KR20180008256A - Composition for producing phosphorylated tagatose from phosphorylated fructose derivative comprising Fructose 1,6-bisphosphate aldolase from Caldicellulosiruptor sp. as effective component - Google Patents

Composition for producing phosphorylated tagatose from phosphorylated fructose derivative comprising Fructose 1,6-bisphosphate aldolase from Caldicellulosiruptor sp. as effective component Download PDF

Info

Publication number
KR20180008256A
KR20180008256A KR1020170031142A KR20170031142A KR20180008256A KR 20180008256 A KR20180008256 A KR 20180008256A KR 1020170031142 A KR1020170031142 A KR 1020170031142A KR 20170031142 A KR20170031142 A KR 20170031142A KR 20180008256 A KR20180008256 A KR 20180008256A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ala
glu
fructose
lys
gly
Prior art date
Application number
KR1020170031142A
Other languages
Korean (ko)
Other versions
KR101826835B1 (en
Inventor
신홍식
이상왕
백민석
Original Assignee
(주)케비젠
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by (주)케비젠 filed Critical (주)케비젠
Priority to KR1020170031142A priority Critical patent/KR101826835B1/en
Publication of KR20180008256A publication Critical patent/KR20180008256A/en
Application granted granted Critical
Publication of KR101826835B1 publication Critical patent/KR101826835B1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C07H1/02—Phosphorylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/02—Aldehyde-lyases (4.1.2)
    • C12Y401/02013—Fructose-bisphosphate aldolase (4.1.2.13)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

The present invention relates to a composition for producing phosphorylated tagatose from phosphorylated fructose derivatives containing fructose 1, 6-bisphosphate aldolase derived from strains in caldicellulosiruptor as an effective component. According to the present invention, the activity of fructose 1, 6-bisphosphate aldolase converts fructose 1-phosphate, fructose 1, 6-bisphosphate, fructose 6-phosphate, and fructose derivatives, expressed in chemical formulas 1 and 2, into phosphorylated tagatose. As such, the composition is capable of having high applicability for the production of tagatose by making fructose 1, 6-bisphosphate aldolase have the diversity of characteristics; being eco-friendly by using enzymes from organisms; requiring only a simple enzyme fixation procedure; and being very useful for relevant industries by significantly reducing costs for production with a high conversation rate as well as maximizing production.

Description

칼디셀룰로시럽터 속 균주 유래의 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소를 유효성분으로 함유하는 인산화 과당 유도체로부터 인산화 타가토스를 생산하기 위한 조성물{Composition for producing phosphorylated tagatose from phosphorylated fructose derivative comprising Fructose 1,6-bisphosphate aldolase from Caldicellulosiruptor sp. as effective component}Composition for producing phosphorylated tagatose from phosphorylated fructose derivative comprising Fructose containing fructose 1,6-bisphosphate aldolase enzyme derived from the strain of the genus Caldicellulose as an active ingredient {Composition for producing phosphorylated tagatose from phosphorylated fructose derivative comprising Fructose 1,6-bisphosphate aldolase from Caldicellulosiruptor sp. as effective component}

본 발명은 칼디셀룰로시럽터 속 균주 유래의 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소를 유효성분으로 함유하는 인산화 과당 유도체로부터 인산화 타가토스를 생산하기 위한 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for producing phosphorylated tagatose from a phosphorylated fructose derivative containing a fructose 1,6-bisphosphate aldolase enzyme derived from a strain of the genus Caldicellulose syrup as an active ingredient.

타가토스를 생산하는 첫 번째 방법으로 갈락티톨(D-galactitol)을 산화시켜서 타가토스를 생산할 수 있다. 이 경우 생체전환 최대 수율은 92%인 것으로 보고하였다. 그러나 갈락티톨의 원료로서의 사용 불가능성과 높은 비용 때문에 대규모 타가토스의 생산에는 사용되지 못하고 있다.The first way to produce tagatose is to oxidize galactitol (D-galactitol) to produce tagatose. In this case, the maximum yield of biotransformation was reported to be 92%. However, due to the inability to use galactitol as a raw material and high cost, it has not been used for large-scale production of tagatose.

두 번째 방법으로 사이코스(D-psicose)로부터 타가토스를 제조하는 방법이 제안되었다. 사이코스는 희귀한 당이지만, 슈도모나스 시코리(Pseudomonas cichorii)나 로도박터 스패로이데스(Rhodobacter sphaeroides)로부터의 D-타가토스 3-에피머레이즈 또는 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)로부터의 D-사이코스 3-에피머레이즈를 사용하여 상대적으로 싼 원료인 프럭토스(D-fructose)를 에피머화하여 생산할 수 있다. 그러나 사이코스를 통해 프럭토스로부터 타가토스를 생산하는 방법은 상업적인 적용성은 매우 희박한 것으로 알려져 있다.As a second method, a method of preparing tagatose from D-psicose has been proposed. Between each course, but rare, Pseudomonas Classico Lee (Pseudomonas cichorii) or Rhodobacter seupaeroyi Death (Rhodobacter sphaeroides ) from D-tagatose 3-epimerase or Agrobacterium tumerfaciens ( Agrobacterium tumefaciens ) can be produced by epimerizing D-fructose, a relatively inexpensive raw material, using D-psicose 3-epimerase. However, it is known that the method of producing tagatose from fructose through psychosis has very little commercial applicability.

세 번째 방법으로 갈락토스를 이성화시키는 경제적인 방법이 제안되었다. 갈락토오스는 화학적 또는 효소 이성화할 수 있다. 타가토스의 생산을 위한 화학적 방법은 Biospherics Inc. (USA)에 의해 개발 및 특허(미국등록특허 제5002612호)되었다. 상기 미국등록특허 제5002612호에 따르면, 수산화칼슘과 촉매로서 염화칼슘을 이용하여 갈락토오스를 이성화하여 타가토스를 생성할 수 있다고 보고했다. 수산화칼슘은 강 알칼리성 조건과 상대적으로 낮은 온도에서 타가토스와 불용성 복합체를 형성한다. 이러한 현탁액에 산, 바람직하게는 이산화탄소를 처리하면 복합체로부터 타가토스를 유리시킬 수 있다. 불용성 칼슘염은 여과과정을 통해 제거하고, 나머지 이온은 이온 교환 크로마토그래피를 이용해 제거할 수 있다. 이후 순수한 타가토스는 결정화를 통해 얻을 수 있다. 그러나 이 화학적 방법은 부산물 및 화학 폐기물 형성과 같은 몇 가지 단점을 가지고 있다. 이 방법에는 반응 혼합물의 집중적인 냉각을 필요로 하기 때문에 에너지 소비가 많은 공정이라는 단점을 가지고 있다.As a third method, an economical method of isomerizing galactose has been proposed. Galactose can be chemically or enzymatically isomerized. Chemical methods for the production of tagatose are provided by Biospherics Inc. (USA) developed and patented (US Patent No. 5002612). According to the US Patent No. 5002612, it is reported that tagatose can be produced by isomerizing galactose using calcium hydroxide and calcium chloride as a catalyst. Calcium hydroxide forms insoluble complexes with tagatose in strongly alkaline conditions and at relatively low temperatures. Treatment of such a suspension with an acid, preferably carbon dioxide, can liberate tagatose from the complex. The insoluble calcium salt can be removed through filtration, and the remaining ions can be removed using ion exchange chromatography. Subsequently, pure tagatose can be obtained through crystallization. However, this chemical method has several disadvantages, such as the formation of by-products and chemical waste. This method has the disadvantage of being an energy consuming process because it requires intensive cooling of the reaction mixture.

갈락토오스에서 타가토스를 생산하는 효소 방법은 생체촉매로 L-아라비노스 이성화효소를 사용하는 방법이다. 대부분의 L-아라비노스 이성화효소는 최적활성을 보이는 온도가 60 내지 95℃로 매우 높고, 최적 pH 7 이상이다. 더욱이, 대부분의 L-아라비노스 이성화효소가 고활성과 안정성을 갖게 하기 위해서는 Mn2 + 또는 Co2 +와 같은 금속이온을 필요로 하고 있다. 산업적 적용을 위한 산성 pH와 저에너지 공정을 위한 낮은 반응 온도 및 Co2 +와 같은 식품적용 부적합한 이온 사용 등은 개선해야 할 문제점으로 지적되고 있다.The enzyme method for producing tagatose from galactose is a method using L-arabinose isomerase as a biocatalyst. Most of the L-arabinose isomerase has an optimum activity temperature of 60 to 95°C, which is very high, and an optimum pH of 7 or more. Moreover, in order for most of the L-arabinose isomerases to have high activity and stability, metal ions such as Mn 2 + or Co 2 + are required. Acidic pH for industrial applications, low reaction temperatures for low energy processes, and the use of ions inappropriate for food applications such as Co 2 + are pointed out as problems to be improved.

이와 같은 문제점을 해결하기 위해, 원료의 수급이 안정적이고 낮은 가격의 포도당이나 프럭토스를 기질로 하며, 화학적인 전환법이나 고비용 효소전환법이 아닌 저비용 효소전환법을 이용하여 타가토스를 생산하는 방법이 활발히 연구되고 있는 실정이다.In order to solve such a problem, a method of producing tagatose using a low-cost enzyme conversion method rather than a chemical conversion method or high-cost enzymatic conversion method, with a stable supply and demand of raw materials and low-priced glucose or fructose as a substrate. This situation is being actively studied.

단당류는 탄소의 수에 따라 이탄당(glycoladehyde), 삼탄당(glyceraldehyde, dihydroxyacetone), 사탄당(erythrose, threose, erythrulose), 오탄당(arabinose, lyxose, bibose, xylose, ribulose, xylulose), 육탄당(allose, altrose, glucose, mannose, gulose, idose, galactose, talose, psicose, fructose, sorbose, tagatose), 칠탄당(sedoheptulose, mannoheptulose) 등 각각이 D-및 L-forms 형태로 존재한다. 이들 상호간의 전환은 이성화 효소와 에피머화 효소가 관여하는 것으로 알려져 있다. 단당류 에피머화와 이성화는 생물전환을 이용한 산업에서 매우 중요한 기반 기술이다. 에피머화 효소는 단당류의 특정 위치의 -OH기를 치환하는 기능을 가지고 있으며, 이러한 에피머화 효소를 이용한다면 하나의 단당류를 다양한 다른 단당류로의 전환이 가능하다.Monosaccharides are glycoladehyde, glyceraldehyde, dihydroxyacetone, satanose (erythrose, threose, erythrulose), pentose (arabinose, lyxose, bibose, xylose, ribulose, xylulose), and allose, depending on the number of carbons. , altrose, glucose, mannose, gulose, idose, galactose, talose, psicose, fructose, sorbose, tagatose, and heptane sugar (sedoheptulose, mannoheptulose), etc., exist in the form of D- and L-forms, respectively. It is known that the isomerization enzyme and the epimerization enzyme are involved in these conversions. Monosaccharide epimerization and isomerization are very important underlying technologies in the biotransformation industry. Epimerization enzymes have a function of substituting -OH groups at specific positions of monosaccharides, and if these epimerization enzymes are used, one monosaccharide can be converted into various other monosaccharides.

예로서, D-글루코스(D-glucose)의 2번 탄소, 3번 탄소, 4번 탄소, 5번 탄소 각각의 -OH기를 전환하는 에피머화 효소를 이용한다면, 천연으로부터 풍부하게 얻을 수 있는 D-글루코스로부터 D-만노스(D-mannose), D-알로스(D-allose), D-갈락토스(D-galactose), L-아이도스(L-idose)와 같은 희소성이 높은 다양한 단당류로 전환이 가능하게 되고 특히, 육탄당에서 5번 탄소 -OH기와 오탄당에서 4번 탄소 -OH기를 전환하는 에피머화 효소의 경우는 D-form 단당에서 자연계에는 거의 존재하지 않는 L-form 단당으로 전환이 가능하기에 단당류 전환에 에피머화 효소를 이용할 경우 새로운 개념의 산업적 생산법에 의한 파급 효과는 매우 클 것으로 예상된다.For example, if you use an epimerase that converts the -OH group of carbon 2, carbon 3, carbon 4, and carbon 5 of D-glucose, D- which can be obtained abundantly from nature It enables conversion from glucose to various monosaccharides with high scarcity such as D-mannose, D-allose, D-galactose, and L-idose. In particular, in the case of the epimerization enzyme that converts the 5th carbon -OH group from the hexose and the 4th carbon -OH group from the pentose, it is possible to convert from D-form monosaccharide to L-form monosaccharide, which is hardly present in nature. When epimerization enzymes are used for conversion, the ripple effect of the new concept of industrial production method is expected to be very large.

현재까지 보고된 단당 4-에피머화 효소는 보고된 바 없다. 이와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 단당의 에피머화에 관여하는 효소 발굴에 관하여 활발히 연구되고 있고 본 발명자들은 세균과 진균에서 프럭토스 6-포스페이트를 타가토스 6-포스페이트로 전환하는 능력을 갖는 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈를 발굴하여 특허를 출원하였다(한국공개특허 제2015-0025703호 및 한국공개특허 제2015-0042391호). 이들 특허는 헥소카이네즈를 사용하여 과당의 6번째 탄소에 인산기를 붙여 프럭토스 6-포스페이트를 만들고 이를 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈를 활용하여 타가토스 6-포스페이트로 전환한 후 피테이즈를 처리하여 인산기를 제거함으로써 타가토스가 생산되는 세가지 효소의 컴비네이션 반응이다. 이때 헥소카이네이즈를 사용하기 위해서는 인산기의 소스가 되는 생체내 물질인 아데노신 트리포스페이트(ATP)가 기질인 과당과 당량으로 필요하다. 이 물질은 가격이 높아 상업적 규모로 적용하는데 제한적이라는 문제점이 발생한다. 이에 본 발명자는 칼디셀룰로시럽터(Caldicellulosiruptor) 속으로부터 유래한 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈를 신규로 발굴하였고, 이 효소들은 기존의 타가토스 생산에 사용된 프럭토스 6-포스페이트는 물론 프럭토스 1-포스페이트, 프럭토스 1,6-비스포스페이트 모두를 타가토스로 전환하는 능력을 확인했다.No monosaccharide 4-epimerase has been reported to date. In order to solve such a problem, research has been actively conducted on the discovery of enzymes involved in the epimerization of monosaccharides, and the present inventors have studied fructose 1 having the ability to convert fructose 6-phosphate to tagatose 6-phosphate in bacteria and fungi. ,6-bisphosphate aldolase was discovered and applied for a patent (Korean Patent Publication No. 2015-0025703 and Korean Patent Publication No. 2015-0042391). These patents use hexokinase to make fructose 6-phosphate by attaching a phosphate group to the 6th carbon of fructose, and convert it to tagatose 6-phosphate using fructose 1,6-bisphosphate aldolase, and then phytase. It is a combination reaction of three enzymes in which tagatose is produced by removing a phosphoric acid group by treatment. At this time, in order to use hexokinase, adenosine triphosphate (ATP), an in vivo substance that serves as a source of phosphate groups, is required in an equivalent amount of fructose as a substrate. Due to the high cost of this material, there is a problem that it is limited to be applied on a commercial scale. Accordingly, the present inventor newly discovered fructose 1,6-bisphosphate aldolase derived from the genus Caldicellulosiruptor, and these enzymes are not only the fructose 6-phosphate used in the conventional tagatose production, but also The ability to convert both fructose 1-phosphate and fructose 1,6-bisphosphate into tagatose was confirmed.

한국공개특허 제2015-0025703호에서는 '기질 및 효소 컴비네이션 반응을 이용한 프럭토스로부터 타가토스 생산용 조성물 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2015-0042391호에서는 '기질 및 효소 컴비네이션 반응을 이용한 프럭토스로부터 타가토스 생산용 조성물 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이, '칼디셀룰로시럽터 속 균주 유래의 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소를 유효성분으로 함유하는 인산화 과당 유도체로부터 인산화 타가토스를 생산하기 위한 조성물'에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.Korean Patent Publication No. 2015-0025703 discloses'a composition for producing tagatose from fructose using a substrate and enzyme combination reaction, and uses thereof', and Korean Patent Publication No. 2015-0042391 discloses a'substrate and enzyme combination reaction. Although the composition for producing tagatose and its use is disclosed from the fructose used, as in the present invention, it contains as an active ingredient a fructose 1,6-bisphosphate aldolase enzyme derived from a strain of the genus Caldicellulose. The composition for producing phosphorylated tagatose from phosphorylated fructose derivatives is not known at all.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 프럭토스로부터 타가토스를 생산하는 선행 특허의 효소전환반응 중에서 기질이 프럭토스 6-포스페이트로 제한되는 것을 극복하기 위해 타가토스 전환활성을 가진 칼디셀룰로시럽터 속(Caldicellulosiruptor sp.) 유래 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈(Fructose 1,6-bisphosphate aldolase) 효소를 확보하여, 이 효소를 이용한 다양한 인산화 과당 또는 이들의 유도체를 기질로 이용하여 고수율의 타가토스(tagatose) 생산법을 제공하고자 한다.The present invention was derived from the above requirements, and in the present invention, in order to overcome the limitation of the substrate to fructose 6-phosphate in the enzymatic conversion reaction of the prior patent for producing tagatose from fructose, the tagatose conversion activity was improved. With Kaldi Cellulose Syrup Caldicellulosiruptor sp.) derived fructose 1,6-bisphosphate aldolase (Fructose 1,6-bisphosphate aldolase) enzyme was obtained, and a variety of phosphorylated fructose or derivatives thereof using this enzyme were used as a substrate to obtain high-yield tagatose ( tagatose) production method.

따라서, 본 발명에서는 프럭토스 1-포스페이트(fructose 1-phosphate), 프럭토스 6-포스페이트(fructose 6-phosphate), 프럭토스 1,6-비스포스페이트(fructose 1,6-bisphosphate) 또는 이들의 유도체를 기질로 하여 본 발명에서 칼디셀룰로시럽터 속 균주에 속하는 7종의 균주로부터 분리한 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소를 처리한 결과, 고수율로 인산화 타가토스가 생산되는 것을 확인하였다.Therefore, in the present invention, fructose 1-phosphate, fructose 6-phosphate, fructose 1,6-bisphosphate, or derivatives thereof As a substrate, as a result of treatment with fructose 1,6-bisphosphate aldolase enzyme isolated from 7 strains belonging to the genus Caldicellulose strain in the present invention, it was confirmed that phosphorylated tagatose was produced in high yield. .

또한, 프럭토스 6-포스페이트에 대해 기질 특이성을 가진다고 이미 알려진 칼디셀룰로시럽터 사카로리티커스(Caldicellulosiruptor saccharolyticus), 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 및 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) 유래의 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈를 상이한 기질로서 프럭토스 1-포스페이트(fructose 1-phosphate), 프럭토스 1,6-비스포스페이트(fructose 1,6-bisphosphate) 또는 이들의 유도체 및 프럭토스 6-포스페이트(fructose 6-phosphate) 유도체에 처리한 결과, 고수율로 인산화 타가토스가 생산되는 것을 확인하였다. In addition, Caldicellulosiruptor Saccharoliticus (Caldicellulosiruptor) , which is already known to have substrate specificity for fructose 6-phosphate. saccharolyticus ), Escherichia coli ), Bacillus subtilis , Kluyveromyces lactis ) and Streptococcus thermophilus derived from fructose 1,6-bisphosphate aldolase as different substrates fructose 1-phosphate (fructose 1-phosphate), fructose 1,6-bisphosphate (fructose) 1,6-bisphosphate) or a derivative thereof and a fructose 6-phosphate derivative, it was confirmed that phosphorylated tagatose was produced in a high yield.

따라서, 상기한 바와 같이 본 발명은 다양한 기질 특이성을 가지는 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소를 개발함으로써, 본 발명을 완성하였다.Accordingly, as described above, the present invention has completed the present invention by developing a fructose 1,6-bisphosphate aldolase enzyme having various substrate specificities.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 칼디셀룰로시럽터(Caldicellulosiruptor), 에스케리키아(Escherichia), 바실러스(Bacillus), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 및 스트렙토코커스 (Streptococcus) 속 미생물로 이루어진 군으로부터 선택되는 미생물 유래의 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈(Fructose 1,6-bisphosphate aldolase) 효소를 유효성분으로 함유하는 프럭토스 1-포스페이트(fructose 1-phosphate), 프럭토스 1,6-비스포스페이트(fructose 1,6-bisphosphate) 및 프럭토스 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 기질로부터 인산화 타가토스(tagatose)를 생산하기 위한 조성물을 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention kaldi cellulite in syrup emitter (Caldicellulosiruptor), Escherichia (Escherichia), Bacillus (Bacillus), Cluj Vero My process (Kluyveromyces), and Streptococcus (Streptococcus) from the group consisting of a microorganism of the genus Fructose 1-phosphate, fructose 1,6-bis containing fructose 1,6-bisphosphate aldolase enzyme derived from the selected microorganism as an active ingredient A composition for producing phosphorylated tagatose from one or more substrates selected from the group consisting of phosphate (fructose 1,6-bisphosphate) and fructose derivatives is provided.

또한, 본 발명은 프럭토스 1-포스페이트(fructose 1-phosphate), 프럭토스 1,6-비스포스페이트(fructose 1,6-bisphosphate) 및 프럭토스 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 기질에 칼디셀룰로시럽터(Caldicellulosiruptor), 에스케리키아 (Escherichia), 바실러스(Bacillus), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 및 스트렙토코커스 (Streptococcus) 속 미생물로 이루어진 군으로부터 선택되는 미생물 유래의 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈(Fructose 1,6-bisphosphate aldolase) 효소를 처리하는 단계를 포함하는 미생물 유래의 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈효소를 이용한 인산화 타가토스(tagatose)를 생산하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides caldicellulose to one or more substrates selected from the group consisting of fructose 1-phosphate, fructose 1,6-bisphosphate, and fructose derivatives. syrup emitter (Caldicellulosiruptor), Escherichia (Escherichia), Bacillus (Bacillus), Cluj Vero My process (Kluyveromyces) and derived from a microorganism selected from the group consisting of Streptococcus (Streptococcus) spp fructose 1,6-bisphosphate Aldolase (Fructose 1,6-bisphosphate aldolase) provides a method for producing a phosphorylated tagatose (tagatose) using a microorganism-derived fructose 1,6-bisphosphate aldolase enzyme comprising the step of treating an enzyme.

또한, 본 발명은 칼디셀룰로시럽터 속(Caldicellulosiruptor sp.) 균주 유래의 서열번호 1 내지 7의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈(Fructose 1,6-bisphosphate aldolase) 효소를 유효성분으로 함유하는 프럭토스 6-포스페이트(fructose 6-phosphate)로부터 인산화 타가토스(tagatose)를 생산하기 위한 조성물을 제공한다.In addition, the present invention is Caldicellulosiruptor genus (Caldicellulosiruptor sp.) Fructose 1,6-bisphosphate aldolase consisting of any one amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to 7 derived from the strain as an active ingredient It provides a composition for producing phosphorylated tagatose from fructose 6-phosphate containing as.

또한, 본 발명은 프럭토스 6-포스페이트(fructose 6-phosphate)에 칼디셀룰로시럽터 속(Caldicellulosiruptor sp.) 균주 유래의 서열번호 1 내지 7의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈(Fructose 1,6-bisphosphate aldolase) 효소를 처리하는 단계를 포함하는 칼디셀룰로시럽터 속 균주 유래의 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소를 이용한 인산화 타가토스(tagatose)를 생산하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention is in the fructose 6-phosphate (fructose 6-phosphate) in Caldicellulosiruptor genus (Caldicellulosiruptor) sp.) Fructose 1,6-bisphosphate aldolase consisting of any one amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1 to 7 derived from the strain. It provides a method for producing phosphorylated tagatose using a fructose 1,6-bisphosphate aldolase enzyme derived from a strain of the genus Caldicellulose syrup including the step.

본 발명을 통해 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소가 프럭토스 1-포스페이트(fructose 1-phosphate), 프럭토스 1,6-비스포스페이트(fructose 1,6-bisphosphate), 프럭토스 6-포스페이트(fructose 6-phosphate) 및 이들의 유도체를 인산화 타가토스로 전환하는 활성을 확인하였다. 따라서, 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소가 기질의 다양성을 가지므로, 타가토스 생산에 대한 활용도가 더욱 높고, 생물체로부터 얻은 효소를 이용하므로 환경 친화적이며, 간단한 효소 고정화 과정만을 필요로 하고, 전환 수율 또한 높기 때문에 생산 경비를 크게 줄이는 한편 생산효과를 극대화할 수 있어, 관련 산업에 매우 유용하다.Through the present invention, fructose 1,6-bisphosphate aldolase enzyme is used as fructose 1-phosphate, fructose 1,6-bisphosphate, and fructose 6-phosphate. (fructose 6-phosphate) and its derivatives were confirmed to convert to phosphorylated tagatose. Therefore, since the fructose 1,6-bisphosphate aldolase enzyme has a variety of substrates, its utilization for tagatose production is higher, and it is environmentally friendly because it uses enzymes obtained from living organisms, and requires only a simple enzyme immobilization process. In addition, since the conversion yield is also high, the production cost can be greatly reduced and the production effect can be maximized, which is very useful for related industries.

도 1은 프럭토스 6-포스페이트가 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈에 의한 에피머화 반응을 통하여 타가토스 6-포스페이트로 전환되는 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에서 제시한 칼디셀룰로시럽터 속(Caldicellulosiruptor sp.)과 대장균 K-12의 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소에 대한 아미노산 서열 비교결과이다.
도 3은 대장균 K-12 및 칼디셀룰로시럽터 속 7종 유래의 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈화 효소의 에피머화 효소 활성을 비교한 그래프이다.
도 4는 칼디셀룰로시럽터 속 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈의 금속 특이성을 비교한 그래프이다.
도 5는 칼디셀룰로시럽터 히드로써말리스(Caldicellulosiruptor hydrothermalis)의 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소의 pH(A), 온도(B) 및 시간경과(C)에 따른 프럭토스 6-포스페이트에서 타가토스 6-포스페이트로의 전환활성을 각각 그래프로 나타낸 것이다.
도 6은 칼디셀룰로시럽터 옵시디안시스(Caldicellulosiruptor obsidiansis)의 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소의 pH(A), 온도(B) 및 시간경과(C)에 따른 프럭토스 6-포스페이트에서 타가토스 6-포스페이트로의 전환활성을 각각 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 칼디셀룰로시럽터 오웬센시스(Caldicellulosiruptor owensensis)의 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소의 pH(A), 온도(B) 및 시간경과(C)에 따른 프럭토스 6-포스페이트에서 타가토스 6-포스페이트로의 전환활성을 각각 그래프로 나타낸 것이다.
도 8은 칼디셀룰로시럽터 크리스트잔소니(Caldicellulosiruptor kristjansonii)의 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소의 pH(A), 온도(B) 및 시간경과(C)에 따른 프럭토스 6-포스페이트에서 타가토스 6-포스페이트로로의 전환활성을 각각 그래프로 나타낸 것이다.
도 9는 칼디셀룰로시럽터 크로노스키엔시스(Caldicellulosiruptor kronotskyensis)의 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소의 pH(A), 온도(B) 및 시간경과(C)에 따른 프럭토스 6-포스페이트에서 타가토스 6-포스페이트로로의 전환활성을 각각 그래프로 나타낸 것이다.
도 10은 칼디셀룰로시럽터 베스시(Caldicellulosiruptor bescii)의 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소의 pH(A), 온도(B) 및 시간경과(C)에 따른 프럭토스 6-포스페이트에서 타가토스 6-포스페이트로의 전환활성을 각각 그래프로 나타낸 것이다.
도 11은 칼디셀룰로시럽터 락토아세티커스(Caldicellulosiruptor lactoaceticus)의 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소의 pH(A), 온도(B) 및 시간경과(C)에 따른 프럭토스 6-포스페이트에서 타가토스 6-포스페이트로의 전환활성을 각각 그래프로 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명에서 사용한 칼디셀룰로시럽터 속 유래 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈를 이용하여 16시간 동안 프럭토스 1-포스페이트에서 타가토스 전환 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명에서 사용한 칼디셀룰로시럽터 속 유래 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈를 이용하여 16시간 동안 프럭토스 1,6-비스포스페이트에서 타가토스 전환 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 칼디셀룰로시럽터 사카로리티커스(Caldicellulosiruptor saccharolyticus) 유래 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈의 기질 프럭토스 1-포스페이트 및 프럭토스 1,6-비스포스페이트에 대한 타가토스 전환능력을 나타낸 것이다.
도 15는 대장균(Escherichia coli) K-12, 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 및 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) 유래의 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈의 기질 프럭토스 1-포스페이트 및 프럭토스 1,6-비스포스페이트에 대한 타가토스 전환능력을 칼디셀룰로시럽터 히드로써말리스(Caldicellulosiruptor hydrothermalis) 유래 효소와 비교하여 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명에서 사용한 타가토스 생산용 과당유도체의 화학구조식을 도시화하여 나타낸 것이다.
도 17은 칼디셀룰로시럽터 속(Caldicellulosiruptor sp.) 8종과 대장균 K-12, 바실러스 서틸리스, 클루이베로마이세스 락티스 및 스트렙토코커스 써모필러스 유래의 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈의 기질로 프럭토스 유도체인 CBG-FP-001 series를 사용하였을 때의 타가토스 전환률(%)을 나타낸 것이다. 도면에 기재된 fructose 1-phosphate, fructose 6-bisphosphate 및 fructose 1,6-bisphosphate는 각각의 유도체로부터 최종적으로 유도된 인산화 과당을 나타낸 것이다.
도 18은 칼디셀룰로시럽터 속(Caldicellulosiruptor sp.) 8종과 대장균 K-12, 바실러스 서틸리스, 클루이베로마이세스 락티스 및 스트렙토코커스 써모필러스 유래의 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈의 기질로 프럭토스 유도체인 CBG-FP-002 series를 각각 사용하였을 때의 타가토스 전환률(%)을 나타낸 것이다. fructose 1-phosphate, fructose 6-bisphosphate 및 fructose 1,6-bisphosphate는 각각의 유도체로부터 최종적으로 유도된 인산화 과당을 나타낸 것이다. n=1~2의 전환률은 n=1 또는 n=2일 때 전환률의 평균값을 나타낸 것이다.
도 19는 본 발명에서 사용한 pETDuet-1 벡터 시스템을 도식화한 것으로 이는 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈를 클로닝하여 단백질을 발현, 분리 정제하기 위하여 사용되었다.FIG. 1 shows a process in which fructose 6-phosphate is converted to tagatose 6-phosphate through an epimerization reaction by fructose 1,6-bisphosphate aldolase.
Figure 2 is the genus Caldicellulosiruptor presented in the present invention (Caldicellulosiruptor sp.) and E. coli K-12 fructose 1,6-bisphosphate aldolase enzyme compared to the amino acid sequence.
3 is a graph comparing the epimerization enzyme activity of fructose 1,6-bisphosphate aldolase enzyme derived from 7 species of Escherichia coli K-12 and caldicellulose syrup genus.
4 is a graph comparing the metal specificity of fructose 1,6-bisphosphate aldolase in caldicellulose syrup.
5 is a fructose 6-phosphate according to pH (A), temperature (B) and time (C) of fructose 1,6-bisphosphate aldolase enzyme of Caldicellulosiruptor hydrothermalis. The conversion activity to tagatose 6-phosphate is shown as a graph.
6 is a fructose 6-phosphate according to pH (A), temperature (B) and time (C) of fructose 1,6-bisphosphate aldolase enzyme of Caldicellulosiruptor obsidiansis. The conversion activity to tagatose 6-phosphate is shown as a graph.
7 is a Caldicellulosiruptor Owensenses (Caldicellulosiruptor). owensensis ) of fructose 1,6-bisphosphate aldolase enzymes, respectively, graphs the conversion activity of fructose 6-phosphate to tagatose 6-phosphate according to pH (A), temperature (B) and time (C). It is represented by
Figure 8 is a fructose 6-phosphate according to pH (A), temperature (B) and time (C) of fructose 1,6-bisphosphate aldolase enzyme of Caldicellulosiruptor kristjansonii. The conversion activity to tagatose 6-phosphate is shown as a graph, respectively.
9 is a fructose 6-phosphate according to pH (A), temperature (B) and time (C) of fructose 1,6-bisphosphate aldolase enzyme of Caldicellulosiruptor kronotskyensis The conversion activity to tagatose 6-phosphate is shown as a graph, respectively.
Figure 10 is a fructose 6-phosphate according to the pH (A), temperature (B) and time (C) of the fructose 1,6-bisphosphate aldolase enzyme of Caldicellulosiruptor bescii Each graph shows the conversion activity to tagatose 6-phosphate.
11 is a fructose 6- according to pH (A), temperature (B) and time (C) of fructose 1,6-bisphosphate aldolase enzyme of Caldicellulosiruptor lactoaceticus. Each graph shows the conversion activity from phosphate to tagatose 6-phosphate.
FIG. 12 shows the results of conversion from fructose 1-phosphate to tagatose for 16 hours using fructose 1,6-bisphosphate aldolase derived from the genus caldicellulose syrup used in the present invention.
13 is a caldicellulose syrup used in the present invention It shows the result of conversion of tagatose from fructose 1,6-bisphosphate for 16 hours using the genus-derived fructose 1,6-bisphosphate aldolase.
Figure 14 is Caldicellulosiruptor saccharolyticus (Caldicellulosiruptor saccharolyticus) It shows the ability to convert tagatose to the substrate fructose 1-phosphate and fructose 1,6-bisphosphate of the derived fructose 1,6-bisphosphate aldolase.
Figure 15 is Escherichia coli K-12 , Bacillus subtilis , Kluyveromyces lactis (Kluyveromyces) lactis ) and Streptococcus thermophilus The ability to convert tagatose to the substrate fructose 1,6-bisphosphate aldolase derived from fructose 1-phosphate and fructose 1,6-bisphosphate was determined by caldicellulosiruptor hydrothermalis . It is shown in comparison with the derived enzyme.
16 is a diagram showing the chemical structural formula of the fructose derivative for producing tagatose used in the present invention.
Figure 17 is the genus Caldicellulosiruptor (Caldicellulosiruptor sp.) 8 species and E. coli K-12, Bacillus Certilis, Kluyveromyces lactis And It shows the conversion rate (%) of tagatose when using the fructose derivative CBG-FP-001 series as a substrate for fructose 1,6-bisphosphate aldolase derived from Streptococcus thermophilus. The fructose 1-phosphate, fructose 6-bisphosphate and fructose 1,6-bisphosphate shown in the figure represent the phosphorylated fructose finally derived from each derivative.
Figure 18 is the genus Caldicellulosiruptor (Caldicellulosiruptor sp.) 8 species and E. coli K-12, Bacillus Certilis, Kluyveromyces lactis And It shows the conversion rate (%) of tagatose when each of the fructose derivatives CBG-FP-002 series was used as a substrate for fructose 1,6-bisphosphate aldolase derived from Streptococcus thermophilus. fructose 1-phosphate, fructose 6-bisphosphate and fructose 1,6-bisphosphate represent phosphorylated fructose finally derived from each derivative. The conversion rate of n=1 to 2 represents the average value of the conversion rate when n=1 or n=2.
19 is a schematic diagram of the pETDuet-1 vector system used in the present invention, which was used to express, isolate and purify proteins by cloning fructose 1,6-bisphosphate aldolase.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 칼디셀룰로시럽터(Caldicellulosiruptor), 에스케리키아(Escherichia), 바실러스(Bacillus), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 및 스트렙토코커스 (Streptococcus) 속 미생물로 이루어진 군으로부터 선택되는 미생물 유래의 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈(Fructose 1,6-bisphosphate aldolase) 효소를 유효성분으로 함유하는 프럭토스 1-포스페이트(fructose 1-phosphate), 프럭토스 1,6-비스포스페이트(fructose 1,6-bisphosphate) 및 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 프럭토스 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 기질로부터 인산화 타가토스(tagatose)를 생산하기 위한 조성물을 제공한다.According to an aspect of the invention, the invention syrup emitter (Caldicellulosiruptor), Escherichia (Escherichia), Bacillus (Bacillus), Cluj Vero My process (Kluyveromyces), and Streptococcus (Streptococcus) in made of a microorganism with kaldi cellulite Fructose 1-phosphate, fructose 1,6 containing an enzyme of fructose 1,6-bisphosphate aldolase selected from the group as an active ingredient It provides a composition for producing phosphorylated tagatose from at least one substrate selected from the group consisting of -bisphosphate (fructose 1,6-bisphosphate) and a fructose derivative represented by the following formula (1) or (2).

Figure pat00001
Figure pat00001

(상기 화학식 1에서,(In Chemical Formula 1,

R1, R2는 각각

Figure pat00002
또는 H을 나타내고(단, R1, R2는 모두 H는 아님),R 1 and R 2 are each
Figure pat00002
Or H (however, R 1 , R 2 are not all H),

R3은 ONa, OK, OCa, Cl, Br 또는 F를 나타낸다.)R 3 represents ONa, OK, OCa, Cl, Br or F.)

Figure pat00003
Figure pat00003

(상기 화학식 2에서,(In Chemical Formula 2,

R4, R5는 각각

Figure pat00004
또는 H를 나타내고(단, R4, R5는 모두 H는 아님),R 4 and R 5 are each
Figure pat00004
Or H (however, R 4 and R 5 are not all H),

R6, R7은 각각

Figure pat00005
,
Figure pat00006
,
Figure pat00007
,
Figure pat00008
또는 CCl3를 나타내고, n은 0~10, X는 Cl, Br, F, O-R9 또는 COO-R9을 나타내고, R8, R9은 각각 CH3, CH2CH3 또는 H를 나타낸다.)R 6 and R 7 are each
Figure pat00005
,
Figure pat00006
,
Figure pat00007
,
Figure pat00008
Or CCl 3 represents, n represents 0-10, X represents Cl, Br, F, OR 9 or COO-R 9 , R 8 and R 9 represent CH 3 , CH 2 CH 3 or H, respectively.)

본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에서, 상기 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈(Fructose 1,6-bisphosphate aldolase) 효소는 칼디셀룰로시럽터 히드로써말리스(Caldicellulosiruptor hydrothermalis), 칼디셀룰로시럽터 옵시디안시스(Caldicellulosiruptor obsidiansis), 칼디셀룰로시럽터 오웬센시스(Caldicellulosiruptor owensensis), 칼디셀룰로시럽터 크리스트잔소니(Caldicellulosiruptor kristjansonii), 칼디셀룰로시럽터 크로노스키엔시스(Caldicellulosiruptor kronotskyensis), 칼디셀룰로시럽터 베스시(Caldicellulosiruptor bescii), 칼디셀룰로시럽터 락토아세티커스(Caldicellulosiruptor lactoaceticus), 칼디셀룰로시럽터 사카로리티커스(Caldicellulosiruptor saccharolyticus), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 및 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 미생물로부터 유래한 효소일 수 있고, In the composition according to an embodiment of the present invention, the fructose 1,6-bisphosphate aldolase enzyme is caldicellulosyrupter hydromalis (Caldicellulosiruptor). hydrothermalis ), Caldicellulosiruptor obsidiansis ), Caldicellulosiruptor owensensis ), Caldicellulosiruptor, Caldicellulosiruptor kristjansonii ), Caldicellulosiruptor kronotskyensis ), Caldicellulosiruptor bescii ), Caldicellulosiruptor lactoaceticus (Caldicellulosiruptor lactoaceticus ), Caldicellulosiruptor saccharolyticus ), Escherichia coli , Bacillus subtilis , Kluyveromyces lactis ) and Streptococcus thermophilus , it may be an enzyme derived from a microorganism selected from the group consisting of,

바람직하게는 칼디셀룰로시럽터 히드로써말리스(Caldicellulosiruptor hydrothermalis) 유래의 서열번호 1의 아미노산 서열, 칼디셀룰로시럽터 옵시디안시스(Caldicellulosiruptor obsidiansis) 유래의 서열번호 2의 아미노산 서열, 칼디셀룰로시럽터 오웬센시스(Caldicellulosiruptor owensensis) 유래의 서열번호 3의 아미노산 서열, 칼디셀룰로시럽터 크리스트잔소니(Caldicellulosiruptor kristjansonii) 유래의 서열번호 4의 아미노산 서열, 칼디셀룰로시럽터 크로노스키엔시스(Caldicellulosiruptor kronotskyensis) 유래의 서열번호 5의 아미노산 서열, 칼디셀룰로시럽터 베스시(Caldicellulosiruptor bescii) 유래의 서열번호 6의 아미노산 서열, 칼디셀룰로시럽터 락토아세티커스(Caldicellulosiruptor lactoaceticus) 유래의 서열번호 7의 아미노산 서열, 칼디셀룰로시럽터 사카로리티커스(Caldicellulosiruptor saccharolyticus) 유래의 서열번호 8의 아미노산 서열, 대장균(Escherichia coli) 유래의 서열번호 9의 아미노산 서열, 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 서열번호 10의 아미노산 서열, 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 유래의 서열번호 11의 아미노산 서열 및 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) 유래의 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.Preferably, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 derived from Caldicellulosiruptor hydrothermalis , Caldicellulosiruptor obsidiansis (Caldicellulosiruptor obsidiansis ) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 derived from, Caldicellulosiruptor Owensensis (Caldicellulosiruptor owensensis ) derived from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 derived from Caldicellulosiruptor kristjansonii (Caldicellulosiruptor kristjansonii), Caldicellulosiruptor Chronoschiensis (Caldicellulosiruptor kronotskyensis ) amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 derived from, Caldicellulosiruptor, Caldicellulosiruptor bescii ) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, Caldicellulosiruptor lactoaceticus , the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 derived from Caldicellulosiruptor lactoaceticus, Caldicellulosiruptor saccharolyticus ) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 derived from Escherichia coli ) derived from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) derived from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, Kluyveromyces lactis (Kluyveromyces lactis ) derived from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 and Streptococcus thermophilus ( Streptococcus thermophilus ) derived from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 may be made of any one amino acid sequence selected from the group, but is not limited thereto.

본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에서, 상기 기질은 프럭토스 6-포스페이트(fructose 6-phosphate)을 추가로 포함하여, 프럭토스 1-포스페이트(fructose 1-phosphate), 프럭토스 1,6-비스포스페이트(fructose 1,6-bisphosphate), 프럭토스 6-포스페이트(fructose 6-phosphate) 및 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 프럭토스 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 기질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the composition according to an embodiment of the present invention, the substrate further comprises fructose 6-phosphate, fructose 1-phosphate, fructose 1,6-bis It may be one or more substrates selected from the group consisting of phosphate (fructose 1,6-bisphosphate), fructose 6-phosphate, and fructose derivatives represented by Chemical Formula 1 or Chemical Formula 2, but is not limited thereto. Does not.

본 발명에서 사용한 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소의 유전자는 상기 12종의 미생물 유래의 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈화 효소 유전자 또는 단백질로, 이에 대응되는 유전자를 클로닝하고, 상기 유전자를 포함한 발현벡터로 형질전환된 미생물을 배양하여 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소를 과발현시켜 효소의 특성을 규명한 결과, 기질특이성이 프럭토스-1-포스페이트 및 프럭토스-1,6-비스포스페이트 4번 탄소 에피머화 작용을 나타내는 효소임을 입증하고, 상기 효소를 사용하여 타가토스-1-포스페이트 및 타가토스-1,6-비스포스페이트를 생산 후 상업용 피타아제를 처리하여 타가토스를 생산하는 것을 특징으로 한다.The gene of the fructose 1,6-bisphosphate aldolase enzyme used in the present invention is a fructose 1,6-bisphosphate aldolase gene or protein derived from the 12 microorganisms, and the corresponding gene is cloned, As a result of culturing a microorganism transformed with the expression vector containing the gene and overexpressing the fructose 1,6-bisphosphate aldolase enzyme to investigate the properties of the enzyme, the substrate specificity was fructose-1-phosphate and fructose-1. ,6-bisphosphate Proving that it is an enzyme exhibiting carbon epimerization activity, and using the enzyme to produce tagatose-1-phosphate and tagatose-1,6-bisphosphate, and then treat commercial phytase to tagatose Characterized in that to produce.

효소의 특성을 규명하기 위하여, 본 발명은 종래 실험을 통해 전혀 기능적으로 규명되지 않고 다만 염기서열의 특성만으로 평가되어 명명된 공지의 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소의 유전자를 함유하고 있는 균주로부터 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)을 통해 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소 코딩 유전자를 대량으로 수득한 후, 적절한 발현 벡터에 삽입하여 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조한 후 상기 재조합 벡터로 적절한 미생물에 형질전환시킨 균주를 발효 배지에서 배양하여 과발현시킨 효소를 정제하여 사용한다.In order to investigate the properties of the enzyme, the present invention contains the gene of the known fructose 1,6-bisphosphate aldolase enzyme named after being evaluated only by the properties of the base sequence, but not functionally at all through conventional experiments. After obtaining a large amount of fructose 1,6-bisphosphate aldolase enzyme-coding gene from the strain through polymerase chain reaction (PCR), and inserting it into an appropriate expression vector, fructose 1,6-bisphosphate aldol After preparing a recombinant vector containing a Raise gene, a strain transformed into an appropriate microorganism with the recombinant vector is cultured in a fermentation medium to purify and use the overexpressed enzyme.

상기 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소와 프럭토스와의 반응 조건으로 기질 농도는 5~30%(w/v)의 범위로 pH 8.5에서 50℃로 반응시키는 것이 인산화 타가토스 생산수율에 있어 바람직하다. 이는 프럭토스의 기질 농도가 55-75%(w/v) 범위에서 인산화 타가토스 생산수율이 우수하였으며, 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈화 효소의 최적 pH와 온도 범위이기 때문이다.In the reaction conditions of the fructose 1,6-bisphosphate aldolase enzyme and fructose, the substrate concentration in the range of 5 to 30% (w/v) at pH 8.5 to 50° C. is the result of the phosphorylated tagatose production yield. It is preferable. This is because the yield of phosphorylated tagatose was excellent when the substrate concentration of fructose was 55-75% (w/v), and it was the optimum pH and temperature range of the fructose 1,6-bisphosphate aldolase enzyme.

본 발명의 일 구현예에 따른 조성물에서, 상기 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소는 고정화된 효소일 수 있으며, 고정화 방법은 흡착법, 공유결합법 또는 가두기법(entrapment)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the composition according to an embodiment of the present invention, the fructose 1,6-bisphosphate aldolase enzyme may be an immobilized enzyme, and the immobilization method may be an adsorption method, a covalent bonding method, or an entrapment method. Not limited.

산업적으로 대량생산을 위해서, 효소를 이용한 생물공정은 화학공정에 비해 온화한 반응조건에서 반응이 진행되어 화학공정에 비해 에너지가 절약되며, 공정이 단순하여 공정비용이 적게 드는 장점이 있다. 하지만 이용되는 효소의 가격이 고가이며, 효소의 낮은 안정성이 극복해야 할 단점이다. 이러한 문제를 해결하고 공정비용의 감소를 위해 효소의 고정화가 널리 이용되고 있다. 효소를 고정화하면 반응에 사용한 효소를 다음 반응에 재사용할 수 있어 효소의 높은 가격 문제를 해결하여 공정비용을 감소시킬 수 있으며, 고정화하지 않는 효소보다 안정성이 증대되어 공정에 더 효율적으로 이용할 수 있다.For industrial mass production, bioprocesses using enzymes have advantages in that the reaction proceeds under milder reaction conditions compared to chemical processes, saving energy compared to chemical processes, and reducing process costs due to simple processes. However, the cost of the enzyme used is expensive, and the low stability of the enzyme is a disadvantage to be overcome. In order to solve this problem and reduce process cost, immobilization of enzymes is widely used. When the enzyme is immobilized, the enzyme used in the reaction can be reused for the next reaction, solving the problem of high cost of the enzyme, reducing the process cost, and increasing the stability than the non-immobilized enzyme, so that it can be used more efficiently in the process.

생산성을 향상시키기 위한 방법으로 세포를 고정화시키는 방법이 있는데, 세포를 고정화하는 이유는 일반적으로, 이차대사산물의 생합성이 유도(induction)되면, 그 생합성 속도는 빠르게 증가하여 최고값에 도달한 후, 점차 생합성 속도가 감소한다고 알려져 있다. 특히, 연속배양 또는 장기간의 회분식 배양시 흔히 관찰되는 현상으로서 돌연변이에 의해 얻은 고생산성 균주를 장기간 배양할 경우에 균주의 복귀돌연변이(back mutation)가 발생한다. 복귀 돌연변이 발생에 의해 생산성이 낮은 세포는 원래 균주보다 생장속도가 빨라, 결국 이들 세포가 배양기를 차지함으로써 공정의 생산성을 떨어뜨린다. 이와 비슷한 경우가 재조합 단백질을 생산하는 공정에서도 많이 지적되고 있다. 이와 같은 공정 안정성(operational stability)에 대한 문제는 이차대사산물 생산공정 개발에 있어서 필수적으로 해결해야 할 문제들 중의 하나이다. 이를 해결할 수 있는 방법들 중의 하나가 고정화세포를 이용한 공정으로서, 세포를 고정화할 경우 유전적 안정성(genetic stability)이 증가한다고 알려져 있다.As a method to improve productivity, there is a method of immobilizing cells. The reason for immobilizing cells is generally, when the biosynthesis of a secondary metabolite is induced, the biosynthesis rate increases rapidly and reaches the maximum value. It is known that the rate of biosynthesis gradually decreases. In particular, as a phenomenon commonly observed during continuous culture or long-term batch culture, a back mutation of the strain occurs when a highly productive strain obtained by mutation is cultured for a long period of time. Cells with low productivity due to the occurrence of return mutations have a faster growth rate than the original strain, and eventually these cells occupy the incubator, thereby reducing the productivity of the process. Similar cases have been pointed out in the process of producing recombinant proteins. This problem of operational stability is one of the problems that must be solved in the development of the secondary metabolite production process. One of the ways to solve this problem is a process using immobilized cells, which is known to increase genetic stability when cells are immobilized.

효소 또는 세포를 고정화시켜 생물반응제품을 생산하는 방법은 제조원가의 절감 등 그 경제적인 유용성으로 인해 지금까지 많은 연구가 행하여져 왔으며, 글루코스 이소머라제(Glucose isomerase) 고정화에 의한 프럭토스의 생산, 아미노아실라제(Aminoacylase) 고정화에 의한 아미노산의 생산 등이 공업적으로 실제 이용되고 있다.The method of producing bioreactive products by immobilizing enzymes or cells has been studied so far due to its economical utility such as reduction of manufacturing cost, and production of fructose by immobilization of glucose isomerase, aminoacyl Production of amino acids by immobilization of aminoacylase, etc., is actually used industrially.

일반적인 고정화 방법으로는 흡착법, 공유결합법, 포괄법(가두기법) 등이 있는데, 흡착법은 담체에 효소 또는 세포가 물리적으로 고정화되므로 연속운전으로 공업적 응용시 탈착이 우려되고, 공유결합법은 결합력은 강하나 효소의 실활이 쉽게 일어나기 때문에 실제 공업적으로는 알지네이트 등을 사용한 포괄법이 많이 이용되고 있다. 포괄법으로 효소나 세포를 고정화시켜 공업적으로 이용하고자 할 때는 먼저 담체의 선택이 중요한데, 가격이 저렴하고, 고정화 후 별도의 강도처리공정이 필요 없으며, 장기간 연속운전에도 안정한 제반 특성을 갖춘 것이 바람직하다.Typical immobilization methods include adsorption method, covalent bonding method, and enclosing method (containment method).In the adsorption method, since enzymes or cells are physically immobilized on a carrier, desorption is concerned in industrial applications through continuous operation, and covalent bonding method is a binding force. Silver is strong, but since the deactivation of the enzyme easily occurs, a comprehensive method using alginate and the like is widely used industrially. In the case of industrial use by immobilizing enzymes or cells by a comprehensive method, the selection of a carrier is important first.It is desirable that the price is inexpensive, and there is no need for a separate strength treatment process after immobilization, and it is desirable to have stable characteristics even during long-term continuous operation. Do.

또한, 본 발명은 프럭토스 1-포스페이트(fructose 1-phosphate), 프럭토스 1,6-비스포스페이트(fructose 1,6-bisphosphate) 및 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 프럭토스 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 기질에 칼디셀룰로시럽터(Caldicellulosiruptor), 에스케리키아 (Escherichia), 바실러스(Bacillus), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 및 스트렙토코커스 (Streptococcus) 속 미생물로 이루어진 군으로부터 선택되는 미생물 유래의 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈(Fructose 1,6-bisphosphate aldolase) 효소를 처리하는 단계를 포함하는 미생물 유래의 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈효소를 이용한 인산화 타가토스(tagatose)를 생산하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention from the group consisting of fructose 1-phosphate (fructose 1-phosphate), fructose 1,6-bisphosphate (fructose 1,6-bisphosphate) and a fructose derivative represented by the formula (1) or (2) one or more substrates selected by kaldi cellulose syrup emitter (Caldicellulosiruptor), Escherichia (Escherichia), Bacillus (Bacillus), Cluj Vero My process (Kluyveromyces), and Streptococcus (Streptococcus) derived from a microorganism selected from the group consisting of a microorganism of the genus Phosphorylated tagatose using a microbial-derived fructose 1,6-bisphosphate aldolase enzyme comprising the step of treating the fructose 1,6-bisphosphate aldolase enzyme of Provides a way to produce it.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈(Fructose 1,6-bisphosphate aldolase) 효소는 칼디셀룰로시럽터 히드로써말리스(Caldicellulosiruptor hydrothermalis), 칼디셀룰로시럽터 옵시디안시스(Caldicellulosiruptor obsidiansis), 칼디셀룰로시럽터 오웬센시스(Caldicellulosiruptor owensensis), 칼디셀룰로시럽터 크리스트잔소니(Caldicellulosiruptor kristjansonii), 칼디셀룰로시럽터 크로노스키엔시스(Caldicellulosiruptor kronotskyensis), 칼디셀룰로시럽터 베스시(Caldicellulosiruptor bescii), 칼디셀룰로시럽터 락토아세티커스(Caldicellulosiruptor lactoaceticus), 칼디셀룰로시럽터 사카로리티커스(Caldicellulosiruptor saccharolyticus), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 및 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 미생물로부터 유래한 효소일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 1 내지 12의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the method according to an embodiment of the present invention, the fructose 1,6-bisphosphate aldolase enzyme is caldicellulosyrupter hydromalis (Caldicellulosiruptor). hydrothermalis ), Caldicellulosiruptor obsidiansis ), Caldicellulosiruptor owensensis ), Caldicellulosiruptor, Caldicellulosiruptor kristjansonii ), Caldicellulosiruptor kronotskyensis ), Caldicellulosiruptor bescii ), Caldicellulosiruptor lactoaceticus (Caldicellulosiruptor lactoaceticus ), Caldicellulosiruptor saccharolyticus ), Escherichia coli , Bacillus subtilis , Kluyveromyces lactis ) and Streptococcus thermophilus (Streptococcus thermophilus) may be an enzyme derived from a microorganism selected from the group consisting of, preferably any one amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to 12 It may be made, but is not limited thereto.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 기질은 프럭토스 6-포스페이트(fructose 6-phosphate)을 추가로 포함하여, 프럭토스 1-포스페이트(fructose 1-phosphate), 프럭토스 1,6-비스포스페이트(fructose 1,6-bisphosphate), 프럭토스 6-포스페이트(fructose 6-phosphate) 및 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 프럭토스 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 기질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the method according to an embodiment of the present invention, the substrate further comprises fructose 6-phosphate, fructose 1-phosphate, fructose 1,6-bis It may be one or more substrates selected from the group consisting of phosphate (fructose 1,6-bisphosphate), fructose 6-phosphate, and fructose derivatives represented by Chemical Formula 1 or Chemical Formula 2, but is not limited thereto. Does not.

또한, 본 발명은 칼디셀룰로시럽터 속(Caldicellulosiruptor sp.) 균주 유래의 서열번호 1 내지 7의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈(Fructose 1,6-bisphosphate aldolase) 효소를 유효성분으로 함유하는 프럭토스 6-포스페이트(fructose 6-phosphate)로부터 인산화 타가토스(tagatose)를 생산하기 위한 조성물을 제공한다.In addition, the present invention is Caldicellulosiruptor genus (Caldicellulosiruptor sp.) Fructose 1,6-bisphosphate aldolase consisting of any one amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to 7 derived from the strain as an active ingredient It provides a composition for producing phosphorylated tagatose from fructose 6-phosphate containing as.

또한, 본 발명은 프럭토스 6-포스페이트(fructose 6-phosphate)에 칼디셀룰로시럽터 속(Caldicellulosiruptor sp.) 균주 유래의 서열번호 1 내지 7의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈(Fructose 1,6-bisphosphate aldolase) 효소를 처리하는 단계를 포함하는 칼디셀룰로시럽터 속 균주 유래의 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈효소를 이용한 인산화 타가토스(tagatose)를 생산하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention is in the fructose 6-phosphate (fructose 6-phosphate) in Caldicellulosiruptor genus (Caldicellulosiruptor) sp.) Fructose 1,6-bisphosphate aldolase consisting of any one amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1 to 7 derived from the strain. It provides a method for producing phosphorylated tagatose using a fructose 1,6-bisphosphate aldolase enzyme derived from a strain of the genus Caldicellulose syrup including the step.

본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 효소는 고정화된 효소일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the method according to an embodiment of the present invention, the enzyme may be an immobilized enzyme, but is not limited thereto.

본 발명의 혼합효소 반응은 다른 한편으로는 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈화 효소를 세포 내에서 반응시켜 인산화 타가토스를 대량으로 생산하기 위한 방법으로, 대량으로 발현된 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소를 과발현시켜 세포 내에서 사용하는 게 바람직하다. 이는 세포 내에 과발현된 효소는 활성이 장기간 유지될 수 있는 환경을 조성해 주고, 반응 시 필요한 cofactor 재생 가능성 때문인데, 본 발명에서 사용 가능한 대장균은 효소를 과발현할 수 있는 대장균이라면 그 어느 것을 사용해도 무방하다.The mixed enzyme reaction of the present invention, on the other hand, is a method for mass-producing phosphorylated tagatose by reacting fructose 1,6-bisphosphate aldolase enzyme in cells. -It is preferable to overexpress the bisphosphate aldolase enzyme and use it in cells. This is because the enzyme overexpressed in the cell creates an environment in which the activity can be maintained for a long period of time, and is due to the possibility of regeneration of cofactors necessary for the reaction.Escherichia coli usable in the present invention may be used as long as it is E. coli capable of overexpressing the enzyme. .

본 발명에 따른 인산화 타가토스 생산 방법은 미생물로부터 얻은 효소를 이용하므로 환경 친화적이며, 간단한 효소 고정화 과정만을 필요로 하고, 프럭토스 1-포스페이트(fructose 1-phosphate), 프럭토스 1,6-비스포스페이트(fructose 1,6-bisphosphate), 프럭토스 6-포스페이트(fructose 6-phosphate) 및 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 프럭토스 유도체로부터 인산화 타가토스 생산을 이전에 없던 방법으로 전환시키고, 생산경비를 크게 줄이는 한편 생산 효과를 극대화할 수 있다.The phosphorylated tagatose production method according to the present invention is environmentally friendly because it uses enzymes obtained from microorganisms, requires only a simple enzyme immobilization process, and fructose 1-phosphate, fructose 1,6-bisphosphate. (fructose 1,6-bisphosphate), fructose 6-phosphate and fructose derivatives represented by the following formula (1) or formula (2) to convert the production of phosphorylated tagatose into a method that has not been previously While greatly reducing, the production effect can be maximized.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by examples. However, the following examples are merely illustrative of the present invention, and the contents of the present invention are not limited to the following examples.

실시예Example 1. 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소 생산을 위한 재조합 벡터 제조 1. Preparation of a recombinant vector for the production of fructose 1,6-bisphosphate aldolase enzyme

프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소 유전자는 칼디셀룰로시럽터 히드로써말리스(Caldicellulosiruptor hydrothermalis), 칼디셀룰로시럽터 옵시디안시스(Caldicellulosiruptor obsidiansis), 칼디셀룰로시럽터 오웬센시스(Caldicellulosiruptor owensensis), 칼디셀룰로시럽터 크리스트잔소니(Caldicellulosiruptor kristjansonii), 칼디셀룰로시럽터 크로노스키엔시스(Caldicellulosiruptor kronotskyensis), 칼디셀룰로시럽터 베스시(Caldicellulosiruptor bescii) 및 칼디셀룰로시럽터 락토아세티커스(Caldicellulosiruptor lactoaceticus)의 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소 유전자의 DNA 염기서열을 기본으로 PCR법을 이용하여 대량으로 증폭하고, 클로닝 사이트 SalI와 NotI을 사용하여 pETDuet-1(노바젠)에 삽입하고, 재조합 벡터 pETDuet-1/프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈(도 15)를 제조하여, 이를 통상적인 형질전환 방법에 의해 대장균 BL21(DE3)에 형질전환하였다. 대량생산을 위해 재조합 시드(seed) 균주를 액화질소에서 냉동보관하였다.The fructose 1,6-bisphosphate aldolase enzyme gene is Caldicellulosiruptor Hydromalis (Caldicellulosiruptor). hydrothermalis ), Caldicellulosiruptor obsidiansis ), Caldicellulosiruptor owensensis ), Caldicellulosiruptor, Caldicellulosiruptor kristjansonii ), Caldicellulosiruptor kronotskyensis ), Caldicellulosiruptor bescii ) and caldicellulosiruptor lactoaceticus (Caldicellulosiruptor lactoaceticus) fructose 1,6-bisphosphate aldolase enzyme gene DNA sequence based on the PCR method, amplified in large quantities using PCR, and cloning site Sal I And Not I were inserted into pETDuet-1 (Novagen), and a recombinant vector pETDuet-1/fructose 1,6-bisphosphate aldolase (FIG. 15) was prepared, which was then obtained by a conventional transformation method. Transformed into BL21 (DE3). Recombinant seed strains were stored frozen in liquid nitrogen for mass production.

실시예 2. 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소의 대량생산을 위한 발현Example 2. Expression for mass production of fructose 1,6-bisphosphate aldolase enzyme

재조합 벡터, pETDuet-1/프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈를 포함하고 있는 대장균 BL21(DE3) 균주를 항생제인 암피실린이 포함된 LB 배지 50ml가 들어있는 250ml의 플라스크에 접종하여, OD600=2.0이 될 때까지 37℃의 진탕 배양기에서 배양하고, 배양한 종균을 발효 배지(1% 글리세롤, 0.1% 펩톤, 3% 효모 추출물, 0.014% 이인산칼륨, 0.1% 일인산나트륨) 3.5 리터가 들어있는 5 리터의 발효조에 첨가하여 본 배양을 수행하였다. 배양 후, OD600=2.0일 때, ITPG를 1mM 되도록 첨가하여 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소의 대량생산을 유도하였다. 이때, 상기 과정 중의 교반 속도는 500rpm, 통기량은 1.0vvm, 배양 온도는 37℃가 유지되도록 하였다.E. coli containing recombinant vector, pETDuet-1/fructose 1,6-bisphosphate aldolase BL21(DE3) strain was inoculated into a flask of 250 ml containing 50 ml of LB medium containing antibiotic ampicillin , cultured in a shaking incubator at 37°C until OD 600 = 2.0, and the cultured seed was fermented in a fermentation medium (1 % Glycerol, 0.1% peptone, 3% yeast extract, 0.014% potassium diphosphate, 0.1% sodium monophosphate) was added to a 5 liter fermenter containing 3.5 liters to perform main culture. After incubation , when OD 600 =2.0, ITPG was added to 1 mM to induce mass production of fructose 1,6-bisphosphate aldolase enzyme. In this case, the stirring speed during the above process was 500 rpm, the aeration amount was 1.0vvm, and the culture temperature was maintained at 37°C.

실시예 3. 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소의 정제Example 3. Purification of fructose 1,6-bisphosphate aldolase enzyme

프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소 정제를 위해서는 과발현된 균주의 배양액을 6,000g로 4℃에서 30분 동안 원심분리하고, 0.85% 염화나트륨 용액으로 두 번 세척하였다. 회수된 세포를 라이소자임이 1mg/ml이 함유된 세포파쇄 완충용액(50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, pH8.0)에 용해하고, 얼음 안에서 30분간 방치하였다. 세포 용액을 세포파쇄기(프렌치 프레스)로 15,000lb/in2에서 파쇄한 다음, 세포 파쇄액을 12,000g로 4℃에서 20분 동안 원심분리하고, 상등액은 0.45μm 여과지로 여과한 후 다음 정제과정에 이용하였다.To purify the fructose 1,6-bisphosphate aldolase enzyme, the culture medium of the overexpressed strain was centrifuged at 6,000 g for 30 minutes at 4° C., and washed twice with 0.85% sodium chloride solution. The recovered cells were dissolved in a cell disruption buffer solution containing 1 mg/ml of lysozyme (50mM NaH 2 PO 4 , 300mM NaCl, pH 8.0), and left in ice for 30 minutes. After crushing the cell solution at 15,000 lb/in 2 with a cell disruptor (French press), centrifuge the cell lysate at 12,000 g at 4°C for 20 minutes, and filter the supernatant with 0.45 μm filter paper, Was used.

정제를 위해서는 단백질분석크로마토그라피(FPLC)를 수행하고, 상기 여과액을 pH8.0인 300mM 염화나트륨(NaCl)과 10 mM 이미다졸(imidazole)이 함유된 50 mM인산 완충용액에 평형시킨 히스트랩 에이치피(HisTrap HP) 컬럼에 적용하였다. 이때 컬럼을 같은 완충용액으로 세척시킨 후 부착된 효소는 같은 완충용액에 10mM에서 200mM 사이의 기울기 농도의 이미다졸이 포함된 용액을 1ml/min 속도로 하여 용출(elution)되게 하였다. 용출된 효소는 pH7.0인 50mM 트리스 완충용액으로 투석하였다.For purification, protein analysis chromatography (FPLC) was performed, and the filtrate was equilibrated in a 50 mM phosphate buffer solution containing 300 mM sodium chloride (NaCl) and 10 mM imidazole at pH 8.0. HisTrap HP) column. At this time, after washing the column with the same buffer solution, the attached enzyme was eluted at a rate of 1 ml/min in a solution containing imidazole having a gradient concentration of 10 mM to 200 mM in the same buffer solution. The eluted enzyme was dialyzed against a pH 7.0 50 mM Tris buffer solution.

본 발명에서 이용한 칼디셀룰로시럽터(Caldicellulosiruptor) 속의 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소의 아미노산 서열을 비교한 결과를 도 2에 표현했으며 이들 효소의 기질로서 프럭토스-6-포스페이트를 활용한 타가토스 전환능력을 확인하였고 그 결과 기존에 알려진 대장균 K-12 유래의 효소에 비해 평균 100~150% 높은 활성을 확인했다(도 3). The result of comparing the amino acid sequence of the fructose 1,6-bisphosphate aldolase enzyme in the genus Caldicellulosiruptor used in the present invention is shown in FIG. 2, and fructose-6-phosphate is used as a substrate for these enzymes. One tagatose conversion ability was confirmed, and as a result, an average of 100-150% higher activity than the previously known E. coli K-12-derived enzyme was confirmed (FIG. 3).

실시예Example 4. 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소의 4. Fructose 1,6-bisphosphate aldolase enzyme 에피머화Epimerization 효능에 대한 금속이온의 영향 Effect of metal ions on efficacy

프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소는 본래의 기능인 프럭토스 6-포스페이트 기질을 다이하이드록시 아세트포스페이트와 글리세르알데하이드 3-포스페이트로 전환 시 금속 아연이 관여하며, 역가를 향상시킨다고 보고되어 있다.It has been reported that fructose 1,6-bisphosphate aldolase enzyme is involved in the conversion of the original function of fructose 6-phosphate substrate to dihydroxy acetphosphate and glyceraldehyde 3-phosphate, and enhances the titer. .

본 발명에서도 기질을 프럭토스 6-포스페이트로 적용하고 타가토스 6-포스페이트로의 에피머화 역가에 대한 금속염의 영향을 분석하였다. 금속염 효과를 조사하기 위해서 이디티에이(EDTA)를 처리하거나 또는 1mM 금속이온 첨가 후 측정하였으며, 반응은 30%의 과당과 800ug의 효소가 함유된 1ml의 50mM 트리스 완충용액에서 pH8.5와 50℃에서 16시간 수행했다. 상기 반응 후 0.2M 염산용액을 첨가하여 pH를 4.5-4.7 범위로 적정한 후 500unit의 피타아제를 처리하여 50℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 효소활성의 측정은 Bio-액체크로마토그래피(Bio-Lc, Thermo Scientific Inc)를 활용하였다. 분석조건은 다음과 같다. 각 반응액 10ul를 Dionex CarboPac PA1 컬럼에 주입한 후 200mM 수산화나트륨 용매를 1ml/min의 유속으로 운용하여 일렉트로케미컬 검출기를 통해 반응 후 남아 있는 과당과 타가토스 크로마토그램 내 면적으로 산출했다.In the present invention, the substrate was applied as fructose 6-phosphate and the effect of the metal salt on the epimerization titer to tagatose 6-phosphate was analyzed. In order to investigate the effect of metal salt, it was measured after treatment with EDTA or addition of 1 mM metal ions. The reaction was carried out at pH 8.5 and 50 ℃ in 1 ml of 50 mM Tris buffer containing 30% fructose and 800 ug of enzyme. Performed for 16 hours. After the reaction, 0.2M hydrochloric acid solution was added to adjust the pH to 4.5-4.7, and then 500 units of phytase were treated and reacted at 50° C. for 3 hours. Enzyme activity was measured using Bio-liquid chromatography (Bio-Lc, Thermo Scientific Inc). Analysis conditions are as follows. After injecting 10 ul of each reaction solution into a Dionex CarboPac PA1 column, 200 mM sodium hydroxide solvent was operated at a flow rate of 1 ml/min, and the area within the remaining fructose and tagatose chromatograms were calculated through an electrochemical detector.

분석 결과, 본 발명의 칼디셀룰로시럽터(Caldicellulosiruptor) 속 유래 7종의 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소는 이디티에이(EDTA) 첨가에는 별 영향을 받지 않으나, 염화아연(ZnCl2), 황산아연(ZnSO4), 염화마그네슘(MgCl2), 황산마그네슘(MgSO4) 등을 첨가할 경우에는 40 내지 60% 정도의 활성이 감소하는 것으로 나타났다(도 4).As a result of the analysis, 7 kinds of fructose 1,6-bisphosphate aldolase enzymes derived from the genus Caldicellulosiruptor of the present invention are not affected by the addition of EDTA, but zinc chloride (ZnCl 2 ) , When zinc sulfate (ZnSO 4 ), magnesium chloride (MgCl 2 ), magnesium sulfate (MgSO 4 ), and the like are added, the activity of about 40 to 60% was decreased (FIG. 4).

실시예Example 5. 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소의 5. Fructose 1,6-bisphosphate aldolase enzyme 에피머화Epimerization 효능에 대한 pH 및 온도의 영향 Effect of pH and temperature on efficacy

칼디셀룰로시럽터(Caldicellulosiruptor) 속 유래 7종의 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈의 프럭토스 6-포스페이트에서 타가토스 6-포스페이트로의 에피머화에 대한 pH, 온도 및 시간 경과에 따른 활성을 확인하기 위해, 다양한 pH 및 온도에서 효소와 기질을 반응시키고, 효소 활성을 비교하였다. Caldicellulosiruptor To confirm the activity over pH, temperature and time for the epimerization of fructose 1,6-bisphosphate aldolase from the genus from fructose 6-phosphate to tagatose 6-phosphate, various pH and The enzyme and the substrate were reacted at temperature, and the enzyme activity was compared.

pH 변화에 대한 효과를 조사하기 위한 반응은 30%의 프럭토스 6-포스페이트와 800ug의 효소가 함유된 1ml의 50mM Tris-HCl 완충용액 pH 7.0에서부터 9.0까지의 범위의 반응액을 사용하였다. 반응 온도는 50℃에서 16시간 동안 반응을 시켰다. 반응 후, 0.2M 염산용액을 첨가하여 pH를 4.5-4.7 범위로 적정한 후 500unit의 피타아제를 처리하여 50℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 효소활성의 측정은 Bio-액체크로마토그래피(Bio-Lc, Thermo Scientific Inc)를 활용하였다. 분석조건은 다음과 같다. 각 반응액 10ul를 Dionex CarboPac PA1 컬럼에 주입한 후 200mM 수산화나트륨 용매를 1ml/min의 유속으로 운용하여 일렉트로케미컬 검출기를 통해 반응 후 남아 있는 과당과 타가토스 크로마토그램 내 면적으로 산출했고, 그 결과를 각각 도 5 내지 도 11의 (A)에 나타내었다. 본 발명의 칼디셀룰로시럽터(Caldicellulosiruptor) 속 유래 7종 효소 모두 pH 7부터 9까지의 변화에 대한 활성 변화는 거의 없는 것으로 나타났다.The reaction to investigate the effect on the pH change was a reaction solution ranging from pH 7.0 to 9.0 in 1 ml of 50 mM Tris-HCl buffer solution containing 30% fructose 6-phosphate and 800 ug of enzyme. The reaction temperature was allowed to react at 50° C. for 16 hours. After the reaction, 0.2M hydrochloric acid solution was added to adjust the pH to a range of 4.5-4.7, treated with 500 units of phytase, and reacted at 50° C. for 3 hours. Enzyme activity was measured using Bio-liquid chromatography (Bio-Lc, Thermo Scientific Inc). Analysis conditions are as follows. After 10 ul of each reaction solution was injected into the Dionex CarboPac PA1 column, 200 mM sodium hydroxide solvent was operated at a flow rate of 1 ml/min, and the remaining fructose and tagatose chromatograms were calculated as the area within the reaction through an electrochemical detector. It is shown in Figure 5 to Figure 11 (A), respectively. Caldicellulosiruptor of the present invention All of the seven enzymes derived from the genus showed almost no change in activity against changes from pH 7 to 9.

온도 효과를 조사하기 위한 반응은, 20℃에서 70℃까지 30%의 프럭토스 6-포스페이트와 800ug의 효소가 함유된 1ml의 50mM Tris-HCl 완충용액을 pH 8.5에서 16시간 동안 반응시켰다. 이후 전환수율 분석을 위한 반응은 0.2M 염산용액을 첨가하여 pH 4.5-4.7 범위로 적정한 후 500unit의 피타아제를 처리하여 50℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 효소활성의 측정은 Bio-액체크로마토그래피(Bio-Lc, Thermo Scientific Inc)를 활용하였다. 분석조건은 다음과 같다. 각 반응액 10ul를 Dionex CarboPac PA1 컬럼에 주입한 후 200mM 수산화나트륨 용매를 1ml/min의 유속으로 운용하여 일렉트로케미컬 검출기를 통해 반응 후 남아 있는 과당과 타가토스 크로마토그램 내 면적으로 산출했다. 그 결과는 각각 도 5 내지 도 11의 (B)에 나타냈다. 이상의 결과를 확인하여 각 효소들의 최적온도는 50℃인 것으로 확인됐다.In the reaction to investigate the temperature effect, 1 ml of 50 mM Tris-HCl buffer solution containing 30% of fructose 6-phosphate and 800 ug of enzyme was reacted at pH 8.5 for 16 hours from 20°C to 70°C. The reaction for the conversion yield analysis was then titrated to a pH of 4.5-4.7 by adding 0.2M hydrochloric acid solution, and then treated with 500 units of phytase and reacted at 50° C. for 3 hours. Enzyme activity was measured using Bio-liquid chromatography (Bio-Lc, Thermo Scientific Inc). Analysis conditions are as follows. After injecting 10 ul of each reaction solution into a Dionex CarboPac PA1 column, 200 mM sodium hydroxide solvent was operated at a flow rate of 1 ml/min, and the area within the remaining fructose and tagatose chromatograms were calculated through an electrochemical detector. The results are shown in Figs. 5 to 11 (B), respectively. By checking the above results, it was confirmed that the optimum temperature for each enzyme was 50°C.

프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈의 프럭토스 6-포스페이트에서 타가토스 6-포스페이트로의 에피머화에 대한 시간 경과에 따른 최대 전환효율을 분석하기 위해, 30%의 프럭토스 6-포스페이트와 800ug의 효소가 함유된 1ml의 50mM Tris-HCl 완충용액을 pH8.5에서 64시간(3,840분)까지 반응을 시켰으며, 상기 반응 후 0.2M 염산용액을 첨가하여 pH 4.5-4.7 범위로 적정한 후 500unit의 피타아제를 처리하여 50℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 효소활성의 측정은 Bio-액체크로마토그래피(Bio-Lc, Thermo Scientific Inc)를 활용하였다. 분석조건은 다음과 같다. 각 반응액 10ul를 Dionex CarboPac PA1 컬럼에 주입한 후 200mM 수산화나트륨 용매를 1ml/min의 유속으로 운용하여 일렉트로케미컬 검출기를 통해 반응 후 남아 있는 과당과 타가토스 크로마토그램 내 면적으로 산출하여, 그 결과를 각각 도 5 내지 도 11의 (C)에 나타냈다. 각 효소들의 반응 시간에 따른 전환율은 최소 91%에서 최대 96%를 보였으며 이때의 반응 시간은 960분 내외로 나타났다.To analyze the maximum conversion efficiency over time for the epimerization of fructose 1,6-bisphosphate aldolase from fructose 6-phosphate to tagatose 6-phosphate, 30% of fructose 6-phosphate and 800 ug 1 ml of 50mM Tris-HCl buffer solution containing the enzyme was reacted at pH 8.5 for 64 hours (3,840 minutes), and after the reaction, 0.2M hydrochloric acid solution was added to titrate to a pH range of 4.5-4.7. Treated with phytase and reacted at 50° C. for 3 hours. Enzyme activity was measured using Bio-liquid chromatography (Bio-Lc, Thermo Scientific Inc). Analysis conditions are as follows. After injecting 10ul of each reaction solution into the Dionex CarboPac PA1 column, 200mM sodium hydroxide solvent was operated at a flow rate of 1ml/min, and the result was calculated as the area in the chromatogram of the remaining fructose and tagatose after the reaction through an electrochemical detector. It is shown in Fig. 5 to Fig. 11 (C), respectively. The conversion rate according to the reaction time of each enzyme showed a minimum of 91% to a maximum of 96%, and the reaction time at this time was around 960 minutes.

본 발명에서 선발한 칼디셀룰로시럽터 히드로써말리스(Caldicellulosiruptor hydrothermalis), 칼디셀룰로시럽터 옵시디안시스(Caldicellulosiruptor obsidiansis), 칼디셀룰로시럽터 오웬센시스(Caldicellulosiruptor owensensis), 칼디셀룰로시럽터 크리스트잔소니(Caldicellulosiruptor kristjansonii), 칼디셀룰로시럽터 크로노스키엔시스(Caldicellulosiruptor kronotskyensis), 칼디셀룰로시럽터 베스시(Caldicellulosiruptor bescii) 및 칼디셀룰로시럽터 락토아세티커스(Caldicellulosiruptor lactoaceticus)에서 유래한 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈의 프럭토스 6-포스페이트에서 타가토스 6-포스페이트로의 에피머화 활성은 동일 반응조건에서의 결과에서 대장균 유래의 것에 비교하여 2.5배 정도 빠른 것으로 나타났고, 최대활성은 80% 정도로 비슷하였다. Caldicellulosiruptor hydrothermalis selected in the present invention, Caldicellulosiruptor obsidiansis , Caldicellulosiruptor owensensis , Caldicellulosiruptor Christ Caldicellulosiruptor kristjansonii ), Caldicellulosiruptor kronotskyensis ), Caldicellulosiruptor bescii ) and fructose 1,6-bisphosphate aldolase derived from Caldicellulosiruptor lactoaceticus.The epimerization activity from fructose 6-phosphate to tagatose 6-phosphate was the same reaction conditions. In the results of, it was found to be 2.5 times faster than that derived from E. coli, and the maximum activity was similar to about 80%.

실시예Example 6. 기질을 6. Temperament 프럭토스Fructose 1- One- 포스페이트로With phosphate 이용한 Used 프럭토스Fructose 1,6- 1,6- 비스포스Bisforce 페이트 Fate 알돌레이즈Aldolase 효소의 Enzymatic 에피머화Epimerization 능력 ability

칼디셀룰로시럽터(Caldicellulosiruptor) 속 유래 7종의 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈의 기질 다양성을 확인하기 위해 프럭토스 1-포스페이트에서 타가토스로의 에피머화에 대한 전환효율을 분석하였다. 30%의 프럭토스 1-포스페이트와 800ug의 효소가 함유된 1ml의 50mM Tris-HCl 완충용액을 pH8.5에서 16시간까지 반응을 시켰으며, 상기 반응 후 0.2M 염산용액을 첨가하여 pH 4.5-4.7 범위로 적정한 후 500unit의 피타아제를 처리하여 50℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 효소활성의 측정은 Bio-액체크로마토그래피(Bio-Lc, Thermo Scientific Inc)를 활용하였다. 분석조건은 다음과 같다. 각 반응액 10ul를 Dionex CarboPac PA1 컬럼에 주입한 후 200mM 수산화나트륨 용매를 1ml/min의 유속으로 운용하여 일렉트로케미컬 검출기를 통해 반응 후 남아 있는 과당과 타가토스 크로마토그램 내 면적으로 산출하였고, 그 결과를 도 12에 나타냈다. 각 효소들은 동일한 반응조건에서 각 전환율은 균종에 따라 최소 88%에서 최대 99%를 보였다. Caldicellulosiruptor In order to confirm the substrate diversity of 7 kinds of fructose 1,6-bisphosphate aldolase derived from the genus, the conversion efficiency of the epimerization of fructose 1-phosphate to tagatose was analyzed. 1ml of 50mM Tris-HCl buffer solution containing 30% fructose 1-phosphate and 800ug of enzyme was reacted at pH 8.5 for 16 hours, and after the reaction, 0.2M hydrochloric acid solution was added to pH 4.5-4.7. After titration to the range, 500 units of phytase were treated and reacted at 50° C. for 3 hours. Enzyme activity was measured using Bio-liquid chromatography (Bio-Lc, Thermo Scientific Inc). Analysis conditions are as follows. After 10 ul of each reaction solution was injected into the Dionex CarboPac PA1 column, 200 mM sodium hydroxide solvent was operated at a flow rate of 1 ml/min, and the remaining fructose and tagatose chromatograms were calculated as the area within the reaction through an electrochemical detector. Fig. 12 shows. Each enzyme showed a minimum conversion rate of 88% to a maximum of 99% depending on the species under the same reaction conditions.

실시예Example 7. 기질을 7. Temperament 프럭토스Fructose 1,6- 1,6- 비스포스페이트로With bisphosphate 이용한 Used 프럭토스Fructose 1,6- 1,6- 비스포스페이트Bisphosphate 알돌레이즈Aldolase 효소의 Enzymatic 에피머화Epimerization 능력 ability

상기한 분석 결과에서 기존의 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈와는 다르게 칼디셀룰로시럽터(Caldicellulosiruptor) 속 7종 유래 효소는 프럭토스 1-포스페이트도 타가토스로 전환하는 능력을 확인했다. 이를 근거로 생체내 해당과정에서 생성되는 프럭토스 1,6-비스포스페이트에 대한 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈의 타가토스 전환능력을 확인했다(도 13). 상기와 동일한 반응조건에서 프럭토스 1,6-비스포스페이트 또한 균종별 차이는 있었지만 칼디셀룰로시럽터 히드로써말리스(Caldicellulosiruptor hydrothermalis)의 경우 최대 98%의 전환율을 보였다. 이때의 기질로서의 프럭토스 1,6-비스포스페이트의 농도 또한 30%로 진행했다.In the above analysis results, unlike the existing fructose 1,6-bisphosphate aldolase , Caldicellulosiruptor Enzymes derived from 7 species of the genus also confirmed the ability to convert fructose 1-phosphate to tagatose. Based on this, it was confirmed that the tagatose conversion ability of fructose 1,6-bisphosphate aldolase to fructose 1,6-bisphosphate produced in the glycolysis process in vivo (Fig. 13). In the same reaction conditions as above, fructose 1,6-bisphosphate also differed by species, but Caldicellulosiruptor hydrothermalis showed a conversion rate of up to 98%. The concentration of fructose 1,6-bisphosphate as a substrate at this time also proceeded to 30%.

실시예Example 8. 8. 칼디셀룰로시럽터Caldicellulose syrup 사카로리티커스( Saccharomyces ( CaldicellulosiruptorCaldicellulosiruptor saccharolyticus saccharolyticus )로부터 유래한 Derived from 프럭토스Fructose 1,6- 1,6- 비스포스페이트Bisphosphate 알돌레이즈의Aldolase 프럭토Fructo 스 1-Stud 1- 포스페이트Phosphate 및 And 프럭토스Fructose 1,6- 1,6- 비스포스페이트를Bisphosphate 기질로한Temperament 에피머화Epimerization 능력 ability

상기한 결과를 토대로 기존에 프럭토스 6-포스페이트를 타가토스 6-비스포스페이트로 전환하는 능력이 공개된 칼디셀룰로시럽터 사카로리티커스(Caldicellulosiruptor saccharolyticus) 유래의 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈를 활용하여 기질을 프럭토스 1-포스페이트 및 프럭토스 1,6-비스포스페이트로 하여 타가토스 전환능력을 확인했다. 30%의 각 기질을 800ug의 각 효소가 함유된 1ml의 50mM Tris-HCl 완충용액을 pH8.5에서 16시간까지 반응을 시켰으며, 상기 반응 후 0.2M 염산용액을 첨가하여 pH를 4.5-4.7 범위로 적정한 후 500unit의 피타아제를 처리하여 50℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 효소활성의 측정은 Bio-액체크로마토그래피(Bio-Lc, Thermo Scientific Inc)를 활용하였다. 분석조건은 다음과 같다. 각 반응액 10ul를 Dionex CarboPac PA1 컬럼에 주입한 후 200mM 수산화나트륨 용매를 1ml/min의 유속으로 운용하여 일렉트로케미컬 검출기를 통해 반응 후 남아 있는 과당과 타가토스 크로마토그램 내 면적으로 산출하였고, 그 결과를 도 14에 나타냈다. 본 효소의 경우에서도 프럭토스 1-포스페이트 및 프럭토스 1,6-비스포스페이트를 타가토스로 90% 이상 전환하는 것을 확인할 수 있었다.Existing on the basis of the result of fructose 6-phosphate to 6-bis tagatose as to the syrup disclosed in emitter kaldi cellulose saccharide ability to phosphate conversion utility carcass (Caldicellulosiruptor saccharolyticus ) Using the derived fructose 1,6-bisphosphate aldolase, the substrates were fructose 1-phosphate and fructose 1,6-bisphosphate, and the ability to convert tagatose was confirmed. 30% of each substrate was reacted with 1 ml of 50mM Tris-HCl buffer solution containing 800 ug of each enzyme at pH 8.5 for 16 hours, and after the reaction, 0.2M hydrochloric acid solution was added to increase the pH in the range of 4.5-4.7. After titration with, 500 units of phytase were treated and reacted at 50° C. for 3 hours. Enzyme activity was measured using Bio-liquid chromatography (Bio-Lc, Thermo Scientific Inc). Analysis conditions are as follows. After 10 ul of each reaction solution was injected into the Dionex CarboPac PA1 column, 200 mM sodium hydroxide solvent was operated at a flow rate of 1 ml/min, and the remaining fructose and tagatose chromatograms were calculated as the area within the reaction through an electrochemical detector. Fig. 14 shows. In the case of this enzyme, it could be confirmed that fructose 1-phosphate and fructose 1,6-bisphosphate were converted to tagatose by 90% or more.

실시예Example 9. 대장균( 9. Escherichia coli ( Escherichia coliEscherichia coli ) K-12) K-12 , , 바실러스 서틸리스(Bacillus Certilis ( Bacillus subtilisBacillus subtilis )) , , 클루이베로마이세스Cluy Veromyces 락티스Lactis (( KluyveromycesKluyveromyces lactislactis ) 및 ) And 스트렙토코커스Streptococcus 써모필러스( Thermophilus ( Streptococcus Streptococcus thermophilusthermophilus )) 유래한 Originated 프럭토스Fructose 1,6- 1,6- 비스포스페이트Bisphosphate 알egg 돌레이즈의 Dolaze's 프럭토스Fructose 1- One- 포스페이트Phosphate 및 And 프럭토스Fructose 1,6- 1,6- 비스포스페이트를Bisphosphate 기질로 한 Temperament 에피머화 능력Epimerization ability

상기한 결과를 토대로 기존에 공개된 특허에서 프럭토스 6-포스페이트를 타가토스 6-비스포스페이트로 전환하는 능력이 공개된 대장균(Escherichia coli) K-12, 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 및 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) 유래의 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈를 활용하여 기질을 프럭토스 1-포스페이트 및 프럭토스 1,6-비스포스페이트로 하여 타가토스 전환능력을 확인했다. 30%의 각 기질을 800㎍의 각 효소가 함유된 1ml의 50mM Tris-HCl 완충용액을 pH8.5에서 16시간까지 반응을 시켰으며, 상기 반응 후 0.2M 염산용액을 첨가하여 pH를 4.5-4.7 범위로 적정한 후 500unit의 피타아제를 처리하여 50℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 효소활성의 측정은 Bio-액체크로마토그래피(Bio-Lc, Thermo Scientific Inc)를 활용하였다. 분석조건은 다음과 같다. 각 반응액 10㎕를 Dionex CarboPac PA1 컬럼에 주입한 후 200mM 수산화나트륨 용매를 1ml/min의 유속으로 운용하여 일렉트로케미컬 검출기를 통해 반응 후 남아 있는 과당과 타가토스 크로마토그램 내 면적으로 산출하였고, 본 효소들의 경우에서도 프럭토스 1-포스페이트 및 프럭토스 1,6-비스포스페이트를 타가토스로 90% 이상 전환됨을 확인했다(도 15).Based on the above results, the ability to convert fructose 6-phosphate to tagatose 6-bisphosphate in previously published patents was disclosed ( Escherichia coli ) K-12 , Bacillus subtilis , Kluyveromyces lactis ) and Streptococcus thermophilus Using the derived fructose 1,6-bisphosphate aldolase, the substrates were fructose 1-phosphate and fructose 1,6-bisphosphate, and the ability to convert tagatose was confirmed. 30% of each substrate was reacted with 1 ml of 50mM Tris-HCl buffer solution containing 800 µg of each enzyme at pH 8.5 for 16 hours, and after the reaction, 0.2M hydrochloric acid solution was added to increase the pH to 4.5-4.7. After titration to the range, 500 units of phytase were treated and reacted at 50° C. for 3 hours. Enzyme activity was measured using Bio-liquid chromatography (Bio-Lc, Thermo Scientific Inc). Analysis conditions are as follows. After 10 μl of each reaction solution was injected into the Dionex CarboPac PA1 column, 200 mM sodium hydroxide solvent was operated at a flow rate of 1 ml/min, and the area within the remaining fructose and tagatose chromatograms were calculated through the electrochemical detector. In the case of those, it was confirmed that fructose 1-phosphate and fructose 1,6-bisphosphate were converted to tagatose by 90% or more (FIG. 15).

실시예Example 10. 10. 타가토스Tagatos 생산용 기질의 다양성 확보를 위한 과당유도체를 활용한 Using fructose derivatives to secure the diversity of production substrates 칼디셀룰로시럽터Caldicellulose syrup 속( genus( CaldicellulosiruptorCaldicellulosiruptor spsp .) 8종, 대장균 K-12,.) 8 species, E. coli K-12, 바실러스Bacillus 서틸리스, Certilis, 클루이베로마이세스Cluy Veromyces 락티스Lactis 및And 스트렙토코커스Streptococcus 써모필러스Thermophilus 유래의 Derived 프럭Fruck 토스 1,6-Toss 1,6- 비스포스페이트Bisphosphate 알돌레이즈의Aldolase 에피머화Epimerization 능력 ability

상기한 타가토스 생산법에서 상업적으로 기질의 다양성에서 기인한 생산원가의 절감은 무엇보다 중요하다고 할 수 있다. 따라서 본 발명에서는 과당의 유도체를 합성하여 이들을 기질로 사용한 타가토스 전환율을 확인했다. 칼디셀룰로시럽터 속(Caldicellulosiruptor sp.) 8종과 대장균 K-12, 바실러스 서틸리스, 클루이베로마이세스 락티스 및 스트렙토코커스 써모필러스 유래의 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈를 활용하여 기질은 도 17 및 도 18에서 제시된 과당유도체 CBG-FP-001 및 CBG-FP-002 중 각 화합물을 선정하고, 이를 기질로 하여 타가토스 전환능력을 확인했다(도 17 및 도 18). 30%의 각 기질을 800㎍의 각 효소가 함유된 1ml의 50mM Tris-HCl 완충용액을 pH8.5에서 16시간까지 반응을 시켰으며, 상기 반응 후 0.2M 염산용액을 첨가하여 pH를 4.5-4.7 범위로 적정한 후 500unit의 피타아제를 처리하여 50℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 효소활성의 측정은 Bio-액체크로마토그래피(Bio-Lc, Thermo Scientific Inc)를 활용하였다. 분석조건은 다음과 같다. 각 반응액 10㎕를 Dionex CarboPac PA1 컬럼에 주입한 후 200mM 수산화나트륨 용매를 1ml/min의 유속으로 운용하여 일렉트로케미컬 검출기를 통해 반응 후 남아 있는 과당과 타가토스 크로마토그램 내 면적으로 산출하였고, 그 결과 본 발명에서 활용한 효소 모두 각 과당유도체를 타가토스로 90% 이상 전환시키는 것을 확인함으로써 기질의 다양성을 확보할 수 있었다(도 17 및 도 18).In the above-described tagatose production method, it can be said that the reduction of production cost due to the diversity of substrates commercially is most important. Therefore, in the present invention, derivatives of fructose were synthesized and the conversion rate of tagatose using them as a substrate was confirmed. Caldicellulosiruptor genus sp.) 8 species and E. coli K-12, Bacillus Certilis, Kluyveromyces lactis And Streptococcus Thermophilus Using the derived fructose 1,6-bisphosphate aldolase, each compound was selected from the fructose derivatives CBG-FP-001 and CBG-FP-002 shown in FIGS. 17 and 18 as a substrate, and tagatose as a substrate. Conversion ability was confirmed (FIGS. 17 and 18). 30% of each substrate was reacted with 1 ml of 50mM Tris-HCl buffer solution containing 800 µg of each enzyme at pH 8.5 for 16 hours, and after the reaction, 0.2M hydrochloric acid solution was added to increase the pH to 4.5-4.7. After titration to the range, 500 units of phytase were treated and reacted at 50° C. for 3 hours. Enzyme activity was measured using Bio-liquid chromatography (Bio-Lc, Thermo Scientific Inc). Analysis conditions are as follows. After 10 μl of each reaction solution was injected into the Dionex CarboPac PA1 column, 200 mM sodium hydroxide solvent was operated at a flow rate of 1 ml/min, and the area within the remaining fructose and tagatose chromatograms were calculated through the electrochemical detector. By confirming that all of the enzymes used in the present invention convert 90% or more of each fructose derivative to tagatose, it was possible to ensure the diversity of the substrate (FIGS. 17 and 18 ).

<110> CHEBIGEN INC. SIN, HONG-SIG <120> Composition for producing phosphorylated tagatose from phosphorylated fructose derivative comprising Fructose 1,6-bisphosphate aldolase from Caldicellulosiruptor sp. as effective component <130> PN17097 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 323 <212> PRT <213> Caldicellulosiruptor hydrothermalis <400> 1 Met Pro Leu Val Thr Thr Arg Glu Met Phe Lys Lys Ala Ala Glu Gly 1 5 10 15 Lys Tyr Ala Ile Gly Ala Phe Asn Val Asn Asn Met Glu Ile Ile Gln 20 25 30 Gly Ile Val Glu Ala Ala Lys Glu Glu Gln Ala Pro Leu Ile Leu Gln 35 40 45 Val Ser Ala Gly Ala Arg Lys Tyr Ala Lys His Ile Tyr Leu Ile Lys 50 55 60 Leu Val Glu Ala Ala Leu Glu Asp Ser Gly Asp Leu Pro Ile Ala Leu 65 70 75 80 His Leu Asp His Gly Glu Asp Phe Glu Ile Cys Lys Ala Cys Ile Asp 85 90 95 Gly Gly Phe Thr Ser Val Met Ile Asp Gly Ser Arg Leu Pro Phe Glu 100 105 110 Glu Asn Ile Ala Leu Thr Lys Lys Val Val Glu Tyr Ala His Glu Arg 115 120 125 Gly Val Val Val Glu Ala Glu Leu Gly Lys Leu Ala Gly Ile Glu Asp 130 135 140 Asn Val Lys Val Ala Glu His Glu Ala Ala Phe Thr Asp Pro Asp Gln 145 150 155 160 Ala Ala Glu Phe Val Glu Arg Thr Gly Val Asp Ser Leu Ala Val Ala 165 170 175 Ile Gly Thr Ser His Gly Ala Tyr Lys Phe Lys Gly Asp Pro Arg Leu 180 185 190 Asp Phe Glu Arg Leu Gln Lys Ile Val Glu Lys Leu Pro Lys Asp Phe 195 200 205 Pro Ile Val Leu His Gly Ala Ser Thr Val Leu Pro Glu Phe Val Glu 210 215 220 Met Cys Asn Lys Tyr Gly Gly Asn Ile Pro Gly Ala Lys Gly Val Pro 225 230 235 240 Glu Asp Met Leu Arg Lys Ala Ala Glu Leu Gly Val Arg Lys Ile Asn 245 250 255 Ile Asp Thr Asp Leu Arg Leu Ala Met Thr Ala Ala Ile Arg Lys His 260 265 270 Leu Tyr Glu His Pro Asp His Phe Asp Pro Arg Gln Tyr Leu Lys Asp 275 280 285 Gly Arg Asp Ala Ile Lys Glu Met Val Lys His Lys Leu Arg Asn Val 290 295 300 Leu Gly Cys Ala Gly Lys Ala Pro Glu Ile Leu Glu Glu Ile Lys Lys 305 310 315 320 Asn Arg Gly <210> 2 <211> 323 <212> PRT <213> Caldicellulosiruptor obsidiansis <400> 2 Met Pro Leu Val Thr Thr Arg Glu Met Phe Lys Lys Ala Ala Glu Gly 1 5 10 15 Lys Tyr Ala Ile Gly Ala Phe Asn Val Asn Asn Met Glu Ile Ile Gln 20 25 30 Gly Ile Val Glu Ala Ala Lys Glu Glu Gln Ala Pro Leu Ile Leu Gln 35 40 45 Val Ser Ala Gly Ala Arg Lys Tyr Ala Lys His Ile Tyr Leu Ile Lys 50 55 60 Leu Val Glu Ala Ala Leu Glu Asp Ser Gly Asp Leu Pro Ile Ala Leu 65 70 75 80 His Leu Asp His Gly Glu Asp Phe Glu Ile Cys Lys Ala Cys Ile Asp 85 90 95 Gly Gly Phe Thr Ser Val Met Ile Asp Gly Ser Arg Leu Pro Phe Glu 100 105 110 Glu Asn Ile Ala Leu Thr Lys Lys Val Val Glu Tyr Ala His Glu Arg 115 120 125 Gly Val Val Val Glu Ala Glu Leu Gly Lys Leu Ala Gly Ile Glu Asp 130 135 140 Asn Val Lys Val Ala Glu His Glu Ala Ala Phe Thr Asp Pro Asp Gln 145 150 155 160 Ala Ala Glu Phe Val Glu Arg Thr Gly Val Asp Ser Leu Ala Val Ala 165 170 175 Ile Gly Thr Ser His Gly Ala Tyr Lys Phe Lys Gly Asp Pro Arg Leu 180 185 190 Asp Phe Glu Arg Leu Gln Lys Ile Val Glu Lys Leu Pro Lys Asp Phe 195 200 205 Pro Ile Val Leu His Gly Ala Ser Thr Val Leu Pro Glu Phe Val Glu 210 215 220 Met Cys Asn Lys Tyr Gly Gly Asn Ile Pro Gly Ala Lys Gly Val Pro 225 230 235 240 Glu Asp Met Leu Arg Lys Ala Ala Glu Leu Gly Val Arg Lys Ile Asn 245 250 255 Ile Asp Thr Asp Leu Arg Leu Ala Met Thr Ala Ala Ile Arg Lys His 260 265 270 Leu Tyr Glu His Pro Asp His Phe Asp Pro Arg Gln Tyr Leu Lys Asp 275 280 285 Gly Arg Asp Ala Ile Lys Glu Met Val Lys His Lys Leu Arg Asn Val 290 295 300 Leu Gly Cys Ala Gly Lys Ala Pro Glu Ile Leu Glu Glu Ile Lys Lys 305 310 315 320 Asn Arg Gly <210> 3 <211> 323 <212> PRT <213> Caldicellulosiruptor owensensis <400> 3 Met Pro Leu Val Thr Thr Arg Glu Met Phe Lys Lys Ala Ala Glu Gly 1 5 10 15 Lys Tyr Ala Ile Gly Ala Phe Asn Val Asn Asn Met Glu Ile Ile Gln 20 25 30 Gly Ile Val Glu Ala Ala Lys Glu Glu Gln Ala Pro Leu Ile Leu Gln 35 40 45 Val Ser Ala Gly Ala Arg Lys Tyr Ala Lys His Ile Tyr Leu Ile Lys 50 55 60 Leu Val Glu Ala Ala Leu Glu Asp Ser Gly Asp Leu Pro Ile Ala Leu 65 70 75 80 His Leu Asp His Gly Glu Asp Phe Glu Ile Cys Lys Ala Cys Ile Asp 85 90 95 Gly Gly Phe Thr Ser Val Met Ile Asp Gly Ser Arg Leu Pro Phe Glu 100 105 110 Glu Asn Ile Ala Leu Thr Lys Lys Val Val Glu Tyr Ala His Glu Arg 115 120 125 Gly Val Val Val Glu Ala Glu Leu Gly Lys Leu Ala Gly Ile Glu Asp 130 135 140 Asn Val Lys Val Ala Glu His Glu Ala Ala Phe Thr Asp Pro Asp Gln 145 150 155 160 Ala Ala Glu Phe Val Glu Arg Thr Gly Val Asp Ser Leu Ala Val Ala 165 170 175 Ile Gly Thr Ser His Gly Ala Tyr Lys Phe Lys Gly Asp Pro Lys Leu 180 185 190 Asp Phe Glu Arg Leu Gln Arg Ile Val Glu Lys Leu Pro Lys Asp Phe 195 200 205 Pro Ile Val Leu His Gly Ala Ser Thr Val Leu Pro Glu Phe Val Glu 210 215 220 Met Cys Asn Lys Tyr Gly Gly Asn Ile Pro Gly Ala Lys Gly Val Pro 225 230 235 240 Glu Asp Met Leu Arg Lys Ala Ala Glu Leu Gly Val Arg Lys Ile Asn 245 250 255 Ile Asp Thr Asp Leu Arg Leu Ala Met Thr Ala Ala Ile Arg Lys His 260 265 270 Leu Tyr Glu His Pro Asp His Phe Asp Pro Arg Gln Tyr Leu Lys Asp 275 280 285 Gly Arg Asp Ala Ile Lys Glu Met Val Lys His Lys Leu Arg Asn Val 290 295 300 Leu Gly Cys Ala Gly Lys Ala Pro Glu Ile Leu Glu Glu Ile Lys Lys 305 310 315 320 Asn Arg Gly <210> 4 <211> 323 <212> PRT <213> Caldicellulosiruptor kristjansonii <400> 4 Met Pro Leu Val Thr Thr Arg Glu Met Phe Lys Lys Ala Ala Glu Gly 1 5 10 15 Lys Tyr Ala Ile Gly Ala Phe Asn Val Asn Asn Met Glu Ile Ile Gln 20 25 30 Gly Ile Val Glu Ala Ala Lys Glu Glu Gln Ala Pro Leu Ile Leu Gln 35 40 45 Val Ser Ala Gly Ala Arg Lys Tyr Ala Lys His Ile Tyr Leu Ile Lys 50 55 60 Leu Val Glu Ala Ala Leu Glu Asp Ser Gly Asp Leu Pro Ile Ala Leu 65 70 75 80 His Leu Asp His Gly Glu Asp Phe Glu Ile Cys Lys Ala Cys Ile Asp 85 90 95 Gly Gly Phe Thr Ser Val Met Ile Asp Gly Ser Arg Leu Pro Phe Glu 100 105 110 Glu Asn Ile Ala Leu Thr Lys Lys Val Val Glu Tyr Ala His Glu Arg 115 120 125 Gly Val Val Val Glu Ala Glu Leu Gly Lys Leu Ala Gly Ile Glu Asp 130 135 140 Asn Val Lys Val Ala Glu His Glu Ala Ala Phe Thr Asp Pro Asp Gln 145 150 155 160 Ala Ala Glu Phe Val Glu Arg Thr Gly Val Asp Ser Leu Ala Val Ala 165 170 175 Ile Gly Thr Ser His Gly Ala Tyr Lys Phe Lys Gly Asp Pro Arg Leu 180 185 190 Asp Phe Glu Arg Leu Gln Lys Ile Val Glu Lys Leu Pro Lys Asp Phe 195 200 205 Pro Ile Val Leu His Gly Ala Ser Thr Val Leu Pro Glu Phe Val Glu 210 215 220 Met Cys Asn Lys Tyr Gly Gly Asn Ile Pro Gly Ala Lys Gly Val Pro 225 230 235 240 Glu Asp Met Leu Arg Lys Ala Ala Glu Leu Gly Val Arg Lys Ile Asn 245 250 255 Ile Asp Thr Asp Leu Arg Leu Ala Met Thr Ala Ala Ile Arg Lys His 260 265 270 Leu Tyr Glu His Pro Asp His Phe Asp Pro Arg Gln Tyr Leu Lys Asp 275 280 285 Gly Arg Asp Ala Ile Lys Glu Met Val Lys His Lys Leu Lys Asn Val 290 295 300 Leu Gly Cys Ala Gly Lys Ala Pro Glu Ile Leu Glu Glu Ile Lys Lys 305 310 315 320 Asn Arg Gly <210> 5 <211> 323 <212> PRT <213> Caldicellulosiruptor kronotskyensis <400> 5 Met Pro Leu Val Thr Thr Arg Glu Met Phe Lys Lys Ala Ala Glu Gly 1 5 10 15 Lys Tyr Ala Ile Gly Ala Phe Asn Val Asn Asn Met Glu Ile Ile Gln 20 25 30 Gly Ile Val Glu Ala Ala Lys Glu Glu Gln Ala Pro Leu Ile Leu Gln 35 40 45 Val Ser Ala Gly Ala Arg Lys Tyr Ala Lys His Val Tyr Leu Ile Lys 50 55 60 Leu Val Glu Ala Ala Leu Glu Asp Ser Gly Asp Leu Pro Ile Ala Leu 65 70 75 80 His Leu Asp His Gly Glu Asp Phe Glu Ile Cys Lys Ala Cys Ile Asp 85 90 95 Gly Gly Phe Thr Ser Val Met Ile Asp Gly Ser Arg Leu Pro Phe Glu 100 105 110 Glu Asn Ile Ala Leu Thr Arg Lys Val Val Glu Tyr Ala His Glu Arg 115 120 125 Gly Val Val Val Glu Ala Glu Leu Gly Lys Leu Ala Gly Ile Glu Asp 130 135 140 Asn Val Lys Val Ala Glu His Glu Ala Ala Phe Thr Asp Pro Asp Gln 145 150 155 160 Ala Ala Glu Phe Val Glu Arg Thr Gly Val Asp Ser Leu Ala Val Ala 165 170 175 Ile Gly Thr Ser His Gly Ala Tyr Lys Phe Lys Gly Asp Pro Arg Leu 180 185 190 Asp Phe Glu Arg Leu Gln Lys Ile Val Glu Lys Leu Pro Lys Asp Phe 195 200 205 Pro Ile Val Leu His Gly Ala Ser Thr Val Leu Pro Glu Phe Val Glu 210 215 220 Met Cys Asn Lys Tyr Gly Gly Asn Ile Pro Gly Ala Lys Gly Val Pro 225 230 235 240 Glu Asp Met Leu Arg Lys Ala Ala Glu Leu Gly Val Arg Lys Ile Asn 245 250 255 Ile Asp Thr Asp Leu Arg Leu Ala Met Thr Ala Ala Ile Arg Lys His 260 265 270 Leu Tyr Glu His Pro Asp His Phe Asp Pro Arg Gln Tyr Leu Lys Asp 275 280 285 Gly Arg Asp Ala Ile Lys Glu Met Val Lys His Lys Leu Arg Asn Val 290 295 300 Leu Gly Cys Ala Gly Lys Ala Pro Glu Ile Leu Glu Glu Ile Lys Lys 305 310 315 320 Asn Arg Gly <210> 6 <211> 323 <212> PRT <213> Caldicellulosiruptor bescii <400> 6 Met Pro Leu Val Thr Thr Arg Glu Met Phe Lys Lys Ala Ala Glu Gly 1 5 10 15 Lys Tyr Ala Ile Gly Ala Phe Asn Val Asn Asn Met Glu Ile Ile Gln 20 25 30 Gly Ile Val Glu Ala Ala Lys Glu Glu Gln Ala Pro Leu Ile Leu Gln 35 40 45 Val Ser Ala Gly Ala Arg Lys Tyr Ala Lys His Ile Tyr Leu Ile Lys 50 55 60 Leu Val Glu Ala Ala Leu Glu Asp Ser Gly Asp Leu Pro Ile Ala Leu 65 70 75 80 His Leu Asp His Gly Glu Asp Phe Glu Ile Cys Lys Ala Cys Ile Asp 85 90 95 Gly Gly Phe Thr Ser Val Met Ile Asp Gly Ser Arg Leu Pro Phe Glu 100 105 110 Glu Asn Ile Ala Leu Thr Lys Lys Val Val Glu Tyr Ala His Glu Arg 115 120 125 Gly Val Val Val Glu Ala Glu Leu Gly Lys Leu Ala Gly Ile Glu Asp 130 135 140 Asn Val Lys Val Ala Glu His Glu Ala Ala Phe Thr Asp Pro Asp Gln 145 150 155 160 Ala Ala Glu Phe Val Glu Arg Thr Gly Val Asp Ser Leu Ala Val Ala 165 170 175 Ile Gly Thr Ser His Gly Ala Tyr Lys Phe Lys Gly Asp Pro Arg Leu 180 185 190 Asp Phe Glu Arg Leu Gln Lys Ile Val Glu Lys Leu Pro Lys Asp Phe 195 200 205 Pro Ile Val Leu His Gly Ala Ser Thr Val Leu Pro Glu Phe Val Glu 210 215 220 Met Cys Asn Lys Tyr Gly Gly Asn Ile Pro Gly Ala Lys Gly Val Pro 225 230 235 240 Glu Asp Met Leu Arg Lys Ala Ala Glu Leu Gly Val Arg Lys Ile Asn 245 250 255 Ile Asp Thr Asp Leu Arg Leu Ala Met Thr Ala Ala Ile Arg Lys His 260 265 270 Leu Tyr Glu His Pro Asp His Phe Asp Pro Arg Gln Tyr Leu Lys Asp 275 280 285 Gly Arg Asp Ala Ile Lys Glu Met Val Lys His Lys Leu Arg Asn Val 290 295 300 Leu Gly Cys Ala Gly Lys Ala Pro Glu Ile Leu Glu Glu Ile Lys Lys 305 310 315 320 Asn Arg Gly <210> 7 <211> 323 <212> PRT <213> Caldicellulosiruptor lactoaceticus <400> 7 Met Pro Leu Val Thr Thr Arg Glu Met Phe Lys Lys Ala Ala Glu Gly 1 5 10 15 Lys Tyr Ala Ile Gly Ala Phe Asn Val Asn Asn Met Glu Ile Ile Gln 20 25 30 Gly Ile Val Glu Ala Ala Lys Glu Glu Gln Ala Pro Leu Ile Leu Gln 35 40 45 Val Ser Ala Gly Ala Arg Lys Tyr Ala Lys His Ile Tyr Leu Ile Lys 50 55 60 Leu Val Glu Ala Ala Leu Glu Asp Ser Gly Asp Leu Pro Ile Ala Leu 65 70 75 80 His Leu Asp His Gly Glu Asp Phe Glu Ile Cys Lys Ala Cys Ile Asp 85 90 95 Gly Gly Phe Thr Ser Val Met Ile Asp Gly Ser Arg Leu Pro Phe Glu 100 105 110 Glu Asn Ile Ala Leu Thr Lys Lys Val Val Glu Tyr Ala His Glu Arg 115 120 125 Gly Val Val Val Glu Ala Glu Leu Gly Lys Leu Ala Gly Ile Glu Asp 130 135 140 Asn Val Lys Val Ala Glu His Glu Ala Ala Phe Thr Asp Pro Asp Gln 145 150 155 160 Ala Ala Glu Phe Val Glu Arg Thr Gly Val Asp Ser Leu Ala Val Ala 165 170 175 Ile Gly Thr Ser His Gly Ala Tyr Lys Phe Lys Gly Asp Pro Arg Leu 180 185 190 Asp Phe Glu Arg Leu Gln Lys Ile Val Glu Lys Leu Pro Lys Asp Phe 195 200 205 Pro Ile Val Leu His Gly Ala Ser Thr Val Leu Pro Glu Phe Val Glu 210 215 220 Met Cys Asn Lys Tyr Gly Gly Asn Ile Pro Gly Ala Lys Gly Val Pro 225 230 235 240 Glu Asp Met Leu Arg Lys Ala Ala Glu Leu Gly Val Arg Lys Ile Asn 245 250 255 Ile Asp Thr Asp Leu Arg Leu Ala Met Thr Ala Ala Ile Arg Lys His 260 265 270 Leu Tyr Glu His Pro Asp His Phe Asp Pro Arg Gln Tyr Leu Lys Asp 275 280 285 Gly Arg Asp Ala Ile Lys Glu Met Val Lys His Lys Leu Lys Asn Val 290 295 300 Leu Gly Cys Ala Gly Lys Ala Pro Glu Ile Leu Glu Glu Ile Lys Lys 305 310 315 320 Asn Arg Gly <210> 8 <211> 323 <212> PRT <213> Caldicellulosiruptor saccharolyticus <400> 8 Met Pro Leu Val Thr Thr Lys Glu Met Phe Lys Lys Ala Ala Glu Gly 1 5 10 15 Lys Tyr Ala Ile Gly Ala Phe Asn Val Asn Asn Met Glu Ile Ile Gln 20 25 30 Gly Ile Val Glu Ala Ala Lys Glu Glu Gln Ala Pro Leu Ile Leu Gln 35 40 45 Val Ser Ala Gly Ala Arg Lys Tyr Ala Lys His Val Tyr Leu Val Lys 50 55 60 Leu Val Glu Ala Ala Leu Glu Asp Ser Gly Asp Leu Pro Ile Ala Leu 65 70 75 80 His Leu Asp His Gly Glu Asp Phe Glu Ile Cys Lys Ala Cys Ile Asp 85 90 95 Gly Gly Phe Thr Ser Val Met Ile Asp Gly Ser Arg Leu Pro Phe Glu 100 105 110 Glu Asn Ile Ala Leu Thr Lys Lys Val Val Glu Tyr Ala His Glu Arg 115 120 125 Gly Val Val Val Glu Ala Glu Leu Gly Lys Leu Ala Gly Ile Glu Asp 130 135 140 Asn Val Lys Val Ala Glu His Glu Ala Ala Phe Thr Asp Pro Asp Gln 145 150 155 160 Ala Ala Glu Phe Val Glu Arg Thr Gly Val Asp Ser Leu Ala Val Ala 165 170 175 Ile Gly Thr Ser His Gly Ala Tyr Lys Phe Lys Gly Glu Pro Arg Leu 180 185 190 Asp Phe Glu Arg Leu Gln Arg Ile Val Glu Lys Leu Pro Lys Gly Phe 195 200 205 Pro Ile Val Leu His Gly Ala Ser Ser Val Leu Pro Glu Phe Val Glu 210 215 220 Met Cys Asn Lys Tyr Gly Gly Asn Ile Pro Gly Ala Lys Gly Val Pro 225 230 235 240 Glu Asp Met Leu Arg Lys Ala Ala Glu Leu Gly Val Arg Lys Ile Asn 245 250 255 Ile Asp Thr Asp Leu Arg Leu Ala Met Thr Ala Ala Ile Arg Lys His 260 265 270 Leu Ala Glu His Pro Asp His Phe Asp Pro Arg Gln Tyr Leu Lys Asp 275 280 285 Gly Arg Glu Ala Ile Lys Glu Met Val Lys His Lys Leu Arg Asn Val 290 295 300 Leu Gly Cys Ser Gly Lys Ala Pro Glu Ile Leu Glu Glu Ile Lys Lys 305 310 315 320 Asn Arg Gly <210> 9 <211> 286 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 9 Met Pro Leu Val Asn Gly Arg Ile Leu Leu Asp Arg Ile Gln Glu Lys 1 5 10 15 Arg Val Leu Ala Gly Ala Phe Asn Thr Thr Asn Leu Glu Thr Thr Ile 20 25 30 Ser Ile Leu Asn Ala Ile Glu Arg Ser Gly Leu Pro Asn Phe Ile Gln 35 40 45 Ile Ala Pro Thr Asn Ala Gln Leu Ser Gly Tyr Asp Tyr Ile Tyr Glu 50 55 60 Ile Val Lys Arg His Ala Asp Lys Met Asp Val Pro Val Ser Leu His 65 70 75 80 Leu Asp His Gly Lys Thr Gln Glu Asp Val Lys Gln Ala Val Arg Ala 85 90 95 Gly Phe Thr Ser Val Met Ile Asp Gly Ala Ala Phe Ser Phe Glu Glu 100 105 110 Asn Ile Ala Phe Thr Gln Glu Ala Val Asp Phe Cys Lys Ser Tyr Gly 115 120 125 Val Pro Val Glu Ala Glu Leu Gly Ala Ile Leu Gly Lys Glu Asp Asp 130 135 140 His Val Ser Glu Ala Asp Cys Lys Thr Glu Pro Glu Lys Val Lys Thr 145 150 155 160 Phe Val Glu Arg Thr Gly Cys Asp Met Leu Ala Val Ser Ile Gly Asn 165 170 175 Val His Gly Leu Asp Asp Ile Pro Arg Ile Asp Ile Pro Leu Leu Lys 180 185 190 Arg Ile Ala Glu Val Cys Pro Val Pro Leu Val Ile His Gly Gly Ser 195 200 205 Gly Ile Ala Pro Glu Ile Leu Arg Ser Phe Val Asn Tyr Arg Val Ala 210 215 220 Lys Val Asn Ile Ala Ser Asp Leu Arg Lys Ala Phe Ile Thr Ala Val 225 230 235 240 Gly Lys Ala Tyr Val Asn Asn His Asn Glu Ala Asn Leu Ala Arg Val 245 250 255 Met Ala Ser Ala Lys Asn Ala Val Glu Glu Asp Val Tyr Ser Lys Ile 260 265 270 Leu Met Met Asn Glu Gly His Arg Leu Val Arg Lys Ala Ser 275 280 285 <210> 10 <211> 306 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 10 Met Leu Gly Trp Lys Ala Phe Phe Ala Arg Arg Gln Ser Gly Tyr Ile 1 5 10 15 Arg Arg Thr Phe Asp Met Pro Leu Val Ser Met Thr Glu Met Leu Asn 20 25 30 Thr Ala Lys Glu Lys Gly Tyr Ala Val Gly Gln Phe Asn Leu Asn Asn 35 40 45 Leu Glu Phe Thr Gln Ala Ile Leu Gln Ala Ala Glu Glu Glu Lys Ser 50 55 60 Pro Val Ile Leu Gly Val Ser Glu Gly Ala Gly Arg Tyr Met Gly Gly 65 70 75 80 Phe Lys Thr Val Val Ala Met Val Lys Ala Leu Met Glu Glu Tyr Lys 85 90 95 Val Thr Val Pro Val Ala Ile His Leu Asp His Gly Ser Ser Phe Glu 100 105 110 Ser Cys Ala Lys Ala Ile His Ala Gly Phe Thr Ser Val Met Ile Asp 115 120 125 Ala Ser His His Pro Phe Glu Glu Asn Val Ala Thr Thr Ala Lys Val 130 135 140 Val Glu Leu Ala His Phe His Gly Val Ser Val Glu Ala Glu Leu Gly 145 150 155 160 Thr Val Gly Gly Gln Glu Asp Asp Val Ile Ala Glu Gly Val Ile Tyr 165 170 175 Ala Asp Pro Lys Glu Cys Gln Glu Leu Val Glu Arg Thr Gly Ile Asp 180 185 190 Cys Leu Ala Pro Ala Leu Gly Ser Val His Gly Pro Tyr Lys Gly Glu 195 200 205 Pro Asn Leu Gly Phe Lys Glu Met Glu Glu Ile Gly Lys Ser Thr Gly 210 215 220 Leu Pro Leu Val Leu His Gly Gly Thr Gly Ile Pro Thr Ala Asp Ile 225 230 235 240 Lys Lys Ser Ile Ser Leu Gly Thr Ala Lys Ile Asn Val Asn Thr Glu 245 250 255 Asn Gln Ile Ser Ser Ala Lys Ala Val Arg Glu Thr Leu Ala Ala Lys 260 265 270 Pro Asp Glu Tyr Asp Pro Arg Lys Tyr Leu Gly Pro Ala Arg Glu Ala 275 280 285 Ile Lys Glu Thr Val Ile Gly Lys Met Arg Glu Phe Gly Ser Ser Asn 290 295 300 Gln Ala 305 <210> 11 <211> 361 <212> PRT <213> Kluyveromyces lactis <400> 11 Met Pro Ala Gln Asp Val Leu Thr Arg Lys Thr Gly Val Ile Val Gly 1 5 10 15 Asp Asp Val Lys Ala Leu Phe Asp Tyr Ala Lys Glu His Lys Phe Ala 20 25 30 Ile Pro Ala Ile Asn Val Thr Ser Ser Ser Thr Val Val Ala Ala Leu 35 40 45 Glu Ala Ala Arg Asp Asn Lys Ser Pro Ile Ile Leu Gln Thr Ser Asn 50 55 60 Gly Gly Ala Ala Tyr Phe Ala Gly Lys Gly Val Ser Asn Glu Gly Gln 65 70 75 80 Asn Ala Ser Ile Arg Gly Ser Ile Ala Ala Ala His Tyr Ile Arg Ser 85 90 95 Ile Ala Pro Ala Tyr Gly Ile Pro Val Val Leu His Thr Asp His Cys 100 105 110 Ala Lys Lys Leu Leu Pro Trp Phe Asp Gly Met Leu Lys Ala Asp Glu 115 120 125 Glu Tyr Phe Ala Lys His Gly Glu Pro Leu Phe Ser Ser His Met Leu 130 135 140 Asp Leu Ser Glu Glu Thr Asp Glu Glu Asn Ile Gly Leu Cys Val Lys 145 150 155 160 Tyr Phe Thr Arg Met Ala Lys Ile His Gln Trp Leu Glu Met Glu Ile 165 170 175 Gly Ile Thr Gly Gly Glu Glu Asp Gly Val Asn Asn Glu Gly Thr Ser 180 185 190 Asn Asp Lys Leu Tyr Thr Thr Pro Glu Thr Val Phe Ser Val His Glu 195 200 205 Ala Leu Ser Lys Ile Ser Pro Asn Phe Ser Ile Ala Ser Ala Phe Gly 210 215 220 Asn Val His Gly Val Tyr Lys Ile Ala Ala Ala Leu Lys Pro Glu Leu 225 230 235 240 Leu Gly Thr Phe Gln Asp Tyr Ala Ala Lys Gln Leu Asn Lys Lys Ala 245 250 255 Glu Asp Lys Pro Leu Tyr Leu Val Phe His Gly Gly Ser Gly Ser Ser 260 265 270 Thr Lys Asp Phe His Thr Ala Ile Asp Phe Gly Val Val Lys Val Asn 275 280 285 Leu Asp Thr Asp Cys Gln Phe Ala Tyr Leu Ser Gly Ile Arg Asp Tyr 290 295 300 Val Leu Asn Lys Lys Asp Tyr Leu Met Thr Pro Val Gly Asn Pro Thr 305 310 315 320 Gly Glu Asp Ser Pro Asn Lys Lys Tyr Tyr Asp Pro Arg Val Trp Val 325 330 335 Arg Glu Gly Glu Lys Thr Met Ser Lys Arg Ile Thr Gln Ala Leu Glu 340 345 350 Ile Phe Arg Thr Lys Gly Ala Leu Glu 355 360 <210> 12 <211> 293 <212> PRT <213> Streptococcus thermophilus <400> 12 Met Ala Ile Val Ser Ala Glu Lys Phe Val Gln Ala Ala Arg Asp Asn 1 5 10 15 Gly Tyr Ala Val Gly Gly Phe Asn Thr Asn Asn Leu Glu Trp Thr Gln 20 25 30 Ala Ile Leu Arg Ala Ala Glu Ala Lys Lys Ala Pro Val Leu Ile Gln 35 40 45 Thr Ser Met Gly Ala Ala Lys Tyr Met Gly Gly Tyr Lys Leu Cys Lys 50 55 60 Ala Leu Ile Glu Glu Leu Val Glu Ser Met Gly Ile Thr Val Pro Val 65 70 75 80 Ala Ile His Leu Asp His Gly His Tyr Asp Asp Ala Leu Glu Cys Ile 85 90 95 Glu Val Gly Tyr Thr Ser Ile Met Phe Asp Gly Ser His Leu Pro Ile 100 105 110 Asp Glu Asn Leu Lys Leu Ala Lys Glu Ile Val Glu Lys Ala His Ala 115 120 125 Lys Gly Ile Ser Val Glu Ala Glu Val Gly Thr Ile Gly Gly Glu Glu 130 135 140 Asp Gly Ile Val Gly Arg Gly Glu Leu Ala Pro Ile Glu Asp Ala Lys 145 150 155 160 Ala Met Val Ala Thr Gly Val Asp Phe Leu Ala Ala Gly Ile Gly Asn 165 170 175 Ile His Gly Pro Tyr Pro Glu Asn Trp Glu Gly Leu Asp Leu Asn His 180 185 190 Leu Gln Lys Leu Thr Glu Ala Val Pro Gly Phe Pro Ile Val Leu His 195 200 205 Gly Gly Ser Gly Ile Pro Asp Asp Gln Ile Gln Glu Ala Ile Lys Leu 210 215 220 Gly Val Ala Lys Val Asn Val Asn Thr Glu Cys Gln Ile Ala Phe Ala 225 230 235 240 Asn Ala Thr Arg Lys Phe Val Ala Glu Tyr Glu Ala Asn Glu Ala Glu 245 250 255 Tyr Asp Lys Lys Lys Leu Phe Asp Pro Arg Lys Phe Leu Lys Pro Gly 260 265 270 Phe Glu Ala Ile Thr Glu Ala Val Glu Glu Arg Ile Asp Val Phe Gly 275 280 285 Ser Ala Asn Lys Ala 290 <110> CHEBIGEN INC. SIN, HONG-SIG <120> Composition for producing phosphorylated tagatose from phosphorylated fructose derivative comprising Fructose 1,6-bisphosphate aldolase from Caldicellulosiruptor sp. as effective component <130> PN17097 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 323 <212> PRT <213> Caldicellulosiruptor hydrothermalis <400> 1 Met Pro Leu Val Thr Thr Arg Glu Met Phe Lys Lys Ala Ala Glu Gly 1 5 10 15 Lys Tyr Ala Ile Gly Ala Phe Asn Val Asn Asn Met Glu Ile Ile Gln 20 25 30 Gly Ile Val Glu Ala Ala Lys Glu Glu Gln Ala Pro Leu Ile Leu Gln 35 40 45 Val Ser Ala Gly Ala Arg Lys Tyr Ala Lys His Ile Tyr Leu Ile Lys 50 55 60 Leu Val Glu Ala Ala Leu Glu Asp Ser Gly Asp Leu Pro Ile Ala Leu 65 70 75 80 His Leu Asp His Gly Glu Asp Phe Glu Ile Cys Lys Ala Cys Ile Asp 85 90 95 Gly Gly Phe Thr Ser Val Met Ile Asp Gly Ser Arg Leu Pro Phe Glu 100 105 110 Glu Asn Ile Ala Leu Thr Lys Lys Val Val Glu Tyr Ala His Glu Arg 115 120 125 Gly Val Val Val Glu Ala Glu Leu Gly Lys Leu Ala Gly Ile Glu Asp 130 135 140 Asn Val Lys Val Ala Glu His Glu Ala Ala Phe Thr Asp Pro Asp Gln 145 150 155 160 Ala Ala Glu Phe Val Glu Arg Thr Gly Val Asp Ser Leu Ala Val Ala 165 170 175 Ile Gly Thr Ser His Gly Ala Tyr Lys Phe Lys Gly Asp Pro Arg Leu 180 185 190 Asp Phe Glu Arg Leu Gln Lys Ile Val Glu Lys Leu Pro Lys Asp Phe 195 200 205 Pro Ile Val Leu His Gly Ala Ser Thr Val Leu Pro Glu Phe Val Glu 210 215 220 Met Cys Asn Lys Tyr Gly Gly Asn Ile Pro Gly Ala Lys Gly Val Pro 225 230 235 240 Glu Asp Met Leu Arg Lys Ala Ala Glu Leu Gly Val Arg Lys Ile Asn 245 250 255 Ile Asp Thr Asp Leu Arg Leu Ala Met Thr Ala Ala Ile Arg Lys His 260 265 270 Leu Tyr Glu His Pro Asp His Phe Asp Pro Arg Gln Tyr Leu Lys Asp 275 280 285 Gly Arg Asp Ala Ile Lys Glu Met Val Lys His Lys Leu Arg Asn Val 290 295 300 Leu Gly Cys Ala Gly Lys Ala Pro Glu Ile Leu Glu Glu Ile Lys Lys 305 310 315 320 Asn Arg Gly <210> 2 <211> 323 <212> PRT <213> Caldicellulosiruptor obsidiansis <400> 2 Met Pro Leu Val Thr Thr Arg Glu Met Phe Lys Lys Ala Ala Glu Gly 1 5 10 15 Lys Tyr Ala Ile Gly Ala Phe Asn Val Asn Asn Met Glu Ile Ile Gln 20 25 30 Gly Ile Val Glu Ala Ala Lys Glu Glu Gln Ala Pro Leu Ile Leu Gln 35 40 45 Val Ser Ala Gly Ala Arg Lys Tyr Ala Lys His Ile Tyr Leu Ile Lys 50 55 60 Leu Val Glu Ala Ala Leu Glu Asp Ser Gly Asp Leu Pro Ile Ala Leu 65 70 75 80 His Leu Asp His Gly Glu Asp Phe Glu Ile Cys Lys Ala Cys Ile Asp 85 90 95 Gly Gly Phe Thr Ser Val Met Ile Asp Gly Ser Arg Leu Pro Phe Glu 100 105 110 Glu Asn Ile Ala Leu Thr Lys Lys Val Val Glu Tyr Ala His Glu Arg 115 120 125 Gly Val Val Val Glu Ala Glu Leu Gly Lys Leu Ala Gly Ile Glu Asp 130 135 140 Asn Val Lys Val Ala Glu His Glu Ala Ala Phe Thr Asp Pro Asp Gln 145 150 155 160 Ala Ala Glu Phe Val Glu Arg Thr Gly Val Asp Ser Leu Ala Val Ala 165 170 175 Ile Gly Thr Ser His Gly Ala Tyr Lys Phe Lys Gly Asp Pro Arg Leu 180 185 190 Asp Phe Glu Arg Leu Gln Lys Ile Val Glu Lys Leu Pro Lys Asp Phe 195 200 205 Pro Ile Val Leu His Gly Ala Ser Thr Val Leu Pro Glu Phe Val Glu 210 215 220 Met Cys Asn Lys Tyr Gly Gly Asn Ile Pro Gly Ala Lys Gly Val Pro 225 230 235 240 Glu Asp Met Leu Arg Lys Ala Ala Glu Leu Gly Val Arg Lys Ile Asn 245 250 255 Ile Asp Thr Asp Leu Arg Leu Ala Met Thr Ala Ala Ile Arg Lys His 260 265 270 Leu Tyr Glu His Pro Asp His Phe Asp Pro Arg Gln Tyr Leu Lys Asp 275 280 285 Gly Arg Asp Ala Ile Lys Glu Met Val Lys His Lys Leu Arg Asn Val 290 295 300 Leu Gly Cys Ala Gly Lys Ala Pro Glu Ile Leu Glu Glu Ile Lys Lys 305 310 315 320 Asn Arg Gly <210> 3 <211> 323 <212> PRT <213> Caldicellulosiruptor owensensis <400> 3 Met Pro Leu Val Thr Thr Arg Glu Met Phe Lys Lys Ala Ala Glu Gly 1 5 10 15 Lys Tyr Ala Ile Gly Ala Phe Asn Val Asn Asn Met Glu Ile Ile Gln 20 25 30 Gly Ile Val Glu Ala Ala Lys Glu Glu Gln Ala Pro Leu Ile Leu Gln 35 40 45 Val Ser Ala Gly Ala Arg Lys Tyr Ala Lys His Ile Tyr Leu Ile Lys 50 55 60 Leu Val Glu Ala Ala Leu Glu Asp Ser Gly Asp Leu Pro Ile Ala Leu 65 70 75 80 His Leu Asp His Gly Glu Asp Phe Glu Ile Cys Lys Ala Cys Ile Asp 85 90 95 Gly Gly Phe Thr Ser Val Met Ile Asp Gly Ser Arg Leu Pro Phe Glu 100 105 110 Glu Asn Ile Ala Leu Thr Lys Lys Val Val Glu Tyr Ala His Glu Arg 115 120 125 Gly Val Val Val Glu Ala Glu Leu Gly Lys Leu Ala Gly Ile Glu Asp 130 135 140 Asn Val Lys Val Ala Glu His Glu Ala Ala Phe Thr Asp Pro Asp Gln 145 150 155 160 Ala Ala Glu Phe Val Glu Arg Thr Gly Val Asp Ser Leu Ala Val Ala 165 170 175 Ile Gly Thr Ser His Gly Ala Tyr Lys Phe Lys Gly Asp Pro Lys Leu 180 185 190 Asp Phe Glu Arg Leu Gln Arg Ile Val Glu Lys Leu Pro Lys Asp Phe 195 200 205 Pro Ile Val Leu His Gly Ala Ser Thr Val Leu Pro Glu Phe Val Glu 210 215 220 Met Cys Asn Lys Tyr Gly Gly Asn Ile Pro Gly Ala Lys Gly Val Pro 225 230 235 240 Glu Asp Met Leu Arg Lys Ala Ala Glu Leu Gly Val Arg Lys Ile Asn 245 250 255 Ile Asp Thr Asp Leu Arg Leu Ala Met Thr Ala Ala Ile Arg Lys His 260 265 270 Leu Tyr Glu His Pro Asp His Phe Asp Pro Arg Gln Tyr Leu Lys Asp 275 280 285 Gly Arg Asp Ala Ile Lys Glu Met Val Lys His Lys Leu Arg Asn Val 290 295 300 Leu Gly Cys Ala Gly Lys Ala Pro Glu Ile Leu Glu Glu Ile Lys Lys 305 310 315 320 Asn Arg Gly <210> 4 <211> 323 <212> PRT <213> Caldicellulosiruptor kristjansonii <400> 4 Met Pro Leu Val Thr Thr Arg Glu Met Phe Lys Lys Ala Ala Glu Gly 1 5 10 15 Lys Tyr Ala Ile Gly Ala Phe Asn Val Asn Asn Met Glu Ile Ile Gln 20 25 30 Gly Ile Val Glu Ala Ala Lys Glu Glu Gln Ala Pro Leu Ile Leu Gln 35 40 45 Val Ser Ala Gly Ala Arg Lys Tyr Ala Lys His Ile Tyr Leu Ile Lys 50 55 60 Leu Val Glu Ala Ala Leu Glu Asp Ser Gly Asp Leu Pro Ile Ala Leu 65 70 75 80 His Leu Asp His Gly Glu Asp Phe Glu Ile Cys Lys Ala Cys Ile Asp 85 90 95 Gly Gly Phe Thr Ser Val Met Ile Asp Gly Ser Arg Leu Pro Phe Glu 100 105 110 Glu Asn Ile Ala Leu Thr Lys Lys Val Val Glu Tyr Ala His Glu Arg 115 120 125 Gly Val Val Val Glu Ala Glu Leu Gly Lys Leu Ala Gly Ile Glu Asp 130 135 140 Asn Val Lys Val Ala Glu His Glu Ala Ala Phe Thr Asp Pro Asp Gln 145 150 155 160 Ala Ala Glu Phe Val Glu Arg Thr Gly Val Asp Ser Leu Ala Val Ala 165 170 175 Ile Gly Thr Ser His Gly Ala Tyr Lys Phe Lys Gly Asp Pro Arg Leu 180 185 190 Asp Phe Glu Arg Leu Gln Lys Ile Val Glu Lys Leu Pro Lys Asp Phe 195 200 205 Pro Ile Val Leu His Gly Ala Ser Thr Val Leu Pro Glu Phe Val Glu 210 215 220 Met Cys Asn Lys Tyr Gly Gly Asn Ile Pro Gly Ala Lys Gly Val Pro 225 230 235 240 Glu Asp Met Leu Arg Lys Ala Ala Glu Leu Gly Val Arg Lys Ile Asn 245 250 255 Ile Asp Thr Asp Leu Arg Leu Ala Met Thr Ala Ala Ile Arg Lys His 260 265 270 Leu Tyr Glu His Pro Asp His Phe Asp Pro Arg Gln Tyr Leu Lys Asp 275 280 285 Gly Arg Asp Ala Ile Lys Glu Met Val Lys His Lys Leu Lys Asn Val 290 295 300 Leu Gly Cys Ala Gly Lys Ala Pro Glu Ile Leu Glu Glu Ile Lys Lys 305 310 315 320 Asn Arg Gly <210> 5 <211> 323 <212> PRT <213> Caldicellulosiruptor kronotskyensis <400> 5 Met Pro Leu Val Thr Thr Arg Glu Met Phe Lys Lys Ala Ala Glu Gly 1 5 10 15 Lys Tyr Ala Ile Gly Ala Phe Asn Val Asn Asn Met Glu Ile Ile Gln 20 25 30 Gly Ile Val Glu Ala Ala Lys Glu Glu Gln Ala Pro Leu Ile Leu Gln 35 40 45 Val Ser Ala Gly Ala Arg Lys Tyr Ala Lys His Val Tyr Leu Ile Lys 50 55 60 Leu Val Glu Ala Ala Leu Glu Asp Ser Gly Asp Leu Pro Ile Ala Leu 65 70 75 80 His Leu Asp His Gly Glu Asp Phe Glu Ile Cys Lys Ala Cys Ile Asp 85 90 95 Gly Gly Phe Thr Ser Val Met Ile Asp Gly Ser Arg Leu Pro Phe Glu 100 105 110 Glu Asn Ile Ala Leu Thr Arg Lys Val Val Glu Tyr Ala His Glu Arg 115 120 125 Gly Val Val Val Glu Ala Glu Leu Gly Lys Leu Ala Gly Ile Glu Asp 130 135 140 Asn Val Lys Val Ala Glu His Glu Ala Ala Phe Thr Asp Pro Asp Gln 145 150 155 160 Ala Ala Glu Phe Val Glu Arg Thr Gly Val Asp Ser Leu Ala Val Ala 165 170 175 Ile Gly Thr Ser His Gly Ala Tyr Lys Phe Lys Gly Asp Pro Arg Leu 180 185 190 Asp Phe Glu Arg Leu Gln Lys Ile Val Glu Lys Leu Pro Lys Asp Phe 195 200 205 Pro Ile Val Leu His Gly Ala Ser Thr Val Leu Pro Glu Phe Val Glu 210 215 220 Met Cys Asn Lys Tyr Gly Gly Asn Ile Pro Gly Ala Lys Gly Val Pro 225 230 235 240 Glu Asp Met Leu Arg Lys Ala Ala Glu Leu Gly Val Arg Lys Ile Asn 245 250 255 Ile Asp Thr Asp Leu Arg Leu Ala Met Thr Ala Ala Ile Arg Lys His 260 265 270 Leu Tyr Glu His Pro Asp His Phe Asp Pro Arg Gln Tyr Leu Lys Asp 275 280 285 Gly Arg Asp Ala Ile Lys Glu Met Val Lys His Lys Leu Arg Asn Val 290 295 300 Leu Gly Cys Ala Gly Lys Ala Pro Glu Ile Leu Glu Glu Ile Lys Lys 305 310 315 320 Asn Arg Gly <210> 6 <211> 323 <212> PRT <213> Caldicellulosiruptor bescii <400> 6 Met Pro Leu Val Thr Thr Arg Glu Met Phe Lys Lys Ala Ala Glu Gly 1 5 10 15 Lys Tyr Ala Ile Gly Ala Phe Asn Val Asn Asn Met Glu Ile Ile Gln 20 25 30 Gly Ile Val Glu Ala Ala Lys Glu Glu Gln Ala Pro Leu Ile Leu Gln 35 40 45 Val Ser Ala Gly Ala Arg Lys Tyr Ala Lys His Ile Tyr Leu Ile Lys 50 55 60 Leu Val Glu Ala Ala Leu Glu Asp Ser Gly Asp Leu Pro Ile Ala Leu 65 70 75 80 His Leu Asp His Gly Glu Asp Phe Glu Ile Cys Lys Ala Cys Ile Asp 85 90 95 Gly Gly Phe Thr Ser Val Met Ile Asp Gly Ser Arg Leu Pro Phe Glu 100 105 110 Glu Asn Ile Ala Leu Thr Lys Lys Val Val Glu Tyr Ala His Glu Arg 115 120 125 Gly Val Val Val Glu Ala Glu Leu Gly Lys Leu Ala Gly Ile Glu Asp 130 135 140 Asn Val Lys Val Ala Glu His Glu Ala Ala Phe Thr Asp Pro Asp Gln 145 150 155 160 Ala Ala Glu Phe Val Glu Arg Thr Gly Val Asp Ser Leu Ala Val Ala 165 170 175 Ile Gly Thr Ser His Gly Ala Tyr Lys Phe Lys Gly Asp Pro Arg Leu 180 185 190 Asp Phe Glu Arg Leu Gln Lys Ile Val Glu Lys Leu Pro Lys Asp Phe 195 200 205 Pro Ile Val Leu His Gly Ala Ser Thr Val Leu Pro Glu Phe Val Glu 210 215 220 Met Cys Asn Lys Tyr Gly Gly Asn Ile Pro Gly Ala Lys Gly Val Pro 225 230 235 240 Glu Asp Met Leu Arg Lys Ala Ala Glu Leu Gly Val Arg Lys Ile Asn 245 250 255 Ile Asp Thr Asp Leu Arg Leu Ala Met Thr Ala Ala Ile Arg Lys His 260 265 270 Leu Tyr Glu His Pro Asp His Phe Asp Pro Arg Gln Tyr Leu Lys Asp 275 280 285 Gly Arg Asp Ala Ile Lys Glu Met Val Lys His Lys Leu Arg Asn Val 290 295 300 Leu Gly Cys Ala Gly Lys Ala Pro Glu Ile Leu Glu Glu Ile Lys Lys 305 310 315 320 Asn Arg Gly <210> 7 <211> 323 <212> PRT <213> Caldicellulosiruptor lactoaceticus <400> 7 Met Pro Leu Val Thr Thr Arg Glu Met Phe Lys Lys Ala Ala Glu Gly 1 5 10 15 Lys Tyr Ala Ile Gly Ala Phe Asn Val Asn Asn Met Glu Ile Ile Gln 20 25 30 Gly Ile Val Glu Ala Ala Lys Glu Glu Gln Ala Pro Leu Ile Leu Gln 35 40 45 Val Ser Ala Gly Ala Arg Lys Tyr Ala Lys His Ile Tyr Leu Ile Lys 50 55 60 Leu Val Glu Ala Ala Leu Glu Asp Ser Gly Asp Leu Pro Ile Ala Leu 65 70 75 80 His Leu Asp His Gly Glu Asp Phe Glu Ile Cys Lys Ala Cys Ile Asp 85 90 95 Gly Gly Phe Thr Ser Val Met Ile Asp Gly Ser Arg Leu Pro Phe Glu 100 105 110 Glu Asn Ile Ala Leu Thr Lys Lys Val Val Glu Tyr Ala His Glu Arg 115 120 125 Gly Val Val Val Glu Ala Glu Leu Gly Lys Leu Ala Gly Ile Glu Asp 130 135 140 Asn Val Lys Val Ala Glu His Glu Ala Ala Phe Thr Asp Pro Asp Gln 145 150 155 160 Ala Ala Glu Phe Val Glu Arg Thr Gly Val Asp Ser Leu Ala Val Ala 165 170 175 Ile Gly Thr Ser His Gly Ala Tyr Lys Phe Lys Gly Asp Pro Arg Leu 180 185 190 Asp Phe Glu Arg Leu Gln Lys Ile Val Glu Lys Leu Pro Lys Asp Phe 195 200 205 Pro Ile Val Leu His Gly Ala Ser Thr Val Leu Pro Glu Phe Val Glu 210 215 220 Met Cys Asn Lys Tyr Gly Gly Asn Ile Pro Gly Ala Lys Gly Val Pro 225 230 235 240 Glu Asp Met Leu Arg Lys Ala Ala Glu Leu Gly Val Arg Lys Ile Asn 245 250 255 Ile Asp Thr Asp Leu Arg Leu Ala Met Thr Ala Ala Ile Arg Lys His 260 265 270 Leu Tyr Glu His Pro Asp His Phe Asp Pro Arg Gln Tyr Leu Lys Asp 275 280 285 Gly Arg Asp Ala Ile Lys Glu Met Val Lys His Lys Leu Lys Asn Val 290 295 300 Leu Gly Cys Ala Gly Lys Ala Pro Glu Ile Leu Glu Glu Ile Lys Lys 305 310 315 320 Asn Arg Gly <210> 8 <211> 323 <212> PRT <213> Caldicellulosiruptor saccharolyticus <400> 8 Met Pro Leu Val Thr Thr Lys Glu Met Phe Lys Lys Ala Ala Glu Gly 1 5 10 15 Lys Tyr Ala Ile Gly Ala Phe Asn Val Asn Asn Met Glu Ile Ile Gln 20 25 30 Gly Ile Val Glu Ala Ala Lys Glu Glu Gln Ala Pro Leu Ile Leu Gln 35 40 45 Val Ser Ala Gly Ala Arg Lys Tyr Ala Lys His Val Tyr Leu Val Lys 50 55 60 Leu Val Glu Ala Ala Leu Glu Asp Ser Gly Asp Leu Pro Ile Ala Leu 65 70 75 80 His Leu Asp His Gly Glu Asp Phe Glu Ile Cys Lys Ala Cys Ile Asp 85 90 95 Gly Gly Phe Thr Ser Val Met Ile Asp Gly Ser Arg Leu Pro Phe Glu 100 105 110 Glu Asn Ile Ala Leu Thr Lys Lys Val Val Glu Tyr Ala His Glu Arg 115 120 125 Gly Val Val Val Glu Ala Glu Leu Gly Lys Leu Ala Gly Ile Glu Asp 130 135 140 Asn Val Lys Val Ala Glu His Glu Ala Ala Phe Thr Asp Pro Asp Gln 145 150 155 160 Ala Ala Glu Phe Val Glu Arg Thr Gly Val Asp Ser Leu Ala Val Ala 165 170 175 Ile Gly Thr Ser His Gly Ala Tyr Lys Phe Lys Gly Glu Pro Arg Leu 180 185 190 Asp Phe Glu Arg Leu Gln Arg Ile Val Glu Lys Leu Pro Lys Gly Phe 195 200 205 Pro Ile Val Leu His Gly Ala Ser Ser Val Leu Pro Glu Phe Val Glu 210 215 220 Met Cys Asn Lys Tyr Gly Gly Asn Ile Pro Gly Ala Lys Gly Val Pro 225 230 235 240 Glu Asp Met Leu Arg Lys Ala Ala Glu Leu Gly Val Arg Lys Ile Asn 245 250 255 Ile Asp Thr Asp Leu Arg Leu Ala Met Thr Ala Ala Ile Arg Lys His 260 265 270 Leu Ala Glu His Pro Asp His Phe Asp Pro Arg Gln Tyr Leu Lys Asp 275 280 285 Gly Arg Glu Ala Ile Lys Glu Met Val Lys His Lys Leu Arg Asn Val 290 295 300 Leu Gly Cys Ser Gly Lys Ala Pro Glu Ile Leu Glu Glu Ile Lys Lys 305 310 315 320 Asn Arg Gly <210> 9 <211> 286 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 9 Met Pro Leu Val Asn Gly Arg Ile Leu Leu Asp Arg Ile Gln Glu Lys 1 5 10 15 Arg Val Leu Ala Gly Ala Phe Asn Thr Thr Asn Leu Glu Thr Thr Ile 20 25 30 Ser Ile Leu Asn Ala Ile Glu Arg Ser Gly Leu Pro Asn Phe Ile Gln 35 40 45 Ile Ala Pro Thr Asn Ala Gln Leu Ser Gly Tyr Asp Tyr Ile Tyr Glu 50 55 60 Ile Val Lys Arg His Ala Asp Lys Met Asp Val Pro Val Ser Leu His 65 70 75 80 Leu Asp His Gly Lys Thr Gln Glu Asp Val Lys Gln Ala Val Arg Ala 85 90 95 Gly Phe Thr Ser Val Met Ile Asp Gly Ala Ala Phe Ser Phe Glu Glu 100 105 110 Asn Ile Ala Phe Thr Gln Glu Ala Val Asp Phe Cys Lys Ser Tyr Gly 115 120 125 Val Pro Val Glu Ala Glu Leu Gly Ala Ile Leu Gly Lys Glu Asp Asp 130 135 140 His Val Ser Glu Ala Asp Cys Lys Thr Glu Pro Glu Lys Val Lys Thr 145 150 155 160 Phe Val Glu Arg Thr Gly Cys Asp Met Leu Ala Val Ser Ile Gly Asn 165 170 175 Val His Gly Leu Asp Asp Ile Pro Arg Ile Asp Ile Pro Leu Leu Lys 180 185 190 Arg Ile Ala Glu Val Cys Pro Val Pro Leu Val Ile His Gly Gly Ser 195 200 205 Gly Ile Ala Pro Glu Ile Leu Arg Ser Phe Val Asn Tyr Arg Val Ala 210 215 220 Lys Val Asn Ile Ala Ser Asp Leu Arg Lys Ala Phe Ile Thr Ala Val 225 230 235 240 Gly Lys Ala Tyr Val Asn Asn His Asn Glu Ala Asn Leu Ala Arg Val 245 250 255 Met Ala Ser Ala Lys Asn Ala Val Glu Glu Asp Val Tyr Ser Lys Ile 260 265 270 Leu Met Met Asn Glu Gly His Arg Leu Val Arg Lys Ala Ser 275 280 285 <210> 10 <211> 306 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 10 Met Leu Gly Trp Lys Ala Phe Phe Ala Arg Arg Gln Ser Gly Tyr Ile 1 5 10 15 Arg Arg Thr Phe Asp Met Pro Leu Val Ser Met Thr Glu Met Leu Asn 20 25 30 Thr Ala Lys Glu Lys Gly Tyr Ala Val Gly Gln Phe Asn Leu Asn Asn 35 40 45 Leu Glu Phe Thr Gln Ala Ile Leu Gln Ala Ala Glu Glu Glu Glu Lys Ser 50 55 60 Pro Val Ile Leu Gly Val Ser Glu Gly Ala Gly Arg Tyr Met Gly Gly 65 70 75 80 Phe Lys Thr Val Val Ala Met Val Lys Ala Leu Met Glu Glu Tyr Lys 85 90 95 Val Thr Val Pro Val Ala Ile His Leu Asp His Gly Ser Ser Phe Glu 100 105 110 Ser Cys Ala Lys Ala Ile His Ala Gly Phe Thr Ser Val Met Ile Asp 115 120 125 Ala Ser His His Pro Phe Glu Glu Asn Val Ala Thr Thr Ala Lys Val 130 135 140 Val Glu Leu Ala His Phe His Gly Val Ser Val Glu Ala Glu Leu Gly 145 150 155 160 Thr Val Gly Gly Gln Glu Asp Asp Val Ile Ala Glu Gly Val Ile Tyr 165 170 175 Ala Asp Pro Lys Glu Cys Gln Glu Leu Val Glu Arg Thr Gly Ile Asp 180 185 190 Cys Leu Ala Pro Ala Leu Gly Ser Val His Gly Pro Tyr Lys Gly Glu 195 200 205 Pro Asn Leu Gly Phe Lys Glu Met Glu Glu Ile Gly Lys Ser Thr Gly 210 215 220 Leu Pro Leu Val Leu His Gly Gly Thr Gly Ile Pro Thr Ala Asp Ile 225 230 235 240 Lys Lys Ser Ile Ser Leu Gly Thr Ala Lys Ile Asn Val Asn Thr Glu 245 250 255 Asn Gln Ile Ser Ser Ala Lys Ala Val Arg Glu Thr Leu Ala Ala Lys 260 265 270 Pro Asp Glu Tyr Asp Pro Arg Lys Tyr Leu Gly Pro Ala Arg Glu Ala 275 280 285 Ile Lys Glu Thr Val Ile Gly Lys Met Arg Glu Phe Gly Ser Ser Asn 290 295 300 Gln Ala 305 <210> 11 <211> 361 <212> PRT <213> Kluyveromyces lactis <400> 11 Met Pro Ala Gln Asp Val Leu Thr Arg Lys Thr Gly Val Ile Val Gly 1 5 10 15 Asp Asp Val Lys Ala Leu Phe Asp Tyr Ala Lys Glu His Lys Phe Ala 20 25 30 Ile Pro Ala Ile Asn Val Thr Ser Ser Ser Thr Val Val Ala Ala Leu 35 40 45 Glu Ala Ala Arg Asp Asn Lys Ser Pro Ile Ile Leu Gln Thr Ser Asn 50 55 60 Gly Gly Ala Ala Tyr Phe Ala Gly Lys Gly Val Ser Asn Glu Gly Gln 65 70 75 80 Asn Ala Ser Ile Arg Gly Ser Ile Ala Ala Ala His Tyr Ile Arg Ser 85 90 95 Ile Ala Pro Ala Tyr Gly Ile Pro Val Val Leu His Thr Asp His Cys 100 105 110 Ala Lys Lys Leu Leu Pro Trp Phe Asp Gly Met Leu Lys Ala Asp Glu 115 120 125 Glu Tyr Phe Ala Lys His Gly Glu Pro Leu Phe Ser Ser His Met Leu 130 135 140 Asp Leu Ser Glu Glu Thr Asp Glu Glu Asn Ile Gly Leu Cys Val Lys 145 150 155 160 Tyr Phe Thr Arg Met Ala Lys Ile His Gln Trp Leu Glu Met Glu Ile 165 170 175 Gly Ile Thr Gly Gly Glu Glu Asp Gly Val Asn Asn Glu Gly Thr Ser 180 185 190 Asn Asp Lys Leu Tyr Thr Thr Pro Glu Thr Val Phe Ser Val His Glu 195 200 205 Ala Leu Ser Lys Ile Ser Pro Asn Phe Ser Ile Ala Ser Ala Phe Gly 210 215 220 Asn Val His Gly Val Tyr Lys Ile Ala Ala Ala Leu Lys Pro Glu Leu 225 230 235 240 Leu Gly Thr Phe Gln Asp Tyr Ala Ala Lys Gln Leu Asn Lys Lys Ala 245 250 255 Glu Asp Lys Pro Leu Tyr Leu Val Phe His Gly Gly Ser Gly Ser Ser 260 265 270 Thr Lys Asp Phe His Thr Ala Ile Asp Phe Gly Val Val Lys Val Asn 275 280 285 Leu Asp Thr Asp Cys Gln Phe Ala Tyr Leu Ser Gly Ile Arg Asp Tyr 290 295 300 Val Leu Asn Lys Lys Asp Tyr Leu Met Thr Pro Val Gly Asn Pro Thr 305 310 315 320 Gly Glu Asp Ser Pro Asn Lys Lys Tyr Tyr Asp Pro Arg Val Trp Val 325 330 335 Arg Glu Gly Glu Lys Thr Met Ser Lys Arg Ile Thr Gln Ala Leu Glu 340 345 350 Ile Phe Arg Thr Lys Gly Ala Leu Glu 355 360 <210> 12 <211> 293 <212> PRT <213> Streptococcus thermophilus <400> 12 Met Ala Ile Val Ser Ala Glu Lys Phe Val Gln Ala Ala Arg Asp Asn 1 5 10 15 Gly Tyr Ala Val Gly Gly Phe Asn Thr Asn Asn Leu Glu Trp Thr Gln 20 25 30 Ala Ile Leu Arg Ala Ala Glu Ala Lys Lys Ala Pro Val Leu Ile Gln 35 40 45 Thr Ser Met Gly Ala Ala Lys Tyr Met Gly Gly Tyr Lys Leu Cys Lys 50 55 60 Ala Leu Ile Glu Glu Leu Val Glu Ser Met Gly Ile Thr Val Pro Val 65 70 75 80 Ala Ile His Leu Asp His Gly His Tyr Asp Asp Ala Leu Glu Cys Ile 85 90 95 Glu Val Gly Tyr Thr Ser Ile Met Phe Asp Gly Ser His Leu Pro Ile 100 105 110 Asp Glu Asn Leu Lys Leu Ala Lys Glu Ile Val Glu Lys Ala His Ala 115 120 125 Lys Gly Ile Ser Val Glu Ala Glu Val Gly Thr Ile Gly Gly Glu Glu 130 135 140 Asp Gly Ile Val Gly Arg Gly Glu Leu Ala Pro Ile Glu Asp Ala Lys 145 150 155 160 Ala Met Val Ala Thr Gly Val Asp Phe Leu Ala Ala Gly Ile Gly Asn 165 170 175 Ile His Gly Pro Tyr Pro Glu Asn Trp Glu Gly Leu Asp Leu Asn His 180 185 190 Leu Gln Lys Leu Thr Glu Ala Val Pro Gly Phe Pro Ile Val Leu His 195 200 205 Gly Gly Ser Gly Ile Pro Asp Asp Gln Ile Gln Glu Ala Ile Lys Leu 210 215 220 Gly Val Ala Lys Val Asn Val Asn Thr Glu Cys Gln Ile Ala Phe Ala 225 230 235 240 Asn Ala Thr Arg Lys Phe Val Ala Glu Tyr Glu Ala Asn Glu Ala Glu 245 250 255 Tyr Asp Lys Lys Lys Leu Phe Asp Pro Arg Lys Phe Leu Lys Pro Gly 260 265 270 Phe Glu Ala Ile Thr Glu Ala Val Glu Glu Arg Ile Asp Val Phe Gly 275 280 285 Ser Ala Asn Lys Ala 290

Claims (2)

칼디셀룰로시럽터 속(Caldicellulosiruptor sp.) 균주 유래의 서열번호 1 내지 7의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈(Fructose 1,6-bisphosphate aldolase) 효소를 유효성분으로 함유하는 프럭토스 6-포스페이트(fructose 6-phosphate)로부터 인산화 타가토스(tagatose)를 생산하기 위한 조성물. Caldicellulosiruptor (Fructose 1,6-bisphosphate aldolase) enzyme consisting of any amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 1 to 7, A composition for producing a phosphorylated tagatose from fructose 6-phosphate. 프럭토스 6-포스페이트(fructose 6-phosphate)에 칼디셀룰로시럽터 속(Caldicellulosiruptor sp.) 균주 유래의 서열번호 1 내지 7의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈(Fructose 1,6-bisphosphate aldolase) 효소를 처리하는 단계를 포함하는 칼디셀룰로시럽터 속 균주 유래의 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소를 이용한 인산화 타가토스(tagatose)를 생산하는 방법.The fructose 6-phosphate was added to the Caldicellulosiruptor (Fructose 1,6-bisphosphate aldolase) enzyme consisting of any one of the amino acid sequences selected from the group consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 1 to 7, A method for producing a phosphorylated tagatose using a fructose 1,6-bisphosphate aldolase enzyme derived from a sialic acid of a cellulase of Caldel celluli.
KR1020170031142A 2017-03-13 2017-03-13 Composition for producing phosphorylated tagatose from phosphorylated fructose derivative comprising Fructose 1,6-bisphosphate aldolase from Caldicellulosiruptor sp. as effective component KR101826835B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170031142A KR101826835B1 (en) 2017-03-13 2017-03-13 Composition for producing phosphorylated tagatose from phosphorylated fructose derivative comprising Fructose 1,6-bisphosphate aldolase from Caldicellulosiruptor sp. as effective component

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170031142A KR101826835B1 (en) 2017-03-13 2017-03-13 Composition for producing phosphorylated tagatose from phosphorylated fructose derivative comprising Fructose 1,6-bisphosphate aldolase from Caldicellulosiruptor sp. as effective component

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020160090008A Division KR101765684B1 (en) 2016-07-15 2016-07-15 Composition for producing phosphorylated tagatose from phosphorylated fructose derivative comprising Fructose 1,6-bisphosphate aldolase from Caldicellulosiruptor sp. as effective component

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20180008256A true KR20180008256A (en) 2018-01-24
KR101826835B1 KR101826835B1 (en) 2018-02-08

Family

ID=61029462

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020170031142A KR101826835B1 (en) 2017-03-13 2017-03-13 Composition for producing phosphorylated tagatose from phosphorylated fructose derivative comprising Fructose 1,6-bisphosphate aldolase from Caldicellulosiruptor sp. as effective component

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101826835B1 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10138506B2 (en) 2015-10-02 2018-11-27 Bonumose Llc Enzymatic production of D-tagatose

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10138506B2 (en) 2015-10-02 2018-11-27 Bonumose Llc Enzymatic production of D-tagatose
US10533202B2 (en) 2015-10-02 2020-01-14 Bonumose Llc Enzymatic production of D-tagatose
US11034988B2 (en) 2015-10-02 2021-06-15 Bonumose, Inc. Enzymatic production of D-tagatose

Also Published As

Publication number Publication date
KR101826835B1 (en) 2018-02-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4915917B2 (en) Method for producing lacto-N-biose I and galacto-N-biose
JP6209526B2 (en) Production method of D-allose
Tabata et al. Production of N-acetyl-D-neuraminic acid by coupling bacteria expressing N-acetyl-D-glucosamine 2-epimerase and N-acetyl-D-neuraminic acid synthetase
US20130302857A1 (en) Trehalose phosphorylases and their use in the biocatalytic production of trehalose-analogues and glycosyl phosphates
Poonperm et al. Cloning, sequencing, overexpression and characterization of L-rhamnose isomerase from Bacillus pallidus Y25 for rare sugar production
WO2017111339A1 (en) Strain producing allose from fructose and method for producing allose using same
Dai et al. Whole-cell biosynthesis of d-tagatose from maltodextrin by engineered Escherichia coli with multi-enzyme co-expression system
KR101081604B1 (en) Method for production of L-ribose from L-arabinose by two-step enzyme reactions
KR101826835B1 (en) Composition for producing phosphorylated tagatose from phosphorylated fructose derivative comprising Fructose 1,6-bisphosphate aldolase from Caldicellulosiruptor sp. as effective component
JP2000295996A5 (en)
JP2014140361A (en) Ketose 3-epimerase enzyme
Yoshida et al. Production of trehalose by a dual enzyme system of immobilized maltose phosphorylase and trehalose phosphorylase
JP2023123685A (en) Methods for producing trehalose employing trehalose phosphorylase variant
KR20170116979A (en) Fructose 1,6-bisphosphate aldolase from Lactobacillus plantarum with conversion activity from fructose 6-phosphate to tagatose 6-phosphate and method for producing tagatose using the same
KR101008556B1 (en) Method for Production of L?ribose
KR101765684B1 (en) Composition for producing phosphorylated tagatose from phosphorylated fructose derivative comprising Fructose 1,6-bisphosphate aldolase from Caldicellulosiruptor sp. as effective component
KR0145418B1 (en) Inosine guanosine kinase
KR20170116978A (en) Composition for producing phosphorylated tagatose from fructose 6-phosphate comprising Fructose 1,6-bisphosphate aldolase from Bifidobacterium longum as effective component
KR101663358B1 (en) Fructose 1,6-bisphosphate aldolases from various microorganisms and enzymatic conversion method of tagatose 6-phosphate from fructose 6-phosphate by the same
JP2014064513A (en) Method for preparation of 2-deoxy-scyllo-inosose
KR101361688B1 (en) Method for production of lactulose from lactose using N-acetyl glucosamin 2-epimerase
CN112680482B (en) Biological preparation method of mannitol
WO2019035482A1 (en) Protein exhibiting epimerization activity
KR20070069357A (en) Metallic-ions independent isomerase and methods for isomerization by using it
KR20180042973A (en) Preparation method of D-allose using a novel L-rhamnose isomerase

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
A201 Request for examination
N231 Notification of change of applicant
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant