KR20180025335A - Myeloma Cell Over-expressing XIAP Protein - Google Patents

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KR20180025335A
KR20180025335A KR1020160109988A KR20160109988A KR20180025335A KR 20180025335 A KR20180025335 A KR 20180025335A KR 1020160109988 A KR1020160109988 A KR 1020160109988A KR 20160109988 A KR20160109988 A KR 20160109988A KR 20180025335 A KR20180025335 A KR 20180025335A
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이영하
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김규태
이종서
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Abstract

The present invention relates to a myeloma cell overexpressing an XIAP protein and to a production method therefor. According to the present invention, the myeloma cell overexpressing the XIAP protein acquires resistance to apoptosis resulting from the inhibition of caspase-3 activation, and thus when produced as a hybridoma, the fusion efficacy thereof increases as a result of an increase in survival rate, and accordingly, the antibody-producing capability thereof increases.

Description

XIAP 단백질을 과발현하는 골수종 세포{Myeloma Cell Over-expressing XIAP Protein}Myeloma Cell Overexpressing XIAP Protein Overexpressing XIAP Protein < RTI ID = 0.0 >

본 발명은 XIAP 단백질을 과발현하는 골수종 세포와 이의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 항체를 생산하는 하이브리도마를 보다 높은 효율로 제조할 수 있는 XIAP 단백질을 과발현하는 골수종 세포 및 이의 제조방법에 관한 것이다. The present invention relates to a myeloma cell overexpressing a XIAP protein and a method for producing the same. More specifically, the present invention relates to a myeloma cell overexpressing a XIAP protein capable of producing a hybridoma producing an antibody at a higher efficiency, and a method for producing the same.

단클론항체(Monoclonal antibody)를 만드는 기술은 1975년 Kohler & Milstein에 의해 발명되었다. 항체를 생성하는 비장세포를 골수종 세포(myeloma cell)와 융합(fusion)시키는 기술로, 융합된 세포를 하이브리도마(hybridoma)라고 한다. 하이브리도마 생산에 사용되는 골수종 세포는 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase, HGPRT) 혹은 티미딘키나제(thymidine kinase, TK)가 없기 때문에 HAT(Hypoxanthine-Aminopterin-Thymine) 배지에서는 DNA 합성을 계속할 수 없어 사멸한다. 반면, 하이브리도마 세포는 HGPRT 유전자를 보유한 비장 세포와 융합되었으므로 정상세포의 샐비지 경로(salvage pathway)를 이용하여 DNA 합성을 계속할 수 있고(Arthur and Massey, 1981), HAT 배지에서도 증식하는 HAT-저항성을 지니게 되므로 융합되지 않은 골수종 세포와 선별이 가능하다. The technique of making a monoclonal antibody was invented in 1975 by Kohler & Milstein. A technique for fusion of splenocytes that produce antibodies with myeloma cells is called hybridoma. Since the myeloma cells used for hybridoma production do not have hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase (HGPRT) or thymidine kinase (TK), the HY cells (Hypoxanthine-Aminopterin-Thymine) DNA synthesis can not be continued and it will die. On the other hand, since hybridoma cells were fused with spleen cells bearing HGPRT gene, DNA synthesis can be continued using the salvage pathway of normal cells (Arthur and Massey, 1981), and HAT- It is resistant and can be distinguished from unfused myeloma cells.

이러한 하이브리도마 기술은 진단 및 치료의 목적으로 항체를 생산하기 위해 가장 널리 사용되는 기술로서 생체에서 분리한 B 림프구와 골수종 세포를 PEG(polyethylene glycol)처리 또는 전기융합(electrofusion) 방식으로 두 세포를 융합시키게 되나, PEG 처리 또는 전기융합 과정에서 세포에 손상을 초래하여 융합된 하이브리도마의 생존률이 저해되므로 융합이 매우 비효율적이고 항체를 생산하는 능력에 있어서 일관성이 없는 결과를 나타내는 문제가 있었다. 이에 따라 융합효율이 우수하고 융합된 하이브리도마의 항체 생산능력이 뛰어난 새로운 하이브리도마 생산을 위한 골수종 세포 개발의 필요성이 제기되었다. Such hybridoma technology is the most widely used technique for producing antibodies for diagnostic and therapeutic purposes. It is a technique for separating B lymphocytes and myeloma cells separated from living body into two cells by PEG (polyethylene glycol) treatment or electrofusion However, there is a problem in that the fusion is very inefficient and inconsistent in the ability to produce antibodies because the viability of fused hybridomas is impaired by causing damage to cells in the process of PEG treatment or electrofusion. Thus, there is a need for the development of myeloma cells for the production of new hybridomas with excellent fusion efficiency and excellent ability to produce antibodies of fused hybridomas.

본 발명자들은 융합효율 및 하이브리도마의 항체 생성능력이 우수한 골수종 세포를 제작하기 위하여 세포의 생존과 증식능력에 관련된 여러가지 유전자를 골수종 세포에 도입하였다. 그 중에서 XIAP(X-linked inhibitor of apoptosis) 유전자를 골수종 세포에 도입한 결과, 상기 유전자를 도입하지 않은 다른 골수종 세포에 비하여 높은 생존율과 항체(IgG) 발현율을 나타내는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.The present inventors have introduced various genes related to cell survival and proliferative capacity into myeloma cells in order to prepare myeloma cells excellent in fusion efficiency and ability to produce antibodies of hybridoma. It was confirmed that XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis) gene was introduced into myeloma cells and that it showed higher survival rate and antibody (IgG) expression ratio than other myeloma cells that did not introduce the gene.

미국특허공보 US 4720459 A는 인간/인간 하이브리도마의 생산을 위한 골수종 세포를 개시하고 있다. 상기 골수종 세포는 엡스타인 바 바이러스에서 유래한 EBNA-1 단백질과, 골수종 면역글로불린을 검출가능한 수준으로 분비하지 않고, 인간의 림프구와 융합하여 인간/인간 하이브리도마를 형성하여 지속적으로 항체를 분비할 수 있은 인간 골수종 세포를 개시하고 있다.US Patent Publication No. US 4720459 A discloses myeloma cells for the production of human / human hybridomas. The myeloma cells can secrete antibodies continuously by forming human / human hybridomas by fusing with human lymphocytes without releasing EBNA-1 protein derived from Epstein-Barr virus and myeloma immunoglobulin to a detectable level Lt; RTI ID = 0.0 > myeloma < / RTI >

또한, 미국특허출원공개공보 US 20070141064 A1은 인간 림프구 세포주와, 인간 골수종 세포주, 인간 융합 파트너 세포주 및 이들을 이용한 하이브리도마의 제조방법을 개시하고 있다. In addition, U.S. Patent Application Publication No. 20070141064 A1 discloses a human lymphocyte cell line, a human myeloma cell line, a human fusion partner cell line, and a method for producing a hybridoma using the same.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.

본 발명의 목적은 XIAP(X-linked inhibitor of apoptosis) 단백질을 과발현하는 골수종 세포(myeloma cell)를 제공하는데 있다. It is an object of the present invention to provide a myeloma cell that overexpresses an X-linked inhibitor of apoptosis (XIAP) protein.

본 발명의 다른 목적은 XIAP 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합벡터로 골수종 세포를 트랜스펙션 시키는 단계를 포함하는, XIAP 단백질을 과발현하는 골수종 세포의 제조방법을 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to provide a method for producing myeloma cells overexpressing XIAP protein, comprising transfection of myeloma cells with a recombinant vector comprising a nucleotide sequence encoding the XIAP protein.

본 발명의 또 다른 목적은 XIAP 단백질을 과발현하는 골수종 세포가 항체생산 B 림프구와 융합되어 제조된 하이브리도마(hybridoma)를 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to provide a hybridoma prepared by fusing myeloma cells overexpressing XIAP protein with antibody-producing B lymphocytes.

본 발명의 또 다른 목적은 XIAP 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합벡터를 유효성분으로 포함하는, XIAP 과발현 골수종 세포의 생산용 재조합벡터 키트를 제공하는데 있다.It is still another object of the present invention to provide a recombinant vector kit for the production of XIAP-overexpressing myeloma cells, which comprises, as an active ingredient, a recombinant vector comprising a nucleotide sequence encoding a XIAP protein.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 XIAP(X-linked inhibitor of apoptosis) 단백질을 과발현하는 골수종 세포(myeloma cell)를 제공한다.According to one aspect of the present invention, there is provided a myeloma cell that overexpresses an X-linked inhibitor of apoptosis (XIAP) protein.

또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 XIAP 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합벡터로 골수종 세포를 트랜스펙션 시키는 단계를 포함하는 XIAP 단백질을 과발현하는 골수종 세포의 제조방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is also provided a method for producing a myeloma cell overexpressing a XIAP protein, comprising transfecting a myeloma cell with a recombinant vector comprising a nucleotide sequence encoding a XIAP protein .

본 발명의 발명자들은 기존의 골수종 세포를 항체생산 B 림프구와 융합하여 하이브리도마를 제조시, 세포에 손상을 초래하여 융합된 하이브리도마의 생존률이 저하되는 문제점을 해결하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 아폽토시스(apoptosis)와 관련된 유전자인 XIAP 유전자를 골수종 세포에 도입하여 과발현시키는 경우 상기 골수종 세포의 융합시 생존율이 증가하고, 항체 생산능력이 증가함을 확인하였다.The inventors of the present invention have tried to solve the problem that the viability of fused hybridomas is lowered by causing damage to cells when fusing existing myeloma cells with antibody-producing B lymphocytes to produce hybridomas. As a result, it was confirmed that when the XIAP gene, which is a gene related to apoptosis, is introduced into myeloma cells and overexpressed, the survival rate upon fusion of the myeloma cells increases and the antibody production capacity increases.

본 명세서의 용어, “XIAP(X-linked inhibitor of apoptosis)”는 3개의 배큘로바이러스 IAP 반복 도메인과 RING 도메인에 의해 구조적으로 특징지어지는 유전자를 의미하며, 세포사 프로테아제(cell-death protease)의 직접적인 억제제 및 카스파제(Caspase)들의 중요한 조절자로 알려져 있다. The term " X-linked inhibitor of apoptosis " (XIAP) in the present specification means a gene structurally characterized by three baculovirus IAP repeat domains and a RING domain, and is directly related to cell death protease Lt; / RTI > inhibitors and caspases.

본 발명에서, 상기 카스파제(caspase)는 시스테인 프로테아제(cysteine protease)의 가족으로 ICE(interleukin-1 β converting enzyme)과 단백질가수분해효소라고도 불리우며, 아폽토시스(apoptosis), 즉 프로그램된 세포사멸사에 필수적이고, 세포의 사형을 집행하는 단백질로 알려진 효소를 말한다. 세포자살의 실행과 염증반응에 중요한 시토카인(IL-1β또는 IGIF: IFN-γ-inducing factor)의 후 처리(processing) 및 세포증식, 이동, 분화 등 많은 생리현상에 관여하는 일군의 시스테인 단백질가수분해효소를 의미한다. 카스파제는 1990년대 중반에 발견된 이후로 잠재적인 치료의 표적이 되어왔으며, 2009년 11월까지 12개의 카스파제가 사람에서 발견되었다. 세포사멸사를 일으키는 카스파제는 크게 두 종류로 나뉘게 되는데 비활성화된 effector 카스파제를 자르는 initiator 카스파제와 다른 단백질을 기질로 하여 분해시켜 사포사멸사 과정을 유발하는 effector 카스파제가 있다. 카스파아제 연쇄반응(cascade)의 억제는 카스파아제 억제제에 의해 조절되는 것으로 알려져 있다.In the present invention, the caspase is a family of cysteine proteases and is also known as ICE (interleukin-1 beta converting enzyme) and protein hydrolyzing enzyme, and it is essential for apoptosis, Refers to an enzyme known as a protein that enforces the execution of a cell. A group of cysteine proteases involved in many physiological phenomena such as cell proliferation, migration, differentiation, and processing of cytokines (IL-1β or IGIF: IFN-γ-inducing factor) Lt; / RTI > Caspase has been the target of potential therapy since its discovery in the mid-1990s, and by November 2009 12 caspases were found in humans. There are two main types of caspases that cause apoptosis. They are effector caspases that cause the initiation of apoptosis by degrading the initiator caspase and other proteins that degrade inactivated effector caspases as substrates. The inhibition of the caspase cascade is known to be regulated by caspase inhibitors.

본 명세서의 용어 “골수종 세포(myeloma cell)"는 형질세포(plasma cell)가 종양화한 것으로, 미숙형부터 성숙형까지 형태학적으로는 다양하며, 여러 가지 세포생물학적 특성에서도 다양성이 풍부하다. 이들은 임상상(像), 경과, 예후 등에도 밀접하게 관련되어 있으며, 생산하는 면역글로불린은 단클론성(monoclonal)인 것이 특징적이다. As used herein, the term " myeloma cell "refers to a tumor cell of a plasma cell, which is morphologically diverse from immature to mature, and has a wide variety of cellular biological properties. It is closely related to the clinical picture (image), progress and prognosis, and the immunoglobulin to be produced is monoclonal.

본 명세서의 용어 “하이브리도마(hybridoma)”는 골수종(myeloma) 세포와 항체생산세포와의 세포융합에 의하여 형성된 잡종 세포로 단일클론항체(monoclonal antibody)를 영속적으로 생산할 수 있는 세포이다. 밀스테인(Milstein)과 쾰러(Kohler)에 의해 1975년 최초로 제작되었으며, 이것은 106-108개 중 한 개의 빈도로 존재하는 항원특이적 항체생산세포를 분리하여 증식시킴으로써 단일클론항체(monoclonal antibody)를 생산한다는 획기적인 방법이다. 세포융합제로서 폴리에틸렌글리콜이 사용됨에 따라 하이브리도마 회수효율도 상승되고 방법도 비교적 간단하게 되었다. 하이브리도마 생산에 사용되는 골수종 세포는 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase, HGPRT) 혹은 티미딘키나제(thymidine kinase, TK)가 없는 것으로, HAT(Hypoxanthine-Aminopterin-Thymine) 배지에서는 DNA 합성을 계속할 수 없어 사멸하게 되지만, HGPRT 유전자를 보유한 비장 세포와 융합된 하이브리도마 세포는 정상세포의 샐비지 경로를 이용하여 DNA 합성을 계속할 수 있고(Arthur and Massey, 1981), HAT 배지에서도 증식하는 HAT-저항성을 지니게 되므로 융합되지 않은 골수종 세포와 선별이 가능하다. The term " hybridoma " in the present specification is a hybrid cell formed by cell fusion between a myeloma cell and an antibody producing cell, and is a cell capable of producing a monoclonal antibody per se. It was first produced by Milstein and Kohler in 1975. It is a monoclonal antibody by isolating and proliferating antigen-specific antibody-producing cells present at a frequency of 10 6 -10 8 , Is a breakthrough method. The use of polyethylene glycol as a cell fusion agent increased the hybridoma recovery efficiency and made the method relatively simple. Hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase (HGPRT) or thymidine kinase (TK) is absent in myeloma cells used for hybridoma production. Hypoxanthine-aminopterin-thymine (HAT) In the medium, DNA synthesis can not be continued, but hybridoma cells fused with spleen cells containing the HGPRT gene can continue to synthesize DNA using the salvage pathway of normal cells (Arthur and Massey, 1981), HAT It also has HAT-resistance that proliferates in the medium, so it can be screened with unfused myeloma cells.

본 명세서의 용어 “과발현(over-expression)”은 특정 유전자에 대해서 해당 유전자의 야생형 단백질의 평균 발현량에 비해 상대적으로 증가된 수준으로 해당 단백질을 발현(expression)하는 것을 의미한다. 본 발명의 경우, 야생형에 있어서의 XIAP 단백질의 평균 발현량보다 증가된 수준으로 XIAP 단백질을 발현하는 경우를 말한다. As used herein, the term " over-expression " refers to expression of a particular gene at a level that is relatively increased relative to the average expression level of the wild-type protein of the gene of interest. In the case of the present invention, it refers to a case where the XIAP protein is expressed at an increased level than the average expression amount of the XIAP protein in the wild type.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 골수종 세포는 포유류 동물 유래의 골수종 세포이며, 구체적으로는 마우스, 랫트, 햄스터, 토끼, 개, 고양이, 염소, 돼지, 소, 양, 영장류, 인간 등에서 유래한 것이며, 이들 유래의 골수종 세포로는 P3X63Ag8, p3-U1, NS-1, MPC-11, SP2/0, F0, P3x63Ag8. V653, R-210 및 S194 등이 있다. 특히 마우스 골수종 세포의 경우, IgG1을 발현하는 MOPC21 암세포에서 유래되었으며 면역글로불린(immnunoglobulin)의 H, L 체인의 발현을 제거시킨 NS0, P3-X63-Ag8.653, SP2/0-Ag14로 변형되어 융합세포주(fusion partner cell)로 많이 사용되고 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서 사용한 마우스 골수종 세포는 SP2/0-Ag14(ATCC, CRL-1581)이다. According to one embodiment of the present invention, the myeloma cell of the present invention is a myeloma cell derived from a mammalian animal, and specifically a mouse, a rat, a hamster, a rabbit, a dog, a cat, a goat, a pig, And myeloma cells derived from these are P3X63Ag8, p3-U1, NS-1, MPC-11, SP2 / 0, F0, P3x63Ag8. V653, R-210, and S194. In particular, mouse myeloma cells were transformed into NS0, P3-X63-Ag8.653, and SP2 / 0-Ag14, which were derived from MOPC21 cancer cells expressing IgG1 and eliminated immunoglobulin H, L chain expression, It is widely used as a fusion partner cell. The mouse myeloma cells used in the specific examples of the present invention are SP2 / 0-Ag14 (ATCC, CRL-1581).

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 XIAP 단백질은 상기 다양한 포유류 동물 유래의 XIAP 단백질일 수 있으며, 구체적으로는 마우스, 랫트, 햄스터, 토끼, 개, 고양이, 염소, 돼지, 소, 양, 영장류, 인간에서 유래한 XIAP 단백질이고, 가장 구체적으로는 마우스 유래 XIAP 단백질이나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to another embodiment of the present invention, the XIAP protein of the present invention may be an XIAP protein derived from the various mammalian animals, and specifically, a mouse, a rat, a hamster, a rabbit, a dog, a cat, a goat, , Primate, human-derived XIAP protein, most specifically mouse-derived XIAP protein, but is not limited thereto.

본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 XIAP 단백질은 서열번호 1에 개시된 아미노산 서열을 갖는 단백질이나, 이에 제한되는 것은 아니다. According to a specific embodiment of the present invention, the XIAP protein of the present invention is a protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.

또한, 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 XIAP 단백질을 과발현하는 골수종 세포는 아폽토시스(apoptosis) 저항성이 증가된 것을 특징으로 한다. 상기 아폽토시스 저항성의 증가는 XIAP 단백질을 과발현하지 않는 야생형의 골수종 세포의 평균적인 아폽토시스 수준과 비교하여 상대적으로 아폽토시스가 발생하지 않아 세포의 생존율이 높게 나타나는 상태를 의미하며, 본 발명의 XIAP 유전자의 과발현이 골수종 세포 내의 Caspase 3 활성화를 억제함으로써 나타난다.According to another embodiment of the present invention, the myeloma cells overexpressing the XIAP protein of the present invention are characterized by increased apoptosis resistance. The increase in the resistance to apoptosis means a state in which the cell survival rate is high due to relatively no apoptosis compared with the average level of apoptosis of wild-type myeloma cells not overexpressing the XIAP protein. The overexpression of the XIAP gene of the present invention And by inhibiting caspase 3 activation in myeloma cells.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 XIAP 유전자는 ExPASy 데이터베이스를 기반으로 유전자를 합성 후 PCR(polymerase chain reaction)법으로 증폭하고(sense primer: 5'-ggccTCTAGAgccaccatgactttcaacagtttgag-3'/antisense primer: 5'-ggccTCTAGAtcaagacatgaaaatttt-3'), PCR 정제 키트(iNtRON, Cat No. 17286)를 이용해 XIAP DNA를 정제하여 확보하였다. 마우스의 XIAP 유전자는 XbaI (NEB, R0145L) 제한효소를 이용하여 잘라낸 후 pLenti6/V5-DEST(Invitrogen, V49610)에 라이게이션(ligation)한 뒤 DH5α 숙주세포에 형질전환(transformation)하여 다량의 DNA를 확보하였다. According to a specific embodiment of the present invention, the XIAP gene of the present invention is synthesized based on the ExPASy database and amplified by polymerase chain reaction (PCR) (sense primer: 5'-ggccTCTAGAgccaccatgactttcaacagtttgag-3 '/ antisense primer: 5'-ggccTCTAGAtcaagacatgaaaatttt-3 ') and a PCR purification kit (iNtRON, Cat No. 17286). The mouse XIAP gene was cut out using restriction enzyme XbaI (NEB, R0145L), ligated to pLenti6 / V5-DEST (Invitrogen, V49610), transformed into DH5α host cells, Respectively.

본 발명에서 상기 확보한 마우스의 XIAP 유전자는 구체적으로는 서열번호 2에 개시된 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있으나, 이제 제한되는 것은 아니다. 상기 XIAP 유전자의 클로닝, 형질전환, 콜로니 선별(colony picking), XIAP 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA의 회수 등과 관련된 기술내용은 당업계에 널리 알려진 다양한 방법에 의하여 수행될 수 있다. The XIAP gene of the mouse obtained in the present invention may specifically have the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto. Techniques related to the cloning, transformation, colony picking of the XIAP gene, and recovery of plasmid DNA containing XIAP gene can be performed by various methods well known in the art.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명은 상기 수득한 XIAP 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합벡터로 골수종 세포를 트랜스펙션 시켜 XIAP 단백질을 과발현하는 골수종 세포를 제조하는 것을 특징으로 한다. According to another embodiment of the present invention, the present invention provides a method for producing myeloma cells overexpressing XIAP protein by transfection of myeloma cells with a recombinant vector comprising a nucleotide sequence encoding the XIAP protein obtained above.

본 명세서의 용어 “벡터(vector)"는 세포 내로 전달되는 DNA 단편, 핵산 분자 등을 의미하며, 상기 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재제조될 수 있으며, 용어 "전달체"와 호환하여 사용될 수 있다. "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미하며, 일반적으로 벡터에 사용되는 선별 마커(selection marker), 형광 단백질 발현 유전자 등 다양한 염기서열을 추가로 포함할 수 있다. As used herein, the term " vector "refers to a DNA fragment, nucleic acid molecule, or the like that is delivered into a cell, which can be replicated and recombinantly produced in a host cell and compatible with the term" "Expression vector" means a recombinant DNA molecule comprising a desired coding sequence and an appropriate nucleic acid sequence necessary for expressing a coding sequence operably linked in a particular host organism, A selection marker, and a fluorescent protein expression gene.

본 발명에 있어서, 본 발명의 상기 벡터는 XIAP 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으며, 상기 벡터는 구체적으로 동물세포에 발현하는 벡터이다. 상기 본 발명에 있어서, 상기 동물세포 발현벡터는 동물세포에서 상기 유전자를 전달하여 발현할 수 있는 비바이러스성 (플라스미드 또는 리포좀) 또는 바이러스성 벡터를 포함한다. 구체적으로는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노부속바이러스와 같은 바이러스성 벡터일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 렌티바이러스 벡터인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 도 1에서는 상기 XIAP를 발현하는 렌티바이러스 벡터인 pLenti6/V5-DEST를 개시하고 있으며, 이 벡터는 선별마커로 블라스티시딘(blasticidin) 및 암피실린(ampicilin)을 사용할 수 있도록 설계되어 있다.In the present invention, the vector of the present invention may comprise a nucleotide sequence encoding the XIAP protein, which is a vector expressing specifically in animal cells. In the present invention, the animal cell expression vector includes a non-viral (plasmid or liposome) or viral vector capable of expressing the gene by transferring the gene in an animal cell. Specifically, it may be a viral vector such as retrovirus, lentivirus, adenovirus, adeno-associated virus, and more specifically, it is a lentiviral vector. 1 of the present invention discloses pLenti6 / V5-DEST, a lentiviral vector expressing XIAP, which is designed to use blasticidin and ampicillin as selection markers .

본 명세서에 있어서, "트랜스펙션(transfection)"이란, 동물 세포에 DNA를 직접 도입하여 세포의 유전 형질을 변이시키는 방법을 의미하며, 본 발명의 벡터를 세포에 도입할 수 있는 방법이라면 제한이 없다.As used herein, the term "transfection " means a method of directly introducing DNA into animal cells to mutate the genetic traits of the cells. If the vector of the present invention can be introduced into cells, none.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 방법 중 XIAP 단백질은 서열번호 1에 개시된 아미노산 서열을 가진 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 XIAP 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 코돈의 축퇴성에 의한 뉴클레오티드 서열의 조합을 포함한다. 본 발명에서 상기 XIAP 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 구체적으로는 서열번호 2에 개시된 뉴클레오티드 서열을 가지는 것일 수 있다. 본 발명에서 이용되는 상기 뉴클레오티드 서열은 상기 언급된 서열번호 2에 개시된 서열 이외에 상기 뉴클레오티드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 본 발명의 뉴클레오티드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 구체적으로는 최소 90%의 상동성, 가장 구체적으로는 최소 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NBCI (National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the XIAP protein may be a protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, but the present invention is not limited thereto. The nucleotide sequence encoding the XIAP protein may be a And a combination of nucleotide sequences. In the present invention, the nucleotide sequence encoding the XIAP protein may specifically have the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2. The nucleotide sequence used in the present invention is interpreted to include a nucleotide sequence that exhibits substantial identity to the nucleotide sequence in addition to the sequence disclosed in SEQ ID NO: 2 mentioned above. The above substantial identity is obtained by aligning the nucleotide sequence of the present invention to any other sequence as much as possible and analyzing the aligned sequence using algorithms commonly used in the art, % Homology, more particularly at least 90% homology, and most particularly at least 95% homology. Alignment methods for sequence comparison are well known in the art. Various methods and algorithms for alignment are described by Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48: 443 (1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31 (1988); Higgins and Sharp, Gene 73: 237-44 (1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5: 151-3 (1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16: 10881-90 (1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8: 155-65 (1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24: 307-31 (1994). The NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-10 (1990)) is accessible from National Center for Biological Information (NBCI) It can be used in conjunction with sequence analysis programs such as blastx, tblastn and tblastx. BLSAT is available at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. A method for comparing sequence homology using this program can be found at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html.

본 발명의 XIAP 유전자는 상기한 다양한 벡터에 의해 골수종 세포로 도입될 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 상기한 렌티바이러스 벡터의 일종인 pLenti6/V5-DEST에 XIAP 유전자를 라이게이션하여 SP2/0 골수종 세포에 도입하였으며, 웨스턴블롯으로 패키징 세포(293T cell) 및 골수종 세포에서 발현되는 XIAP 단백질을 검출하였다(도 2).The XIAP gene of the present invention can be introduced into myeloma cells by the various vectors described above. In the example of the present invention, the XIAP gene was ligated to pLenti6 / V5-DEST, which is a kind of lentiviral vector, and introduced into SP2 / 0 myeloma cells. The cells were packaged in packaging cells (293T cells) and myeloma cells XIAP protein was detected (Fig. 2).

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 XIAP 유전자를 과발현하는 골수종 세포는 일반 골수종 세포에 비하여 XIAP 단백질을 최대 약 13배로 발현하는 것을 확인하였다(도 3a 및 도 3b).According to a specific embodiment of the present invention, the myeloma cells overexpressing the XIAP gene of the present invention express XIAP protein up to about 13-fold compared to normal myeloma cells (FIGS. 3A and 3B).

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 XIAP 유전자를 과발현하는 골수종 세포는 일반 골수종 세포와 비교하여 세포의 성장률은 동등하고, 세포의 생존율은 다소 우수하게 나타난다. According to another embodiment of the present invention, the myeloma cells overexpressing the XIAP gene of the present invention have the same growth rate of cells as the general myeloma cells, and the cell survival rate is somewhat superior.

또한, 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 XIAP 유전자를 과발현하는 골수종 세포는 일반 골수종 세포와 마찬가지로 HAT 민감성을 나타내어 B 림프구와 융합된 골수종 세포와 융합되지 않은 골수종 세포를 감별할 수 있으므로 항체생산을 위한 단일클론항체용 하이브리도마의 제작에 유용하게 사용할 수 있다.In addition, according to another embodiment of the present invention, the myeloma cells overexpressing the XIAP gene of the present invention can be distinguished from myeloma cells fused with B lymphocytes and myeloma cells unfused with B lymphocytes because they exhibit HAT sensitivity similar to normal myeloma cells And can be useful for the production of hybridomas for monoclonal antibodies for antibody production.

뿐만 아니라, 본 발명의 XIAP 유전자를 과발현 하는 골수종 세포는 소듐아자이드(sodium azide)에 의한 아폽토시스에 대한 저항성에 있어서, 일반 골수종 세포에 비하여 높은 생존율을 나타내며(도 6a 및 도 6b), Annexin V 염색을 통해 분석한 결과 early 및 late phase의 아폽토시스가 40% 이상 감소하여 하이브리도마 제작에 사용시 보다 높은 생존율을 기대할 수 있는 결과는 나타내었다(도 7a 및 도 7b).In addition, the myeloma cells overexpressing the XIAP gene of the present invention exhibit a higher survival rate than those of normal myeloma cells in terms of resistance to apoptosis by sodium azide (Figs. 6A and 6B), Annexin V staining The results showed that the apoptosis of early and late phases was decreased by 40% or more and a higher survival rate could be expected when used in hybridoma production (FIGS. 7A and 7B).

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 XIAP 단백질을 과발현하는 골수종 세포가 항체생산 B 림프구와 융합되어 제조된 하이브리도마(hybridoma)를 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a hybridoma prepared by fusing myeloma cells overexpressing XIAP protein with antibody-producing B lymphocytes.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 XIAP 단백질을 과발현하는 골수종 세포를 이용하여 제조한 하이브리도마는 일반 골수종 세포에 비하여 일반 마우스의 비장세포와 융합시 평균 1.36배의 생존율을 나타내었으며, 콜로니의 생성비율도 1.35배로 우수함을 확인할 수 있었다(표 4).According to a specific embodiment of the present invention, the hybridoma prepared using the myeloma cells overexpressing the XIAP protein of the present invention exhibited an average survival rate of 1.36-fold when fused with normal mouse spleen cells compared with normal myeloma cells , And the generation ratio of colonies was 1.35 times (Table 4).

또한, 본 발명의 다른 구체적인 구현예에 따르면, 상기 XIAP 단백질을 과발현하는 골수종 세포를 면역화한 마우스의 비장세포와 융합시, 일반 골수종 세포에 비하여 1.6-2.3배의 하이브리도마 콜로니를 생성하였으며(높은 생존율), 2.5-3배의 항체 생산율을 나타내어 단일클론항체 생산을 위한 하이브리도마 제작용 골수종 세포로서 매우 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있었다(도 8 내지 도 10).In addition, according to another specific embodiment of the present invention, hybridization with spleen cells of mice immunized with myeloma cells overexpressing the XIAP protein resulted in 1.6-2.3 fold of hybridoma colony compared to normal myeloma cells (high Survival rate) and antibody production rate of 2.5-3 times, indicating that it can be very useful as a myeloma cell for hybridoma production for monoclonal antibody production (FIGS. 8 to 10).

또한, 본 발명의 또 다른 구체적인 구현예에 따르면, 상기 XIAP 단백질을 발현하는 골수종 세포로 제작한 하이브리도마의 경우, XIAP 단백질을 도입하지 않았거나, XIAP 발현이 사라진 하이브리도마 세포주보다 높은 IgG 발현 수준을 나타냄을 확인할 수 있었다. In addition, according to another specific embodiment of the present invention, the hybridomas prepared from the myeloma cells expressing the XIAP protein exhibit higher IgG expression than the hybridoma cell line in which the XIAP protein is not introduced or the XIAP expression is lost In the case of the US.

본 발명의 또 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 XIAP 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합벡터를 유효성분으로 포함하는, XIAP 과발현 골수종 세포의 생산용 재조합벡터 키트를 제공한다.According to still another aspect of the present invention, there is provided a recombinant vector kit for the production of XIAP-overexpressing myeloma cells, which comprises, as an active ingredient, a recombinant vector comprising a nucleotide sequence encoding a XIAP protein.

상기 재조합벡터는 동물세포에서 상기 유전자를 전달하여 발현할 수 있는 비바이러스성 (플라스미드 또는 리포좀) 또는 바이러스성 벡터를 포함한다. 구체적으로는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노부속바이러스와 같은 바이러스성 벡터일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 렌티바이러스 벡터인 것을 특징으로 한다.The recombinant vector includes a non-viral (plasmid or liposome) or viral vector capable of expressing the gene by transferring the gene in an animal cell. Specifically, it may be a viral vector such as retrovirus, lentivirus, adenovirus, adeno-associated virus, and more specifically, it is a lentiviral vector.

본 발명의 XIAP 과발현 골수종 세포의 생산용 재조합벡터 키트에는 XIAP 유전자의 숙주세포 내 도입에 적합한 하나 또는 그 이상의 다른 구성 성분을 포함하는 조성물이 포함될 수 있고, 재조합벡터의 구조 또는 트랜스펙션 활성을 안정하게 유지시키는 완충액 또는 반응액이 추가로 포함될 수 있다. 또한, 안정성을 유지하기 위해, -80℃ 내지 4℃의 저온이 유지된 상태로 제공될 수 있다. 본 발명의 XIAP 과발현 골수종 세포의 생산용 재조합벡터 키트는 XIAP 단백질, 보다 구체적으로는 서열목록 제1 서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 제1 서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 코돈의 축퇴성에 의해 이와 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으며, 구체적으로는 서열목록 제2 서열의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. The recombinant vector kit for the production of XIAP overexpressing myeloma cells of the present invention may include a composition comprising one or more other components suitable for the intracellular introduction of the XIAP gene into a stable and stable composition or transfection activity of the recombinant vector A buffer solution or a reaction solution may be further included. Further, in order to maintain stability, a low temperature of -80 DEG C to 4 DEG C may be maintained. The recombinant vector kit for the production of the XIAP overexpressing myeloma cells of the present invention may comprise a nucleotide sequence encoding the XIAP protein, more specifically, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. In addition, the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the first sequence may comprise a nucleotide sequence substantially identical thereto by codon degeneracy, specifically, a nucleotide sequence of the second sequence listing.

본 발명의 XIAP 단백질을 과발현시키는 뉴클레오티드의 삽입 및 단백질의 발현의 목적을 보다 용이하게 달성하기 위하여, 본 발명의 재조합벡터는 상기 XIAP 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드의 증폭을 위한 PCR 프라이머를 포함할 수 있다. 구체적으로 상기 프라이머의 서열은 후술할 실시예에 개시된 염기서열과 동일한 것일 수 있으나, 이에 반드시 제한되는 것은 아니다.The recombinant vector of the present invention may include a PCR primer for amplification of the nucleotide encoding the XIAP protein in order to more easily accomplish the object of insertion of the nucleotide overexpressing the protein of the present invention and expression of the protein. Specifically, the sequence of the primer may be the same as the nucleotide sequence disclosed in the following examples, but is not limited thereto.

또한, 본 발명의 재조합벡터는 상기 XIAP 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드를 재조합벡터와 별도로 또는 이에 라이게이션(ligation)시킨 상태로 제공될 수 있다. 한편, 본 발명의 XIAP 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드를 라이게이션시키지 않은 채로 제공되는 경우에는, 본 발명의 상기 뉴클레오티드 또는 XIAP 단백질의 시험관 내 또는 생체 내에서 결합시키기 위한 성분 또는 그 위치를 탐색하기 위한 성분을 추가로 포함할 수 있다. 상기 성분은 본 발명의 XIAP 코딩 뉴클레오티드를 벡터 내에 삽입하기 위한 제한효소(restriction enzyme), 리가아제(ligase)등을 포함한다. 또한 상기 성분은 XIAP 단백질의 표지를 위한 공지의 화합물이거나, 항원-항체반응을 통한 탐색을 위하여 본 발명의 펩타이드 또는 본 발명의 XIAP 단백질과 결합하는 항체 또는 이들에 대한 2차 항체 및 이의 검출을 위한 시약일 수 있다. In addition, the recombinant vector of the present invention may be provided with the nucleotide encoding the XIAP protein separately or in ligation from the recombinant vector. Meanwhile, when the nucleotide encoding the XIAP protein of the present invention is provided without ligation, a component for binding in vitro or in vivo to the nucleotide or XIAP protein of the present invention, or a component for searching its position, May be further included. Such components include restriction enzymes, ligases and the like for inserting the XIAP coding nucleotides of the present invention into the vector. The component may also be a known compound for the labeling of XIAP proteins or may be a compound that binds to the peptide of the present invention or the XIAP protein of the invention or a secondary antibody thereto for detection through the antigen- It may be a reagent.

본 발명의 XIAP 과발현 골수종 세포의 생산용 키트는 상기 XIAP 유전자가 도입된 재조합벡터를 감염이 가능한 바이러스 입자로서 패키징하기 위한 패키징 세포주를 포함할 수 있다. 상기 패키징 세포주는 293T 세포 및 HT1080 세포 등을 비롯한 어떠한 패키징 세포도 될 수 있으나, 구체적으로는 293T 세포인 것을 특징으로 한다. 상기 XIAP 유전자가 도입된 재조합벡터는 적합한 패키징 세포에 도입 및 배양하여 XIAP 유전자가 도입된 바이러스 입자를 생산할 수 있고, 상기 생산된 XIAP 유전자 도입 바이러스 입자를 XIAP 유전자의 과발현을 유도하고자 하는 골수종 세포주에 감염시켜 본 발명의 일 양태인 XIAP 과발현 골수종 세포를 제조할 수 있다. The kit for producing XIAP overexpressing myeloma cells of the present invention may include a packaging cell line for packaging the recombinant vector into which the XIAP gene has been introduced as an infectious virus particle. The packaging cell line may be any packaging cell including 293T cell, HT1080 cell and the like, and is specifically 293T cell. The recombinant vector into which the XIAP gene has been introduced can be introduced into a suitable packaging cell and cultured to produce a virus particle into which the XIAP gene has been introduced and the produced XIAP gene can be introduced into a myeloma cell line to induce overexpression of the XIAP gene To produce XIAP overexpressing myeloma cells, which is an embodiment of the present invention.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 XIAP 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합벡터는 렌티바이러스 벡터일 수 있다. 상기 렌티바이러스 벡터는 XIAP 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 상기 벡터 내에 라이게이션시킨 후, 이를 패키징 세포에 트랜스펙션시키면 패키징된 렌티바이러스 입자가 생성된다.According to a specific embodiment of the present invention, the recombinant vector comprising the nucleotide sequence encoding the XIAP protein may be a lentiviral vector. The lentiviral vector is obtained by ligation of the nucleotide sequence encoding the XIAP protein into the vector, and then transfecting the vector into the packaging cell.

본 발명에 있어서, 본 발명의 다른 일 양태인 골수종 세포의 제조방법, 골수종 세포의 생산용 제조합벡터 키트에서 이 재조합 벡터를 포함하는 내용은 상술된 본 발명이 일 양태에 내용과 동일하므로 중복하여 설명하지 않는다.In the present invention, in the method for producing a myeloma cell and the combination kit for producing a myeloma cell according to another embodiment of the present invention, the content of the recombinant vector is the same as that of the above-described embodiment of the present invention, I do not explain.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:

본 발명은 XIAP 단백질을 과발현하는 골수종 세포 및 이의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a myeloma cell overexpressing a XIAP protein and a method for producing the same.

본 발명에 따르면, XIAP 단백질을 과발현시킨 골수종 세포는 카스파제 3(Caspase 3) 활성화 억제에 따른 아폽토시스에 대한 저항성을 획득하므로 하이브리도마로 제작할 경우 생존율의 증가로 인해 융합효율이 증가하며 그에 따라 항체생산능력이 향상되는 효과가 있다.According to the present invention, the myeloma cells overexpressing the XIAP protein obtain resistance to apoptosis due to inhibition of caspase 3 activation, so that when the hybridoma is produced, the fusion efficiency is increased due to the increase of the survival rate, The production capacity is improved.

도 1은 본 발명의 XIAP 유전자의 도입을 위해 사용되는 렌티바이러스벡터 pLenti6/V5-DEST의 벡터맵을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 XIAP 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 패키징 세포(293T) 및 XIAP 유전자를 트랜스펙션시킨 골수종 세포(SP2/0)에서의 XIAP 발현량을 웨스턴블롯으로 확인한 도이다.
도 3a 및 도 3b는 XIAP 유전자를 과발현 시켜 확보한 12종의 서브클론의 XIAP의 발현량을 비교한 도이다. GAPDH는 세포에서 발현량이 거의 일정하게 유지되는 하우스 키핑 유전자(house keeping gene)로, GAPDH 유전자의 발현량을 기준으로 비교함으로써 XIAP 유전자의 발현량을 객관적으로 정량하는 것이 가능하다.
도 4는 XIAP 유전자를 과발현 시킨 골수종 세포(SP2/XIAP)의 세포성장율, 생존율을 일반 골수종 세포(SP2/0)와 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 5a 및 도 5b는 XIAP 유전자를 과발현 시킨 골수종 세포(SP2/XIAP)와 일반 골수종 세포(SP2/0)의 HAT에 대한 민감성을 비교하기 위하여 HAT 배지에 배양한 시간에 따른 세포의 생존율 및 현미경 검경사진을 나타낸 도이다.
도 6a 및 도 6b는 XIAP 유전자를 과발현 시킨 골수종 세포(SP2/XIAP)와 일반 골수종 세포(SP2/0)의 소듐아자이드에 의한 아폽토시스에 대한 저항성을 비교하기 위하여 배양시간에 따른 세포의 생존율 및 현미경 검경사진을 나타낸 도이다.
도 7a 및 도 7b는 소듐아자이드에 의한 아폽토시스에 대한 저항성을 Annexin V 염색을 통하여 FACS로 관찰한 그래프를 나타낸 도이다.
도 8 내지 도 10은 각각 BSA, GST, hIgG를 항원으로 하여 면역시킨 마우스의 B 림프구와 본 발명의 XIAP 유전자를 과발현 시킨 골수종 세포(SP2/XIAP)를 융합하여 제조한 하이브리도마의 생존율 및 항체생산능력을 비교하여 나타낸 도이다.1 is a diagram showing a vector map of a lentivirus vector pLenti6 / V5-DEST used for introduction of the XIAP gene of the present invention.
FIG. 2 is a diagram showing Western blotting of the amount of XIAP expression in myeloma cells (SP2 / 0) in which a lentiviral vector containing the XIAP gene of the present invention is transfected with a packaging cell (293T) and an XIAP gene.
FIGS. 3A and 3B are graphs comparing the expression levels of XIAP of 12 subclones obtained by overexpressing the XIAP gene. FIG. GAPDH is a house keeping gene whose expression level is maintained almost constant in a cell. It is possible to objectively quantify the expression amount of XIAP gene by comparing the expression level of GAPDH gene based on the expression amount of GAPDH gene.
4 is a graph showing cell growth rate and survival rate of myeloma cells (SP2 / XIAP) overexpressing XIAP gene in comparison with normal myeloma cells (SP2 / 0).
FIGS. 5A and 5B are graphs showing the cell survival rate and microscopic examination of HIT-cultured cells in the HAT medium to compare the sensitivity of HAT to myeloma cells (SP2 / XIAP) and normal myeloma cells (SP2 / 0) Fig.
FIGS. 6A and 6B are graphs showing cell survival rates and microscopic changes according to incubation time in order to compare the resistance to sodium apide-induced apoptosis of myeloma cells (SP2 / XIAP) overexpressing XIAP gene and normal myeloma cells (SP2 / 0) Fig.
FIGS. 7A and 7B are graphs showing FACS observation of resistance to sodium apide-induced apoptosis through Annexin V staining. FIG.
FIGS. 8 to 10 are graphs showing the survival rates of hybridomas prepared by fusing B lymphocytes immunized with BSA, GST, and hIgG as antigens and myeloma cells (SP2 / XIAP) overexpressing the XIAP gene of the present invention, And comparing production capacities.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .

실시예Example

실시예Example 1. 융합파트너 세포의 제작(cell line 개발) 1. Fabrication of fusion partner cell (cell line development)

1-1. 유전자 1-1. gene 클로닝Cloning (Gene cloning)(Gene cloning)

마우스의 XIAP(X-linked inhibitor of apoptosis) 유전자는 ExPASy 데이터베이스를 기반으로 유전자를 합성 후 PCR(polymerase chain reaction)법으로 증폭하고(sense primer: 5'-ggccTCTAGAgccaccatgactttcaacagtttgag-3'/antisense primer: 5'-ggccTCTAGAtcaagacatgaaaatttt-3'), PCR 정제 키트(iNtRON, Cat No. 17286)를 이용해 XIAP DNA를 정제하여 확보하였다. 마우스의 XIAP 유전자는 XbaI (NEB, R0145L) 제한효소를 이용하여 잘라낸 후 pLenti6/V5-DEST(Invitrogen, V49610)에 라이게이션(ligation)한 뒤 DH5α 숙주세포에 형질전환(transformation)하여 다량의 DNA를 확보하였다.The gene of X-linked inhibitor of apoptosis (XIAP) of mouse was synthesized based on ExPASy database and amplified by polymerase chain reaction (PCR) (sense primer: 5'-ggccTCTAGAgccaccatgactttcaacagtttgag-3 '/ antisense primer: 5'- ggccTCTAGAtcaagacatgaaaatttt-3 ') and a PCR purification kit (iNtRON, Cat No. 17286). The mouse XIAP gene was cut out using restriction enzyme XbaI (NEB, R0145L), ligated to pLenti6 / V5-DEST (Invitrogen, V49610), transformed into DH5α host cells, Respectively.

1-2. 1-2. XIAPXIAP 유전자 포함 바이러스 벡터 생산 및  Gene-containing viral vector production and 역가측정Titration (Virus production and titration)(Virus production and titration)

XIAP 유전자를 포함한 렌티 바이러스 벡터를 확보하기 위해 293T 세포를 100 mm 배양용기(Corning, 430147)에 4x106 cells/10 ml로 10% FBS/DMEM 배지에 배양하여 준비하였다. Opti-MEM 배지(Gibco, 31985-070)를 500 ㎕씩 첨가한 튜브 2개를 준비하여 한 튜브에는 DNA를 VSV-G : Delta8.9 : 발현 DNA(XIAP DNA) = 1 : 1.5 : 2 (Invitrogen, K4970-00)의 비율로 섞어주고, 다른 튜브에는 리포펙타민 2000(Invitrogen, 11668-019)을 XIAP DNA : 리포펙타민 = 1:3의 비율이 되도록 미리 준비하였다. 두 튜브는 따로 상온에서 5분간 반응 후 리포펙타민 혼합액을 DNA 튜브로 옮겨 조심스럽게 섞어준 뒤 상온에서 20분간 추가 반응하였다. 준비된 293T 세포는 24시간 배양 후 트랜스펙션(transfection)을 위하여 Opti-MEM 배지로 5 ml 교체하고 DNA 및 리포펙타민 혼합액을 세포에 천천히 떨어뜨려 트랜스펙션을 진행하였다. 8시간 후 10% FBS/DMEM 배지로 교체하고 48시간 동안 배양하여 배양상층액의 렌티바이러스를 확보한 다음, Lenti-X concentrator(Takara, 631231)를 이용하여 렌티바이러스를 10배 농축하였다.293T cells were prepared in a 10 mM FBS / DMEM medium at 4 × 10 6 cells / 10 ml in a 100 mm culture dish (Corning, 430147) in order to obtain a lentiviral vector containing the XIAP gene. Two tubes containing 500 μl of Opti-MEM medium (Gibco, 31985-070) were prepared. One tube contained DNA in VSV-G: Delta8.9: expression DNA (XIAP DNA) = 1: 1.5: , K4970-00). Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668-019) was added to the other tube in advance so as to have a ratio of XIAP DNA: lipofectamine = 1: 3. After incubation for 5 minutes at room temperature, the lipofectamine mixture was transferred to a DNA tube and carefully mixed. The reaction was further continued at room temperature for 20 minutes. The prepared 293T cells were incubated for 24 hours, then transfected with 5 ml of Opti-MEM medium, and the DNA and lipofectamine mixture were slowly added to the cells for transfection. After 8 hours, the medium was replaced with 10% FBS / DMEM medium and cultured for 48 hours to obtain lentivirus of culture supernatant. Lentivirus was concentrated 10 times using Lenti-X concentrator (Takara, 631231).

제작된 렌티바이러스의 역가를 측정하기 위해 하루 전날 A549 세포를 6 웰 플레이트(Corning, 3516)에 2x105 cells로 준비하였다. 바이러스 감염을 위해 배지를 제거하고 6 ㎍/ml 폴리브렌(polybrene) (Sigma, H9268-5G)이 포함된 바이러스 상층액를 희석하여(10:1, 10:2, 10:3, 10:4, 10:5)하여 넣어주었다. 24시간 후 새로운 배지로 교체하고 추가로 24시간 배양하였다. pLenti6/V5-DEST 벡터의 선별마커(selection marker)인 블라스티시딘(blasticidin) (Gibco/R210-01, 10ug/ml)이 포함된 배지로 교체하면서 약 20일간 배양하였다. 20일간 배양 후 바이러스 역가를 측정하기 위해 크리스탈 바이올렛 용액(crystal violet solution) (Sigma/V5265-250ML) 1 ml를 넣어주고 30분간 상온에서 염색하였다. 염색된 콜로니 수를 세어 XIAP 유전자가 포함된 렌티바이러스의 역가를 계산하였다. To measure the titer of the lentivirus, A549 cells were prepared on a day before 6-well plate (Corning, 3516) at 2 × 10 5 cells. The medium was removed for virus infection and the virus supernatant containing 10 μg / ml polybrene (Sigma, H9268-5G) was diluted (10: 1, 10: 2, 10: : 5). After 24 hours, the medium was replaced with fresh medium and cultured for an additional 24 hours. and cultured for about 20 days while being replaced with a medium containing blasticidin (Gibco / R210-01, 10 ug / ml), which is a selection marker of pLenti6 / V5-DEST vector. After incubation for 20 days, 1 ml of crystal violet solution (Sigma / V5265-250ML) was added to measure virus titer and stained at room temperature for 30 minutes. The number of stained colonies was counted to calculate the titer of the lentivirus containing the XIAP gene.

1-3. SP2/0 골수종 세포에 바이러스 도입(Virus transduction in SP2/0)1-3. Virus transduction in SP2 / 0 cells in SP2 / 0 myeloma cells

XIAP 유전자를 골수종 세포에 트랜스펙션 시키기 위하여 마우스 골수종 세포인 SP2/0 세포를 배양하고 트랜스펙션을 수행하는 당일에 배지를 제거한 후 배지와 함께 상기 1-2에서 제조한 XIAP 유전자가 포함된 렌티바이러스를 MOI (1, 2, 5, 10)로 SP2/0 세포에 넣어준 다음, 폴리브렌(polybrene)을 최종 6 ㎍/ml의 농도로 넣어준 뒤 37℃, CO2 배양기에서 배양하였다. 다음 날 렌티바이러스가 포함된 샘플을 제거해 준 뒤 새로운 배지로 교체하고 24시간 후에 pLenti6/V5-DEST 벡터의 선별마커인 블라스티시딘(최종 농도 10 ㎍/ml)을 넣은 배지로 교체한 후, 14-21일 이 될 때까지 2-3 일마다 한 번씩 교체하며 배양하였다. 배양 중 블라스티시딘에 의해 바이러스가 트랜스펙션된 골수종 세포가 확인되면 한계희석법(limiting dilution)으로 희석하여 단일 세포로 클로날 셀렉션(clonal selection)을 진행하였다. 그 후 각각의 단일 세포를 배양한 후 세포 용해물(RIPA Lysis and Extraction Buffer, Na3VO4 100mM + NaF(0.5M) + PMSF(100mM) + 프로테아제 억제제 (1X), Cat. 89900))을 만들어 XIAP 단백질의 발현 여부를 판단한 후 최종 XIAP 과발현 골수종 세포주를 선별하였다.In order to transfect the XIAP gene into myeloma cells, SP2 / 0 cells as mouse myeloma cells were cultured and the medium was removed on the day of transfection. Then, the medium was lysed with the medium containing the XIAP gene prepared in 1-2 above The virus was transferred to SP2 / 0 cells with MOI (1, 2, 5, 10) and polybrene was added to the final concentration of 6 ㎍ / ml and cultured in a CO 2 incubator at 37 ° C. The next day, the sample containing lentivirus was removed and replaced with fresh medium. After 24 hours, the medium was replaced with a medium containing blasticidin (final concentration 10 / / ml), which is a selection marker for pLenti6 / V5-DEST vector, They were cultured alternately every 2-3 days until 14-21 days. When myeloma cells transfected with viral strains were identified by culture with blasticidin, clonal selection was performed by single cell dilution with limiting dilution. After each single cell was cultured, a cell lysate (RIPA Lysis and Extraction Buffer, Na3VO4 100 mM NaF (0.5 M) + PMSF (100 mM) + protease inhibitor (1X), Cat. 89900) And the final XIAP overexpressing myeloma cell line was selected.

상기 293T 세포와 SP2/0 세포에서의 XIAP 단백질의 발현 결과는 도 2에 나타내었다.The results of expression of the XIAP protein in the 293T cells and the SP2 / 0 cells are shown in FIG.

실시예 2. XIAP 과발현 세포주의 특성분석Example 2. Characterization of XIAP overexpressing cell line

2-1. XIAP 과발현 클론 선별 및 XIAP 단백질 발현 분석2-1. XIAP overexpression clone selection and XIAP protein expression analysis

XIAP 단백질이 과발현된 SP2/XIAP 풀(pool) 세포에서 XIAP 발현량이 높은 단클론의 세포주를 확보하기 위하여, 한계희석법을 이용해 12종의 서브클론(subclone)을 확보하고, 각 서브클론의 XIAP 발현량을 웨스턴블롯을 이용하여 확인하였다. 먼저 각 서브클론의 세포를 10 ml의 1X PBS로 2회 세척한 후 프로테아제 억제제(Sigma, P8340)가 포함된 1X RIPA buffer (Biosolution, BR002)를 이용하여 세포용해물(lysate)을 수득하였다. BCA 단백질 어세이 킷트(BCA protein assay kit) (Pierce, 23227)를 이용하여 세포 용해물 내 XIAP 단백질의 농도를 측정하였다. 각 서브클론의 세포용해물 30 ㎍을 12% SDS-PAGE로 분리하고 NC 멤브레인에 옮겨주었다. 비특이 반응을 줄이기 위하여 NC 멤브레인을 블로킹 버퍼(1X PBS/5% 스킴 밀크)로 상온에서 1시간 동안 블로킹하였고, 1X TBS/T로 5분씩 3회 세척 후, 상기 블로킹 버퍼에 1차 항체인 래빗(Rabbit) 항-XIAP(Santa Cruz, sc-55551)는 1:1000으로, 로딩 대조군(loading control)인 마우스 항-GAPDH(Abcam, ab9484)는 1:2000으로 희석한 후 4℃에서 하룻밤(over-night) 반응시켰다. 1X TBST로 3회 세척 후 이차항체 항-래빗 IgG-HRP(AbClon, Abc-5003)와 항-마우스 IgG-HRP(AbClon, Abc-5001)을 1:5000으로 희석하여 상온에서 2시간 반응하여 결합시켰다. 3회 세척 후 AbSignal 기질(Abclon, Abc-3001)을 처리하여 각 서브클론의 발광정도를 ChemiDocTM Touch Imaging system을 이용하여 확인하였고, Image Lab 분석 프로그램을 이용하여 상대적인 발현 양을 수치화시켜 분석하였다. To obtain a monoclonal cell line with a high expression level of XIAP in SP2 / XIAP pool cells overexpressing XIAP protein, 12 subclones were obtained by limiting dilution and XIAP expression level of each subclone was determined And confirmed by Western blotting. Cells of each subclone were washed twice with 10 ml of 1X PBS and lysates were obtained using 1X RIPA buffer (Biosolution, BR002) containing protease inhibitor (Sigma, P8340). The concentration of XIAP protein in the cell lysate was measured using a BCA protein assay kit (Pierce, 23227). 30 μg of each subclone cell lysate was separated by 12% SDS-PAGE and transferred to NC membrane. To reduce nonspecific reactions, the NC membrane was blocked with blocking buffer (1X PBS / 5% skim milk) at room temperature for 1 hour, washed 3 times with 1X TBS / T for 5 minutes, GAPDH (Abcam, ab9484), a loading control, was diluted 1: 2000 and then incubated overnight at 4 ° C in the presence of 1: 1000 rabbit anti-XIAP (Santa Cruz, sc-55551) -night). After washing three times with 1X TBST, secondary antibody anti-rabbit IgG-HRP (AbClon, Abc-5003) and anti-mouse IgG-HRP (AbClon, Abc-5001) were diluted 1: 5000 and reacted at room temperature for 2 hours . After washing three times, the abscissa substrate (Abclon, Abc-3001) was treated and the degree of luminescence of each subclone was confirmed by using ChemiDoc TM Touch Imaging system and the relative expression amount was quantified by Image Lab analysis program.

결과는 도 3a 및 도 3b에 나타내었다.The results are shown in FIGS. 3A and 3B.

상기 도 3a 및 도 3b에 나타낸 바와 같이, XIAP에서 확보한 12종의 서브클론 중 #3E4와 #5E11 클론에서 XIAP의 발현이 가장 높게 확인되었으며 SP2/0의 GAPDH 대비 XIAP의 발현양을 1로 보았을 때 #3E4 clone은 약 13배, #5E11 clone은 약 2.5배 높은 발현율이 나타나는 것을 확인하였다. 상기 결과로부터 XIAP 발현이 상대적으로 가장 높은 #3E4 클론을 선택하여 이후의 실험을 진행하였고 이를 SP2/XIAP로 명명하였다.As shown in FIGS. 3A and 3B, the expression of XIAP was highest in the # 3E4 and # 5E11 clones among the 12 subclones obtained in the XIAP, and the expression level of XIAP versus GAPDH in SP2 / 0 was 1 , The expression level of the # 3E4 clone was about 13 times higher than that of the # 5E11 clone. From the above results, the # 3E4 clone with the highest expression of XIAP was selected and the subsequent experiments were carried out and named SP2 / XIAP.

2-2. XIAP 과발현 골수종 세포의 세포생존율 및 HAT 민감성 확인2-2. Cell viability and HAT sensitivity of XIAP overexpressing myeloma cells

상기 2-1에서 제작한 본 발명의 SP2/XIAP의 특성을 확인하기 위하여, 세포생장곡선과 생존율을 확인하였다. SP2/0와 SP2/XIAP 세포를 100 mm 배양용기에 0.5x105/ml로 10 ml씩 분주한 후 6일차까지 매일 수거하여 배양 상층액 10 ㎕와 트립판 블루용액(Trypan Blue Solution) (Gibco, 15250-061)을 1:1로 섞어 Luna automated cell counter(Logos, L10001)기기를 이용해 생존한 세포의 밀도(viable cell density)와 생존율(viability, %)를 측정하였다. In order to confirm the characteristics of SP2 / XIAP of the present invention prepared in the above 2-1, cell growth curve and survival rate were confirmed. SP2 / 0 and SP2 / XIAP cells were dispensed in a 100-mm culture container at a concentration of 0.5 × 10 5 / ml in 10 ml each day. The culture supernatant (10 μl) and trypan blue solution (Gibco, Viable cell density and viability (%) of the surviving cells were measured using a Luna automated cell counter (Logos, L10001) instrument.

결과는 표 1과 표 2, 도 4에 나타내었다.The results are shown in Tables 1 and 2 and FIG.

Figure pat00001
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Figure pat00002
Figure pat00002

상기 표 1, 표 2 및 도 4에 나타낸 바와 같이, SP2/0와 SP2/XIAP의 세포 성장율은 동등하였으나(표 1 및 도 4의 하단 그래프), 생존율(viability)을 비교한 결과 SP2/0보다 SP2/XIAP에서 5-6일차에서 상대적으로 높은 생존율이 확인되었다(표 2 및 도 4의 상단 그래프). As shown in Tables 1, 2 and 4, the cell growth rates of SP2 / 0 and SP2 / XIAP were equal (Table 1 and lower graph of FIG. 4) A relatively high survival rate was observed at 5-6 days in SP2 / XIAP (upper graph in Table 2 and Fig. 4).

또한, 골수종 세포의 가장 큰 특성인 HAT 민감성을 확인하기 위하여, HAT가 함유된 배지에서의 세포 생존력을 확인하였다. SP2/0와 SP2/XIAP 세포를 96웰 플레이트에 2.5x105/ml, 100 ㎕씩 분주하여 10% DMEM 및 HAT(Sigma, H0262)가 포함된 DMEM 배지에 배양하였다. 배양 후 24, 48, 및 72시간에 CCK-8(Dojindo, CK-04-13)를 배양액의 10%로 첨가한 후 37℃에서 3시간 동안 반응시킨 다음, 분광광도계(PerkinElmer, Cat. No. 2030-0030)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한 육안으로 관찰하기 위해 현미경으로도 검경하였다. In addition, to confirm HAT sensitivity, which is the greatest characteristic of myeloma cells, cell viability in HAT-containing medium was confirmed. SP2 / 0 and SP2 / XIAP cells were plated in a 96 well plate at 2.5 × 10 5 / ml in a volume of 100 μl, and cultured in a DMEM medium containing 10% DMEM and HAT (Sigma, H0262). CCK-8 (Dojindo, CK-04-13) was added at 10% of the culture at 24, 48, and 72 hours after the incubation, followed by reaction at 37 ° C for 3 hours. Then, a spectrophotometer (PerkinElmer, Cat. 2030-0030). The absorbance at 450 nm was measured. It was also examined microscopically for visual observation.

결과는 표 3, 도 5a 및 도 5b에 나타내었다.The results are shown in Table 3, Figs. 5A and 5B.

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상기 표 3 및 도 5a에 나타낸 세포생존율과, 도 4b에 나타낸 현미경으로 세포를 관찰한 결과로부터, 본 발명의 XIAP가 과발현된 SP2/XIAP도 SP2/0와 동일한 수준으로 HAT에 대한 민감성을 가진다는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 SP2/XIAP에는 HAT에 대한 저항성이 없는 것을 확인하였다.From the cell viability shown in Table 3 and FIG. 5A and the result of observing the cells under the microscope shown in FIG. 4B, the SP2 / XIAP overexpressing XIAP of the present invention had sensitivity to HAT at the same level as SP2 / 0 Respectively. Therefore, it was confirmed that the SP2 / XIAP of the present invention had no resistance to HAT.

2-3. 2-3. XIAPXIAP 과발현 골수종 세포의  Overexpressing myeloma cells 아폽토시스Apoptosis (( ApoptosisApoptosis ) 저항성 확인) Resistance check

소듐아자이드(sodium azide)에On sodium azide 의한  by 아폽토시스Apoptosis 저항성 확인 Resistance check

본 발명의 XIAP가 과발현된 골수종 세포주(SP2/XIAP)의 아폽토시스 저항성을 확인하기 위하여, 대사억제제(metabolic inhibitor)인 소듐아자이드(sodium azide)를 처리한 그룹과 처리하지 않은 그룹의 세포생존율을 관찰하였다. SP2/0와 SP2/XIAP를 10% FBS/DMEM 배지로 2.5x105/ml로 희석하여 96웰 플레이트(Corning, 3596)에 100 ㎕씩 분주하였다. 소듐아자이드(Sigma, S2002)를 10% FBS/DMEM 배지에 각각 4, 8 mM 농도로 첨가하고 0.2 ㎛의 주사기 필터(Sartorius, 16534-K)로 여과한 후 각 웰에 10% FBS/DMEM 배지를 100 ㎕씩 분주하여 최종 2, 4 mM의 농도로 넣어주었다. 소듐아자이드를 처리하지 않은 대조군 그룹은 10% FBS/DMEM 배지를 100ul씩 추가 분주하였다. 소듐아자이드를 처리한지 24, 48시간에 CCK-8(Dojindo, CK-04-13)를 배양액의 10%로 첨가하였다. 37℃에서 3시간 반응 후 분광광도계(Perkin Elmer, Cat. No. 2030-0030)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한 육안으로도 관찰하기 위해 현미경으로 검경하였다. In order to confirm the apoptotic resistance of XIAP-overexpressed myeloma cell line (SP2 / XIAP) of the present invention, the cell survival rate of the group treated with sodium azide, which is a metabolic inhibitor, and the group treated with sodium azide were observed Respectively. SP2 / 0 and SP2 / XIAP were diluted to 2.5x10 < 5 > / ml with 10% FBS / DMEM medium and 100 [mu] l were dispensed into 96 well plates (Corning, 3596). Sodium azide (Sigma, S2002) was added to 10% FBS / DMEM medium at a concentration of 4 and 8 mM, and the mixture was filtered through a 0.2 μm syringe filter (Sartorius, 16534-K) Was added to each well at a final concentration of 2, 4 mM. The control group without sodium azide was added with 100 ul of 10% FBS / DMEM medium. CCK-8 (Dojindo, CK-04-13) was added to 10% of the culture at 24 and 48 hours after treatment with sodium azide. After incubation at 37 ° C for 3 hours, the absorbance was measured at 450 nm using a spectrophotometer (Perkin Elmer, Cat. No. 2030-0030). It was also examined under a microscope for visual observation.

결과는 도 6a 및 도 6b에 나타내었다.The results are shown in Figs. 6A and 6B.

상기 도 6a에 나타낸 바와 같이, 소듐아자이드를 처리하지 않은 그룹의 세포생존율을 100%로 보았을 때 SP2/0 는 소듐아자이드 처리 24시간 후 생존율이 2% 까지 급격히 저하되었지만, SP2/XIAP는 소듐아자이드 처리 48시간까지 생존율이 20%까지 유지되는 것을 확인하였다. 현미경에서도 SP2/XIAP는 소듐아자이드 처리 48시간까지 살아있는 세포가 다수 관찰되었다(도 6b). 따라서, SP2/XIAP가 SP2/0 세포주보다 아폽토시스에 대한 저항성이 있는 것으로 확인할 수 있었다.As shown in FIG. 6A, when the cell viability of the group not treated with sodium azide was taken as 100%, the survival rate of SP2 / 0 rapidly decreased to 2% after 24 hours of treatment with sodium azide, but SP2 / It was confirmed that the survival rate was maintained at 20% until 48 hours of azide treatment. In the microscope, SP2 / XIAP also showed a number of viable cells up to 48 hours of sodium azide treatment (Fig. 6b). Therefore, it was confirmed that SP2 / XIAP is more resistant to apoptosis than SP2 / 0 cell line.

AnnexinAnnexin V 염색을 통한  Through V-staining 아폽토시스Apoptosis 저항성 확인 Resistance check

또한, 상기 두 세포주의 소듐아자이드에 의한 아폽토시스 저항성을 FACS(Fluorescence activated cell sorter)로 관찰하였다. 상기와 동일한 두 세포주(SP2/0, SP2/XIAP)에 0.5% 소듐아자이드를 6시간 처리한 후 Annexin V(SouthernBiothed, 10010-02) 염색을 통하여 아폽토시스를 관찰하였다. In addition, the apoptosis resistance of the two cell lines by sodium azide was observed by fluorescence activated cell sorter (FACS). Two cell lines (SP2 / 0, SP2 / XIAP) as described above were treated with 0.5% sodium azide for 6 hours and observed for apoptosis through Annexin V (Southern Biothed, 10010-02) staining.

결과는 도 7a 및 도 7b에 나타내었다.The results are shown in Figs. 7A and 7B.

상기 도 7a 및 도 7b에 나타낸 바와 같이, SP2/XIAP 세포주에서 early 및 late phase의 아폽토시스가 40% 이상 감소하여, 아폽토시스가 저해되는 것을 확인할 수 있었다.As shown in FIGS. 7A and 7B, apoptosis of early and late phases was decreased by 40% or more in the SP2 / XIAP cell line, and it was confirmed that apoptosis was inhibited.

SP2/SP2 / XIAP의Of XIAP 아폽토시스Apoptosis 저항성의 메커니즘 확인( Identification of Mechanism of Resistance ( CaspaseCaspase 3 활성화 억제) 3 activation inhibition)

SP2/XIAP의 apoptosis 저항성을 확인하기 위해서 effector caspase인 Caspase-3 활성화 억제능력을 웨스턴블롯을 수행하였다. 6웰 플레이트(Corning, 3516)에 SP2/0, SP2/XIAP 세포를 10% FBS/DMEM 배지에 1x106/ml로 희석하여 1 ml씩 분주하였다. 수용성-덱사메타손(water soluble-Dexamethasone, DXM)(Sigma, D2915)을 10% FBS/DMEM 배지에 200 μM의 농도로 녹이고 0.2 ㎛ 주사기 필터(Sartorius, 16534-K)로 여과한 후 각 최종농도가 100 μM이 되도록 웰에 1 ml씩 분주하였다. 덱사메타손 처리 후 1, 2, 4, 8시간에 세포를 회수하여 1X PBS로 2회 세척 후 프로테아제 억제제(Sigma, P8340)가 포함된 1X RIPA buffer (Biosolution, BR002)를 이용하여 세포용해물을 수득하여 BCA 단백질 어세이 키트(Pierce, 23227)를 이용하여 농도를 측정하였다. 각 세포용해물 30 ㎍을 12% SDS-PAGE로 분리하고 NC 멤브레인에 옮겼다. 멤브레인은 비특이 반응을 줄이기 위해 블로킹 버퍼(1X PBS/5% 스킴 밀크)로 상온에서 1시간 동안 블로킹하였고 1X TBS/T로 5분씩 3회 세척 후 상기 블로킹 버퍼에 일차항체인 래빗 항-Caspase 3(Cell signaling technology, 9665)를 1:2000으로, 로딩 대조군(loading control)인 래빗 항-β 액틴(AbClon, Abc-2002)을 1:2500으로 희석 후 4℃에서 하룻밤(over-night) 반응시켰다. 1X TBST로 3회 세척 후 이차항체인 항-래빗 IgG-HRP(AbClon, Abc-5003)를 1:5000으로 희석하여 상온에서 2시간 반응하여 결합시켰다. 3회 세척 후 AbSignal 기질(Abclon, Abc-3001)을 처리하여 각 세포주의 발광정도를 ChemiDocTM Touch Imaging system을 이용하여 확인하였다. SP2/0에서는 덱사메타손을 처리한 후 4시간부터 활성화 형태인 cleaved caspase 3의 양이 증가하지만, SP2/XIAP에서는 덱사메타손 처리 8시간 후부터 cleaved caspase 3 가 증가하는 것을 관찰하였다. 따라서, SP2/XIAP 세포주는 caspase 3의 활성화를 억제함으로써 아폽토시스에 대한 저항성을 나타냄을 확인할 수 있었다.To confirm apoptosis resistance of SP2 / XIAP, Western blotting was performed to inhibit caspase-3 activation, an effector caspase. SP2 / 0 and SP2 / XIAP cells were diluted 1 × 10 6 / ml in 10% FBS / DMEM medium in a 6-well plate (Corning, 3516) and dispensed in 1 ml each. Water soluble-Dexamethasone (DXM) (Sigma, D2915) was dissolved in a 10% FBS / DMEM medium at a concentration of 200 μM and filtered through a 0.2 μm syringe filter (Sartorius, 16534-K) lt; RTI ID = 0.0 > uM. < / RTI > Cells were harvested at 1, 2, 4, and 8 hours after dexamethasone treatment, washed twice with 1X PBS, and lysed with 1X RIPA buffer (Biosolution, BR002) containing protease inhibitor (Sigma, P8340) The concentration was measured using a BCA protein assay kit (Pierce, 23227). 30 μg of each cell lysate was separated by 12% SDS-PAGE and transferred to NC membrane. The membranes were blocked with blocking buffer (1X PBS / 5% skim milk) for 1 hour at room temperature, washed three times for 5 minutes each with 1X TBS / T, and then incubated in the blocking buffer with rabbit anti- Rabbit anti-beta actin (AbClon, Abc-2002) as a loading control was diluted to 1: 2500 with 1: 2000 cell signaling technology (9665) and reacted overnight at 4 ° C . After washing three times with 1X TBST, the secondary antibody anti-Rabbit IgG-HRP (AbClon, Abc-5003) was diluted 1: 5000 and reacted at room temperature for 2 hours. After washing three times, the AbSignal substrate (Abclon, Abc-3001) was treated and the degree of luminescence of each cell line was confirmed using ChemiDoc TM Touch Imaging system. In SP2 / 0, the amount of cleaved caspase 3 increased from 4 hours after dexamethasone treatment, but cleaved caspase 3 increased from 8 hours after dexamethasone treatment in SP2 / XIAP. Therefore, it was confirmed that the SP2 / XIAP cell line exhibited resistance to apoptosis by inhibiting activation of caspase 3.

실시예Example 3.  3. XIAPXIAP 과발현 골수종 세포를 이용한  Overexpressing myeloma cells 하이브리도마Hybridoma 제작 및 세포융합 효율(Fusion efficacy) 확인 Production and confirmation of cell fusion efficiency (Fusion efficacy)

아폽토시스 저항성이 확인된 SP2/XIAP 골수종 세포의 세포융합 효율(fusion efficacy)을 확인하기 위하여 일반 마우스의 비장세포(normal mouse spleen cell)와 면역화한 마우스의 비장세포(immunized mouse spleen cell)를 SP2/XIAP 골수종 세포와 융합하였다. In order to confirm the fusion efficacy of SP2 / XIAP myeloma cells with confirmed apoptosis resistance, normal mouse spleen cells and immunized mouse spleen cells were immunized with SP2 / XIAP Fused with myeloma cells.

3-1. 마우스의 면역화(immunization)3-1. Immunization of mice

마우스 면역에 사용된 단백질은 BSA(Millipore, 82-100-6), GST, hIgG이고, BALB/c 마우스 1마리 당 각각의 단백질 100 ㎍을 어주번트(Sigma, P5506)와 혼합하여 복강으로(intraperitoneal, IP) 주사하였다. 2주 후 동일한 항원 100 ㎍을 1X PBS에 섞어 복강 주사하여 면역반응을 증가(boosting)시키고 3일 뒤 생쥐의 비장을 떼어내어 B 림프구를 분리하였다. The proteins used for mouse immunization were BSA (Millipore, 82-100-6), GST, hIgG, and 100 ug of each protein per BALB / c mouse was mixed with adjuvant (Sigma, P5506) , IP). Two weeks later, 100 μg of the same antigen was mixed with 1 × PBS, and the immune response was boosted by intraperitoneal injection. Three days later, the spleen of the mouse was removed to separate the B lymphocytes.

3-2. 세포융합(Fusion)3-2. Cell fusion (Fusion)

분리한 B 림프구는 마우스 림프종 세포인 SP2/0-Ag14(ATCC, CRL-1581) 또는 본 발명의 XIAP를 과발현시킨 SP2/XIAP 세포주와 5:1로 섞고, PEG-1500(Roche, 783641) 용액을 이용하여 융합시켰다. The isolated B lymphocytes were mixed with mouse lymphoma cells SP2 / 0-Ag14 (ATCC, CRL-1581) or SP2 / XIAP cell line overexpressing the XIAP of the present invention at a ratio of 5: 1 and a solution of PEG-1500 (Roche, 783641) .

3-3. HAT 선별(HAT selection)3-3. HAT selection (HAT selection)

융합된 세포는 하이포크산틴(hypoxanthin), 아미노프테린(aminopterine), 티미딘(thymidine)이 첨가되어 있는 HAT 배지(HAT supplement, Sigma, H0262) 에 배양하여 선별하였다. 골수종과 B 림프구가 융합된 세포(hybridoma)를 HAT 배지에 배양한지 5일째에 각 웰을 현미경으로 관찰하여 군집을 이루어 자라는 하이브리도마 콜로니 수를 계수하여 하이브리도마의 생성율을 비교하였다. Fused cells were cultured in HAT medium (HAT supplement, Sigma, H0262) supplemented with hypoxanthin, aminopterine, and thymidine. On the 5th day after hybridoma cells fused with myeloma and B lymphocytes were cultured in HAT medium, hybridization colonies were counted by counting the number of hybridoma colonies growing in the clusters by observing each well with a microscope.

상기 결과는 표 4와 도 8 내지 도 10에 나타내었다.The results are shown in Table 4 and Figs. 8 to 10.

Figure pat00004
Figure pat00004

상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 일반 마우스 비장세포를 SP2/0와 SP2/XIAP 세포와 융합 후 생성된 하이브리도마 콜로니를 계수한 결과 SP2/0로 융합한 그룹보다 SP2/XIAP 세포를 이용하여 융합한 그룹이 평균 1.4배 많은 하이브리도마를 생산하는 것을 확인하였다. As shown in Table 4, when hybridoma colonies generated after fusion of SP2 / 0 and SP2 / XIAP cells were counted, SP2 / XIAP cells were used for fusion One group was found to produce an average of 1.4 times more hybridomas.

또한, 도 8 내지 도 10에 나타낸 바와 같이, 면역한 마우스 비장세포를 이용하여 융합하였을 때는 SP2/0를 이용한 그룹보다 SP2/XIAP를 이용한 그룹에서 1.6배에서 2.3배 많은 하이브리도마 콜로니를 생성함을 관찰할 수 있었다(도 8 내지 도 10의 total colony). In addition, as shown in Figs. 8 to 10, when the immunized mouse spleen cells were fused, 1.6 to 2.3 times more hybridoma colonies were produced in the SP2 / XIAP group than in the SP2 / 0 group (Total colony of Figs. 8 to 10).

3-4. 항체생성 하이브리도마의 스크리닝(Screening)3-4. Screening of antibody-producing hybridomas

항원과 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마만을 스크리닝하기 위하여, 상기 3-3에서 선별한 하이브리도마를 7일 동안 추가배양한 후 indirect ELISA 방법을 이용해 항체를 생산하는 하이브리도마 세포인지 확인하였다. 먼저 각 항원을 1㎍/mL의 농도로 웰당 50 ㎕씩 half area 96웰 ELISA 플레이트(Corning, 3690)에 분주한 후 4℃에서 하룻밤 코팅하였다. TBS-T(0.05% Triton X-100)로 3회 세척한 후 200 ㎕의 TBS-T/SM(2% 스킴 밀크)로 상온에서 30분 동안 블로킹하였고, 블로킹한 플레이트를 3회 세척 후 하이브리도마 배양액 샘플을 넣고 37℃에서 2시간 동안 항원-항체 반응을 유도하였다. 플레이트를 3회 세척한 후 이차 항체로 항-마우스 IgG-HRP(AbClon, Abc-5001)을 TBS-T/SM에 1:10,000으로 희석하여 넣고 37℃에서 1시간 동안 항체를 결합시켰다. 플레이트를 3회 세척한 후 TMB 용액(Biofx, TMBC-1000)를 넣고 상온에서 20분간 발색하였으며, 1N 농도의 황산(DukSan, 254)을 첨가하여 발색을 정지한 후 분광광도계(Perkin Elmer, 2030-0030)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 항원과 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는지 여부를 선별하였다.In order to screen only the hybridomas producing antibodies that bind to the antigen, the hybridomas selected in the above 3-3 were further cultured for 7 days and then confirmed to be hybridoma cells producing antibodies by indirect ELISA . First, each antigen was dispensed in a half area 96-well ELISA plate (Corning, 3690) at a concentration of 1 / / mL, 50 per well, and then coated overnight at 4 째 C. After three washes with TBS-T (0.05% Triton X-100), the cells were blocked with 200 μl of TBS-T / SM (2% skim milk) at room temperature for 30 minutes. After washing the blocked plate three times, A plate culture sample was added and an antigen-antibody reaction was induced at 37 ° C for 2 hours. After washing the plate three times, anti-mouse IgG-HRP (AbClon, Abc-5001) was diluted to 1: 10,000 in TBS-T / SM as secondary antibody and bound for 1 hour at 37 ° C. After washing the plates three times, TMB solution (Biofx, TMBC-1000) was added and developed at room temperature for 20 minutes. After stopping the coloration by adding 1N sulfuric acid (DukSan, 254), the resultant was measured with a spectrophotometer (Perkin Elmer, 0030), and the absorbance at 450 nm was measured to select whether to produce an antibody that specifically binds to the antigen.

상기 결과는 도 8 내지 도 10에 나타내었다.The results are shown in FIG. 8 to FIG.

도 8 내지 도 10에 나타낸 바와 같이, 각 항원과 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 세포를 ELISA로 확인한 결과 SP2/0를 이용한 그룹보다 SP2/XIAP를 이용한 그룹에서 2.5배-3배 많은 항체 생성율을 나타냄을 확인하였다(도 8 내지 도 10의 Positive clone).As shown in FIG. 8 to FIG. 10, the cells producing antibodies that specifically bind to each antigen were confirmed by ELISA. As a result, the antibody production rate was 2.5 to 3 times higher in the group using SP2 / XIAP than in the group using SP2 / 0 (Positive clone in Figs. 8 to 10).

실시예 4. XIAP 과발현 골수종 세포로 제작한 하이브리도마 세포의 IgG 발현 양 비교Example 4. Comparison of IgG expression levels of hybridoma cells prepared with XIAP overexpressing myeloma cells

상기 실시예 3에서 제작한 각 항원에 대해 특이적인 항체를 생산하는 하이브리도마를 이용하여 XIAP 발현과 항체 생산율을 웨스턴블롯으로 비교하였다. XIAP 발현 확인은 상기 실시예 2의 2-1에 상술한 방법과 동일하게 수행하였고, 항체의 발현 확인은 위해 각 하이브리도마 세포를 1x106/ml로 10% FBS/DMEM 배지에 배양한 후 1, 2, 3, 4일째 배양 상층액을 12% SDS-PAGE로 분리하고, NC 멤브레인에 트랜스퍼하였다. 상기 NC 멤브레인을 상온에서 1시간 블로킹한 후 항-마우스 IgG-HRP(AbClon, Abc-5001)를 1:5000으로 처리하고 상온에서 2시간 결합시켰다. 3회 세척 후 AbSignal 기질(Abclon, Abc-3001)을 처리하여 세포주의 발광 정도를 ChemiDocTM Touch Imaging system을 이용하여 확인하였다. XIAP의 발현이 유지되고 있는 하이브리도마 세포주가 SP2/0 또는 XIAP의 발현이 사라진 하이브리도마 세포주보다 IgG 발현 수준이 높은 것을 확인할 수 있었다. 따라서, XIAP 단백질의 과발현이 하이브리도마의 생존능력을 증가시킴에 따라 항체 발현 또한 오랫동안 유지할 수 있는 것을 확인할 수 있었다.Using a hybridoma producing antibodies specific for each antigen prepared in Example 3, XIAP expression and antibody production were compared by Western blotting. XIAP expression confirmation was carried out in the same manner as described in 2-1 of Example 2. To confirm the expression of the antibody, each hybridoma cell was cultured in a 10% FBS / DMEM medium at 1 × 10 6 / ml, , The culture supernatant on days 2, 3 and 4 was separated by 12% SDS-PAGE and transferred to NC membrane. The NC membrane was blocked for 1 hour at room temperature, treated with anti-mouse IgG-HRP (AbClon, Abc-5001) at a ratio of 1: 5000, and bound at room temperature for 2 hours. After washing three times, the AbSignal substrate (Abclon, Abc-3001) was treated and the degree of luminescence of the cell line was confirmed using ChemiDoc TM Touch Imaging system. It was confirmed that the hybridoma cell line in which the expression of XIAP was maintained had a higher IgG expression level than the hybridoma cell line in which SP2 / 0 or XIAP expression disappeared. Therefore, it was confirmed that the overexpression of XIAP protein increased the viability of the hybridoma, and the antibody expression could be maintained for a long time.

<110> AbClon Inc. <120> Myeloma Cell Over-expressing XIAP Protein <130> PN160298 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 496 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Met Thr Phe Asn Ser Phe Glu Gly Thr Arg Thr Phe Val Leu Ala Asp 1 5 10 15 Thr Asn Lys Asp Glu Glu Phe Val Glu Glu Phe Asn Arg Leu Lys Thr 20 25 30 Phe Ala Asn Phe Pro Ser Ser Ser Pro Val Ser Ala Ser Thr Leu Ala 35 40 45 Arg Ala Gly Phe Leu Tyr Thr Gly Glu Gly Asp Thr Val Gln Cys Phe 50 55 60 Ser Cys His Ala Ala Ile Asp Arg Trp Gln Tyr Gly Asp Ser Ala Val 65 70 75 80 Gly Arg His Arg Arg Ile Ser Pro Asn Cys Arg Phe Ile Asn Gly Phe 85 90 95 Tyr Phe Glu Asn Gly Ala Ala Gln Ser Thr Asn Pro Gly Ile Gln Asn 100 105 110 Gly Gln Tyr Lys Ser Glu Asn Cys Val Gly Asn Arg Asn Pro Phe Ala 115 120 125 Pro Asp Arg Pro Pro Glu Thr His Ala Asp Tyr Leu Leu Arg Thr Gly 130 135 140 Gln Val Val Asp Ile Ser Asp Thr Ile Tyr Pro Arg Asn Pro Ala Met 145 150 155 160 Cys Ser Glu Glu Ala Arg Leu Lys Ser Phe Gln Asn Trp Pro Asp Tyr 165 170 175 Ala His Leu Thr Pro Arg Glu Leu Ala Ser Ala Gly Leu Tyr Tyr Thr 180 185 190 Gly Ala Asp Asp Gln Val Gln Cys Phe Cys Cys Gly Gly Lys Leu Lys 195 200 205 Asn Trp Glu Pro Cys Asp Arg Ala Trp Ser Glu His Arg Arg His Phe 210 215 220 Pro Asn Cys Phe Phe Val Leu Gly Arg Asn Val Asn Val Arg Ser Glu 225 230 235 240 Ser Gly Val Ser Ser Asp Arg Asn Phe Pro Asn Ser Thr Asn Ser Pro 245 250 255 Arg Asn Pro Ala Met Ala Glu Tyr Glu Ala Arg Ile Val Thr Phe Gly 260 265 270 Thr Trp Thr Ser Ser Val Asn Lys Glu Gln Leu Ala Arg Ala Gly Phe 275 280 285 Tyr Ala Leu Gly Glu Gly Asp Lys Val Lys Cys Phe His Cys Gly Gly 290 295 300 Gly Leu Thr Asp Trp Lys Pro Ser Glu Asp Pro Trp Glu Gln His Ala 305 310 315 320 Lys Trp Tyr Pro Gly Cys Lys Tyr Leu Leu Asp Glu Lys Gly Gln Glu 325 330 335 Tyr Ile Asn Asn Ile His Leu Thr His Ser Leu Glu Glu Ser Leu Gly 340 345 350 Arg Thr Ala Glu Lys Thr Pro Ser Leu Thr Lys Lys Ile Asp Asp Thr 355 360 365 Ile Phe Gln Asn Pro Met Val Gln Glu Ala Ile Arg Met Gly Phe Ser 370 375 380 Phe Lys Asp Ile Lys Lys Thr Met Glu Glu Lys Ile Gln Thr Ser Gly 385 390 395 400 Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Glu Val Leu Ile Ala Asp Leu Val Ser Ala 405 410 415 Gln Lys Asp Asn Thr Glu Asp Glu Ser Ser Gln Thr Ser Leu Gln Lys 420 425 430 Asp Ile Ser Thr Glu Glu Gln Leu Arg Arg Leu Gln Glu Glu Lys Leu 435 440 445 Cys Lys Ile Cys Met Asp Arg Asn Ile Ala Ile Val Phe Val Pro Cys 450 455 460 Gly His Leu Val Thr Cys Lys Gln Cys Ala Glu Ala Val Asp Lys Cys 465 470 475 480 Pro Met Cys Tyr Thr Val Ile Thr Phe Lys Gln Lys Ile Phe Met Ser 485 490 495 <210> 2 <211> 1491 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 2 atgactttca acagttttga gggaactaga acgttcgtac ttgcagacac caacaaggac 60 gaagagttcg tagaggagtt taatcggtta aagacatttg ctaacttccc aagttcctcg 120 cctgtttcag catcaacatt ggcgcgagct gggtttcttt ataccggcga gggagacacc 180 gtgcaatgct tcagttgtca tgcggccatt gaccgctggc agtacggaga ctcagccgtg 240 ggacggcaca ggagaatatc cccaaattgc agattcatca atggctttta ttttgagaac 300 ggtgctgcac agtctacgaa ccccggcatc caaaatggcc agtacaaatc tgaaaactgt 360 gtgggaaata gaaatccttt cgcccccgac aggccacccg agactcacgc tgattacctc 420 ttgcggaccg gccaggtcgt agatattagc gacaccatat acccgaggaa ccctgccatg 480 tgcagtgagg aagccagatt gaagtctttt cagaactggc cggattacgc tcacctcacc 540 cccagagagt tagccagtgc tggcctctac tacacaggcg ctgatgacca agtgcagtgc 600 ttctgctgcg ggggaaaact gaagaattgg gagccgtgtg atcgtgcctg gagcgaacac 660 aggcgccatt tccccaattg cttctttgtt ctgggccgca acgttaatgt gcgaagcgaa 720 tccggtgtgt cctctgatag gaatttcccc aactcaacta acagcccccg caacccagcc 780 atggcagaat atgaagctcg gatcgtgacg tttggaacat ggacatcctc agtcaacaag 840 gaacagctgg cacgcgccgg attttatgca ctaggtgagg gcgataaggt gaagtgtttt 900 cactgcgggg gtgggctcac cgattggaag ccatccgaag acccttggga acagcatgcg 960 aagtggtatc ctgggtgcaa gtacctattg gatgagaagg ggcaagaata cataaacaat 1020 atccatctga cccactcact tgaggagtct ctgggacgta ctgctgaaaa aacaccatcg 1080 ctaacaaaaa aaatcgacga caccatcttc cagaatccta tggtgcagga agctatccga 1140 atgggattca gcttcaagga cattaaaaag acaatggagg agaaaatcca gacgtccggg 1200 agcagctatc 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280 285 Tyr Ala Leu Gly Glu Gly Asp Lys Val Lys Cys Phe His Cys Gly Gly     290 295 300 Gly Leu Thr Asp Trp Lys Pro Ser Glu Asp Pro Trp Glu Gln His Ala 305 310 315 320 Lys Trp Tyr Pro Gly Cys Lys Tyr Leu Leu Asp Glu Lys Gly Gln Glu                 325 330 335 Tyr Ile Asn Asn Ile His Leu Thr His Ser Leu Glu Glu Ser Leu Gly             340 345 350 Arg Thr Ala Glu Lys Thr Pro Ser Leu Thr Lys Lys Ile Asp Asp Thr         355 360 365 Ile Phe Gln Asn Pro Met Val Gln Glu Ala Ile Arg Met Gly Phe Ser     370 375 380 Phe Lys Asp Ile Lys Lys Thr Met Glu Glu Lys Ile Gln Thr Ser Gly 385 390 395 400 Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Glu Val Leu Ile Ala Asp Leu Val Ser Ala                 405 410 415 Gln Lys Asp Asn Thr Glu Asp Glu Ser Ser Gln Thr Ser Leu Gln Lys             420 425 430 Asp Ile Ser Thr Glu Glu Gln Leu Arg Arg Leu Gln Glu Glu Lys Leu         435 440 445 Cys Lys Ile Cys Met Asp Arg Asn Ile Ala Ile Val Phe Val Pro Cys     450 455 460 Gly His Leu Val Thr Cys Lys Gln Cys Ala Glu Ala Val Asp Lys Cys 465 470 475 480 Pro Met Cys Tyr Thr Val Ile Thr Phe Lys Gln Lys Ile Phe Met Ser                 485 490 495 <210> 2 <211> 1491 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 2 atgactttca acagttttga gggaactaga acgttcgtac ttgcagacac caacaaggac 60 gaagagttcg tagaggagtt taatcggtta aagacatttg ctaacttccc aagttcctcg 120 cctgtttcag catcaacatt ggcgcgagct gggtttcttt ataccggcga gggagacacc 180 gtgcaatgct tcagttgtca tgcggccatt gaccgctggc agtacggaga ctcagccgtg 240 ggacggcaca ggagaatatc cccaaattgc agattcatca atggctttta ttttgagaac 300 ggtgctgcac agtctacgaa ccccggcatc caaaatggcc agtacaaatc tgaaaactgt 360 gtgggaaata gaaatccttt cgcccccgac aggccacccg agactcacgc tgattacctc 420 ttgcggaccg gccaggtcgt agatattagc gacaccatat acccgaggaa ccctgccatg 480 tgcagtgagg aagccagatt gaagtctttt cagaactggc cggattacgc tcacctcacc 540 cccagagagt tagccagtgc tggcctctac tacacaggcg ctgatgacca agtgcagtgc 600 ttctgctgcg ggggaaaact gaagaattgg gagccgtgtg atcgtgcctg gagcgaacac 660 aggcgccatt tccccaattg cttctttgtt ctgggccgca acgttaatgt gcgaagcgaa 720 tccggtgtgt cctctgatag gaatttcccc aactcaacta acagcccccg caacccagcc 780 atggcagaat atgaagctcg gatcgtgacg tttggaacat ggacatcctc agtcaacaag 840 gaacagctgg cacgcgccgg attttatgca ctaggtgagg gcgataaggt gaagtgtttt 900 cactgcgggg gtgggctcac cgattggaag ccatccgaag acccttggga acagcatgcg 960 aagtggtatc ctgggtgcaa gtacctattg gatgagaagg ggcaagaata cataaacaat 1020 atccatctga cccactcact tgaggagtct ctgggacgta ctgctgaaaa aacaccatcg 1080 ctaacaaaaa aaatcgacga caccatcttc cagaatccta tggtgcagga agctatccga 1140 atgggattca gcttcaagga cattaaaaag acaatggagg agaaaatcca gacgtccggg 1200 agcagctatc taagccttga ggtcctgatt gcagatcttg tgagcgctca gaaagacaac 1260 accgaggatg aatcaagcca gacttcattg cagaaggaca tctctactga agagcagcta 1320 aggagactac aagaggagaa gctctgtaaa atctgcatgg atcggaacat cgctatcgtc 1380 ttcgtgcctt gtggacacct ggtcacttgt aagcagtgtg cagaagccgt tgacaaatgc 1440 cccatgtgct acaccgtcat tactttcaag cagaaaattt tcatgtcttg a 1491

Claims (15)

XIAP(X-linked inhibitor of apoptosis) 단백질을 과발현하는 골수종 세포(myeloma cell).Myeloma cells overexpressing XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis) protein. 제1항에 있어서, 상기 골수종 세포는 마우스 유래 골수종 세포인 것을 특징으로 하는 골수종 세포.The myeloma cell according to claim 1, wherein the myeloma cell is a mouse derived myeloma cell. 제 2 항에 있어서, 상기 마우스 유래 골수종 세포는 SP2/0인 것을 특징으로 하는 골수종 세포.3. The myeloma cell according to claim 2, wherein the mouse derived myeloma cell is SP2 / 0. 제 1 항에 있어서, 상기 XIAP 단백질은 마우스 유래 XIAP 단백질인 것을 특징으로 하는 골수종 세포.The myeloma cell according to claim 1, wherein the XIAP protein is a mouse-derived XIAP protein. 제 1 항에 있어서, 상기 XIAP 단백질은 서열번호 1에 개시된 아미노산 서열을 갖는 단백질인 것을 특징으로 하는 골수종 세포.The myeloma cell according to claim 1, wherein the XIAP protein is a protein having an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 1. 제 1 항에 있어서, 상기 XIAP 단백질을 과발현 골수종 세포는 아폽토시스(apoptosis) 저항성이 증가된 것을 특징으로 하는 골수종 세포.2. The myeloma cell according to claim 1, wherein the XIAP protein overexpressing myeloma cells is increased in apoptosis resistance. 제 6 항에 있어서, 상기 아폽토시스 저항성의 증가는 Capase 3 활성화 억제를 통해 달성되는 것을 특징으로 하는 골수종 세포.7. The myeloma cell of claim 6, wherein said increased apoptotic resistance is achieved through inhibition of Capase 3 activation. XIAP 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합벡터로 골수종 세포를 트랜스펙션 시키는 단계를 포함하는, XIAP 단백질을 과발현하는 골수종 세포의 제조방법.7. A method of producing a myeloma cell overexpressing a XIAP protein, comprising transfecting a myeloma cell with a recombinant vector comprising a nucleotide sequence encoding a XIAP protein. 제 8 항에 있어서, 상기 재조합벡터에 의해 트랜스펙션 되는 골수종 세포는 마우스 유래 골수종 세포인 것을 특징으로 하는 방법.9. The method of claim 8, wherein the myeloma cells transfected by the recombinant vector are mouse derived myeloma cells. 제 9 항에 있어서, 상기 마우스 유래 골수종 세포는 SP2/0인 것을 특징으로 하는 방법.10. The method according to claim 9, wherein said mouse derived myeloma cells are SP2 / 0. 제 8 항에 있어서, 상기 XIAP 단백질은 마우스 유래 XIAP 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.9. The method according to claim 8, wherein the XIAP protein is a mouse-derived XIAP protein. 제 8 항에 있어서, 상기 XIAP 단백질은 서열번호 1에 개시된 아미노산 서열을 갖는 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.9. The method according to claim 8, wherein the XIAP protein is a protein having an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: XIAP 단백질을 과발현하는 골수종 세포가 항체생산 B 림프구와 융합되어있는 하이브리도마(hybridoma).Hybridoma in which myeloma cells overexpressing XIAP protein are fused with antibody-producing B lymphocytes. XIAP 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합벡터를 유효성분으로 포함하는, XIAP 과발현 골수종 세포의 생산용 재조합벡터 키트.A recombinant vector kit for the production of XIAP overexpressing myeloma cells, comprising as an active ingredient a recombinant vector comprising a nucleotide sequence encoding a XIAP protein. 제 14 항에 있어서, 상기 XIAP 단백질은 서열번호 1에 개시된 아미노산 서열을 갖는 단백질인 것을 특징으로 하는 키트.
15. The kit according to claim 14, wherein the XIAP protein is a protein having an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO:
KR1020160109988A 2016-08-29 2016-08-29 Myeloma Cell Over-expressing XIAP Protein KR20180025335A (en)

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