제 Cervical cancer suppression 마이크로RNAMicroRNA 후보군 발현에 따른 자궁경부암 환자의 생존율 및 세포 수와 전이 억제 가능성 확인 Survival rate and cell number and potential inhibition of metastasis in cervical cancer patients according to the expression of candidate group

상기 실시예 1에서 발굴된 miR-1, miR-206, miR-376a, miR-329, miR-497 및 miR-218이 자궁경부암을 억제할 수 있다는 사실을 확인하기 위하여, TCGA에서 자궁경부암 환자(n=425, 2016년 9월 기준)의 임상정보를 바탕으로 생존율(survival analysis)을 카플란 메이어(Kaplan-Meier, 이하 KM으로 표기) 생존분석을 통하여 조사하였다. 특히 해당 마이크로RNA의 발현이 높은 경우와 낮은 경우에서의 생존율에 차이가 있는지를 확인하기 위해서, 임상정보와 함께 miRNA-Seq 결과를 함께 분석하여 전체 환자군에서 상위 25%로 해당 마이크로RNA가 높게 발현되는 경우(High 25%; 도3A, 도3B, 도3E)와 하위 25%로 낮게 발현하는 경우(Low 25%; 도3A, 도3B, 도3E)로 나눠서 시간에 따른 생존 확률을 퍼센트(%)로 계산하여 생존함수와 함께 KM 생존곡선으로 나타내었고 (도3A, 도3B, 도3E), 차이가 나타나는 경우 그 통계적인 유효성은 로그순위법 (log-rank test) 또는 Wilcoxon 부호 순위 검증으로 분석하였다. 그 결과, miR-1이 상대적으로 많이 발현되는 환자에서는 4년 이내의 생존율이 높게 나타나고 (Wilcoxon, P=0.06, 도3A의 왼쪽 도면), 3년 이내에서는 더욱 유의적으로 나타나는 것을 확인하였다 (Wilcoxon, P=0.04, 도3A의 왼쪽 도면). 또한 miR-206도 발현이 많이 되었을 때, 환자의 5년 생존율이 증가하는 것을 관찰하였다 (log-rank, P=0.08, 도3A의 오른쪽 도면). 이전에 암억제 기능이 보고된 miR-1, miR-206 이외에 miR-376a, miR-329도 실시예1에서 HPV18의 E7 mRNA에 결합하면서 자궁경부암 환자에서 그 발현이 억제되는 것을 관찰하였으므로, 이들의 암억제 기능을 확인하기 위해서 동일하게 생존율 분석을 실시하였으나 큰 차이를 나타내지 않았다 (도 3B). 하지만 miR-497의 경우 그 발현이 증가된 환자에서 유의하게 5년 생존율이 증가하는 것을 발견하였으며 (log-rank, P=0.04, 도3C의 왼쪽 도면), miR-218도 동일하게 4년 생존율을 증가시키며 (Wilcoxon, P=0.08, 도3C의 오른쪽 도면) 보다 더 유의하게는 3년 생존율이 증가함을 관찰하였다 (Wilcoxon, P=0.06, 도3C의 오른쪽 도면). In order to confirm that miR-1, miR-206, miR-376a, miR-329, miR-497 and miR-218 uncovered in Example 1 can inhibit cervical cancer, TCGA Survival analysis was performed by Kaplan-Meier (KM) survival analysis based on the clinical information of n = 425 and September 2016. In order to confirm whether there is a difference in the survival rate between the high and low microRNA expression levels, the miRNA-Seq results were analyzed together with the clinical information and the highest microRNA levels were expressed in the upper 25% (Low 25%; FIG. 3A, FIG. 3B, and FIG. 3E) in the case of low expression (High 25%; FIGS. 3A, 3B and 3E) (Fig. 3A, Fig. 3B, Fig. 3E), and the statistical validity of the difference is analyzed by the log-rank test or the Wilcoxon sign rank test . As a result, survival rate within 4 years was higher in patients with relatively high miR-1 expression (Wilcoxon, P = 0.06, left figure in FIG. 3A) and more significant within 3 years (Wilcoxon , P = 0.04, left drawing of Fig. 3A). In addition, when miR-206 expression was increased, the 5-year survival rate of patients increased (log-rank, P = 0.08, right drawing of FIG. 3A). Since miR-376a and miR-329, in addition to miR-1 and miR-206, previously reported to inhibit cancer, bind to E7 mRNA of HPV18 in Example 1 and their expression is inhibited in cervical cancer patients, Survival analysis was performed in the same manner to confirm the suppression function of cancer, but no significant difference was shown (FIG. 3B). However, miR-497 significantly increased the 5-year survival rate in patients with increased expression (log-rank, P = 0.04, left panel of Fig. 3C) (Wilcoxon, P = 0.06, right drawing of FIG. 3C), significantly more than the 3-year survival rate (Wilcoxon, P = 0.08, right drawing of FIG. 3C).

이렇게 자궁경부암 환자의 생존율을 증가시키는 것으로 관찰된 마이크로RNA가 실제로 분열되는 자궁경부암 세포의 수에 영향을 미치는 지를 확인하기 위해서, 대조군 miRNA (NT (non-targeting), 도3D), miR-1, miR-329, miR-376a를 합성하였다. 상기 마이크로RNA miRBase (http://www.mirbase.org/) 데이터베이스에 있는 서열대로 인간의 마이크로RNA를 기준으로 동일한 가이드 가닥과 운반 가닥을 Bioneer사 또는 ST Pharma사를 통해 화학적으로 합성하고 HPLC로 분리하였으며, 상기 회사에서 제공한 방법에 따라 가이드 가닥과 운반 가닥의 이중체(duplex)로 제조하였다. 이 때, 대조군인 NT는 예쁜 꼬마 선충(C.elegans)에만 발현하는 마이크로RNA인 cel-miR-67의 서열을 siRNA 형태로 합성한 후, 가이드 가닥과 운반자 가닥 모두 5‘말단 기준 1번째와 2번째 모두를 2’OMe로 변형시킨 것을 사용하였다. 이들 각각을 50nM의 농도로 HeLa세포에 Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen) 시약을 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 전달(transfection)하였다. 이때, HeLa 세포는 10% FBS(fetal bovine serum), 100 U/ml 페니실린, 및 100 ㎍/ml 스텝토마이신을 보충한 Dulbecco's 개질 Eagle's 배지(Invitrogen)에서 배양하였으며, 항생제 없는 완전배지에서 트랜스펙션을 수행하였다. 이후 24시간, 48시간 후에 세포의 수를 countess II (Life technologies) 기기로 측정하였다. 그 결과 miR-1의 경우 유의하게 자궁경부암 세포인 HeLa의 세포수를 감소시키는 것을 확인하였다 (도3D, P<0.01,n=4, t-test). 이때 miR-329, miR-376a의 발현 증가는 세포수 감소를 일으키지 못하여, 대신에 이들이 암세포의 전이를 억제하는게 관여하는 세포 이동에 영향을 미치는지를 확인하기 위하여, 창상회복실험(wound healing assay)을 실시하였다. 위의 실험과 동일한 방법으로 대조군(NT), miR-206, miR-329, miR-376a를 합성하고 이를 HeLa세포에 도입한 후, 창상(wound)을 일으킨 후 이것이 메꿔져서 회복되는 것을 Leica DMi8 현미경으로 관찰하고 (도3E, 위의 도면), 이를 image J (https://imagej.nih.gov) 프로그램으로 정량분석(도3E, 아래 도면) 하였다. 그 결과 이미 암세포 전이를 막는 것으로 알려진 miR-206의 경우 이전에 보고된 결과와 동일하게 대조군에 비하여 유의하게 세포의 이동을 막았다 (P<0.05, t-test, n=4). 또한 miR-329, miR-376a도 알려진 전이 억제 마이크로RNA인 miR-206과 동일하게 자궁경부암 세포의 이동을 유의하게 억제하였으며 (도면3E, P<0.05, t-test, n=4), 따라서 miR-329, miR-376a가 자궁경부암의 전이를 억제하는 종양 억제 마이크로RNA로 작용할 수 있음을 확인하였다.To investigate whether the microRNAs observed to increase the survival rate of patients with cervical cancer affect the number of cervical cancer cells that actually divide, control miRNAs (NT (non-targeting), Figure 3D), miR-1, miR-329 and miR-376a were synthesized. The same guide strand and transport strand were synthesized chemically via Bioneer or ST Pharma based on the human microRNA according to the sequence in the microRNA miRBase (http://www.mirbase.org/) database and isolated by HPLC And was made into a duplex of guide strand and transport strand according to the method provided by the company. At this time, the control group NT synthesized the sequence of cel-miR-67, which is a microRNA expressed only in C. elegans, in the form of siRNA, and then the guide strand and the carrier strand were ligated to the first and second All of which were transformed into 2'OMe. Each of these was transfected into HeLa cells at a concentration of 50 nM using Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) reagent according to the manufacturer's protocol. At this time, HeLa cells were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (Invitrogen) supplemented with 10% FBS (fetal bovine serum), 100 U / ml penicillin, and 100 ug / ml stepomycin and transfection in complete medium without antibiotics Respectively. After 24 hours and 48 hours, the number of cells was measured with a countess II (Life technologies) instrument. As a result, miR-1 significantly decreased the number of cervical cancer cells, HeLa (Fig. 3D, P <0.01, n = 4, t-test). At this time, in order to confirm that the increased expression of miR-329 and miR-376a did not cause cell loss, instead, they were used as a wound healing assay to determine whether they affect cell migration involved in inhibiting cancer cell metastasis Respectively. (NT), miR-206, miR-329 and miR-376a were synthesized in the same manner as in the above experiment, and after wounding was induced after introduction into HeLa cells, they were recovered and recovered by a Leica DMi8 microscope (FIG. 3E, upper drawing), and quantitatively analyzed with the image J (https://imagej.nih.gov) program (FIG. 3E, drawing below). As a result, miR-206, which is already known to prevent cancer metastasis, inhibited cell migration (P <0.05, t-test, n = 4) as compared with the control group. In addition, miR-329 and miR-376a significantly inhibited the migration of cervical cancer cells (Fig. 3E, p <0.05, t-test, n = 4) -329, miR-376a could act as tumor suppressor microRNAs that inhibit the metastasis of cervical cancer.

[실시예 3][Example 3]

RNA간섭 유도 핵산인 206/E7 siRNA의 표적 유전자 발현 억제 효율 비교Comparison of target gene expression inhibition efficiency of 206 / E7 siRNA, an RNA interference inducing nucleic acid

상기 실시예 1과 실시예 2에서의 결과를 토대로, miR-1 (또는 miR-206), miR-376a, miR-329, miR-218-5p. miR-497-5p는 종양 억제 마이크로RNA로 작용한다는 것을 확인하였기에, 이들의 발단 위치(seed region)인 5‘ 말단 기준 2번째에서 8번째 사이에 최소한 6개 이상의 연속적인 서열을 포함하면서 HPV18의 E6/E7의 mRNA와는 완전 상보적으로 염기배열할 수 있는 RNA간섭 유도 핵산의 서열을 디자인 하였다 (도 4A). 이때 miR-1과 miR-206은 동일한 발단서열(1번째에서 8번째까지의 서열이 5’-UGGAAUG-3’로 동일함)을 가지므로 함께 디자인 하였으며, 이때 사용한 HPV18의 E6/E7 mRNA 서열은 HeLa 세포에서 보고된 GenBank (M20324) 데이터를 사용하였다. 더불어 HPV 16에 대해서도 동일하게 마이크로RNA의 발단서열을 포함하여 해당 마이크로RNA와 같이 기능하면서 E6/E7 mRNA를 억제하는 RNA 간섭유도 물질로서 작용하는 서열을 디자인 하였다 (도 4B). 이때에는 HPV16의 감염으로 자궁경부암이 발생된 SiHa 세포에서 얻어진 E6와 E7의 코딩유전자서열(CDS (coding sequence))을 GenBank에서 사용하였다 (E6, AF003019.1; E7, AF003021.1). (Or miR-206), miR-376a, miR-329, and miR-218-5p., Based on the results in Examples 1 and 2 above. miR-497-5p acts as a tumor suppressor microRNA. Thus, it has been shown that miR-497-5p has a high affinity for E6 of HPV18, including at least 6 consecutive sequences between the 2nd and 8th bases at the 5 ' / E7 (Fig. 4A). The nucleotide sequence of the RNA interference-inducible nucleic acid was designed so that it could be perfectly complementary to the mRNA of / E7. In this case, miR-1 and miR-206 were designed together with the same starting sequence (the first to eighth sequences are the same as 5'-UGGAAUG-3 '), and the E6 / E7 mRNA sequence of HPV18 GenBank (M20324) data reported in HeLa cells was used. In addition, HPV 16 was designed to function as an RNA interference inducer which suppresses E6 / E7 mRNA functioning as a microRNA, including the initiation sequence of microRNAs (FIG. 4B). At this time, the coding sequence of E6 and E7 (CDS (coding sequence)) obtained from SiHa cells that developed cervical cancer due to HPV16 infection was used in GenBank (E6, AF003019.1; E7, AF003021.1).

자세하게는 miR-1 또는 miR-206의 발단부분의 서열을 포함하면서 HPV18의 E6/E7 mRNA를 억제하는 siRNA (206/E7)는 5'-UGGAAUGCUCGAAGGUCGdtdt-3'로 제작하였다 (도 4C).이 때 마이크로RNA의 발단 위치는 5’말단 기준 1번째부터 8번째 사이에서 최소한 6개 이상의 염기배열이 연속적으로 되는 서열을 가지며, 이에 따라 1-6, 2-7, 3-8 위치의 3가지 6mer와 1-7, 2-8의 2가지 7mer, 그리고 1-8 위치의 1가지 8mer가 최소한으로 만들어 질 수 있다. 위에서의 206/E7 siRNA는 발단 위치에서 5’말단 기준 1-7 위치의 miR-1/206 7mer (UGGAAUG)를 가지고 있다. 206/E7 siRNA는 miR-206과 miR-1의 발단서열뿐만 아니라, 5’말단 기준 12번째부터 16번째까지 서열과 19번째 서열이 동일하며, 추가적으로 siRNA를 디자인하는 19+2의 규칙에 따라 3‘말단에 추가하는 2개의 디옥시리보스 티민(deoxyribose thymine)중 3’말단 기준 2번째 디옥스리보스 티민이 miR-206의 유라실(Uracil)과 유사하도록 구성되었다. 이에 따라, 206/E7 siRNA는 전체적으로 ~64%의 염기서열이 miR-206 또는 miR-1과 동일하며, 동일한 발단서열을 가지고 있다는 점에서, miR-206 또는 miR-1과 동일하게 작용할 수 있다 (도 4C). In detail, the siRNA (206 / E7) which inhibits the E6 / E7 mRNA of HPV18, including the sequence at the beginning of miR-1 or miR-206, was constructed with 5'-UGGAAUGCUCGAAGGUCGdtdt-3 ' The position of the initiation of microRNA has a sequence in which at least six bases are continuous from the 1st to 8th bases at the 5 'end, and thus, the 6 mer of 1-6, 2-7, 3-8 positions Two 7-mers of 1-7, 2-8, and one 8-mer of 1-8 positions can be made to a minimum. The above 206 / E7 siRNA has a miR-1/206 7 mer (UGGAAUG) at positions 1-7 relative to the 5 'end at the initiation site. The 206 / E7 siRNA is identical in sequence to the 19th sequence from the 12th to 16th bases at the 5 'end as well as the initiation sequence of miR-206 and miR-1. In addition, End of the deoxyribose thymine was similar to the Uracil of miR-206 at the 3 &apos; end of the second deoxynucleoside thymine. Thus, 206 / E7 siRNAs can function in the same way as miR-206 or miR-1 in that the ~ 64% overall sequence is identical to miR-206 or miR-1 and has identical initiation sequences 4C).

206/E7 siRNA의 기능에서 온-타겟인 E7 유전자에 결합하고 억제하는 면을 생각해보면, miR-1과 miR-206이 자궁경부암 세포(HeLa)에서 E7 mRNA에 쉽게 결합하고 있는 결과 (도 2A)를 바탕으로, 206/E7 siRNA도 세포에 도입되었을 때 효과적으로 E7 유전자를 억제할 수 있을 것으로 생각된다. 또한 이러한 온-타겟 효과는 기존에 E7 siRNA와 동일하게 효과적일 것으로 예상되어, 기존에 HPV18의 E7을 억제할 용도로 여러 siRNA 서열로부터 가장 효과적인 것으로 동정된 E7 siRNA (5‘-UGCAAUAUACACAGGUUAdTdT-3', 도 3A)와 함께 E7에 대한 온-타겟 저해 효율을 다음과 같이 비교하여 보았다 (도 4D). 우선은 본 발명에 따른 siRNA는 우선 가이드 가닥으로 합성하고, 이와 함께 운반자 가닥을 기존의 구조인 19개의 완전 상보배열(perfect reverse complement)과 함께 3'말단에 2개의 dT(Deoxy Thymine Nucleotide)의 돌출부를 가지는 이중가닥으로 생성될 수 있도록 제조하였다. 이러한 RNA는 Bioneer사 또는 ST Pharma사를 통해 화학적으로 합성하고 HPLC로 분리하였으며, 상기 회사에서 제공한 방법에 따라 가이드 가닥과 운반 가닥의 이중체(duplex)로 제조하였다. siRNA의 온-타겟 저해 효율을 정확하게 측정하고자 루시퍼라제 리포터(luciferase reporter) 측정을 여러 농도의 siRNA에서 수행하여 IC50 (inhibitory concentration 50) 분석을 수행하였다. 이러한 루시퍼라제 리포터 실험은 Promega사의 psi-check2 벡터를 사용하여 레닐라 루시퍼라제 유전자 다음에 해당 siRNA와 완전상보적인 서열을 삽입 제작하여 시행하였다. 즉, 상기에서 이중체로 제조된 siRNA는 0, 0.05, 0.1, 0.8, 5, 20, 75 nM을 사용하여 HeLa세포(ATCC CCL-2)에 psi-check2 벡터와 함께 Lipofectamine 2000 시약(Invitrogen)을 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 HeLa 세포에 전달(co-transfection)시켜서 그 효과를 조사하였다. 트랜스펙션을 수행한 후 24시간 후, Promega사의 Dual-luciferase reporter asssay system을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 루시퍼라제의 활성을 측정하여 siRNA의 효과를 조사하였으며, 레닐라 루시퍼라제 활성 계측은 Promega사의 Glomax Luminometer를 이용하여 최소 4번 이상의 반복 실험으로 반딧불(firefly) 루시퍼라제의 활성에 의해 표준화되어 계산하였다.Considering the surface binding and inhibition of the on-target E7 gene in the function of 206 / E7 siRNA, miR-1 and miR-206 bind easily to E7 mRNA in cervical cancer cells (HeLa) , It is thought that 206 / E7 siRNA can effectively inhibit E7 gene when introduced into cells. These on-target effects are expected to be as effective as E7 siRNAs, and E7 siRNAs (5'-UGCAAUAUACACAGGUUAdTdT-3 ', E7 siRNAs identified as the most effective from multiple siRNA sequences, 3A) and the on-target inhibition efficiency for E7 were compared as follows (FIG. 4D). First, the siRNA according to the present invention is first synthesized as a guide strand, and the carrier strand is ligated with 19 conventional perfect reverse complement sequences and two dT (Deoxy Thymine Nucleotide) protrusions at the 3 'Lt; RTI ID = 0.0 &gt; of &lt; / RTI &gt; These RNAs were chemically synthesized through Bioneer or ST Pharma, separated by HPLC, and made into duplexes of guide strand and transport strand according to the method provided by the company. In order to accurately measure the on-target inhibition efficiency of siRNA, the luciferase reporter assay was performed on various concentrations of siRNA to perform IC 50 (inhibitory concentration 50) analysis. These luciferase reporter experiments were performed by inserting a sequence complementary to the siRNA after the Renilla luciferase gene using Promega's psi-check2 vector. That is, the siRNA prepared in duplicate was used for the Lipofectamine 2000 reagent (Invitrogen) together with the psi-check2 vector in HeLa cells (ATCC CCL-2) using 0, 0.05, 0.1, 0.8, 5, 20 and 75 nM And co-transfected into HeLa cells according to the manufacturer's protocol to investigate its effect. Twenty-four hours after the transfection, the activity of siRNA was measured by using a dual-luciferase reporter asssay system of Promega according to the protocol of the manufacturer. The activity of the siRNA was measured by Promega At least four replicate experiments using a Glomax Luminometer were standardized and calculated by the activity of firefly luciferase.

그 결과, 도 4D에 나타낸 바와 같이, 206/E7 siRNA의 온-타겟 억제능이 IC50가 1.02nM로 기존에 최적의 온-타겟 효과를 보이는 것으로 선택된 E7 siRNA의 IC50인 1.01nM과 동일하게 나타남을 관찰하였다. 또한 이러한 siRNA의 효과가 실제로 자궁경부암 세포 내에서 E7 단백질의 발현을 저해하는지를 확인하기 위해서, HeLa 세포에서의 E7 단백질 양의 변화를 면역 블롯 분석(immunoblot assay)으로 측정하였다 (도 4D). 즉, 각각 75nM의 대조군 siRNA(Cont), E7 siRNA 또는 206/E7 siRNA을 Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen)로 제조사의 프로토콜에 따라 전달하고, 48시간 이후에 세포를 얻었다. 이 후 세포를 RIPA 용해 시약(바이오세상)으로 깬 후, 그 세포 용해액의 단백질 양을 Quick Start Bradford 단백질 측정 시약 (Bio-Rad)으로 제조사의 프로토콜에 따라 측정하여, 동일양으로 맞추어준 후에, SDS-PAGE로 전기영동을 한 후, PVDF 막에 옮기고, HPV의 E7을 인식하는 항체(8E2; abcam)로 그 양을 측정하였으며, 대조군으로는 β-actin 항체(Cell signaling)를 사용하였다. 그 결과, E7 siRNA와 206/E7 siRNA 둘 다 효율적으로 자궁경부암 세포의 HPV E7 단백질의 발현을 억제하는 것을 확인하였다 (도 4D). 이와 같이, 206/E7 siRNA는 기존의 개발된 E7 siRNA와 동일하게 우수한 온-타겟 억제 효과를 보이면서, 실제로 자궁경부암 세포 내에서의 E7 단백질의 양을 효과적으로 없앤다는 것을 확인하였다.As a result, as, 206 / E7 siRNA of the whole shown in Fig. 4D-target inhibitory ability the IC 50 is in a conventional 1.02nM optimum on-appear in the same manner as the IC 50 of 1.01nM E7 siRNA selected to exhibit the targeted effects Were observed. In order to confirm whether the effect of the siRNA actually inhibited the expression of E7 protein in cervical cancer cells, the change of the amount of E7 protein in HeLa cells was measured by immunoblot assay (Fig. 4D). That is, 75 nM each of control siRNA (Cont), E7 siRNA or 206 / E7 siRNA was delivered with Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) according to the manufacturer's protocol, and cells were obtained after 48 hours. Then, the cells were rinsed with a RIPA dissolution reagent (BioWorld), and the amount of the protein in the cell lysate was measured according to the manufacturer's protocol using Quick Start Bradford protein measurement reagent (Bio-Rad) After electrophoresis on SDS-PAGE, the cells were transferred to a PVDF membrane, and the amount of the antibody was determined using an antibody (8E2; abcam) recognizing E7 of HPV. As a control, β-actin antibody (Cell signaling) was used. As a result, it was confirmed that both E7 siRNA and 206 / E7 siRNA effectively inhibited the expression of HPV E7 protein in cervical cancer cells (Fig. 4D). Thus, it was confirmed that 206 / E7 siRNA effectively inhibited the amount of E7 protein in cervical cancer cells while showing an excellent on-target inhibitory effect as the previously developed E7 siRNA.

miR-1 (또는 miR-206) 이외에 HPV18과 HPV16의 E6/E7 mRNA를 억제하는 RNA 간섭물질로 디자인한 siRNA 서열도, 도 4E에 나타낸 서열로 합성하였고, E6/E7 유전자 억제 효과를 HPV18은 HeLa 세포에서 HPV16은 SiHa 세포에서 qPCR로 확인하였다 (도 4F). 이 때 50nM의 siRNA를 사용하였고, 이를 Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) 시약을 이용하여 해당 프로토콜에 따라 트랜스펙션하고 24시간 후에 총 RNA를 RNeasy 키트(Qiagen)로 추출하고, 해당 프로토콜에 따라 Superscript III RT (Invitrogen)로 역전사하고, SYBR　Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)로 qPCR을 수행하여 PCSK9의 mRNA을 측정하고 GAPDH mRNA 값으로 표준화하였다. 그 결과 모든 siRNA가 E6/E7 유전자를 효과적으로 억제한다는 것을 확인할 수 있었다 (도 4F)In addition to miR-1 (or miR-206), an siRNA sequence designed as an RNA interference substance that suppresses E6 / E7 mRNA of HPV18 and HPV16 was also synthesized with the sequence shown in Fig. 4E. The E6 / E7 gene- In cells, HPV16 was confirmed by qPCR in SiHa cells (Fig. 4F). At this time, 50 nM of siRNA was transfected using Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) reagent according to the corresponding protocol. After 24 hours, the total RNA was extracted with RNeasy kit (Qiagen) and Superscript III RT Invitrogen) and qPCR was performed with SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) to measure the mRNA of PCSK9 and normalized to the GAPDH mRNA value. As a result, it was confirmed that all the siRNA effectively inhibited the E6 / E7 gene (Fig. 4F)

[[ 실시예Example 4]  4]

206/E7 206 / E7 siRNA의siRNA 표적 유전자 발현 저해 효과 및 자궁경부암 세포의 사멸 유도 효과 비교 Inhibition effect of target gene and induction of cervical cancer cell death induction

상기 실시예 3에서 확인한 바와 같이, 206/E7 siRNA는 기존의 E7 siRNA와 동일하게 효율적으로 E7 단백질 발현을 억제하였다. HPV의 E6와 E7 유전자는 함께 전사되어 동일한 E7/E7 전령RNA(mRNA)를 만들고, 따라서 이를 억제하는 siRNA는 동일하게 E6와 E7 모두의 유전자 발현을 억제할 수 있다. 따라서 206/E7 siRNA이 E6/E7 mRNA를 동일하게 억제하는지를 확인하기 위해서, E6와 E7 mRNA 부분을 특이적으로 인식하는 프라이머를 디자인하여, 그 RNA 양을 qPCR(Quantitative Polymerase Chain Reaction)로 측정하였다. 먼저, HeLa 세포에 75nM의 대조군 siRNA, E7 siRNA, 또는 206/E7 siRNA 분자를 Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen) 시약을 이용하여 해당 회사가 제공하는 프로토콜에 따라 트랜스펙션하고, 24시간 후에 총 RNA를 RNeasy 키트(Qiagen)로 추출하고, 해당 프로토콜에 따라 Superscript III RT(Invitrogen)로 역전사하고, SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)로 qPCR을 수행하여 E6와 E7의 부분을 측정하는 프라이머로 그 RNA의 양을 측정하고 GAPDH mRNA 값으로 표준화하였다. 그 결과, 206/E7 siRNA는 기존의 E7 siRNA와 동일하게 HPV18의 E6와 E7 mRNA 부분의 양을 효과적으로 줄이는 것을 확인하였다 (도 5A). As shown in Example 3 above, 206 / E7 siRNA effectively inhibited E7 protein expression in the same manner as existing E7 siRNA. The E6 and E7 genes of HPV are transcribed together to produce the same E7 / E7 messenger RNA (mRNA), and thus siRNAs that suppress it can similarly inhibit gene expression in both E6 and E7. Therefore, in order to confirm whether the 206 / E7 siRNA inhibits E6 / E7 mRNA equally, a primer that specifically recognizes the E6 and E7 mRNA regions was designed and its RNA amount was measured by qPCR (Quantitative Polymerase Chain Reaction). First, 75 nM of control siRNA, E7 siRNA, or 206 / E7 siRNA molecule was transfected into HeLa cells using a Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) reagent according to the protocol provided by the company, and 24 hours later, total RNA was transferred to an RNeasy kit (Qiagen), reverse transcribed with Superscript III RT (Invitrogen) according to the protocol, and qPCR performed with SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) to measure the amount of E6 and E7 Were measured and normalized to GAPDH mRNA levels. As a result, it was confirmed that the 206 / E7 siRNA efficiently reduced the amount of the E6 and E7 mRNA portions of HPV18 as in the conventional E7 siRNA (Fig. 5A).

206/E7 siRNA가 HPV18의 E6의 단백질 발현을 억제한다면, E6에 의해서 일어나는 p53의 분해가 저해될 것이다. 한편 p53은 DNA의 손상을 인식하고 복구하거나 세포를 사멸시키는 유전자의 전사를 조절하는 것으로 잘 알려져 있고 이에 따라 암 억제 유전자로 작용하므로, 이러한 p53 단백질의 증가로 p53의 전사 표적인 p21의 mRNA가 증가할 것이다. 이를 확인하고자 위와 동일한 조건으로 qPCR을 수행하고 대신에 p21의 mRNA를 측정하였다. 그 결과, 206/E7 siRNA도 동일하게 E7 siRNA와 같이 p21의 전사를 늘리는 것을 확인하여, p53의 기능 회복을 관찰하였다 (도 5B). 상기 관찰한 바와 같이, 206/E7 siRNA가 기존의 E7 siRNA와 같이 HPV18의 E6와 E7의 발현을 억제하여 p53의 단백질 양과 기능을 회복시킨다는 점에서, 206/E7 siRNA는 효과적으로 HPV18 유래 자궁경부암의 사멸을 촉진시켜 암세포를 억제할 가능성이 있다. 이를 확인하고자, 이전과 동일하게 75nM 대조군 siRNA와 206/E7 siRNA를 HeLa 세포에 전달한 후 48시간 후에 PI(propodium iodide)로 염색하고, FACS(Fluorescence-activated cell sorting)로 분석한 결과, 세포사멸인 아폽토시스(apoptosis)로 인해 생성되는 DNA 조각화가 206/E7 siRNA의 경우에는 43±3%(3번 반복 실험 결과)로 대조군의 13±2%에 비해 3배 이상 증가한 것을 관찰 할 수 있었다 (도 5C). 206/E7 siRNA에 의한 아폽토시스 증가가 siRNA를 자궁경부암 세포인 HeLa에 전달한지 48시간 후에 일어난다는 사실에 기반하여, 이번에는 siRNA를 전달한 후에 3일까지 매일 세포의 숫자를 측정하였다 (도 5D). 그 결과 2일 후부터 급격하게 206/E7 siRNA를 전달한 HeLa 세포의 숫자가 줄어드는 것을 확인하였으며, 동시에 현미경 상에서도 세포가 아폽토시스의 특징을 보이면서 사멸되는 것을 관찰하였다 (도 5D). 추가적으로, 이러한 세포사멸 효율을 기존의 E7 siRNA와 비교하기 위해서, 위의 실시예와 동일하게 대조군, E7, 206/E7 siRNA를 각각 HeLa에 전달 시킨 후, 72시간 후에 Annexin V: FITC Apoptosis Detection Kit II (BD Pharmingen)를 사용하여, 회사에서 제공된 프로토콜에 따라 PI와 annexin V로 염색한 후, FACS로 세포사멸을 아폽토시스와 네크로시스(necrosis)로 구별하여 측정하였다 (도 5E). 그 결과, 206/E7 siRNA는 기존의 E7 siRNA보다 2배 이상으로 아폽토시스로 인한 세포 사멸을 일으키는 것을 확인하였다 (도 5E). 상기와 같이, 206/E7 siRNA는 기존의 E7 siRNA와 동일하게 E6, E7의 mRNA를 분해하고, 이에 따라 증가된 p53 단백질의 전사 표적인 p21의 전사를 활성화시키며, HPV18 유래 자궁경부암 세포인 HeLa의 아폽토시스에 의한 세포사멸을 증가시켜 암을 억제한다는 사실을 확인하였으며, 이에 따라 206/E7 siRNA는 기존의 E7 siRNA 보다 효과적으로 자궁암 세포의 사멸을 유도한다는 것을 알 수 있다. If the 206 / E7 siRNA inhibits the protein expression of E6 in HPV18, the degradation of p53 by E6 will be inhibited. In addition, p53 is known to regulate transcription of genes that recognize and repair DNA damage, and thus acts as a tumor suppressor gene. Therefore, the increase of p53 protein leads to the increase of p53 mRNA something to do. To confirm this, qPCR was performed under the same conditions as above, and mRNA of p21 was measured instead. As a result, it was confirmed that the 206 / E7 siRNA similarly increases the transcription of p21 like E7 siRNA, and the function recovery of p53 was observed (Fig. 5B). As observed above, the 206 / E7 siRNA effectively inhibited the expression of E6 and E7 in HPV18 and restored the protein content and function of p53, as well as the existing E7 siRNA, thus effectively killing HPV18 -derived cervical cancer To inhibit cancer cells. To confirm this, same as before, 75 nM control siRNA and 206 / E7 siRNA were transferred to HeLa cells and stained with PI (propodium iodide) 48 hours later and analyzed by fluorescence-activated cell sorting (FACS) In the case of 206 / E7 siRNA, the DNA fragmentation resulting from apoptosis was 43 ± 3% (3 repeated experiments), which was 3-fold higher than that of the control group 13 ± 2% (FIG. 5C ). Based on the fact that an increase in apoptosis by 206 / E7 siRNA occurs 48 hours after delivery of siRNA to cervical cancer cell HeLa, this time the number of cells was measured daily for up to 3 days after siRNA delivery (Fig. 5D). As a result, it was confirmed that the number of HeLa cells that delivered 206 / E7 siRNA abruptly decreased after 2 days, and at the same time, the cells were observed to be apoptotic in appearance under the microscope (FIG. 5D). In addition, in order to compare the cell death efficiency with the conventional E7 siRNA, the control group, E7, and 206 / E7 siRNAs were delivered to HeLa, respectively, and 72 hours later, Annexin V: FITC Apoptosis Detection Kit II (BD Pharmingen), stained with PI and annexin V according to the protocol provided by the company, and then cell death was determined by FACS as apoptosis and necrosis (FIG. 5E). As a result, it was confirmed that the 206 / E7 siRNA caused apoptosis-induced apoptosis more than twice as much as that of the existing E7 siRNA (Fig. 5E). As described above, the 206 / E7 siRNA degrades the mRNA of E6 and E7 in the same manner as the existing E7 siRNA, activates transcription of p21, which is a transcription target of the increased p53 protein, and activates HPV18-derived cervical cancer cell line HeLa It has been confirmed that the inhibition of cancer by apoptosis-induced apoptosis induces the death of uterine cancer cells more effectively than the conventional E7 siRNA.

[실시예 5] [Example 5]

206/E7 206 / E7 siRNA의siRNA 마이크로RNA로써의As a microRNA 표적 유전자 억제 효과 및 암 침윤 억제 효과 확인  Confirmation of target gene inhibitory effect and cancer invasion inhibitory effect

206/E7 siRNA는 miR-206 또는 miR-1의 5‘말단으로부터 1번째부터 8번째까지의 서열인 발단 부위(seed region)를 가지고 있으므로 miR-206(또는 miR-1)과 동일하게 표적 유전자를 억제하고 동일한 기능을 하도록 발명되었다. 따라서 이러한 마이크로RNA로써의 기능을 확인하고자, 상기 실시예에서 qPCR을 시행했던 방법과 동일하게 HeLa 세포에 75nM의 대조군 siRNA (-), miR-206 (206), E7 siRNA 또는 206/E7 siRNA를 전달하고, qPCR 실험을 miR-206(또는 miR-1)의 발단 싸이트 표적(seed site target)으로 알려진 PTK9과 ADAR1 유전자에 대해서 실시하였다. 이때 miR-206은 상기 실시예에서 siRNA에 대해 기술한 동일 방법으로 합성하여 제작했으며, 이 때 miRBase (http://www.mirbase.org/)의 인간 miR-206과 동일한 서열을 사용하였다. PTK9과 ADAR1 유전자는 그 mRNA에 miR-1 또는 miR-206의 발단부위와 결합할 수 있는 AUUCCA 서열을 가지고 있으며, 이들은 miR-1 또는 miR-206에 의해서 저해되는 표적 유전자로 알려져 있다. 상기에서 실시한 qPCR 분석 결과, 206/E7 siRNA도 miR-206과 동일하게 그 표적 유전자인 PTK9과 ADAR1의 mRNA의 양을 효율적으로 감소시키는 것을 관찰하였으며, 이를 통하여 206/E7 siRNA가 miR-206과 동일한 표적을 억제할 수 있다는 사실을 확인하였다 (도 6A). Since the 206 / E7 siRNA has a seed region that is the first to eighth sequence from the 5 'end of miR-206 or miR-1, the target gene is identical to miR-206 (or miR-1) And to have the same function. Therefore, in order to confirm the function of the microRNA, 75 nM of control siRNA (-), miR-206 (206), E7 siRNA or 206 / E7 siRNA was delivered to HeLa cells in the same manner as in the above- And qPCR experiments were performed on the PTK9 and ADAR1 genes, which are known as the target site targets of miR-206 (or miR-1). Here, miR-206 was synthesized by the same method as described for the siRNA in the above example, and the same sequence as human miR-206 of miRBase (http://www.mirbase.org/) was used. The PTK9 and ADAR1 genes have AUUCCA sequences that are capable of binding to the initiation sites of miR-1 or miR-206 in their mRNAs, which are known as target genes that are inhibited by miR-1 or miR-206. As a result of the above qPCR analysis, it was observed that the 206 / E7 siRNA effectively reduced the amount of mRNA of the target genes PTK9 and ADAR1 in the same manner as miR-206, Gt; (FIG. 6A). &Lt; / RTI &gt;

206/E7 siRNA에 의해서 일어나는 miR-206 표적 유전자의 저해를 전체 전사체에 대해서 확인하고자 RNA-Seq 분석을 추가로 시행하였다. 즉, HeLa 세포에 206/E7 siRNA와 대조군 siRNA를 각각 전달시킨 다음, 24시간 후에 전체 RNA를 RNAeasy(Qiagen) 키트로 추출하여, Otogenetics 에서 제공하는 RNA-Seq 는 유전자 서열분석에 기반한 유전자 발현 실험을 수행하였다. 상기 실험으로 얻어진 서열 데이터인 FASTAQ 파일을 TopHat, Cufflink, Cuffdiff 프로그램을 사용하여 순차적으로 분석한 다음, 대조군 siRNA를 도입한 HeLa 세포에서의 결과로 표준화하여 로그비(Fold change, log2 ratio)로 나타내어 분석을 실시하였다. 이러한 결과는 최종적으로는 miR-206의 발단 싸이트, 즉 AUUCCA 서열을 포함하면서, 가장 강력하게 표적으로써의 억제 효과를 보이는 것으로 알려진 CAUUCCA (5‘말단 기준 2번째에서부터 8번째까지와 염기 배열하는 7mer)를 가지고 있는 타겟 mRNA를 대상으로, 전체 전사체(total)와 비교하여 얻어진 mRNA 프로파일 결과를 저해되는 순서대로 누적비율(cumulative fraction)로 비교 분석하였다 (도 6B). 그 결과, 206/E7 siRNA가 miR-206의 7mer 발단 싸이트(CAUUCCA)를 가지고 있는 mRNA들이 전체 전사체와 비교하여 상대적으로 유의하게 억제된다는 사실을 통계적인 테스트를 통해 확인하였다(Kolmogorov-Smirnov test, P<0.01). 이를 통해 206/E7 siRNA를 자궁경부암 세포인 HeLa에 도입되었을 때, miR-206(또는 miR-1)과 동일하게 작용하여 그 발단 싸이트 표적 유전자군을 억제하고, 이러한 효과는 miR-206(또는 miR-1)과 동일한 생물학적 기능을 나타낼 수 있다는 점을 알 수 있었다.RNA-Seq analysis was further performed to confirm inhibition of the miR-206 target gene caused by 206 / E7 siRNA against the entire transcript. In other words, 206 / E7 siRNA and control siRNA were respectively transferred to HeLa cells, and 24 hours later, total RNA was extracted with RNAeasy (Qiagen) kit, and RNA-Seq provided by Otogenetics was subjected to gene expression analysis based on gene sequence analysis Respectively. The FASTAQ file, which is the sequence data obtained by the above experiment, was sequentially analyzed using TopHat, Cufflink, and Cuffdiff programs, and normalized to the results of HeLa cells transfected with a control siRNA, and expressed as Fold change (log2 ratio) Respectively. These results ultimately led to CAUUCCA (the second to eighth nucleotide and the 7-mer nucleotide sequence aligned at the 5 'end), which is known to have the most potent target inhibitory effect, including the initiation site of miR-206, (Fig. 6B), the mRNA profile results obtained by comparing the total mRNA with the total mRNA were compared in a cumulative fraction in the order of inhibition. As a result, it was confirmed through statistical tests that the 206 / E7 siRNA was relatively inhibited in comparison with the whole transcripts of mRNA having the 7mer meristem (CAUUCCA) of miR-206 (Kolmogorov-Smirnov test, P &lt; 0.01). When the 206 / E7 siRNA is introduced into the cervical cancer cell line HeLa, it acts like miR-206 (or miR-1) and inhibits its target gene target gene group, -1), which is the same as that of the wild type.

따라서, 206/E7 siRNA가 miR-206과 동일하게 암세포의 침윤을 억제하는지를 확인하고자 Corning™ BioCoat™ Matrigel™ Invasion Chamber with BD Matrigel Matrix 키트(BD)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 HeLa 세포에 75nM의 대조군 siRNA(NT), miR-206, E7 siRNA, 206/E7 siRNA를 상기 실시예와 동일하게 Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) 시약을 사용하여 트랜스펙션하고 HeLa 세포의 침윤 변화를 측정하였다. 그 결과, miR-206과 E7 siRNA 모두 HeLa 세포의 침윤을 억제하였으나, 206/E7의 경우에는 이 둘의 저해 정도를 합한 정도로 HeLa 세포의 침윤을 더 많이 억제하였다. 특히, 추가적으로 206/E7 siRNA의 5‘말단 기준 2번째를 2'OMe로 변형하여 miR-206의 기능을 하는 발단 부분이 표적을 인식하지 못하도록 했을 때, HeLa 세포의 침윤 억제가 miR-206/E7에 비해 줄어들었으며, 그 침윤 억제 정도가 E7 siRNA에 의해 일어나는 정도와 비슷한 것을 관찰하였다 (도 6C).Therefore, in order to confirm whether 206 / E7 siRNA inhibits the infiltration of cancer cells in the same manner as miR-206, HeLa cells were transfected with 75 nM of HepG2 cells using a CorningBioCoatTM MatrigelTM Invasion Chamber with BD Matrigel Matrix Kit (BD) The control siRNA (NT), miR-206, E7 siRNA, and 206 / E7 siRNA were transfected using Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) reagent in the same manner as in the above example, and the change in invasion of HeLa cells was measured. As a result, both miR-206 and E7 siRNA inhibited the infiltration of HeLa cells, but inhibited the infiltration of HeLa cells to the extent of 206 / E7 combined. In particular, when the second portion of the 206 / E7 siRNA was modified to 2'OMe to prevent the target portion from recognizing the target portion of miR-206, the infiltration inhibition of HeLa cells was inhibited by miR-206 / E7 (Fig. 6C). The degree of inhibition of invasion was similar to that caused by E7 siRNA (Fig. 6C).

또한, 206/E7 siRNA가 자궁경부암 세포의 이동을 miR-1과 동일하게 억제하면서, 세포 사멸을 유도하는 효과를 보이는 지를 확인하기 위해서 창상회복실험(wound healing assay)을 HeLa 세포에서 실시 하였으며, 그 결과 206/E7은 miR-1과 동일하게 자궁경부암 세포의 이동을 유의하게 억제하면서 (p<0.01, n=4, t-test) E7 siRNA와 마찬가지로 세포 사멸을 유도하는 것으로 확인할 수 있었다 (도 6D). 또한 이 효과는 image J 프로그램으로 정량했을 때, 기존의 siRNA인 E7에 비해서 월등하게 자궁경부암 세포의 이동을 억제함을 알 수 있었다 (도 6E). 이러한 결과로부터 206/E7 siRNA가 miR-206과 동일하게 전사체 수준에서 발단 부분을 통해 표적 유전자를 억제하며, 이는 기존의 E7 siRNA에 비해서 추가적으로 miR-206과 같은 기능을 수행함으로써 HPV 유래 자궁경부암의 침윤 및 전이를 보다 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있다.In addition, a wound healing assay was performed on HeLa cells in order to confirm that 206 / E7 siRNA inhibits the migration of cervical cancer cells to the same extent as miR-1 and induces apoptosis. Results 206 / E7 were found to induce apoptosis in the same manner as E7 siRNA (p <0.01, n = 4, t-test) while significantly inhibiting the migration of cervical cancer cells as miR-1 ). In addition, when this effect was quantified by the image J program, it was found to be superior to the existing siRNA, E7, to inhibit the migration of cervical cancer cells (Fig. 6E). These results indicate that the 206 / E7 siRNA inhibits the target gene through the initiation site at the transcript level, similar to miR-206, which, in addition to the existing E7 siRNA, performs the same function as miR-206, Invasion and metastasis can be inhibited more effectively.

[실시예 6][Example 6]

206/E7 206 / E7 siRNA의siRNA 생체 암 저해 효과를 자궁경부암 이종이식 생쥐 모델에서 평가  Evaluation of the inhibitory effect of the biomarker on the cervical cancer xenograft mouse model

상기 실시예에서 분석한 206/E7 siRNA의 자궁경부암 억제 효과를 생체 내에서 평가하기 위해, 인간 자궁경부암 세포인 HeLa를 생쥐에 이종 이식한 후, 이에 대한 206/E7 siRNA의 암 억제 효과를 평가하였다. 즉 실험용 누드 마우스(Nu/nu; Orient)에 5 x 105 개의 HeLa-luc (Bioware Cell Line; Caliper) 세포를 Matrigel(BD Matrigel Matrix; BD)를 이용하여 제공되는 제조사의 프로토콜에 따라 PBS 용액과 섞어서 25%로 피하 주사하여 자궁경부암 이종이식 생쥐 모델을 만들었다(도 7). 이 후 4일, 6일, 8일, 11일이 지난 시기에 각각 대조군 siRNA 또는 206/E7 siRNA를 이종이식된 암세포에 주입하였다 (도 6A, 화살표로 표시). 이러한 siRNA의 주입은 in vivo-jetPEI(polyplus)를 사용하여, 회사에서 제공되는 프로토콜에 따라 4일과 6일 후에 각각 10ug씩, 8일과 11일 후에는 15ug씩 siRNA를 사용하여 1.2배의 in vivo-jetPEI(10ug당 1.2ul)와 함께 처리하였으며, 암세포의 크기는 vivoGlo Luciferin(Xenogen)를 제조사의 프로토콜에 따라 투여한 후, bioluminiscence image(Caliper)로 분석하였다. 그 결과, 206/E7 siRNA를 처리했을 경우 암세포의 크기가 8일 이후부터 현저하게 줄어드는 것을 관찰하였다 (도 7A). 또한 이렇게 줄어든 암세포의 크기는 18일, 20일 후에 추가적으로 20ug의 siRNA를 처리하고 그 부피를 측정했을 때에도 줄어든 크기가 유지되어 29일까지 유효함을 확인하였다 (도 7B).In order to evaluate the cervical cancer inhibitory effect of the 206 / E7 siRNA analyzed in the above example in vivo, the human cervical cancer cell line HeLa was xenotransplanted into mice, and the inhibitory effect of 206 / E7 siRNA on the cancer was evaluated . 5 x 10 5 HeLa-luc (Bioware Cell Line) caliper cells were injected into a nude mouse (Nu / nu; Orient) in a laboratory according to the manufacturer's protocol provided by Matrigel (BD Matrigel Matrix; BD) And subcutaneously injected at 25% to prepare a cervical cancer xenograft mouse model (Fig. 7). 6, 8, and 11 days later, control siRNA or 206 / E7 siRNA were injected into xenotransplantation cancer cells (FIG. 6A, indicated by an arrow). Injection of these siRNAs was carried out using in vivo-jetPEI (polyplus), in accordance with the protocol provided by the company, with 10 ug of each 4 days and 6 days, and 15 ug after 8 and 11 days, respectively, (1.2 ug per 10 ug), and the size of cancer cells was analyzed by bioluminiscence image (Caliper) after vivoGlo Luciferin (Xenogen) was administered according to the manufacturer's protocol. As a result, it was observed that when the 206 / E7 siRNA was treated, the size of the cancer cells remarkably decreased after 8 days (Fig. 7A). In addition, the size of cancer cells reduced by 18 days and 20 days after addition of 20 ug of siRNA was measured, and it was confirmed that the reduced size was maintained until the 29th day when the volume was measured (Fig. 7B).

또한, 추가적으로 자궁경부암 이종이식 마우스모델를 유도한 초기 시점에서 206/E7 siRNA의 효과를 기존의 E7 siRNA와 비교하기 위해서, HeLa 세포를 실험용 누드 마우스의 피하조직에 이식한 후 3일, 4일, 9일, 11일, 13일에 각각 10ug의 siRNA를 투여하고, 그 효능을 상기와 동일한 방법으로 평가하였다 (도 7C). 그 결과, 206/E7 siRNA와 E7 siRNA 둘 다 자궁경부암의 크기를 현저하게 줄이며, 특히 206/E7의 경우에는 14일 후의 암세포의 크기가 기존의 E7 siRNA에 비해 보다 많이 줄어들어 있음을 관찰하였다 (도 7D). 이러한 206/E7 siRNA의 우수한 자궁경부암 억제 효과는 반복한 실험에서도 유효하였으며, 특히 22일 후에는 E7 siRNA 보다 우수함을 추가적으로 확인하였다 (도 7E). 이와 같이, 자궁경부암 이종이식 마우스 모델 실험에서 206/E7 siRNA는 생체 내에서 효과적으로 자궁경부암의 크기를 줄이며, 이러한 효과는 30일까지 유지되며 기존의 E7 siRNA 보다 효율적으로 암을 억제함을 알 수 있었다.In addition, in order to compare the effect of 206 / E7 siRNA with the conventional E7 siRNA at the initial stage of inducing a cervical cancer xenograft mouse model, HeLa cells were transplanted into the subcutaneous tissues of experimental nude mice, On the day, 11, and 13, 10 ug siRNAs were administered, respectively, and the efficacy was evaluated in the same manner as described above (Fig. 7C). As a result, both the 206 / E7 siRNA and the E7 siRNA significantly reduced the size of the cervical cancer, especially in the case of 206 / E7, the size of cancer cells after 14 days was much smaller than that of the existing E7 siRNA 7D). The superior cervical cancer inhibitory effect of these 206 / E7 siRNAs was also valid in repeated experiments, especially after 22 days, better than E7 siRNA (Fig. 7E). Thus, in the cervical cancer xenograft mouse model experiment, 206 / E7 siRNA effectively reduced the size of cervical cancer in vivo, and this effect was maintained for 30 days and inhibited cancer more efficiently than the existing E7 siRNA .

Claims (12)

RNA 간섭 유도 핵산의 이중가닥 중 하나의 단일가닥이 miR-206, miR-1, miR-376a, miR-329, miR-497 및 miR-218로 구성된 군에서 선택되는 하나의 마이크로RNA의 염기서열을 포함하고 인간유두종 바이러스(huma papilloma virus: HPV)의 E6 또는 E7 유전자의 발현을 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산.
A single strand of one of the double strands of the RNA interference inducing nucleic acid comprises a base sequence of one microRNA selected from the group consisting of miR-206, miR-1, miR-376a, miR-329, miR-497 and miR- An RNA interference inducing nucleic acid that inhibits the expression of E6 or E7 gene of human papilloma virus (HPV).
제 1항에 있어서,
상기 RNA 간섭 유도 핵산의 이중가닥 중 하나의 단일가닥은 miR-206, miR-1, miR-376a, miR-329, miR-497 및 miR-218로 구성된 군에서 선택되는 하나의 마이크로RNA의 5’ 말단 기준 1번째에서 8번째 사이의 6개 내지 8개의 연속적인 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 RNA 간섭 유도 핵산.
The method according to claim 1,
Wherein the single strand of the double strand of the RNA interference inducing nucleic acid is selected from the group consisting of miR-206, miR-1, miR-376a, miR-329, miR-497 and miR- Wherein the RNA interference inducing nucleic acid comprises 6 to 8 consecutive nucleotide sequences between 1st and 8th terminal reference.
제 2항에 있어서,
상기 RNA 간섭 유도 핵산의 이중가닥 중 하나의 단일가닥의 5’ 말단으로부터 2번째 내지 7번째 서열이 GGAAUG, UCAUAG, ACACAC, AGCAGC 또는 UGUGCU인 것을 특징으로 하는 RNA 간섭 유도 핵산.
3. The method of claim 2,
Wherein the second to seventh sequences from the 5 'end of the single strand of the double-stranded RNA interference inducing nucleic acid are GGAAUG, UCAUAG, ACACAC, AGCAGC or UGUGCU.
제 1항에 있어서,
상기 RNA 간섭 유도 핵산은 siRNA, miRNA, shRNA, DsiRNA, lsiRNA, ss-siRNA, piRNA, endosiRNA 및 asiRNA로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 RNA 간섭 유도 핵산.
The method according to claim 1,
Wherein the RNA interference inducing nucleic acid is selected from the group consisting of siRNA, miRNA, shRNA, DsiRNA, lsiRNA, ss-siRNA, piRNA, endosiRNA and asiRNA.
제 1항에 있어서,
상기 RNA 간섭 유도 핵산의 이중가닥 중 miR-206, miR-1, miR-376a, miR-329, miR-497 및 miR-218로 구성된 군에서 선택되는 하나의 마이크로RNA의 염기서열을 포함하는 단일가닥은 아고너트 단백질과 결합하는 것을 특징으로 하는 RNA 간섭 유도 핵산.
The method according to claim 1,
A single strand comprising a base sequence of one microRNA selected from the group consisting of miR-206, miR-1, miR-376a, miR-329, miR-497 and miR-218 among the double strands of said RNA interference- Wherein the nucleic acid binds to an agonist protein.
제 1항에 있어서,
상기 RNA 간섭 유도 핵산의 이중가닥 중 miR-206 또는 miR-1의 염기서열을 포함하는 단일가닥은 PTK9 또는 ADAR1 유전자 발현을 억제하고, AUUCCA 서열을 가지고 있는 전사체를 억제하는 것을 특징으로 하는 RNA 간섭 유도 핵산.
The method according to claim 1,
Wherein the single strand comprising the nucleotide sequence of miR-206 or miR-1 among the double strands of the RNA interference inducing nucleic acid inhibits PTK9 or ADAR1 gene expression and inhibits a transcript having the AUUCCA sequence, Induced nucleic acid.
제 1항에 있어서,
상기 RNA 간섭 유도 핵산은 자궁경부암 세포의 사멸을 유도하는 것을 특징으로 하는 RNA간섭 유도 핵산.
The method according to claim 1,
Wherein the RNA interference inducing nucleic acid induces the death of cervical cancer cells.
제 1항에 있어서,
상기 RNA 간섭 유도 핵산은 자궁경부암 세포의 침윤 또는 전이를 억제하는 것을 특징으로 하는 RNA 간섭 유도 핵산.
The method according to claim 1,
Wherein the RNA interference inducing nucleic acid inhibits invasion or metastasis of cervical cancer cells.
제 1항의 RNA 간섭 유도 핵산 서열에 상응하는 DNA 서열을 포함하는 벡터.
A vector comprising a DNA sequence corresponding to the RNA interference inducible nucleic acid sequence of claim 1.
제 1항의 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 HPV의 감염으로 유발되는 암의 치료용 약학 조성물.
A pharmaceutical composition for the treatment of cancer caused by infection of HPV comprising the RNA interference inducing nucleic acid of claim 1.
제 10항에 있어서,
상기 암은 자궁경부암, 질암, 외음부암, 항문암, 음경암, 편도암, 인두암, 후두암, 머리와 목암 및 폐의 선암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 HPV 감염으로 유발되는 암의 치료용 약학 조성물.
11. The method of claim 10,
Wherein said cancer is selected from the group consisting of cervical cancer, vaginal cancer, vulvar cancer, anal cancer, penile cancer, tonsil cancer, parietal cancer, laryngeal cancer, head and neck cancer and lung adenocarcinoma. &Lt; / RTI &gt;
제 10항에 있어서,
상기 약학 조성물은 경구, 피하, 정맥 내, 근육 내, 비강 내 또는 복강 내로 투여되는 것을 특징으로 하는 HPV의 감염으로 유발되는 암의 치료용 약학 조성물. 11. The method of claim 10,
Wherein said pharmaceutical composition is administered orally, subcutaneously, intravenously, intramuscularly, intranasally or intraperitoneally.
KR1020170130179A 2016-10-11 2017-10-11 Small interfering RNA and Pharmaceutical Composition for Treatment of HPV related cancer comprising the same KR102129852B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20160131223 2016-10-11
KR1020160131223 2016-10-11

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20180040107A true KR20180040107A (en) 2018-04-19
KR102129852B1 KR102129852B1 (en) 2020-07-24

Family

ID=62088073

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020170130179A KR102129852B1 (en) 2016-10-11 2017-10-11 Small interfering RNA and Pharmaceutical Composition for Treatment of HPV related cancer comprising the same

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102129852B1 (en)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190137019A (en) * 2018-05-31 2019-12-10 고려대학교 산학협력단 Modified nucleic acids suppressing microRNA and use thereof
KR20200137636A (en) * 2019-05-31 2020-12-09 고려대학교 산학협력단 RNA interference inducing nucleic acids suppressing noncanonical targets of microRNA and use thereof
KR20200137635A (en) * 2019-05-31 2020-12-09 고려대학교 산학협력단 RNA interference inducing nucleic acids suppressing noncanonical targets of microRNA and use thereof
KR20200137634A (en) * 2019-05-31 2020-12-09 고려대학교 산학협력단 RNA interference inducing nucleic acids suppressing noncanonical targets of microRNA and use thereof
WO2021107747A1 (en) * 2019-11-28 2021-06-03 고려대학교 산학협력단 Rna interference-inducing nucleic acid comprising 8-oxoguanine, modified nucleic acid binding to microrna comprising 8-oxoguanine, and uses thereof

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1439227A1 (en) * 2003-01-15 2004-07-21 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts HPV-E6-specific siRNAs for the treatment of HPV-related tumors
EP1595954A1 (en) * 1997-09-05 2005-11-16 The Government of the United States of America, as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services Human papilloma virus inhibition by antisense oligonucleotides
CN104560992A (en) * 2013-10-10 2015-04-29 复旦大学附属妇产科医院 MicroRNA for preventing and treating human papilloma virus infection and cervical carcinoma

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1595954A1 (en) * 1997-09-05 2005-11-16 The Government of the United States of America, as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services Human papilloma virus inhibition by antisense oligonucleotides
EP1439227A1 (en) * 2003-01-15 2004-07-21 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts HPV-E6-specific siRNAs for the treatment of HPV-related tumors
CN104560992A (en) * 2013-10-10 2015-04-29 复旦大学附属妇产科医院 MicroRNA for preventing and treating human papilloma virus infection and cervical carcinoma

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Int. J. Mol. Sci.,제15권,15700-15733면 (2014) 1부.* *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190137019A (en) * 2018-05-31 2019-12-10 고려대학교 산학협력단 Modified nucleic acids suppressing microRNA and use thereof
KR20200137636A (en) * 2019-05-31 2020-12-09 고려대학교 산학협력단 RNA interference inducing nucleic acids suppressing noncanonical targets of microRNA and use thereof
KR20200137635A (en) * 2019-05-31 2020-12-09 고려대학교 산학협력단 RNA interference inducing nucleic acids suppressing noncanonical targets of microRNA and use thereof
KR20200137634A (en) * 2019-05-31 2020-12-09 고려대학교 산학협력단 RNA interference inducing nucleic acids suppressing noncanonical targets of microRNA and use thereof
WO2021107747A1 (en) * 2019-11-28 2021-06-03 고려대학교 산학협력단 Rna interference-inducing nucleic acid comprising 8-oxoguanine, modified nucleic acid binding to microrna comprising 8-oxoguanine, and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
KR102129852B1 (en) 2020-07-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102129852B1 (en) Small interfering RNA and Pharmaceutical Composition for Treatment of HPV related cancer comprising the same
Sun et al. LncRNA SNHG7 contributes to tumorigenesis and progression in breast cancer by interacting with miR-34a through EMT initiation and the Notch-1 pathway
Niu et al. MiR-205 promotes motility of ovarian cancer cells via targeting ZEB1
Bian et al. Hotair facilitates hepatic stellate cells activation and fibrogenesis in the liver
Denby et al. miR-21 and miR-214 are consistently modulated during renal injury in rodent models
US8067572B2 (en) Hybrid interfering RNA
JP5976643B2 (en) Methods and compositions for specific inhibition of beta-catenin by double stranded RNA
TW201106977A (en) Development of universal cancer drugs and vaccines
KR20110110776A (en) Extended dicer substrate agents and methods for the specific inhibition of gene expression
US20240076677A1 (en) TOXIC RNAi ACTIVE SEED SEQUENCES FOR KILLING CANCER CELLS
WO2007038788A2 (en) Small interfering rnas as non-specific drugs
Huang et al. RETRACTED ARTICLE: The microRNA-1246 promotes metastasis in non-small cell lung cancer by targeting cytoplasmic polyadenylation element-binding protein 4
Zhong et al. miR-21-5p promotes lung adenocarcinoma progression partially through targeting SET/TAF-Iα
Ding et al. MiR-let-7e inhibits invasion and magration and regulates HMGB1 expression in papillary thyroid carcinoma
Yang et al. LAMC1 mRNA promotes malignancy of hepatocellular carcinoma cells by competing for MicroRNA‐124 binding with CD151
Ma et al. MiRNA-200b regulates RMP7-induced increases in blood-tumor barrier permeability by targeting RhoA and ROCKII
Alvarez-Salas et al. Molecular approaches to cervical cancer therapy
Wang et al. Inhibition of miR‐24 suppresses malignancy of human non‐small cell lung cancer cells by targeting WWOX in vitro and in vivo
Bai et al. CircSND1 regulated by TNF-α promotes the migration and invasion of cervical cancer cells
Chiappinelli et al. Reduced DICER1 elicits an interferon response in endometrial cancer cells
Mackedenski et al. Characterizing the interaction between insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 1 (IMP1) and KRAS expression
JP2011093892A (en) Tumor proliferation inhibitor containing cancer-inhibitive micro-rna
US8980854B2 (en) miRNA compounds for treatment of prostate carcinoma
Brito et al. Streptolysin-O reversible permeabilisation is an effective method to transfect siRNAs into myeloma cells
CN104884096B (en) Composition for treating cancer related to human papillomavirus infection

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right