KR20180037449A - Brain tumor animal model and the Use thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 CreERT2 유전자 및 암유전자를 대뇌에서 과발현하는 뇌종양 동물모델 및 이를 이용한 뇌종양 예방 및 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a brain tumor animal model that overexpresses the CreER T2 gene and cancer gene in the cerebrum, and a method for screening a brain tumor prevention and treatment agent using the same.
뇌종양은 종양에서 기원한 것으로 여겨지는 세포의 종류에 따라 분류된다. 확산, 섬유성 성상세포종은 성인에게 가장 일반적인 타입의 일차 뇌종양이다. 이러한 종양은 조직병리학적으로 3등급의 악성 종양으로 구분된다: 세계 보건 기구(WHO) 등급 Ⅱ 성상세포종, WHO 등급 Ⅲ 미분화성상세포종 및 WHO 등급 IV 다형성교아종(GBM). WHO 등급 Ⅱ 성상세포종은 가장 무기력한 확산 성상세포종 스펙트럼이다. 성상세포종은 주변 뇌에 침투하는 주목할 만한 경향을 나타내며, 이는 국소 제어시 치료학적 시도를 혼동스럽게 하였다. 이러한 침습성 능력은 종종 저 등급뿐만 아니라, 고 등급 종양에서 분명하다. 다형성교아종(Glioblastoma multiforme: GBM)은 대부분의 환자에서 2년 미만의 생존 기간을 갖는 성상세포종의 가장 악성적인 단계이다. 조직학적으로, 이러한 종양은 밀집한 세포질, 고 증식 지표, 내피 증식 및 소상괴사(focal necrosis)로 특징지어진다. 이러한 병소의 고 증식 특성은 다중 분열 효과로부터 생기기 쉽다. GBM의 특징 중 하나는 내피 증식이다. 성상세포종의 생물학적 서브세트(subset)가 존재하며, 이는 이러한 종양에서 관찰되는 임상학적 이질성을 보여주는 것이다. 이러한 서브세트는 뇌 줄기 신경교종을 포함하며, 이는 종종 악성 코스가 후속하는 소아학적 확산, 섬유성 성상세포종의 형태이다. 뇌 줄기 GBMs은 보다 어린 환자에게 영향을 미치는 이들의 성체 GBMs과 유전적 특징을 공유한다. 다형성 황색 성상세포종(PXA)은 주로 청소년에게 영향을 미치는 깊지 않은 저 등급의 성상세포 종양이다. 이러한 종양은 특이한 조직학적 모습을 가지며, 전형적으로 외과학적 치료로 처리될 수 있는 느린-성장 종양이다. 그러나, 일부 PXAs는 GBM으로서 재발할 수 있다. 모양세포성 성상세포종(pilocytic astrocytoma)은 아동기의 가장 흔한 성상세포 종양이며, 성인에게 영향을 미치는 확산, 섬유성 성상세포종과는 임상적으로 및 조직병리학적으로 다르다. 모양세포성 성상세포종은 확산, 섬유성 성상세포종과 동일한 게놈 변화를 갖지 않는다. 상의하세포성 거대세포 성상세포종(Subependymal Giant Cell Astrocytoma)(SEGA)은 결절성 경화증(TS)과 보통 관련이 있는 심실 주변의 저등급 성상세포 종양이며, TS 환자의 심실을 채우는 조직학적으로 소위 "캔들-거터링(candle-guttering)"으로 확인된다. TS에서 다른 종양 병소와 유사하게, 이들은 느리게 성장하며, 진정한 신생물(true neoplasm)보다는 과오종(harmartomas)에 더 유사할 수 있다. 유아기의 결합조직형성 성상세포종(DCAI) 및 결합조직형성 유아 신경절 교세포종(DIGG)은 1살 또 2살의 유아에 영향을 미치는, 크고, 외견상 보통 낭포성의 양성 성상세포종이다. 핍지교종 및 희소별아교세포종(혼합 신경교종)은 일반적으로 확산, 섬유성 성상세포종과 임상학적으로 그리고 생물학적으로 가장 가까운 관계에 있는 뇌종양이다. 그러나, 이러한 종양은 성상세포종에 비해 덜 일반적이며, 일반적으로 확산 성상세포종에 비해 나은 예측성을 갖는다. 핍지교종 및 희소별아교세포종은 WHO 등급 III 악성 핍지교종 또는 악성 희소별아교세포종으로, 또는 WHO 등급 IV GBM으로 진전될 수 있다. 따라서, 핍지교종 종양을 일으키는 유전적 변화는 GBM에 대한 다른 경로를 구성한다. 뇌질피복 세포증은 유아의 공격적 심실내 종양에서부터 성인의 양성 척수 종양에 이르기까지 다양하다. 뇌질피복 세포증의 GBM으로의 전이는 드물다. 또한, 맥락막망 종양은 심실계에서 우선적으로 일어나는 다양한 그룹의 종양이며, 유아의 공격적 천막상부(supratentorial) 심실내 종양에서부터 성인의 양성 소뇌교각부종양(cerebellopontine angle tumor)에 이르기까지 다양하다. 맥락층 종양은 리프라우메니 증후군(Li-Fraumeni syndrome) 및 폰 히펠-린다우병(Von Hippel-Lindau disease)에 걸린 환자에서 종종 보고되었다. 수모세포종은 주로 유아의 후두와(posterior fossa)에서 발생하는 고 악성의 초기 종양이다. 뇌수막종은 뇌수막에서 발생하며 그 하부의 뇌를 압박하는 일반적인 두개강내 종양이다. 뇌수막종은 일반적으로 양성이지만, 일부는 "이형(atypical)" 뇌수막종이 국부적으로 재발할 수 있으며, 그리고 일부 뇌수막종은 솔직히 악성이며 뇌를 침입하거나 전이될 수 있다. 이형 및 악성 뇌수막종은 양성 뇌수막종 만큼 흔하지는 않다. 신경초종은 말초신경에서 발생하는 양성 종양이다. 신경초종은 뇌 신경, 특히, 8번째의 뇌 신경의 전방부(전방 신경초종, 청신경종)에서 발생할 수 있으며, 소뇌교각부 매스(cerebellopontine angle masses)로 존재한다. 혈관모 세포종은 내피 세포, 혈관주위세포 및 소위 기질 세포로 구성된 불특정 기원의 종양이다. 이러한 양성 종양은 청소년의 소뇌 및 척수에서 가장 빈번하게 발생한다. 다발성 혈관모 세포종은 폰 히펠-린다우병(VHL)의 특성이다. 혈관주위세포종(HPCs)은 국부적으로 공격적인 거동을 나타내며 전이될 수 있는 경뇌막 종양이다. 경뇌막계 혈관주위세포종(HPC)의 조직 형성은 오랫동안 논의되어왔으며, 일부 저자들은 이를 별개의 독립체로 분류하고, 나머지 저자들은 이를 수막종의 서브타입으로 분류하였다. 일차 및 전이성 뇌종양 모두의 증상은 주로 뇌에서의 위치 및 종양의 크기에 따라 달라진다. 뇌의 각 영역이 특정 기능을 담당하기 때문에, 증상은 상당히 달라진다. 뇌의 전두엽에서의 종양은 무기력 및 마비, 기분 장애(mood disturbance), 사고 장애(difficulty thinking), 착란상태 및 방향감각 상실, 및 광범위한 정서적 기분 변화를 일으킬 수 있다. 두정엽 종양은 발작, 무감각 또는 마비, 쓰기의 어려움, 간단한 수학 문제의 수행 불능, 특정 움직임의 어려움, 및 접촉 감각의 상실을 일으킬 수 있다. 후두부에서의 종양은 각 시야의 반으로의 시력 손실, 시각적 환각 및 발작을 일으킬 수 있다. 측두엽 종양은 마비, 지각 및 공간적 장애 및 수용실어증(receptive aphasia)을 일으킬 수 있다. 만일 종양이 소뇌에서 일어난다면, 그 사람은 운동 실조, 조정력의 상실, 두통 및 구토를 가질 수 있다. 시상하부에서의 종양은 정서 변화를 일으킬 수 있으며, 뜨거운 것과 차가운 것의 자각 변화를 일으킬 수 있다. 또한, 시상하부 종양은 유아의 성장 및 영양에 영향을 미칠 수 있다. 소뇌를 제외하고, 뇌의 한쪽에서의 종양은 신체의 반대편에서 증상 및 장애를 일으킨다.Brain tumors are classified according to the type of cells that are thought to originate from the tumor. Diffuse, fibrous astrocytoma is the most common type of primary brain tumor in adults. These tumors are histopathologically classified as
이러한 배경 하에, 뇌종양에 대한 새로운 치료제를 발견하기 위하여 연구자들은 병인, 증상, 치료, 생리학적 기초에 부합하는 동물모델의 개발에 도전하고 있다. 이러한 동물모델의 연구는 뇌종양의 기전을 정확히 알아내고, 다양한 새로운 치료 표적들과 새로운 치료법의 효과 검증에 중요한 역할을 할 것으로 생각된다.Under these circumstances, in order to find new therapeutic agents for brain tumors, researchers are challenging the development of animal models that are compatible with pathogenesis, symptoms, treatment, and physiological basis. Studies of these animal models will play an important role in accurately determining the mechanisms of brain tumors and verifying the effectiveness of various new therapeutic targets and new therapies.
현재까지는 약물치료나 기전연구를 위한 질병모델로서 대부분 설치류를 이용해 왔으나, 동물 질환모델의 병리양상과 증상이 사람에서 관찰되는 것과 많은 차이를 보이고 있어 설치류 질환모델에서 나온 결과를 토대로 임상시험을 시행할 경우 많은 문제점이 있어 효과적인 뇌종양 질환 모델로 사용 가능할 동물은 아직까지 확립하지 못하고 있는 실정이다.Until now, most of the disease models for pharmacotherapy and mechanism studies have been using rodents, but the pathology patterns and symptoms of animal disease models are much different from those observed in humans, so clinical trials based on results from rodent disease models The number of animals that can be used as an effective brain tumor disease model has not yet been established.
그러므로, 인간과의 디멘존, 번식, 수명 및 행동양상의 확연한 차이로 인해 보다 인간과 가까운 종을 이용한 질환동물 모델에 대한 필요성이 제기되었고, 영장류의 경우 그 희소성 및 사육관리의 비용 및 어려움으로 인해 극히 제한적인 분야에서만 질환연구에 활용 가능한 제약이 있으므로, 이에 따라 비교적 저렴한 비용과 시설에서 보다 정확한 난치질환 연구를 할 수 있는 돼지를 새로운 모델 동물로서 바이오 메디컬 분야에 활용하고자 하는 요구가 증가되고 있다.Therefore, a clear distinction between dimenzon, reproduction, lifespan, and behavior with humans has raised the need for animal models of disease using more human species, and in the case of primates, the cost and difficulty of rarity and breeding management Therefore, there is a growing demand for biomedical research as a new model animal for pigs that can study incurable diseases at a relatively low cost and at a relatively low cost.
돼지는 해부 생리학적으로 인간과 유사성이 인정되어 이미 각종 질환의 병리학적 기전과 치료를 위한 연구에 이용되고 있으며, 특히 오랫동안 경제 동물로 가치가 인정되어 다른 중/대 동물을 질환모델로 사용할 때보다 윤리적인 문제점을 피해갈 수 있으며, 안정적인 사육 시스템이 구축되어 있어 실험동물 모델 개발 시 유지 및 관리가 용이한 장점이 있다.Pigs have been recognized for similarity with human anatomy physiologically and have already been used for the pathological mechanism and treatment of various diseases. Especially, when pigs are valued as economic animals for a long time, It can avoid ethical problems and has a stable breeding system, so it is easy to maintain and manage when developing animal models.
이에, 본 발명자들은 CreERT2 유전자 및 암유전자를 포함하는 재조합 벡터를 확립하고, 상기 재조합 벡터가 도입된 동물모델에서 상기 CreERT2 유전자 및 암유전자가 대뇌에서 과발현됨을 확인하였고, 아울러 이를 뇌종양 동물모델로 이용할 수 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.The present inventors have confirmed that the CreER T2 gene and the oncogene is overexpressed in the brain in the established recombinant vector, wherein the recombinant vector introduced into an animal model including a CreER T2 gene and the oncogene, as well as this, a brain tumor animal models The present invention has been completed.
본 발명의 목적은 CreERT2 유전자 및 암유전자를 포함하는 뇌종양 동물모델 제작용 재조합 벡터를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a recombinant vector for constructing a brain tumor animal model comprising CreER T2 gene and cancer gene.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터가 도입된, 뇌종양 동물 모델을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a brain tumor animal model into which said recombinant vector has been introduced.
본 발명의 또 다른 목적은 뇌종양 예방 및 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a method of screening for a preventive and therapeutic agent for brain tumors.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 CreERT2 유전자 및 암유전자를 포함하는 뇌종양 동물모델 제작용 재조합 벡터를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a recombinant vector for constructing a brain tumor animal model comprising CreER T2 gene and cancer gene.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터가 도입된, 뇌종양 동물모델 제작용 형질전환 세포를 제공한다.The present invention also provides a transformed cell for producing a brain tumor animal model into which the recombinant vector is introduced.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 체세포의 핵을, 탈핵된 난자에 이식하여 형성된 핵 이식란을 제공한다.In addition, the present invention provides a nuclear transfer embryo formed by transplanting the nucleus of somatic cells transformed with the recombinant vector into an enucleated oocyte.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터가 도입된 핵 공여 세포의 핵을 탈핵된 난자에 이식하여 산자를 생산하는 것을 특징으로 하는, 뇌종양 동물모델의 제조방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for producing a brain tumor animal model, characterized in that the core of the nuclear donor cell into which the recombinant vector is introduced is transplanted into the enucleated oocyte to produce a live egg.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터에 의해 형질전환된, CreERT2 및 암유전자를 과발현하는 것을 특징으로 하는 뇌종양 동물모델을 제공한다.In addition, the present invention provides a brain tumor animal model characterized by overexpressing CreER T2 and cancer gene transformed by the recombinant vector.
또한, 본 발명은 1) 뇌종양 동물모델에 뇌종양 예방 또는 치료제 후보물질을 투여하는 단계; 및 2) 후보물질 투여 후, 상기 동물모델의 뇌조직을 후보물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 암유전자의 발현이 억제되는 경우 뇌종양 예방 또는 치료제로 판단하는 단계;를 포함하는 뇌종양 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.Also, the present invention provides a method for treating a brain tumor, comprising the steps of: 1) administering a tumor tumor prophylactic or therapeutic agent candidate substance to a brain tumor animal model; And 2) judging the brain tissue of the animal model as a brain tumor prevention or treatment agent when the expression of the cancer gene is inhibited compared with a control group in which the candidate agent is not administered after administration of the candidate substance, Screening method.
본 발명에 따른 CreERT2유전자 및 암유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 동물에서 CreERT2 및 암유전자가 성상세포 특이적으로 대뇌에서 과발현되고 다른 기관에서는 발현되지 않으므로 이를 이용하여 뇌종양 동물모델로 이용할 수 있다. 또한, 상기 동물모델은 질병 기전의 규명, 치료물질의 탐색, 진단법의 개발 등에 다양하게 활용될 수 있으므로 향후 뇌종양 예방 및 치료제 개발에 유용하게 이용될 수 있다.In an animal transformed with a recombinant vector containing CreER T2 gene and cancer gene according to the present invention, CreER T2 and cancer gene are overexpressed in the cerebral cells and not expressed in other organs, and therefore, they can be used as a brain tumor animal model . In addition, the animal model can be used for various purposes such as identification of a disease mechanism, search for a therapeutic substance, development of a diagnostic method, and so on, so that it can be usefully used for development of a brain tumor prevention and therapeutic agent.
도 1은 성상세포 특이적인 CreERT2-매개 재조합 시스템의 모식도를 나타낸 도이다.
도 2는 LCMV-EGFPLoxP 플라스미드에 의해 형질전환된 공여 세포주를 형광활성세포분류방법(FACS)를 사용하여 분류한 결과(a) 및 EGFP의 발현을 형광현미경을 이용하여 관찰한 결과(b)를 나타낸 도이다.
도 3은 공여 세포주에 시스템 벡터의 도입여부를 PCR에 의해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 SCNT 배 발달을 평가한 결과(a 및 b) 및 이를 정리한 결과(c)를 나타낸 도이다.
도 5는 배아 이식된 대리모에서 출산된 5마리의 형질전환 새끼돼지를 나타낸 도이다.
도 6은 새끼 돼지 내에 pGFAP-CreERT2; EGFPLoxP 유전자가 도입되었는지 여부를 PCR에 의해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 F 및 R 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 GFAP 프로모터에 의해 제어되는 CreERT2 유전자가 GFAP-양성 아교 세포 내에서 발현되는지 여부를 확인하기 위해 면역형광 (IF) 염색을 수행하여 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 EGFP 형질도입 유전자의 뇌 조직 내 발현을 확인하기 위해 면역형광(IF) 염색을 수행하여 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 돼지 성상세포-특이적인 pGFAP-CreERT2; EGFPLoxP 재조합 시스템이 TM 처리에 의해 작동하는지 확인하기 위해, F-R' 세트를 사용하여 수행한 PCR 분석 결과를 나타낸 도이다.Figure 1 is a schematic diagram of an astrocyte-specific CreER T2 -mediated recombination system.
Fig. 2 shows the result of (a) classification of the donor cell line transformed with the LCMV-EGFP LoxP plasmid using the fluorescence activated cell sorting method (FACS) and (b) observation of the expression of EGFP using the fluorescence microscope Fig.
FIG. 3 is a graph showing the results of PCR for confirming the introduction of a system vector into a donor cell line. FIG.
FIG. 4 is a diagram showing the results (a and b) of evaluation of the SCNT fold development and the result (c) summarizing the results.
Fig. 5 shows five transgenic piglets born from embryo-transferred surrogate mothers.
Figure 6 shows the expression of pGFAP-CreER T2 ; EGFP LoxP gene was introduced by PCR.
FIG. 7 shows the result of performing PCR using F and R primers. FIG.
FIG. 8 is a graph showing the result of observing immunofluorescence (IF) staining in order to confirm whether CreER T2 gene controlled by GFAP promoter is expressed in GFAP-positive glial cells.
FIG. 9 is a graph showing the result of observing immunofluorescence (IF) staining for confirming the expression of an EGFP transgene in brain tissue. FIG.
Fig. 10 shows the results of a comparison of porcine astrocytic-specific pGFAP-CreER T2 ; FIG. 8 is a graph showing the results of PCR analysis performed using the FR 'set in order to confirm whether the EGFP LoxP recombination system is operated by the TM treatment.
본 발명은 CreERT2 유전자 및 암유전자(oncogene)를 포함하는 뇌종양 동물모델 제작용 재조합 벡터를 제공한다.The present invention provides a recombinant vector for constructing a brain tumor animal model comprising CreERT2 gene and oncogene.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다. 보다 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 pGFAP-CreERT2; EGFPLoxP 재조합 시스템을 이용한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail. More specifically, in one embodiment of the present invention, pGFAP-CreER T2 ; EGFP LoxP recombination system.
상기 재조합 시스템은 두개의 벡터를 포함하며, 하나는 GFAP 프로모터-CreERT2 유전자 벡터와 또 다른 하나는 LoxP-EGFP 유전자 벡터이다.The recombination system comprises two vectors, one is the GFAP promoter -CreER T2 gene vector and the other is the LoxP-EGFP gene vector.
상기 CreERT2 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 표시될 수 있으며, 상기 뉴클레오티드와 기능적으로 동일한 기능을 할 수 있는 변이체가 본 발명의 범위에 포함된다.The CreER T2 gene may be represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and variants capable of functionally equivalent to the nucleotide are included in the scope of the present invention.
상기 “기능적으로 동등한”이란 염기의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 염기서열에 의해 코딩된 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 코딩할 수 있는 염기서열을 의미한다. 예를 들어, 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, 상기 융합단백질을 코딩하는 핵산 분자와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants)를 포함하는 개념이다.As used herein, the term " functionally equivalent " means that at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 90%, even more preferably at least 70% Means a nucleotide sequence capable of encoding a protein having substantially the same physiological activity as a protein encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having a sequence homology of 95% or more. For example, although some base sequences have been modified by deletion, substitution, or insertion, they include variants that can function in a functionally equivalent manner to the nucleic acid molecule encoding the fusion protein .
상기 암유전자(oncogene)는 암세포를 만드는 유전물질, 즉 암을 유발시키는 능력을 가진 유전자를 의미하며, 발암유전자 또는 종양유전자라고도 한다. 상기 암유전자는 sis, EGFR, FGF 패밀리(bFGF, aFGF, int2/FGF3, hst1/K-fgf/FGF4, FGF5, hst2/FGF6, KGF, AIGF, erbB1, erbB2/neu(HER2, NGL), ros, met, trkA, trkB, trkC, ret, kit, PDGFRβ, flt1, flt3, flk1/kdr, flk2, FGFR패밀리(FGFR2/K-sam/bek, KGFR, FGFR1/N-sam/flg/Cek1/bF, FGF3/Cek3, FGFR4), abl, src패밀리(src, yes, fyn, fgr, lyn, lck, hck, blk, csk, fps, fes, mas, gsp, gip, ras패밀리(H-ras, K-ras, N-ras), mos, raf패밀리(raf, A-raf1, B-raf, rel, ski, sno), myc패밀리(myc, N-myc, L-myc, max), myb패밀리(myb, A-myb, B-myb), fos패밀리(fos, fosB, fra1, fra2), jun패밀리(jun, junB, junD, jif1), ets패밀리(ets1, ets2, erg, elk1, Spi1/PU.1, fli1, GABPa, elf1, SAP1), db1, ect2, bcl1, bcl2, bcl3, bcl6, bcr, pml, pbx1/prf, PIK3CA, all1/mll, aml1, dec, ews, tls/fus 및 tel 중에서 선택된 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 EGFR, H-ras, Myc, PIK3CA일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The oncogene refers to a genetic material for producing cancer cells, that is, a gene having an ability to induce cancer, and is also referred to as a carcinogenic gene or a tumor gene. The cancer gene may be selected from the group consisting of sis, EGFR, FGF family (bFGF, aFGF, int2 / FGF3, hst1 / K-fgf / FGF4, FGF5, hst2 / FGF6, KGF, AIGF, erbB1, erbB2 / neu (FGFR2 / K-sam / bek, KGFR, FGFR1 / N-sam / flg / Cek1 / bF, FGF3, trkA, trkB, trkC, ret kit, PDGFR ?, flt1, flt3, flk1 / kdr, flk2, FGFR family (H-ras, K-ras, fck, fck, blk, csk, fps, fs, mas, gsp, gip, ras family (src, yes, fyn, fgr, lyn, lck, (Myb, A-rac), mos, raf family (raf, A-raf1, B-raf, rel, ski, sno), myc family (eta, ets2, erg, elk1, Spi1 / PU.1, fli1, myb, B-myb), the fos family (fos, fosB, fra1, fra2), jun family (jun, junB, junD, jif1) May be at least one selected from among GABPa, elf1, SAP1), db1, ect2, bcl1, bcl2, bcl3, bcl6, bcr, pml, pbx1 / prf, PIK3CA, all1 / mll, aml1, dec, ews, tls / , Preferably EGFR, H-ras, Myc, PIK3CA, but is not limited thereto.
상기 재조합 벡터는 GFAP프로모터를 포함하며, 이는 성상세포 계열의 마커 유전자 중 하나인 GFAP(신경교섬유질산성단백질) 유전자의 프로모터 서열로부터 분리한 것이다.The recombinant vector comprises a GFAP promoter, which is isolated from the promoter sequence of GFAP (glial fibrous acid protein) gene, one of the marker genes of astrocytic lineage.
기존의 많은 연구들에서 확립하여 사용하던 2.2kb의 인간의 GFAP 프로모터 서열과 비교하여 돼지의 GFAP 프로모터 서열은 상당히 높은 비율로 보존된 서열을 가지고 있다. 기존 보고에 따르면 GFAP mRNA 전사 시작 기준 -1,400 bp에서 -1,600 bp의 서열이 중요한 기능을 하는 것으로 밝혀져 있는데, 이 부분의 유사성이 매우 높게 관찰이 되고 있다. 이는 인간의 GFAP 프로모터 서열을 돼지 모델에 적용하였을 경우, 비특이적인 발현을 유도할 가능성을 의미한다. 따라서, 미니돼지 모델에서의 미니돼지 본연의 GFAP 프로모터 서열의 적용은 보다 더 정교한 성상세포 특이적 재조합 시스템을 구현할 수 있을 것으로 기대된다.Compared to the 2.2 kb human GFAP promoter sequence established and used in many previous studies, the GFAP promoter sequence of the pig has a conserved sequence at a fairly high rate. According to previous reports, the sequence of -1,600 bp at -1,400 bp for GFAP mRNA transcription initiation has been found to play an important role, and the similarity of this part is very high. This implies the possibility of inducing nonspecific expression when a human GFAP promoter sequence is applied to a pig model. Therefore, it is expected that the application of the mini pig-native GFAP promoter sequence in the mini-pig model can realize a more precise stellate cell-specific recombination system.
본 발명의 일 실시예에서는 발현벡터 내에 돼지 GFAP 프로모터를 포함시킨 것을 사용하였으며, 상기 돼지 GFAP 프로모터는 서열번호 2로 표시될 수 있다.In one embodiment of the present invention, a porcine GFAP promoter containing a porcine GFAP promoter is used in the expression vector, and the porcine GFAP promoter may be represented by SEQ ID NO: 2.
또한, 본 발명의 재조합 벡터는 리포터 유전자를 더 포함할 수 있으며, 이는 CreERT2 매개 재조합을 통해 제거될 수 있는 LoxP가 리포터 유전자 옆에 위치한다. 상기 리포터 유전자는 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein; GFP) 유전자, 변이형녹색형광 단백질(enhanced green fluorescent protein; EGFP) 유전자, 적색형광(RFF) 유전자, 발광효소(luciferase) 유전자, 베타-칼락토시다제(beta-galactosidase; EBG) 유전자, 클로람페니콜 유전자, 아세틸트랜스퍼라제(chloramphenicol acetyltransferase; CAT) 유전자 또는 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 유전자 일 수 있으며, 바람직하게는 변이형녹색형광 단백질(enhanced green fluorescent protein; EGFP) 유전자일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In addition, the recombinant vector of the present invention may further comprise a reporter gene, which is located next to the reporter gene, LoxP which can be removed through CreER T2 mediated recombination. The reporter gene includes a green fluorescent protein (GFP) gene, an enhanced green fluorescent protein (EGFP) gene, a red fluorescence (RFF) gene, a luciferase gene, The gene may be a beta-galactosidase (EBG) gene, a chloramphenicol gene, a chloramphenicol acetyltransferase (CAT) gene or an alkaline phosphatase gene, preferably an enhanced green fluorescent protein ; EGFP) gene, but is not limited thereto.
본 명세서에 사용된, 용어 '벡터' 또는 '발현벡터'라 함은 구조유전자를 암호화하는 핵산이 삽입될 수 있고, 숙주 세포 내에서 상기 핵산을 발현할 수 있는 당분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 벡터 또는 기타 매개체를 의미한다. 바람직하게는 바이러스 벡터일 수 있다.As used herein, the term "vector" or "expression vector" refers to a plasmid, virus vector, or vector that can be inserted into a nucleic acid encoding a structural gene and capable of expressing the nucleic acid in a host cell Or other media. Preferably a viral vector.
상기 바이러스 벡터로는, 이에 제한되지는 않으나, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 허피스 바이러스 벡터, 아비폭스바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등이 있다. 특히, 렌티바이러스를 이용하는 방법이 바람직하다. 유전자 요법을 위한 렌티바이러스 벡터의 주요 장점은 다량의 유전자를 복제세포 내에 전달하고, 세포 DNA 내로 전달된 유전자를 정확하게 통합하며, 유전자 형질 감염 후 연속적인 감염이 유발되지 않는 것이다.Such viral vectors include, but are not limited to, retroviral vectors, adenovirus vectors, herpes virus vectors, avipoxvirus vectors, lentivirus vectors, and the like. Particularly, a method using lentivirus is preferable. The main advantage of lentiviral vectors for gene therapy is that they transfer large amounts of genes into the cloned cells, integrate the genes transferred into the cellular DNA precisely, and do not cause subsequent infection after gene transfection.
본 발명의 재조합 벡터는 선택 마커를 포함할 수 있으며, 상기 선택 마커에는 카나마이신 저항성 유전자, 네오마이신 저항성 유전자와 같은 항생제 저항성 유전자 및 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질과 같은 형광 단백질 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.The recombinant vector of the present invention may include a selection marker, and the selection marker includes an antibiotic resistance gene such as a kanamycin resistance gene and a neomycin resistance gene, a fluorescent protein such as a green fluorescent protein and a red fluorescent protein, It does not.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터가 도입된, 뇌종양 동물모델 제작용 형질전환 세포를 제공한다.The present invention also provides a transformed cell for producing a brain tumor animal model into which the recombinant vector is introduced.
본 명세서에 사용된, 용어 '뇌종양(brain tumor)'은 악성이거나 양성이든지 관계없이 모든 신생 세포 성장 및 증식을 나타내는 모든 전암(pre-cancerous) 세포 및 암 세포를 칭한다.As used herein, the term " brain tumor " refers to all pre-cancerous and cancer cells that exhibit all neoplastic cell growth and proliferation whether malignant or benign.
재조합 벡터는 당업계에 공지된 방법으로 세포 내에 도입할 수 있다.The recombinant vector can be introduced into cells by a method known in the art.
예를 들어, 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAEDextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electroporation), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 형질전환 동물 제작을 위한 세포 내로 도입할 수 있다.For example, but not by way of limitation, transient transfection, microinjection, transduction, cell fusion, calcium phosphate precipitation, liposome-mediated transfection, DEAE dextran The present invention relates to a method for introducing a nucleic acid into a cell, such as, for example, DEAEDextran-mediated transfection, polybrene-mediated transfection, electroporation, gene gun, Into a cell for the production of a transgenic animal.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 돼지 유래 체세포의 핵을, 탈핵된 난자에 이식하여 형성된 돼지의 핵 이식란을 제공한다.In addition, the present invention provides a porcine nuclear transfer embryo formed by transplanting the nucleus of a porcine-derived somatic cell transformed with the recombinant vector into an enucleated oocyte.
본 명세서에 사용된, 용어 '핵 이식'은 탈핵된 난자에 다른 세포 또는 핵을 인공적으로 결합시켜 동일한 형질을 갖도록 하는 유전자 조작기술을 말한다. '핵 이식란'은 핵 공여 세포가 도입 또는 융합된 난자를 말한다.As used herein, the term " nuclear transfer " refers to a genetic engineering technique that allows an enucleated oocyte to artificially bind other cells or nuclei to the same trait. 'Nuclear transfer embryos' refers to oocytes into which nuclear donor cells are introduced or fused.
본 명세서에 사용된, 용어 '복제'는 한 개체와 동일한 유전자 세트를 가진 새로운 개체를 만드는 유전자 조작기술로서 특히 본 발명에서는 돼지의 체세포, 배아 세포, 태아 유래 세포 및/또는 성체 유래 세포가 다른 세포의 핵 DNA 서열과 실질적으로 동일한 핵 DNA 서열을 갖는 것을 말한다. 본 발명은 핵 이식 기술을 이용하여 돼지을 복제하는 기술을 이용한다. 특히, 체세포 핵 이식 기술은 생식과정에서 일반적으로 이루어지는 감수분열 및 반수 염색체 보유 생식세포를 경유하지 않고도 자손을 탄생시킬 수 있는 기술로서 성체가 가진 배수체 보유 체세포를 핵이 제거된 난자에 이식하여 수정란을 생산하고 상기 수정란을 생체 내로 이식하여 새로운 개체를 발생시키는 방법이다.As used herein, the term " cloning " is a genetic engineering technique for creating new individuals with the same set of genes as an individual. In particular, in the present invention, somatic cells, embryonic cells, fetal cells and / Quot; nucleotide sequence " of the " nucleotide " The present invention utilizes a technique of replicating pigs using nuclear transfer technology. In particular, somatic cell nuclear transfer technology is a technology that can produce offspring without passing through the meiosis and hemispheric retention cells that are common in the reproductive process. As a technology, transplanted somatic cells are transplanted into the nucleus- And the embryo is transplanted in vivo to generate a new individual.
본 명세서에 사용된, 용어 '핵 공여 세포'는 핵 수용체인 수핵 난자로 핵을 전달하는 세포 또는 세포의 핵을 말한다. '난자'는 바람직하게는 제2차 감수분열 중기까지 도달한 성숙난자를 말한다. 본 발명에서 상기 핵 공여 세포로는 돼지의 체세포 또는 줄기세포를 사용할 수 있다.As used herein, the term " nuclear donor cell " refers to the nucleus of a cell or cell that delivers nuclei to a nuclear receptor, a recipient oocyte. The term " oocyte " preferably refers to a mature oocyte that has reached the middle stage of the second meiosis. In the present invention, porcine somatic cells or stem cells can be used as the nuclear donor cells.
본 명세서에 사용된, 용어 '체세포(somatic cell)'란, 다세포 생물을 구성하는 세포 중 생식 세포 이외의 세포이며, 어떤 목적으로 특화하여 그 이외의 세포는 되지 않는 분화된 세포와, 몇 종류인가의 다른 기능을 갖는 세포로 분화되는 능력을 갖는 세포를 포함한다.As used herein, the term " somatic cell " refers to a cell other than a germ cell among cells constituting a multicellular organism, Lt; RTI ID = 0.0 > cell < / RTI > having different functions.
본 발명에서 사용될 수 있는 체세포로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 난구세포, 상피세포, 섬유아세포, 신경세포, 각질세포, 조혈세포, 멜라닌 세포, 연골세포, 마크로파지, 단구세포, 근육세포, B 림프구, T 림프구, 배아 줄기세포, 배아 생식세포, 태아 유래 세포, 태좌세포 및 배아세포 등이 있다. 보다 바람직하게는, 태아 유래 세포 및 성체 섬유아세포, 난구세포일 수 있다. 가장 바람직하게는, 돼지의 태아 및 성체에서 분리한 섬유아세포를 이용한다. 이 세포의 특징은 초기 분리시 다수의 세포를 얻을 수 있고, 세포 배양도 비교적 쉬우며 체외에서 배양 및 조작이 용이하다는 장점을 지니고 있다.The somatic cells that can be used in the present invention include, but are not limited to, cumulus cells, epithelial cells, fibroblasts, neurons, keratinocytes, hematopoietic cells, melanocytes, cartilage cells, macrophages, monocytes, B lymphocytes, T lymphocytes, embryonic stem cells, embryonic germ cells, fetal derived cells, embryonic cells and embryonic cells. More preferably, it may be a fetal-derived cell, an adult fibroblast, or a cumulus cell. Most preferably, fibroblasts isolated from fetal and adult pigs are used. The characteristics of these cells are that they can obtain a large number of cells at the initial separation, have relatively easy cell culture, and are easy to cultivate and manipulate in vitro.
핵 공여 세포로서 제공되는 상기 체세포는 외과용 표본 또는 생체검사용 표본을 제조하는 방법으로부터 수득될 수 있다.The somatic cells provided as nuclear donor cells can be obtained from a method for producing a surgical specimen or a specimen for biopsy.
또한, 본 발명은 상기 조합 벡터에 의해 형질전환된, CreERT2 및 암유전자를 과발현하는 것을 특징으로 하는 뇌종양 동물모델을 제공한다.The present invention also provides a brain tumor animal model characterized by overexpressing CreER T2 and an cancer gene transformed by said combination vector.
상기 형질전환은 체세포 핵이식 기술(somatic cell nuclear transfer, SCNT)에 의해 이루어질 수 있으며, 재조합 벡터의 발현은 뇌 조직에서 발생할 수 있으며, 바람직하게는 대뇌에서 발생할 수 있다. 이때, 상기 재조합 벡터의 발현은 타목시펜 처리에 의해 유도될 수 있다.The transfection may be carried out by somatic cell nuclear transfer (SCNT), and expression of the recombinant vector may occur in the brain tissue, preferably in the cerebrum. At this time, the expression of the recombinant vector can be induced by treatment with tamoxifen.
상기 뇌종양 동물모델은 재조합 벡터가 도입된 핵 공여세포의 핵을 탈핵된 난자에 이식하여 산자를 생산하는 방식으로 이루어질 수 있다.The brain tumor animal model can be obtained by transplanting the nucleus of the nuclear donor cell into which the recombinant vector has been introduced into the enucleated oocyte to produce a live egg.
본 명세서에 사용된, 용어 '동물모델'이란 사람의 질병과 아주 유사한 형태의 질병을 가진 동물을 말한다. 사람의 질병 연구에 있어 질환모델 동물이 의미를 갖는 것은 사람과 동물들 간의 생리적 또는 유전적인 유사성에 의한다. 질병 연구에 있어 생체의학 질환모델 동물은 질병의 다양한 원인과 발병과정 및 진단에 대한 연구용 재료를 제공해주고, 질환모델 동물의 연구를 통해 질병에 관련된 유전자들을 알아내고, 유전자들 간의 상호작용을 이해할 수 있게 하고, 개발된 신약후보물질의 실제 효능 및 독성 검사를 통해 실용화 가능성의 여부를 판단하는 기초 자료를 얻을 수 있다.As used herein, the term " animal model " refers to an animal having a disease in a form very similar to that of a human. Diseases in the study of human disease The significance of model animals is due to their physiological or genetic similarities between humans and animals. Biomedical disease models in disease studies Animals provide research materials for various causes of diseases, pathogenesis and diagnosis, and research on disease-related animals to identify disease-related genes and understand the interactions between genes And the basic efficacy and toxicity test of the developed new drug candidates will provide basic data for judging the possibility of practical use.
"동물" 또는 "실험동물"은 인간 이외의 임의의 포유류 동물을 의미한다. 상기 동물은 배아, 태아, 신생아 및 성인을 포함하는 모든 연령의 동물을 포함한다. 본 발명에서 사용하기 위한 동물들은, 예를 들어, 상업용 소스로부터 이용할 수 있다. 이런 동물들은 실험용 동물 또는 다른 동물, 토끼, 설치류(예를 들어, 생쥐, 쥐, 햄스터, 게르빌루스 및 기니피그), 소,양, 돼지, 염소, 말, 개, 고양이, 새(예를 들어, 닭, 칠면조, 오리, 거위), 영장류(예를 들어, 침팬지, 원숭이, 붉은털원숭이)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 가장 바람직한 동물은 돼지이다."Animal" or "laboratory animal" means any mammal other than a human. The animal includes animals of all ages, including embryos, fetuses, neonates and adults. Animals for use in the present invention can be used, for example, from commercial sources. Such animals include, but are not limited to, laboratory animals or other animals, rabbits, rodents (such as mice, rats, hamsters, gerbils and guinea pigs), cows, sheep, pigs, goats, horses, (Eg, chickens, turkeys, ducks, geese), primates (eg, chimpanzees, monkeys, rhesus monkeys). The most preferred animal is a pig.
돼지는 해부 생리학적으로 인간과 유사성이 인정되어 이미 각종 질환의 병리학적 기전과 치료를 위한 연구에 이용되고 있으며, 특히 오랫동안 경제 동물로 가치가 인정되어 다른 중/대 동물을 질환모델로 사용할 때보다 윤리적인 문제점을 피해갈 수 있으며, 안정적인 사육 시스템이 구축되어 있어 실험동물 모델 개발시 유지 및 관리가 용이한 장점이 있다.Pigs have been recognized for similarity with human anatomy physiologically and have already been used for the pathological mechanism and treatment of various diseases. Especially, when pigs are valued as economic animals for a long time, It can avoid ethical problems and has a stable breeding system, so it is easy to maintain and manage when developing animal models.
본 명세서에 사용된, 용어 '배양'은 생물체나 생물체의 일부(기관 ·조직 ·세포 등)를 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 일로써, 이 경우 외적 조건으로 온도 ·습도 ·빛 ·기체상의 조성(이산화탄소나 산소의 분압) 등이 중요하며, 그 밖에 배양되는 생물체에 가장 중요한 직접적인 영향을 주는 것은 배지(배양기)로, 그 생물체의 직접적인 환경인 동시에 생존이나 증식에 필요한 각종 영양소의 공급장이다.As used herein, the term "cultivation" refers to cultivating an organism or a part of an organism (organ, tissue, cell, etc.) under an appropriately artificially controlled environmental condition. In this case, the temperature, humidity, light, (Carbon dioxide and oxygen partial pressure), and other important factors directly affect the organism to be cultivated is the medium (incubator), which is a direct environment for the organism and at the same time a supply point for various nutrients to be.
본 명세서에 사용된, 용어 '체외배양'이란 세포 등이 체내에서 자라는 상태와 구분되는 방법으로 실험실의 인큐베이터(incubator)에서 체내의 환경과 유사한 조건으로 배양하는 일련의 실험실 과정을 의미하는 것이다.As used herein, the term " in vitro culture " refers to a series of laboratory procedures in which cells are cultured in an incubator in a laboratory in a manner similar to the environment in the body, in a manner distinct from the growth of cells.
본 명세서에 사용된, 용어 '배지' 또는 '배지 조성물'은 당, 아미노산, 각종 영양물질, 혈청, 성장인자, 무기질 등의 세포의 성장 및 증식 등에 필수적인 요소를 포함하는 생체 외에서 세포 등의 성장 및 증식을 위한 혼합물을 말한다.As used herein, the term "medium" or "medium composition" refers to a medium which is capable of growing and growing cells in vitro, including essential elements for growth and proliferation of cells such as sugars, amino acids, various nutrients, serum, Refers to a mixture for growth.
본 명세서에 사용된, 용어 '분화(differentiation)'라는 용어는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다. 반적으로 비교적 단순한 계(系)가 둘 이상의 질적으로 다른 부분계(部分系)로 분리되는 현상이다.As used herein, the term " differentiation " refers to a phenomenon in which the structure or function of one another is specialized during the growth of cells through proliferation and proliferation, that is, I mean that function changes. In contrast, relatively simple systems are separated into two or more qualitatively different sub systems.
본 명세서에 사용된, 용어 '융합'은 핵 공여 세포와 수핵 난자의 지질막 부분의 결합을 의미한다. 예를 들어, 지질막은 세포의 플라스마막 또는 핵막이 될 수 있다. 융합은 핵 공여 세포와 수핵 난자가 서로 인접하게 위치해 있는 경우 또는 핵 공여세포가 수핵 난자의 주란강(perivitelline space) 내에 위치해 있는 경우에 전기적 자극을 가함으로써 일어날 수 있다.As used herein, the term " fusion " refers to the association of the nuclear donor cell with the lipid membrane portion of the recipient oocyte. For example, a lipid membrane can be a plasma membrane or a nuclear membrane of a cell. Fusion can occur by applying electrical stimulation when the nuclear donor cell and the recipient oocyte are adjacent to each other or when the nuclear donor cell is located in the perivitelline space of the recipient oocyte.
본 명세서에 사용된, 용어 '산자(living offspring)'는 자궁 밖에서 생존할 수 있는 동물을 말한다. 바람직하게는, 1초, 1분, 한 시간, 하루, 한 주, 한달, 6달 또는 일년 이상 생존할 수 있는 동물을 말한다. 상기 동물은 생존을 위해 자궁 내 환경을 필요로 하지 않는다.As used herein, the term " living offspring " refers to an animal that can survive outside the uterus. Preferably, it refers to an animal that can survive for 1 second, 1 minute, 1 hour, 1 day, 1 week, 1 month, 6 months, or 1 year. The animal does not require an intrauterine environment for survival.
본 발명에 따른 CreERT2유전자 및 암유전자를 포함하는 재조합 유전자는 성상세포 특이적으로 대뇌에서 높게 발현되며 다른 기관에서는 재조합 유전자가 발현되지 않으므로 이를 이용하여 형질전환을 통해 뇌종양 동물모델을 제조할 수 있으며, 제조된 동물모델은 질병 기전의 규명, 치료물질의 탐색, 진단법의 개발 등에 다양하게 활용될 수 있으므로 뇌종양 예방 및 치료제 개발에 유용하게 이용될 수 있다.The recombinant gene comprising the CreER T2 gene and the cancer gene according to the present invention is highly expressed in the cerebral cells and highly expressed in the cerebral cells and the recombinant gene is not expressed in other organs, , The manufactured animal model can be used for various purposes such as identification of disease mechanism, search for therapeutic substance, development of diagnostic method, and thus, it can be usefully used for development of brain tumor prevention and treatment agent.
또한, 본 발명은 1) 뇌종양 동물모델에 뇌종양 예방 또는 치료제 후보물질을 투여하는 단계; 및 2) 후보물질 투여 후, 상기 동물모델의 뇌조직을 후보물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 암유전자 발현이 억제되는 경우 뇌종양 예방 또는 치료제로 판단하는 단계;를 포함하는 뇌종양 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.Also, the present invention provides a method for treating a brain tumor, comprising the steps of: 1) administering a tumor tumor prophylactic or therapeutic agent candidate substance to a brain tumor animal model; And 2) judging the brain tissue of the animal model as a brain tumor prevention or treatment agent when the cancer gene expression is suppressed as compared with a control group in which the candidate agent is not administered after administration of the candidate substance, and screening for a brain tumor prevention or treatment agent ≪ / RTI >
본 발명에서 사용되는 용어, "후보물질"이란 뇌종양 예방 및 치료제로서 테스트할 물질을 의미하며, 예컨대 추출물, 단백질, 올리고펩티드, 소형 유기 분자, 다당류, 폴리뉴클레오티드 및 광범위한 화합물 등의 임의 분자를 포함할 수 있다. 이러한 후보물질은 또한 천연물질뿐 아니라, 합성물질도 포함한다.The term "candidate substance " used in the present invention means a substance to be tested as a brain tumor prevention and treatment agent, and includes any molecule such as an extract, protein, oligopeptide, small organic molecule, polysaccharide, polynucleotide, . Such candidate materials also include synthetic materials as well as natural materials.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"은 상기 동물모델의 뇌조직을 후보물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 후보물질의 투여로 뇌종양을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는, 상기 후보물질의 투여로 상기 동물모델의 뇌종양 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.As used herein, the term "prevention" means any action that inhibits or delays brain tumors by administration of a candidate agent compared to a control without administration of the candidate agent, The administration of the candidate substance means any action that improves or alters the brain tumor symptom of the animal model.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the following examples. However, the following examples are intended to illustrate the contents of the present invention, but the scope of the present invention is not limited to the following examples. Embodiments of the present invention are provided to more fully describe the present invention to those skilled in the art.
실시예Example 1. One. 성상세포Astrocytes -특이적인 - specific pGFAPpGFAP -- CreERCreer T2T2 ; ; EGFPEGFP LoxPLoxP 재조합 시스템을 갖는 공여 TG 돼지 섬유아세포의 제조 Preparation of Donor TG Pig Fibroblast with Recombination System
1-1. 1-1. 렌티Lent 바이러스 생산 Virus production
렌티바이러스를 생산하기 위해, 293FT 세포를 100mm 플레이트의 10 % 소 태아 혈청 (Serena) 및 2 mM L- 글루타민 (Lonza, Basel, Switzerland)을 포함하는 완전 DMEM 배지에 플레이팅 하고, 12시간 동안 부착하도록 하였다. 형질전환은 무혈청 DMEM 배지(Invitrogen) 내에 4 μg 트랜스퍼 벡터 플라스미드, 6 μg 3세대 생산 패키징 플라스미드 및 24 μl 폴리익스프레스 에이전트(Excellgene Inc. Rockville, USA)를 첨가한 상태에서 제조업체의 지침에 따라 수행하였다. 형질전환 6시간 후에, 상기 세포를 인산 완충 식염수(PBS)로 세척하고, L-글루타민 및 10% FBS가 포함된 신선한 완전 DMEM배지에 첨가하고, 42시간 동안 배양하였다. 그 후 렌티바이러스를 함유하고 있는 배지를 형질전환 48시간 후 수거하고, 0.45 마이크론 주사기를 통해 여과하였다. 각 렌티바이러스는 제조업체의 지침에 따라 Lenti-X Concentrator (Clontech Laboratories, Inc.)를 사용하여 농축하였다.To produce lentivirus, 293 FT cells were plated in complete DMEM medium containing 100 mm plates of 10% fetal bovine serum (Serena) and 2 mM L-glutamine (Lonza, Basel, Switzerland) and allowed to attach for 12 hours Respectively. Transfection was performed according to the manufacturer's instructions with 4 μg transfer vector plasmid, 6 μg third generation packaging plasmid and 24 μl polyexpress agent (Excellgene Inc. Rockville, USA) in serum-free DMEM medium (Invitrogen) . After 6 hours of transformation, the cells were washed with phosphate buffered saline (PBS) and added to fresh complete DMEM medium containing L-glutamine and 10% FBS and incubated for 42 hours. The medium containing the lentivirus was then collected after 48 hours of transformation and filtered through a 0.45 micron syringe. Each lentivirus was enriched using a Lenti-X Concentrator (Clontech Laboratories, Inc.) according to the manufacturer's instructions.
1-2. 재조합 벡터의 제조1-2. Preparation of recombinant vector
돼지 GFAP 프로모터 서열을 이용한 성상세포 특이적인 GFAP-CreERT2; EGFP LoxP 재조합 시스템을 고안하였으며, 본 발명에 사용된 벡터를 도 1에 개략적으로 나타내었다.Stromal cell-specific GFAP-CreER T2 using a porcine GFAP promoter sequence; An EGFP LoxP recombination system was devised and the vector used in the present invention is schematically shown in Fig.
도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 시스템은 돼지 GFAP 프로모터에 의해 제어되는 CreERT2 형질전환 유전자의 렌티바이러스 벡터 및 두 개의 LoxP 부위에 의해 연접되어 있는 발현 EGFP 형질전환 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터 컨스트럭트로 구성된 두 개의 벡터를 포함하며, 상기 두 벡터는 핵 공여 섬유아세포주에 도입되었다. 이때 돼지 GFAP 프로모터는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프로모터를 사용하였다.As shown in Figure 1, the system consists of a plasmid vector construct comprising a lentiviral vector of the CreER T2 transgene controlled by the porcine GFAP promoter and an expression EGFP transgene con- nected by two LoxP sites The two vectors were introduced into nuclear donor fibroblast cells. At this time, as the porcine GFAP promoter, the promoter represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 was used.
먼저, 돼지-GFAP-CreERT2 유전자 컨스트럭트를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 제조하기 위해, pCDH-CMV-MCS-EF1-puro 렌티바이러스 벡터의 CMV 프로모터를 두 제한 효소, SnaBI 및 NheI와, pGL3-기본-돼지 GFAP 프로모터 플라스미드로부터 EcoRI (Blunted by Klenow fragment) 및 NheI로 절단된 돼지 GFAP 프로모터 서열(GFAP 전사 시작 부위로부터 -1,817에서 17 업스트림까지)을 제거하고, 벡터 내로 리게이션시켰다. 그 후, pCre-ERT2 플라스미드로부터 EcoRI에 의해 절단된 CreERT2 유전자를 pCDH-pGFAP-MCS-EF1-puro의 동일한 제한 효소 부위에 삽입하였다.First, the pigs -GFAP-CreER T2 gene construct in order to produce a lentiviral vector containing the root trucks, pCDH-CMV-MCS-EF1 -puro lentiviral vector of the CMV promoter, the two restriction enzymes, SnaBI and NheI and, pGL3- Pig GFAP promoter sequences (from -1,817 to 17 upstream from the GFAP transcription start site) truncated from EcoRI (Blunted by Klenow fragment) and NheI from the base-porcine GFAP promoter plasmid were removed and ligated into the vector. The CreER T2 gene cleaved by EcoRI from the pCre-ER T2 plasmid was then inserted into the same restriction enzyme site of pCDH-pGFAP-MCS-EF1-puro.
CMV-LoxP-EGFP-pA-LoxP 컨스트럭트를 제조하기 위해, LCMV:ECFP(LoxP)MCS (#31377, Addgene)를 변형하였다. Nco1 및 BsrG1에 의해 제거된 ECFP 서열과, 동일한 제한효소에 의해 절단된 EGFP-C2 (#6083-1, CLONTECH Laboratories, Inc.)을 삽입하였다.To prepare the CMV-LoxP-EGFP-pA-LoxP construct, LCMV: ECFP (LoxP) MCS (# 31377, Addgene) was modified. EGFP-C2 (# 6083-1, CLONTECH Laboratories, Inc.) digested with the same restriction enzyme was inserted into the ECFP sequence removed by Nco1 and BsrG1.
1-3. 1-3. 공여세포주Donor cell line 확립 Establish
먼저, Yucatane 미니어쳐 돼지 섬유아세포를 제조업체의 지침에 따라, electroporation tool(Neon® Transfection System, Invitrogen)를 사용하여 LCMV-EGFP(LoxP)-ESD를 형질전환시킨다. 3~4주 후에, EGFP 양성세포를 FACS Aria II (BD biosciences, San Jose, USA)를 사용하여 분리하였다.First, Yucatane miniature swine fibroblasts are transformed with LCMV-EGFP (LoxP) -ESD using an electroporation tool (Neon Transfection System, Invitrogen) according to the manufacturer's instructions. After 3 to 4 weeks, EGFP-positive cells were isolated using FACS Aria II (BD biosciences, San Jose, USA).
돼지 GFAP-CreERT2 컨스트럭트를 도입하기 위해, EGFP 양성세포를 pCDH-pGFAP-CreERT2-EF1-puro의 농축된 렌티바이러스 세포로 감염시켰다. 감염 3일 후, 감염된 세포를 완전 배지에 배양하고, 5일 동안 퓨로마이신(2.0 ug/ml)을 첨가하였다.To introduce the porcine GFAP-CreER T2 construct, EGFP-positive cells were infected with enriched lentiviral cells of pCDH-pGFAP-CreER T2 -EF1-puro. Three days after infection, infected cells were cultured in complete medium and puromycin (2.0 ug / ml) was added for 5 days.
공여 세포 확립이 제대로 이루어졌는지 확인하기 위해, 형광활성 세포 분류 (Fluorescence activated cell sorter, FACS)법을 이용하여 형질전환된 LCMV-EGFP(LoxP) 플라스미드 벡터를 분류하였으며, 그 결과를 도 2a에 나타내었다. 또한, EGFP의 발현을 형광현미경을 이용하여 관찰하였으며, 그 결과를 도 2b에 나타내었다.In order to confirm whether the donor cell was properly established, the transformed LCMV-EGFP (LoxP) plasmid vector was classified using the fluorescence activated cell sorter (FACS) method, and the result is shown in FIG. 2A . In addition, the expression of EGFP was observed using a fluorescence microscope, and the results are shown in FIG. 2B.
그 후, 항생제 선택 후 수득한 세 개의 세포 콜로니를 최종 공여 세포로 확정하였다. PCR을 이용하여 게놈 내로 각 형질전환 유전자의 도입여부를 확인하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.Thereafter, three cell colonies obtained after antibiotic selection were determined as the final donor cells. PCR was used to confirm the introduction of each transgene into the genome. The results are shown in FIG.
도 3에 나타낸 바와 같이 CreERT2 및 EGFP가 나타남으로써, 공여 세포에 재조합 유전자가 도입되었음을 확인하였다.As shown in Fig. 3, CreER T2 and EGFP appeared, confirming that a recombinant gene was introduced into donor cells.
실시예Example 2. 2. GFAPGFAP -- CreER ; EGFPCreER; EGFP LoxPLoxP 세포를 이용한 TG TG using cells 복제 돼지의Replica of pig 생산 production
2-1. 1차 배양2-1. Primary culture
사산된 돼지로부터 분리한 귀조직을 dPBS+(dPBS with 1x anti-anti)로 세척한 후, 에탄올로 소독하고, dPBS+로 세척하였다. 소독된 귀 조직으로부터 피부조직을 분리하고, 면도칼로 상기 조직을 잘게 잘랐다. 잘린 피부 조직을 3시간 동안 트립신과 함께 배양한 후 트립신 중화를 위해 세포 배양 배지(2x anti-anti + 10% FBS + DMEM)에 첨가하였다. 트립신이 처리된 조직을 100 mm 배양 접시에서 배양하였으며, 부착성 세포를 계대배양하였다. 최초 배양은 humid incubator (Astec, Fukuoka, Japan)를 사용하여 39℃의 5% CO2 조건하에서 수행하였다.Ear tissues separated from dead pigs were washed with dPBS + (dPBS with 1x anti-anti), then sterilized with ethanol and washed with dPBS +. The skin tissue was detached from the sterilized ear tissue and the tissue was chopped with a razor blade. Clipped skin tissue was incubated with trypsin for 3 hours and then added to cell culture medium (2x anti-anti + 10% FBS + DMEM) for trypsin neutralization. The tissue treated with trypsin was cultured in a 100 mm culture dish and adherent cells were subcultured. The initial culture was carried out in a humid incubator (Astec, Fukuoka, Japan) under 5% CO 2 at 39 ° C.
2-2. 난자수집 및 체외성숙(in vitro maturation, 2-2. Oocyte collection and in vitro maturation, IVMIVM ))
돼지 난소를 도축장에서 수집한 후, 돼지난포액(pFF) 및 난구-난자 복합체 (COCs)를 3-6mm의 난소여포에서 흡입을 통해 수득하였다. IVM동안 사용된 배지는 TCM199(Gibco, Life Technologies, Melbourne, Australia), 0.6 mM 시스테인, 0.91 mM 피루브산 소듐, 10 ng/ml 상피세포 성장인자, 75 g/ml 카나마이신, 1 g/ml 인슐린, 10% (v/v) 및 Pff로 조성하였다. 돼지 COCs는 4-웰 접시(Nunc, Roskilde, Denmark)의 500 ml IVM 배지에서 웰 당 50-60 세포를 동시배양하였다. IVM 은 humid incubator (Astec, Fukuoka, Japan)를 사용하여, 39℃ 하에서 5% CO2 의 조건에서 수행하였다. 성숙은 10 IU/ml 말 융모 성선자극 호르몬(eCG) 및 10 IU/ml 인간 CG를 포함한 IVM 배지에서 22시간 동안 수행하였다. 그 후, 상기 세포를 호르몬-프리 IVM 배지에 옮기고, 18시간 동안 배양하였다. 그 후 성숙된 COCs를 0.1% 히알루로니다제 및 TLH-PVS 배지에서 부드러운 피펫을 사용하여 벗겨냈다. 벗겨낸 난자를 상기 공정을 통해 수득하였으며, 이후 실험과정에서 사용하였다.Porcine ovaries were harvested from slaughterhouses and then porcine follicular fluid (pFF) and cumulus-ovum complexes (COCs) were obtained by inhalation in 3-6 mm ovarian follicles. The medium used during IVM was TCM 199 (Gibco, Life Technologies, Melbourne, Australia), 0.6 mM cysteine, 0.91 mM sodium pyruvate, 10 ng / ml epithelial cell growth factor, 75 g / ml kanamycin, 1 g / ml insulin, 10% (v / v) and Pff. Porcine COCs were co-cultured in 50-60 cells per well in 500 ml IVM medium in 4-well plates (Nunc, Roskilde, Denmark). IVM was performed at 39 ° C and 5% CO 2 using a humid incubator (Astec, Fukuoka, Japan). Maturation was carried out for 22 hours in IVM medium containing 10 IU / ml horse chorionic gonadotropin (eCG) and 10 IU / ml human CG. The cells were then transferred to hormone-free IVM medium and incubated for 18 hours. The mature COCs were then stripped off using a soft pipette in 0.1% hyaluronidase and TLH-PVS medium. Peeled oocytes were obtained through the above process and were then used in the experimental procedure.
2-3. 체세포 2-3. Somatic cell 핵이식Nuclear transfer (( SCNTSCNT ) 및 체외배양 () And in vitro culture IVCIVC ))
TG 공여 세포주의 정상 상태를 평가하기 위해 체세포 핵이식((somatic cell nuclear transfer, SCNT)을 수행하였다. Cloud male #5 (정상 세포주), Cloud #5 pGFAP-CreERT2; EGFPLoxP (벡터 삽입 세포주) 및 재클론-TG 세포주를 공여세포로 사용하였다. (Normal cell line),
구체적으로, IVM 40시간 후에, 탈핵과정을 위해 중기 II의 무결함 난자를 선택하였다. 중기 II 단계 난자를 5 μg/mL 사이토칼라신 B (CB)를 첨가한 칼슘프리 TLH 함유 0.2% 소혈청 알부민 (TLH-BSA)로 세번 세척하고, 16 mm 글래스 피펫을 갖는 현미조작장치(Humagen, Charlottesville, VA, U.S.A.)를 사용하여 탈핵과정을 수행하였다. 탈핵 후, 트립신 처리된 태아 섬유아세포가 탈핵 난자의 위란강 내부로 옮겨졌다. 그 후, 세포융합 생성기(LF201; Nepa Gene, Chiba, Japan)를 사용하여 0.1 mM CaCl2 및 0.05 mM MgCl2 를 포함하는 260 mM 만니톨 용액 내에서 60 μs동안 180 V/mm DC의 두 펄스로 융합하였다. 전기적 융합 후에, SNCT 배아를 6-디메틸 아미노퓨린(6-dimethyl aminopurine, 6DMAP)에서4시간 동안 5 μg/mL CB 가 첨가된 돼지접합 배지(PZM) 30μl와 함께 배양하였다. 그 후, 배아를 IVC를 위해 PZM 드롭으로 옮겼다. 융합 후 이틀째, 배아 분열을 평가하고(1 셀, 2 셀, 4 셀, 8 셀, 조각), 융합 후 7일에, 배반포 형성을 정량적으로(초기 배반포, 확장 배반포, 부화 배반포) 평가한 결과를 도 4a 내지 4b에 나타내었으며, 이를 정리한 결과를 도 4c에 나타내었다.Specifically, after 40 hours of IVM, medium defect II oocytes were selected for the enucleation process. Middle-stage II-stage oocytes were washed three times with 0.2% bovine serum albumin (TLH-BSA) containing calcium-free TLH supplemented with 5 μg / ml cytochalasin B (CB) and washed three times with a brown rice manipulator (Humagen, Charlottesville, Va., USA) was used for enucleation. After enucleation, fetal fibroblasts treated with trypsin were transferred into the inner nuclear layer of the enucleated oocytes. Then, using two pulses of 180 V / mm DC for 60 μs in a 260 mM mannitol solution containing 0.1 mM CaCl 2 and 0.05 mM MgCl 2 using a cell fusion generator (LF201; Nepa Gene, Chiba, Japan) Respectively. After electrical fusion, SNCT embryos were incubated with 6 μl of 6-dimethylaminopurine (6 DMAP) for 30 min with 30 μl of porcine ligation medium (PZM) supplemented with 5 μg / ml CB for 4 h. The embryo was then transferred to the PZM drop for IVC. On the second day after fusion, embryo cleavage was evaluated (1 cell, 2 cell, 4 cell, 8 cell, piece) and quantification of blastocyst formation (initial blastocyst, expanded blastocyst and hatching blastocyst) 4A to 4B, and the results are summarized in FIG. 4C.
도 4c에 나타낸 바와 같이, Cloud male #5 (정상 세포주), Cloud #5 pGFAP-CreERT2; EGFPLoxP (벡터 삽입 세포주) 및 재클론-TG 세포주의 융합률(71.8 ± 6.1, 74.2 ± 2.6 및 76.7 ± 2.9) 및 절단률(73.8 ± 4.0, 63.6 ± 2.2 및 62.6 ± 13.7)은 큰 차이가 없었다. 배반포 형성률은 정상 세포주(Cloud male #5) 군과 벡터 삽입 세포주(Cloud #5 pGFAP-CreERT2; EGFPLoxP) 군(19.5±1.2, 21.0±1.6)에서 큰 차이가 없었으나, 재클론-TG 세포주 군에서는 벡터 삽입 세포주 군 대비 상당히 높은 배반포 형성률을 확인하였다(21.0±1.6, 39.2±5.0).As shown in Figure 4c, Cloud male # 5 (normal cell line),
이는 공여 세포 내 외부 유전자로 인한 SCNT 배아 발달에 영향이 없으며, 재클론 세포주의 확립하고 재클론 세포주를 SCNT 공여세포에 사용함으로써 TG 배아 생산 및 TG 돼지 생산 효율이 증대될 수 있음을 나타낸다.This indicates that SCNT embryo development due to foreign genes in the donor cell is not affected, and that the clone cell line is established and that the recombinant cell line can be used in SCNT donor cells to increase TG embryo production and TG production efficiency.
2-4. 배아 이식2-4. Embryo implantation
비 과배란된, 자연 순환 Landrace x Duroc의 어린 잡종 암퇘지를 대리모로 사용하였다. 먼저, 마취를 위해 케타민(유한양행 50mg/ml) 1ml 및 Xylezine (100mg/ml) 3ml를 상기 돼지의 귀 정맥에 주사하였다. 그 후, 이소플루란(액상)을 사용하여 호흡 마취상태를 유지하였다. 모든 수술 기구는 수술을 위해 소독하였다. 복부 개복술은 생식기관의 노출을 위해 수행하였다. 4시간 후, SCNT 배아가 팽대부 협부 접합에서 수란관으로 옮겨졌다. 30일 후 임신이 초음파에 의해 진단되었다.Non-overfed, natural circulation Landrace x Duroc's young hybrid sows were used as surrogate mothers. First, 1 ml of ketamine (
배아 이식은 대리모의 배란 상태 직전에 세 번 실시하였다. 그 중 하나는 임신되었고, 임신 후 115일 후 5마리의 TG 새끼돼지를 출산하였으며, 이를 도 5에 나타내었다.Embryo transfer was performed three times immediately before the ovulation state of the surrogate mother. One of them was pregnant and gave birth to 5 TG piglets 115 days after pregnancy, which is shown in FIG.
그러나, 세 마리의 새끼돼지는 사산되었고, 또 다른 한 마리는 22일 후에 죽었으며, 단 한 마리만 생존하였다. 피부세포의 gDNA로부터 결과는 다섯 마리의 새끼 돼지 모두 pGFAP-CreERT2; EGFPLoxP 유전자가 도입된 것을 PCR을 통해 확인하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 3달 후, 5일 동안 15 mg/kg의 TM을 경구 투여하였고, 7일 후 안락사하였다.However, the three piglets were stillborn, another died after 22 days, and only one survived. The results from the gDNA of skin cells showed that all five piglets were pGFAP-CreER T2 ; The introduction of the EGFP LoxP gene was confirmed by PCR, and the results are shown in Fig. After 3 months, 15 mg / kg of TM was orally administered for 5 days and euthanized 7 days later.
도 6에 나타낸 바와 같이, #1 내지 #5의 새끼 돼지 내에 재조합 유전자가 모두 나타났음을 확인하였다. As shown in Fig. 6, it was confirmed that all the recombinant genes appeared in
실시예Example 3. 3. 형질전환 돼지의Transgenic pig 신경계 내 In the nervous system pGFAPpGFAP -- CreERCreer T2T2 ; ; EGFPEGFP LoxPLoxP 시스템의 발현 여부 Whether the system is manifested
돼지 GFAP 프로모터 서열에 의해 제어되는 형질전환 유전자가 성상세포 계통에서 특이적으로 발현되는지를 여부를 확인하기 위하여, 자연 유산된 두 마리의 TG 돼지, #2 및 #3을 포함한 4 마리의 TG 돼지로부터 각 조직을 정량적 PCR(qPCR)법을 이용해 분석하였다. 구체적으로, 먼저, qRT-PCR를 mRNA수준을 결정하기 위해 수행하였다. 전체 RNA를 제조업체의 지침에 따라 트리졸 시약(Invitrogen)을 사용하여 세포로부터 분리하였다. RNase-free DNase-처리된 RNA(1μg)를 제조업체의 지침에 따라 RevertAid™ First strand Cdna 합성 키트(Thermo)를 사용하여 cDNA를 합성하기 위한 주형으로서 사용하였다. qRT-PCR 분석은 Takara SYBR Premix Ex Taq 및 CFX096 (Bio-Rad)를 사용하여 수행하였다. 표적 유전자의 발현 수준은 대조군인 18S rRNA에 의해 정규화하였으며, 각 프라이머 서열은 하기 표 1에 나타내었다.To determine whether the transgene controlled by the porcine GFAP promoter sequence was specifically expressed in the astrocytic lineage, two TG pigs spontaneously aborted, four TG
각 동결 조직 및 세포의 게놈 DNA 시료는 제조업체의 지침에 따라 Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega, Madison, USA)를 사용하여 분리하였다. 크고 거친 조직의 경우에 제조업체의 추천된 방법에 따라 Bullet Blender® (Next Advance Inc. New York, USA)를 사용하여 게놈 DNA 추출 공정 전에 각 조직을 균일화시켰다. 게놈 DNA의 형질전환된 유전자는 열 사이클러 내에서 각 프라이머 세트(EGFP, CreERT2, 18s) 및 DNA 중합효소(Genecraft, Manchester, UK)와 함께 증폭되며, 상기 PCR 분석의 결과를 도 7에 나타내었다.Genomic DNA samples from each frozen tissue and cell were isolated using the Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega, Madison, USA) according to the manufacturer's instructions. For large and coarse tissue, each tissue was homogenized prior to the genomic DNA extraction process using Bullet Blender® (Next Advance Inc. New York, USA) according to the manufacturer's recommended method. Genomic DNA transfected genes were amplified in heat cycler with each primer set (EGFP, CreER T2 , 18s) and DNA polymerase (Genecraft, Manchester, UK) .
도 7에 나타낸 바와 같이, CreERT2 유전자는 내인성 GFAP 레벨과 함께 다른 조직에 비해 뇌에서 높게 발현이 나타나는 것을 확인하였다.As shown in Fig. 7, the CreER T2 gene showed high expression in the brain as compared with other tissues along with the endogenous GFAP level.
또한, GFAP 프로모터에 의해 제어되는 CreERT2 유전자가 GFAP-양성 아교 세포 내에서 발현되는지 여부를 확인하기 위해 면역형광 (IF) 염색을 수행하였다. 구체적으로, 파라핀에 포함된 돼지 뇌 조직은 4μm 두께의 조각으로 잘라 4°C에서 12시간 동안 GFAP (691102; 1:500; MP Biomedical ImmunOTM), Cre 재조합효소 (12830S; 1:200; Cell Signaling), EGFP (AB6673; 1:200; Abcam, & AB290; 1:200; Abcam), 및 as100β(S2644; 1:200; Sigma)에 대한 일차 항체와 함께 염색하였다. 염색 후, Alexa Fluor® 488 또는 594 (A11001, A11005, A11012, or A11055; 1:500, respectively; Thermo Fisher Scientific Inc.)와 접합된 2차 항체를 실온에서 1시간 동안 배양하였다. DAPI(4′,6-디아미디노-2-페닐인) 1μg/mL로 5분간 핵을 염색시키고, 그 후 공초점 레이저 현미경(LSM5 Pascal, Carl Zeiss)을 사용하여 형광이미지를 관찰하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다.Immunofluorescence (IF) staining was also performed to determine whether the CreER T2 gene, which is regulated by the GFAP promoter, is expressed in GFAP-positive glial cells. Specifically, the pig brain tissue contained in the paraffin was cut into 4 μm-thick pieces and GFAP (691102; 1: 500; MP Biomedical ImmunOTM), Cre recombinase (1: 200; Cell Signaling) for 12 hours at 4 ° C, , EGFP (AB6673; 1: 200; Abcam, AB290; 1: 200; Abcam) and as100? (S2644; 1: 200; Sigma). After staining, secondary antibodies conjugated with Alexa Fluor 488 or 594 (A11001, A11005, A11012, or A11055; 1: 500, respectively; Thermo Fisher Scientific Inc.) were incubated for 1 hour at room temperature. The nuclei were stained with 1 μg / mL of DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenyl) for 5 minutes, and then fluorescence images were observed using a confocal laser microscope (LSM5 Pascal, Carl Zeiss) The results are shown in Fig.
도 8에 나타낸 바와 같이, CreERT2 유전자 발현은 별모양 GFAP-양성 성상세포뿐만 아니라, 비성상세포 일부에서도 발견되었다. As shown in Fig. 8, CreER T2 Gene expression was found not only in star-shaped GFAP-positive astrocytes but also in some non-astrocytes.
또한, GFAP 프로모터가 비-성상세포 내에서 그것의 형질도입유전자를 전사하는지 여부를 확인하기 위해, #2 및 #3 TG 돼지의 귀 조직으로부터 얻은 섬유아세포를 4OH-TM으로 처리하였다. GFAP 프로모터에 의해 제어되는 CreERT2는 상기 세포에서는 작동되지 않았다. 또한, EGFP 형질도입 유전자의 뇌 조직 내 발현을 IF 염색을 통해 확인하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다. In addition, fibroblasts from ear tissues of # 2 and # 3 TG pigs were treated with 4OH-TM to confirm whether the GFAP promoter transcribed its transgene in non-astrocytic cells. CreER T2 regulated by the GFAP promoter did not work in these cells. In addition, the expression of EGFP transgene in brain tissue was confirmed by IF staining, and the results are shown in Fig.
도 9에 나타낸 바와 같이, 세포 대부분은 EGFP를 발현하지만, GFAP 양성 세포는 상대적으로 뇌 조직내 다른 세포들에 비해 상대적으로 약한 강도를 보였다. 상기 결과로부터 성상세포-특이적인 재조합 시스템의 두 형질전환 유전자가 TG 돼지 내에서 발현된 것으로 추측된다.As shown in FIG. 9, most of the cells expressed EGFP, but GFAP-positive cells showed relatively weaker intensity than the other cells in brain tissue. From the above results, it is presumed that the two transgenic genes of astrocytic-specific recombination system were expressed in TG pigs.
실시예Example 4. 4. 4OH4OH -- TMTM 처리 후의 Post-treatment GFAPGFAP -- 발현세포Expressing cell 내 of mine pGFAPpGFAP -- CreERCreer T2T2 ;EGFP; EGFP LoxPLoxP 재조합 Recombination
돼지 성상세포-특이적인 pGFAP-CreERT2; EGFPLoxP 재조합 시스템이 TM 처리에 의해 작동하는지 확인하기 위해, 두 LoxP 부위에 연접한 F-R 프라이머 쌍을 이용하여 재조합 부위를 증폭시킴으로써 게놈 DNA PCR 분석을 수행하였다. 그 결과, floxed DNA 의 생성물은 아니었으나, 사전-재조합 DNA를 증폭시킨 PCR 생성물을 검출하였다. CreERT2 매개 재조합을 찾기 위한 세미-네스티드 PCR은, PCR의 첫번째 라운드에 프라이머의 첫번째 쌍, F 및 R, 그리고 NeoThermTM DNA 중합효소 (Genecraft, Manchester, UK)를 사용하여 열 사이클러 내에서 수행한다. 모든 PCR 생성물은 UV 노출없이 잘려진 후에 예상되는 생성물 사이즈의 부분 및 1% 아가로스겔로 DNA 전기영동에 의해 분리된다. 그러면 겔 조각들이 겔 추출 키트(Elpis Biotech Inc. Daejeon, Korea)를 사용하여 나타나게 된다. 그 후, PCR 두번째 라운드는 첫번째 생성물의 내부 서열을 증폭시킨 F-R' 세트를 사용하여 수행하였으며, PCR 분석 결과를 도 10에 나타내었다.Porcine astrocytes-specific pGFAP-CreER T2 ; Genomic DNA PCR analysis was performed by amplifying the recombination sites using pairs of FR primers linked to the two LoxP sites to confirm that the EGFP LoxP recombination system was working by TM treatment. As a result, it was not a product of floxed DNA, but PCR products amplifying pre-recombinant DNA were detected. Semi-nested PCR to find CreER T2 mediated recombination was performed in a heat cycler using the first pair of primers, F and R, and NeoTherm TM DNA polymerase (Genecraft, Manchester, UK) in the first round of PCR do. All PCR products are separated by DNA electrophoresis on a 1% agarose gel and a fraction of the expected product size after being cut without UV exposure. The gel fragments are then displayed using a gel extraction kit (Elpis Biotech Inc. Daejeon, Korea). The second round of PCR was then performed using the FR 'set in which the internal sequence of the first product was amplified and the PCR analysis results are shown in FIG.
도 10에 나타낸 바와 같이, 사후-재조합을 보여주는 450bp의 PCR 생성물이 TM 투여 돼지의 뇌에서만 검출되었음을 확인하였다.As shown in Fig. 10, it was confirmed that a 450 bp PCR product showing post-recombination was detected only in TM-treated pigs' brains.
상기 데이터 결과에 따라, CreERT2 유전자가 4-OH TM 처리에 따라 뇌 성상세포가 드문 곳에서 작동하는 GFAP 프로모터에 의해 제어된다는 것을 확인하였다.Based on the above data results, it was confirmed that the CreER T2 gene was regulated by the GFAP promoter which operates in the rare place of the brain astrocytes in accordance with 4-OHTM treatment.
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gagggtaggg aacaggtttg 1200 ttcttcaaat tcccagcgtc tagcgggcac tggaaggaga atacggagcg aggaaaggcc 1260 tgggatatgg ggtctaagag ttagaagaca ggggactttc tgctgtggct cagcagatta 1320 tgaaccccaa ctagaatcca cgaggacgtg ggtttgacct ctagcctaac tccgtgggtt 1380 aaggatccgg cgtggccgtg cactgcggtg taggccggca gctgcagctc tgattcaacc 1440 cctagccttg ggaacttcca tatgctgtgg gtgcagccct aaaaagacaa aagaaaaaaa 1500 aaagttagaa gacaggtcag aggtcatcag gtccagccct tccctgaccc acatcacaga 1560 gaagaggtct ccttgcccag ggatcaggtc cccagaccca gcatcagccc cacgaactgc 1620 ccactggttc ctctgtctgc agccaggcct gcctctgggc agtgaccccg atggggtgag 1680 aggcgctctc ctaacggctg ggctgcagcc cagccccacc ccctcaggct atgccagggg 1740 ggcgttgcca ggggcagcct gggccgtgcc aggccggccc actcctccat aaagcctgca 1800 1800 <110> HBION CO., LTD. <120> Brain tumor animal model and the Use thereof <130> 1-13P <160> 2 <170> KoPatentin 3.0 <210> 1 <211> 1983 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cre-ERT [synthetic construct] <400> 1 atgtccaatt tactgaccgt acaccaaaat ttgcctgcat taccggtcga tgcaacgagt 60 gatgaggttc gcaagaacct gatggacatg ttcagggatc gccaggcgtt ttctgagcat 120 acctggaaaa tgcttctgtc cgtttgccgg tcgtgggcgg catggtgcaa gttgaataac 180 cggaaatggt ttcccgcaga acctgaagat gttcgcgatt atcttctata tcttcaggcg 240 cgcggtctgg cagtaaaaac tatccagcaa catttgggcc agctaaacat gcttcatcgt 300 cggtccgggc tgccacgacc aagtgacagc aatgctgttt cactggttat gcggcggatc 360 cgaaaagaaa acgttgatgc cggtgaacgt gcaaaacagg ctctagcgtt cgaacgcact 420 gatttcgacc aggttcgttc actcatggaa aatagcgatc gctgccagga tatacgtaat 480 ctggcatttc tggggattgc ttataacacc ctgttacgta tagccgaaat tgccaggatc 540 agggttaaag atatctcacg tactgacggt gggagaatgt taatccatat tggcagaacg 600 aaaacgctgg ttagcaccgc aggtgtagag aaggcactta gcctgggggt aactaaactg 660 gtcgagcgat ggatttccgt ctctggtgta gctgatgatc cgaataacta cctgttttgc 720 cgggtcagaa aaaatggtgt tgccgcgcca tctgccacca gccagctatc aactcgcgcc 780 ctggaaggga tttttgaagc aactcatcga ttgatttacg gcgctaagga tgactctggt 840 cagagatacc tggcctggtc tggacacagt gcccgtgtcg gagccgcgcg 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ccacatcagg 1740 cacatgagta acaaaggcat ggagcatctg tacagcatga agtgcaagaa cgtggtgccc 1800 ctctatgacc tgctgctgga ggcggcggac gcccaccgcc tacatgcgcc cactagccgt 1860 ggaggggcat ccgtggagga gacggaccaa agccacttgg ccactgcggg ctctacttca 1920 tcgcattcct tgcaaaagta ttacatcacg ggggaggcag agggtttccc tgccacagct 1980 tga 1983 <210> 2 <211> 1800 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 2 aattcacaag cagcctataa catgcccaaa tgaagggcat ctcccccagc atagaggagg 60 ggcattgctc agacaggagc ggagggaccg agacggctct gagagctggg gagggggcga 120 gtagccaggc cttgtctaca gagccggagt cctggcaatg ctgggccacc ctccaaggcc 180 ttcccctggt gcccactgaa tgactcacct tggcacagac acaatggtca gaggtgggca 240 cagagcctgc tccccactgc accccagcac ccctcagatg ctttccgaga agttctttga 300 gccaggggct tgggctgcat cccgcctaac aggctggcat cttgggataa aaacagcaca 360 gccccctggg ggctgccctc actgtgcgac gccctcacca gcggcagaga acaaggctcc 420 attcagcaag tgcccaagga gagggatcag aggcccaggc atgggcagtg ggggtggagg 480 cagggggagg agggctgccc acttcccaga agtccagggg caccgatgag ccaagagcct 540 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cgtggccgtg cactgcggtg taggccggca gctgcagctc tgattcaacc 1440 cctagccttg ggaacttcca tatgctgtgg gtgcagccct aaaaagacaa aagaaaaaaa 1500 aaagttagaa gacaggtcag aggtcatcag gtccagccct tccctgaccc acatcacaga 1560 gaagaggtct ccttgcccag ggatcaggtc cccagaccca gcatcagccc cacgaactgc 1620 ccactggttc ctctgtctgc agccaggcct gcctctgggc agtgaccccg atggggtgag 1680 aggcgctctc ctaacggctg ggctgcagcc cagccccacc ccctcaggct atgccagggg 1740 ggcgttgcca ggggcagcct gggccgtgcc aggccggccc actcctccat aaagcctgca 1800 1800
Claims (12)
2) 후보물질 투여 후, 상기 동물모델의 뇌조직을 후보물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 암유전자 발현이 억제되는 경우 뇌종양 예방 또는 치료제로 판단하는 단계;를 포함하는 뇌종양 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법.
1) administering a tumor tumor prophylactic or therapeutic agent candidate agent to the brain tumor animal model of claim 10; And
2) comparing the brain tissue of the animal model with the control group in which the candidate substance is not administered after the administration of the candidate substance, and judging the brain tissue as a brain tumor prevention or treatment agent when the cancer gene expression is inhibited; and .
Priority Applications (1)
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| KR1020160127604A KR20180037449A (en) | 2016-10-04 | 2016-10-04 | Brain tumor animal model and the Use thereof |
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20190056164A (en) * | 2017-11-16 | 2019-05-24 | 한국과학기술연구원 | Transgenic animal inducing reactive astrocyte and preparation method thereof |
| CN112759633A (en) * | 2021-01-07 | 2021-05-07 | 江西农业大学 | Protein and nucleic acid thereof for establishing pig cancer model |
| KR20230041475A (en) * | 2021-09-17 | 2023-03-24 | 서울대학교산학협력단 | Manufacturing method of animal model having brain tumor, animal model manufactured by the method, and screening method of medicine for brain tumor using the model |
-
2016
- 2016-10-04 KR KR1020160127604A patent/KR20180037449A/en unknown
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