KR20180004584A - Bacteriophage JBP901 belonging to subfamily Spounavirinae of family Myoviridae and its use - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 미오비리대 과(family Myoviridae)의 스파우나비리내 아과(subfamily Spounavirinae)에 속하는 박테리오파지 JBP901 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상기 박테리오파지 JBP901로부터 유래된 엔도리신(endolysin) 단백질 및 꼬리 섬유 단백질(tail fiber protein), 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a bacteriophage JBP901 belonging to the subfamily Spounavirinae of the family Myoviridae and to the use thereof and more particularly to a bacteriophage JBP901 belonging to the subfamily Spounavirinae of the family Myoviridae and more particularly to an endolysin protein derived from the bacteriophage JBP901, A tail fiber protein, and uses thereof.
바실러스 세레우스(Bacillus cereus)는 B. cereus sensu lacto group에 속하며, 설사, 구토 및 구역질을 유발하는 기회감염성의 식품 전염성 항원이다. 이는 우유, 치즈, 시리얼, 쌀, 말린 고추가루 및 발효 식품과 같은 다양한 식품 및 식품 첨가제에서 분리되었음이 공지되었으며, 104 CFU/g 이상의 농도로 오염된 식품은 식품 규제를 통과하지 못하고 유통 제한되고 있다. Bacillus cereus is B. cereus sensu belongs to the lacto group and is an opportunistic foodborne antigen that causes diarrhea, vomiting and nausea. It has been known that it has been isolated from various food and food additives such as milk, cheese, cereal, rice, dried chili powder and fermented foods, and foods contaminated with concentrations of 10 4 CFU / g or higher are not permitted to pass food regulations, have.
박테리오파지(bacteriophage)는 "세균(bacteria)을 먹는다(phage)"는 의미를 가지며, 세균을 숙주 세포로 하여 이에 감염되는 바이러스를 지칭한다. 파지는 크게 용균 파지(virulent phage) 및 용원성 파지(Temperate phage)로 분류하며, 용균 사이클만 반복하는 것을 용균 파지, 용원 및 용균 사이클을 동시에 가지는 것을 약독성, 용원성 파지로 정의한다. 약독성 파지는 숙주 세포의 유전자에 자신의 유전자 정보를 넣어 파지의 형태는 사라지지만 숙주 세포를 사멸하지 않으며, 이러한 상태로 숙주 세포에 좋은 환경 조건에 있는 한 지속되고, 숙주 세포의 외부 환경이 악화되면 숙주 세포의 유전자에 있던 일부의 파지 유전자를 용균 사이클로 바꾸어 새로운 파지를 만들고, 숙주 세포를 용균시켜 밖으로 방출된다. 용균성 파지의 경우, 세균 감염 후에 많은 수의 새로운 파지를 만들어 세포막을 파괴하며 밖으로 나와 용균 시키는데, 일반적으로 숙주 세포의 증식속도보다 파지의 증식속도가 높으므로 세균의 증식을 제한하는 중요한 요인이 될 수 있다.Bacteriophage means "phage" and refers to a virus that is infected with a bacterium as a host cell. The phage is classified into virulent phage and temperate phage. The phage is defined as a weakly toxic and a phage phage having only a lytic cycle, a lytic cycle, a lytic cycle and a lytic cycle. The phagocytic phage is a phage in which the genetic information of the host cell is put into the gene of the host cell so that the form of the phage disappears but the host cell does not die. In this state, the host cell continues to exist under good environmental conditions, When a phage gene in a host cell gene is replaced with a lytic cycle, a new phage is generated, and the host cell is lysed and released to the outside. In the case of the bacterial phage, a large number of new phages are formed after bacterial infection, and the cell membrane is destroyed and lysed out. Generally, the growth rate of the phage is higher than the proliferation rate of the host cell, which is an important factor limiting bacterial proliferation .
이러한 박테리오파지는 넓은 숙주 범위를 가질 수 있고, 특정 숙주균에 대한 정확한 용균 활성을 나타내고, 이를 이용하여 유해성 세균에 대한 억제 활성을 얻고자 연구가 진행되고 있다.Such a bacteriophage has a wide host range, exhibits accurate lytic activity against a specific host bacterium, and is being studied to obtain an inhibitory activity against harmful bacteria by using it.
바실러스 균에 대한 생장 억제 활성을 나타내는 박테리오파지로서, 한국 발효 식품으로부터 박테리오파지 JBP901이 분리되었다. 박테리오파지 JBP901은 바실러스 세레우스, 바실러스 튜렝겐시스(B. thuringiensis), 바실러스 미코이데스(B. mycoides) 및 바실러스 위엔스텝파네시스(B. weihenstephanensis)와 같은 바실러스 속 균에 대하여 용해 활성을 나타낼 수 있음이 공지되었다(비특허문헌 0001). 이후 연구에서 JBP901은 바실러스 세레우스 분리 균주에 대하여, 음식 또는 인간으로부터 분리된 344 개의 분리체 중에서 279 개의 분리체에 대하여 용해 활성을 가지는 반면, 유용한 발효균으로서 알려진 B. subtilis 및 B. licheniformis에 대하여는 생장에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였음이 공지된 바 있다(비특허문헌 0002). 그러나, 이의 생물화학적인 일부 특징에 대하여만 연구되었을 뿐, 보다 효과적으로 박테리오파지 JBP901을 적용하기 위하여 전장 유전체 서열에 대한 연구가 이루어지지 않아, 이의 용도가 제한적이었다.Bacteriophage JBP901 was isolated from Korean fermented food as a bacteriophage showing growth inhibitory activity against Bacillus bacteria. Bacteriophage JBP901 may exhibit lytic activity against Bacillus species such as Bacillus cereus, B. thuringiensis , B. mycoides , and B. weihenstephanensis (Non-Patent Document 0001). In subsequent studies, JBP901 has a solubilizing activity on 279 isolates from 344 isolates isolated from food or human, while B. subtilis and B. licheniformis , known as useful fermenting bacteria, (See Non-Patent Document 0002). However, only some of its biochemical characteristics have been studied, and the application of the bacteriophage JBP901 has not been studied because of its inability to study the full-length genome sequence.
따라서, 본 발명자들은 발효 식품에서 유해균에 대한 억제 활성을 나타내는 박테리오파지 JBP901을 보다 안전하고 효과적으로 사용하기 위해 노력한 결과, 박테리오파지 JBP901의 유전체 전장의 염기 서열을 분석하였고, 이를 통해 박테리오파지 JBP901은 SPO1-유사 파지와는 상이한 유전체 및 단백질체를 가지며, 미오비리대 과(family Myoviridae)의 스파우나비리내 아과(subfamily Spounavirinae)에 속하는 것을 확인하였다. 또한, 박테리오파지 JBP901의 유전정보로부터 유용한 용도로 사용될 수 있을 것으로 예상되는 엔도리신(endolysin) 단백질 및 꼬리 섬유 단백질(tail fiber protein)을 암호화하는 유전 정보를 선별하여, 이를 통해 다양한 용도를 찾을 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors have made efforts to use bacteriophage JBP901, which exhibits inhibitory activity against harmful bacteria in fermented foods, more safely and effectively. As a result, the nucleotide sequence of the bacteriophage JBP901 was analyzed and the bacteriophage JBP901 was identified as SPO1- Have different genomes and protein bodies and belong to the subfamily Spounavirinae of the family Myoviridae . From the genetic information of bacteriophage JBP901, genetic information encoding endolysin protein and tail fiber protein, which is expected to be useful, can be selected and used for various purposes By confirming, the present invention has been completed.
이에, 본 발명자들은 박테리오파지 JBP901의 전장 유전체 분석을 통해 항균 활성에 대하여 유용하게 사용될 수 있는 유전자를 발굴하였고, 이를 통해 박테리오파지 JBP901가 유의적인 항균 활성을 나타낼 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the inventors of the present invention have uncovered a gene that can be useful for antimicrobial activity through analysis of the full-length genome of bacteriophage JBP901, and confirmed that bacteriophage JBP901 can exhibit significant antibacterial activity, thereby completing the present invention.
따라서, 본 발명의 목적은 미오비리대 과(family Myoviridae)의 스파우나비리내 아과(subfamily Spounavirinae)에 속하는 박테리오파지 JBP901의 유전체 염기서열 정보를 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide genome sequence information of bacteriophage JBP901 belonging to the subfamily Spounavirinae of the family Myoviridae .
또한, 본 발명의 또다른 목적은 상기 박테리오파지 JBP901의 유전 정보로부터 유용한 용도를 가질 수 있는 단백질을 암호화하는 유전자를 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide a gene encoding a protein that can have a useful use from the genetic information of the bacteriophage JBP901.
또한, 본 발명의 또다른 목적은 상기 단백질의 용도를 제공하는 것이다.Yet another object of the present invention is to provide the use of the protein.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 미오비리대 과(family Myoviridae)의 스파우나비리내 아과(subfamily Spounavirinae)에 속하는, 박테리오파지 JBP901를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a bacteriophage JBP901 belonging to the subfamily Spounavirinae of the family Myoviridae .
본 발명의 또다른 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 박테리오파지 JBP901은 유전자은행 등록번호(GeneBank accession number) KJ676859의 유전체 서열을 전장으로 포함할 수 있으며, 상기 유전체 서열은 서열번호 1 내지 3의 염기서열로 기재되는 뉴클레오티드를 일부로 포함하는 것일 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the bacteriophage JBP901 may include a genetic sequence of a gene bank accession number KJ676859 as an entire length, and the genetic sequence is a nucleotide sequence of SEQ ID NOS: It may be one containing as part of the nucleotide described.
본 발명은 또한, 유해균 제어 능력을 가지며, 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성되는 엔도리신(endolysin) 단백질을 제공한다.The present invention also provides an endolysin protein having the ability to control harmful bacteria and consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
본 발명은 상기 엔도리신 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는, 발현 벡터를 제공한다.The present invention provides an expression vector comprising a gene encoding the endorrhine protein.
본 발명은 상기 발현 벡터로 형질전환된, 형질전환체를 제공한다.The present invention provides a transformant transformed with the above expression vector.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 엔도리신 단백질은 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 유전자에 의해 암호화될 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the endorrhizin protein may be encoded by a gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
본 발명의 또다른 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 엔도리신 단백질은 박테리오파지 JBP901로부터 유래된 것일 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the endorhysin protein may be derived from bacteriophage JBP901.
본 발명은 또한, 상기 엔도리신 단백질을 유효성분으로 포함하는, 항균용 조성물을 제공한다.The present invention also provides an antimicrobial composition comprising the endorhynin protein as an active ingredient.
본 발명은 또한, 숙주 세포에 대한 특이적인 결합능을 가지며, 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성되는, 엔도리신의 세포막 결합 도메인(cell wall binding domain, CBD)를 제공한다.The present invention also provides a cell wall binding domain (CBD) of endorrhizin, which has a specific binding capacity to a host cell and is composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.
본 발명은 상기 엔도리신의 CBD를 암호화하는 유전자를 포함하는, 발현 벡터를 제공한다.The present invention provides an expression vector comprising a gene encoding the CBD of the endorhysin.
본 발명은 상기 발현 벡터로 형질전환된, 형질전환체를 제공한다.The present invention provides a transformant transformed with the above expression vector.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 엔도리신의 CBD는 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 유전자에 의해 암호화되는 것일 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the CBD of the endorhysin may be one encoded by a gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 엔도리신의 CBD는 박테리오파지 JBP901로부터 유래된 것일 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the CBD of the endorhysin may be derived from bacteriophage JBP901.
본 발명은 또한, The present invention also relates to
i) 유해균 감염 의심 시료에 상기 엔도리신의 CBD를 첨가하는 단계; 및i) adding CBD of the endorhysin to a sample suspected of infecting a harmful microorganism; And
ii) 상기 단계 i)에서 첨가한 꼬리 섬유 단백질과 결합하는 유해균의 농도를 확인하는 단계;를 포함하는, 엔도리신의 CBD를 이용한 유해균의 신속 검출 방법을 제공한다.and ii) confirming the concentration of the harmful bacteria bound to the caudate fiber protein added in the step i). The present invention also provides a method for the rapid detection of harmful bacteria using CBD of endorrisin.
본 발명은 또한, 상기 엔도리신의 CBD를 포함하는, 유해균 검출용 키트를 제공한다.The present invention also provides a kits for the detection of a noxious bacteria, comprising the CBD of the endorrisin.
본 발명은 또한, 상기 엔도리신의 CBD 및 유해균 사멸용 항생제가 결합된, 약물 전달체를 제공한다.The present invention also provides a drug delivery system to which CBD of endorrisin and an antibiotic for killing microorganisms are combined.
본 발명은 또한, 상기 약물 전달체를 유효성분으로 포함하는, 항균용 조성물을 제공한다.The present invention also provides an antimicrobial composition comprising the drug delivery vehicle as an active ingredient.
본 발명은 또한, 숙주 세포에 대한 특이적인 결합능을 가지며, 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성되는, 꼬리 섬유 단백질(tail fiber protein)을 제공한다.The present invention also provides a tail fiber protein having a specific binding capacity to a host cell and consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
본 발명은 상기 꼬리 섬유 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는, 발현 벡터를 제공한다.The present invention provides an expression vector comprising a gene encoding said tail fiber protein.
본 발명은 상기 발현 벡터로 형질전환된, 형질전환체를 제공한다.The present invention provides a transformant transformed with the above expression vector.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 꼬리 섬유 단백질은 서열번호 3의 염기서열로 구성되는 유전자에 의해 암호화되는 것일 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the tail fiber protein may be encoded by a gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 꼬리 섬유 단백질은 박테리오파지 JBP901로부터 유래된 것일 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the tail fiber protein may be derived from bacteriophage JBP901.
본 발명은 또한, The present invention also relates to
i) 유해균 감염 의심 시료에 상기 꼬리 섬유 단백질을 첨가하는 단계; 및i) adding the tail fiber protein to a suspect sample of a noxious bacteria; And
ii) 상기 단계 i)에서 첨가한 꼬리 섬유 단백질과 결합하는 유해균의 농도를 확인하는 단계;를 포함하는, 꼬리 섬유 단백질을 이용한 유해균의 신속 검출 방법을 제공한다.and ii) confirming the concentration of the harmful microorganism which binds to the added tail fiber protein in step i). The present invention also provides a method for the rapid detection of harmful microorganisms using the tail fiber protein.
본 발명은 또한, 상기 꼬리 섬유 단백질을 포함하는, 유해균 검출용 키트를 제공한다.The present invention also provides a kit for detecting a noxious bacteria, comprising the tail fiber protein.
본 발명은 또한, 상기 꼬리 섬유 단백질 및 유해균 사멸용 항생제가 결합된, 약물 전달체를 제공한다.The present invention also provides a drug delivery vehicle to which said tail fiber protein and an antibiotic for the destruction of noxious bacteria are combined.
본 발명은 또한, 상기 약물 전달체를 유효성분으로 포함하는, 항균용 조성물을 제공한다.The present invention also provides an antimicrobial composition comprising the drug delivery vehicle as an active ingredient.
따라서, 본 발명은 다양한 균에 대한 항균 활성을 나타내는 박테리오파지 JBP901 및 이의 유전체 염기서열을 제공한다. 본 발명의 박테리오파지 JBP901은 발효 식품으로부터 분리되었으나, 정확한 유전체 정보가 없어 구체적인 특징 및 항균 활성 효과의 증가에 대하여 확인할 수 없었던 한계를 극복하고, 보다 정확한 유전체 정보를 기반으로 하여 항균 활성 효과를 증진 및 개선할 수 있다. Accordingly, the present invention provides the bacteriophage JBP901 and its genomic sequence showing antibacterial activity against various bacteria. The bacteriophage JBP901 of the present invention was isolated from the fermented food but overcomes the limit that could not be confirmed for the specific characteristics and the increase of the antimicrobial activity effect due to lack of accurate genome information and enhances and improves the antimicrobial activity effect based on more accurate genome information can do.
이와 더불어, 본 발명의 박테리오파지 JBP901의 유전체 정보로부터, 박테리오파지 유전자들의 특성이 알려지지 않은 부분을 연구하여 박테리오파지 유래의 유전자의 다양한 용도를 찾을 수 있다. 특히, 박테리오파지 JBP901 유래의 엔도리신(endolysin) 단백질은 유해균에 대한 유의적인 용균 활성을 나타내므로 유해균 제어에 유용하게 사용할 수 있으며, 엔도리신의 CBD(endolysin cell wall binding domain) 및 꼬리 섬유 단백질(tail fiber protein)은 특정 숙주 세포에 특이적으로 결합할 수 있어, 항체 대체제로서 유해균의 검출 방법에 사용될 수 있고, 항균제와 결합된 형태의 약물전달체로 사용될 수 있다.In addition, from the genomic information of the bacteriophage JBP901 of the present invention, various uses of the gene derived from bacteriophage can be found by studying a part of the bacteriophage genes whose characteristics are unknown. In particular, the endolysin protein derived from bacteriophage JBP901 exhibits significant lytic activity against harmful bacteria, and thus can be useful for control of harmful bacteria. The endolysin cell wall binding domain (CBD) and tail fiber protein can be specifically bound to a specific host cell, and can be used as a method for detecting harmful bacteria as an antibody substitute, and can be used as a drug delivery agent in a form combined with an antibacterial agent.
도 1은 박테리오파지 JBP901의 유전체 지도(genome map)을 나타낸다. 구체적으로, 박스로 표시된 부분은 박테리오파지 JBP901의 ORF를 나타내며, 정방향 가닥의 ORF는 녹색 박스이며, 역방향 가닥의 ORF는 적색 박스를 표기한다.
도 2는 박테리오파지 JBP901 및 공지된 파지의 유전체 쌍대 비교 결과를 나타낸다:
도 2a는 박테리오파지 JBP901의 유전체를 Bcp1(NC_024137), Bc431v3(JX094431), BCP78(JN797797), phiAGATE (NC_020081) 및 Bastille (JF966203)와 비교한 결과를 나타내며; 및
도 2b는 박테리오파지 JBP901의 유전체를 SPO1(NC_011421), Twort(AY954970) 및 BCP8-2과 비교한 결과를 나타낸다.
도 3은 박테리오파지 JBP901, Bcp1 및 Bv431v3을 대상으로 한 CoreGene 분석 결과를 나타낸다.
도 4는 계통발생학 분석을 위해 박테리오파지 JBP901의 주요 캡시드 단백질 암호화 유전자를 대상으로 최대 가능성 가계도(maximum likelihood tree, ML) 분석한 결과이다:
도 4a는 박테리오파지 JBP901 및 비분류 파지(unclassified phage)를 대상으로 한 최대 가능성 가계도이며; 및
도 4b는 박테리오파지 JBP901 및 ICTV 분류된 파지를 대상으로 한 최대 가능성 가계도이다.
도 5는 박테리오파지 JBP901 유래 단백질과 다른 파지의 유사 단백질 간의 서열 비교 분석 결과이다:
도 5a는 박테리오파지 JBP901 유래 엔도리신 단백질 및 다른 파지의 유사 단백질 간의 아미노산 배열(alignment) 분석 결과를 나타내며; 및
도 5b는 박테리오파지 JBP901 유래 꼬리 섬유 단백질 및 다른 파지의 유사 단백질 간의 아미노산 배열(alignment) 분석 결과를 나타낸다.Figure 1 shows the genome map of bacteriophage JBP901. Specifically, the box indicates the ORF of bacteriophage JBP901, the ORF of the forward strand is the green box, and the ORF of the reverse strand indicates the red box.
Figure 2 shows the results of a pair of genetic pairs of bacteriophage JBP901 and a known phage:
2A shows the results of comparing the dielectric of bacteriophage JBP901 with Bcp1 (NC_024137), Bc431v3 (JX094431), BCP78 (JN797797), phiAGATE (NC_020081) and Bastille (JF966203); And
2B shows the results of comparing the dielectric of bacteriophage JBP901 with SPO1 (NC_011421), Twort (AY954970) and BCP8-2.
Figure 3 shows the results of CoreGene analysis for bacteriophages JBP901, Bcp1 and Bv431v3.
Figure 4 shows the maximum likelihood tree (ML) analysis of major capsid protein coding genes of bacteriophage JBP901 for phylogenetic analysis:
Figure 4a is a maximum likelihood plot for bacteriophage JBP901 and unclassified phage; And
Figure 4b is a maximum likelihood graph for bacteriophage JBP901 and ICTV classified phage.
Fig. 5 shows a sequence comparison result between bacteriophage JBP901-derived protein and other phage-like proteins:
5A shows the result of amino acid alignment analysis between the bacteriophage JBP901-derived endorrice protein and other phage-like proteins; And
FIG. 5B shows the result of amino acid alignment analysis between the bacteriophage JBP901-derived tail fiber protein and other phage-like proteins.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
상술한 바와 같이, 박테리오파지는 넓은 숙주 범위를 가질 수 있고, 특정 숙주균에 대한 정확한 용균 활성을 나타내므로, 이를 이용하여 유해성 세균에 대한 억제 활성을 얻고자 연구가 진행되어 박테리오파지 JBP901을 분리하였으나, 유전체 염기서열이 연구되지 않아 항균 활성에 대한 구체적인 연구가 불가능하였고, 이를 통해 유용하게 사용할 수 있는 유전자 또한 연구하지 못해 제한점을 가졌다.As described above, since the bacteriophage has a wide host range and exhibits accurate lytic activity against a specific host bacterium, the bacteriophage JBP901 has been isolated in order to obtain an inhibitory activity against harmful bacteria by using it, Because the nucleotide sequence was not studied, detailed studies on the antimicrobial activity were impossible and the gene which could be usefully used could not be studied.
본 발명의 박테리오파지 JBP901은 발효 식품으로부터 분리되었으나, 정확한 유전체 정보가 없어 구체적인 특징 및 항균 활성 효과의 증가에 대하여 확인할 수 없었던 한계를 극복하고, 보다 정확한 유전체 정보를 기반으로 하여 항균 활성 효과를 증진 및 개선할 수 있다. 이와 더불어, 본 발명의 박테리오파지 JBP901이 다양한 유해성 세균에 대하여 유의적인 항균 활성을 나타내므로, 항균용 조성물의 유효성분으로 사용할 수 있어 효과적이다.The bacteriophage JBP901 of the present invention was isolated from the fermented food but overcomes the limit that could not be confirmed for the specific characteristics and the increase of the antimicrobial activity effect due to lack of accurate genome information and enhances and improves the antimicrobial activity effect based on more accurate genome information can do. In addition, since the bacteriophage JBP901 of the present invention exhibits significant antibacterial activity against various harmful bacteria, it can be effectively used as an effective ingredient of an antibacterial composition.
따라서, 본 발명은 미오비리대 과(family Myoviridae)의 스파우나비리내 아과(subfamily Spounavirinae)에 속하는, 박테리오파지 JBP901를 제공한다.Thus, the present invention provides bacteriophage JBP901 belonging to the subfamily Spounavirinae of the family Myoviridae .
본 발명의 박테리오파지 JBP901은 유전자은행 등록번호(GeneBank accession number) KJ676859의 유전체 서열을 전장으로 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.The bacteriophage JBP901 of the present invention preferably comprises, but is not limited to, the genome sequence of GeneBank accession number KJ676859.
상기 유전체 서열은 서열번호 1 내지 3의 염기서열로 기재되는 뉴클레오티드를 일부로 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 구체적으로 상기 서열번호 1의 염기서열은 엔도리신(endolysin) 단백질을 암호화하는 염기서열일 수 있고, 서열번호 2의 염기서열은 엔도리신의 CBD(endolysin cell wall binding domain)를 암호화하는 염기서열일 수 있으며, 서열번호 3은 꼬리 섬유 단백질(tail fiber protein)을 암호화하는 염기서열일 수 있다. 또한, 상기 엔도리신 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성되는 단백질인 것이 바람직하며, 상기 엔도리신의 CBD는 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드인 것이 바람직하고, 상기 꼬리 섬유 단백질은 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성되는 단백질인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.The above-mentioned genomic sequence is preferably, but not limited to, a part of the nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NOS: 1 to 3. Specifically, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 may be a nucleotide sequence encoding an endolysin protein, and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 may be a nucleotide sequence encoding an endolysin cell wall binding domain (CBD) And SEQ ID NO: 3 may be a nucleotide sequence encoding a tail fiber protein. Preferably, the endorrhizin protein is a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and the CBD of the endorhysin is preferably a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, 6, but is not limited thereto.
본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, 본 발명자들은 발효식품으로부터 바실러스 세레우스에 대한 억제능을 가지는 것으로 보고된 박테리오파지 JBP901의 유전체 염기서열을 분석하여, 유전자은행 등록번호(GeneBank accession number) KJ676859의 유전체 서열을 확인하였으며, 이를 데이터베이스에 공지된 박테리오파지인 BCP78, Bc431v3 및 Bcp1의 유전체 서열과 비교 분석하여, 기능적 단백질을 암호화하는 ORF 서열을 확인하여 JBP901의 유전체 지도를 확보하였다(도 1 및 [표 1]).In a specific embodiment of the present invention, the present inventors analyzed the genomic sequence of bacteriophage JBP901, which has been reported to have the ability to inhibit Bacillus cereus from fermented foods, to determine the genetic sequence of GeneBank accession number KJ676859 And the genomic sequence of BCP78, Bc431v3 and Bcp1, which are known bacteriophages in the database, was compared and the ORF sequence encoding the functional protein was confirmed to obtain a genome map of JBP901 (FIG. 1 and [Table 1]).
또한, 본 발명자들은 박테리오파지 JBP901의 계통발생적 분석을 위해, BCP78, Bc431v3 및 Bcp1 파지와 유전체 및 단백질체와 비교 분석한 결과, 박테리오파지 JBP901은 SPO1-유사 파지 또는 Twort-유사 파지 군과는 낮은 수준의 유사성을 나타내고 BCP78, Bc431v3 및 Bcp1 파지와 높은 수준의 유전체 및 단백질체의 상동성을 나타내므로, 미오비리대 과(family Myoviridae)의 스파우나비리내 아과(subfamily Spounavirinae)에 속하는 것을 확인하였다(도 2 내지 도 4).In addition, for phylogenetic analysis of the bacteriophage JBP901, the present inventors compared the bacteriophage JBP901 with the BCP78, Bc431v3 and Bcp1 phage and the genome and the protein body, and found that the bacteriophage JBP901 has a low similarity to the SPO1-like phage or Twort- And showed homology between the BCP78, Bc431v3 and Bcp1 phage and high level of genomic and protein bodies, and thus belonging to the subfamily Spounavirinae of the family Myoviridae (Fig. 2 to Fig. 4 ).
또한, 본 발명자들은 박테리오파지 JBP901의 유전 정보를 확인한 바, 이로부터 유용한 용도를 가지는 유전자를 선별하고 특성을 분석할 수 있을 것으로 기대하였다. 이에, 박테리오파지 JBP901의 엔도리신 단백질 또는 이의 CDB의 아미노산 서열과 이를 암호화하는 유전자를 다른 유사 파지 유래 엔도리신 단백질 및 이의 유전자와 서열 분석하여 비교하였을 때, 단백질 단위에서 높은 수준의 서열 상동성을 나타내는 것을 확인하였다(표 2 및 도 5a). 또한, 박테리오파지 JBP901의 꼬리 섬유 단백질(tail fiber protein)의 유전자를 다른 유사 파지 유래 꼬리 섬유 단백질 및 이의 유전자와 서열 분석하여 비교하였을 때, 박테리오파지 JBP901의 꼬리 섬유 단백질은 이들과 서로 다른 유전자 염기서열 및 단백질 아미노산 서열을 가지고 있어, 다른 특징적인 활성을 추가로 나타낼 수 있을 것으로 기대하였다(표 3 및 도 5b).In addition, the present inventors confirmed the genetic information of bacteriophage JBP901, and from this, it was expected that genes having useful uses could be selected and analyzed. When the amino acid sequence of the endoribin protein of JBP901 or the CDB of the bacteriophage JBP901 and the gene encoding the endoribin protein of CDB of the bacteriophage JBP901 were analyzed by sequence analysis with other endophilic endoredysin proteins and their genes, (Table 2 and Fig. 5A). In addition, when the gene of the tail fiber protein of bacteriophage JBP901 was compared with that of the other similar phage-derived tail fiber protein and its gene, the tail fiber protein of bacteriophage JBP901 had a different nucleotide sequence and protein Amino acid sequence, and was expected to be able to further exhibit other characteristic activities (Table 3 and Figure 5b).
따라서, 본 발명의 박테리오파지 JBP901의 유전체 서열을 이용하여 항균 활성 및 다양한 용도로의 활용을 위한 연구 자료로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 박테리오파지 JBP901의 엔도리신 단백질의 용균 활성을 통해 유해균 제어를 위한 항균용 조성물의 유효성분으로 사용할 수 있으며, 엔도리신의 CBD 및 꼬리 섬유 단백질을 이용하여 항체 대체제로서 유해균의 검출 방법에 사용될 수 있고, 항균제와 결합된 형태의 약물전달체로 사용될 수 있다.Therefore, the present invention can be used as research data for antimicrobial activity and utilization for various purposes by using the genetic sequence of bacteriophage JBP901 of the present invention. For example, the bacteriophage JBP901 can be used as an active ingredient of an antimicrobial composition for control of harmful microorganisms through the lytic activity of endorrhizin protein, and can be used as an antibody substitute for the detection method of harmful bacteria using CBD and tail fiber proteins of endorrisin And can be used as a drug delivery agent in a form combined with an antimicrobial agent.
또한, 본 발명은 유해균 제어 능력을 가지며, 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성되는 엔도리신(endolysin) 단백질을 제공한다.The present invention also provides an endolysin protein having the ability to control harmful bacteria and consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
또한, 본 발명은 상기 엔도리신 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는, 발현 벡터를 제공한다.The present invention also provides an expression vector comprising a gene encoding the endorrhizin protein.
또한, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된, 형질전환체를 제공한다.In addition, the present invention provides a transformant transformed with said vector.
본 발명의 엔도리신 단백질은 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 유전자에 의해 암호화되는 유전자인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.The endorozyne protein of the present invention is preferably a gene encoded by a gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
본 발명의 엔도리신 단백질은 박테리오파지 JBP901로부터 유래된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.The endorhysin protein of the present invention is preferably, but not limited to, derived from bacteriophage JBP901.
본 발명의 엔도리신 단백질은 박테리오파지 유래의 엔도리신 단백질들과 유사한 유전자 및 단백질 상동성을 나타내므로, 숙주 유해균에 대하여 특이적이고 효과적인 용균 활성을 나타낼 수 있다. Since the endorhynin protein of the present invention shows similar gene and protein homology to endorrhizin proteins derived from bacteriophage, it can exhibit a specific and effective lytic activity against host pest.
또한, 본 발명은 상기 엔도리신 단백질을 유효성분으로 포함하는, 항균용 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for antimicrobial use comprising the above endorhynin protein as an active ingredient.
본 발명의 항균용 조성물은, 유해균 제어용 항생제, 항균 보조제, 항균용 식품 첨가제, 항균용 사료 첨가제, 항균용 방부용 조성물 및 항균용 의약외품의 형태일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.The antimicrobial composition of the present invention may be in the form of an antibiotic for controlling harmful microorganisms, an antimicrobial auxiliary agent, an antimicrobial food additive agent, an antimicrobial feed additive agent, an antimicrobial nasal composition, and a quasi-drug for antimicrobial use, but is not limited thereto.
본 발명의 엔도리신 단백질은 박테리오파지 JBP901 유래의 용균 단백질로서, 숙주로 하는 세포에 대하여 효과적인 용균 활성을 나타낼 수 있으므로, 항균용 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.The endorhysin protein of the present invention is a lytic protein derived from bacteriophage JBP901, and can exhibit an effective lytic activity on a host cell, and thus can be used as an effective ingredient of an antimicrobial composition.
또한, 본 발명은 숙주 세포에 대한 특이적인 결합능을 가지며, 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성되는, 엔도리신의 CBD를 제공한다.In addition, the present invention provides a CBD of endorrhizin, which has a specific binding ability to a host cell and is composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.
또한, 본 발명은 상기 엔도리신의 CBD를 암호화하는 유전자를 포함하는, 발현 벡터를 제공한다.Further, the present invention provides an expression vector comprising a gene encoding the CBD of the endorrisin.
또한, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된, 형질전환체를 제공한다.In addition, the present invention provides a transformant transformed with said vector.
본 발명의 엔도리신의 CBD는 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 유전자에 의해 암호화되는 유전자인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.The CBD of endolysin of the present invention is preferably a gene encoded by a gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.
본 발명의 엔도리신의 CBD는 박테리오파지 JBP901로부터 유래된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.The CBD of endolysin of the present invention is preferably, but not limited to, derived from bacteriophage JBP901.
본 발명의 엔도리신의 CBD는 박테리오파지 유래의 CBD 서열과 상이하여, 박테리오파지 JBP901가 숙주로 하는 세포에 대하여 특이적인 반응이 가능하므로, 이를 항체 대체제로서 유해균의 검출 방법에 사용할 수 있고, 항균제와 결합된 형태의 약물전달체로 사용할 수 있다.Since the CBD of endorozine of the present invention differs from the CBD sequence derived from bacteriophage, the bacteriophage JBP901 can specifically react to the host cell. Therefore, it can be used as a method for detecting harmful bacteria as an antibody substitute, Type drug delivery system.
또한, 본 발명은 상기 엔도리신의 CBD를 이용한 유해균의 신속 검출 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for the rapid detection of harmful bacteria using CBD of endorrisin.
상기 방법은 아래의 단계로 구성되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다:The method is preferably, but not exclusively, composed of the following steps:
i) 유해균 감염 의심 시료에 본 발명의 엔도리신의 CBD를 첨가하는 단계; 및i) adding a CBD of the endorhysin of the present invention to a suspect sample of a harmful microbial infection; And
ii) 상기 단계 i)에서 첨가한 엔도리신의 CBD와 결합하는 유해균의 농도를 확인하는 단계.ii) confirming the concentration of the harmful bacteria which binds to CBD of the endorozine added in the step i).
또한, 본 발명은 상기 엔도리신의 CBD를 포함하는, 유해균 검출용 키트를 제공한다.The present invention also provides a kits for the detection of a harmful microorganism comprising the endocrine CBD.
또한, 본 발명은 상기 엔도리신의 CBD가 유해균 사멸용 항생제가 결합된 형태의 약물 전달체를 제공한다.In addition, the present invention provides a drug delivery system in which CBD of endorrisin is bound to an antibiotic for the destruction of harmful bacteria.
본 발명의 약물 전달체에 있어서, 엔도리신의 CBD는 박테리오파지 JBP901가 숙주 세포에 하는 유해균에 대하여 특이적인 결합이 가능하여, 상기 유해균으로 항생제를 정확하고 빠르게 전달하기 위한 용도를 가지는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.In the drug delivery system of the present invention, it is preferable that the CBD of endorrhizine has a use for bacteriophage JBP901 capable of binding specifically to harmful bacteria in host cells and delivering the antibiotic to the above harmful bacteria accurately and rapidly. However, It does not.
또한, 본 발명은 숙주 세포에 대한 특이적인 결합능을 가지며, 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성되는, 꼬리 섬유 단백질(tail fiber protein)을 제공한다.In addition, the present invention provides a tail fiber protein having the specific binding ability to a host cell and consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
또한, 본 발명은 상기 꼬리 섬유 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는, 발현 벡터를 제공한다.The present invention also provides an expression vector comprising a gene encoding said tail fiber protein.
또한, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된, 형질전환체를 제공한다.In addition, the present invention provides a transformant transformed with said vector.
본 발명의 꼬리 섬유 단백질은 서열번호 3의 염기서열로 구성되는 유전자에 의해 암호화되는 유전자인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.The tail fiber protein of the present invention is preferably a gene encoded by a gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, but is not limited thereto.
본 발명의 꼬리 섬유 단백질은 박테리오파지 JBP901로부터 유래된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.The tail fiber protein of the present invention is preferably, but not limited to, derived from bacteriophage JBP901.
본 발명의 꼬리 섬유 단백질은 박테리오파지 유래의 꼬리 섬유 단백질 단백질들과 유전자의 염기서열 및 단백질의 아미노산 서열 상동성이 높지 않아, 박테리오파지 JBP901가 숙주로 하는 세포에 대하여 특이적인 반응이 가능하므로, 이를 항체 대체제로서 유해균의 검출 방법에 사용할 수 있고, 항균제와 결합된 형태의 약물전달체로 사용할 수 있다.Since the tail fiber protein of the present invention is not highly homologous to the nucleotide sequence of the gene of the bacteriophage-derived tail protein protein and the amino acid sequence of the protein, the bacteriophage JBP901 can specifically react to the host cell, Which can be used as a method for detecting harmful microorganisms, and can be used as a drug delivery system in a form combined with an antibacterial agent.
또한, 본 발명은 상기 꼬리 섬유 단백질을 이용한 유해균의 신속 검출 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for the rapid detection of harmful bacteria using the above-mentioned tail fiber protein.
상기 방법은 아래의 단계로 구성되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다:The method is preferably, but not exclusively, composed of the following steps:
i) 유해균 감염 의심 시료에 본 발명의 꼬리 섬유 단백질을 첨가하는 단계; 및i) adding the tail fiber protein of the present invention to a suspect sample of a harmful infection; And
ii) 상기 단계 i)에서 첨가한 꼬리 섬유 단백질과 결합하는 유해균의 농도를 확인하는 단계.ii) confirming the concentration of the harmful bacteria which binds to the caudal fiber protein added in the step i).
또한, 본 발명은 상기꼬리 섬유 단백질을 포함하는, 유해균 검출용 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a kit for detecting harmful bacteria comprising the tail fiber protein.
또한, 본 발명은 상기 꼬리 섬유 단백질이 유해균 사멸용 항생제가 결합된 형태의 약물 전달체를 제공한다.In addition, the present invention provides a drug delivery system in which the tail fiber protein is bound to an antibiotic for the destruction of harmful bacteria.
본 발명의 유해균의 신속 검출 방법 또는 약물 전달체에 있어서, 꼬리 섬유 단백질은 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성되는 박테리오파지 JBP901 유래의 꼬리 섬유 단백질 전장일 수 있고, 이의 활성 단편 펩타이드 서열만을 사용할 수도 있으나, 이에 한정되지 않는다.In the method for rapid detection of noxious bacteria or the drug delivery system of the present invention, the tail fiber protein may be a full-length tail protein protein derived from the bacteriophage JBP901 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and only the active fragment peptide sequence thereof may be used. It is not limited.
본 발명의 약물 전달체에 있어서, 꼬리 섬유 단백질은 박테리오파지 JBP901가 숙주 세포에 하는 유해균에 대하여 특이적인 결합이 가능하여, 상기 유해균으로 항생제를 정확하고 빠르게 전달하기 위한 용도를 가지는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.In the drug delivery system of the present invention, the tail fiber protein is preferably a bacteriophage JBP901 capable of binding specifically to a harmful bacterium to be hosted on the host cell, and having an application for accurately and rapidly delivering the antibiotic to the above harmful bacterium. Do not.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these examples are for illustrative purposes only and that the scope of the present invention is not construed as being limited by these examples.
박테리오파지 Bacteriophage JBP901의Of JBP901 분리 및 유전체 염기서열 분석 Isolation and genomic sequencing
<1-1> 박테리오파지 <1-1> Bacteriophage JBP901의Of JBP901 정제 및 DNA 분리 Purification and DNA Isolation
박테리오파지 JBP901의 유전체 염기서열을 분석하기 위해, 공지된 방법(비특허문헌 0001)에 따라 발효식품으로부터 분리된 바실러스 속(Bacillus spp.) 균주로부터 박테리오파지를 단일 플라그(single plaque) 단위로 분리하고, 숙주 세포에서 감염 배양하여 대량 생산하였다. 그런 다음, 숙주 세포를 파쇄하고 파쇄하고 원심분리하여 수득한 상층액을 CsCl 농도구배 초고속원심분리하고 투석하여 박테리오파지 JBP901를 분리 정제하였다.To analyze the genomic sequence of bacteriophage JBP901, bacteriophage was isolated from a Bacillus spp. Strain isolated from a fermented food according to a known method (non-patent document 0001) in a single plaque unit, Cells were infected and cultured. Then, the host cells were disrupted, disrupted and centrifuged, and the resulting supernatant was subjected to CsCl concentration gradient ultracentrifugal centrifugation and dialyzed to separate and purify the bacteriophage JBP901.
분리 정제한 박테리오파지 JBP901는 DNase를 처리한 후 PEG로 침전한 후, SDS/EDTA 용액을 처리하고, 페놀:클로로포름 추출 방법으로 박테리오파지 JBP901의 유전체 DNA를 추출하였다. The purified and purified bacteriophage JBP901 was treated with DNase, precipitated with PEG, treated with SDS / EDTA solution, and extracted with the phenol: chloroform extraction method to extract the genomic DNA of bacteriophage JBP901.
<1-2> 박테리오파지 <1-2> Bacteriophage JBP901의Of JBP901 전장 유전체 염기서열 분석 Full-length genome sequencing
박테리오파지 JBP 901로부터 유전체 DNA를 분리하여, 이의 염기서열을 분석하고 기능적으로 단백질 등을 암호화하는 유전자를 예측하였다.Genomic DNA was isolated from bacteriophage JBP 901, its nucleotide sequence was analyzed, and genes encoding proteins and the like were predicted functionally.
구체적으로, 추출한 유전체 DNA는 마크로젠 사(Macrogen Inc., 한국)에 의뢰하여 454 GS-FLX 시스템(Titanium GS70 Chemistry, Roche Life Science, Mannheim, Germany)을 사용해, 유전체 전장의 염기서열을 분석하였다. 454 GS-FLX 시스템으로 97,624 개로 나뉜 DNA 절편의 서열을 얻었고, 이를 Roche Newbler assembly 소프트웨어 2.9를 사용하여 DNA 절편의 서열을 조합하여, 유전자은행 등록번호(GeneBank accession number) KJ676859의 서열로서 박테리오파지 JBP901 서열을 수득하였다. Q30 퀄리티 필터의 한계값(threshold)으로 평균 커버리지는 55×였고, 최소 커버리지는 17×이었다. 말단 반복 서열의 존재를 확인하여 박테리오파지 JBP901의 조합한 유전체 서열에 대해 지도화하기 위해서, Geneious software v8.14를 사용하여 분석하였다(Klumpp, Jochen, et al. "The SPO1-related bacteriophages." Archives of virology 155.10 (2010): 1547-1561.).Specifically, the extracted genomic DNA was sequenced by Macrogen Inc. (Korea) and analyzed for the nucleotide sequence of the genome electric field using a 454 GS-FLX system (Titanium GS70 Chemistry, Roche Life Science, Mannheim, Germany). A sequence of DNA fragments divided into 97,624 pieces by the 454 GS-FLX system was obtained, and the sequence of the DNA fragment was combined using Roche Newbler assembly software 2.9 to obtain the bacteriophage JBP901 sequence as a sequence of GeneBank accession number KJ676859 . The average coverage was 55 × with a threshold of Q30 quality filter and the minimum coverage was 17 ×. To mapping for the combination a genome sequence of bacteriophage JBP901 to confirm the presence of terminal repeat sequences were analyzed using Geneious software v8.14 (Klumpp, Jochen, et al. "The SPO1-related bacteriophages." Archives of virology 155.10 (2010): 1547-1561.).
박테리오파지 JBP901의 암호화 서열(coding sequence, CDS)는 Glimmer 3.02, FgeneB, GeneMark.hmm 2.8 및 RAST 4.0 분석 프로그램을 사용하여 예측하였다. 박테리오파지 JBP901의 유전제 전장을 상기 분석 프로그램으로 각각 분석한 후, 적어도 3 개의 분석 프로그램에 의해서 CDS로서 예측된 경우를 선별하여 박테리오파지 JBP901의 CDS로서 판단하고, 이후 분석에서 대상으로 하였다.The coding sequence (CDS) of bacteriophage JBP901 was predicted using Glimmer 3.02, FgeneB, GeneMark.hmm 2.8 and RAST 4.0 analysis program. The genetic background of the bacteriophage JBP901 was analyzed by the above analysis program, and the cases predicted as CDS by at least three analysis programs were selected as the CDS of the bacteriophage JBP901 and then analyzed.
CDS로서 판단된 유전자를 대상으로, 암호화하는 각각의 단백질을 protein-protein BLAST (BLASTP) 알고리즘을 사용하여 기능적 부위를 예측 분석하였다. tRNA를 암호화하는 유전자는 tRNA-SE v.1.21 프로그램에 기본 변수값을 입력하여 예측 분석하였다.For the genes judged to be CDS, each protein that encodes was predicted and analyzed by functional protein-protein BLAST (BLASTP) algorithm. Genes that encode tRNA were predicted and analyzed by entering basic variable values into tRNA-SE v.1.21 program.
<1-3> 박테리오파지 <1-3> Bacteriophage JBP901JBP901 유전체와 유사 박테리오파지 간의 유전체 비교 분석 Comparative analysis of genome between genome and bacteriophage
분석한 박테리오파지 JBP901 유전체 및 기능적 유전자 서열을 이용하여, 유사 박테리오파지로 예상되는 미오비리대(Myoviridae) 파지의 유전체 서열과 비교하기 위해, Easyfig 및 CoreGenes 3.0 분석 프로그램을 사용하여 뉴클레오티드 및 단백질 수준에서 비교 분석하였다. 22,000 내지 29,500 번째 뉴클레오티드 염기 사이에서 높은 수준의 염기서열 해독 범위가 나타나는 것을 확인하여, Geneious 소프트웨어 프로그램을 사용하여 분석하였다. 전체 ORF를 분석하고, 이로부터 데이터베이스에 공지된 박테리오파지인 BCP78, Bc431v3 및 Bcp1의 단백질과 아미노산 서열의 상동성이 50%를 넘는 경우, JBP901의 해당 단백질도 공지된 박테리오파지의 단백질과 기능적으로 높은 유사도를 가지는 것으로 판단하였다.Using the analyzed bacteriophage JBP901 genomic and functional gene sequences, comparative analysis was performed at the nucleotide and protein levels using the Easyfig and CoreGenes 3.0 assay programs to compare the genomic sequence of the Myoviridae phage, which is expected to be a bacteriophage of similar bacteriophage . The analysis was performed using the Geneious software program, confirming that a high level of sequence sequencing was found between nucleotides 22,000 to 29,500 nucleotides. When the total ORF is analyzed and the homology of the amino acid sequences of the bacteriophages BCP78, Bc431v3 and Bcp1 known in the database to those of the BCP1, Bc431v3 and Bcp1 exceeds 50%, the corresponding protein of JBP901 also has a functionally high similarity to the known bacteriophage protein .
그 결과, 도 1 및 하기 [표 1]에서 나타난 바와 같이 박테리오파지 JBP901의 전체 유전체 서열은 전체 159,492 bp 길이의 서열번호 1의 염기서열과 같으며, 전체 GC 함유량이 39.7 mol%임을 확인하였고, 말단에는 22,000 내지 29,500 번째 뉴클레오티드 염기 사이에서 높은 수준의 기능적 유전 서열이 존재하며, 말단에는 불필요한 중복 서열이 존재하는 것을 확인하였다(도 1). 또한, 전체 ORF는 201 개이며, 이 중 172 개 ORF는 역방향 가닥이고 29 개 ORF는 정방향 가닥임을 확인하였으며, tRNA는 총 19 개 임을 분석하였다(도 1).As a result, as shown in Fig. 1 and the following Table 1, the entire genomic sequence of bacteriophage JBP901 was identical to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 with a total length of 159,492 bp, and the GC content was found to be 39.7 mol% There was a high level of functional genomic sequence between nucleotides 22,000 to 29,500 nucleotides and an unnecessary redundant sequence at the ends (Fig. 1). In addition, the total ORF was 201, and 172 ORFs were reverse-stranded, 29 ORFs were confirmed to be forward strand, and 19 tRNAs were analyzed (FIG. 1).
또한, 전체 ORF 중에서 공지된 박테리오파지인 BCP78, Bc431v3 및 Bcp1의 단백질과 높은 아미노산 상동성을 나타내는 단백질로서 41 개 단백질을 확인하였으며, 이들을 기능에 따라 분류하였을 때, 6 개의 기능군으로 분류할 수 있음을 확인하였다.In addition, 41 proteins were identified as proteins showing high amino acid homology with the proteins of BCP78, Bc431v3 and Bcp1, which are known bacteriophages in the whole ORFs. When these proteins are classified according to function, they can be classified into 6 functional groups Respectively.
명칭(해당ORF)Pseudobacteriophage
Name (corresponding ORF)
상동성(%)amino acid
Homology (%)
대사 및
전사 단백질Nucleotides
Metabolism and
Transcription protein
alpha subunitRibonucleoside-diphosphate reductase
alpha subunit
nucleotidohydrolaseDeoxyuridine 5'-triphosphate
nucleotidohydrolase
(AID17869) Gluconobacter morbifer
(AID17869)
단백질DNA replication
protein
(packaging)
단백질Virus packaging
(packaging)
protein
단백질Host solubility
protein
superfamily proteinMetallo-beta-lactamase
superfamily protein
생물학적 조절을 위하여 박테리오파지는 넓은 숙주 범위를 가지며, 특정 숙주균에 대한 정확한 용균 활성을 나타내고, 이외 숙주균에 대하여는 바이러스성 독성을 나타내거나 숙주의 병원성 활성을 증가시킬 수 있는 유전자가 결여되어 있는 것이 필수적으로 요구된다. 상기 [표 1]에서 나타난 단백질 기능군과 관련하여, 박테리오파지 JBP901은 인테그라제(integrase) 또는 독성과 관련된 단백질을 포함하지 않는 것을 확인하였다. 그러나, ORF061은 lactamase_B family에 대해 상보적인 도메인을 포함하는 metallo-beta-lactamase supfamily 단백질로서 예상하였으며, B. cereus(GeneBank taxon: 1396)의 금속 이온 의존적인 가수분해효소에 대하여는 낮은 아미노산 서열 상동성(약 27% 상동성 및 62%의 쿼리 커버리지)을 나타내는 것을 확인하였다.For biological control, it is essential that the bacteriophage has a broad host range, exhibits accurate lytic activity against a specific host bacterium, and lacks a gene that can induce viral toxicity or increase the virulence of the host . With respect to the protein functional groups shown in Table 1 above, it was confirmed that bacteriophage JBP901 does not contain integrase or toxicity related proteins. However, ORF061 was predicted to be a metallo-beta-lactamase supfamily protein containing a complementary domain to the lactamase B family, and a low amino acid sequence homology to the metal ion-dependent hydrolase of B. cereus (GeneBank taxon: 1396) About 27% homology and 62% query coverage).
박테리오파지 Bacteriophage JBP901의Of JBP901 계통발생적 분석 Phylogenetic analysis
JBP901의 형태학적 분석에 기초하였을 때, 박테리오파지 JBP901는 마이오비리다에 속의 SPO1-유사 군의 파지 군에 속할 것으로 판단하였으므로(비특허문헌 0001), 본 발명에서는 박테리오파지 JBP901의 유전체 서열을 통해 계통발생적 분석을 수행하였다.Based on the morphological analysis of JBP901, it was determined that the bacteriophage JBP901 belongs to the group of the SPO1-like group of myoblidas (Non-Patent Document 0001). In the present invention, the phylogenetic analysis of the bacteriophage JBP901 Respectively.
그 결과, 박테리오파지 JBP901의 유전체에는 SPO1-유사 파지의 대표적인 유전자(Gp29)인, dUMP 하이드록시메틸라아제(deoxyuridylate hydroxymethyltransferase) 유전자가 결여되어 있어, SOP1-유사 파지로서 알려져 있는 특징을 가지지 않음을 확인하였다. 또한, 상기 [표 1]에서 확인한 바와 같이 박테이로파지 JBP901의 ORF는 블라스트 분석(BLASTP)을 통해 Bcp1, Bc431v3, 및 BCP78 파지와 높은 점수의 hit 값을 얻을 수 있음을 확인하여(표 1), 이로부터 박테리오파지 JBP901은 SPO1-유사 파지 또는 Twort-유사 파지 군에 속하지 않는 것을 확인하였다.As a result, it was confirmed that the genome of the bacteriophage JBP901 lacks the dUMP hydroxymethyltransferase gene, which is a representative gene of SPO1-like phage (Gp29), and has no known characteristics as the SOP1-like phage . As shown in Table 1, the ORF of the bacillary phage JBP901 was confirmed to be capable of obtaining hit scores of Bcp1, Bc431v3, and BCP78 phage and high scores through blast analysis (BLASTP) (Table 1) , Confirming that bacteriophage JBP901 does not belong to the SPO1-like phage or the Twort-like phage group.
이와 마찬가지로, 도 2에서 나타난 바와 같이 Easyfig 소프트웨어를 이용하여 JBP901과 유사 미오비리마에 파지의 유전체 전장 서열을 비교하였을 때, Bcp1, BCP78, Bc431v3 및 JBP901 파지 간에 공유되는 신터니(synteny)를 확인한 반면(도 2a), SOP1-유사 파지 및 Twort-유사 파지에 대하여는 신터니가 나타나지 않음을 확인하였다(도 2b). 또한, 한계값 점수(threshold score)가 75 값인 BLASTP 분석을 이용한 CoreGene 분석을 통해, JBP901 파지는 Bc431v3, Bcp1 및 BCP78 파지와 각각 89.6%, 84.1% 및 67.2%의 단백질체(proteome) 유사도를 나타내는 반면, Twort 및 SPO1 파지에 대하여는 33.3% 및 29.9%으로 낮은 수준의 단백질체 유사도를 나타내는 것을 확인하였다.Likewise, when comparing the genomic sequence of the phage to the JBP901 and the similar mioviridae using the Easyfig software as shown in FIG. 2, the synteny shared between the Bcp1, BCP78, Bc431v3 and JBP901 phage was confirmed ( 2a), and no syncytia was observed for SOP1-like and Twort-like phage (FIG. 2b). In addition, CoreGene analysis using BLASTP analysis with a threshold score of 75 showed proteome similarity of 89.6%, 84.1% and 67.2%, respectively, to the Bc431v3, Bcp1 and BCP78 phage of JBP901 phage, , And 33.3% and 29.9% for Twort and SPO1 phage, respectively.
CoreGene 분석 수행 결과를 사용하여 쌍대비교(pairwise comparison) 분석을 수행하였을 때, 도 3에서 나타난 바와 같이 Bcp1, Bc431v3 및 JBP901 파지의 3개의 파지 모두에서 유사한 유전자는 163 개이며, 이 외에도 Bcp1 및 JBP901 파지는 9 개의 유전자가 유사하고 Bc431v3 및 BCP901 파지는 17 개의 유전자가 유사하며, Bc431v3 및 Bcp1 파지는 34개의 유전자가 유사하여 각각 공유될 수 있음을 확인하였다(도 3). 각각의 파지에서 특이적으로 나타나는 유전자는, Bcp1에서 23 개, Bc431v3에서 24 개, 및 JBP901에서 12 개의 유전자임을 확인하였다(도 3).When a pairwise comparison analysis was performed using the results of the CoreGene analysis, as shown in FIG. 3, 163 pieces of similar genes were found in all three phages of Bcp1, Bc431v3 and JBP901 phages. In addition, Bcp1 and JBP901 phage (Fig. 3), and that Bc431v3 and BCP901 phages are similar to 17 genes, while Bc431v3 and Bcp1 phage are similar to 34 genes, respectively (Fig. 3). The genes specifically expressed in each phage were found to be 23 in Bcp1, 24 in Bc431v3, and 12 in JBP901 (Fig. 3).
그럼에도 JBP901 단백질은 형태학적으로 SOP1-유사 파지의 형태를 나타내었는데, 이를 다시 확인하기 위해서 스파우나비리내(Spounavirinae) 파지로 분류되는 모든 ICTV를 포함하는 다른 파지들과 JBP901에서 주요 캡시드 단백질 또는 꼬리 형성 단백질(tail sheath protein)을 암호화하는 유전자를 비교하여 최대 가능성 가계도(maximum likelihood tree, ML)을 그려 계통분석하였다. 그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이 JBP901은 SOP1-유사 파지가 아님을 확인하였다(도 4). 이를 통해, 본 발명의 JBP901 파지는 미오비리대 과(family Myoviridae)의 스파우나비리내 아과(subfamily Spounavirinae)에 속하는 것을 확인하였다.Nevertheless, the JBP901 protein morphologically showed the shape of the SOP1-like phage. To confirm this, JBP901 and other phages, including all ICTV classified as Spounavirinae phages, and major capsid protein or tail The maximum likelihood tree (ML) was plotted by comparing the genes encoding the protein (tail sheath protein). As a result, it was confirmed that JBP901 was not an SOP1-like phage as shown in Fig. 4 (Fig. 4). Thus, it was confirmed that the JBP901 phage of the present invention belongs to the subfamily Spounavirinae of the family Myoviridae .
박테리오파지 Bacteriophage JBP901JBP901 유전 정보로부터 유용 유전자의 선별 Selection of useful genes from genetic information
박테리오파지가 암호화하고 있는 유전자는 다양한 방법으로 이용될 수 있다. 본 발명에서 확인한 JBP901 파지의 유전체 정보로부터 유용한 유전자를 선별하여 이를 이용하고자, 박테리오파지 JBP901에서 유용하게 사용할 수 있을 것으로 예상되는 유전자 부분을 선별하였다.The genes encoded by the bacteriophage can be used in a variety of ways. From the genomic information of the JBP901 phage identified in the present invention, useful genes were selected and gene fragments expected to be useful in bacteriophage JBP901 were selected.
<3-1> 박테리오파지 <3-1> Bacteriophage JBP901의Of JBP901 엔도리신Endorizine (( endolysinendolysin ) 단백질의 유해균 제어 효과 확인) Confirmation of control effect of protein on the harmful bacteria
박테리오파지 유래의 리신(lysin) 단백질의 용균 활성(lytic activity)을 이용하여 유해균의 제어에 이용할 수 있을 것으로 예상하였다. 이에, 본 발명에서 확인한 박테리오파지 JBP901의 유전체 서열에서 엔도리신 단백질 및 이를 암호화하는 유전자를 블라스트 분석(blast search)하여, BM15, BCP78, TsarBomba 및 vB_BceM-Bc431v3 파지 유래의 엔도리신 단백질 서열 및 이를 암호화하는 유전자 서열의 상동성 분석을 수행하였다.The lytic activity of lysin protein derived from bacteriophage was expected to be used for the control of harmful bacteria. Thus, the endorrhizin protein and its encoding gene were blast-detected in the genome sequence of the bacteriophage JBP901 identified in the present invention, and the endoribin protein sequence derived from BM15, BCP78, TsarBomba and vB_BceM-Bc431v3 phages and the gene encoding the same Sequence homology analysis was performed.
그 결과, 하기 [표 2] 도 5a에서 나타난 바와 같이 박테리오파지 JBP901의 엔도리신 유전자(서열번호 1, gp011)는 기존 공지된 박테리오파지 유래의 엔도리신 유전자와는 상이하나(표 2), 박테리오파지 JBP901의 엔도리신 단백질의 아미노산 서열은 M15, BCP78, TsarBomba 및 vB_BceM-Bc431v3 파지 유래의 엔도리신 단백질의 아미노산 서열과 높은 수준의 상동성을 나타내어, 본 발명의 박테리오파지 JBP901의 엔도리신 단백질 또한 유의적인 용균 활성을 나타낼 것으로 예상하였다.As a result, as shown in Fig. 5A, endorrhizin genes (SEQ ID NO: 1 and gp011) of bacteriophage JBP901 are different from endorricein genes derived from known bacteriophage (Table 2) The amino acid sequence of the lysine protein showed high homology with the amino acid sequence of the endorrhizin protein from the M15, BCP78, TsarBomba and vB_BceM-Bc431v3 phage, and the endorhysin protein of the bacteriophage JBP901 of the present invention also exhibited significant lytic activity .
(corverage)Coverage
(corverage)
25 proteinhydrolase family
25
<3-2> 박테리오파지 <3-2> Bacteriophage JBP901의Of JBP901 엔도리신의Endoricin CBD( CBD ( endolysinendolysin cell wall binding domain) 및 꼬리 섬유 단백질(tail fiber protein)의 숙주 세포에 대한 특이적 cell wall binding domain and tail fiber protein specific for host cells 결합능Cohesion 확인 Confirm
엔도리신 유전자의 C-말단에 주로 존재하는 것으로 알려진 세포벽 결합 도메인(cell wall binding domain, CBD) 또는 꼬리 섬유 단백질 등은 특정 숙주세포에 특이적으로 결합할 수 있다. 이에, 본 발명에서 확인한 박테리오파지 JBP901의 유전체 서열에서 엔도리신의 CBD 및 꼬리 섬유 단백질을 암호화하는 유전자 및 단백질 서열을 블라스트 분석(blast search)하여, BM15, BCP78, TsarBomba 및 vB_BceM-Bc431v3 파지 유래의 엔도리신의 CBD 및 꼬리 섬유 단백질을 암호화하는 유전자 및 단백질 서열과의 상동성을 확인하였다.The cell wall binding domain (CBD) or the tail fiber protein, which is known to be mainly present at the C-terminus of the endorrhizin gene, can specifically bind to a specific host cell. Thus, in the genome sequence of the bacteriophage JBP901 identified in the present invention, the gene and the protein sequence encoding the CBD and the tail fiber protein of endorrisin were subjected to blast search to obtain endolysin from BM15, BCP78, TsarBomba and vB_BceM-Bc431v3 phage And the homology of the gene coding for CBD and the tail fiber protein and the protein sequence was confirmed.
그 결과, 상기 [표 2], 하기 [표 3] 및 도 5b에서 나타난 바와 같이 다양한 박테리오파지들에서 JBP901 엔도리신의 CBD(표 2) 및 꼬리 섬유 단백질의 암호화 유전자와 유사한 유전자들이 발견되었으나(표 3), 아미노산 서열 배열 분석을 통해 JBP901 엔도리신의 CBD 및 꼬리 섬유 단백질 및 이를 암호화하는 유전자는 BM15, BCP78, TsarBomba 및 vB_BceM-Bc431v3 파지 엔도리신의 CBD 및 유래의 꼬리 섬유 단백질 및 이를 암호화하는 유전자와 서로 다른 염기서열 및 아미노산 서열을 보유하고 있음을 확인하였다(표 3 및 도 5b).As a result, genes similar to those encoding JBP901 endorysin CBD (Table 2) and the tail fiber protein were found in various bacteriophages as shown in [Table 2], [Table 3] and [ ). Through analysis of the amino acid sequence, the CBD and the tail fiber proteins of JBP901 endorrhizin and the genes encoding the CBD and the endo lysine were encoded by the CBD and the derived tail fiber proteins of BM15, BCP78, TsarBomba and vB_BceM-Bc431v3 phage endrhizine, (Table 3 and Fig. 5b). ≪ tb > < TABLE >
(corverage)Coverage
(corverage)
<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY <120> Bacteriophage JBP901 belonging to subfamily Spounavirinae of family Myoviridae and its use <130> 1060872 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 819 <212> DNA <213> Bacteriophage JBP901 <400> 1 atgggaacat ataacgtaca cggtggtcac aacagtattg tgcaaggagc taactacgga 60 aaccgaaaag agcacgttat ggatcgtcaa gtgaaggacg ctctaatcag taagctacgt 120 agtcttggtc acacagtata cgactgcaca gatgagacag gttctacaca gtctgctaac 180 ttacgtaaca tcgtagctaa atgtaacgct cataacgtag acttagacat ctcattacac 240 ttaaacgcat tcaacggatc ggctaatggt gttgaggttt gctactacga ccaacaagct 300 ctagctgcta aagtgtctaa gcaattgtct gacgacatcg gatggtctaa ccgtggagct 360 aaacctcgta cagaccttta cgttctaaac aacacaagag cacctgctat cttaatcgaa 420 ttaggattca tcgacaacga tagcgacatg gctaagtgga acgtagataa aatcgcagac 480 gctatctgct acgctatcac aggtcaacgt gcaggggcta ctggcggaag cactgggggg 540 tctacaggtg gaagcactgg cggaggtgga tacgactcta gttggttcac accacaaaac 600 ggtgtattca cagctaacac 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agtggtgtgt agtcaaaatc 2040 ttccac 2046 <210> 4 <211> 272 <212> PRT <213> Bacteriophage JBP901 <400> 4 Met Gly Thr Tyr Asn Val His Gly Gly His Asn Ser Ile Val Gln Gly 1 5 10 15 Ala Asn Tyr Gly Asn Arg Lys Glu His Val Met Asp Arg Gln Val Lys 20 25 30 Asp Ala Leu Ile Ser Lys Leu Arg Ser Leu Gly His Thr Val Tyr Asp 35 40 45 Cys Thr Asp Glu Thr Gly Ser Thr Gln Ser Ala Asn Leu Arg Asn Ile 50 55 60 Val Ala Lys Cys Asn Ala His Asn Val Asp Leu Asp Ile Ser Leu His 65 70 75 80 Leu Asn Ala Phe Asn Gly Ser Ala Asn Gly Val Glu Val Cys Tyr Tyr 85 90 95 Asp Gln Gln Ala Leu Ala Ala Lys Val Ser Lys Gln Leu Ser Asp Asp 100 105 110 Ile Gly Trp Ser Asn Arg Gly Ala Lys Pro Arg Thr Asp Leu Tyr Val 115 120 125 Leu Asn Asn Thr Arg Ala Pro Ala Ile Leu Ile Glu Leu Gly Phe Ile 130 135 140 Asp Asn Asp Ser Asp Met Ala Lys Trp Asn Val Asp Lys Ile Ala Asp 145 150 155 160 Ala Ile Cys Tyr Ala Ile Thr Gly Gln Arg Ala Gly Ala Thr Gly Gly 165 170 175 Ser Thr Gly Gly Ser Thr Gly Gly Ser Thr Gly Gly Gly Gly Tyr Asp 180 185 190 Ser Ser Trp Phe Thr Pro Gln Asn Gly Val Phe Thr Ala Asn Thr Thr 195 200 205 Ile Lys Val Arg Ser Glu Pro Ser Val Asn Ala Thr His Leu Arg Thr 210 215 220 Leu Tyr Ser Gly Gly Thr Phe Lys Tyr Thr Ser Phe Gly Ile Glu Lys 225 230 235 240 Glu Gly Tyr Val Trp Ile Lys Gly Val Asp Gly Thr Tyr Val Ala Thr 245 250 255 Gly Glu Thr Arg Asp Gly Lys Arg Ile Ser Tyr Trp Gly Thr Phe Gln 260 265 270 <210> 5 <211> 72 <212> PRT <213> Bacteriophage JBP901 <400> 5 Gly Val Phe Thr Ala Asn Thr Thr Ile Lys Val Arg Ser Glu Pro Ser 1 5 10 15 Val Asn Ala Thr His Leu Arg Thr Leu Tyr Ser Gly Gly Thr Phe Lys 20 25 30 Tyr Thr Ser Phe Gly Ile Glu Lys Glu Gly Tyr Val Trp Ile Lys Gly 35 40 45 Val Asp Gly Thr Tyr Val Ala Thr Gly Glu Thr Arg Asp Gly Lys Arg 50 55 60 Ile Ser Tyr Trp Gly Thr Phe Gln 65 70 <210> 6 <211> 681 <212> PRT <213> Bacteriophage JBP901 <400> 6 Met Glu Asp Phe Asp Tyr Thr Pro Leu Ser Ser Met Arg Phe Gln Ala 1 5 10 15 Gln Leu Gly Ser Glu Val Lys Arg Met Tyr Lys Glu Gly Glu Ser Val 20 25 30 Val Arg Leu Ser Leu Ala Arg Val Thr Lys Val Asn Tyr Lys Tyr Asn 35 40 45 Thr Val Glu Val Met Thr Thr Leu His Lys Asn Ser Thr Ser Lys Asn 50 55 60 Pro Ser Asp Asn Gly Arg Tyr Ser Ala Arg Leu Pro Val Val Phe Gly 65 70 75 80 Gly Arg Thr Pro Gln Gly Lys Val Tyr Gly Ser Asn Thr Ile Val Thr 85 90 95 Ile Gly Ser Leu Val Leu Ile Gly Phe Leu Glu Gly Asn Lys Asp His 100 105 110 Pro Ile Val Leu Asn Ile Tyr Gly Asp Ala Asp Asn Gln Ser Met Leu 115 120 125 Thr Arg Thr Thr Met Thr Gly Gly Asp Glu Ser Asp Glu Ala Val Gln 130 135 140 Arg Glu Leu Trp Gln Leu Phe Thr Leu Tyr Pro Ser Met Thr Tyr Gln 145 150 155 160 Asn Ile Asp Gly Arg Gly Asn Lys Glu Val Thr Phe Ser Gly Lys Ser 165 170 175 Phe Met Tyr Ile Thr Asp Thr Asp Pro Gly Asn Glu Tyr Val Gln Asp 180 185 190 Gly Ala Phe Asp Tyr Ala Asp Leu Pro Ser Ser Arg Tyr Ala Asn Gly 195 200 205 Glu Leu Ile Glu Pro Ile Ser Pro Asn Ser Pro Thr Val Leu Tyr Val 210 215 220 His Gln Gly Ile Tyr Asp Asn His Arg Val Thr Phe Phe Leu Lys Ser 225 230 235 240 Asp Gly Thr Leu Arg Val Gly Ser Arg His Arg Asn Gly Lys Gly Ile 245 250 255 Thr Tyr Gln Glu Met Lys Thr Asp Gly Ser Phe Ser Ile Val Gln Lys 260 265 270 Gln Asp Thr Thr Asn Pro Glu Glu Ile Ser Lys Lys Phe Ser Lys Phe 275 280 285 Glu Ile Ser Glu Asn Gly Asp Val Thr Ile Gln Ser Pro Asp His Lys 290 295 300 Leu Thr Ile Thr Lys Asp Gly Val Leu Ile Asp Gly Lys Pro Ile Gly 305 310 315 320 Ser Gly Gly Gly Gly Gly Asp Leu Glu Ile Ile Lys Asp Leu Gln Glu 325 330 335 Gln Val Lys Asn Val Thr Thr Gln Val Thr Met Val Asn Gly Lys Leu 340 345 350 Asp Phe Lys Ile Asp Lys Val Glu Ile Glu Ile Asp Leu Asp Thr Leu 355 360 365 Arg Gln Glu Gln Gln Lys Val Leu Asp Ala Ile Arg Ala Gln Leu Asp 370 375 380 Ser Leu Ser Ser Ala Leu Lys Ala Met Lys Asp Tyr Thr Leu Pro Ala 385 390 395 400 Phe Glu Asp Gly Thr Val Thr Ala Asp Glu Lys Lys Lys Val Asn Glu 405 410 415 Leu Leu Thr Ala Val Gly Arg Glu Lys Ala Lys Val Asp Glu Lys Tyr 420 425 430 Ser Gln Thr Ile Ser Asp Pro Phe Leu Pro Ala Thr His Lys Asp Leu 435 440 445 Leu Thr Val Ser Lys Gly Val Leu Asp Ser Arg His Gln Ala Leu Leu 450 455 460 Asn Thr Ile Glu Ile Val Met Leu Asp Gly Val Ile Thr Pro Asp Glu 465 470 475 480 Arg Ile Ala Val Ala Gln Ala Phe Asp Gly Tyr Glu Gln Ala Ile Ala 485 490 495 Ala Leu Asp Val Ser Phe Lys Gln Ala Met Asp Ala Ile Leu Glu Ala 500 505 510 Arg Ile Lys Glu Ala Gln Glu Asn Ala Met Lys Tyr Arg Asp Thr Glu 515 520 525 Met Arg Lys Ile Gly Ser Gln Ile Thr Gln Leu Ala Asp Ser Ile Thr 530 535 540 Ala Lys Val Ser Ser Glu Gln Leu Ser Lys Gln Ile Glu Glu Val Arg 545 550 555 560 Ser Glu Met Ala Thr Lys Glu Glu Gln Lys Glu Ile Lys Asp Thr Ala 565 570 575 Glu Lys Ala Gln Lys Asp Ala Glu Glu Ala Leu Lys Lys Val Pro His 580 585 590 Arg Ile Met Val Gly Ser Thr Asn Gly Leu Ile Phe Arg Asn Gly Glu 595 600 605 Ile Asp Ser Ile Leu Tyr Ala Lys Val Tyr Lys Gly Asp Asp Glu Val 610 615 620 Thr Ser Thr Ile Pro Thr Ala Asn Phe Phe Trp Ser Arg Ile Ser Asp 625 630 635 640 Asp Glu Ser Gly Asp Leu Gln Trp Asn Lys Asp His Val Gly Val Gly 645 650 655 Ser Ser Phe Lys Ile Ser Lys Asp Asp Val Pro Gln Arg Ala Thr Phe 660 665 670 Glu Cys Asp Val Glu Val Pro Ser Ser 675 680 <110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY <120> Bacteriophage JBP901 belonging to subfamily Spounavirinae of family Myoviridae and its use <130> 1060872 <160> 6 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 819 <212> DNA <213> Bacteriophage JBP901 <400> 1 atgggaacat ataacgtaca cggtggtcac aacagtattg tgcaaggagc taactacgga 60 aaccgaaaag agcacgttat ggatcgtcaa gtgaaggacg ctctaatcag taagctacgt 120 agtcttggtc acacagtata cgactgcaca gatgagacagta gttctacaca gtctgctaac 180 ttacgtaaca tcgtagctaa atgtaacgct cataacgtag acttagacat ctcattacac 240 ttaaacgcat tcaacggatc ggctaatggt gttgaggttt gctactacga ccaacaagct 300 ctagctgcta aagtgtctaa gcaattgtct gacgacatcg gatggtctaa ccgtggagct 360 aaacctcgta cagaccttta cgttctaaac aacacaagag cacctgctat cttaatcgaa 420 ttaggattca tcgacaacga tagcgacatg gctaagtgga acgtagataa aatcgcagac 480 gctatctgct acgctatcac aggtcaacgt gcaggggcta ctggcggaag cactgggggg 540 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gtactaccga ccatgatacg atgaggtacc ttcttcaagg cttcttctgc 300 atccttttgt gctttctcgg cagtgtcctt gatttctttc tgttcttctt ttgtagccat 360 ttcagaacga acctcttcta tttgtttcga tagttgttct gaactaactt ttgccgtgat 420 agagtctgct agttgcgtaa tctgtgaacc gattttacgc atctctgtat ctctatattt 480 catagcattc tcttgtgctt ctttaatacg ggcttcaagg attgcgtcca ttgcctgttt 540 aaaggatacg tctaaagcag cgatagcttg ctcataccca tcgaatgcct gtgctactgc 600 tatacgttcg tcaggagtga taactccgtc taacataacg atttctattg tgttcagtaa 660 cgcttgatgt ctactgtcta gtacaccctt cgatactgtt aataaatctt tgtgtgtggc 720 tggtaggaac ggatcggaga tagtttggct gtacttctcg tctacctttg ctttctctct 780 tcctacggca gttagaagct cgttaacttt cttcttttca tctgccgtaa ccgtaccatc 840 ctcaaatgca ggtaacgtat agtccttcat agctttcagt gcgctagata aactgtccag 900 ttgtgctcgg atagcatcta atactttttg ttgctcctgt cgaagcgtat ccaagtctat 960 ctctatctca actttatcaa tcttgaaatc tagcttaccg ttaaccattg ttacttgcgt 1020 agttacgttc tttacttgtt cttgtaagtc cttgataatc tcaaggtctc ctcctccacc 1080 acctgaaccg attggtttac cgtcaatcag aacaccatct tttgtgatag ttaatttgtg 1140 gtcaggggac tggattgtaa catcaccatt ttcagaaatt tcaaacttag agaacttttt 1200 agaaatctct tcagggttcg tagtatcctg cttctgcacg atagagaacg atccgtctgt 1260 tttcatttct tggtatgtaa tccctttacc atttctatgt ctgctaccta cacgtaacgt 1320 tccgtccgat ttaaggaaga aggtaactct atgattgtca tagatacctt ggtggacgta 1380 taatactgta ggagagttcg gagatatagg ttcgattagt tctccatttg cataacgaga 1440 actcggtaaa tctgcgtagt cgaaagctcc gtcctgcacg tattcattcc cagggtcagt 1500 gtctgtaata tacataaatg atttacctga gaaagttact tccttatttc ctcgaccatc 1560 aatattctga tatgtcatag aagggtataa agtgaataac tgccatagct cacgttggac 1620 tgcttcgtct gattcgtctc cacctgtcat cgttgtacgt gttaacattg attggttgtc 1680 tgcatcaccg tagatgttta aaacaatagg gtggtcttta ttaccttcta agaatccgat 1740 taacactaac gatccgattg taacgattgt gttagaaccg tatactttac cttgcggagt 1800 acgtccaccg aatacaactg gtagtctagc agagtatcgt ccgttgtcac ttggattctt 1860 tgatgttgag tttttatgta gtgttgtcat aacttccact gtattgtact tatagttaac 1920 ctttgtaacc ctagcaaggg agagcctaac aacactctct ccctccttgt acatacgttt 1980 aacttctgat cctagttgag cctgaaacct catagaggac agtggtgtgt agtcaaaatc 2040 ttccac 2046 <210> 4 <211> 272 <212> PRT <213> Bacteriophage JBP901 <400> 4 Met Gly Thr Tyr Asn Val His Gly Gly His Asn Ser Ile Val Gln Gly 1 5 10 15 Ala Asn Tyr Gly Asn Arg Lys Glu His Val Met Asp Arg Gln Val Lys 20 25 30 Asp Ala Leu Ile Ser Lys Leu Arg Ser Leu Gly His Thr Val Tyr Asp 35 40 45 Cys Thr Asp Glu Thr Gly Ser Thr Gln Ser Ala Asn Leu Arg Asn Ile 50 55 60 Val Ala Lys Cys Asn Ala His As Val Asp Leu Asp Ile Ser Leu His 65 70 75 80 Leu Asn Ala Phe Asn Gly Ser Ala Asn Gly Val Glu Val Cys Tyr Tyr 85 90 95 Asp Gln Gln Ala Leu Ala Ala Lys Val Ser Lys Gln Leu Ser Asp Asp 100 105 110 Ile Gly Trp Ser Asn Arg Gly Ala Lys Pro Arg Thr Asp Leu Tyr Val 115 120 125 Leu Asn Asn Thr Arg Ala Pro Ala Ile Leu Ile Glu Leu Gly Phe Ile 130 135 140 Asp Asn Asp Ser Asp Met Ala Lys Trp Asn Val Asp Lys Ile Ala Asp 145 150 155 160 Ala Ile Cys Tyr Ala Ile Thr Gly Gln Arg Ala Gly Ala Thr 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Gly Asp Leu Gln Trp Asn Lys Asp His Val Gly Val Gly 645 650 655 Ser Ser Phe Lys Ile Ser Lys Asp Asp Val Pro Gln Arg Ala Thr Phe 660 665 670 Glu Cys Asp Val Glu Val Pro Ser Ser 675 680
Claims (9)
Bacteriophage JBP901 belonging to the subfamily Spounavirinae of the family Myoviridae .
The bacteriophage JBP901 according to claim 1, wherein the bacteriophage JBP901 comprises the genetic sequence of a gene bank accession number KJ676859 as an entire length.
3. The bacteriophage JBP901 according to claim 2, wherein said genomic sequence comprises the nucleotides of SEQ ID NOS: 1-3.
An endolysin protein having the ability to control harmful bacteria and consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
An antimicrobial composition comprising the endoribine protein of claim 4 as an active ingredient.
An endolysin cell wall binding domain (endolysin CBD) of endolysin, which has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and has a specific binding activity to host cells.
A tail fiber protein having a specific binding ability to a host cell and consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
ii) 상기 단계 i)에서 첨가한 엔도리신 CBD 또는 꼬리 섬유 단백질과 결합하는 유해균의 농도를 확인하는 단계;를 포함하는, 유해균의 신속 검출 방법.
i) adding the endoribin CBD of claim 6 or the tail fiber protein of claim 7 to a suspect infection sample; And
ii) confirming the concentration of the endophytic bacteria which binds to the endorhysin CBD or the tail fiber protein added in the step i).
Any one of the endoribin CBD of claim 6 or the tail fiber protein of claim 7; And antibiotics for the destruction of harmful bacteria.
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2016
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E601 | Decision to refuse application |