KR20180025790A - Cross-linked nanofiber sheet using animal cartilage-derived materials and method for manufacturing the same - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 동물 연골 유래 조직을 이용한 가교된 나노섬유 시트 및 이의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a crosslinked nanofiber sheet using an animal cartilage derived tissue and a method for producing the same.
연골은 다른 결합조직과 같이 결합조직세포와 무세포기질로 구성되어 있지만, 고유결합조직과는 달리 단단하면서도 어느 정도 유연성이 있는 기질을 함유한 특수한 결합조직이다. 연골의 결합조직세포는 대부분 연골세포 한가지로 구성되어 있으며, 이러한 연골세포들은 연골 기질 안의 연골소강에 위치해 있다. Cartilage, like other connective tissues, is composed of connective tissue cells and acellular matrix, but unlike native connective tissue, it is a specialized connective tissue containing a rigid but somewhat flexible substrate. Most of the connective tissue cells of the cartilage are composed of one cartilage cell, and these cartilage cells are located in the cartilage cavity in the cartilage matrix.
무세포기질은 섬유와 무형질로 나누어진다. 섬유성분은 대부분 Ⅱ형 아교질(콜라겐)로 구성되어 있으나, 일부 연골에는 탄력섬유가 풍부하게 있다. 무형질은 주로 황산화글리코스아미노글리칸으로 구성되어 있는 단백당이 주성분을 이루고 있다. 연골기질에서는 많은 수의 단백당 분자가 글리코스아미노글리칸의 하나인 히알루론산에 의해 연결 단백질에 의해 연결되어 거대분자를 이룬다. 이러한 거대분자는 아교섬유와도 결합되어 있다. 단백당 분자는 무형질의 당단백질인 콘드로넥틴에 의해 아교섬유에 부착되어 있다. Cell - free substrates are divided into fibers and intact. Most of the fiber is composed of Ⅱ type collagen (collagen), but some cartilage has abundant elastic fibers. Amorphous consist mainly of protein sugars composed of glycosaminoglycans sulfate. In the cartilaginous matrix, a large number of protein sugar molecules are linked by hyaluronic acid, one of the glycosaminoglycans, to the linking protein to form a macromolecule. These macromolecules are also linked to glue fibers. Protein sugar molecules are attached to glue fibers by the intangible glycoprotein chondronectin.
기타 기질로는 비-콜라겐 단백질과 당단백질 등이 연골의 건조 중량의 10~15%를 차지하고 있으며, 이들은 주로 기질 거대분자의 구조를 안정화시키고 유기조직을 형성하는 것을 도와준다. Other substrates include non-collagen proteins and glycoproteins, which account for 10-15% of the dry weight of the cartilage, which mainly help stabilize the structure of the substrate macromolecules and form organic tissues.
한편, 조직 이식시 세포항원은 숙주에 의해서 인식되므로 조직의 염증반응이나 면역 거부반응을 야기할 수 있다. 하지만 무세포기질의 구성물은 일반적으로 동종 수용자에게는 구성물에 대한 내성이 있기 때문에 심혈관, 혈관, 피부, 신경, 골근, 건, 방광, 간 등을 포함한 조직의 다양한 무세포기질은 조직공학과 재생의학의 응용과 관련하여 많은 연구가 진행되고 있다.On the other hand, the cellular antigen is recognized by the host during tissue transplantation, which may lead to tissue inflammation or immune rejection. However, since the constituents of cell-free matrix are generally resistant to constituents in allogeneic recipients, various cell-free matrices of tissues including cardiovascular, blood vessels, skin, nerve, bone, tendon, bladder, Many studies have been carried out.
그러나, 폴리비닐알코올(PVA)와 같은 합성 고분자의 혼합 없이, 이와 같은 동물 연골 유래 조직을 단독으로 이용하여 항유착 생체 시트로 유용하게 활용가능한 생체 시트로 방사하는 기술에 대한 연구는 현재까지 없었다. However, to date, there has been no research on a technique for radiating such an animal cartilage-derived tissue as a bio-sheet which can be used as an anti-adhesion bio-sheet without using a synthetic polymer such as polyvinyl alcohol (PVA) alone.
본 발명은 (a) 동물 연골 유래 조직을 개질시켜 수용성 동물 연골 유래 조직을 제조하는 단계; (b) 상기 수용성 동물 연골 유래 조직을 극성 유기 용매 및 pH 1~5인 산 용매의 혼합 용매에 첨가한 후 교반하여 용액을 제조한 후, 이를 전기방사법으로 방사하여 나노섬유 시트를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 나노섬유 시트를 가교하는 단계를 포함하는 가교된 나노섬유 시트의 제조방법 등을 제공하고자 한다.(A) preparing an aqueous animal cartilage derived tissue by modifying an animal cartilage derived tissue; (b) adding the water-soluble animal cartilage-derived tissue to a mixed solvent of a polar organic solvent and an acidic solvent having a pH of 1 to 5, stirring the mixture to prepare a solution, and spinning the solution to prepare a nanofiber sheet; And (c) crosslinking the nanofiber sheet. The present invention also provides a method for producing a crosslinked nanofiber sheet comprising the step of crosslinking the nanofiber sheet.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be solved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other matters not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
본 발명은 (a) 동물 연골 유래 조직을 개질시켜 수용성 동물 연골 유래 조직을 제조하는 단계; (b) 상기 수용성 동물 연골 유래 조직을 극성 유기 용매 및 pH 1~5인 산 용매의 혼합 용매에 첨가한 후 교반하여 용액을 제조한 후, 이를 전기방사법으로 방사하여 나노섬유 시트를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 나노섬유 시트를 가교하는 단계를 포함하는 가교된 나노섬유 시트의 제조방법를 제공한다.(A) preparing an aqueous animal cartilage derived tissue by modifying an animal cartilage derived tissue; (b) adding the water-soluble animal cartilage-derived tissue to a mixed solvent of a polar organic solvent and an acidic solvent having a pH of 1 to 5, stirring the mixture to prepare a solution, and spinning the solution to prepare a nanofiber sheet; And (c) crosslinking the nanofiber sheet. The present invention also provides a method for producing a crosslinked nanofiber sheet.
상기 가교는 카보이미드계 화합물, 알데히드계 화합물, 에폭시계 화합물 및 디이소시아네이트계 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 가교제를 포함하는 가교용액을 이용하여 수행될 수 있다.The crosslinking may be carried out using a crosslinking solution containing at least one crosslinking agent selected from the group consisting of a carbomide compound, an aldehyde compound, an epoxy compound and a diisocyanate compound.
상기 가교는 상기 나노섬유 시트를 가교용액에 침지하거나, 상기 나노섬유 시트에 가교용액을 초음파 분사 또는 전기방사시킴으로써 수행될 수 있다.The crosslinking may be performed by immersing the nanofiber sheet in a crosslinking solution, or ultrasonic jetting or electrospinning the crosslinking solution on the nanofiber sheet.
본 발명의 일 구현예로, (a) 동물 연골 유래 조직을 개질시켜 수용성 동물 연골 유래 조직을 제조하는 단계; (b-1) 상기 수용성 동물 연골 유래 조직에 제1 화학 작용기를 도입하고, 극성 유기 용매 및 pH 1~5인 산 용매의 혼합 용매에 첨가한 후 교반하여 제1 용액을 제조하는 단계; (b-2) 상기 수용성 동물 연골 유래 조직에 제2 화학 작용기를 도입하고, 극성 유기 용매 및 pH 1~5인 산 용매의 혼합 용매에 첨가한 후 교반하여 제2 용액을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 제1 용액 및 상기 제2 용액을 혼합한 후, 이를 전기방사법으로 방사와 동시에 가교하는 단계를 포함하는 가교된 나노섬유 시트의 제조방법을 제공한다. In one embodiment of the present invention, there is provided a method for producing a cartilage-derived cartilage comprising: (a) modifying an animal cartilage-derived tissue to produce a water-soluble animal cartilage derived tissue; (b-1) introducing a first chemical functional group into the water-soluble animal cartilage-derived tissue, adding it to a polar organic solvent and a mixed solvent of an acidic solvent having a pH of 1 to 5, and then stirring to prepare a first solution; (b-2) introducing a second chemical functional group into the water-soluble animal cartilage-derived tissue, adding it to a polar organic solvent and a mixed solvent of an acidic solvent having a pH of 1 to 5, and then stirring to prepare a second solution; And (c) cross-linking the first solution and the second solution simultaneously with spinning by electrospinning. The present invention also provides a method for producing a crosslinked nanofiber sheet.
(상기 제1 화학 작용기, 상기 제2 화학 작용기)는 (알카인기, 아자이드기), (알카인기, 싸이올기), (에폭시기, 아민기), (에폭시기, 싸이올기), (아크로일기, 아민기), (아크로일기, 싸이올기) 및 (테트라진, 사이클로옥텐)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 조합일 수 있다.(Epoxy group, amine group), (epoxy group, thiol group), (acyl group, amine group), (acyl group, azide group) (Acyl group, thiol group), and (tetrazine, cyclooctene).
상기 가교는 상기 제1 화학 작용기와 상기 제2 화학 작용기 간의 화학 반응을 통해 수행될 수 있다.The crosslinking may be carried out through a chemical reaction between the first chemical functional group and the second chemical functional group.
상기 극성 유기 용매는 헥사플루오로이소프로판올(Hexafluoroisopropanol; HFIP), 헥사플루오로프로판올(Hexafluoropropanol; HFP), 디메틸포름아미드(dimethyl formamide), 디메틸설폭시드(dimethylsulfoxide), 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 메틸렌클로라이드(methylenechloride), 아세토니트릴(acetonitrile), 테트라하이드로퓨란(tetra hydro furan) 및 에틸아세테이트(ethyl acetate)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.The polar organic solvent may be at least one selected from the group consisting of hexafluoroisopropanol (HFIP), hexafluoropropanol (HFP), dimethyl formamide, dimethylsulfoxide, methanol, ethanol, And may be at least one selected from the group consisting of propanol, methylenechloride, acetonitrile, tetra hydrofuran and ethyl acetate.
상기 pH 1~5인 산 용매는 0.1~1 M의 트리플루오로아세트산, 아세트산 및 포름산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. The acidic solvent having a pH of 1 to 5 may be at least one selected from the group consisting of 0.1 to 1 M of trifluoroacetic acid, acetic acid and formic acid.
상기 극성 유기 용매 및 상기 pH 1~5인 산 용매의 부피비는 5:1 내지 10:1일 수 있다.The volume ratio of the polar organic solvent and the acidic solvent having a pH of 1 to 5 may be 5: 1 to 10: 1.
상기 용액에 대하여, 상기 수용성 동물 연골 유래 조직은 10 중량% 내지 20 중량%일 수 있다.For this solution, the aqueous animal cartilage derived tissue may be from 10% to 20% by weight.
상기 용액에 극성 비양성자성 용매를 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다.And adding a polar aprotic solvent to the solution.
상기 용액에 대하여, 상기 극성 비양성자성 용매는 5 부피% 내지 15 부피%일 수 있다.For this solution, the polar aprotic solvent may be between 5% and 15% by volume.
상기 방사는 방사거리 5~20 cm 이며, 전압 20~30 kV, 방출속도 1~20 ㎕/min인 조건으로 주사기 바늘의 내부 직경이 18 G~26 G인 주사기를 사용하여 수행될 수 있다.The radiation may be performed using a syringe having an inner diameter of the injector needle of 18 G to 26 G under conditions of a radiation distance of 5 to 20 cm, a voltage of 20 to 30 kV, and an emission rate of 1 to 20 μl / min.
상기 동물 연골 유래 조직은 돼지, 소, 양, 말 또는 고양이에서 유래한 것일 수 있다. The animal cartilage derived tissue may be derived from pigs, cows, sheep, horses or cats.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 방법으로 제조된 가교된 나노섬유 시트를 제공한다. In another embodiment of the present invention, there is provided a crosslinked nanofiber sheet produced by the above method.
상기 가교된 나노섬유 시트에 대한 물 접촉각을 5초 동안 측정한 결과, 30° 이상의 각도를 유지할 수 있다. As a result of measuring the water contact angle of the crosslinked nanofiber sheet for 5 seconds, an angle of 30 DEG or more can be maintained.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 가교된 나노섬유 시트를 이용한 항유착 생체 시트를 제공한다. According to another embodiment of the present invention, there is provided an anti-adhesion bio-sheet using the crosslinked nanofiber sheet.
본 발명에 따른 동물 연골 유래 조직을 이용한 가교된 나노섬유 시트의 제조방법은 전기방사법으로 방사하기 전, 수용성 동물 연골 유래 조직을 극성 유기 용매 및 pH 1~5인 산 용매의 혼합 용매에 첨가한 후 교반하여 용액을 제조하는 단계를 필수적으로 포함하는 것으로, 상기 혼합 용매는 휘발성이 뛰어나면서도 동물 연골 유래 조직의 콜라겐을 쉽게 분해시킬 수 있어, 폴리비닐알코올(PVA)와 같은 합성 고분자의 혼합 없이, 수용성 동물 연골 유래 조직 자체 만으로 용이한 방사를 가능하게 할 수 있다. The method for producing a crosslinked nanofiber sheet using an animal cartilage-derived tissue according to the present invention is characterized in that a water-soluble animal cartilage-derived tissue is added to a mixed solvent of a polar organic solvent and an acidic solvent having a pH of 1 to 5 And the mixture is stirred to prepare a solution. The mixed solvent is excellent in volatility and can easily decompose the collagen of the tissue derived from animal cartilage, The animal cartilage-derived tissue itself can enable easy irradiation.
상기 전기방사법으로 방사된 나노섬유 시트는 가교를 통해, 생체 적용을 위한 생분해도가 조절될 수 있고, 소수성 특성을 보이며, 낮은 독성으로 인하여 생체 적합성이 우수한 특성이 있다. 특히, 상기 가교된 나노섬유 시트는 유착이 일어날 수 있는 생체 부위에 적용되어, 장기적 또는 단기적으로 효율적인 유착 방지 효과를 일정하게 유지할 수 있으므로, 생체 시트, 특히, 항유착 생체 시트로 유용하게 활용 가능하다.The nanofiber sheet spun by the electrospinning method has properties of biodegradability for bio-application through crosslinking, hydrophobic property, and biocompatibility due to low toxicity. Particularly, since the crosslinked nanofiber sheet can be applied to a living body region where adhesion can take place, the effect of preventing adhesion can be maintained at a constant level over a long term or short term, so that it can be effectively used as a biomaterial sheet, .
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 나노섬유 시트의 제조방법, 이로부터 제조된 가교된 나노섬유 시트 및 이를 이용한 생체 시트를 보여주는 그림이다.
도 2a는 실시예 1~4에 따른 전기방사법을 이용한 나노섬유 시트의 제조 단계를 보여주는 그림이고, 도 2b는 실시예 1에서 제조된 나노섬유 시트 표면을 육안으로 관찰한 사진 및 주사전자현미경으로 관찰한 사진이다.
도 3a~d는 실시예 2~5에 따른 가교된 나노섬유 시트의 제조방법을 보여주는 그림 및 실시예 2~5에서 가교된 나노섬유 시트 표면을 주사전자현미경으로 관찰한 사진이고, 도 3e는 실시예 1에서 제조된 나노섬유 시트 표면을 육안으로 관찰한 사진 및 실시예 2~5에서 가교된 나노섬유 시트의 표면을 육안으로 관찰한 사진을 비교한 것이다.
도 4는 실시예 1에서 제조된 나노섬유 시트 및 실시예 2에서 가교된 나노섬유 시트의 생체 적용을 위한 생분해도를 비교한 사진이다.
도 5는 실시예 1에서 제조된 나노섬유 시트 및 실시예 2에서 가교된 나노섬유 시트에 대한 물 접촉각을 5 초 동안 측정한 결과를 비교한 사진이다.
도 6은 실시예 2에서 가교된 나노섬유 시트의 독성 평가 결과를 보여주는 사진이다.
도 7a~b는 실시예 2에서 가교된 나노섬유 시트의 항유착성 평가 결과를 확인하기 위해, 실시예 2에서 가교된 나노섬유 시트 표면을 형광현미경 및 FE-SEM로 관찰한 사진이다.
도 8은 장 유착 모델 래트를 대상으로 실시예 2에서 가교된 나노섬유로 인한 유착 방지 효과를 보여주는 실험 과정 및 실험 결과를 보여주는 사진이다. FIG. 1 is a view showing a method of producing a nanofiber sheet according to an embodiment of the present invention, a crosslinked nanofiber sheet produced therefrom, and a biomaterial sheet using the same.
FIG. 2A is a view showing a step of manufacturing a nanofiber sheet using the electrospinning method according to Examples 1 to 4, FIG. 2B is a view showing a surface of a nanofiber sheet prepared in Example 1 with a naked eye and a scanning electron microscope It's a picture.
FIGS. 3A to 3D are views showing a method of producing a crosslinked nanofiber sheet according to Examples 2 to 5 and a photograph of a surface of a crosslinked nanofiber sheet in Examples 2 to 5, respectively, by scanning electron microscopy. FIG. The photographs of the surface of the nanofiber sheet prepared in Example 1 were visually observed and the photographs of the surfaces of the nanofiber sheet bridged in Examples 2 to 5 were visually observed.
4 is a photograph showing a comparison of biodegradability for biocompatibility between the nanofiber sheet prepared in Example 1 and the nanofiber sheet crosslinked in Example 2. FIG.
FIG. 5 is a photograph showing a comparison of the water contact angle measured for 5 seconds between the nanofiber sheet prepared in Example 1 and the crosslinked nanofiber sheet in Example 2. FIG.
6 is a photograph showing the result of evaluating the toxicity of the crosslinked nanofiber sheet in Example 2. Fig.
7A and 7B are photographs of a surface of a crosslinked nanofiber sheet in Example 2 observed with a fluorescence microscope and an FE-SEM in order to confirm the results of evaluating the anti-adhesion properties of the crosslinked nanofiber sheet in Example 2. FIG.
8 is a photograph showing an experimental procedure and an experimental result showing the effect of preventing adhesion due to crosslinked nanofibers in Example 2 in a long-term adhesion model rat.
본 발명자들은 폴리비닐알코올(PVA)와 같은 합성 고분자의 혼합 없이, 동물 연골 유래 조직을 단독으로 방사하여 가교된 나노섬유 시트를 제조하는 방법에 대해 연구하던 중, 수용성으로 개질된 동물 연골 유래 조직을 극성 유기 용매 및 pH 1~5인 산 용매의 혼합 용매의 혼합 용매에 혼합한 용액을 이용함으로써, 생체에 적용하기에 특성이 우수한 가교된 나노섬유 시트를 최종 제조할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다. The inventors of the present invention studied a method for producing crosslinked nanofiber sheets by singly spinning tissue derived from animal cartilage without mixing a synthetic polymer such as polyvinyl alcohol (PVA), and found that the water-soluble modified cartilage- It is confirmed that a crosslinked nanofiber sheet excellent in characteristics for application to living bodies can be finally prepared by using a solution prepared by mixing a mixed solvent of a polar organic solvent and a mixed solvent of an acidic solvent having a pH of 1 to 5, .
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
가교된 나노섬유 시트의 제조방법 (1)Method for producing crosslinked nanofiber sheet (1)
본 발명의 일 구현예는 (a) 동물 연골 유래 조직을 개질시켜 수용성 동물 연골 유래 조직을 제조하는 단계; (b) 상기 수용성 동물 연골 유래 조직을 극성 유기 용매 및 pH 1~5인 산 용매의 혼합 용매에 첨가한 후 교반하여 용액을 제조한 후, 이를 전기방사법으로 방사하여 나노섬유 시트를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 나노섬유 시트를 가교하는 단계를 포함하는 가교된 나노섬유 시트의 제조방법을 제공한다. One embodiment of the present invention relates to a method for producing a cartilage-derived animal tissue, comprising the steps of: (a) modifying an animal cartilage-derived tissue to prepare a water-soluble animal cartilage derived tissue; (b) adding the water-soluble animal cartilage-derived tissue to a mixed solvent of a polar organic solvent and an acidic solvent having a pH of 1 to 5, stirring the mixture to prepare a solution, and spinning the solution to prepare a nanofiber sheet; And (c) crosslinking the nanofiber sheet. The present invention also provides a method for producing a crosslinked nanofiber sheet.
즉, 본 발명의 일 구현예에 따른 가교된 나노섬유 시트의 제조방법은 수용성 동물 연골 유래 조직을 전기방사법으로 방사한 후, 가교하는 2단계 반응으로 수행된다. That is, the method of producing a crosslinked nanofiber sheet according to an embodiment of the present invention is performed by a two-step reaction in which a water-soluble animal cartilage-derived tissue is radiated by electrospinning and then crosslinked.
먼저, 본 발명의 일 구현예에 따른 가교된 나노섬유 시트의 제조방법은 동물 연골 유래 조직을 개질시켜 수용성 동물 연골 유래 조직을 제조하는 단계[(a) 단계]를 포함한다.First, a method of producing a crosslinked nanofiber sheet according to an embodiment of the present invention includes a step of modifying an animal cartilage-derived tissue to produce a water-soluble animal cartilage-derived tissue (step (a)).
본 명세서 내 “나노섬유 시트”라 함은 나노 크기의 직경을 가지는 섬유들이 화학적으로는 가교되지 않은 채로 서로 교차하면서 형성된 메쉬 구조를 가지는 시트를 말하는 것이다. 한편, 본 명세서 내 “가교된 나노섬유 시트”라 함은 하나의 섬유 내에서 또는 섬유와 섬유가 교차되는 지점에서 화학적으로 가교된 상태로 서로 교차하면서 형성된 메쉬 구조를 가지는 시트를 말하는 것이다.As used herein, the term " nanofiber sheet " refers to a sheet having a mesh structure formed by cross-linking fibers having a nano-sized diameter without chemically cross-linking. The term " crosslinked nanofiber sheet " in the present specification refers to a sheet having a mesh structure formed by crossing each other in a single fiber or chemically crosslinked at a point where the fiber and the fiber intersect.
본 명세서 내 “동물 연골 유래 조직”이라 함은 동물 유래 연골 조직, 바람직하게 동물 유래 연골 무세포기질(Cartilage acellular matrix; CAM)을 말하는 것으로, 구체적으로, 동물 연골 유래 조직은 돼지, 소, 양, 말 또는 고양이에서 유래한 것일 수 있고, 돼지에서 유래한 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 동물 연골 유래 조직을 이루는 섬유성분은 대부분 콜라겐으로 구성되는 것을 특징으로 한다. The term "animal cartilage derived tissue" in this specification refers to an animal derived cartilage tissue, preferably an animal derived cartilage acellular matrix (CAM). Specifically, the animal cartilage derived tissue is a pork, It may be derived from horses or cats, preferably from pigs, but is not limited thereto. The fibrous component constituting the tissue derived from animal cartilage is characterized in that it is mostly composed of collagen.
구체적으로, 본 발명에서는 동물 연골 유래 조직을 동결건조 및 동결분쇄하여 동물 연골 유래 조직(예컨대, 파우더 형태)을 제조한 후, 이를 개질시켜 수용성 동물 연골 유래 조직(예컨대, 파우더 형태)을 제조할 수 있다. Specifically, in the present invention, an animal cartilage-derived tissue (for example, a powder form) can be prepared by preparing an animal cartilage-derived tissue (for example, a powder form) by lyophilization and freeze- have.
상기 동결건조 및 동결분쇄는 전처리된 동물 연골 유래 조직을 이용하여 초저온 조건에서 수행될 수 있고, 이때, 초저온 조건이라 함은, -50℃ ~ -100℃ 및 0.01 mTorr ~ 10 mTorr 조건을 말한다. 또한, 동결분쇄는 공지의 분쇄기를 사용하여 수행될 수 있고, 이러한 방법으로 제조된 파우더 형태의 동물 연골 유래 조직은 10μm 내지 100μm 크기를 가질 수 있다. The lyophilization and freeze-pulverization may be performed at an ultra-low temperature condition using the pretreated animal cartilage-derived tissue, and the ultra-low temperature condition refers to a condition of -50 ° C to -100 ° C and 0.01 mTorr to 10 mTorr. In addition, the freeze pulverization can be carried out using a known pulverizer, and the animal-derived cartilage-derived tissue in the form of powder produced by this method can have a size of 10 mu m to 100 mu m.
이후, 상기 제조된 동물 연골 유래 조직을 단백질 분해 효소를 포함하는 수용액에 용해시킨 후, 중화시킨 다음, 단백질 분해 효소를 투석 등의 방법에 의해 제거함으로써 수용성 동물 연골 유래 조직을 제조할 수 있다. 이후, 초저온에서 동결건조를 추가할 수 있다. 이때, 단백질 분해 효소로는 동물 연골 유래 조직을 구성하고 있는 콜라겐을 분해할 수 있는 효소가 사용될 수 있고, 펩신인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. Thereafter, the prepared animal cartilage-derived tissue is dissolved in an aqueous solution containing a protease, and then the proteinase is neutralized and then the proteinase is removed by dialysis or the like to produce a water-soluble animal cartilage-derived tissue. Then, freeze-drying can be added at an ultra-low temperature. At this time, an enzyme capable of degrading collagen constituting the tissue derived from animal cartilage can be used as the protease, and it is preferably pepsin, but is not limited thereto.
다음으로, 본 발명의 일 구현예에 따른 가교된 나노섬유 시트의 제조방법은 상기 수용성 동물 연골 유래 조직을 극성 유기 용매 및 pH 1~5인 산 용매의 혼합 용매에 첨가한 후 교반하여 용액을 제조한 후, 이를 전기방사법으로 방사하여 나노섬유 시트를 제조하는 단계[(b) 단계]를 포함한다.Next, in the method of producing a crosslinked nanofiber sheet according to an embodiment of the present invention, the water-soluble animal cartilage-derived tissue is added to a mixed solvent of a polar organic solvent and an acidic solvent having a pH of 1 to 5, And then spinning it by electrospinning to produce a nanofiber sheet (step (b)).
상기 혼합 용매는 극성 유기 용매 및 pH 1~5인 산 용매를 포함하는 것으로, 상기 극성 유기 용매는 전기방사를 수행하기 위한 극성이 부여된 용매로서, 휘발성이 커서 전기방사시 원활한 용매 휘발을 가능하게 할 수 있다. 구체적으로, 상기 상기 극성 유기 용매는 헥사플루오로이소프로판올(Hexafluoroisopropanol; HFIP), 헥사플루오로프로판올(Hexafluoropropanol; HFP), 디메틸포름아미드(dimethyl formamide), 디메틸설폭시드(dimethylsulfoxide), 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 메틸렌클로라이드(methylenechloride), 아세토니트릴(acetonitrile), 테트라하이드로퓨란(tetra hydro furan) 및 에틸아세테이트(ethyl acetate)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있고, 헥사플루오로이소프로판올(Hexafluoroisopropanol; HFIP)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, pH 1~5인 산은 상기 범위의 pH를 유지함으로써, 동물 연골 유래 조직을 구성하고 있는 콜라겐을 쉽게 분해할 수 있다. 구체적으로, 상기 pH 1~5인 산은 0.1~1 M의 트리플루오로아세트산, 아세트산 및 포름산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것이 바람직하고, 0.1~1 M의 트리플루오로아세트산인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. The mixed solvent includes a polar organic solvent and an acidic solvent having a pH of 1 to 5. The polar organic solvent is a polarized solvent for performing electrospinning and is highly volatile, can do. Specifically, the polar organic solvent may be at least one selected from the group consisting of hexafluoroisopropanol (HFIP), hexafluoropropanol (HFP), dimethyl formamide, dimethylsulfoxide, methanol, ethanol may be at least one selected from the group consisting of ethanol, propanol, methylenechloride, acetonitrile, tetra hydrofuran and ethyl acetate, and hexafluoroisopropanol (Hexafluoroisopropanol: HFIP), but is not limited thereto. In addition, an acid having a pH of 1 to 5 can easily decompose collagen constituting an animal cartilage-derived tissue by maintaining the pH within the above range. Specifically, the acid having a pH of 1 to 5 is preferably at least one selected from the group consisting of 0.1 to 1 M of trifluoroacetic acid, acetic acid and formic acid, more preferably 0.1 to 1 M of trifluoroacetic acid, It is not limited.
구체적으로, 상기 혼합 용매에서 상기 극성 유기 용매 및 상기 pH 1~5인 산 용매의 부피비는 5:1 내지 10:1인 것이 바람직하고, 7:1 내지 9:1인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이때, 극성 유기 용매의 부피비가 너무 크게 되면, 동물 연골 유래 조직을 구성하고 있는 콜라겐을 충분히 분해시키지 못하고 주사기 바늘이 막히는 점과 제조된 나노섬유 시트의 표면이 매끄럽지 못하게 되는 문제점이 있고, pH 1~5인 산 용매의 부피비가 너무 크게 되면, 동물 연골 유래 조직을 구성하고 있는 콜라겐을 과도하게 분해시켜 제조된 나노섬유 시트의 강도가 매우 약해지는 문제점이 있다. Specifically, the volume ratio of the polar organic solvent and the acidic solvent having a pH of 1 to 5 in the mixed solvent is preferably 5: 1 to 10: 1, more preferably 7: 1 to 9: 1, It does not. At this time, if the volume ratio of the polar organic solvent is too high, the collagen forming the animal cartilage-derived tissue can not be sufficiently decomposed, the needle of the syringe is clogged and the surface of the produced nanofiber sheet is not smooth. When the volume ratio of the five-phosphoric acid solvent is too large, the strength of the nanofiber sheet produced by decomposing the collagen constituting the animal cartilage-derived tissue is extremely weakened.
상기 용액에 대하여, 상기 수용성 동물 연골 유래 조직은 10 중량% 내지 20 중량%인 것이 바람직하고, 14 중량% 내지 16 중량%인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이때, 수용성 동물 연골 유래 조직의 함량이 너무 적으면, 점도가 낮아서 전기방사가 이루어질 때 용매가 적절히 증발되지 않아 나노섬유 시트가 제조되지 않는 문제점이 있고, 수용성 동물 연골 유래 조직의 함량이 너무 크면, 점도가 높아서 전기적 힘에 의하여 방사가 이루어지지 못하는 문제점이 있다. For the above solution, the water-soluble animal cartilage-derived tissue is preferably 10 wt% to 20 wt%, more preferably 14 wt% to 16 wt%, but is not limited thereto. If the content of the water-soluble animal cartilage-derived tissues is too low, there is a problem that the viscosity is low and the solvent is not appropriately evaporated when the electrospinning is performed, so that the nanofiber sheet can not be produced. There is a problem that spinning can not be performed by an electric force because of high viscosity.
선택적으로, 상기 용액에 극성 비양성자성 용매를 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다. Optionally, the method may further comprise adding a polar aprotic solvent to the solution.
상기 극성 비양성자성 용매는 전기가 잘 통하는 용매로서, 전기방사 효율을 증대시키기 위해 첨가될 수 있다. 상기 극성 비양성자성 용매에서 양이온은 δ-를 띠는 O나 N에 의해서 용매화가 잘 되지만, 음이온은 δ+띠는 것이 없으므로 용매화가 잘 되지 않아, 상대적으로 자유로운 상태로, 이러한 음이온은 용매에 의해 단단한 상호작용으로 결합되어 있지 않기 때문에 노출된 음이온(naked anion)이라 한다. The polar aprotic solvent may be added to increase the electrospinning efficiency as a well-known solvent. In the polar aprotic solvent, the cation is solvated by O or N having δ-, but since the anion has no δ + band, the solvent is not easily solved and is relatively free. It is called naked anion because it is not bonded by a hard interaction.
구체적으로, 상기 극성 비양성자성 용매로 디메틸포름아미드(Dimethyl formamide; DMF), 디메틸술폭시드(Dimethyl sulfoxide; DMSO), 헥사메틸포스포릭트리아미드(Hexamethylphosphoric triamide; DMSO) 및 에테르류로부터 이루어진 군으로부터 선택된 용매를 사용할 수 있고, 디메틸포름아미드(Dimethyl formamide; DMF)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. Specifically, the polar aprotic solvent is selected from the group consisting of dimethyl formamide (DMF), dimethyl sulfoxide (DMSO), hexamethylphosphoric triamide (DMSO) and ethers A solvent may be used, and it is preferably, but not limited to, dimethyl formamide (DMF).
상기 용액에 대하여, 상기 극성 비양성자성 용매는 5 부피% 내지 15 부피%인 것이 바람직하고, 10 부피% 내지 13 부피%인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이때, 극성 비양성자성 용매가 상기 용액에 대하여, 5 부피% 미만인 경우에는, 전기방사 효율을 충분히 증대시키지 못하는 문제점이 있고, 극성 비양성자성 용매가 상기 용액에 대하여, 15 부피%를 초과하는 경우에는, 이를 제거하기 위한 세척 공정이 추가되어야 하는 문제점이 있다. For this solution, the polar aprotic solvent is preferably 5 vol% to 15 vol%, more preferably 10 vol% to 13 vol%, but is not limited thereto. At this time, when the polar aprotic solvent is less than 5 vol% based on the solution, the electrospinning efficiency can not be sufficiently increased, and when the polar aprotic solvent exceeds 15 vol% There is a problem in that a washing process for removing the washing process must be added.
이후, 상기 용액을 전기방사법으로 방사하는데, 상기 전기방사법은 폴리비닐알코올(PVA)와 같은 합성 고분자의 혼합 없이, 상기 용액 내 포함된 동물 연골 유래 조직 자체의 방사를 통해 나노섬유 시트를 제조하기 위한 것으로, 전기방사시에 상기 혼합 용매의 특성상 원활한 제거가 가능하기 때문에 나노섬유들이 서로 교차하면서 형성된 메쉬 구조를 가지는 나노섬유 시트를 제조할 수 있다. Thereafter, the solution is irradiated by electrospinning, wherein the electrospinning is carried out without mixing a synthetic polymer such as polyvinyl alcohol (PVA), to produce a nanofiber sheet through the radiation of the animal cartilage derived tissue itself contained in the solution Since the nature of the mixed solvent can be removed at the time of electrospinning, a nanofiber sheet having a mesh structure in which nanofibers cross each other can be manufactured.
상기 전기방사법은 공지의 전기방사기를 사용하여 수행될 수 있고, 구체적으로, 주사기 바늘과 콜렉터 사이에 전압차가 발생하고, 이에 따라 토출된 용액의 혼합 용매가 휘발되면서 나노섬유가 형성된 후, 콜렉터에 적층된다.The electrospinning can be performed using a known electrospinner, and specifically, a voltage difference is generated between the needle of the syringe and the collector, whereby the mixed solvent of the discharged solution is volatilized and the nanofiber is formed, do.
구체적으로, 상기 전기방사법은 주사기 바늘과 콜렉터 사이의 방사거리 5~20 cm 이며, 전압 20~30 kV, 방출속도 1~20 ㎕/min 인 조건으로 주사기 바늘의 내부 직경이 18~26 G인 주사기를 사용하여 수행될 수 있다. Specifically, the electrospinning method is performed using a syringe needle having an inner diameter of 18 to 26 G, a spraying distance of 5 to 20 cm between the syringe needle and the collector, a voltage of 20 to 30 kV and a discharge rate of 1 to 20 μl / ≪ / RTI >
다음으로, 본 발명의 일 구현예에 따른 가교된 나노섬유 시트의 제조방법은 상기 나노섬유 시트를 가교하는 단계[(c) 단계]를 포함한다.Next, a method of producing a crosslinked nanofiber sheet according to an embodiment of the present invention includes a step (c) of crosslinking the nanofiber sheet.
상기 가교는 가교용액을 이용하여 수행될 수 있고, 구체적으로, 상기 가교는 상기 나노섬유 시트를 가교용액에 침지하거나, 상기 나노섬유 시트에 가교용액을 초음파 분사 또는 전기방사시킴으로써 수행될 수 있다. 이때, 상기 가교용액은 카보이미드계 화합물, 알데히드계 화합물, 에폭시계 화합물 및 디이소시아네이트계 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 가교제를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 가교 용액에 대하여, 상기 가교제는 0.1 중량% 내지 10 중량%인 것이 바람직하고, 0.1 중량% 내지 5 중량%인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.The crosslinking may be performed using a crosslinking solution. Specifically, the crosslinking may be performed by immersing the nanofiber sheet in a crosslinking solution, or ultrasonic jetting or electrospinning the crosslinking solution on the nanofiber sheet. At this time, the crosslinking solution preferably includes at least one crosslinking agent selected from the group consisting of a carbomide compound, an aldehyde compound, an epoxy compound and a diisocyanate compound, but is not limited thereto. The cross-linking agent is preferably 0.1 wt% to 10 wt%, more preferably 0.1 wt% to 5 wt% with respect to the cross-linking solution, but is not limited thereto.
예컨대, 카보이미드계 화합물로서 1-에틸-3-(3-디메틸 아미노프로필카보이미드), 1-에틸-3-(2-몰포리닐-4-에틸) 카보이미드 또는 디시클로헥실카보이미드를 사용할 수 있고, 알데히드계 화합물로서 포름알데히드, 글루타르알데히드 또는 덱스트린 알데히드를 사용할 수 있다. 이러한 가교제의 알데히드기는 콜라겐의 아민기와 화학 반응할 수 있고, 가교제의 아민기는 콜라겐의 카르복시기와 화학 반응함으로써 가교될 수 있다. For example, it is possible to use 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropylcarbamido), 1-ethyl-3- (2-morpholinyl-4-ethyl) carbomide or dicyclohexylcarbomide as the carbomide compound Formaldehyde, glutaraldehyde or dextrin aldehyde may be used as the aldehyde-based compound. The aldehyde group of the crosslinking agent can chemically react with the amine group of the collagen, and the amine group of the crosslinking agent can be crosslinked by a chemical reaction with the carboxyl group of the collagen.
상기 열거한 가교제 외에도, 측쇄 또는 말단에 카르복시기를 갖는 생체적합성 고분자를 사용할 수 있다. 상기 생체적합성 고분자는 폴리카프로락톤(PCL,polycaprolactone)을 포함할 수 있고, 글리콜라이드(GA, glycolide), 락타이드(LA, lactide) 등의 단량체의 공중합(copolymerization)들로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 가교제의 알데히드기는 콜라겐의 아민기와 화학 반응할 수 있고, 가교제의 카르복시기는 콜라겐의 아민기와 화학 반응함으로써 가교될 수 있다. In addition to the crosslinking agents listed above, a biocompatible polymer having a carboxyl group at the side chain or terminal may be used. The biocompatible polymer may include polycaprolactone (PCL), and may be at least one selected from the group consisting of copolymerizations of monomers such as glycolide (GA), lactide (LA), lactide, and the like. But is not limited thereto. The aldehyde group of the crosslinking agent can chemically react with the amine group of the collagen, and the carboxyl group of the crosslinking agent can be crosslinked by chemical reaction with the amine group of the collagen.
상기 전기방사법으로 방사된 나노섬유 시트는 가교를 통해, 생체 적용을 위한 생분해도가 조절될 수 있고, 소수성 특성을 보이며, 낮은 독성으로 인하여 생체 적합성이 우수한 특성이 있다. 특히, 상기 가교된 나노섬유 시트는 유착이 일어날 수 있는 생체 부위에 적용되어, 장기적 또는 단기적으로 효율적인 유착 방지 효과를 일정하게 유지할 수 있으므로, 생체 시트, 특히, 항유착 생체 시트로 유용하게 활용 가능하다. 반면, 가교되지 아니한 나노섬유 시트는 친수성 특성을 보이는 것으로, 물에 대한 용해도가 너무 높아 생체에 적용이 어려운 문제점이 있다. The nanofiber sheet spun by the electrospinning method has properties of biodegradability for bio-application through crosslinking, hydrophobic property, and biocompatibility due to low toxicity. Particularly, since the crosslinked nanofiber sheet can be applied to a living body region where adhesion can take place, the effect of preventing adhesion can be maintained at a constant level over a long term or short term, so that it can be effectively used as a biomaterial sheet, . On the other hand, the non-crosslinked nanofiber sheet exhibits hydrophilic properties, and its solubility in water is too high, making it difficult to apply it to a living body.
가교된 나노섬유 시트의 제조방법 (2)(2) A method for producing a crosslinked nanofiber sheet
본 발명의 다른 구현예는 (a) 동물 연골 유래 조직을 개질시켜 수용성 동물 연골 유래 조직을 제조하는 단계; (b-1) 상기 수용성 동물 연골 유래 조직에 제1 화학 작용기를 도입하고, 극성 유기 용매 및 pH 1~5인 산 용매의 혼합 용매에 첨가한 후 교반하여 제1 용액을 제조하는 단계; (b-2) 상기 수용성 동물 연골 유래 조직에 제2 화학 작용기를 도입하고, 극성 유기 용매 및 pH 1~5인 산 용매의 혼합 용매에 첨가한 후 교반하여 제2 용액을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 제1 용액 및 상기 제2 용액을 혼합한 후, 이를 전기방사법으로 방사와 동시에 가교하는 단계를 포함하는 가교된 나노섬유 시트의 제조방법을 제공한다. Another embodiment of the present invention is a method for producing a cartilage-derived animal tissue, comprising the steps of: (a) modifying an animal cartilage-derived tissue to prepare a water-soluble animal cartilage derived tissue; (b-1) introducing a first chemical functional group into the water-soluble animal cartilage-derived tissue, adding it to a polar organic solvent and a mixed solvent of an acidic solvent having a pH of 1 to 5, and then stirring to prepare a first solution; (b-2) introducing a second chemical functional group into the water-soluble animal cartilage-derived tissue, adding it to a polar organic solvent and a mixed solvent of an acidic solvent having a pH of 1 to 5, and then stirring to prepare a second solution; And (c) cross-linking the first solution and the second solution simultaneously with spinning by electrospinning. The present invention also provides a method for producing a crosslinked nanofiber sheet.
즉, 본 발명의 다른 구현예에 따른 가교된 나노섬유 시트의 제조방법은 수용성 동물 연골 유래 조직을 전기방사법으로 방사와 동시에 가교하는 1단계 반응으로 수행된다. That is, the method for producing a crosslinked nanofiber sheet according to another embodiment of the present invention is performed in a one-step reaction in which a water-soluble animal cartilage-derived tissue is crosslinked simultaneously with spinning by electrospinning.
먼저, 본 발명의 다른 구현예에 따른 가교된 나노섬유 시트의 제조방법은 동물 연골 유래 조직을 개질시켜 수용성 동물 연골 유래 조직을 제조하는 단계[(a) 단계]를 포함한다.First, a method for producing a crosslinked nanofiber sheet according to another embodiment of the present invention includes a step of modifying an animal cartilage-derived tissue to prepare a water-soluble animal cartilage-derived tissue (step (a)).
상기 (a) 단계의 구체적인 내용은 가교된 나노섬유 시트의 제조방법 (1)에서 설명한 바와 같으므로, 중복 설명을 생략한다. Since details of the step (a) are the same as those described in the method (1) for producing a crosslinked nanofiber sheet, the duplicated description will be omitted.
다음으로, 본 발명의 다른 구현예에 따른 가교된 나노섬유 시트의 제조방법은 상기 수용성 동물 연골 유래 조직에 제1 화학 작용기를 도입하고, 극성 유기 용매 및 pH 1~5인 산 용매의 혼합 용매에 첨가한 후 교반하여 제1 용액을 제조하는 단계[(b-1) 단계]; 및 상기 수용성 동물 연골 유래 조직에 제2 화학 작용기를 도입하고, 극성 유기 용매 및 pH 1~5인 산 용매의 혼합 용매에 첨가한 후 교반하여 제2 용액을 제조하는 단계[(b-2) 단계]를 포함한다.Next, a method for producing a crosslinked nanofiber sheet according to another embodiment of the present invention comprises introducing a first chemical functional group into the water-soluble animal cartilage-derived tissue, and mixing the solvent with a polar organic solvent and a mixed solvent of an acidic solvent having a pH of 1 to 5 Followed by stirring to prepare a first solution (step (b-1)); And a step of introducing a second chemical functional group into the water-soluble animal cartilage-derived tissue and adding it to a polar organic solvent and a mixed solvent of an acidic solvent having a pH of 1 to 5 and then stirring to prepare a second solution [(b-2) .
상기 제1 화학 작용기 및 상기 제2 화학 작용기는 가교를 위해 도입되는 작용기로서, 하나의 작용기는 수용성 동물 연골 유래 조직의 말단에 도입되어, 다른 화학 작용기가 도입된 수용성 동물 연골 유래 조직의 다른 화학 작용기와 화학 반응을 통해 가교될 수 있다. The first chemical group and the second chemical group are functional groups introduced for crosslinking. One functional group is introduced at the end of the water-soluble animal cartilage-derived tissue, and the other chemical groups of the water-soluble animal cartilage- And can be crosslinked through a chemical reaction.
구체적으로, (상기 제1 화학 작용기, 상기 제2 화학 작용기)는 (알카인기, 아자이드기), (알카인기, 싸이올기), (에폭시기, 아민기), (에폭시기, 싸이올기), (아크로일기, 아민기), (아크로일기, 싸이올기) 및 (테트라진, 사이클로옥텐)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 조합인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 구체적으로, 상기 제1 화학 작용기를 도입하기 위해, amino-PEG4-alkyne(알카인기), alkyne-PEG5-acid(알카인기), alkyne-PEG-amine(알카인기) oxiranylamine(에폭시기), 2-oxiranyl-ethylamine(에폭시기), acrylamide(아크로일기), acrylic acid(아크로일기), acryloyl chloride(아크로일기), methyltetrazine-amine(테트라진), methyltetrazine-PEG4-amine(테트라진), methyltetrazine-propylamine(테트라진), tetrazine-PEG5-NHS ester(테트라진), methyltetrazine-PEG4-NHS ester(테트라진), methyltetrazine-silfo-NHS ester(테트라진), methyltetrazine-PEG4-acid(테트라진), methyltetrazine-PEG12-NHS ester(테트라진), methyltetrazine-NHS ester(테트라진), methyltetrazine-acid(테트라진), tetrazine-acid(테트라진)를 사용할 수 있고, 상기 제2 화학 작용기를 도입하기 위해, azide-PEG4-amine(아자이드기), 3-amino-1-propanethiol(싸이올기), 11-mercaptoundecanoic acid(싸이올기), Aminomethanethiol(싸이올기), thiol PEG amine(싸이올기), ethylene diamine(아민기), PEG diamine(아민기), (S)-3-amino-2-(hydroxymethyl)propionic acid(아민기), amino-acetic acid(아민기), trans-cyclooctene-amine(사이클로옥텐), transcyclooctene-NHS ester(사이클로옥텐), trans cyclooctene-PEG-NHS ester(사이클로옥텐), trans cyclooctene-PEG4-acid(사이클로옥텐)를 사용할 수 있다. Specifically, (the first chemical group and the second chemical group) may be selected from the group consisting of (alkaline-base, azide group), (alkaline-base, thiol group), (epoxy group, amine group), (epoxy group, (Acyl group, thiol group) and (tetrazine, cyclooctene group), but is not limited thereto. Specifically, in order to introduce the first chemical functional group, an amino-PEG4-alkyne (alkaline), an alkyne-PEG5-acid (alkaline), an alkyne-PEG- acrylate, acrylic acid, acryloyl chloride, methyltetrazine-amine (tetrazine), methyltetrazine-PEG4-amine (tetrazine), methyltetrazine-propylamine (tetrazine) (tetrazine), methyltetrazine-PEG-NHS ester (tetrazine), methyltetrazine-PEG4-NHS ester (tetrazine) (tetrazine), methyltetrazine-NHS ester (tetrazine), methyltetrazine-acid (tetrazine), and tetrazine-acid (tetrazine) may be used. In order to introduce the second chemical group, azide-PEG4-amine (Azide group), 3-amino-1-propanethiol (thiol group), 11-mercaptoundecanoic acid (thiol group), aminomethanethiol ), thiol PEG amine (thiol group), ethylene diamine (amine group), PEG diamine (amine group), (S) -3-amino-2- (hydroxymethyl) propionic acid (amine group) Trans cyclooctene-amine (cyclooctene), transcyclooctene-NHS ester (cyclooctene), trans cyclooctene-PEG-NHS ester (cyclooctene), and trans cyclooctene-PEG4-acid (cyclooctene).
그밖에, 상기 혼합 용매의 구체적인 내용은 가교된 나노섬유 시트의 제조방법 (1)의 혼합 용매에서, 그리고, 상기 제1 용액 및 상기 제2 용액의 구체적인 내용은 가교된 나노섬유 시트의 제조방법 (1)의 용액에서 설명한 바와 같으므로, 중복 설명을 생략한다. In addition, the specific content of the mixed solvent is determined in a mixed solvent of the method (1) for producing a crosslinked nanofiber sheet, and the specific contents of the first solution and the second solution are obtained by a method ), And hence redundant description will be omitted.
다음으로, 본 발명의 다른 구현예에 따른 가교된 나노섬유 시트의 제조방법은 상기 제1 용액 및 상기 제2 용액을 혼합한 후, 이를 전기방사법으로 방사와 동시에 가교하는 단계[(c) 단계]를 포함한다. Next, a method of producing a crosslinked nanofiber sheet according to another embodiment of the present invention includes a step of mixing the first solution and the second solution, followed by crosslinking the same with electrospinning (step (c)), .
상기 제1 용액 및 상기 제2 용액은 상술한 바와 같이, 서로 다른 화학 작용기를 포함하므로, 전기방사법을 수행하는 경우, 방사와 동시에 가교를 수행할 수 있고, 이를 통해 가교된 나노섬유 시트의 물성을 증대시킬 수 있다. Since the first solution and the second solution contain different chemical functional groups as described above, when the electrospinning is carried out, the crosslinking can be performed simultaneously with the spinning, whereby the physical properties of the crosslinked nanofiber sheet Can be increased.
상기 가교는 상기 제1 화학 작용기와 상기 제2 화학 작용기 간의 화학 반응을 통해 수행될 수 있다. The crosslinking may be carried out through a chemical reaction between the first chemical functional group and the second chemical functional group.
그밖에, 상기 전기방사법의 구체적인 내용은 가교된 나노섬유 시트의 제조방법 (1)에서 설명한 바와 같으므로, 중복 설명을 생략한다. In addition, the specific contents of the electrospinning method are the same as those described in the method (1) for producing a crosslinked nanofiber sheet, and duplicated description thereof will be omitted.
가교된 나노섬유 시트 및 이를 이용한 생체 시트Crosslinked nanofiber sheet and biomaterial sheet using the same
본 발명은 상기 방법으로 제조된 가교된 나노섬유 시트를 제공하고, 상기 가교된 나노섬유 시트를 이용한 생체 시트, 바람직하게, 항유착 생체 시트를 제공한다. The present invention provides a crosslinked nanofiber sheet produced by the above method and provides a biomaterial sheet using the crosslinked nanofiber sheet, preferably an anti-adhesion biomaterial sheet.
상기 전기방사법으로 방사된 나노섬유 시트는 가교를 통해, 생체 적용을 위한 생분해도가 조절될 수 있고, 소수성 특성을 보이며, 낮은 독성으로 인하여 생체 적합성이 우수한 특성이 있다.The nanofiber sheet spun by the electrospinning method has properties of biodegradability for bio-application through crosslinking, hydrophobic property, and biocompatibility due to low toxicity.
상기 가교된 나노섬유 시트의 소수성 표면 특성을 평가하기 위해서, 상기 가교된 나노섬유 시트에 물을 접촉시켜 물 접촉각을 측정할 수 있다. 상기 가교된 나노섬유 시트에 대한 물 접촉각을 5초 동안 측정한 결과, 30° 이상, 바람직하게, 50° 이상의 각도를 유지함으로써, 젖음성 저하 및 소수성 표면 특성을 유지할 수 있다. In order to evaluate the hydrophobic surface characteristics of the crosslinked nanofiber sheet, it is possible to measure the water contact angle by contacting water with the crosslinked nanofiber sheet. As a result of measuring the water contact angle of the cross-linked nanofiber sheet for 5 seconds, it is possible to maintain the wettability and the hydrophobic surface property by maintaining an angle of 30 DEG or more, preferably 50 DEG or more.
특히, 상기 가교된 나노섬유 시트는 유착이 일어날 수 있는 생체 부위에 적용되어, 장기적 또는 단기적으로 효율적인 유착 방지 효과를 일정하게 유지할 수 있으므로, 생체 시트, 특히, 항유착 생체 시트로 유용하게 활용 가능하다.Particularly, since the crosslinked nanofiber sheet can be applied to a living body region where adhesion can take place, the effect of preventing adhesion can be maintained at a constant level over a long term or short term, so that it can be effectively used as a biomaterial sheet, .
본 발명에 따른 동물 연골 유래 조직을 이용한 가교된 나노섬유 시트의 제조방법은 전기방사법으로 방사하기 전, 수용성 동물 연골 유래 조직을 극성 유기 용매 및 pH 1~5인 산 용매의 혼합 용매에 첨가한 후 교반하여 용액을 제조하는 단계를 필수적으로 포함하는 것으로, 상기 혼합 용매는 휘발성이 뛰어나면서도 동물 연골 유래 조직의 콜라겐을 쉽게 분해시킬 수 있어, 폴리비닐알코올(PVA)와 같은 합성 고분자의 혼합 없이, 수용성 동물 연골 유래 조직 자체 만으로 용이한 방사를 가능하게 할 수 있다. The method for producing a crosslinked nanofiber sheet using an animal cartilage-derived tissue according to the present invention is characterized in that a water-soluble animal cartilage-derived tissue is added to a mixed solvent of a polar organic solvent and an acidic solvent having a pH of 1 to 5 And the mixture is stirred to prepare a solution. The mixed solvent is excellent in volatility and can easily decompose the collagen of the tissue derived from animal cartilage, The animal cartilage-derived tissue itself can enable easy irradiation.
상기 전기방사법으로 방사된 나노섬유 시트는 가교를 통해, 생체 적용을 위한 생분해도가 조절될 수 있고, 소수성 특성을 보이며, 낮은 독성으로 인하여 생체 적합성이 우수한 특성이 있다. 특히, 상기 가교된 나노섬유 시트는 유착이 일어날 수 있는 생체 부위에 적용되어, 장기적 또는 단기적으로 효율적인 유착 방지 효과를 일정하게 유지할 수 있으므로, 생체 시트, 특히, 항유착 생체 시트로 유용하게 활용 가능하다.The nanofiber sheet spun by the electrospinning method has properties of biodegradability for bio-application through crosslinking, hydrophobic property, and biocompatibility due to low toxicity. Particularly, since the crosslinked nanofiber sheet can be applied to a living body region where adhesion can take place, the effect of preventing adhesion can be maintained at a constant level over a long term or short term, so that it can be effectively used as a biomaterial sheet, .
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in order to facilitate understanding of the present invention. However, the following examples are provided only for the purpose of easier understanding of the present invention, and the present invention is not limited by the following examples.
[[ 실시예Example ]]
실시예Example 1: 돼지 연골 유래 조직을 이용한 나노섬유 시트의 제조 1: Manufacture of Nanofiber Sheet Using Pig Tissue Derived from Pigs
(1) 돼지 연골 유래 파우더의 제조(1) Production of pork cartilage derived powder
돼지 연골 유래 조직으로부터 돼지 슬관절을 분리한 후, 돼지 연골 유래 조직이 마르지 않도록 1×PBS에 담궈주었다. 분리된 돼지 연골 유래 조직을 비커에 담아 PBS로 핏물이 보이지 않을 때까지 세척하였다. PBS를 제거하고, 멸균 3차수로 1회 세척한 후, 멸균 3차수를 제거하였다. 세척한 돼지 연골 유래 조직을 초저온 냉동고에서 -70℃ 및 5 mTorr 조건에서 48시간 동안 동결건조하였다. 동결건조된 돼지 연골 조각을 동결 분쇄하여 동물 연골 유래 파우더를 준비하였다. 돼지 연골 유래 파우더를 1×PBS에 넣고 4℃에서 4시간 동안 교반하였다. 용액을 50 mL 튜브에 분주하고, 원심분리기를 이용하여 원심분리 후 상층액을 제거 후 동물 연골 유래 파우더를 비커에 옮긴 후 SDS 완충액을 첨가하여 4℃에서 2시간 동안 교반하였다. 이후 3,300 rcf으로 10분 동안 원심분리하고 상층액을 제거하여 멸균 3차수를 넣고 현탁시킨 뒤 원심분리하였다. 원심분리 후 상층액을 제거한 후 돼지 연골 유래 파우더를 비커에 옮긴 후 DNase 용액을 첨가해 100 rpm으로 12시간 동안 교반해주었다. 이후, 용액을 50 mL 튜브에 분주하고 3,300 rcf으로 10분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거 후 멸균 3차수를 넣고 동물 연골 유래 파우더를 현탁하여 세척하였다. 상층액을 제거 후 소량의 멸균 3차수를 첨가해 동물 연골 유래 파우더를 현탁하여 초저온 냉동고에서 -70℃ 및 5 mTorr 조건에서 48시간 동안 동결건조하였다.After removing the pig knee from the pig cartilage-derived tissues, the pig-cartilage-derived tissues were immersed in 1 × PBS to prevent drying. Separated pig cartilage derived tissues were placed in a beaker and washed with PBS until no blood was visible. PBS was removed, washed once with sterile third order, and sterile third order removed. The washed pig cartilage-derived tissues were lyophilized in a cryogenic freezer at -70 ° C and 5 mTorr for 48 hours. The lyophilized pork cartilage pieces were frozen and ground to prepare animal cartilage derived powder. The pork cartilage-derived powder was added to 1 × PBS and stirred at 4 ° C for 4 hours. The solution was dispensed into a 50-mL tube, centrifuged using a centrifuge, and the supernatant was removed. The cartilage-derived powder was transferred to a beaker, followed by addition of SDS buffer and stirring at 4 ° C for 2 hours. After centrifugation at 3,300 rcf for 10 minutes, the supernatant was removed, sterilized third-order water was added, suspended, and centrifuged. After centrifugation, the supernatant was removed, and the pork cartilage-derived powder was transferred to a beaker, followed by addition of DNase solution and stirring at 100 rpm for 12 hours. The solution was then dispensed into 50 mL tubes and centrifuged at 3,300 rcf for 10 minutes. After removal of the supernatant, sterile third order water was added and the animal cartilage derived powder was suspended and washed. After removing the supernatant, the animal cartilage-derived powder was suspended with a small amount of sterilized third order and lyophilized for 48 hours at -70 ° C and 5 mTorr in a cryogenic freezer.
(2) 수용성 돼지 연골 유래 파우더의 제조(2) Preparation of water-soluble pig cartilage-derived powder
동결 건조된 돼지 연골 유래 파우더 1 g 당 25 mL의 800 unit/mL 펩신 수용액을 첨가하여 교반하여 용액을 준비하였다. 준비된 용액에 NaOH 용액을 첨가하여 pH 7.4로 맞춰 중화시킨 후, 투석막을 7~8 cm로 잘라 흐르는 물에 씻어 내고 멸균 3차수로 헹궈주고 멸균 3차수에 적셔주었다. 투석막의 한쪽 끝을 고정 시킨 후, 깔대기를 이용해 투석막 안에 중화시킨 용액을 부어주었다. 투석막의 안의 공기를 최대한 제거하고 나머지 한쪽 끝을 고정시킨 후, 멸균 3차수 2 L에 넣고 4℃에서 24시간 동안 교반하였다. 투석을 마친 펩신 수용액을 동결건조할 용기에 담아 초저온 냉동고로 -70℃ 및 0 mTorr 조건에서 48시간 동안 동결건조하여 수용성 돼지 연골 유래 파우더를 제조하였다. 25 mL of 800 unit / mL pepsin aqueous solution was added to 1 g of the lyophilized pig cartilage derived powder, and the solution was prepared by stirring. NaOH solution was added to the prepared solution to neutralize the solution to pH 7.4, and the dialyzed membrane was washed with flowing water of 7 to 8 cm, rinsed with sterilized third order, and wetted with sterilized third order water. After fixing one end of the dialysis membrane, the solution neutralized in the dialysis membrane was poured using a funnel. The air inside the dialysis membrane was removed as much as possible, the other end was fixed, and the solution was added to sterilized second order 2 L and stirred at 4 ° C for 24 hours. The dialyzed pepsin aqueous solution was placed in a freeze-dried container and lyophilized at -70 ° C and 0 mTorr for 48 hours in a cryogenic freezer to prepare a water-soluble pig cartilage-derived powder.
(3) 나노섬유 시트의 제조(3) Production of Nanofiber Sheet
수용성 돼지 연골 유래 파우더를 헥사플루오로이소프로판올(Hexafluoroisopropanol; HFIP): 0.5 M 트리플루오로아세트산(Trifluoroacetic acid; TFA)=8:1 부피비의 혼합 용매에 15: 85 중량비로 첨가한 후 48시간 동안 교반하여 용액을 제조하였다. 이후, 제조된 용액 대비 디메틸포름아미드(Dimethylformamide; DMF)을 11 부피%로 첨가하였다. 그 다음, 이를 방사거리 10 cm, 전압 24 kV, 방출속도 8 ㎕/min인 조건으로 주사기 바늘의 내부 직경이 24 G[Stubs Iron Wire Gauge system에 따른 철사나 금속끈, 금속튜브의 직경을 국제적으로 표준화된 체계인 게이지(Gauge) 단위]인 주사기를 사용하여 전기방사[homemade ES-1 (DaeLim Starlet, Siheung, Korea)]하여 나노섬유들이 서로 교차하면서 형성된 메쉬 구조를 가지는 나노섬유 시트를 제조하였고(도 2a 참조), 그 표면은 주사전자현미경을 통하여 관찰하였다(도 2b 참조). 구체적으로, plasma-sputtering apparatus(Emitech, K575, Kent, UK)로 나노섬유 시트를 코팅한 후, FE-SEM(JSM-6700F, JEOL, Tokyo, Japan)을 통하여 표면 구조를 관찰하였다.The water-soluble pig cartilage-derived powder was added to a mixed solvent of hexafluoroisopropanol (HFIP): 0.5 M Trifluoroacetic acid (TFA) = 8: 1 by volume ratio at a ratio of 15:85, and stirred for 48 hours Solution. Then, 11% by volume of dimethylformamide (DMF) was added to the prepared solution. Then, the inner diameter of the syringe needle was 24 G [Stubs Iron Wire Gauge system], and the diameter of wire, metal strap, and metal tube was measured internationally A nanofiber sheet having a mesh structure in which nanofibers cross each other was prepared by using electrospinning (homemade ES-1 (DaeLim Starlet, Siheung, Korea)) using a syringe which is a standardized gauge unit 2A), and its surface was observed through a scanning electron microscope (see FIG. 2B). Specifically, the nanofiber sheet was coated with a plasma-sputtering apparatus (Emitech, K575, Kent, UK) and the surface structure was observed through FE-SEM (JSM-6700F, JEOL, Tokyo, Japan).
실시예 2: 가교용액 침지를 통한 나노섬유 시트의 가교Example 2: Crosslinking of Nanofiber Sheet Through Immersion in Crosslinked Solution
헥사플루오로이소프로판올(Hexafluoroisopropanol; HFIP) 용매에 글루타르알데히드(Glutaraldehyde) 1 중량%를 첨가하여 가교용액을 제조하였다. 가교용액을 80 ml의 바이알에 40 ml 넣은 후, 실시예 1에서 제조된 나노섬유 시트를 3 × 3 cm 크기로 잘라 가교용액에 완전히 침지시킨 후 즉시 꺼내어 가교시켰다. 위 방법을 2회 반복하여 가교된 나노섬유 시트를 제조하였고, 그 표면은 주사전자현미경 및 육안을 통하여 관찰하였다(도 3a 및 도 3e 참조).A crosslinking solution was prepared by adding 1% by weight of glutaraldehyde to a solvent of hexafluoroisopropanol (HFIP). 40 ml of the cross-linking solution was placed in an 80 ml vial, and the nanofiber sheet prepared in Example 1 was cut into a size of 3 x 3 cm and fully immersed in the cross-linking solution, immediately taken out and crosslinked. The above method was repeated twice to prepare a crosslinked nanofiber sheet, and its surface was observed through a scanning electron microscope and a naked eye (see FIGS. 3A and 3E).
실시예 3: 가교용액 초음파 분사를 통한 나노섬유 시트의 가교Example 3 Crosslinking of Nanofiber Sheet Through Ultrasonic Injection of Crosslinked Solution
헥사플루오로이소프로판올(Hexafluoroisopropanol; HFIP) 용매에 글루타르알데히드(Glutaraldehyde) 1 중량%를 첨가하여 가교용액을 제조하였다. 실시예 1에서 제조된 나노섬유 시트를 단일축 초음파 분무기 아래에 위치시키고, 가교용액을 주사기에 넣은 후, 0.1 ml/min의 유속으로 단일축 초음파 분사기에 흘려주었다. 이후, 60 Hz의 진동주파수로 분사하여 가교시켰다. 위 방법을 양면 각 2회 반복하여 가교된 나노섬유 시트를 제조하였고, 그 표면은 주사전자현미경 및 육안을 통하여 관찰하였다(도 3b 및 도 3e 참조).A crosslinking solution was prepared by adding 1% by weight of glutaraldehyde to a solvent of hexafluoroisopropanol (HFIP). The nanofiber sheet prepared in Example 1 was placed under a single-axis ultrasonic atomizer, and the cross-linking solution was put in a syringe and then flowed into a single-axis ultrasonic injector at a flow rate of 0.1 ml / min. Thereafter, the mixture was sprayed at a vibration frequency of 60 Hz for crosslinking. The above method was repeated twice to obtain a crosslinked nanofiber sheet. The surface of the crosslinked nanofiber sheet was observed through a scanning electron microscope and a naked eye (see FIGS. 3B and 3E).
실시예 4: 가교용액 전기방사를 통한 나노섬유 시트의 가교Example 4 Crosslinking of Nanofiber Sheet by Electrospinning of Crosslinked Solution
헥사플루오로이소프로판올(Hexafluoroisopropanol; HFIP) 용매에 글루타르알데히드(Glutaraldehyde) 1 중량%를 첨가하여 가교용액을 제조하였다. 콜렉터에 실시예 1에서 제조된 나노섬유가 있는 상태에서 가교용액을 전기방사하여 가교시킴으로써 가교된 나노섬유 시트를 제조하였고, 그 표면은 주사전자현미경 및 육안을 통하여 관찰하였다(도 3c 및 도 3e 참조). 이때, 전기방사는 방사거리 5 cm, 전압 8 kV, 방출속도 1 ㎕/h인 조건으로 주사기 바늘의 내부 직경이 24 G인 주사기를 사용하여 수행되었다.A crosslinking solution was prepared by adding 1% by weight of glutaraldehyde to a solvent of hexafluoroisopropanol (HFIP). The cross-linked nanofiber sheet was prepared by electrospinning the cross-linking solution with the nanofibers prepared in Example 1 by crosslinking the collector, and the surface thereof was observed through a scanning electron microscope and the naked eye (see FIGS. 3C and 3E ). At this time, the electrospinning was carried out using a syringe having an inner diameter of 24 G of a syringe needle under the conditions of a radiation distance of 5 cm, a voltage of 8 kV, and a release rate of 1 μl / h.
실시예 5: 제1 및 제2 화학 작용기 간의 화학반응을 통한 나노섬유 시트의 가교Example 5: Cross-linking of nanofiber sheet through chemical reaction between first and second chemical functional groups
실시예 1의 (2)에서 제조된 수용성 돼지 연골 유래 파우더에 PBS를 첨가하여 10 mg/ml 농도의 수용성 돼지 연골 유래 파우더 용액을 제조하였고, Transcyclooctene(TC)-PEG-NHS ester 5 mmol을 첨가하여 30분 동안 교반하여 반응시킨 후, 72시간 동안 투석하고 동결건조할 용기에 담아 초저온 냉동고로 -83℃ 및 0 mTorr 조건에서 24시간 동안 동결건조하여 수용성 돼지 연골 유래 파우더에 제1 화학 작용기를 도입하였다. 이후, 헥사플루오로이소프로판올(Hexafluoroisopropanol; HFIP): 0.5 M 트리플루오로아세트산(Trifluoroacetic acid; TFA)=9:1 중량비의 혼합 용매에 15: 85 중량비로 첨가한 후 48시간 동안 교반하여 제1 용액을 제조하였다. 5 mg of transcyclooctene (TC) -PEG-NHS ester was added to the water-soluble pig cartilage-derived powder prepared in Example 1 (2) and PBS was added thereto to prepare a water- The mixture was stirred for 30 minutes and then dialyzed for 72 hours. The mixture was placed in a lyophilized container and lyophilized for 24 hours at -83 ° C and 0 mTorr with a cryogenic freezer to introduce a first chemical functional group into the water-soluble pig cartilage-derived powder . Thereafter, the mixture was added to a mixed solvent of hexafluoroisopropanol (HFIP): 0.5 M Trifluoroacetic acid (TFA) = 9: 1 by weight at a weight ratio of 15:85, and stirred for 48 hours to prepare a first solution .
한편, 실시예 1의 (2)에서 제조된 수용성 돼지 연골 유래 파우더에 PBS를 첨가하여 10 mg/ml 농도의 수용성 돼지 연골 유래 파우더 용액을 제조하였고, tetrazine (TE)-PEG-NHS ester 5 mmol을 첨가하여 30분 동안 교반하여 반응시킨 후, 72시간 동안 투석하고 동결건조할 용기에 담아 초저온 냉동고로 -83℃ 및 0 mTorr 조건에서 24시간 동안 동결건조하여 수용성 돼지 연골 유래 파우더에 제2 화학 작용기를 도입하였다. 이후, 헥사플루오로이소프로판올(Hexafluoroisopropanol; HFIP): 0.5 M 트리플루오로아세트산(Trifluoroacetic acid; TFA)=9:1 중량비의 혼합 용매에 15: 85 중량비로 첨가한 후 48시간 동안 교반하여 제2 용액을 제조하였다.Meanwhile, water soluble pig cartilage-derived powder solution having a concentration of 10 mg / ml was prepared by adding PBS to the water-soluble pig cartilage-derived powder prepared in Example 1 (2), and 5 mmol of tetrazine (TE) -PEG-NHS ester And the mixture was reacted for 30 minutes with stirring. The mixture was dialyzed for 72 hours and lyophilized in a cryogenic freezer at -83 ° C and 0 mTorr for 24 hours to obtain a second chemical functional group in the water-soluble pig cartilage-derived powder Respectively. Then, the mixture was added to a mixed solvent of hexafluoroisopropanol (HFIP): 0.5 M Trifluoroacetic acid (TFA) = 9: 1 by weight at a weight ratio of 15:85, and stirred for 48 hours to obtain a second solution .
그 다음, 각 제1 용액 및 제2 용액을 방사거리 10 cm, 전압 24 kV, 방출속도 8 ㎕/min인 조건으로 주사기 바늘의 내부 직경이 24 G인 주사기를 사용하여 전기방사[homemade ES-1 (DaeLim Starlet, Siheung, Korea)]와 동시에 가교시킴으로써, 가교된 나노섬유 시트를 제조하였고, 그 표면은 주사전자현미경 및 육안을 통하여 관찰하였다(도 3d 및 도 3e 참조).Each of the first solution and the second solution was then subjected to electrospinning (homemade ES-1) using a syringe having an inner diameter of 24 G of a syringe needle under the conditions of a spinning distance of 10 cm, a voltage of 24 kV, (DaeLim Starlet, Siheung, Korea)] to prepare a crosslinked nanofiber sheet. The surface of the crosslinked nanofiber sheet was observed through a scanning electron microscope and a naked eye (see FIGS. 3D and 3E).
실험예Experimental Example
(1) 나노섬유 시트 및 가교된 나노섬유 시트의 생체 적용을 위한 생분해도 평가(1) Evaluation of biodegradability for bio-application of nanofiber sheet and crosslinked nanofiber sheet
물을 20 ml의 바이알에 10 ml 넣었다. 실시예 1에서 제조된 나노섬유 시트와 실시예 2에서 가교된 나노섬유 시트를 1×1 cm로 잘라낸 후, 이를 각각 물에 넣음으로써, 생체 적용을 위한 생분해도를 평가하였다. Water was added to 10 ml of 20 ml vial. The nanofiber sheet prepared in Example 1 and the nanofiber sheet crosslinked in Example 2 were cut into 1 x 1 cm and each was put into water to evaluate biodegradability for biomaterial application.
도 4는 실시예 1에서 제조된 나노섬유 시트 및 실시예 2에서 가교된 나노섬유 시트의 생체 적용을 위한 생분해도를 비교한 사진이다. 4 is a photograph showing a comparison of biodegradability for biocompatibility between the nanofiber sheet prepared in Example 1 and the nanofiber sheet crosslinked in Example 2. FIG.
도 4에 나타난 바와 같이, 실시예 1에서 제조된 나노섬유 시트는 물에 침지된 후 완전히 용해되었으나, 실시예 2에서 가교된 나노섬유 시트는 물에 침지되더라도 완전히 용해되지 않은 것으로 확인된다. 즉, 가교되지 아니한 나노섬유 시트는 물에 대한 용해도가 너무 높아 생체에 적용이 어려우나, 가교된 나노섬유 시트는 가교로 인하여 생분해도가 조절될 수 있어, 생체에 적용이 가능할 것으로 사료되는바, 생체 시트로 활용 가능한 이점을 가지는 것으로 확인된다. As shown in FIG. 4, the nanofiber sheet prepared in Example 1 was completely dissolved after being immersed in water, but it was confirmed that the nanofiber sheet crosslinked in Example 2 was not completely dissolved even when it was immersed in water. That is, although the non-crosslinked nanofiber sheet has a high solubility in water, it is difficult to apply the crosslinked nanofiber sheet to a living body. However, since the crosslinked nanofiber sheet can be controlled in biodegradability due to crosslinking, it can be applied to a living body. It is confirmed that the sheet has an advantage that it can be utilized as a sheet.
(2) 나노섬유 시트 및 가교된 나노섬유 시트의 물 접촉각 측정(2) Measurement of water contact angle of nanofiber sheet and crosslinked nanofiber sheet
가교로 인한 나노섬유 시트의 표면 특성을 분석하기 위해, 실시예 1에서 제조된 나노섬유 시트와 실시예 2에서 가교된 나노섬유 시트에 물을 접촉시켜 물 접촉각을 5초 동안 측정하였다. In order to analyze the surface characteristics of the nanofiber sheet due to crosslinking, the water contact angle was measured for 5 seconds by bringing water into contact with the nanofiber sheet prepared in Example 1 and the nanofiber sheet crosslinked in Example 2.
도 5는 실시예 1에서 제조된 나노섬유 시트 및 실시예 2에서 가교된 나노섬유 시트에 대한 물 접촉각을 5 초 동안 측정한 결과를 비교한 사진이다.FIG. 5 is a photograph showing a comparison of the water contact angle measured for 5 seconds between the nanofiber sheet prepared in Example 1 and the crosslinked nanofiber sheet in Example 2. FIG.
도 5에 나타난 바와 같이, 실시예 1에서 제조된 나노섬유 시트의 경우 물 접촉각이 측정되지 아니하였는바, 가교되지 아니한 나노섬유 시트는 젖음성이 우수하고, 물에 대한 높은 용해도로 인하여 친수성 특성을 보이는 것으로 확인된다. 반면, 실시예 2에서 가교된 나노섬유 시트의 경우 물 접촉각이 약 53.6°로 측정되었는바, 가교된 나노섬유 시트는 물에 대한 낮은 용해도로 인하여 소수성 특성을 보이는 것으로 확인된다. As shown in FIG. 5, in the case of the nanofiber sheet prepared in Example 1, the water contact angle was not measured. As a result, the non-crosslinked nanofiber sheet had excellent wettability and hydrophilicity due to high solubility in water . On the other hand, in the case of the crosslinked nanofiber sheet in Example 2, the water contact angle was measured to be about 53.6 DEG, and it was confirmed that the crosslinked nanofiber sheet exhibited hydrophobic properties due to low solubility in water.
(3) 가교된 나노섬유 시트의 독성 평가(3) Evaluation of toxicity of crosslinked nanofiber sheet
가교로 인한 나노섬유 시트의 독성을 평가하기 위해서, 실시예 2에서 가교된 나노섬유 시트 상에 GFP-HUVECs를 1, 3, 7일 동안 배양시킨 후 MTT 용액을 첨가하여 독성 평가를 실시하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다. In order to evaluate the toxicity of the nanofiber sheet due to crosslinking, the GFP-HUVECs were cultured on the crosslinked nanofiber sheet in Example 2 for 1, 3, and 7 days, and the toxicity was evaluated by adding MTT solution. The results are shown in Fig.
도 6에 나타난 바와 같이, 실시예 2에서 가교된 나노섬유 시트 표면에는 고정된 GFP-HUVECs가 관찰되지 아니하여 독성이 크게 감소한 것으로 확인되는바, 가교된 나노섬유 시트는 생체 적용시 독성이 문제되지 않을 것으로 확인된다. As shown in FIG. 6, it was confirmed that the GFP-HUVECs were not observed on the surface of the crosslinked nanofiber sheet in Example 2. As a result, the crosslinked nanofiber sheet was not toxic .
(4) 가교된 나노섬유 시트의 항유착성 평가(4) Evaluation of anti-adhesion property of crosslinked nanofiber sheet
가교로 인한 나노섬유 시트의 항유착성을 평가하기 위해서, 실시예 2에서 가교된 나노섬유 시트 상에 GFP-HUVECs를 1, 3, 7일동안 배양시킨 후 10% 포름알데히드로 GFP-HUVECs를 고정하였고, 고정된 GFP-HUVECs의 양을 확인하기 위하여 형광현미경(Olympus IX51, Tokyo, Japan) 및 FE-SEM(JSM-6700F, JEOL, Tokyo, Japan)을 통해 표면을 관찰하여 항유착성 평가를 실시하였으며, 그 결과는 도 7a 및 도 7b에 나타내었다. In order to evaluate the anti-adhesion property of the nanofiber sheet due to crosslinking, GFP-HUVECs were cultured on the crosslinked nanofiber sheet in Example 2 for 1, 3, and 7 days, and the GFP-HUVECs were fixed with 10% formaldehyde And the surface was observed through a fluorescence microscope (Olympus IX51, Tokyo, Japan) and an FE-SEM (JSM-6700F, JEOL, Tokyo, Japan) to confirm the amount of fixed GFP-HUVECs The results are shown in FIGS. 7A and 7B.
도 7a 및 도 7b에 나타난 바와 같이, 실시예 2에서 가교된 나노섬유 시트 표면에 고정된 GFP-HUVECs가 관찰되지 아니하였는바, 가교된 나노섬유 시트는 생체 적용시 항유착성이 우수한바, 항유착 생체 시트로 유용하게 활용 가능한 이점을 가지는 것으로 확인된다.As shown in FIGS. 7A and 7B, GFP-HUVECs immobilized on the surface of the crosslinked nanofiber sheet in Example 2 were not observed. The crosslinked nanofiber sheet is excellent in anti-adhesion property in vivo application, It has been confirmed that it has an advantage that it can be advantageously used as a biocompatible seat.
(5) 동물실험을 통한 가교된 나노섬유 시트의 조직에 대한 항유착성 평가 (5) Evaluation of anti-adhesion property of cross-linked nanofiber sheet on tissue by animal experiment
실험대상으로 장 유착 모델 래트를 사용하여, 가교된 나노섬유 시트의 조직에 대한 항유착성을 평가하였다. 구체적으로, 건강한 상태의 8주령 Sprague Dawley계 래트(weight: 230∼280 g)를 3일 동안 실험실에 적응시킨 후, 수술을 시행하였다. 래트를 마취시켜 복부의 털을 깎고 포비돈으로 소독한 다음 복부 정중선을 따라 3∼4 cm 정도 개복하였다. 개복 후 절개선에서 1 cm 떨어진 우측 복막에 1×1 cm 크기로 상처부위를 만들고, 복막 상처부위에 맞닿은 막창자(cecum) 장막에 실핏줄이 터져 약간의 출혈이 맺힐 정도로 문질러서 찰과상을 유발하였다. 이후, 실시예 2에서 가교된 나노섬유 시트를 2×2 cm 크기로 잘라 상처부위를 다 덮도록 상처부위가 맞닿은 부위에 넣어 주었다. 수술이 끝난 래트에 물과 먹이를 충분히 주면서 7일간 키운 후, 희생시켜 좌하복부에 새로운 절개선을 가하여 유착 정도를 평가하였고, 그 실험 과정 및 실험 결과는 도 8에 나타내었다.The adhesion of the crosslinked nanofiber sheet to tissues was evaluated by using a long adhesion model rat as an experimental subject. Specifically, 8-week-old Sprague Dawley rats (weight: 230-280 g) in a healthy state were adapted to the laboratory for 3 days and then operated on. The rats were anesthetized and the abdomen was shaved and disinfected with povidone, followed by 3 to 4 cm of the abdominal midline. After the laparotomy, the wound was made 1 × 1 cm in the
도 8에 나타난 바와 같이, 장 유착 모델 래트는 실시예 2에서 가교된 나노섬유로 인하여 유착을 방지하는 효과를 가지는 것으로 확인된다. As shown in Fig. 8, it was confirmed that the long-adhesion model rats had the effect of preventing adhesion due to the crosslinked nanofibers in Example 2.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.It will be understood by those skilled in the art that the foregoing description of the present invention is for illustrative purposes only and that those of ordinary skill in the art can readily understand that various changes and modifications may be made without departing from the spirit or essential characteristics of the present invention. will be. It is therefore to be understood that the above-described embodiments are illustrative in all aspects and not restrictive.
Claims (17)
(b) 상기 수용성 동물 연골 유래 조직을 극성 유기 용매 및 pH 1~5인 산 용매의 혼합 용매에 첨가한 후 교반하여 용액을 제조한 후, 이를 전기방사법으로 방사하여 나노섬유 시트를 제조하는 단계; 및
(c) 상기 나노섬유 시트를 가교하는 단계를 포함하는
가교된 나노섬유 시트의 제조방법.
(a) preparing an aqueous animal cartilage derived tissue by modifying an animal cartilage derived tissue;
(b) adding the water-soluble animal cartilage-derived tissue to a mixed solvent of a polar organic solvent and an acidic solvent having a pH of 1 to 5, stirring the mixture to prepare a solution, and spinning the solution to prepare a nanofiber sheet; And
(c) crosslinking the nanofiber sheet.
A method for producing a crosslinked nanofiber sheet.
상기 가교는 카보이미드계 화합물, 알데히드계 화합물, 에폭시계 화합물 및 디이소시아네이트계 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 가교제를 포함하는 가교용액을 이용하여 수행되는
가교된 나노섬유 시트의 제조방법.
The method according to claim 1,
The crosslinking is carried out using a crosslinking solution comprising at least one crosslinking agent selected from the group consisting of a carbomide compound, an aldehyde compound, an epoxy compound and a diisocyanate compound
A method for producing a crosslinked nanofiber sheet.
상기 가교는 상기 나노섬유 시트를 가교용액에 침지하거나, 상기 나노섬유 시트에 가교용액을 초음파 분사 또는 전기방사시킴으로써 수행되는
가교된 나노섬유 시트의 제조방법.
The method according to claim 1,
The crosslinking is carried out by immersing the nanofiber sheet in a crosslinking solution or ultrasonic jetting or electrospinning a crosslinking solution on the nanofiber sheet
A method for producing a crosslinked nanofiber sheet.
(b-1) 상기 수용성 동물 연골 유래 조직에 제1 화학 작용기를 도입하고, 극성 유기 용매 및 pH 1~5인 산 용매의 혼합 용매에 첨가한 후 교반하여 제1 용액을 제조하는 단계;
(b-2) 상기 수용성 동물 연골 유래 조직에 제2 화학 작용기를 도입하고, 극성 유기 용매 및 pH 1~5인 산 용매의 혼합 용매에 첨가한 후 교반하여 제2 용액을 제조하는 단계; 및
(c) 상기 제1 용액 및 상기 제2 용액을 혼합한 후, 이를 전기방사법으로 방사와 동시에 가교하는 단계를 포함하는
가교된 나노섬유 시트의 제조방법.
(a) preparing an aqueous animal cartilage derived tissue by modifying an animal cartilage derived tissue;
(b-1) introducing a first chemical functional group into the water-soluble animal cartilage-derived tissue, adding it to a polar organic solvent and a mixed solvent of an acidic solvent having a pH of 1 to 5, and then stirring to prepare a first solution;
(b-2) introducing a second chemical functional group into the water-soluble animal cartilage-derived tissue, adding it to a polar organic solvent and a mixed solvent of an acidic solvent having a pH of 1 to 5, and then stirring to prepare a second solution; And
(c) cross-linking the first solution and the second solution after spinning it by electrospinning
A method for producing a crosslinked nanofiber sheet.
(상기 제1 화학 작용기, 상기 제2 화학 작용기)는 (알카인기, 아자이드기), (알카인기, 싸이올기), (에폭시기, 아민기), (에폭시기, 싸이올기), (아크로일기, 아민기), (아크로일기, 싸이올기) 및 (테트라진, 사이클로옥텐)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 조합인
가교된 나노섬유 시트의 제조방법.
5. The method of claim 4,
(Epoxy group, amine group), (epoxy group, thiol group), (acyl group, amine group), (acyl group, azide group) (Acyl group, thiol group), and (tetrazine, cyclooctene).
A method for producing a crosslinked nanofiber sheet.
상기 가교는 상기 제1 화학 작용기와 상기 제2 화학 작용기 간의 화학 반응을 통해 수행되는
가교된 나노섬유 시트의 제조방법.
5. The method of claim 4,
Wherein the crosslinking is carried out through a chemical reaction between the first chemical functional group and the second chemical functional group
A method for producing a crosslinked nanofiber sheet.
상기 극성 유기 용매는 헥사플루오로이소프로판올(Hexafluoroisopropanol; HFIP), 헥사플루오로프로판올(Hexafluoropropanol; HFP), 디메틸포름아미드(dimethyl formamide), 디메틸설폭시드(dimethylsulfoxide), 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 메틸렌클로라이드(methylenechloride), 아세토니트릴(acetonitrile), 테트라하이드로퓨란(tetra hydro furan) 및 에틸아세테이트(ethyl acetate)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인
가교된 나노섬유 시트의 제조방법.
The method according to claim 1 or 4,
The polar organic solvent may be at least one selected from the group consisting of hexafluoroisopropanol (HFIP), hexafluoropropanol (HFP), dimethyl formamide, dimethylsulfoxide, methanol, ethanol, At least one member selected from the group consisting of propanol, methylenechloride, acetonitrile, tetra hydrofuran and ethyl acetate,
A method for producing a crosslinked nanofiber sheet.
상기 pH 1~5인 산 용매는 0.1~1 M의 트리플루오로아세트산, 아세트산 및 포름산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인
가교된 나노섬유 시트의 제조방법.
The method according to claim 1 or 4,
The acidic solvent having a pH of 1 to 5 is preferably at least one selected from the group consisting of 0.1 to 1 M of trifluoroacetic acid, acetic acid and formic acid
A method for producing a crosslinked nanofiber sheet.
상기 극성 유기 용매 및 상기 pH 1~5인 산 용매의 부피비는 5:1 내지 10:1인
가교된 나노섬유 시트의 제조방법.
The method according to claim 1 or 4,
The volume ratio of the polar organic solvent and the acidic solvent having a pH of 1 to 5 is 5: 1 to 10: 1
A method for producing a crosslinked nanofiber sheet.
상기 용액에 대하여, 상기 수용성 동물 연골 유래 조직은 10 중량% 내지 20 중량%인
가교된 나노섬유 시트의 제조방법.
The method according to claim 1 or 4,
For the solution, the water-soluble animal cartilage derived tissue is 10 wt% to 20 wt%
A method for producing a crosslinked nanofiber sheet.
상기 용액에 극성 비양성자성 용매를 첨가하는 단계를 더 포함하는
가교된 나노섬유 시트의 제조방법.
The method according to claim 1 or 4,
Further comprising adding a polar aprotic solvent to said solution
A method for producing a crosslinked nanofiber sheet.
상기 용액에 대하여, 상기 극성 비양성자성 용매는 5 부피% 내지 15 부피%인
가교된 나노섬유 시트의 제조방법.
12. The method of claim 11,
For this solution, the polar aprotic solvent may comprise from 5 vol% to 15 vol%
A method for producing a crosslinked nanofiber sheet.
상기 방사는 방사거리 5~20 cm 이며, 전압 20~30 kV, 방출속도 1~20 ㎕/min인 조건으로 주사기 바늘의 내부 직경이 18~26 G인 주사기를 사용하여 수행되는
가교된 나노섬유 시트의 제조방법.
The method according to claim 1 or 4,
The radiation is carried out using a syringe having an inner diameter of the injector needle of 18 to 26 G under the conditions of a radiation distance of 5 to 20 cm, a voltage of 20 to 30 kV and a release rate of 1 to 20 μl / min
A method for producing a crosslinked nanofiber sheet.
상기 동물 연골 유래 조직은 돼지, 소, 양, 말 또는 고양이에서 유래한 것인
가교된 나노섬유 시트의 제조방법.
The method according to claim 1 or 4,
The animal cartilage-derived tissue is derived from pigs, cows, sheep, horses or cats
A method for producing a crosslinked nanofiber sheet.
A crosslinked nanofiber sheet produced by the process according to claims 1 or 4.
상기 가교된 나노섬유 시트에 대한 물 접촉각을 5초 동안 측정한 결과, 30° 이상의 각도를 유지하는
가교된 나노섬유 시트.
16. The method of claim 15,
As a result of measuring the water contact angle of the crosslinked nanofiber sheet for 5 seconds,
Crosslinked nanofiber sheet.
An anti-adhesion bio-sheet using the crosslinked nanofiber sheet according to claim 15.
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