KR20180000991A - Manufacturing method of patient specific Patient-Derived Cell and Uses thereof - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to a method for producing patient-specific patient-derived cells (PDCs), exhibiting anticancer resistance, genetic features, and histological features in a cancer patient. The present invention further relates to a method for screening a patient-customized anticancer agent using the same. According to the production method of the present invention, acquisition of PDCs effectively exhibiting anticancer resistance, genetic features, and histological features in the cancer patient is possible in a remarkably reduced amount of time compared to a model based on heterograft of patient-derived cancer tissues. Accordingly, the method of the present invention can be useful for developing preclinical models and screening patient-customized anticancer agents using the same.

Description

환자특이적 환자 유래 세포의 제조방법 및 이의 이용{Manufacturing method of patient specific Patient-Derived Cell and Uses thereof} [0001] The present invention relates to a method for producing a patient-specific patient-derived cell,

본 발명은 암 환자의 조직학적 특징, 유전학적 특징, 항암제 내성을 반영하는 환자 특이적 환자 유래 세포의 제조방법 및 이를 이용한 환자 맞춤형 항암제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a method for producing a patient-specific patient-derived cell that reflects a histological characteristic, a genetic characteristic, an anticancer drug resistance, and a method for screening a patient-customized anticancer drug using the same.

항암 치료 전략은 암 관련 병태 생리의 이해에 근거한 새로운 치료제의 지속적인 개발 덕택에 점차 개선되고 있다. 후보 항암제의 효능을 평가하는 임상 시험은 대규모 환자군을 요구하기 때문에 비용과 시간이 많이 소요되며, 일부 환자는 시험 과정에서 약물로 인한 불필요한 위험성에 노출되게 된다. 약물 개발 과정에서 새로운 치료제의 임상 시험 진입 여부를 결정하는 전임상 평가(preclinical test)는 성공 가능성이 높은 치료제를 선정하기 위해 중요한 과정으로서, 이 때 이용되어야 하는 이상적인 모델은 보다 정확한 치료 반응 예측도, 선행된 표적 분자 경로 (molecular pathway)의 이해, 실제 임상 환자를 대변할 수 있는 조직학적, 분자적, 암 주위 미세환경의 보존, 그리고 약동학적 또는 약력학적 분석의 용이성 등 여러 조건을 만족해야 한다. Chemotherapy strategies are gradually being improved because of the continued development of new therapies based on understanding cancer-related pathophysiology. Clinical trials evaluating the efficacy of candidate anticancer drugs are costly and time consuming because they require large patient populations, and some patients are exposed to unnecessary risks from drugs during testing. Preclinical testing, which determines whether a new drug enters clinical trials in the course of drug development, is an important step in selecting a drug that is likely to be successful. The ideal model to be used at this time is a more accurate prediction of response, The understanding of the molecular pathway involved, the preservation of the histologic, molecular, perinatal microenvironment that can represent the actual patient, and the ease of pharmacokinetic or pharmacodynamic analysis.

그러나 새로운 항암제의 구상부터 승인까지 약 80~100억 달러의 고비용과 약 10년이라는 장기간이 소요되지만 기존의 전임상 모델에서 탁월한 항암 효과를 보여 임상 시험까지 진입한 치료제의 약 90%가 실제 환자에서 유의한 암진행의 억제 및 생존 연장을 유도하지 못하는 한계는, 기존에 사용되는 전임상 검증 시스템에 표적 치료제 개발 시대에 적합한 대안적인 모델이 필요함을 시사한다. However, it takes about 10 to 10 years for a new anticancer drug to cost approx. $ 10 to $ 10 billion, but it has excellent anticancer effect in the preclinical model. Approximately 90% The limitation of inhibiting the progression of cancer and prolonging survival suggests that an alternative model suitable for the target drug development era is needed for the preclinical verification system used.

실제 환자 암의 생물학적 특성과 임상 경과를 최대한 가깝게 재현할 수 있는 전임상 이종 이식 모델은 임상 시험에서의 항암 효과를 정확하게 예견하는 데 필수적으로 요구된다. 기존 모델의 낮은 예측성은 인간 암세포주(cancer cell lines)에 기반을 두고 있기 때문인데, 세포주는 in vitro 배양 조건에서 장기간의 선택 압력(selection pressure)을 거치면서 실제 암환자에서 유래한 조직에 비해 동질적이고(homogeneous) 미분화되어 있다. Preclinical xenotransplantation models that can reproduce the biological characteristics and clinical course of actual patient cancer as closely as possible are essential for accurately anticancer effects in clinical trials. The low predictability of existing models is based on human cancer cell lines, which undergo long-term selection pressures in in vitro culture conditions and are more homogeneous than those derived from actual cancer patients Homogeneous and undifferentiated.

기존 보고된 방식의 낮은 예측성 등의 문제점을 해결하기 위한 대안으로, 환자 유래 암조직 이종 이식 모델이 제시되었으나 이는 이식된 암조직의 생착을 위하여, 일반적으로 약 2~4 개월, 바람직하게는 최소 6개월 경과 후에 이식 성공 여부를 판단할 수 있는 등의 한계점이 지적되었다. A patient-derived cancer tissue xenograft model has been proposed as an alternative to solve problems such as low predictability of the previously reported method, but it is generally about 2-4 months, preferably at least And the ability to judge the success of transplantation after 6 months.

최근 항암제 개발 분야에서, 다종의 세포를 광범위하게 공격하는 광범위 항암제의 문제점을 해결하기 위하여 표적화된 항암 치료제에 대한 연구가 진행되고 있다. 나아가, 항암제가 모든 암환자에게 동일한 치료 효과를 가져오지 못하는 문제점을 해결하기 위하여 환자 맞춤형의 항암제를 선별하여 처방하기 위한 연구가 주목받고 있다. In recent years, in the field of development of anticancer drugs, targeted chemotherapeutic agents have been studied in order to solve the problems of broad-spectrum anticancer agents that attack a wide variety of cells. Furthermore, studies have been focused on the selective treatment of patient-specific anticancer drugs in order to solve the problem that the anticancer drugs do not bring the same therapeutic effect to all cancer patients.

그러나 앞서 확인한 바와 같이, 기존의 모델은 낮은 예측성, 장기간의 모델 확립 시간 소요 등의 문제점이 보고되어 있는 바, 환자 맞춤형 항암제를 제공하기 위한 모델에 대한 필요성이 있다.  However, as previously noted, existing models have reported problems such as low predictability and long-term model establishment time requirements, and there is a need for a model to provide a patient-tailored anticancer drug.

본 발명자들은 암 환자의 삼출액으로부터 분리된 환자 유래 세포의 특징과 부모 일차 종양 세포와의 관련성을 연구하던 중, 환자 특이적 환자 유래 세포가 일차 종양 세포의 조직학적, 유전학적, 항암제 내성 등의 특징을 높은 관련도로 반영할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다. The present inventors studied the characteristics of patient-derived cells isolated from the exudates of cancer patients and their relationship with the parental primary tumor cells, and found that the patient-specific patient-derived cells exhibited the histological, genetic and anticancer drug resistance characteristics Can be reflected to a high degree of relevance, thus completing the present invention.

따라서 본 발명은 환자 특이적 환자 유래 세포의 제조방법 및 이를 이용한 환자 맞춤형 항암제의 스크리닝 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method for producing a patient-specific patient-derived cell and a screening method for a patient-customized anticancer agent using the same.

상기 목적을 제공하기 위하여, 본 발명은 1) 암 환자로부터 삼출액을 얻는 단계; 2) 상기 삼출액을 500 내지 2000rpm으로 원심분리하는 단계; 3) 원심분리된 세포를 배지에서 재부유시키고 암세포를 분리하는 단계; 및 4) 분리된 암세포를 1 내지 10 계대(passage) 배양하는 단계; 를 포함하는 환자 특이적 환자 유래 세포(Patient-Derived Cell) 의 제조방법을 제공한다. In order to provide the above object, the present invention provides a method for treating cancer, comprising the steps of: 1) obtaining an effusion from a cancer patient; 2) centrifuging the effluent at 500 to 2000 rpm; 3) resuspending the centrifuged cells in the medium and isolating the cancer cells; And 4) culturing the isolated cancer cells 1 to 10 passages; (Patient-Derived Cell) comprising the same.

또한 본 발명은 1) 상기 제조방법을 통해 제조된 환자 유래 세포(PDC)에 후보 항암제를 처리하는 단계; 및 2) 환자 유래 세포에서 항암제 처리에 따른 항암 효과를 확인하는 단계; 를 포함하는 환자 맞춤형 항암제의 스크리닝 방법을 제공한다. The present invention also provides a method for treating cancer, comprising the steps of: 1) treating a patient-derived cell (PDC) prepared by the above-described method with a candidate anticancer agent; And 2) confirming the anticancer effect according to the anticancer treatment in the patient-derived cells; The present invention provides a screening method of a patient-customized anticancer agent.

또한 본 발명은 상기 제조방법을 통해 제조된 환자 유래 세포(PDC)를 포함하는 환자 맞춤형 항암제 스크리닝용 키트를 제공한다. The present invention also provides a kit for screening a patient-customized anticancer agent comprising the patient-derived cells (PDC) produced through the above-described production method.

또한 본 발명은 상기 제조방법을 통해 제조된 환자 유래 세포(PDC)의 변이를 분석하는 단계; 를 포함하며, 상기 변이는 유전체 단위 반복 변이(copy number variations, CNV), 점 돌연변이, 인트론성 변이, 미스센스 돌연변이, 프레임쉬프트(frame shift) 돌연변이, 단일염기변이 및 InDel 변이로 이루어진 군에서 선택된 1종이상인, 암 환자의 세포 변이에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. The present invention also relates to a method for preparing a cell line, comprising the steps of: analyzing a mutation of a patient-derived cell (PDC) Wherein the mutation is selected from the group consisting of genomic unit variation variations (CNV), point mutations, intronic mutations, mismatch mutations, frame shift mutations, single base mutations and InDel mutations. A paper trader, and a cancer patient.

본 발명의 제조방법에 따르면 암 환자의 조직학적, 유전학적 특징 및 항암제 내성을 효과적으로 반영할 수 있는 환자 유래 세포(PDC)를 환자 유래 암조직 이종이식 기반 모델과 비교하여 현저하게 단축된 시간을 통해 얻을 수 있으므로, 전임상 모델 구축, 이를 통한 환자 맞춤형 항암제 스크리닝에 유용하게 이용할 수 있다. According to the manufacturing method of the present invention, the patient-derived cells (PDC) capable of effectively reflecting the histological, genetic characteristics and anticancer drug resistance of the cancer patient are compared with the patient-derived cancer tissue xenograft-based model, Therefore, it can be used for the construction of the preclinical model and the screening of the patient-customized anticancer drug therewith.

도 1은 환자 유래 세포(PDC) 모델의 구축을 위한 단계를 나타낸 것이다.
도 2는 환자 유래 세포(PDC) 집단의 돌연변이 분석을 Ion Ampliseq (적색) 및 nCounter Copy number variation assay (청색) 로 나타낸 도이다.
((A): 위암, (B): 대장암, (C): 간암 (D): 췌장암 및 담도암 (E): 사카로마(육종), (F): 그 외 암, (G): 동시다발 원발암)
도 3의 (A) 는 일차 종양 및 환자 유래 세포 (PDC) 에서 확인된 유전적 변화(genomic alterations) 변이체를 벤다이어그램으로 나타낸 도이다.
도 3의 (B)는 일차 종양 및 환자 유래 세포(PDC) 사이의 변이체 대립 유전자 빈도 연관도(VAF)를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4의 (A)는 환자 유래 세포(PDC) 모델 및 일차 종양의 면역조직학적 분석 및 조직 단편을 현미경으로 확인한 결과를 나타낸 도이다 (40x).
도 4의 (B) 는 계대 수에 따른 환자 유래 세포(PDC)의 조직 및 종양 크기를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4의 (C) 는 P0 내지 P2 및 PDX 의 paired 비교 결과를 나타낸 도이다. 좌측 하단은 두개 시료에 대한 대립 유전자 빈도의 dot plot을 나타낸다. 대각선은 4개 시료의 대립 유전자 히스토그램을 나타낸다. 우측 상단은 변이체의 intersection 수와 대립 유전자 빈도 연관을 나타낸다.
도 4의 (D)는 4개 시료 유래의 유전자의 intersection 및 확인된 변이체의 벤다이어그램을 나타낸 도이다.
도 4의 (E) 는 P0, P1, 및 P2 내 BRAF (적색) 및 PDGFA (청색) 대립 유전자 빈도를 나타낸 도이다.
도 5는 복수 위암 집단 PDC 의 유전자 발현 결과를 나타낸 도이다.
도 5의 (A)는 3개 다른 데이터 셋트 통합에 대한 유전자 발현 분석 흐름을 나타낸 도이다.
도 5의 (B)는 TCGA GC 시료와 ACRG, PDC GC, 및 환자 유래 세포(PDC) 외(위 암 제외 시료) 시료의 모든-쌍 시료 연관도를 나타낸 도이다.
도 5의 (C)는 주성분 분석(principal component analysis)을 이용한 3개 데이터 셋트 시료의 이차원적 플롯을 나타낸 도이다. 시료는 TCGA GC, TCGA 정상, ACRG, PDC GC 및 PDC 외를 나타낸다.
도 5의 (D)는 메타 분석 이후 유전자 발현(485 개 유전자 및 716 시료) 의 시료 계층화된 클러스팅을 나타낸 도이다 (청색: 풍부한 정상 시료 클러스터, 적색: 풍부한 종양 시료 클러스터).
도 5의 (E) 는 MET 및 ERBB2 발암 유전자의 다른 발현의 케이스 분석을 나타낸 도이다. 바 플롯은 5개 다른 군에서의 이들 유전자의 발현 수준을 나타낸다(적색: 정상 시료 및 종양 시료의 비교, 흑색: 종양 시료들 간의 비교). Figure 1 shows the steps for constructing a patient derived cell (PDC) model.
FIG. 2 is a diagram showing the mutation analysis of a patient-derived cell (PDC) population by Ion Ampliseq (red) and nCounter Copy number variation assay (blue).
(A): stomach cancer (B): colorectal cancer (C): liver cancer (D): pancreatic cancer and bile duct cancer Multiple cancer carcinogen)
Figure 3 (A) is a Venn diagram showing genomic alterations mutants identified in primary tumor and patient derived cells (PDC).
FIG. 3 (B) shows the result of confirming the mutant allele frequency correlation (VAF) between the primary tumor and the patient-derived cells (PDC).
4 (A) is a diagram showing the patient-derived cell (PDC) model and immunohistological analysis of the primary tumor and microscopic examination of tissue fragments (40x).
FIG. 4 (B) is a diagram showing the results of confirming the tissue and tumor size of patient-derived cells (PDC) according to the number of passages.
4C is a diagram showing the results of paired comparison of P0 to P2 and PDX. The bottom left shows a dot plot of the allele frequency for the two samples. The diagonal lines show allele histograms of four samples. The upper right part shows the number of intersection of mutant and allele frequency.
FIG. 4D is a diagram showing the intersection of the genes derived from the four samples and the Venn diagram of the identified mutants.
Figure 4 (E) shows the frequency of BRAF (red) and PDGFA (blue) alleles in P0, P1, and P2.
5 is a graph showing gene expression results of a multiple gastric cancer population PDC.
Figure 5 (A) shows the flow of gene expression analysis for three different data set integrations.
FIG. 5 (B) shows all-pair sample associations of TCGA GC samples, ACRG, PDC GC, and patient derived cells (PDC) and samples other than gastric cancer.
FIG. 5C is a diagram showing a two-dimensional plot of three data set samples using principal component analysis. FIG. The samples show TCGA GC, TCGA normal, ACRG, PDC GC and PDC and others.
Figure 5 (D) shows sample-layered clustering of gene expression (485 genes and 716 samples) after meta-analysis (blue: abundant normal sample cluster, red: abundant tumor sample cluster).
Figure 5 (E) shows a case analysis of different expression of MET and ERBB2 oncogenes. Bar plot shows expression levels of these genes in five different groups (red: comparison of normal and tumor samples, black: comparison between tumor samples).

본 발명은 환자 특이적 환자 유래 세포(Patient-Derived Cell, 이하 "PDC") 의 제조방법에 관한 것이다. The present invention relates to a method for producing a patient-specific cell (Patient-Derived Cell, hereinafter referred to as "PDC").

본 발명의 PDC는 환자 종양 세포의 특징을 높은 연관도를 가지고 반영하는 것을 특징으로 하며, 모델 확립에 짧은 시간이 소요되므로 환자 맞춤형 약물 평가에 유용하게 사용될 수 있으므로 기존의 전임상 모델을 대체하는 수단이 될 수 있고, 간단한 제조방법을 통해 얻을 수 있는 장점이 있다. The PDC of the present invention is characterized by reflecting the characteristics of the patient tumor cells with a high degree of relevance. Since it takes a short time to establish the model, it can be used for the evaluation of the patient-customized drug, There is an advantage that can be obtained through a simple manufacturing method.

보다 구체적으로 본 발명의 PDC 제조 방법은 1) 암 환자로부터 삼출액을 얻는 단계; 2) 상기 삼출액을 500 내지 2000rpm으로 원심분리하는 단계; 3) 원심분리된 세포를 배지에서 재부유시키고 암세포를 분리하는 단계; 및 4) 분리된 암세포를 1 내지 10 계대(passage) 배양하는 단계; 를 포함하는 환자 특이적 환자 유래 세포(Patient-Derived Cell) 의 제조방법에 관한 것이다. More specifically, the PDC preparation method of the present invention comprises the steps of: 1) obtaining an effusion from a cancer patient; 2) centrifuging the effluent at 500 to 2000 rpm; 3) resuspending the centrifuged cells in the medium and isolating the cancer cells; And 4) culturing the isolated cancer cells 1 to 10 passages; To a method for producing a patient-specific cell (Patient-Derived Cell).

본 발명에 있어서 용어 "PDC"는 암환자로부터 얻어지고, 계대 배양을 통해 구축된 세포로 암 환자의 조직학적 특징 유전학적 특징, 항암제 내성 등의 임상학적 특징을 높은 수준의 연관도로 반영하며 계대 배양을 통해서도 높은 연관도를 유지할 수 있는 세포를 말한다. PDC는 이종 이식 모델에 이식하여 사용할 수도 있으나, 이종 이식 모델에 이식하기 전 단계에서 암 환자 각각이 가지고 있는 개별적인 특징을 반영하면서도 P1을 수득하는데 약 3주의 짧은 시간만이 소요되므로, 이종 이식 모델 구축에 소요되는 3~4 달 정도의 시간을 효과적으로 단축하여 세포 단계에서 환자 맞춤형 암 분석에 사용하는 것이 바람직하다. In the present invention, the term "PDC" refers to a cell obtained from a cancer patient and constructed through subculture. The PDC reflects a high level of clinical characteristics such as histological features, anticancer drug resistance, And the ability to maintain a high degree of association. PDC can be used in a xenotransplantation model, but it takes only about 3 weeks to obtain P1, reflecting the individual characteristics of each cancer patient before the xenotransplantation model. Therefore, the xenotransplantation model It is preferable to shorten the time of about 3 to 4 months to be used for the patient-customized cancer analysis at the cell stage.

본 발명에서 삼출액(effusion) 이란, 피의 성분이 혈관 밖으로 나와 신체 부위에 모임 액상의 물질을 말하며, 누출액과 비교하여 단백 성분이 다량으로 포함되어 있는 액악 물질을 말한다. 본 발명의 삼출액은 PDC를 억기 위한 목적으로 암 환자에서 수득가능하며, 삼출액을 얻기 위한 방법은 당 분야에 공지된 방법을 자유롭게 이용할 수 있다. In the present invention, effusion refers to a liquid substance in which a blood component comes out from a blood vessel and collects in a body part, and contains a large amount of protein component as compared with a leakage solution. The exudate of the present invention can be obtained in a cancer patient for the purpose of suppressing PDC, and the method for obtaining the exudate can be freely used in the methods known in the art.

상기 삼출액은 복수 삼출액, 흉막 삼출액 및 심낭 삼출액으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 특히 복수 삼출액이 PDC의 수득에 가장 바람직하다. The exudate may be at least one selected from the group consisting of multiple exudates, pleural effusions and pericardial effusions, and multiple exudates are most preferred for obtaining PDCs.

복수란 복강 내에 다량의 액체가 고인 것을 말하며, 복수(Ascites) 삼출액은 위암, 간암, 췌장암, 결장암 등의 위장관의 암, 난소암, 유방암, 폐암, 악성 중피종에서 일어날 수 있다. Ascites exudate may occur in gastrointestinal cancer such as gastric cancer, liver cancer, pancreatic cancer, colon cancer, ovarian cancer, breast cancer, lung cancer, and malignant mesothelioma.

흉막 삼출액(pleural effusions) 이란, 원인 질환에 의하여 흉막에서 흡수되는 체액보다 생성되는 체약이 많아질 때 발생하는 것을 말하며, 특히 악성 흉막 삼출액은, 암에 의해서 발생된 흉수가 가슴막 공간에 생기는 것을 의미한다. Pleural effusions are those that occur when the amount of body fluids produced by body fluids is greater than that of body fluids absorbed by the cause of the disease. In particular, malignant pleural effusions indicate that pleural effusion caused by cancer occurs in the chest membrane space do.

심낭 삼출액 (pericardial effusion) 이란, 심장을 싸고 있는 막인 심낭의 두 층 사이에 수분이 증가된 것을 의미한다. Pericardial effusion means that the moisture is increased between the two layers of the pericardium, the heart surrounding the heart.

삼출액으로부터 PDC의 분리를 위하여 본 발명에서는 상기 삼출액을 원심분리하는 단계, 원심분리된 세포를 배지에서 재부유시키고 암세포를 분리하는 단계를 수행한다. In order to separate PDC from the exudate, the present invention performs centrifugation of the effluent, resuspension of the centrifuged cells in the medium, and separation of cancer cells.

보다 구체적으로 수득한 삼출액은 500 내지 3000rpm, 바람직하게는 500 내지 2000rpm, 더욱 바람직하게는 1000 내지 1500rpm, 가장 바람직하게는 1500rpm으로 원심분리할 수 있다. More specifically, the effluent obtained can be centrifuged at 500 to 3000 rpm, preferably 500 to 2000 rpm, more preferably 1000 to 1500 rpm, most preferably 1500 rpm.

삼출액의 원심분리를 통해 수득한 원심분리된 세포를 포함하는 세포 펠렛을 배양 배지에 재부유시키고, 플레이팅을 한 후, 암 세포가 충분히 성장할 수 있는 배양 조건 하에서 배양하고 분리할 수 있다. Cell pellets containing the centrifuged cells obtained by centrifugation of the exudate can be resuspended in the culture medium, plated and then cultured and separated under culture conditions in which the cancer cells can sufficiently grow.

분리된 암 세포는 PDC 의 계대 배양 세포를 얻기 위하여 세포가 80-90% 컨플루언스에 도달했을 때 TrypLE Express (Gibco BRL)를 이용하여 계대 배양시킬 수 있다. PDC의 계대 배양을 통해 얻어지는 세포는 계대 수가 반복되어도 환자 유래의 일차 종양 세포의 조직학적, 유전학적, 임상학적 특징을 높은 연관도로 반영할 수 있으며, 상기 계대는 바람직하게는 1 내지 10계대, 더욱 바람직하게는 1내지 5계대, 더더욱 바람직하게는 1 내지 3계대 일 수 있다. 1계대 PDC인 P1은 0.05 내지 4주의 기간을 통해 수득할 수 있어, 환자에게 가장 적합한 약물을 평가할 수 있는 모델을 빨리 제공할 수 있는 장점이 있다. P1 에서 P2로의 성장 기간 역시 0.5-5주의 짧은 시간만이 소요되므로, 환자 유래 이종 이식 모델의 제조와 비교하여 모델을 빨리 제공할 수 있다. Isolated cancer cells can be subcultured using TrypLE Express (Gibco BRL) when cells reach 80-90% confluence to obtain subcultured cells of PDC. Cells obtained from the subculture of PDC can reflect the histological, genetic and clinical characteristics of the primary tumor cells derived from the patient in a highly correlated manner, and the subculture is preferably in the range of 1 to 10 Preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3. P1, a passaged PDC, can be obtained over a period of 0.05 to 4 weeks, providing the advantage of quickly providing a model for evaluating the most appropriate drug for the patient. Since the growth period from P1 to P2 also takes only a short time of 0.5 to 5 weeks, the model can be provided faster than the production of patient-derived xenotransplantation models.

본 발명의 제조방법은, 수득한 PDC 세포를 추후 이용하기 위하여 동결하기 위한 동결처리 방법을 추가적으로 포함할 수 있다. 동결 방법은 PDC의 특성에 영향을 미치지 않는 당 분야에 공지된 동결 배지를 이용하는 방법 등을 제한없이 포함할 수 있다. The production method of the present invention may further include a freezing treatment method for freezing the obtained PDC cells for later use. The method of freezing may include, without limitation, methods using freezing media known in the art which do not affect the properties of the PDC.

본 발명에 있어서 상기 PDC 를 구축가능한 암은 전이성 암일 수 있다. 또한 상기 암은 바람직하게는 위암, 폐암, 결장암, 간세포 암종, 멜라노마, 췌장암, 사카로마, 비소성 폐암, 두경부암, 신장암, 담낭암 및 비뇨기암으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다. In the present invention, the arm capable of constructing the PDC may be a metastable arm. The cancer may preferably be at least one selected from the group consisting of gastric cancer, lung cancer, colon cancer, hepatocellular carcinoma, melanoma, pancreatic cancer, squamoma, non-malignant lung cancer, head and neck cancer, kidney cancer, gallbladder cancer and urinary cancer.

본 발명의 제조방법을 통해 얻어지는 환자 유래 세포인 PDC는 암환자의 조직학적 특징, 유전학적 특징, 항암제 내성을 반영하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이는 이용 및 구축이 용이하므로, 기존의 환자 유래 암세포를 이식하여 구축되는 이종이식 암 모델(PDX)와 비교하여 전임상 평가에 더욱 유용하다. PDC, which is a patient-derived cell obtained through the production method of the present invention, may be characterized by reflecting histological characteristics, genetic characteristics, and anticancer drug resistance of a cancer patient. Because it is easy to use and construct, it is more useful for preclinical evaluation than the xenotransplantation model (PDX) constructed by transplanting existing patient-derived cancer cells.

또한 본 발명은 1) 본 발명의 제조방법을 통해 제조된 환자 유래 세포(PDC)에 후보 항암제를 처리하는 단계; 및 2) 환자 유래 세포에서 항암제 처리에 따른 항암 효과를 확인하는 단계; 를 포함하는 환자 맞춤형 항암제의 스크리닝 방법을 제공한다. The present invention also relates to a method for treating cancer, comprising the steps of: 1) treating a patient-derived cell (PDC) prepared by the method of the present invention with a candidate anticancer agent; And 2) confirming the anticancer effect according to the anticancer treatment in the patient-derived cells; The present invention provides a screening method of a patient-customized anticancer agent.

본 발명의 환자 맞춤형 항암제의 스크리닝 방법은 PDC가 암 환자의 조직학적, 유전학적, 항암제 내성과 같은 임상적 특징을 모두 효과적으로 반영할 수 있다는 사실에 기초하여, 해당 환자에게 가장 적합한 항암제, 부적합한 항암제를 선별해 낼 수 있는 것을 특징으로 한다. The screening method of the patient-customized anticancer agent of the present invention is based on the fact that PDC can effectively reflect all clinical characteristics such as histological, genetic and anticancer drug resistance of cancer patients, Can be sorted out.

상기 후보 항암제는 기존에 널리 사용되고 있는 상용화된 항암제, 예컨대 아파티닙(BIBW 2992), 베바시주맙, 세툭시맙, 다사티닙, E7080, 에를로티닙, 게피티닙, 이마티닙, 라파티닙, 닐로티닙, 파니투무맙, 파조파닙, 페갑타닙, 라니비주맙, 소라페닙, 수니티닙, 트라스투주맙, 반데타닙, 베무라페닙, 아미노글루테티마이드, 아나스트로졸, 엑세메스탄, 파드로졸, 포르메스탄, 레트로졸, 테스토락톤, 보로졸, 라소폭시펜, 랄록시펜, 타목시펜, 토레미펜, 셀레콕시브, 발데콕시브, 로페콕시브 및 트롬보스폰딘로부터 선택된 1종 이상의 항암제일 수 있으며, 이 외에 새롭게 개발되어 특정 환자에게 암 치료를 위해 적용하기 위한 다양한 종류의 항암제를 제한 없이 포함할 수 있다 The candidate anticancer agent may be a commercially available anticancer agent such as apatipinib (BIBW 2992), bevacizumab, cetuximab, dasatinib, E7080, erlotinib, gefitinib, imatinib, lapatinib, The present invention relates to a pharmaceutical composition comprising at least one compound selected from the group consisting of NIP, panitumumap, pazopanib, pecletanib, ranibizumab, sorafenib, sernitinib, trastuzumab, vandetanib, bemurafenot, aminoglutethimide, anastrozole, It may be at least one anticancer agent selected from the group consisting of a prodrug, a sol, formestan, letrozole, testolactone, borozol, lasofoxifene, raloxifene, tamoxifen, toremifene, celecoxib, valdecoxib, rofecoxib and trombospondin , As well as various other types of anti-cancer agents to be newly developed and applied to cancer patients for treatment of certain patients

상기 제 2) 단계에서 항암제 처리에 따른 항암 효과의 확인은 PDC의 유전적 변이, 형태학적 변이, 생리학적 변이 등을 통해 확인할 수 있으며, 상기 유전적 변이는 이에 제한되지 않으나, 암세포에서 발현되는 암 특이적인 유전자의 발현이 억제되거나 이의 발현 양상이 정상적인 세포와 유사하게 변화되는 것을 의미하고, 상기 형태학적 변이는 이에 제한되지 않으나, 암 세포의 사멸, 또는 암 세포의 형태가 정상적인 세포와 유사하게 변화되는 것을 의미하며, 상기 생리학적 변이는 이에 제한되지 않으나, 암세포의 증식특성, 전이특성, 발현단백질의 종류 등이 소멸하거나 또는 정상적인 폐조직 세포의 특성으로 바뀌는 것을 의미할 수 있다. The confirmation of the anticancer effect by the anticancer treatment in the second step can be confirmed by genetic mutation, morphological mutation and physiological mutation of PDC, and the genetic mutation is not limited thereto. However, Means that the expression of a specific gene is suppressed or its expression pattern changes in a similar manner to that of a normal cell. The morphological variation is not limited to this, but the cancer cell death or cancer cell morphology may be changed And the physiological variation is not limited thereto. However, it may mean that the proliferation characteristics, metastatic characteristics, and types of the expressed proteins of the cancer cells disappear or change to the characteristics of normal lung tissue cells.

상기 스크리닝 방법에 따라, PDC에서 효과적인 항암 효과를 나타내는 것으로 확인된 후보 항암제는 PDC 와 상응하는 암 환자에게 맞춤형으로 처방될 수 있는 항암제로 선별될 수 있다. According to the above screening method, a candidate anticancer agent that has been shown to exhibit an effective anticancer effect in PDC can be selected as an anticancer agent that can be customized to a cancer patient corresponding to the PDC.

또한 본 발명은 본 발명의 제조방법을 통해 제조된 환자 유래 세포(PDC)를 포함하는 환자 맞춤형 항암제 스크리닝용 키트에 관한 것이다. The present invention also relates to a patient-customized anti-cancer drug screening kit comprising a patient-derived cell (PDC) produced by the production method of the present invention.

발명의 용어 "스크리닝용 키트"란 다수의 후보물질 중에서 특정한 효과를 나타내는 물질을 선발하는데 사용되는 키트를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 스크리닝용 키트는 특별히 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게 본 발명의 PDC를 이용하여 암을 개선, 경감 또는 치료할 수 있는 효과를 나타내는 물질을 선발하는데 사용되는 키트가 될 수 있다. 보다 바람직하게는 기판에 본 발명의 PDC 가 위치하며 PDC의 변화를 용이하게 검출할 수 있는 키트가 될 수 있다. 이때, 상기 키트는 상기 PDC의 형태학적, 생리학적 또는 유전학적 변화를 측정할 수 있는 항체, 프라이머, 프로브 등의 검출수단을 추가로 포함할 수도 있다. The term "screening kit " of the present invention refers to a kit used to select a substance exhibiting a specific effect among a plurality of candidate substances. For the purpose of the present invention, the screening kit may be a kit used for selecting a substance showing the effect of improving, alleviating or treating cancer by using the PDC of the present invention, although not particularly limited thereto. More preferably, the PDC of the present invention is placed on a substrate, and the PDC can be easily detected. At this time, the kit may further include detection means such as an antibody, a primer, and a probe capable of measuring morphological, physiological or genetic changes of the PDC.

또한 본 발명은 본 발명의 제조방법을 통해 제조된 환자 유래 세포(PDC)의 변이를 분석하는 단계; 를 포함하며, 상기 변이는 유전체 단위 반복 변이(copy number variations, CNV), 점 돌연변이, 인트론성 변이, 미스센스 돌연변이, 프레임쉬프트(frame shift) 돌연변이, 단일염기변이 및 InDel 변이로 이루어진 군에서 선택된 1종이상인, 암 환자의 세포 변이에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. The present invention also relates to a method for producing a compound of the present invention, which comprises the steps of: analyzing a mutation of a patient-derived cell (PDC) produced by the method of the present invention; Wherein the mutation is selected from the group consisting of genomic unit variation variations (CNV), point mutations, intronic mutations, mismatch mutations, frame shift mutations, single base mutations and InDel mutations. A paper trader, and a cancer patient.

본 발명의 PDC는 PDC와 상응하는 암 환자에서 확인되는 유전학적 변이를 높은 연관도로 반영할 수 있으므로, 암환자에서 확인되는 유전적 변화에 대한 연구에 유용하게 사용할 수 있다. 따라서 본 발명의 PDC 의 변이를 당 분양 공지된 방법으로 확인할 수 있으며, 특히 PDC가 반영할 수 있는 유전학적 변이는 유전체 단위 반복 변이(copy number variations, CNV), 점 돌연변이, 인트론성 변이, 미스센스 미스센스 돌연변이, 프레임쉬프트 돌연변이, 단일염기변이 및 InDel 변이로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것이 바람직하다. The PDC of the present invention can highly reflect the genetic mutation confirmed in the cancer patients corresponding to the PDC, and thus can be usefully used for studying genetic changes confirmed in cancer patients. Accordingly, the PDC of the present invention can be identified by a known method, and in particular, the genetic variation that can be reflected by the PDC includes genetic unit copy number variations (CNV), point mutation, intronic mutation, A mismatch mutation, a frame shift mutation, a single base mutation, and an InDel mutation.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in order to facilitate understanding of the present invention. However, the following examples are provided only for the purpose of easier understanding of the present invention, and the present invention is not limited by the examples.

실시예Example 1. PDC(Patient-Derived Cell) 모델의 제조 1. Manufacture of PDC (Patient-Derived Cell) Model

1.1 암 환자로부터 1.1 From Cancer Patients 환자유래Patient origin 세포(PDC)의 제조 Production of Cells (PDC)

2012년 4월부터 2014년 8월 사이에, 전이성 암을 갖는 환자들이 SMC 종양 바이오마커 연구 (NCT#01831609, clinicaltrials.gov)에 참여하였다. 간단하게, inclusion criteria 은 하기와 같이 설정하였다: 18세 이상; 고형암이 병리학적으로 확인됨; 수술적 치료법으로 전이성 병변의 존재가 쉽게 치료되지 않고 치료적 목적으로 경피를 통해 배출될 필요가 있는 체강 내 악성 삼출물(malignant effusion) 을 갖는다. 서면 동의서를 받을 후 치료적 목적으로 삼출물을 수득하였으며, 이러한 모든 과정은 헬싱키 선언의 가이드라인에 따라 수행되었다. 삼성의료센터의 임상 시험 심사위원회가 이와 같은 프로토콜을 승인하였다. PDC 확립을 위해서 총 176명의 환자를 대상으로 하였다. Between April 2012 and August 2014, patients with metastatic cancer participated in the SMC tumor biomarker study (NCT # 01831609, clinicaltrials.gov). Briefly, inclusion criteria were set as follows: 18 years of age or older; Solid tumors confirmed pathologically; Surgical treatment has a malignant effusion in the cervical cavity where the presence of metastatic lesions is not easily treated and needs to be transdermal for therapeutic purposes. After receiving the written consent, exudates were obtained for therapeutic purposes, all of which were carried out in accordance with the guidelines of the Helsinki Declaration. The Samsung Medical Center clinical trial review committee approved these protocols. A total of 176 patients were enrolled to establish the PDC.

176명의 환자 중, 130 개체에서 PDC 모델을 성공적으로 확립하였다 (73.6%). 성공적인 PDC 모델을 세포학적으로 확인하였고, 이들은 2개 계대로 성장을 유지시켰다. 모든 환자 유래의 세포들을 H&E 또는 Papanicolaou를 통해 염색하였고, 현미경 사진을 저장하였다. 박테리아 감염, 세포 성장 실패 등의 부적절한 시료를 제외하고, 116개의 케이스에서 Ion Ampliseq, nCounter CNV 어세이 및 Nanostring-based targeted gene expression profiling을 이용하여 유전적 분석을 수행하였다. 표 1은 환자의 기본적인 특징을 요약한다 (N=116).Of the 176 patients, 130 PDC models were successfully established (73.6%). Successful PDC models were confirmed cytologically, and they maintained growth in two passages. Cells from all patients were stained with H & E or Papanicolaou, and photomicrographs were saved. Genetic analysis was performed in 116 cases using the Ion Ampliseq, nCounter CNV assays, and nanostring-based targeted gene expression profiling, except for inappropriate samples such as bacterial infection and cell growth failure. Table 1 summarizes the basic characteristics of the patient (N = 116).

[표 1][Table 1]

기본적인 환자 특징(N=116)Basic patient characteristics (N = 116)

Figure pat00001
Figure pat00001

표 1 에서 확인되는 바와 같이, 가장 일반적인 암 유형은 위암(GC, N = 58; 50.0%) 이고, 그 뒤로 결장암 (N = 25; 21.6%) 및 간세포 암종 (N = 8; 6.9%) 이다. PDC는 주로 복수삼출액로부터 수집되었고 (N = 101; 87.1%), 그 뒤를 이어 흉막삼출액(pleural effusions) (N = 12; 10.3%), 심낭삼출액(pericardial effusion) 및 다른 기원으로부터 수집하였다. 따라서, 가장 유용한 PDC의 시료는 악성 복수 시료이다. As shown in Table 1, the most common cancer types are gastric cancer (GC, N = 58; 50.0%) followed by colon cancer (N = 25; 21.6%) and hepatocellular carcinoma (N = 8; 6.9%). PDCs were collected mainly from multiple effusions (N = 101; 87.1%) followed by pleural effusions (N = 12; 10.3%), pericardial effusion and other sources. Therefore, the most useful sample of PDC is a malignant multiple sample.

세포의 최대 계대수는 10 (range, 6-14), 그리고 분석 시간에서 계대수는 1 내지 4이다. 모든 PDC는 단일층이 부착된 플라스크에서 성장하였다. 배양 조건에서, 일차 종양 및 모델에 대한 P2 사이의 평균 시간은 4주 (평균 28.6 days)이다. 모든 세포에서, P1에 대한 표본 수집의 평균 시간은 3주 (0.05 내지 4주) 이고, P1 에서 P2 로의 성장은 평균 2.5 주가 소요되었다 (0.5-5주). 평균 배가 시간(doubling time)은 119.5 시간이다. 이와 같은 결과를 통해 생검으로부터 PDC P1을 수득하는데 3주만이 소요되므로, 3-4 달 정도의 시간이 소요되는 PDX 모델보다 확립 및 이용이 용이하다는 우수성을 확인하였다. The maximum number of cells is 10 (range, 6-14), and the number of passages is 1 to 4 at the time of analysis. All PDCs were grown in a single layered flask. Under culture conditions, the average time between P2 for primary tumors and models is 4 weeks (mean 28.6 days). In all cells, the average time of sample collection for P1 was 3 weeks (0.05 to 4 weeks) and the growth from P1 to P2 took an average of 2.5 weeks (0.5-5 weeks). The average doubling time is 119.5 hours. These results showed that PDC P1 was obtained from the biopsy only for 3 weeks. Therefore, it was confirmed that the PDX model was superior to PDX model, which requires 3-4 months of time.

1.2 인간 삼출액의 일차 배양 및 PDC의 동결 보존 1.2 Primary culture of human exudate and cryopreservation of PDC

악성 복수(Malignant ascites) 삼출액, 흉막 삼출액(pleural effusions) 또는 심낭 삼출액(pericardial effusions)을 전이성 암을 가진 환자로부터 수득하였다. 수집된 삼출액(1-5L)를 50ml 튜브에 나누고 10분 동안 1500 rpm으로 원심분리하고 PBS로 2회에 걸쳐 세척하였다. 세포 펠렛을 배양 배지에서 재부유시키고, 75cm2 배양 플라스크에 플레이팅 하였다. 세포들은 10% 우태아혈청(FBS; Gibco BRL, Paisley, UK) 및 1% 항생제-항-진균 용액 (Gibco BRL) 이 보충된 RPMI 1640 배지에서 성장시켰다. 상기 배지는 3일마다 교체하였으며, 세포들을 가습화된 5% 이산화탄소 배양기에서 37도로 유지시켰다. PDC 를 세포가 80-90% 컨플루언스에 도달했을 때 세포를 얻기 위하여 TrypLE Express (Gibco BRL)를 이용하여 계대하였다. 80-90% 컨플루언스에 도달했을 때 세포를 세척하고 TrypLE Express (Gibco BRL)를 이용하여 분리하였으며, 5% CO2 37도에서 3분동안 배양하였다. 분리 후 4mL 의 완전 배양 배지를 트립신 활성을 차단하기 위하여 첨가하고 세포를 15mL 멸균 원심분리 튜브로 옮겼다. 원심분리 후, 세포들을 1ml의 동결 배지에서 재부유시켰으며 (Cellbanker, Zenoaq, Japan) 동결바이알(Nalge Nunc, Naperville, IL, USA)로 이동시키고 -80℃에서 하룻밤동안 동결하였다. Malignant ascites exudates, pleural effusions, or pericardial effusions were obtained from patients with metastatic cancers. The collected effluent (1-5 L) was divided into 50 ml tubes, centrifuged at 1500 rpm for 10 minutes and washed twice with PBS. The cell pellet was resuspended in the culture medium and plated in a 75 cm 2 culture flask. Cells were grown in RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco BRL, Paisley, UK) and 1% antibiotic-anti-fungal solution (Gibco BRL). The medium was changed every 3 days and the cells were maintained at 37 ° C in a humidified 5% CO 2 incubator. PDCs were passaged using TrypLE Express (Gibco BRL) to obtain cells when cells reached 80-90% confluence. Upon reaching 80-90% confluence, the cells were washed and separated using TrypLE Express (Gibco BRL) and incubated for 3 min at 37 ° C in 5% CO 2 . After isolation, 4 mL of complete culture medium was added to block trypsin activity and the cells were transferred to a 15 mL sterile centrifuge tube. After centrifugation, cells were resuspended in 1 ml of freezing medium (Cellbanker, Zenoaq, Japan) and transferred to a freezing vial (Nalge Nunc, Naperville, IL, USA) and frozen overnight at -80 ° C.

실시예Example 2. PDC의 유전자 분석을 통한 변이 분석 2. Mutation analysis by gene analysis of PDC

116 PDC에서 유전자 프로파일링을 얻었다. Ion Ampliseq 2.을 이용하여 50개 유전자에서 181 개 돌연변이를 확인하였다. Ion Ampliseq 2. 은 50개의 일반적으로 돌연변이된 발암 유전자 및 종양 억제 유전자에서 2,855 개의 돌연변이를 확인하는데 사용되었다. 확인 대상의 50개의 유전자는 다음과 같다. Gene profiling was obtained in 116 PDCs. Ion Ampliseq 2. was used to identify 181 mutations in 50 genes. Ion Ampliseq2 was used to identify 2,855 mutations in 50 commonly mutated oncogenes and tumor suppressor genes. The 50 genes to be identified are as follows.

BRAF(NM_004333), HRAS(NM_005343), KRAS(NM_004985), NRAS(NM_002524), FGFR1 (NM_000604), ERBB2(NM_004448), MET(NM_000245), FGFR3(NM_000142), PDGFRA(NM_006206), PIK3CA(NM_006218.1), FLT3(Z26652), RB1(NM_000321), CSF1R(NM_005211), RET(NM_020975), SMARCB1(NM_003073.2), KIT(NM_000222), SRC(NM_005417), PTEN(NM_000314.4), CTNNB1(NM_001904), EGFR(NM_005228), TP53(NM_000546), CDKN2A(NM_000077), ABL1(X16416), JAK2(ENST00000381652), NOTCH1(NM_017617.2), ATM(NM_000051), ERBB4(NM_005235), STK11(NM_000455), PTPN11(NM_002834.3), APC(NM_000038), SMO(NM_005631.3), SMAD4(NM_005359.3), VHL(NM_000551.2), NPM1(NM_002520.4), MPL(NM_005373.1), CDH1(NM_004360.2), HNF1A(NM_000545.3), FBXW7(NM_033632.1), MLH1(NM_000249.2), IDH1(NM_005896.2), JAK3(NM_000215), FGFR2(NM_000141.2), AKT1(ENST00000349310), KDR(NM_002253), ALK(ENST00000349310), GNAS(NM_000516.3). (NM_004333), HRAS NM_005343, KRAS NM_004985, NRAS NM_002524, FGFR1 NM_000604, ERBB2 NM_004448, MET NM_000245, FGFR3 NM_000142, PDGFRA NM_006206, PIK3CA NM_006218.1 ), FLT3 (Z26652), RB1 (NM_000321), CSF1R (NM_005211), RET (NM_020975), SMARCB1 (NM_003073.2), KIT (NM_000222), SRC (NM_005417), PTEN (NM_000314.4), CTNNB1 , EGFR NM_005228, TP53 NM_000546, CDKN2A NM_000077, ABL1 X16416, JAK2 ENST00000381652, NOTCH1 NM_017617.2, ATM NM_000051, ERBB4 NM_005235, STK11 NM_000455, PTPN11 NM_002834.3), APC NM_000038, SMO NM_005631.3, SMAD4 NM_005359.3, VHL NM_000551.2, NPM1 NM_002520.4, MPL NM_005373.1, CDH1 NM_004360.2 ), HNF1A (NM_000545.3), FBXW7 (NM_033632.1), MLH1 (NM_000249.2), IDH1 (NM_005896.2), JAK3 (NM_000215), FGFR2 (NM_000141.2), AKT1 (ENST00000349310), KDR ), ALK (ENST00000349310), GNAS (NM_000516.3).

DNA 시료를 단일 튜브로 옮기고 PCR 증폭을 Ion AmpliSeqCancer Primer Pool and Ion AmpliSeqKit reagents (Life Technologies) 를 이용하여 수행하였다. 증폭절(amplicon) 을 인산화시킨 후 Ion Adapters 에 연결시킨 후 정제하였다. 바코드화된 라이브러리 준비를 위하여, Ion AmpliSeq Library Kit 내 공급된 비-바코드화된 어댑터에 대한 Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit 로부터 바코드화된 어뎁터를 대체하였다. 0.6 및 1.2 비드-시료 부피 비로 결합된 2라운드의 Agencourt AMPure XP 시료가 인풋 DNA 의 제거 및 증폭절-함유 용액으로부터 프라이머의 제외를 위해 사용되었다. 라이브러리 분자의 최종 크기는 약 125-300bp 였다. 자동화된 주형 준비를 위하여 Ion OneTouch Syste에 라이브러리를 위치시켰으며, 서열분석을 제조사의 지시에 따라 Ion PGM sequencer 로 수행하였다. DNA samples were transferred to a single tube and PCR amplification was performed using Ion AmpliSeqCancer Primer Pool and Ion AmpliSeqKit reagents (Life Technologies). The amplicons were phosphorylated and ligated to Ion Adapters and purified. To prepare the bar codeed library, we replaced the bar code adapter from the Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit for the non-bar code adapter supplied in the Ion AmpliSeq Library Kit. Two rounds of Agencourt AMPure XP samples combined at 0.6 and 1.2 bead-sample volume ratios were used for the removal of the input DNA and for the removal of the primer from the amplification-containing solution. The final size of the library molecule was about 125-300 bp. The library was placed in the Ion OneTouch System for automated template preparation and sequence analysis was performed with an Ion PGM sequencer according to the manufacturer's instructions.

새로운 파이프라인을 계대 0, 1, 및 2 (P0, P1 및 P2, 각각) 와 이종이식에 대한 단일염기변이체(SNVs) 의 높은 민감도 확인을 위하여 설계하였다. Varscan2 SNP calling 을 하기 옵션으로 수행하였다: min-coverage, 50; min-varfreq, 0.01; 및 p-value, 0.1. InDels 주위의 변이체는 여과하였다. 변이체들을 Oncotator를 이용하여 기록하였다. The new pipeline was designed for high sensitivity detection of passages 0, 1, and 2 (P0, P1 and P2, respectively) and single base mutants (SNVs) for xenotransplantation. Varscan2 SNP calling was performed with the following options: min-coverage, 50; min-varfreq, 0.01; And p-value, 0.1. The variants around InDels were filtered. Mutants were recorded using Oncotator.

유전체 단위 반복 변이 (Repeated Variation of Dielectric Unit ( CNVCNV ) 확인) Confirm

유전체 단위 반복 변이 (copy number variations, CNV) 를 검출하기 위하여, 300ng의 정제된 유전체 DNA를 PDC로부터 정제하였고 nCounter Copy Number Variation CodeSets 를 이용하여 분석하였다. DNA 를 AluI 절단에 의해서 분절화 하였고, 95℃ 에서 변성시켰다. 분절화된 DNA를 nCounter Cancer CN Assay Kit (Nanostring Technologies, Seattle, WA, USA) 에서 18시간 동안 65℃ 에서 86 개 유전자 codeset 으로 혼성화하였고 제조사의 지시에 따라 처리하였다. nCounter Digital Analyzer 을 검출에 사용하였고 리포터 프로브의 신호를 표로 만들었다. 3 초과 평균 계수를 IHC(immunohistochemistry), FISH(fluorescent in situ hybridization), 또는 실시간 PCR 을 통해 확인하였다. To detect genomic unit variations (CNV), 300 ng of purified genomic DNA was purified from PDC and analyzed using nCounter Copy Number Variation CodeSets. The DNA was segmented by AluI digestion and denatured at 95 ° C. The segmented DNAs were hybridized with 86 gene codeset at 65 ° C for 18 hours in the nCounter Cancer CN Assay Kit (Nanostring Technologies, Seattle, WA, USA) and processed according to the manufacturer's instructions. The nCounter Digital Analyzer was used for detection and the signal of the reporter probe was tabulated. 3 Over-averaged counts were confirmed by immunohistochemistry (IHC), fluorescent in situ hybridization (FISH), or real-time PCR.

상기와 같은 유전자 변이 분석 결과를 도 2에 나타내었다. The results of the gene mutation analysis are shown in FIG.

도 2에 나타낸 바와 같이, 돌연변이 중 대부분은 비동의 점 돌연변이 (nonsynonymous point mutations) 인 것을 확인하였다. 점 돌연변이 외에도, 하나의 절단 돌연변이가 APC에서 발견되었고, TP53 및 VHL 에서 각각 두 개 및 한 개의 프레임쉬프트(frame shift) 돌연변이가 발견되었다. 가장 일반적으로 검출되는 분자 수차(molecular aberrations)은 HRAS, SMARCB1, STK11, PTEN, CDKN2A, TP53, MLH1, PIK3CA, BRAF, EGFR, 및 KRAS 에서 각각 관찰되었다. My Cancer Genome database (http://www.mycancergenome.org/) 및 Therapeutic Target Database (http://bidd.nus.edu.sg/group/TTD/ttd.asp) 데이터베이스를 이용하여 임상적으로 활성을 가질 수 있는 돌연변이를 검출하였다. 116 PDC 중 76개에서 활성을 가질 수 있는 돌연변이를 확인하였다. 유전체 단위 반복 변이 어세이를 이용하여, 11개 유전자에서 16개의 증폭산물을 확인하였다: 3개는 MCL1; 2개는 각각 BRACA2, MET, 및 RAS; 및 한 개는 각각 ZNF217, FGFR1, CDKN1A, AURKA, CRKL, CCND1, 및 WHSC1L1. As shown in Fig. 2, it was confirmed that most of the mutations were non-synonymous point mutations. In addition to point mutations, one truncation mutation was found in APC , and two and one frame shift mutations were found in TP53 and VHL , respectively. The most commonly detected molecular aberrations are HRAS, SMARCB1, STK11, PTEN, CDKN2A, TP53, MLH1, PIK3CA, BRAF, EGFR and KRAS. My Cancer Genome database (http://www.mycancergenome.org/) and the Therapeutic Target Database (http://bidd.nus.edu.sg/group/TTD/ttd.asp) database. Mutations were detected. In 76 of 116 PDCs, mutations that could be active were identified. Using genetic unit repeat mutation assays, 16 amplified products were identified in 11 genes: 3 were MCL1; Two are BRACA2, MET, and RAS, respectively; And one of them is ZNF217, FGFR1, CDKN1A, AURKA, CRKL, CCND1, and WHSC1L1.

실시예Example 2. 일차 종양 및 PDC의 유전학적 관련성 및 임상 표현형 관련성 분석 2. Genetic and clinical phenotypic relevance analysis of primary tumors and PDC

2.1 2.1 표적화된Targeted 서열분석 Sequencing

PDC와 일차 종양 생검을 유전학적으로 비교하기 위하여, 16개의 일차 종양-PDC 쌍 시료에서 표적화된 딥 시퀀싱(deep sequencing)을 수행하였다. 보다 구체적으로 PDC가 그들의 부모 종양의 유전적 조직학적 특성을 유지하는지 여부를 전이성 암을 갖는 동시 발생(synchronous) 환자유래의 PDC 및 일차 종양 16쌍에서 확인하였다. 동시발생 시료는 일차 종양 조달일을 기초로 6개월 미만에서 수집된 것으로 정의하였다. 유전적 DNA를 추출하고 포획된 381 개의 암-연관 유전자에 대하여 SureSelect customized kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 이용하였다. Illumina HiSeq 2500을 100bp paired-end reads 을 갖는 서열분석을 위하여 사용하였다. 시퀀싱 리드(sequencing read)를 각각 SAM/BAM 파일 정렬, duplicate marking 및 local realignment 을 위한 BWA-mem (v0.7.5), SAMTOOLS (v0.1.18), Picard (v1.93) 및 GATK (v3.1.1)을 이용하여 인간 게놈 참조 서열(hg19) 과 정렬하였다. Local realignment 및 base recalibration 을 dbSNP137, Mills indels, HapMap, 및 Omni 에 기초하여 수행하였다. SNV 및 InDel은 Mutect (v1.1.4) 및 Pindel (v0.2.4) 을 이용하여 각각 확인하였으며, ANNOVAR를 변이체를 확인하고 검출하는데 사용하였다. 1%를 초과하는 대립형질 빈도를 갖는 변이체만을 결과에 포함시켰다. 모든 세포들에서 검출된 변이체에 기초하여 상관 계수 (correlation coefficient)를 계산하였으며, 결과를 표 2 및 도 3에 나타내었다. To genetically compare PDC with primary tumor biopsies, targeted deep sequencing was performed on 16 primary tumor-PDC pair samples. More specifically, PDCs were identified in 16 pairs of PDCs and primary tumors from synchronous patients with metastatic cancers to determine whether PDCs retained the genetic and histological characteristics of their parent tumors . Coincident samples were defined as being collected less than 6 months on the basis of primary tumor procurement. Genetic DNA was extracted and SureSelect customized kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) was used for 381 cancer-associated genes. Illumina HiSeq 2500 was used for sequencing with 100 bp paired-end reads. SAMTOOLS (v0.1.18), Picard (v1.93), and GATK (v3.1.1), respectively, for SAM / BAM file alignment, duplicate marking and local realignment, respectively, (Hg19). ≪ / RTI > Local realignment and base recalibration were performed based on dbSNP137, Mills indels, HapMap, and Omni. SNV and InDel were identified using Mutect (v1.1.4) and Pindel (v0.2.4), respectively, and ANNOVAR was used to identify and detect variants. Only mutants with an allelic frequency greater than 1% were included in the results. The correlation coefficient was calculated based on the mutants detected in all cells, and the results are shown in Table 2 and FIG.

[표 2]  [Table 2]

일차 종양 및 상응 PDC 의 유전적 상관 분석 결과Genetic correlation analysis of primary tumors and corresponding PDC

Figure pat00002
Figure pat00002

도 3 및 표 2에 나타낸 바와 같이, 딥 시퀀싱은 유전적 변형이 일차 종양 및 자손 PDC 사이에 매우 일치함을 나타내었다. 도 3 (a) 의 벤다이어그램에 나타낸 바와 같이 일차 종양 및 PDC 에서 변이체들이 확인되었고, 32 개 시료 유래 695 유전적 변화 (genomic alterations) 중 402개가 두가지 유형의 세포에서 모두 확인되었다. 도 3 의 (b) 에 나타낸 바와 같이, 32개의 시료로부터 일반적으로 확인되는 SNV 및 InDel 의 VAF를 plot 을 통해 확인하였고, 평균 변이체 대립 유전자 빈도 연관도(Variant Allele Frequency correlation)는 0.878인 것을 확인하였다. 일차 종양 세포 및 PDC 유래 변이체들 사이의 피어슨 상관 계수는 0.801이다. 상기와 같은 결과를 통해, 환자 유래 세포인 PDC 가 대응되는 일차 종양과 높은 수준의 일치도를 나타내며, PDC가 부모 종양 세포의 특성을 효과적으로 반영할 수 있는 세포임을 확인하였다. As shown in Figure 3 and Table 2, dip sequencing showed that the genetic modification was very consistent between primary tumor and progeny PDC. As shown in the Venn diagram of FIG. 3 (a), mutants were identified in primary tumors and PDCs, and 402 out of 32 samples of 695 genomic alterations were identified in both types of cells. As shown in FIG. 3 (b), the SNVs and the VAFs of InDel generally confirmed from 32 samples were confirmed by plotting and the Variant Allele Frequency correlation was found to be 0.878 . The Pearson correlation coefficient between primary tumor cells and PDC-derived mutants is 0.801. These results indicate that PDC, which is a patient-derived cell, shows a high level of agreement with the corresponding primary tumor and that PDC is a cell that can effectively reflect characteristics of parent tumor cells.

2.2 2.2 PDC 의PDC's 임상적 특성 반영 확인  Confirmation of clinical characteristics

PDC의 약물 반응 프로파일이 표적화된 제제에 대한 대응 환자의 임상적인 반응을 반영할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여 실험을 수행하였다. 임상적 반응 확인을 위하여 사용된 PDC 모델을 하기 표 3에 나타내었다. Experiments were conducted to determine whether the drug response profile of the PDC could reflect the clinical response of the response patient to the targeted agent. The PDC model used for clinical response confirmation is shown in Table 3 below.

[표 3][Table 3]

Figure pat00003
Figure pat00003

표 3에 나타낸 바와 같이, PDC #001의 경우 1.1 μM 의 IC50 을 나타내어 라파티닙에 민감성임이 상응 PDC에서 반영되었다. PDC#014 는 BRAFV600E (+) 멜라노마를 갖는 환자로부터 수집된 시료로부터 생성하였고, 이 환자는 베무라페닙(vemurafenib)에 저항성이다. 이 환자 유래의 PDC는 베무라페닙에 대한 10 μM을 초과하는 IC50을 갖는 것으로 나타나 이 환자의 베무라페닙에 대한 저항성을 반영하였다. PDC#042 는 간세포암을 갖는 환자로부터 수집되었으며, 이 환자는 소라페닙(sorafenib) 에 대하여 저항성을 갖는 환자이며, 베무라페닙에 대해 2.0 μM 이상의 IC50을 갖는다. PDC#51 및 PCD#76은 간세포암을 갖는 환자에 소라페닙을 처리하기 전의 시료로부터 수집하였고, 이 환자들은 나중에 4달을 초과하는 소라페닙 처리 후에 질병이 완화되었다. 이들 두 개의 간세포암 환자 유래 PDC 에서 소라페닙에 대한 IC50 값은 2.0 μM 이하로 확인되었다. As shown in Table 3, PDC # 001 exhibited an IC 50 of 1.1 μM and was sensitive to lapatinib, which was reflected in the corresponding PDC. PDC # 014 was generated from samples collected from patients with BRAFV600E (+) melanoma, which is resistant to vemurafenib. This patient-derived PDC appears to have an IC 50 of more than 10 μM for bemura-penip, reflecting the patient's resistance to bemura-penip. PDC # 042 was collected from patients with hepatocellular carcinoma, the patient is resistant to sorafenib and has an IC 50 of 2.0 μM or greater for bemurafenid. PDC # 51 and PCD # 76 were collected from samples prior to treatment with sorapanib in patients with hepatocellular carcinoma, and these patients were later alleviated after treatment with sorapenib in excess of 4 months. The IC 50 value for sorafenib in these two PDCs derived from HCC patients was found to be less than 2.0 μM.

이와 같은 결과는 환자 유래 세포인 PDC가 암 환자의 약물에 대한 임상적 반응을 정확하게 예측할 수 있으며, 이를 환자의 약물에 대한 민감성 또는 저항성을 확인하는데 유용하게 이용할 수 있음을 나타낸다. These results indicate that PDC, which is a patient-derived cell, can accurately predict the clinical response to drugs in cancer patients and can be usefully used to confirm the sensitivity or resistance of the patient to drugs.

실시예Example 3. PDC 및 PDC로 제조된  3. PDCs and PDCs PDXPDX 의 유전적, 조직학적 특성 확인 Of genetic and histological features

개념 입증 연구(proof-of-concept study)로서, RAS가 증폭된 위암을 환자로부터 복수로부터 얻은 PDC 를 이용하여 확인하였다. 일차 종양 세포 및 PDC의 조직학적 특성 교를 위하여 H&E, CK7, 및 CK20 염색을 수행하였으며, 그 결과를 도 4의 (A) 에 나타내었다. As a proof-of-concept study, RAS confirmed amplified stomach cancer using PDCs obtained from a plurality of patients. H & E, CK7, and CK20 staining were performed for histological characterization of primary tumor cells and PDC, and the results are shown in FIG. 4 (A).

도 4의 (A)에 나타낸 바와 같이 염색 후 현미경을 통해 확인한 일차 종양 세포 및 PDC의 조직학적 특성은 유사한 것으로 확인되었다. As shown in Fig. 4 (A), the histological characteristics of primary tumor cells and PDCs identified through microscopy after staining were confirmed to be similar.

PDC 가 PDX 모델로 전환될 수 있는지 여부를 평가하기 위하여 NSG 마우스에 이들 PDC를 이식하여 PDX 모델을 제조하였다. 보다 구체적으로 실시예 1에서 제조되고 동결유지하였던 PDC를 해동하고 이의 동결 배지를 제거한 후 T75 플라스크에 이동시킨 후 약 80%의 컨플루언스에 도달할 때까지 세포를 3-7일 동안 RPMI/10% FBS에서 성장시켰다. 세포를 수확하고 계수한 후 5,106 세포를 NSG 마우스(Jackson Laboratories) 로 주입하였다. 주입 후 25-85일 후 종양이 발달하였으며, 이들 종양들이 외식하였고 종양의 살아있는 부분을 조각화 한 후 암컷 NMRI nu/nu mice (Harlan Laboratories)에 이식하였다. 이러한 과정을 연속적인 계대의 각각의 모델을 위하여 반복하였다. 각 계대로부터 FFPE(formalin-fixed, Paraffin-embedded)을 준비하고 종양 절편을 H&E로 염색하였다. 절편을 Hamamatsu slide scanner로 스캔하고 이미지를 분석하였다. 제조된 PDC 이종이식 모델의 계대수에 따른 조직학적 특성을 분석하고 이를 도 4(B)에 나타내었다. To evaluate whether the PDC could be converted to the PDX model, the PDX model was prepared by implanting these PDCs in an NSG mouse. More specifically, the PDC prepared and frozen in Example 1 was thawed and its freezing medium was removed. After the frozen medium was removed, the cells were transferred to a T75 flask and the cells were incubated for 3-7 days in RPMI / 10 % FBS. After harvesting and counting the cells, 5,106 cells were injected into NSG mice (Jackson Laboratories). Tumors were developed 25-85 days after injection and these tumors were eaten out and the living parts of the tumors were fragmented and transplanted into female NMRI nu / nu mice (Harlan Laboratories). This process was repeated for each model of successive passages. FFPE (formalin-fixed, Paraffin-embedded) was prepared from each passage and tumor sections were stained with H & E. The sections were scanned with a Hamamatsu slide scanner and images were analyzed. Histological characteristics of the prepared PDC xenotransplantation model according to the number of passages were analyzed and shown in Fig. 4 (B).

다양한 종양 세포의 유전적 특징을 반영할 수 있는 지 여부를 확인하기 위하여, 우리는 일차 종양(P0), P1세포, P3 세포 및 P2 세포로부터 유래된 PDX 의 다양한 대립 형질 빈도를 비교하였고 그 결과를 도 4의 (C) 및 (D) 에 나타내었다. To confirm whether the genetic characteristics of various tumor cells could be reflected, we compared the various allelic frequencies of PDX from primary tumors (P0), P1 cells, P3 cells and P2 cells, 4 (C) and 4 (D).

도 4의 (C) 및 (D) 에 나타낸 바와 같이 세 개의 시료 (P0, P1 및 P2) 는 높은 연관도 (0.99-1) 을 나타냈으며, 확인된 변이체의 수는 유사하였다 (20 내지 27). PDX 는 많은 변이체 (100 초과) 를 나타내었으며, 다른 시료와 관련하여 낮은 연관도를 갖는 것으로 나타났다 (0.6-0.8). 도 4의 (D)에 나타낸 바와 같은 4개 시료의 교집합으로 확인된 총 14개의 위치는 dbSNP 의 위치로 알려져 있고, 평균 대립 빈도는 0.77이다. P0 내지 P2 변이체 교집합의 수는 17이다. BRAF, PDGFA, 및 ZHX2은 오직 P0에서만 확인되었다. dbSNP (rs55932048) 이 빈도 0.6으로 ZHX2 에서 검출되었다. 인트론성 변이체 (chr7.hg19:g.140481514A>G) 를 가진 BRAF 는 COSMIC (stomach = 11, large intestine = 6953) 에서 발견되었고, PDGFA 는 COSMIC (stomach = 32, large intestine = 26)에서 미스센스 돌연변이 (p.I670V) 를 가지고 있다. As shown in Figures 4 (C) and 4 (D), the three samples (P0, P1 and P2) showed a high degree of association (0.99-1) and the number of identified variants was similar (20-27) . PDX exhibited many variants (> 100) and had a low association with other samples (0.6-0.8). A total of 14 positions identified by the intersection of the four samples as shown in Figure 4 (D) are known as dbSNP locations, with an average confliction frequency of 0.77. The number of P0 to P2 mutation intersections is 17. BRAF, PDGFA, and ZHX2 were identified only at PO. dbSNP (rs55932048) was detected in ZHX2 at a frequency of 0.6. BRAF with intronic variant (chr7.hg19: g.140481514A> G) was found in COSMIC (stomach = 11, large intestine = 6953) and PDGFA was found in COSMIC (stomach = 32, large intestine = 26) (p. 1670V).

도 4E에 나타낸 바와 같이, BRAF 및 PDGFA 의 변이체는 그들을 동정하기 어렵게 하는 낮은 대립 빈도 (약 0.15) 를 갖는다. 추가적으로, 도 4E에 나타낸 바와 같이 모든 시료에 대하여 BRAF 및 PDGFA 의 위치 상태 (position status) 연구하였을때 변이체 대립 빈도는 P0 보다 P2 낮은 것으로 나타났다. 예를 들면, P0에 나타나는 PDGFA p.I670V 는 P2에서는 확인되지 않았다. 게다가 BRAF 및 PDGFA 의 변이체는 PDX에서 확인되지 않았다. 상기와 같은 결과를 통해, PDC 의 P0 내지 P2는 공통적 유전적 변이 특징 관련도가 PDX 보다 높고, PDC 가 환자의 유전적, 조직학적 특성을 더욱 효과적으로 반영하며, 약물에 대한 임상적 반응성 예측에 더욱 적합한 시료임을 확인하였다. As shown in Fig. 4E, variants of BRAF and PDGFA have a low allele frequency (about 0.15) which makes them difficult to identify. In addition, as shown in FIG. 4E, when the position status of BRAF and PDGFA was studied for all samples, the mutant allele frequency was found to be P2 lower than P0. For example, the PDGFA p.I670V at P0 was not identified at P2. In addition, variants of BRAF and PDGFA were not identified in PDX. These results indicate that the P0 to P2 of PDCs have a higher common genetic mutation feature association ratio than the PDX and that the PDC more effectively reflects the genetic and histological characteristics of the patient and is more likely to predict the clinical reactivity to the drug It was confirmed that it is a suitable sample.

실시예Example 4. 위암 PDC 및  4. Stomach cancer PDC and TCGATCGA // ACRGACRG 집단 사이의 유전자 발현의 비교 Comparison of gene expression between groups

PDC의 유전자 발현에서의 변화 관련성을 연구하기 위하여, 3개의 다른 데이터베이스를 통합하였다 (TCGA 위암, Asian Cancer Research Group [ACRG] 위암, 및 실시예 1의 PDC 집단). ACRG 및 위암 PDC 시료는 한국 환자로부터 얻었으며, TCGA 데이터셋트의 시료는 다수의 에스닉 군으로부터 얻었다. TCGA는 정상 시료를 포함하기 위한 데이터 셋트이다 (N=33). 크로스-플랫폼 유전자 발현의 비교를 위하여, 메타-분석을 도 5A에 나타낸 워크플로우를 이용하여 수행하였다. 종양-집단 유사성을 다른 집단간 시료 관련성으로부터 추론하였다. 상관관계 분포 (Correlation distribution)를 도 5B에 나타내었다.Three different databases were integrated (TCGA stomach cancer, Asian Cancer Research Group [ACRG] stomach cancer, and PDC group of Example 1) to study changes in gene expression of PDCs. The ACRG and stomach cancer PDC samples were obtained from Korean patients and the TCGA data set samples were obtained from multiple ethnic groups. TCGA is a data set for containing normal samples (N = 33). For comparison of cross-platform gene expression, a meta-analysis was performed using the workflow shown in Figure 5A. Tumor - group similarity was inferred from sample interrelationships between different groups. The correlation distribution is shown in Figure 5B.

도 5B에 나타낸 바와 같이, 집단 사이의 모든 시료의 상관관계가 매우 유사한 것을 확인되었다. ACRG 및 TCGA 사이의 평균 상관관계는 0.69인 반면, ACRG 및 PDC 위암 사이의 상관관계는 0.73이고, ACRG 및 위암을 제외한 PDC(PDC others) 사이에서는 0.7이였다. As shown in FIG. 5B, it was confirmed that the correlation between all samples between groups was very similar. The mean correlation between ACRG and TCGA was 0.69, while the correlation between ACRG and PDC gastric cancer was 0.73 and between ACRG and PDC (PDC others) except stomach cancer was 0.7.

세개의 데이터셋트 시료의 이차원적 플롯을 principal component analysis을 통해 나타내었다. 시료는 TCGA GC, TCGA 정상, ACRG, PDC GC 및 PDC others 를 포함하며, 결과를 도 5C에 나타내었다. PDC GC 시료를 TCGA GC 및 ACRG GC 집단 모두와 함께 메타 분석 후 클러스터화 하고 결과를 도 5D에 나타내었다. ACRG 및 PDC GC 인 한국 환자시료를 PDC plot core 에서 중앙화(centralized) 하였고 TCGA 집단보다 덜 분산되어 있는 것으로 나타났다. 또한 도 5 (E) 에 나타낸 바와 같이, 위암의 발암유전자로 알려진 4개의 주요 다른 발현의 연구에서, MET (p = 0.00) 및 ERBB2 (p = 0.00)이 정상과 종양 조직 사이에서 다르게 발현되어 있음을 확인하였다. 이를 종합하면, 위암 PDC 집단의 유전자 발현 프로파일은 큰 게놈 집단 TCGA 및 ACRG 와 매우 상관관계를 갖는 것을 확인하였다. Two-dimensional plots of the three dataset samples are presented through principal component analysis. The samples included TCGA GC, TCGA normal, ACRG, PDC GC, and PDC others, and the results are shown in FIG. 5C. PDC GC samples were clustered after meta-analysis with both TCGA GC and ACRG GC populations and the results are shown in FIG. 5D. The Korean patient samples, ACRG and PDC GC, were centralized in the PDC plot core and less distributed than the TCGA population. Also, as shown in Fig. 5 (E), in the study of four major different expressions known as gastric carcinogenesis genes, MET (p = 0.00) and ERBB2 (p = 0.00) were differentially expressed between normal and tumor tissues Respectively. Taken together, we confirmed that the gene expression profile of the gastric cancer PDC population is highly correlated with the large genome population TCGA and ACRG.

Claims (8)

1) 암 환자로부터 삼출액을 얻는 단계;
2) 상기 삼출액을 500 내지 2000rpm으로 원심분리하는 단계;
3) 원심분리된 세포를 배지에서 재부유시키고 암세포를 분리하는 단계;
4) 분리된 암세포를 1 내지 10 계대(passage) 배양하는 단계; 를 포함하는 환자 유래 세포(Patient-Derived Cell) 의 제조방법.
1) obtaining an effusion from a cancer patient;
2) centrifuging the effluent at 500 to 2000 rpm;
3) resuspending the centrifuged cells in the medium and isolating the cancer cells;
4) culturing the isolated cancer cells 1 to 10 passages; Gt; (Patient-Derived Cell). ≪ / RTI >
제1항에 있어서, 상기 삼출액은 복수 삼출액, 흉막 삼출액 및 심낭 삼출액으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 환자 유래 세포의 제조방법.
The method of claim 1, wherein the exudate is at least one selected from the group consisting of multiple exudates, pleural effusion, and pericardial effusion.
제1항에 있어서, 상기 암은 전이성 암인 것을 특징으로 하는, 환자 유래 세포의 제조방법.
The method of claim 1, wherein the cancer is a metastatic cancer.
제1항에 있어서, 상기 암은 위암, 폐암, 결장암, 간세포 암종, 멜라노마, 췌장암, 사카로마, 비소성 폐암, 두경부암, 신장암, 담낭암 및 비뇨기암으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인, 환자 유래 세포의 제조방법.
The method of claim 1, wherein the cancer is at least one selected from the group consisting of gastric cancer, lung cancer, colon cancer, hepatocellular carcinoma, melanoma, pancreatic cancer, squamoma, non-focal lung cancer, head and neck cancer, kidney cancer, gallbladder cancer, Gt;
제1항에 있어서, 상기 환자 유래 세포는 암환자의 조직학적 특징, 유전학적 특징, 항암제 내성을 반영하는 것을 특징으로 하는, 환자 유래 세포의 제조방법.
The method according to claim 1, wherein the patient-derived cells reflect histological characteristics, genetic characteristics, and anticancer drug resistance of the cancer patient.
1) 제1항의 제조방법을 통해 제조된 환자 유래 세포(PDC)에 후보 항암제를 처리하는 단계; 및
2) 환자 유래 세포에서 항암제 처리에 따른 항암 효과를 확인하는 단계; 를 포함하는 환자 맞춤형 항암제의 스크리닝 방법.
1) treating a patient-derived cell (PDC) produced by the method of claim 1 with a candidate anticancer agent; And
2) confirming the anticancer effect according to the anticancer treatment in the patient-derived cells; A method for screening a patient-customized anticancer agent.
제1항의 제조방법을 통해 제조된 환자 유래 세포(PDC)를 포함하는 환자 맞춤형 항암제 스크리닝용 키트.
A patient-specific anticancer drug screening kit comprising patient-derived cells (PDC) prepared by the method of claim 1.
제1항의 제조방법을 통해 제조된 환자 유래 세포(PDC)의 변이를 분석하는 단계; 를 포함하며, 상기 변이는 유전체 단위 반복 변이(copy number variations, CNV), 점 돌연변이, 인트론성 변이, 미스센스 돌연변이, 프레임쉬프트(frame shift) 돌연변이, 단일염기변이 및 InDel 변이로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 암 환자의 세포 변이에 대한 정보를 제공하는 방법.Analyzing the variation of the patient-derived cells (PDC) produced by the method of claim 1; Wherein the mutation is selected from the group consisting of genomic unit variation variations (CNV), point mutations, intronic mutations, mismatch mutations, frame shift mutations, single base mutations and InDel mutations. Methods for providing information on cell mutations in cancer patients, more than species.
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