KR20180020112A - Jak 억제제를 포함하는 면역반응 억제용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 JAK(Janus Kinase) 억제제를 포함하는 면역반응 억제용 조성물, JAK(Janus Kinase) 억제제를 포함하는 췌도 보호용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 췌도의 주요소실원인인 즉각성 혈액매개성 염증반응(IBMIR)을 포함한 혈액 및 세포매개성 면역반응 억제효과가 우수할 뿐만 아니라, 기존의 면역억제제와 달리 췌도의 기능유지 및 췌도의 생존률을 향상시키는 효과가 있으므로 이종간 췌도 이식시 면역반응 억제 및 췌도 세포의 보호에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

JAK 억제제를 포함하는 면역반응 억제용 조성물 {Immunosuppression composition comprising JAK inhibitor}

본 발명은 JAK(Janus Kinase) 억제제를 포함하는 면역반응 억제용 조성물, JAK(Janus Kinase) 억제제를 포함하는 췌도 보호용 조성물에 관한 것이다.

췌도는 알파(alpha), 베타(beta), 델타(delta) 세포로 이루어진 세포덩어리로 췌장에서 마치 섬처럼 떨어져 있다고 해서 붙여진 이름이다. 이중 베타 세포는 인슐린을 분비하여 혈액 속의 혈당을 조절하는 중요한 세포이다. 제 1형 당뇨병을 치료하기 위해 최근에는 인슐린을 분비하는 췌도만을 췌장으로부터 분리하여 당뇨병환자에게 이식하는 동종간 이식 방법이 행해지고 있다. 1999년 Edmonton 프로토콜이 개발된 이래로 미국, 유럽에서 동종간 췌도 이식에 의한 당뇨병 치료건수는 900여건에 이르고 있으며, 최근에는 이식된 췌도의 5년 생존율이 50 %에 이르는 등 췌도이식이 당뇨병 치료의 중요한 대안으로 자리 잡아가고 있다. 하지만 췌도이식이 제1형 당뇨병 치료를 위한 가장 최선의 대안이기는 하나, 이식할 췌장이 부족하다는 것이 가장 큰 장벽이다. 이에 대한 대안으로 최근 돼지로부터 췌도를 분리하여 사람에게 이식하고자 하는 연구들이 진행되고 있다. 돼지 췌도는 사람과 생리적으로 유사하고, 많은 양을 얻을 수 있으며, 유전자 변형 등을 쉽게 할 수 있는 장점이 있다. 돼지 췌도를 이용한 당뇨병치료의 가능성은 설치류나 영장류를 이용한 여러 연구에서 증명되었다. 하지만 돼지 췌도를 사람에게 적용하여 당뇨병을 치료하기 위해서는 영장류를 이용한 전임상 연구가 반드시 선행되어야 한다. 2005년 미국의 Emory 대학과 미국의 Minnesorta 대학에서 돼지 췌도를 영장류에 이식하고 이식된 돼지 췌도의 장기간 생존을 최초로 확인한 이래로 지금까지 6 그룹에서 6개월이상의 이식된 췌도의 생존을 보고하고 있다. 이에 따라 이종 장기 이식 커뮤니티는 돼지 췌도 이종 이식의 임상 적용 가능성을 확인하고, 2009년 국제 이종 이식학회(IXA)를 통해 이종췌도의 임상적용에 대한 국제적인 가이드라인을 합의하고 제정하였다. 이 가이드라인을 보면, 임상적용을 위한 전임상 연구의 성공적인 기준은 당뇨병에 걸린 영장류에 돼지 췌도 산물을 이식한 후 최소 6 개월 동안 정상 혈당증 (normoglycemia) 또는 최소 수준의 돼지 C-펩타이드가 8 마리 중 5 마리에서 검출되어야 한다. 그러나 이러한 국제적 가이드라인을 만족하는 연구결과는 아직까지 널리 보고되지 않았다.

한편, 이식된 췌도가 수용체에서 장기간 생존하기 위해서는 이식된 췌도에 대해 발생하는 여러가지 면역반응을 어떻게 효과적으로 억제하느냐에 달려있으며, JAK 억제제와 면역반응 억제 및 췌도 보호 효과의 연관성에 대하여는 알려진 바가 거의 없다.

이에, 본 발명자들은 영장류 및 돼지 간의 이종 이식에 있어서 재현성 및 일관성이 있는 면역억제 방법을 예의 연구하였고, 그 결과 JAK 억제제를 이용하면 면역반응 억제 및 췌도 보호 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 JAK(Janus Kinase) 억제제를 포함하는 면역반응 억제용 조성물, 췌도 보호용 조성물 및 췌도 세포 결함 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 JAK(Janus Kinase) 억제제를 포함하는 면역반응 억제용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 토파시티닙 및 면역억제제를 포함하는 면역 반응 억제용 복합 제제를 제공한다.

또한 본 발명은 토파시티닙을 포함하는 면역 반응 억제 보조용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 JAK(Janus Kinase) 억제제를 포함하는 췌도 보호용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 JAK(Janus Kinase) 억제제를 포함하는 췌도 세포 결함 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 췌도의 주요 소실원인인 즉각성 혈액매개성 염증반응(IBMIR)을 포함한 혈액 및 세포매개성 면역반응 억제효과가 우수할 뿐만 아니라, 기존의 면역억제제와 달리 췌도의 기능유지 및 췌도의 생존률을 향상시키는 효과가 있으므로 이종 또는 동종간 췌도 이식시 면역반응 억제 및 췌도 세포의 보호에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 Th1 및 Th17 선택적 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다. 도 1의 (A) 는 토파시티닙 처리에 따른 Treg, Th1, Th17의 분화 억제 정도를 나타낸 도이며, 도 1의 (B) 는 도 1 (A) 의 결과를 수치화하여 나타낸 도이다. 도 1의 (c)는 토파시티닙 처리 후 Treg 및 Th1 의 분화 억제 정도를 비교하여 나타낸 도이다.
도 2는 마우스에서 토파시티닙 처리에 따른 면역 반응 억제 효과를 췌도의 생존율 및 혈중 글루코오스 농도를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 원숭이에서 토파시티닙 처리에 따른 면역 반응 억제 효과를 이식 후 혈당, 외인성 인슐린, 돼지 및 원숭이 C-펩타이드의 변화를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 토파시티닙의 추가 처리에 따른 이식췌도편의 존재 및 면역거부반응의 양상을 면역 조직화학 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 토파시티닙 처리에 의한 IL-6 혈중 농도의 변화를 통해 체액성 면역 반응 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 토파시티닙 처리에 의한 sCD154의 혈중 농도의 변화를 통해 체액성 면역 반응 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 토파시티닙이 산화적 스트레스로 인한 췌도 세포의 생존율에 미치는 영향을 MTT 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다. 도 7의 (A)는 다양한 조건의 H₂O₂ 에서 토파시티닙 처리에 따른 세포 생존율을 나타낸 도이다. 도 7의 (B) 는 H₂O₂ 50μM 조건에서, 도 7의 (C)는 H₂O₂ 100 μM 조건에서 토파시티닙 처리에따른 세포 생존율 증가 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 자가 췌도이식시 토파시티닙 처리에 따른 췌도 생존율 증가 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다. 도 8의 (A) 는 토파시티닙을 투여받지 않은 대조군의 혈중 글루코오스 농도를 나타내며, 도 8의 (B) 는 토파시티닙 투여군의 혈중 글루코오스 농도를 나타낸다.
도 9은 영장류에서 토파시티닙의 사용 유무에 따른 췌도 손실을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 산화적 스트레스 조건에서 룩소리티닙 및 JANEX-1을 처리하고 24시간 배양한 후 세포 생존율을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 산화적 스트레스 조건에서 룩소리티닙 및 JANEX-1을 처리하고 72시간 배양한 후 세포 생존율을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 룩소리티닙 및 토파시티닙의 세포 자멸사 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다. 도 12의 (A) 및 도 12의 (B) 는 토파시티닙 처리에 따른 세포 자멸사 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸다. 도 12의 (C) 는 토파시티닙 5μM 및 룩소리티닙 5μM 처리에 따른 세포자멸사 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다. 도 12의 (D) 는 토파시티닙 5μM 및 룩소리티닙 5μM 처리에 따른 살아있는 세포 및 세포 자멸사 세포의 비율을 수치화하여 나타낸 도이다.
도 13는 영장류 3마리(R144, R15, R51)에 각각 15mg/일로 토파시티닙을 처리한 후 약물동력학(pharmacodynamics)을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 토파시티닙의 복합 면역억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 면역억제제 투여 프로토콜을 나타낸 도이다.
도 16은 돼지 췌도 영장류 이종이식 후 토파시티닙 복합 투여에 따른 혈당(회색), 외인성인슐린(분홍색), 돼지 및 원숭이 C-peptide 그래프(빨간색 및 검정색 역삼각형)를 확인한 결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 JAK(Janus Kinase) 억제제를 포함하는 면역반응 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 JAK 억제제는 세포, 조직 또는 장기 이식 거부 반응에 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 조성물은 이식 수용체에 의한 조직 이식편의 거부반응을 억제 또는 반전시키거나, 이식 수용체에 이식된 조직의 기능을 생존 연장 또는 보존시키거나, 또는 이식 수용체에서 손상된 이식 조직의 기능을 회복시킨다.

본 발명의 JAK 억제제는 JAK1, JAK2 및 JAK3로 이루어진 군에서 선택된 1종의 억제제일 수 있으며, 바람직하게는 JAK3 억제제일 수 있다.

상기 JAK1 및 JAK2 억제제는 룩소티닙(Ruxolitinib), 오클라시닙(Oclacitinib), 바리티니닙(Baricitinib), 필고티닙(Filgotinib), 간두티닙(Gandotinib), 레스타우리티닙(Lestaurtinib), 파피리티닙(Pacritinib) 및 페드라티닙(Fedratinib)으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으며, JAK3 억제제는 JANEX-1, 토파시티닙(Tofacitinib), WHI-P154 (CAS number: 211555-04-3), 페피시티닙(Peficitinib), ZM 39923 HCl (CAS number: 1021868-92-7) 및 AT9283 (CAS number: 896466-04-9) 로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서는 JAK 억제제, 바람직하게는 토파시티닙이 세포, 조직 또는 장기 이종 이식시 발생하는 면역 반응 중에서 이식에 도움을 줄 수 있는 Treg (조절 T 세포) 의 분화는 억제하지 않으면서, 이식된 장기를 공격하는 Th1 및 Th17 로의 분화만을 선택적으로 억제할 수 있음을 확인하였다. 따라서 본 발명의 JAK 억제제,바람직하게는 토파시티닙은 이종 이식시 발생할 수 있는 면역반응 중 Th1 및 Th17 세포만을 선택적으로 억제할 수 있는 억제제로 사용될 수 있다.

본 발명의 “면역 반응 억제용”에서의 “면역 반응” 는 외부 또는 자기 항원에 의해 유발되는 생체에 유리하지 않은 면역반응을 말하는 것이며, 예컨대 외부 또는 자기 항원에 의해 유발되는 면역반응에 의한 염증반응일 수 있고, 바람직하게는 장기, 조직 및 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상 이식편에 대한 면역 거부 반응을 의미할 수 있다.

현재 췌도 이식에는 인간으로부터 기증받은 췌장에서 분리한 췌도 세포 뿐만 아니라 돼지로부터 분리한 췌도 세포가 췌도 세포 이식 치료에 이용되고 있다. 따라서 본 발명의 장기, 조직 및 세포 역시 인간 또는 다른 공여 동물, 예컨대 포유류인 영장류 또는 돼지에서 유래된 장기, 조직 또는 세포를 의미할 수 있다. 따라서 본 발명에 있어 상기 이식편은 췌장 또는 췌도일 수 있고, 이는 인간 또는 돼지, 원숭이 유래의 췌장 또는 췌도일 수 있다.

본 발명의 JAK 억제제, 바람직하게 토파시티닙은 이식편의 생존율을 증기시키는 것을 특징으로 할 수 있다.

이와 같은 목적으로 투여되는 경우, 상기 토파시티닙은 인간에게 투여 시, 1.0 내지 2 mg/kg/일로 투여되는 것을 특징으로 할 수 있고, 바람직하게는 1.2 내지 내지 1.95 mg/kg/day 로 투여될 수 있다. 이는 류마티스 관절염에 통상적으로 사용되는 투여량보다 고용량이며, 이식편, 바람직하게는 췌도 이식 시 목적하는 효과를 달성할 수 있고 최대 투여 한계 범위 내에 존재하는 투여량으로 새롭게 확인된 투여량인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 토파시티닙 (Tofacitinib)은 이종 장기 이식 시 발생하는 부정적인 면역반응, 예컨대 Th1 및 Th17 분화를 선택적으로 억제하고, 췌도 주변에서 면역 침윤을 억제할 수 있으며, 산화스트레스로부터 이식편을 보호하는 등 췌도 자체를 보호함으로써, 이식된 췌도의 생존율을 현저하게 증가시킬 수 있다. 구체적으로 토파시티닙은 이식 췌도편을 면역 거부 반응으로부터 보호함으로써 이식 부위에서 장기간 생존을 유도할 수 있으며 이를 통해 이종 이식을 받은 개체에서 혈당 수준이 정상적으로 유지되도록 도울 수 있다.

또한 본 발명의 토파시티닙은 기존 당 분야에서 면역 반응 억제용으로 사용되었던 다양한 면역억제제와 함께 또는 분리되어 순차적으로 투여될 수 있다. 따라서 본 발명은 토파시티닙 및 면역억제제를 포함하는 면역 반응 억제용 복합 제제를 제공한다. 상기 복합 제제의 일 구획에는 토파시티닙이, 또다른 일 구획에는 면역억제제가 포함될 수 있으며, 당 분야의 통상의 기술자는 이를 이식편에 의한 면역 반응을 억제하기 위하여 적절하게 조절하여 사용할 수 있다. 바람직하게 상기 토파시티닙 및 면역억제제는 순차적으로 투여될 수 있다. 이러한 목적 달성을 위하여 토파시티닙과 면역억제제는 분리되어 하나의 단위로 패키징 될 수 있다.

토파시티닙과 함께 복합제제로 이용할 수 있는 면역억제제는 당 분야에 통상적으로 알려지고 사용되는 면역억제제일 수 있으며, 바람직하게는 ATG(anti-thymoglobulin), 시롤리무스, 메틸 프레드니솔론, 코르티코스테로이드, 항증식성 제제, 시클로스포린, 타크로리무스, 마이코페놀레이트 모페틸, 미조루빈, 데옥시스퍼구알린, 브레퀴나르 나트륨, 레플루노미드, 아자스피란, 휴미라, 시롤리무스, 아나킨라, 리툭시맙, 코브라독인자(CVF) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.

또한 본 발명의 토파시티닙은 통상적으로 사용되는 이종 장기 이식편에 대한 면역억제프로토콜의 면역억제 반응을 돕고 췌도를 더욱 보호하기 위하여 면역 반응 억제 보조용으로 사용될 수 있다.

상기 “면역 반응 억제 보조용” 이란, 기본적으로 사용되는 면역 억제 프로토콜에 추가적으로 토파시티닙을 투여함으로써 면역 억제 반응을 더욱 효과적으로 억제하여 이식된 이식편, 예컨대 췌장 또는 췌도의 생존율을 토파시티닙 미처리 군과 비교하여 현저히 증가시키는 용도로 사용하는 것을 의미한다.

또한 본 발명은 JAK(Janus Kinase) 억제제를 포함하는 췌도 보호용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 JAK 억제제는 췌도 자체를 보호할 수 있는 우수한 효과를 가지고 있으며, 췌도를 산화적 스트레스로부터 보호하고, 산화적 스트레스에 의한 세포 자멸사를 억제하여 췌도의 생존율을 현저하게 증가시킬 수 있다. 이와 같이 췌도 자체를 자극으로부터 효과적으로 보호하는 경우 이식편의 손실을 방지하여 이식된 수용자의 혈당 조절을 더욱 원활하게 달성할 수 있도록 한다.

상기 JAK 억제제는 JAK1, JAK2 및 JAK3로 이루어진 군에서 선택된 1종의 억제제일 수 있으며, JAK 억제제가 JAK 1 또는 JAK2 억제제인 경우, 이는 룩소티닙(Ruxolitinib), 오클라시닙(Oclacitinib), 바리티니닙(Baricitinib), 필고티닙(Filgotinib), 간두티닙(Gandotinib), 레스타우리티닙(Lestaurtinib), 파피리티닙(Pacritinib) 및 페드라티닙(Fedratinib)으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 할 수 있다. 또한 JAK 억제제가 JAK3 억제제인 경우 JANEX-1, 토파시티닙(Tofacitinib), WHI-P154 (CAS number: 211555-04-3), 페피시티닙(Peficitinib), ZM 39923 HCl (CAS number: 1021868-92-7) 및 AT9283 (CAS number: 896466-04-9) 로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 할 수 있다. 췌도 보호를 위한 상기 JAK 억제제는 바람직하게는 JAK1,2 억제제 예컨대 룩소리티닙, JANEX-1, 또는 JAK3 억제제, 예컨대 토파시티닙일 수 있다.

본 발명의 JAK 억제제, 바람직하게 JAK3 억제제는 산화적 스트레스로부터 췌도를 보호하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 산화적 스트레스에 의한 세포 자멸사를 억제하여, 췌도의 생존율을 증가시키는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 JAK 억제제는 특히 자가 이식된 췌도의 생존율을 현저하게 증가시킬 수 있다. 이종 이식과 달리 자가(동계) 이식은 면역학적 거부 반응보다 이식편 자체를 보호하여 장기간 생존을 유도하는 것이 중요하므로, JAK 억제제의 이러한 보호 효과는 특히 자가(동계) 이식에 유용할 수 있다. 본 발명에서는 JAK 억제제, 바람직하게는 JAK3 억제제가 췌도를 보호함으로써 이식 후 췌도의 초기 소실을 막고 췌도의 세포 자멸사를 억제하여 한계치 췌도로 이식해준 췌도가 모두 정상 혈당을 유지할 수 있도록 함을 확인하였다. 따라서 JAK 억제제, 바람직하게 JAK3 억제제는 적은 양의 자가 췌도를 이식하더라도 췌도의 생존율 증가를 통해 JAK3 억제제 미처리군과 비교하여 혈당 조절을 더욱 용이하게 달성할 수 있다.

또한 본 발명의 JAK 억제제는 이식 초기 즉각성 혈액 매개성 염증 반응 (instant blood-mediated inflammatory reaction, IBMIR) 에 의한 췌도 사멸 억제용일 수 있다.

본 발명에 있어 이식 초기란, 이식편이 수용자에서 자리잡기 위한 시간인 이식 후 3주, 바람직하게는 이식 후부터 2주 동안을 의미한다. 상기 “즉각성 혈액 매개성 염증 반응”이란, 동종 췌도 이식에서 췌도 세포 분리과정에서 노출된 콜라겐 잔기와 췌도 세포에서 발현이 증강된 조직 인자에 의해 수용자에서 유도되는 혈소판 활성화 및 염증 반응을 의미한다. 또한 상기 즉각성 혈액 매개성 염증 반응은 이종췌도 이식에서도 발생할 수 있으며, 이 경우 보체 활성이 응고계 활성보다 먼저 작용하여 유도될 수 있다. 췌도의 이식에 있어서 즉각성 혈액 매개성 염증반응은 이식 초기에 발생하는 것으로, 이식되는 췌도의 생존율을 결정하는 주요한 반응일 수 있다. 본 발명의 JAK 억제제는 이식 반응에서의 초기 즉각성 혈액 매개성 염증 반응에 대한 보호 효과를 나타내어 이식 초기 췌도 보호 효과에 의해 췌도의 손실을 효과적으로 방지할 수 있다.

본 발명의 이식 수용체는 영장류이며, 상기 영장류는 고등 영장류인 원숭이, 침팬지, 고릴라, 오랑우탄 및 인간으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 원숭이, 인간, 침팬지, 및 오랑우탄으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 가장 바람직하게는 원숭이 또는 인간이다.

또한, 수용체는 조직 이식이 필요한 다른 포유류, 특히 상업적 중요성이 있는 포유류, 또는 애완 동물 또는 기타 가치 있는 동물, 예컨대 멸종될 위기에 있는 종일 수 있다. 따라서, 수용체의 비제한적인 예로는 양, 말, 소, 염소, 돼지, 개, 고양이, 토끼, 기니아 피그, 햄스터, 게르빌루스쥐, 래트 및 마우스가 있다.

바람직하게는, 본 발명의 조직은 상기 영장류에 대해 동종이계(allogeneic)이거나, 또는 상기 영장류에 대해 이종발생성(xenogeneic)인 공여체 조직일 수 있다.

상기 공여체 조직은 통상적인 수단으로 지원자나 기타 살아있는 공여체, 또는 사체 공여체로부터 유래할 수 있다. 공여체는 수용체를 사용하여 실행 가능하도록 조직적합성인 것이 바람직하다.

또한 본 발명은 JAK(Janus Kinase) 억제제를 포함하는 췌도 세포 결함 질환 (islet cell-deficiency) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 췌도세포-결함에 의해 발생할 수 있는 모든 질환에 대하여 이용될 수 있다. 본 발명의 췌도세포-결함 질환은 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병, 및 당뇨병성 만성 신질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환일 수 있다. 상기 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병 및 당뇨병성 만성 신질환은 모두 췌도세포 이식으로 치료가 가능한 질병이다. 본 발명의 JAK 억제제를 포함하는 조성물은 특히 췌도세포-결함 질환 중 제1형 당뇨병에 적합할 수 있으며, 제1형 당뇨병의 경우에는, 인슐린을 분비하는 췌도의 베타세포가 파괴됨으로 인하여 인슐린 분비기능이 소실되어 발생하므로, 췌도세포 이식이 제1형 당뇨병에 대한 좋은 치료방법이 될 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸 히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 바람직하게는 비경구로 투여된다. 비경구로 투여되는 경우, 본 발명의 조성물은 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입 및 복강 주입 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 조성물은 적용되는 질환의 종류에 따라, 투여 경로가 결정되는 것이 바람직하다.

또한 본 발명은 JAK 억제제를 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 면역반응 억제 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 토파시티닙 및 면역억제제를 개체에 순차적으로 투여하는 단계; 를 포함하는 면역 반응 억제 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 토파시티닙을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 면역 반응 억제 보조 방법을 제공한다.

상기 면역 반응 억제 및 면역 반응 억제 보조방법에서 개체는 동종 또는 이종 이식편을 이식받는 수용체일 수 있다.

또한 본 발명은 JAK(Janus Kinase) 억제제를 개체 또는 췌도에 처리하는 단계;를 포함하는 췌도 보호 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 JAK(Janus Kinase) 억제제를 개체 또는 췌도에 처리하는 단계;를 포함하는 췌도 세포 결함 질환 치료 방법을 제공한다.

상기 췌도 보호 방법 및 췌도 세포 결함 질환 치료 방법에서의 개체는 이식편을 제공하는 공여자 또는 공여자의 췌도일 수 있다.

본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이며, 중복되는 내용은 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 기재를 생략하였다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: JAK 억제제의 면역억제 효과 확인

JAK (Janus Kinase) 억제제인 토파시티닙(Tofacitinib)의 면역억제 효과를 확인하기 위해서, Th1, Th17 세포의 증식 및 사이토카인 분비능 저해 효과를 다음과 같이 확인하였다.

1.1 토파시티닙의 Th1 , Th17 세포의 증식 저해 효과 확인

이식 시 나타나는 거부 반응은 수용자의 면역세포의 활성에 의한 면역 반응으로 나타나며, 이와 같은 면역반응은 이식의 실패를 유발한다. 따라서 이식 시 발생할 수 있는 면역반응을 억제하는 것은 이식의 성패를 좌우할 수 있는 매우 중요한 과정이다. 이와 같은 수용자의 면역 반응은 면역 반응을 유도하는 사이토카인인 IFN-r를 분비하는 Th1 세포 및 IL-17 분비세포인 Th17 의 증식에 의해 유발되므로, 토파시티닙이 in vitro에서 C57BL/6 생쥐의 naive T 세포가 Th1 세포로 분화하는 과정을 억제할 수 있는지 여부를 확인하였다. 또한 토파시티닙이 이종이식 시 도움을 주는 Treg 에도 영향을 주는지 함께 확인하였다. 먼저 C57BL/6 생쥐를 희생하고 비장에서 비장 세포를 분리한 후, 비장 세포 중에서 CD62L을 높게 발현하고 CD44를 낮게 발현하는 CD4 T세포를 MACS를 이용해 분리했다. CD3/CD28 항체를 바닥에 코팅한 96-웰 마이크로플레이트에 5x10⁴개 씩 나이브(naive) T세포를 분주하고 Th1 또는 Treg 조건에서 분화를 유도하였다. 상기 세포에 사이토카인 칵테일(cytokine cocktail)과 차단 항체(Blocking antibody)를 이용해 조성하여 5일간 배양한 뒤 유세포 분석을 이용해 Treg과 Th1의 분화 정도를 측정하였다. Treg 분화 조건에서 토파시티닙을 300nM, 1μM, 3μM 으로 처리하고 Foxp3+ T 세포의 비율을 %로 표시하여 나타내었고, Th1 및 Th17 세포 분화 조건에서 토파시티닙을 300nM, 1μM, 3μM 농도로 처리하고 T-bet+IFN-gamma+ T 세포의 비율을 %로 표시하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, Treg 세포 분화 조건에서 토파시티닙을 처리하더라도 토파시티닙은 Treg 분화를 크게 억제하지 않았으나, 면역 반응을 유발하는 Th1 분화는 농도 의존적으로 억제하는 것을 확인하였다. 상기 결과에 대한 각 퍼센트를 상대적인 비율로 그래프로 표시하였다. 이러한 결과는 JAK 억제제인 토파시티닙이 이종이식에 도움을 줄 수 있는 Treg 의 분화는 뚜렷하게 억제하지 않으면서, 이종이식 시 유발될 수 있는 면역 반응과 관련된 Th1 및 Th17 세포로의 분화만을 낮은 농도에서도 선택적으로 억제할 수 있음을 나타낸다. 따라서 토파시티닙은 이종 이식 시 발생할 수 있는 면역반응만을 선택적으로 억제하는 억제제로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

1.2 JAK 억제제의 이종 췌도 이식 거부 반응 억제 효과 (마우스)

이종 췌도를 이식하는 경우 면역 거부 반응이 발생하며, 이에 의해 이종 췌도의 사멸이 유도되어 이종 췌도 이식이 실패할 위험성이 있다. 따라서 이식되는 이종 췌도의 생존율을 증가시키기 위한 면역 거부 반응을 억제 공정이 필요하며, JAK 억제제인 토파시티닙이 이러한 효과를 달성할 수 있는지 여부를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 먼저 Balb/c 생쥐를 희생하고 췌장에 0.5μg/ml 농도의 콜라겐분해효소 P (Collagenage P) 를 주입하고 분리하였다. 분리한 췌도를 37℃에서 20분간 콜라겐 분해효소 P와 반응시키고 1.108, 1.096, 1.069, 1.037 밀도의 불연속 밀도 구배 원심분리 (Discontinuous density gradient centrifugation)를 이용하여 순수한 췌도를 분리하였다. 분리한 Balb/c 생쥐의 췌도를 당뇨 유도된 C57BL/6 생쥐의 신장 피막에 500 IEQ (Islet equivalent, 150μm 지름의 췌도 하나의 단위) 로 이식하고 30일 동안 혈당을 측정하였다. 이식 후 1일 2회씩 15mg/kg의 양으로 토파시티닙을 구강 투여하였고, 대조군으로 아무 것도 처리하지 않은 군, 비교군으로 이식 거부 반응 억제제로 사용되는 타크로리무스(Tacrolimus) 1mg/kg ip 주입 처리군을 설정하였다. 혈중 글루코오스 농도는 혈당기로 측정하여 확인하였으며 이를 통해 이종 췌도 이식 후 정상 혈당이 유지되는지 관찰하였다. 혈당이 250mg/dl 미만일 때를 정상으로, 혈당이 2일 연속하여 250mg/dl 이상일 때 거부반응이 일어난 것으로 간주하였으며, 처리에 따른 혈중 글루코오스 농도 및 췌도의 생존 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2의 (A)에 나타낸 바와 같이, 타크로리무스 처리군 (붉은 색) 및 미처리 대조군 (검은 색) 은 이종 췌도 이식 후 약 5 내지 12일 내에 거부 반응이 발생하였다. 그러나 토파시티닙을 처리한 실험군 (파란색) 은 30일 이상 혈당이 250mg/dl 미만으로 장기간 유지되어 장기 생존이 가능함을 확인하였다. 즉, 도 2의 (B) 에 나타낸 바와 같이 이종 췌도를 생쥐에 이식한 후 토파시티닙을 사용하는 경우 이종 췌도의 장기 생존이 가능하였고, 이에 반해 이식거부 반응 억제에 현재 널리 사용하는 면역억제제인 타크로리무스를 사용한 경우는 장기 생존이 이루어지지 않았으므로 토파시티닙은 타크로리무스 등의 기존 약제에 비하여 췌도 이식 시 발생하는 면역 거부반응 억제 및 이식된 췌도의 생존에 매우 효과적인 약제임을 알 수 있다.

1.3 JAK 억제제의 이종췌도 이식 거부 반응 억제 효과 (원숭이)

앞서 실시예 1.2에서 마우스 간 이종 췌도 이식 거부 억제 효과를 확인하였으므로, 영장류인 원숭이에서도 동일한 면역 거부 반응 억제에 의한 췌도 장기생존 유도 효과를 나타내는지 여부를 확인하였다. 이를 확인하기 위하여 영장류-이종 췌도이식 혈당 데이터를 통한 분석, 면역 조직 염색, 초기 체액성 면역 반응 억제 분석을 수행하였다.

1.3.1 토파시티닙 처리에 따른 영장류-이종 췌도이식 혈당 데이터 분석

토파시티닙을 사용한 군과 사용하지 않는 대조군에서의 이식된 돼지 췌도의 생존율을 확인하기 위하여 영장류-이종 췌도이식 혈당 데이터를 측정하였다. 우선, 당뇨 원숭이에 돼지 췌도 100,000 IEQ를 마취 후 개복하여 장간막 정맥에 이식하였다.

공통 면역억제제 투여방법은 다음과 같다: 타크로리무스 (Advagraf®, Astellas Pharma Korea, Seoul, Korea, 목표혈중농도 3-6 ng/ml, 경구 투여, 하루 1회 투여, 이식 3 ~ 30일까지 투여), ATG (Thymoglobulin®, Genzyme, 5-10 mg/kg, 정맥투여, 이식 6, -4, -2 투여), 아달리무맙(Adalimumab)(Humira®, Abbott Laboratories, Queensborough, UK, 5mg/kg, 정맥 투여, 이식 당일 투여), CVF (Quidel, San Diego, CA, 100U/kg, 정맥투여, 이식 전날 투여), 시로리무스(Sirolimus) (Rapamune®, Wyeth, 목표혈중농도 3-6 ng/ml, 경구 투여, 하루 1회 투여, 이식 1부터 이식거부 반응 보일 때까지 투여). 대조군은 토파시티닙을 사용하지 않고, 실험군은 토파시티닙 (Xelzanz, Pfizer Korea, Seoul, Korea) 을 1.6 내지 4.4 mg/kg으로 하루 2회씩 이식 당일부터 거부 반응을 보일 때까지 경구 투여하였다. 이 후 돼지 췌도 영장류 이종 이식 후 혈당을 측정하였다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 토파시티닙을 사용하지 않은 대조군 3마리 (R087, R088, R131) 에서는 이식된 췌도의 거부반응이 토파시티닙을 사용한 군 (R159, R160, R161) 보다 빨리 발생하며 혈당이 적정 수준으로 유지되지 못하는 것을 확인하였다 (좌열). 반면 토파시티닙을 사용한 실험군 (우열) 에서는 돼지췌도 영장류 이종 이식 후 혈당 (회색), 외인성 인슐린 (분홍색), 돼지 C-peptide 그래프 (빨간색 및 검정색 역삼각형)가 적정 수준으로 매우 장기간 동안 유지됨을 확인하였다. 이러한 결과는 토파시티닙 처리에 따라 영장류 이종 췌도 이식 시 발생할 수 있는 면역 거부 반응이 효과적으로 억제되어 췌도의 장기 생존이 이루어짐을 나타내는 결과이며, 이를 통해 토파시티닙을 초기 및 유지 치료법(maintenance Therapy) 에 사용할 수 있음을 확인하였다. 이러한 결과는 토파시티닙 처리에 따라 영장류 이종 췌도 이식 시 발생할 수 있는 면역 거부 반응이 효과적으로 억제되어 췌도의 장기 생존이 이루어짐을 나타내는 결과이며, 이를 통해 토파시티닙을 초기 및 유지 치료법(maintenance Therapy) 에 사용할 수 있음을 확인하였다.

1.3.2 토파시티닙 처리에 따른 면역 조직화학 분석

면역 억제 요법에 토파시티닙 추가 유무에 따른 이식췌도편의 존재 여부 및 면역거부반응의 양상을 검증하기 위해서, 면역조직화학염색법을 이용한 현미경 관찰 방법을 사용하였다. 토파시티닙을 사용한 영장류와 사용하지 않은 영장류의 이식절편(이식된 부분을 생검하여 얻은 간 조직)에서 실제로 생존해 있는 췌도의 형태 및 면역거부 반응을 유발하는 면역세포의 분포를 확인하였다. 구체적으로, 약 20일, 약 200일 토파시티닙을 투여한 경우 약 190일 경에 생검하여 얻은 간 조직에 항-인슐린, 항-CD3, 항-CD68 항체를 이용하여 각각 이식된 간 조직 내에 인슐린 분비 베타세포, T세포, 대식세포가 분포하는 양상을 확인하였다. 각각 세포를 구분하기 위해 각각 다른 색의 발색제(chromogen)을 사용하였으며 각 표지 색은 다음과 같다: 인슐린(red), T 세포(brown), 대식세포(Blue). 측정 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 토파시티닙을 투여한 개체의 경우, 항-인슐린 항체에 반응하는 인슐린 분비 베타세포가 존재하며, 이식된 췌도 주변에 T세포와 대식세포 등의 면역세포의 침윤이 관찰되지 않으나(도 4b, d, f), 토파시티닙을 투여하지 않은 개체의 경우, 약 20일 경과 후 생검한 조직 내 이식된 췌도 주변에 다수의 T세포와 대식세포가 존재함을 확인하였다(도 4a, c). 그리고 약 200일이 경과된 경우 대부분의 췌도는 면역세포에 의해 파괴된 것을 확인하였다(도 4e). 이러한 결과는 토파시티닙이 이식 시 발생하는 면역 거부 반응으로부터 이식된 이종 췌도를 보호할 수 있음을 보여주는 결과이다.

1.3.3 토파시티닙 처리에 따른 초기 체액성 면역반응 억제 효과

췌도를 간 문맥으로 이식하는 경우 즉각성 혈액매개 염증반응에 의하여 수분내지는 수 시간 내에 이식된 췌도의 60-70%가 소실되는 것으로 알려져 있다. 토파시티닙이 이러한 이식 초기 즉각성 혈액 매개성 염증반응도 효과적으로 억제할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 상기 1.3.1 에 기술된 돼지 췌도의 영장류 이식 개체에서 췌도 이식 후 4 시간, 1, 3, 5일에 채혈을 했고, 혈청을 얻은 후 IL-6을 측정했다. 측정 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 토파시티닙을 처리하지 않은 원숭이는 염증성 사이토카인인 IL-6 가 4시간째 30pg/ml 까지 증가했지만 토파시티닙을 처리한 원숭이들에서는 5일까지 10pg/ml 보다 낮은 수준이 효과적으로 유지되었다.

토파시티닙에 의해 또 다른 즉각성 혈액매개 염증반응과 관련된 물질인 sCD40L가 억제되는지를 확인하기 위해서, 췌도 이식 후 15분, 30분, 1시간, 4시간, 1일, 3일, 5일차에 원숭이로부터 채혈을 했고, 혈청을 얻은 후 sCD154를 측정하였다. 측정 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 토파시티닙 처리군에서는 췌도 이식 후 15분, 30분, 1시간, 4시간, 1일, 3일, 5일차에 모두 sCD154 발현이 감소되어 있음을 확인하였다. 이에 따라 토파시티닙이 췌도의 이식 초기 증가하는 염증매개체인 sCD154 역시 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하였다.

이러한 결과는 토파시티닙이 췌도의 이식 초기에 증가하는 염증성 사이토카인을 억제할 수 있음을 보여주는 결과이며, 토파시티닙이 이식 초기 즉각성 혈액매개성 염증 반응의 예방 및 억제에 사용될 수 있음을 나타낸다.

실시예 2: JAK 억제제의 췌도보호 효과 확인

췌도 이식 시, 수용자의 이식 거부 반응으로부터 췌도를 보호하는 것 외에 췌도 자체를 보호하고 췌도 기능을 향상 시킬 수 있다면, 췌도 이식에 의한 당뇨병 치료를 더욱 효과적으로 달성할 수 있다. 따라서 토파시티닙이 이식에 의한 면역 반응 억제와 별개로 췌도 자체를 보호하는 기능을 갖는지 확인하였다.

2.1 토파시티닙의 산화적 스트레스에 대한 보호 효과 확인

토파시티닙이 저산소의 상황에서 흔히 발생하는 산화적 스트레스(Reactive-Oxygen species) 로부터 췌도를 보호하는 효과가 있는지 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 구체적으로, MIN6 세포주 (20-30계대) 를 15% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함한 DMEM(Gibco®, Invitrogen, UK)를 이용해 5% 이산화탄소 세포배양장치에서 배양하였다. 산화적 스트레스의 영향을 보기 위하여 0, 20, 50, 100 μM의 H₂O₂를 세포 배양시 첨가하였고, 그 조건 하에서 토파시티닙 0 nM, 300 nM, 1 μM, 3 μM, 10 μM을 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 72시간 후 세포의 생존율을 보기 위해 MTT 분석법을 수행하였으며 CCK-8 cell proliferation kit (Dojindo®, USA)를 이용하여 세포의 생존율을 측정하고, 측정 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7의 (A)에 나타낸 바와 같이 H₂O₂ 0, 20 μM, 50 μM, 100 μM 조건하에서 토파시티닙을 0, 0.3, 1, 3, 10 μM 처리한 결과 토파시티닙 처리군에서 흡광도가 높게 나타나 생존율이 증가하는 것을 확인하였다. 또한 도 7의 (B)와 (C) 에서도 H₂O₂를 처리하지 않은 조건에 비해 H₂O₂를 50 μM 혹은 100 μM 로 처리 하였을 때 유도되는 세포 생존율의 유의적 감소가 토파시티닙 1, 3 μM 처리에 의하여 유의적으로 증가될 수 있음을 확인하였다. 이러한 결과는 토파시티닙이 산화적 스트레스로 인한 췌도 세포의 사멸로부터 췌도 세포를 보호하여 췌도 세포의 생존율을 향상시킬 수 있음을 나타낸다.

2.2 토파시티닙의 자가 췌도 이식시 췌도 생존율 증가 효과 확인

이종 혹은 동종 이식과 달리 동계 이식은 면역학적인 거부반응보다 이식해주는 췌도의 생존율과 연관이 있다. 따라서 동계 한계 췌도 이식 시 토파시티닙 투여에 의하여 한계 췌도가 100% 정상 작용하는 것을 보임으로써 토파시티닙의 췌도 보호 효과를 동물실험으로 증명하기 위해서 다음과 같이 실험을 수행하였다. 구체적으로, Balb/c 생쥐를 희생하고 췌장에 0.5ug/ml 농도의 콜라겐분해효소 P (Collagenage P) 를 주입하고 분리하였다. 분리한 췌도를 37℃에서 20분간 콜라겐 분해효소 P와 반응시키고 1.108, 1.096, 1.069, 1.037 밀도의 불연속 밀도 구배 원심분리 (Discontinuous density gradient centrifugation)을 이용하여 순수한 췌도를 분리하였다. 분리한 Balb/c 생쥐의 췌도를 당뇨 유도된 동계 Balb/c 생쥐의 신장 피막에 200 IEQ (Islet equivalent, 150μm 지름의 췌도 하나의 단위) 를 이식하고 30일 동안 혈당을 측정하여 그래프로 나타내었다. 혈당유지를 하는데 필요한 한계량의 췌도(Marginal mass islet)를 동계 이식(Syngeneic transplantation)한 후 1일 2회씩 15mg/kg의 양으로 토파시티닙을 구강 투여하였다. 실험 결과를 도 8에 나타내었다.

이식해준 췌도가 동계 내에서 정상혈당을 유지 할 수 있게 해주는 한계량의 췌도 200IEQ를 주었을 때 50퍼센트는 정상혈당을 유지하고 50퍼센트는 유지하지 못하게 된다. 그러나 도 8에 나타낸 바와 같이, 토파시티닙 투여 그룹 (B) 은 100% 모두 정상 혈당에 도달함을 확인하였다. 반면, 토파시티닙을 투여 받지 않은 대조군 (A) 의 경우 한계치 췌도를 이식한 경우 50퍼센트(2/4)만이 정상 혈당에 도달하였다. 따라서 정상혈당을 유지 할 수 있는 (50% 확률, Marginal Mass) 최소량의 자가 췌도를 이식하는 실험에서 토파시티닙을 처리하면 췌도의 생존율의 증가로 혈당 조절이 용이해질 수 있다는 것을 확인하였으며, 즉 정상적인 혈당조절에 필요한 췌도 이식 요구량이 감소하여 적은 양의 췌도로도 당뇨병 치료가 가능해짐을 확인하였다.

2.3 영장류에서 토파시티닙의 사용 유무에 따른 초기 islet 손실 비교

기존의 통상적인 면역요법에 토파시티닙을 추가함에 따라 이식췌도편의 생존율이 증가되는지 여부를 검증하기 위해, 현미경 관찰을 통해 직접적인 생존율 측정을 수행하였다. 토파시티닙 (Xelzanz, Pfizer Korea, Seoul, Korea)을 이식 당일부터 거부 반응을 보일 때까지 하루 2회씩 1.6 내지 4.4 mg/kg 로 경구 투여한 영장류와 토파시티닙을 사용하지 않은 영장류의 이식 절편 (이식된 부분을 생검하여 얻은 간 조직)에서 실제로 생존해 있는 췌도의 수를 확인하였다. 토파시티닙을 투여하지 않은 개체는 약 200일 경, 토파시티닙을 투여한 개체는 약 190일 경에 생검하였다. 생검된 조직에서 항-인슐린 항체를 이용한 면역염색법을 이용하여 인슐린을 분비하는 베타세포임을 확인하고, 각각의 개체의 간 조직 전체에 분포하는 췌도의 수를 확인한 후, 단위면적(1㎠) 당 존재하는 췌도의 수로 환산하여 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타낸 바와 같이, 토파시티닙을 처리한 개체에는 약 3.37개의 췌도가 존재하였으며, 토파시티닙을 투여하지 않은 경우 약 1.65개의 췌도가 존재하였음을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 토파시티닙을 처리한 경우 췌도의 생존율이 약 2배 높은 것을 확인하였다. 이는 기존의 관습적인 면역억제요법에 비교하여 토파시티닙을 추가하면 이식 초기 췌도의 생존율을 더욱 증가시킬 수 있음을 보여주는 결과이다. 또한 토파시티닙이 이식 반응에서의 초기 즉각성 혈액 매개성 염증 반응에 의한 췌도의 손실로부터 췌도를 효과적으로 보호할 수 있다는 결과와도 일치하는 결과이다.

2.4 룩소리티닙 ( Ruxolitinib ) 및 JANEX - 1 의 산화적 스트레스에 대한 보호 효과 확인

JAK1,2 억제제인 룩소리티닙과 다른 JAK3 억제제인 JANEX-1이 토파시티닙과 같이 저산소의 상황에서 흔히 발생하는 산화적 스트레스(Reactive-Oxygen species)로부터 췌도를 보호하는 효과가 있는지 확인하기 위한 실험을 수행하였다. MIN6 세포주 (20-30계대) 는 15% FBS, 1% Penicillin-streptomycin을 포함한 DMEM(Gibco®, Invitrogen, UK)를 이용해 5% 이산화탄소 세포배양장치에서 배양하였다. 산화적 스트레스의 영향을 보기 위하여 50μM의 H₂O₂를 세포 배양시 첨가하였고, 그 조건 하에서 룩소리티닙 및 JANEX-1 을 0nM, 100nM, 300 nM, 1μM, 3μM 로 처리하여 24시간 혹은 72시간 동안 배양한 후 세포의 생존율을 MTT 분석을 통해 확인하였다. CCK-8 cell proliferation kit (Dojindo®, USA)를 이용하여 세포의 생존율을 측정하였고, 24시간 및 72시간 배양에 따른 결과를 도 10 및 도 11 에 나타내었다.

도 10 및 도 11 에 나타낸 바와 같이, H₂O₂ 스트레스가 가해진 세포들에서는 흡광도가 감소하여 세포 생존율이 감소하였으나, 룩소리티닙과 JANEX-1을 처리한 경우 세포 생존율이 증가하는 것을 확인하였다.

2.5 룩소리티닙 ( Ruxolitinib ) 및 토파시티닙의 세포자멸사 억제 효과

JAK1,2 억제제인 룩소리티닙과 JAK3 억제제인 토파시티닙의 췌도 세포자멸사 억제 기능을 MIN6 세포주를 이용하여 확인하였다. 먼저 MIN6 세포주 (20-30계대) 는 15% FBS, 1% Penicillin-streptomycin을 포함한 DMEM(Gibco®, Invitrogen, UK)를 이용해 5% 이산화탄소 세포배양장치에서 배양하였다. 산화적 스트레스의 영향을 보기 위하여 50μM의 H₂O₂를 세포 배양시 첨가하였고, 그 조건 하에서 토파시티닙 또는 룩소리티닙을 5μM 로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 세포사멸을 보기 위해 Annexin V / PI staining을 실시하였고 FACS로 데이터를 관찰하였으며, 그 결과를 도 12에 나타내었다.

도 12에 나타낸 바와 같이 토파시티닙 및 룩소리티닙을 처리한 결과 MIN6 세포주에 유도된 산화적 스트레스 조건에서 세포자멸사의 증가가 토파시티닙 및 룩소리티닙 처리에 의해 현저하게 감소되는 것을 확인하였다. 또한 생쥐 췌도를 분리 후 24시간 배양시 토파시티닙과 룩소니티닙을 5uM로 전처리하여 세포자멸사의 비율이 줄고 생존한 세포의 비율이 올랐음을 확인하였다.

실시예 3: 토파시티닙의 투여 용량 및 투여 시기 확인

3.1 췌도 이식시 면역 거부 반응 억제를 위한 토파시티닙의 투여 용량 확인

토파시티닙이 췌도 이식 시 발생하는 면역 거부 반응을 효과적으로 억제할 수 있고, 췌도 보호 효과를 나타낼 수 있음을 실시예 1 및 2를 통해 확인하였다. 추가적으로 토파시티닙의 최적의 투여 용량 및 투여 방법을 확인하기 위한 실험을 약물동력학, 약력학적 데이터를 통해 확인하였다. 영장류 3마리(약 6-7kg, 평균 6.5kg, R144, R15, R51)에 각각 15mg/일로 토파시티닙을 처리한 후 약물동력학(pharmacodynamics)을 분석한 결과를 도 13에 나타내었다.

도 13에 나타낸 바와 같이, 약효 지속시간은 8 내지 18시간으로 개체간의 차이를 보였다. 따라서 24시간인 경우 6.5kg 원숭이를 기준으로 계산하면 3.0-6.7mg/kg/day 로 처리함이 바람직한 것으로 확인하였다. 이를 토대로 토파시티닙은 17 시간, 7시간으로 나누어서 3.8 내지 5.8 mg/kg/일로 투여하여 이종 췌도 이식에 사용하였으며, 이를 사람에 대하여 환산하면 1.26-1.93mg/kg/day에 해당된다.

건선을 적용증으로 하는 임상 1상의 MaximμM tolerable dosage 확인 연구에서 토파시티닙의 인간 투여량은 50mg/BID, 14일 연속투여로 보고된 바 있다. 성인의 평균 몸무게인 50 내지 70kg 을 기준으로 환산 시 이는 1.42 내지 2mg/kg/day 에 해당한다. 인간 췌도 이식 시 거부 반응 억제에 필요한 토파시티닙 환산 값인 1.26-1.93mg/kg/day 는 상기 환산 수치 범위에 포함되는 바, 위험성 없이 인간에게 투여할 수 있는 투여 방법임을 알 수 있다.

한편 류마티스 관절염을 적용증으로 하는 경우 토파시티닙은 11mg/day 투여되고 있으며, 이를 50 내지 70kg 으로 환산하는 경우 0.16 내지 0.22mg/kg/day 이므로, 췌도 이식 시에는 류마티스 관절염에 사용하는 것보다 고용량으로 투여하는 하는 것이 효과적이라는 것을 확인하였다.

이러한 투여 용량의 환산 결과를 다음 표 1 에 정리하여 나타내었다.

[표 1]

3.2 췌도 이식시 면역 거부 반응 억제를 위한 토파시티닙의 투여 시기 확인

이식된 췌도의 장기생존을 위해서는 이식초기 췌도의 생존을 유지할 방법이 매우 중요하며, 앞서 실시예 1 및 2에서 확인한 바와 같이 JAK 억제제는 효과적으로 췌도의 소실을 막고 췌도를 보호할 수 있다. 이때 JAK 억제제의 적절한 투여 시기 및 방법을 확인하기 위한 실험을 수행하였다.

이종 췌도 이식 초기에 JAK1,2 억제제인 룩소리티닙을 13일까지 사용하고 14일부터 JAK 3 억제제인 토파시티닙을 사용할 때와 토파시티닙을 단독으로 사용할 때 초기 췌도 생존율을 비교하였다. 당뇨 원숭이에 돼지 췌도 100,000 IEQ를 마취 후 개복하여 장간막 정맥에 이식하였다. 공통된 면역억제제로 타크로리무스, ATG, 휴미라, CVF, 시롤리무스(Sirolimus)를 사용하였으며, 초기 13일까지 JAK 1,2 억제제인 룩소리티닙을 사용 후 14일부터 JAK 3 억제제인 토파시티닙을 사용한 실험군, 초기부터 토파시티닙을 사용한 실험군에서의 혈당, 외인성 인슐린 돼지 및 원숭이 C-펩타이드를 확인한 결과를 도 14에 나타내었다.

도 14에 나타낸 바와 같이, 초반부터 토파시티닙 (JAK 3 억제제)을 처리한 실험군이 후기에 토파시티닙을 처리한 실험군보다 혈당 조절이 더 잘 이루어진다는 것을 확인하였다. 즉, 토파시티닙을 이식 초기부터 사용함으로써 췌도의 생존율이 증가하므로, 토파시티닙을 이식초기 즉각성 혈액 매개성 염증반응(IBMIR) 예방 용도에 사용할 수 있음을 다시 한 번 확인하였다.

실시예 4. 토파시티닙의 복합 면역억제 효과 확인

토파시티닙의 복합 면역억제 효과를 확인하기 위해서, 당뇨 원숭이에 돼지췌도 100,000 IEQ를 마취 후 개복하여 장간막 정맥에 이식하였다. 면역억제요법으로 타크로리무스, ATG, 휴미라, CVF, 아나킨라(Anakinra), 시릴로무스, 리툭시맙, 조절 T 세포, 토파시티닙을 사용하였고 면역 프로토콜을 도 15에 나타내었다. 돼지췌도 영장류 이종이식 후 혈당(회색), 외인성인슐린(분홍색), 돼지 및 원숭이 C-peptide 그래프(빨간색 및 검정색 역삼각형)를 확인하였다. 실험 결과를 도 16에 나타내었다.

도 16에 나타낸 바와 같이, 사람에게 췌도 이식 시 다양한 종류의 면역 억제제가 복합적으로 투여되어야 하는데, 토파시티닙은 기존의 면역억제제와 복합적으로 투여하는 경우 시너지 효과를 통해 췌도 이식시 거부반응 억제를 매우 효과적으로 달성할 수 있음을 확인하였다. 즉, 영장류에 돼지 췌도를 이식 시 기존 요법인 타크로리무스, 라팜마이신 등의 일반적인 면역억제제 조합을 사용한 경우 장기 생존이 어려우나 토파시티닙을 추가하여 복합 투여 한 경우 이식된 췌도의 장기 생존을 유도할 수 있다. 따라서 토파시티닙은 기존의 타크로리무스, 라팜마이신과 복합 제제로 순차적으로 투여하여 유지요법(Maintenance therapy)에 사용될 수 있다.

비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한 첨부된 청구 범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.

Claims (23)

1. JAK(Janus Kinase) 억제제를 포함하는 면역 반응 억제용 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 JAK 억제제는 JAK1, JAK2 및 JAK3로 이루어진 군에서 선택된 1종의 억제제인 것을 특징으로 하는, 면역 반응 억제용 조성물.
3. 제2항에 있어서, 상기 JAK3 억제제는 토파시티닙(Tofacitinib)인, 면역반응 억제용 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 JAK 억제제는 Th1 또는 Th17 세포 선택적 억제제인 것을 특징으로 하는, 면역 반응 억제용 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 면역 반응은 장기, 조직 및 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상 이식편에 대한 면역 거부 반응인 것을 특징으로 하는, 면역 반응 억제용 조성물.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 이식편은 췌장 또는 췌도인 것을 특징으로 하는, 면역 반응 억제용 조성물.
   
7. 제3항에 있어서, 상기 토파시티닙은 이식편의 생존율을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 면역 반응 억제용 조성물.
   
8. 제3항에 있어서, 상기 토파시티닙은 인간에게 투여 시, 1.0 내지 2 mg/kg/일로 투여되는 것을 특징으로 하는, 면역 반응 억제용 조성물.
   
9. 토파시티닙 및 면역억제제를 포함하는 면역 반응 억제용 복합 제제.
   
10. 제9항에 있어서, 상기 면역억제제는 ATG(anti-thymoglobulin), 시롤리무스, 메틸 프레드니솔론, 코르티코스테로이드, 항증식성 제제, 시클로스포린, 타크로리무스, 마이코페놀레이트 모페틸, 미조루빈, 데옥시스퍼구알린, 브레퀴나르 나트륨, 레플루노미드, 아자스피란, 휴미라, 시롤리무스, 아나킨라, 리툭시맙, 코브라독인자(CVF) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 면역 반응 억제용 복합 제제.
    
11. 제9항에 있어서, 상기 토파시티닙 및 면역억제제는 순차적으로 투여되는 것을 특징으로 하는, 면역 반응 억제용 복합 제제.
    
12. 토파시티닙을 포함하는 면역 반응 억제 보조용 조성물.
    
13. JAK(Janus Kinase) 억제제를 포함하는 췌도 보호용 조성물.
    
14. 제13항에 있어서, 상기 JAK 억제제는 JAK1, JAK2 및 JAK3로 이루어진 군에서 선택된 1종의 억제제인 것을 특징으로 하는, 췌도 보호용 조성물.
    
15. 제13항에 있어서, 상기 JAK 억제제는 JAK 1 또는 JAK2 억제제이며, 룩소티닙(Ruxolitinib), 오클라시닙(Oclacitinib), 바리티니닙(Baricitinib), 필고티닙(Filgotinib), 간두티닙(Gandotinib), 레스타우리티닙(Lestaurtinib), 파피리티닙(Pacritinib) 및 페드라티닙(Fedratinib)으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는, 췌도 보호용 조성물.
    
16. 제13항에 있어서, 상기 JAK 억제제는 JAK3 억제제이며, JANEX-1, 토파시티닙(Tofacitinib), WHI-P154 (CAS number: 211555-04-3), 페피시티닙(Peficitinib), ZM 39923 HCl (CAS number: 1021868-92-7) 및 AT9283 (CAS number: 896466-04-9) 로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는, 췌도 보호용 조성물.
    
17. 제13항에 있어서, 상기 JAK 억제제는 이식 초기 췌도 보호용인 것을 특징으로 하는, 췌도 보호용 조성물.
    
18. 제13항에 있어서, 상기 JAK 억제제는 췌도를 산화적 스트레스로부터 보호하는 것을 특징으로 하는, 췌도 보호용 조성물.
    
19. 제13항에 있어서, 상기 JAK 억제제는 산화적 스트레스에 의한 세포 자멸사를 억제하는 것을 특징으로 하는, 췌도 보호용 조성물.
    
20. 제13항에 있어서, 상기 JAK 억제제는 췌도의 생존율을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 췌도 보호용 조성물.
    
21. 제13항에 있어서, 상기 JAK 억제제는 이식 초기 즉각성 혈액 매개성 염증 반응 (instant blood-mediated inflammatory reaction) 에 의한 췌도 사멸 억제용인 것을 특징으로 하는, 췌도 보호용 조성물.
    
22. JAK(Janus Kinase) 억제제를 포함하는 췌도 세포 결함 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    
23. 제22항에 있어서, 상기 췌도 세포 결함 질환은 제1 당뇨병, 제2형 당뇨병 및 당뇨병성 만성 신질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환인 것을 특징으로 하는, 췌도 세포 결함 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.

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