KR20170143317A - Antibodies to recombinant Fag e 3 buckwheat allergen and a method for quantitative detection of Fag e 3 - Google Patents

Antibodies to recombinant Fag e 3 buckwheat allergen and a method for quantitative detection of Fag e 3 Download PDF

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Abstract

The present invention relates to a quantitative analysis method for Fag e 3 allergens of Fagopyrum esculentum. According to the present invention, the quantitative analysis method is used to detect and measure the quantity of the recombined Fag e 3 allergens by using a monoclonal antibody (or hybridoma), thereby being useful for monitoring contamination of Fagopyrum esculentum in food products while enabling standardization of the allergens of Fagopyrum esculentum. The quantitative analysis method can be used to complement current food allergy labeling systems. According to the present invention, a two-site enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) system can be used to contribute to the standardization of Fagopyrum esculentum extracts as well as detecting the allergens of Fagopyrum esculentum in an environment and in a food product.

Description

메밀 알레르겐 Ｆａｇ ｅ ３ 에 대한 항체 및 이를 이용한 메밀 알레르겐 Ｆａｇ ｅ ３ 정량분석방법{Antibodies to recombinant Ｆａｇ ｅ ３ buckwheat allergen and a method for quantitative detection of Ｆａｇ ｅ ３}Antibodies against buckwheat allergen Fag e 3 and methods for quantifying buckwheat allergen Fag e 3 using the same and methods for quantitative analysis of buckwheat allergen Fag e 3 [

본 발명은 메밀 알레르겐 Fag e 3 에 대한 항체 및 이를 이용한 메밀 알레르겐 Fag e 3 정량분석방법에 관한 것이다.The present invention relates to an antibody against buckwheat allergen Fag e 3 and a method for quantifying buckwheat allergen Fag e 3 using the same.

메밀은 아시아 국가들에서 인기 있는 음식이다. 서구 국가에서도 메밀의 무(無)글루텐 특성 덕분에 메밀 소비가 최근 늘어나고 있다[1]. 하지만 메밀은 피자나 파스타 같은 이탈리아 음식에서 숨겨진 알레르겐 항원으로 밝혀지고 있다[2]. 한국에서는 학생들의 (6세에서 15세) 2.1% (2,054명 중 44명)가 메밀 알러지가 있으며[3], 메밀은 과민증의 주요 원인이 되고 있다(2.9%, 4/138)[4].Buckwheat is a popular dish in Asian countries. Buckwheat consumption has recently been increasing in western countries due to the non-gluten nature of buckwheat [1]. But buckwheat has been found to be a hidden allergen in Italian foods such as pizza and pasta [2]. In Korea, 2.1% of students (6 to 15 years of age) (44 of 2,054) have buckwheat allergies [3] and buckwheat is the main cause of hypersensitivity (2.9%, 4/138) [4].

식료품에서 알레르겐을 표시하는 것은 중요한 일이며, 대부분의 선진국들은 법적으로 일반 식품 알레르겐을 표시할 것을 요구하고 있다. 하지만, 국제식품규격위원회(Codex Alimentarius Commission)의 권고안에도 불구하고 관련법은 나라마다 다르다[5]. 메밀은 한국에서는 식품 알러지의 주요 원인 중 하나이며, 한국 식약청은 식품에서 메밀성분의 표시를 의무화하도록 했다(공식 발표 2015-7-7). 그러나 표시로는 특정 알레르겐의 내용에 대한 자세한 정보를 알 수 없으며, 식료품에서 이들 알러지를 일으키는 분자들의 농축 정도를 아는 것이 도움이 될 것이다.It is important to label allergens in foodstuffs, and most developed countries are legally required to label food allergens. However, despite the recommendations of the Codex Alimentarius Commission, the laws vary from country to country [5]. Buckwheat is one of the major causes of food allergies in Korea, and the Korea Food and Drug Administration has mandated the labeling of buckwheat ingredients in food (Official Announcement 2015-7-7). However, the label does not provide detailed information on the content of a particular allergen, and it may be helpful to know the concentration of molecules that cause allergies in the food.

다양한 9-, 16-. 19-, 24-kDa 단백질 알레르겐은 메밀의 주된 알레르겐이다[6]. 비실린(vicilin)과 상동인(homologous) 19-kDa의 알레르겐은 무증상 피실험자들보다는 알러지 환자들에서 더 특이적으로 인지된다. 재조합 19-kDa 알레르겐에 대한 특이적 IgE 측정은 통메밀 추출물에 대한 측정보다 더 나은 진단적 가치를 가진다[7]. 상기 19-kDa 알레르겐은 면역학회 국제연합의 알레르겐 명명 하위 위원회의 가이드라인에 따라, Fag e 3으로 지정되었다.Various 9-, 16-. The 19-, 24-kDa protein allergen is the main allergen of buckwheat [6]. Vicilin and homologous 19-kDa allergens are more specifically recognized in allergic patients than in asymptomatic subjects. Specific IgE measurements for recombinant 19-kDa allergens have better diagnostic value than measurements for barley buckwheat extract [7]. The 19-kDa allergen was designated Fag e 3 according to the Guidelines of the Allergen Nomenclature Subcommittee of the Immunization Society of the United Nations.

본 발명자들은 이러한 재조합 Fag e3에 대한 단일클론성항체(mAbs)를 생성하여, Fag e3 알레르겐 농도를 정량화하는 방법을 개발하였다.The inventors have developed a method for quantifying Fag e3 allergen levels by generating monoclonal antibodies (mAbs) to such recombinant Fag e3.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.

본 발명자들은 신규한 메밀 알레르겐 검출 시스템을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 그룹 3 메밀 알레르겐인 Fag e 3 의 정량을 위한 two-site ELISA 시스템을 개발하였다. 재조합 Fag e 3에 대한 단일클론항체를 제작하였고 이를 이용하여 메밀 알레르겐인 Fag e 3 를 검출한계 0.8 μg/mL까지 정량분석할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors have made extensive efforts to develop a novel buckwheat allergen detection system. As a result, we developed a two-site ELISA system for the quantification of Fag e 3, a group 3 buckwheat allergen. A monoclonal antibody against recombinant Fag e 3 was prepared and confirmed that Fag e 3, a buckwheat allergen, could be quantitatively analyzed to a detection limit of 0.8 μg / mL. Thus, the present invention was completed.

따라서 본 발명의 목적은 메밀 Fag e 3 알레르겐의 정량분석방법을 제공하는 데 있다. Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for quantitative analysis of buckwheat Fag e 3 allergen.

본 발명의 다른 목적은 메밀 Fag e 3 알레르겐의 정량분석키트를 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to provide a quantitative assay kit for buckwheat Fag e 3 allergen.

본 발명의 또 다른 목적은 하이브리도마 세포주(기탁번호: KCLRF-BP-00359) 및 하이브리도마 세포주(기탁번호: KCLRF-BP-00360)를 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a hybridoma cell line (accession number: KCLRF-BP-00359) and a hybridoma cell line (accession number: KCLRF-BP-00360).

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다. Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 메밀 Fag e 3 알레르겐의 정량분석방법을 제공한다: (a) 시료 내 Fag e 3 알레르겐을 해리(dissociation)시키는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 시료와 Fag e 3에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 접촉시키는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)의 시료로부터 Fag e 3 를 정량분석하는 단계.According to one aspect of the present invention, the present invention provides a method for the quantitative analysis of buckwheat Fag e 3 allergen comprising the steps of: (a) dissociating Fag e 3 allergen in a sample; (b) contacting the sample of step (a) with an antibody or antigen-binding fragment thereof against Fag e3; And (c) quantitatively analyzing Fag e 3 from the sample of step (b).

본 발명자들은 신규한 메밀 알레르겐 검출 시스템을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 그룹 3 메밀 알레르겐인 Fag e 3 의 정량을 위한 two-site ELISA 시스템을 개발하였다. 재조합 Fag e 3에 대한 단일클론항체를 제작하였고 이를 이용하여 메밀 알레르겐인 Fag e 3 를 검출한계 0.8 μg/mL까지 정량분석할 수 있음을 확인하였다.As a result of intensive research to develop a new buckwheat allergen detection system, the present inventors have developed a two-site ELISA system for quantifying Fag e 3, a group 3 buckwheat allergen. A monoclonal antibody against recombinant Fag e 3 was prepared and it was confirmed that Fag e 3, a buckwheat allergen, could be quantitatively analyzed to a detection limit of 0.8 μg / mL.

메밀(Buckwheat)은 과민항원항체반응인 아나필락시스(anaphylaxis)의 주요 원인이며, Fag e 3은 메밀에서 주요한 알레르겐이다. 그러나 Fag e 3 의 정량을 위한 면역분석시스템은 아직 개발된 바 없다. 이에, 본 발명자들은 재조합 Fag e 3에 대한 단일클론항체를 이용하는 two-site ELISA를 개발하였고, 이를 전체 메밀 추출물에서 Fag e 3을 정량하는데 적용하였다. 본 발명자들은 4개 클론의 단클론항체를 제작하였으며, 이들은 메밀 뿐만 아니라 땅콩과 호두에서도 비실린(vicilin) 알레르겐을 인지하였다. 이러한 항체를 이용한 ELISA는 1% SDS 첨가하고 가열하여 알레르겐이 해리된 후 전체 추출물에서 Fag e 3를 정량하는 것이 가능하였다. 전체 메밀 추출물의 약 12%가 Fag e 3 였다. 본 발명에서 개발된 two-site ELISA의 검출한계는 0.8 μg/mL 였다. Buckwheat is the major cause of the hypersensitive antigen antibody response, anaphylaxis, and Fag e 3 is the major allergen in buckwheat. However, an immunoassay system for the quantification of Fag e 3 has not yet been developed. Thus, we developed a two-site ELISA using recombinant Fag e 3 monoclonal antibody and applied it to quantify Fag e 3 in whole buckwheat extract. The inventors produced monoclonal antibodies of four clones, which recognized not only buckwheat but also vicilin allergens in peanuts and walnuts. ELISA using this antibody was able to quantify Fag e 3 in whole extract after 1% SDS addition and heating to dissociate the allergen. Approximately 12% of the total buckwheat extract was Fag e 3. The detection limit of the two-site ELISA developed in the present invention was 0.8 μg / mL.

본 발명의 방법을 각각의 단계 별로 상세하게 설명하면 다음과 같다: The method of the present invention will be described in detail in each step as follows:

단계 (a) : 알레르겐 해리(dissociation)Step (a): Allergen dissociation

우선, 시료 내 Fag e 3 알레르겐을 해리(dissociation)시킨다. 본 발명의 정량분석방법에 적용되는 시료로서는 생체시료나 환경시료, 식품으로부터의 추출물 등이 있다.First, the Fag e 3 allergen in the sample is dissociated. Examples of the sample to be applied to the quantitative analysis method of the present invention include biological samples, environmental samples, and food extracts.

본 발명에서 용어 “해리(dissociation)”는 시료 내 Fag e 3 알레르겐이 항체에 의해 인지될 수 있는 적절한 구조 또는 상태가 되도록 시료에 물리적 또는 화학적 처리를 하는 것을 의미한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 해리는 열 불활성화(heat treatment) 처리를 의미하고, 상기 시료에 계면활성제를 첨가한 후 가열하여 실시할 수 있다. 첨가 가능한 계면활성제는 공지된 다양한 재료를 이용할 수 있으며, 예컨대 Triton X, Nonidet P40, 또는 SDS 등을 이용할 수 있다.The term " dissociation " in the present invention means to subject a sample to a physical or chemical treatment so that the Fag e 3 allergen in the sample is in a suitable structure or condition that can be recognized by the antibody. According to one embodiment of the present invention, the dissociation means a heat treatment treatment, and may be performed by adding a surfactant to the sample and then heating. As the surfactant that can be added, various known materials can be used, and for example, Triton X, Nonidet P40, SDS or the like can be used.

본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 단계 (a)는 시료에 계면활성제를 처리한 후 95-110℃에서 5-10분간 가열함으로써 실시하거나, 100℃에서 5분간 가열함으로써 실시할 수 있다. According to a specific embodiment of the present invention, the step (a) may be carried out by treating the sample with a surfactant, heating the mixture at 95-110 ° C for 5-10 minutes, or heating the mixture at 100 ° C for 5 minutes.

한편, 상기 단계 (a)의 시료는 환원 또는 비환원 조건 하에서 추출된 것을 이용할 수 있으나, 보다 적절한 시료는 비환원 조건 하에서 추출된 시료이다.On the other hand, the sample of the step (a) can be extracted under the reducing or non-reducing condition, but a more suitable sample is the sample extracted under the non-reducing condition.

본 발명에서 용어 “비환원 조건”이란, 환원제를 첨가하지 않은 상태를 의미한다. 예컨대, 2-머캅토에탄올 등을 첨가하지 않은 조건하에서 시료를 얻는 것이다. 비환원 조건은 단백질의 3차 구조를 유지할 수 있도록 이황화물다리 (disulfide bridge)를 파괴하지 않은 상태를 의미한다.The term " non-reducing condition " in the present invention means a state in which no reducing agent is added. For example, a sample is obtained under the condition that 2-mercaptoethanol or the like is not added. Non-reducing conditions mean that the disulfide bridge is not destroyed to maintain the tertiary structure of the protein.

단계 (b) : 시료와 Fag e 3 항체의 접촉Step (b): Contact between the sample and the Fag e 3 antibody

이어, 상기 단계 (a)의 시료와 Fag e 3에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 접촉시킨다.Next, the sample of step (a) is contacted with the antibody against Fag e3 or an antigen-binding fragment thereof.

본 명세서에서, 사용되는 용어 “항체(antibody)”는 Fag e 3 에 대한 특이 항체로서, 메밀의 Fag e 3 단백질에 대해 특이적으로 결합하며, 완전한 항체 형태뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편을 포함한다. As used herein, the term " antibody ", as used herein, refers to a specific antibody to Fag e 3 that specifically binds to the Fag e 3 protein of buckwheat and includes not only the complete antibody form but also antigen binding fragments of the antibody molecule do.

완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다 (Cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, M. J., Ed., Chapter 45, pp. 41-50, W. B. Saunders Co. Philadelphia, PA(1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 2nd Ed., Chapter 4,pp. 45-65, sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984)). A complete antibody is a structure having two full-length light chains and two full-length heavy chains, each light chain linked by a disulfide bond with a heavy chain. The heavy chain constant region has gamma (gamma), mu (mu), alpha (alpha), delta (delta) and epsilon (epsilon) types and subclasses gamma 1 (gamma 1), gamma 2 ), Gamma 4 (gamma 4), alpha 1 (alpha 1) and alpha 2 (alpha 2). The constant region of the light chain has the kappa and lambda types (Cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, MJ, Ed., Chapter 45, pp. 41-50, WB Saunders Co. Philadelphia, PA (1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 2nd Ed., Chapter 4, pp. 45-65, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984)).

항체 분자의 항원 결합 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다. 본 발명에서 항체는 바람직하게는 완전한 항체 형태이고, IgG1 형태이다.An antigen binding fragment of an antibody molecule means a fragment having an antigen binding function and includes Fab, F (ab ') 2, F (ab') 2 , Fv and the like. Fabs in the antibody fragment have one antigen-binding site in a structure having a variable region of a light chain and a heavy chain, a constant region of a light chain, and a first constant region (C H1 ) of a heavy chain. Fab 'differs from Fab in that it has a hinge region that contains at least one cysteine residue at the C-terminus of the heavy chain C H1 domain. The F (ab ') 2 antibody is produced when the cysteine residue of the hinge region of the Fab' forms a disulfide bond. Recombinant techniques for producing Fv fragments with minimal antibody fragments having only heavy chain variable regions and light chain variable regions are described in PCT International Publication Nos. WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086, WO 88/09344. The double-chain Fv is a non-covalent bond, and the variable region of the heavy chain and the light chain variable region are connected to each other. The single-chain Fv generally shares the variable region of the heavy chain and the variable region of the short chain through the peptide linker Or directly connected at the C-terminus to form a dimer-like structure like the double-stranded Fv. Such an antibody fragment can be obtained using a protein hydrolyzing enzyme (for example, a Fab can be obtained by restriction of the whole antibody to papain, and F (ab ') 2 fragment can be obtained by cleavage with pepsin) Can be produced through recombinant DNA technology. In the present invention, the antibody is preferably in the form of a complete antibody and in the form of IgG1.

본 발명의 항체는 단일클론 항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 Fvs(scFV), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab')단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 그리고 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 항체는 단일클론 항체이다. 용어 “단일클론 항체”는, 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체분자를 의미하며, 단일클론 항체는 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다. 하기의 실시예에 기재된 바와 같이, 유전적 재조합 방법으로 제공될 수 있는 본 발명의 항체는 핵산 서열과 아미노산 서열이 동일하므로 단일클론 항체라 할 수 있다.The antibodies of the present invention can be used in combination with monoclonal antibodies, multispecific antibodies, human antibodies, humanized antibodies, chimeric antibodies, short chain Fvs (scFV), single chain antibodies, Fab fragments, F (ab ') fragments, disulfide- And anti-idiotypic (anti-Id) antibodies, and epitope-binding fragments of such antibodies, and the like. According to one embodiment of the present invention, the antibody is a monoclonal antibody. The term " monoclonal antibody " refers to a single molecule composition of antibody molecules obtained in a substantially identical population of antibodies, wherein the monoclonal antibody exhibits a single binding specificity and affinity for a particular epitope. As described in the following examples, the antibody of the present invention, which can be provided by a genetic recombination method, can be referred to as a monoclonal antibody because the nucleic acid sequence and amino acid sequence are the same.

본 발명에 따르면, Fag e 3에 대한 마우스의 단일클론성 항체는 2주 간격을 두고 세 차례에 걸쳐 재조합 Fag e 3으로 면역성을 갖게 한 BALB/c 마우스의 비장 세포와 골수종 세포(Sp 2.0-Ag 14)를 결합하여(fusion) 생성하였다. 재조합 Fag e 3에 대항하는 항체를 생성한 하이브리도마는 ELISA 로 스크리닝하였다.According to the present invention, mouse monoclonal antibodies against Fag e 3 were prepared from spleen cells and myeloma cells (Sp 2.0-Ag < (R) >) of BALB / c mice immunized with recombinant Fag e 3 three times at intervals of 2 weeks 14) were produced by fusion. Hybridomas producing antibodies against recombinant Fag e 3 were screened by ELISA.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 항체는 하이브리도마 세포(기탁번호: KCLRF-BP-00359 또는 KCLRF-BP-00360)에 의하여 생산된다. 상기 하이브리도마 세포는 한국세포주연구재단에 2016년 03월 09 일자로 기탁되었다. 상기 하이브리도마 세포에 의해 생산된 항체는 Fag e 3 를 인지하며, 2량체(dimerized) Fag e 3 를 보다 특이적으로 인지한다. According to one embodiment of the present invention, the antibody of the present invention is produced by hybridoma cells (Accession No .: KCLRF-BP-00359 or KCLRF-BP-00360). The hybridoma cells were deposited at the Korean Cell Line Research Foundation on Mar. 09, 2016. The antibody produced by the hybridoma cells recognizes Fag e 3 and more specifically recognizes dimerized Fag e 3.

한편, 본 발명의 항체는 비실린-유사(vicilin-like) 알레르겐을 추가적으로 인지할 수 있다. 비실린-유사(vicilin-like) 알레르겐 Ara h 1 (64 kDa) 또는 Jug r 2 (44 kDa) 등이 있으며, 또한 검은 월넛(Jug n 2), 렌틸(Len c 1), 완두콩(Pis s 1), 캐슈(Ana o 1), 헤이즐(Cor a 1), 참깨(Sesi 3)에서도 나타난다.On the other hand, the antibodies of the present invention may additionally recognize vicilin-like allergens. (64 kDa) or Jug r 2 (44 kDa), and black walnut (Jug n 2), lentil (Len c 1), peas (Pis s 1 ), Cashews (Ana o 1), hazel (Cor a 1) and sesame seeds (Sesi 3).

단계 (c) : Fag e 3 정량분석Step (c): Quantitative analysis of Fag e 3

마지막으로, 상기 단계 (b)의 시료로부터 Fag e 3 를 정량분석한다.Finally, Fag e 3 is quantitatively analyzed from the sample of step (b).

본 발명의 정량분석방법은 공지된 다양한 면역분석방법을 사용할 수 있으며, 본 발명의 일 구현예에 따르면, Fag e 3는 ELISA 방법으로 정량분석할 수 있다. ELISA 방법을 이용할 경우 분석은 마이크로플레이트(microplate) 상에서 이루어진다.The quantitative analysis method of the present invention can use various well-known immunoassay methods. According to one embodiment of the present invention, Fag e 3 can be quantitatively analyzed by ELISA method. When using the ELISA method, the analysis is carried out on a microplate.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 ELISA 는 포획항체로서 하이브리도마 세포(기탁번호: KCLRF-BP-00359) 에 의하여 생산된 항체, 및 검출항체로서 하이브리도마 세포(기탁번호: KCLRF-BP-00360)에 의하여 생산된 항체를 이용하여 실시한다.According to one embodiment of the present invention, the ELISA comprises an antibody produced by a hybridoma cell (accession number: KCLRF-BP-00359) as a capture antibody and a hybridoma cell (accession number: KCLRF-BP -00360). ≪ / RTI >

본 발명의 ELISA 방법은 two-site ELISA로서 이에 따른 Fag e 3 알레르겐의 검출한계은 0.8μg/ml 이다. The ELISA method of the present invention is a two-site ELISA in which the detection limit of Fag e allergen is 0.8 μg / ml.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 ELISA 는 포획항체로서 하이브리도마 세포(기탁번호: KCLRF-BP-00359) 에 의하여 생산된 항체, 및 검출항체로서 하이브리도마 세포(기탁번호: KCLRF-BP-00360)에 의하여 생산된 항체를 이용하는 메밀 Fag e 3 알레르겐의 정량분석키트를 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided an ELISA comprising an antibody produced by a hybridoma cell (accession number: KCLRF-BP-00359) as a capture antibody and a hybridoma cell (accession number: KCLRF- BP-00360). ≪ / RTI >

본 발명의 정량분석키트는 상술한 본 발명의 정량분석방법을 이용하는 것으로서, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.The quantitative analysis kit of the present invention uses the quantitative analysis method of the present invention described above, and the description common to both of them is omitted in order to avoid the excessive complexity of the present specification.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 시료 내 Fag e 3 알레르겐에 대한 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주(기탁번호: KCLRF-BP-00359)를 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a hybridoma cell line (accession number: KCLRF-BP-00359) which produces an antibody against Fag e3 allergen in a sample.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 시료 내 Fag e 3 알레르겐에 대한 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주(기탁번호: KCLRF-BP-00360)를 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a hybridoma cell line (accession number: KCLRF-BP-00360) that produces an antibody against Fag e3 allergen in a sample.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다: The features and advantages of the present invention are summarized as follows:

(a) 본 발명은 메밀 Fag e 3 알레르겐의 정량분석방법에 관한 것이다. (a) The present invention relates to a method for quantitative analysis of buckwheat Fag e 3 allergen.

(b) 본 발명의 분석방법은 재조합 Fag e 3에 대한 단클론항체 (하이브리도마)를 이용하여 알레르겐을 검출 및 정량하는 방법으로서, 메밀 알레르겐의 표준화(standardization) 및 식품에서의 메밀 오염을 모니터링하는데 유용하게 사용될 수 있다.(b) The assay method of the present invention is a method for detecting and quantifying allergens using a monoclonal antibody (hybridoma) against recombinant Fag e 3, wherein standardization of buckwheat allergens and buckwheat contamination in food are monitored Can be usefully used.

(c) 또한 현재의 식품 알러지 표시 시스템을 보완할 수 있을 것이며, 본 발명의 two-site ELISA 시스템을 이용하여 식품과 환경에서 메밀 알레르겐의 검출뿐 아니라 메밀 추출물의 표준화에 기여할 수 있을 것이다.(c) It will also be able to supplement the current food allergy labeling system and contribute to the standardization of buckwheat extract as well as the detection of buckwheat allergens in food and environment using the two-site ELISA system of the present invention.

도 1a-1b는 재조합 Fag e 3 (5μg)의 SDS-PAGE 분석과 메밀 추출물에 대한 항체 반응결과를 나타낸다. 재조합 단백질은 환원 및 비환원 조건 하에서 15% 폴리아크릴아마이드 겔에서 분리되었다(1a). 또한, ELISA 방법으로 하이브리도마 배양상층액을 이용하여 메밀 추출물에 대해 재조합 Fag e 3 단일클론항체의 반응성을 측정했다(1b).
도 2a-2b는 단일클론항체에 의한 천연상태의 비실린 유사 알레르겐의 검출반응을 나타낸다. 추출물(10 μg)로부터 단일클론항체를 이용하여 Fag e 3과 그 상동의 알레르겐을 측정하였다. 상기 추출물은 환원(2a) 및 비환원(2b) 조건 하의 15% 겔에서 분리 후 PVDF 막으로 옮겼다. Fag e 3을 검출하기 위해 사용된 단일클론항체는 각 멤브레인하에서 나타난다. M은 분자 질량 기준, B는 메밀 추출물, P는 땅콩 추출물, W는 호두 추출물. 1H6, 2A1, 3D1 및 4H8 는 각각의 하이브리도마 세포를 의미한다.
도 3은 two-site ELISA에 의한 재조합 Fag e 3의 용량 의존적 곡선을 나타낸다. Two-site ELISA는 25 μg/ml 재조합 Fag e 3로부터 4배 희석액으로 정량화되었다. 검출한계는 0.1 μg/ml이었다.
도 4는 천연 상태의 Fag e 3 정량을 용이하게 하기 위해서 전체 메밀 추출물에 계면활성제를 적용한 결과를 보여준다. 메밀추출물 및 재조합 Fag e 3에 1% 계면활성제를 첨가하였다.
도 5a-5b는 총 메밀 추출물에서 Fag e 3의 정량결과이다. SDS의 첨가로 재조합 Fag e 3 (5a)에 대한 민감도가 감소했지만, 총 메밀 추출물(5b)에서의 천연상태의 Fag e 3 민감성은 증가했다. 검출한계는 6 μg/ml이었다 (5a). 1 mg/ml 인 메밀 추출물을 4배 희석하여 용량 의존적 곡선을 생성하였다 (5b).
도 6a-6c는 SDS를 메밀에 첨가한 이후 가열했을 때의 결과이다. 추출물 상에서 재조합 Fag e 3 (6a)와 천연상태의 Fag e 3 (6b)의 검출을 비교하였다. 가열하는 것이 ELISA의 민감도를 향상시켰다. 재조합 Fag e 3의 검출 한계는 0.8μg/ml 이었다(6c).Figures 1a-1b show SDS-PAGE analysis of recombinant Fag e 3 (5 μg) and antibody reaction to buckwheat extract. Recombinant proteins were isolated on 15% polyacrylamide gels under reducing and nonreducing conditions (1a). In addition, the reactivity of recombinant Fag e 3 monoclonal antibodies to the buckwheat extract was measured using a hybridoma culture supernatant by ELISA (1b).
Figures 2a-2b show the detection of naturally-occurring non-silylated allergens by monoclonal antibodies. Fag e 3 and its homologous allergens were measured using a monoclonal antibody from the extract (10 μg). The extract was separated from the 15% gel under reducing (2a) and non-reducing (2b) conditions and then transferred to a PVDF membrane. Monoclonal antibodies used to detect Fag e 3 appear under each membrane. M is based on molecular mass, B is buckwheat extract, P is peanut extract, and W is walnut extract. 1H6, 2A1, 3D1 and 4H8 refer to the respective hybridoma cells.
Figure 3 shows the dose dependent curves of recombinant Fag e3 by two-site ELISA. The two-site ELISA was quantified as a 4-fold dilution from 25 μg / ml recombinant Fag e 3. The detection limit was 0.1 μg / ml.
Figure 4 shows the results of applying a surfactant to the whole buckwheat extract in order to facilitate quantification of Fag e 3 in its natural state. Buckwheat extract and recombinant Fag e 3 were supplemented with 1% surfactant.
Figures 5a-5b show the results of quantitation of Fag e3 in total buckwheat extract. The addition of SDS reduced the sensitivity to recombinant Fag e 3 (5a), but increased Fag e 3 sensitivity in native buckwheat extract (5b). The detection limit was 6 μg / ml (5a). A 1-mg / ml buckwheat extract was diluted 4-fold to produce a dose-dependent curve (5b).
Figs. 6A to 6C show results obtained when SDS was added to buckwheat and then heated. The detection of recombinant Fag e 3 (6a) and native Fag e 3 (6b) on the extract was compared. Heating increased the sensitivity of the ELISA. The detection limit of recombinant Fag e 3 was 0.8 μg / ml (6c).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .

실시예Example

실험재료 및 실험방법Materials and Experiments

알레르겐 추출물Allergen extract

메밀, 호두 및 땅콩 추출물은 선행방법에 따라 준비하였다[6]. 간단히 말하면, 메밀 가루를 에틸 에테르로 지방을 제거한 후 4℃에서 72시간동안 인산완충식염수로 추출하였다. 상층액을 4℃에서 한 시간 동안 50,000 g 로 원심분리 한 후, 증류수로 48시간 동안 투석하였다. 이어 상기 추출물을 감압 하에 동결 건조하여 사용하기 전까지 -20℃에서 저장하였다. 인산완충식염수에서 원상태로 복원된 추출물의 단백질 농축도는 Bradford Assay 방법으로 결정하였다(Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Buckwheat, walnut and peanut extracts were prepared according to the preceding method [6]. Briefly, buckwheat flour was extracted with phosphoric acid buffered saline at 4 ° C for 72 hours after removing the fat with ethyl ether. The supernatant was centrifuged at 50,000 g for 4 hours at 4 ° C and dialyzed against distilled water for 48 hours. The extract was lyophilized under reduced pressure and stored at -20 캜 until use. The protein concentration of the extract recovered from the phosphate buffered saline solution was determined by the Bradford Assay method (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

재조합 Fag e 3에 대한 단일클론성 항체Monoclonal antibody to recombinant Fag e 3

대장균에서 재조합 Fag e 3을 발현시키고, Ni-column을 사용하여 봉입체(inclusion body)로부터 정제하였다[7]. Fag e 3에 대한 마우스의 단일클론항체는, 2주의 간격을 두고 세 차례에 걸쳐 재조합 Fag e 3으로 면역성을 갖게 한 BALB/c 마우스의 비장 세포와 골수종 세포(Sp 2.0-Ag 14)를 결합하여(fusion) 생성하였다. 재조합 Fag e 3에 대항하는 항체를 생성한 하이브리도마는 ELISA 로 스크리닝하였고 한계희석법으로 복제하였다. 상기 복제된 클론의 단일클론항체는 단백질 G (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 정제하였다. 마우스의 단일클론항체의 아이소타이핑 시약에 따라 항체는 모두 IgG1 이었다.Recombinant Fag e 3 was expressed in E. coli and purified from the inclusion body using a Ni-column [7]. Mouse monoclonal antibodies against Fag e 3 were prepared by combining splenocytes and myeloma cells (Sp 2.0-Ag 14) of BALB / c mice immunized with recombinant Fag e 3 three times at intervals of 2 weeks (fusion). Hybridomas that generated antibodies against recombinant Fag e 3 were screened by ELISA and cloned by limiting dilution. Monoclonal antibodies of the cloned clones were purified with protein G (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo., USA). All antibodies were IgG1 according to the isotyping reagent of mouse monoclonal antibody.

SDS-PAGE 및 면역블롯 분석SDS-PAGE and immunoblot analysis

재조합 단백질 또는 메밀 추출물은 환원 조건 또는 비환원 조건 하에서 도데실황산나트륨(SDS)이 포함된 15% 아크릴아마이드 겔에서 분리되었다. 상기 겔을 쿠마씨 블루로 염색하거나 폴리불화비닐리덴멤브레인(0.45μμm, Millipore, Bedford, MA, USA)으로 트랜스퍼하였다. 상기 멤브레인은 0.05%의 Tween 20이 포함된 Tris 완충 식염수에서 3% 탈지우유로 하룻밤 동안 블로킹하었다. 그 후에,멤브레인을 하이브리도마배양 상층액과 반응시켰고, 알칼라인 포스파타아제(Sigma-Aldrich)가 컨쥬게이션된 고트 항-마우스 IgE를 1:1,000로 희석하여 반응시켰다(Sigma-Aldrich). 3-브로모-4-클로로-5-인돌-포스페이트로 현상하였으며, 니트로블루테트라졸륨을 기질로 사용하였다(Promega, Madison, WI, USA).Recombinant protein or buckwheat extracts were isolated on 15% acrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate (SDS) under reducing or nonreducing conditions. The gel was stained with Coomassie blue or transferred onto a polyvinylidene fluoride membrane (0.45 mu m, Millipore, Bedford, MA, USA). The membrane was blocked with 3% skim milk in Tris buffered saline containing 0.05% Tween 20 overnight. The membrane was then reacted with the hybridoma culture supernatant and reacted (Sigma-Aldrich) by diluting 1: 1,000 alkaline phosphatase (Sigma-Aldrich) conjugated goat anti-mouse IgE. Bromo-4-chloro-5-indole-phosphate and nitro blue tetrazolium was used as substrate (Promega, Madison, WI, USA).

항체의 바이오티닐화Biotinylation of antibodies

단백질 G-column으로 정제된 단일클론항체는 EZ-Link®Sulfo-NHS-LC-Biotin (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)으로 바이오티닐화되었다. 즉, 항체 2 mg/ml를 NHS-LC-Biotin과 얼음 상에서 4시간 동안 반응시켰고, 미반응 NHS-LC-Biotin은 인산완충식염수에 대한 투석방법으로 제거하였다.Monoclonal antibodies purified with protein G-column were biotinylated with EZ-Link®Sulfo-NHS-LC-Biotin (ThermoFisher Scientific, Waltham, Mass., USA). That is, 2 mg / ml of antibody was reacted with NHS-LC-Biotin for 4 hours on ice, and unreacted NHS-LC-Biotin was removed by dialysis against phosphate buffered saline.

Two-site ELISA를 이용한 Fag e 3의 측정Measurement of Fag e 3 using two-site ELISA

세 가지 다른 항체를 이용하여 재조합 Fag e 3의 적정 곡선을 비교함으로써 최적의 항체 조합을 구축하였다. 포획 항체(capture antibody)로서 3D1 (10 μg/ml)과 검출 항체(detection antibody)로서 바이오티닐화된 4H8 (1:1000으로 희석)의 조합으로 최적의 결과를 얻었다. 추출물에서 Fag e 3 분리가 용이하도록, 항원을 1%의 여러 계면활성제(TritonX, NonidetP40, 또는 SDS)가 포함된 완충제로 희석하였다. 일부 시료는 계면활성 완충제로 시료를 희석시킨 후 5분간 100℃에서 가열하였다.Optimal antibody combinations were constructed by comparing the titration curves of recombinant Fag e3 using three different antibodies. Optimal results were obtained with a combination of 3D1 (10 μg / ml) as capture antibody and 4H8 (diluted 1: 1000) biotinylated as detection antibody. Antigen was diluted with buffer containing various surfactants (TritonX, NonidetP40, or SDS) at 1% to facilitate the separation of Fag e3 from the extract. Some samples were diluted with a surfactant buffer and heated at 100 ° C for 5 minutes.

요약하자면, 상기 포획 항체를 탄산염 완충제(pH 9.6)로 희석시키고 4℃에서 하룻밤 동안 코팅시켰다. 연속 희석된 항원(재조합 Fage e 3 또는 알레르겐 추출물)을 웰(well)에 첨가하고 3% 탈지우유로 블로킹한 후 상온에서 한 시간 동안 반응시켰다. 검출 항체를 첨가한 후 한 시간 더 반응시켰으며, 30분 동안 스트렙타아비딘-컨쥬게이션된 과산화효소(Sigma-Aldrich)와 반응시켰다. 마이크로타이터 플레이트(microtiter plater)는 매 단계마다 적어도 세 차례 0.05% Tween 20을 포함하는 인산완충식염수로 세척하였다. 색은 2,2’-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)(ThermoFisher Scientific) 또는 3,3’,5,5’-테트라메틸벤지딘(Kirkegaard Perry Laboratories, Gaithersburg, MD, USA)으로 발현시켰다. Briefly, the capture antibody was diluted with carbonate buffer (pH 9.6) and coated overnight at 4 ° C. Serial diluted antigen (recombinant Fage e 3 or allergen extract) was added to the wells, blocked with 3% defatted milk and allowed to react at room temperature for one hour. After addition of the detection antibody, the reaction was further performed for one hour and reacted with streptavidin-conjugated peroxidase (Sigma-Aldrich) for 30 minutes. Microtiter plates were washed with phosphate buffered saline containing 0.05% Tween 20 at least three times per step. The color was measured using a mixture of 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ThermoFisher Scientific) or 3,3 ', 5,5'- tetramethylbenzidine (Kirkegaard Perry Laboratories, Gaithersburg, MD, USA).

비교실험으로서, 땅콩에서 얻은 비실린 유사 알레르겐인 Ara h 1 농축도 역시 Ara h 1 ELISA 키트(Indoor Biotechnologies Inc., Charlottesville, VA, USA)로 측정하였다.As a comparative experiment, the Ara h 1 concentration, a non-silylated allergen from peanuts, was also determined by the Ara h 1 ELISA kit (Indoor Biotechnologies Inc., Charlottesville, VA, USA).

실험결과Experiment result

단일클론성 항체의 특이성Specificity of monoclonal antibodies

음성 알레르겐을 포함하는 메밀 전체 추출물에 대한 mAb의 반응성은 mAb을 이용한 면역블로팅으로 측정하였다. ELISA 상에서 추출물에 대한 mAb의 반응성이 양호했음에도 불구하고, 환원 조건 하에서 분리된 Fag e 3은 mAb를 통해서는 거의 인식되지 않았다(도 1). 이에 본 발명자들은 비환원 조건 하에서 추출물을 분리하면서 면역블로팅을 다시 한 번 실시하였다. 흥미롭게도, mAb 모두 이량체화된(putative dimerized) Fag e 3인 38-kDa 단백질을 우선적으로 인식했다. Ara h 1 (64 kDa)와 Jug r 2(44kDa) 역시 땅콩과 월넛 추출물에서 각각 인식되었다(도 2).The reactivity of mAb to total buckwheat extract containing negative allergens was measured by immunoblotting with mAb. Despite the good reactivity of the mAb to the extract on the ELISA, Fag e 3 isolated under reducing conditions was scarcely recognized through the mAb (Fig. 1). Therefore, the present inventors once again carried out immunoblotting while isolating the extract under non-reducing conditions. Interestingly, both mAbs preferentially recognized the 38-kDa protein Fag e 3, which is putative dimerized. Ara h 1 (64 kDa) and Jug r 2 (44 kDa) were also recognized in peanut and walnut extracts, respectively (FIG. 2).

Two-site ELISA 민감도Two-site ELISA sensitivity

선별된 항체를 사용한 ELISA는 1 μg/ml 미만의 재조합 Fag e 3을 검출할 수 있었다(도 3). 하지만 전체 추출물에서 천연상태의(native) Fag e 3은 검출하기 어려웠다. 이에, 추출물에서 Fag e 3를 용이하게 분리할 수 있도록 여러 계면활성제를 첨가하였다(도 4). 본 연구에서 개발한 ELISA 시스템은 재조합 Fag e 3으로 테스트했을 때, 최대 6 μg/ml의 비실린 알레르겐을 검출할 수 있었다. Fag e 3을 효율적으로 검출하기 위해서는 100 μg/ml 이상의 메밀 단백질이 필요하다(도 5). 하지만 본 발명에서 ELISA의 민감도는 1%의 SDS를 첨가한 후, 항원 혼합물을 100℃에서 5분간 가열함으로써 향상될 수 있었다. 재조합 Fag e 3의 two-site ELISA 검출 한계는 0.8 μg/ml 이었다(도 6a). 메밀 추출물의 검출 한계 역시 계면활성제 첨가 후 가열함으로써 60 μg/mL (0.1 mL)까지 낮아졌다. 동일한 ELISA 방법을 이용하였을 때 땅콩과 호두 추출물에서 비실린-유사 알레르겐은 검출되지 않았다.ELISA using the selected antibodies was able to detect less than 1 μg / ml recombinant Fag e 3 (FIG. 3). However, native Fag e 3 in the whole extract was difficult to detect. Thus, various surfactants were added to easily separate Fag e 3 from the extract (Fig. 4). The ELISA system developed in this study was able to detect up to 6 μg / ml of non-sialylated allergens when tested with recombinant Fag e 3. In order to efficiently detect Fag e 3, 100 μg / ml or more of buckwheat protein is required (FIG. 5). However, the sensitivity of the ELISA in the present invention could be improved by adding 1% SDS and then heating the antigen mixture at 100 ° C for 5 minutes. The two-site ELISA detection limit of recombinant Fag e 3 was 0.8 μg / ml (FIG. 6A). The detection limit of the buckwheat extract was also lowered to 60 μg / mL (0.1 mL) by heating after addition of the surfactant. When the same ELISA method was used, no biliary-like allergens were detected in peanuts and walnut extracts.

알레르겐 추출물에서 Fag e 3 측정Measurement of Fag e 3 in allergen extracts

본 발명자들은 메밀 추출물 1 mg 내에 총 120 μg의 Fag e 3이 존재하는 것을 확인하였다. 하지만, 본 발명의 two-site ELISA 키트로는 땅콩이나 호두 추출물에서 비실린 알레르겐은 검출되지 않았다. 비록 143.75μg 의 Ara h 1이 1 mg의 땅콩 추출물에 존재하는 것으로 검출되기는 했지만, Fag e 3 또한 Ara h 1 ELISA 키트(Indoor Biotechnologies Inc.)로는 검출되지 않았다.The present inventors confirmed that a total of 120 μg of Fag e 3 was present in 1 mg of buckwheat extract. However, the two-site ELISA kit of the present invention did not detect any non-labeled allergens from peanuts or walnut extracts. Fag e 3 was also not detected with the Ara h 1 ELISA kit (Indoor Biotechnologies Inc.), although 143.75 ug of Ara h 1 was detected to be present in 1 mg of peanut extract.

논의Argument

식품 또는 환경에서 알레르겐의 정량화를 위한 면역분석은 알레르겐 회피 및알레르겐 추출물의 표준화에 유용하다[8]. 본 발명자들은 재조합 Fag e 3에 대한 mAb를 이용하여 메밀 알레르겐 Fag e 3을 정량화하기 위해 two-site ELISA 방식을 개발했다. 모든 mAb가 전체 메밀 추출물에 대해 양호한 반응성을 나타내었다(도 1). 그러나, 이들 mAb는 환원 조건 하에서 추출물로부터 천연 상태의 Fag e 3을 쉽게 검출할 수는 없었다(도 2). 재조합 Fag e 3에 대한 모든 mAb는 비실린-유사알레르겐의 입체구조적 에피토프(conformational epitope)를 인식하는 것으로 간주된다(도 2). Ara h 1 (64 kDa)와 Jug r 2 (44 kDa) 역시 비환원 조건 하에서 상기 mAb에 의해 인식되었다.Immunoassay for the quantification of allergens in food or in the environment is useful for standardization of allergen avoidance and allergen extracts [8]. We have developed a two-site ELISA approach to quantify buckwheat allergen Fag e 3 using mAbs for recombinant Fag e 3. All mAbs showed good reactivity to whole buckwheat extract (Figure 1). However, these mAbs could not readily detect native Fag e3 from the extract under reducing conditions (Fig. 2). All mAbs to recombinant Fag e 3 are considered to recognize a conformational epitope of a non-silyl-like allergen (Fig. 2). Ara h 1 (64 kDa) and Jug r 2 (44 kDa) were also recognized by the mAb under non-reducing conditions.

한편, 열처리나 계면활성체 처리를 하기 전에는 재조합 Fag e 3에 대한 mAb를 이용하는 two-site ELISA 방식으로는 전체 추출물에서 Fag e 3을 검출할 수 없었다. mAb와 Fag e 3의 결합은 다른 바실린 관련 단백질에 의해 저해되거나 다합체를 형성하는 것으로 알려져 있는 비실린 분자간의 상호작용에 의해 저해될 수 있다. 글리코실화도 항체 인식에 영향을 미칠 수 있다[9].On the other hand, Fag e 3 could not be detected in whole extract by two-site ELISA using mAb for recombinant Fag e 3 before heat treatment or surfactant treatment. Binding of mAbs to Fag e 3 can be inhibited by interactions between non-silylated molecules, which are inhibited by other versyline-related proteins or are known to form polyhedra. Glycosylation can also affect antibody recognition [9].

흥미롭게도, 각각의 mAb는 추출물에 양호한 반응을 나타내었다. 그러나 재조합 Fag e 3가 잘 정량되었더라도, 추출물로부터 천연 상태의 Fag e 3는 두 개의 mAb조합으로 검출되지 않았다. 재조합 Fag e 3에 대한 mAb는 서로 근접한 에피토프를 인식할 수 있다. 하나의 mAb가 하나의 에피토프 부위에 결합함으로써, 입체 장애로 인해 가까이에 위치한 에피토프에 대한 다른 mAb의 접근성을 감소시킬 수도 있다. 계면활성제로 인한 Fag e 3의 부분 변성이 다른 mAb의 접근성을 증가시킬 수도 있다. 이 가설을 설명하기 위해서는 에피토프 매핑이 수행되어야 한다.Interestingly, each mAb showed a favorable response to the extract. However, although the recombinant Fag e 3 was well quantified, the natural state Fag e 3 from the extract was not detected as a combination of two mAbs. MAbs for recombinant Fag e 3 can recognize epitopes close to each other. By binding one mAb to one epitope site, steric hindrance may reduce the accessibility of other mAbs to nearby epitopes. Partial denaturation of Fag e 3 by surfactants may increase accessibility of other mAbs. To illustrate this hypothesis, epitope mapping should be performed.

재조합 Fag e 3는 우수한 IgE 반응성을 가지고 있으며, 이는 재조합 Fag e 3가 천연 상태의 대응물과 매우 유사한 것을 의미한다[7]. 본 발명자들은 환원 및 비환원 겔을 기반으로 한 재조합 Fag e 3에서 구조적인 차이점을 발견하지 못했다(도 1). 그러나, 천연 상태의 Fag e 3이 환원 조건에서 mAb에 대해 다른 반응성을 보인 것처럼, 환원 조건은 천연상태의 Fag e 3의 경미한 구성의 변화를 유발할 수도 있다(도 2). 천연 상태의 Fag e 3이 IgE 면역블로팅 분석을 기반으로 양호한 IgE 반응성을 나타낸 것처럼, 환원 조건 하에서 구조적으로 변화된 천연상태의 Fag e 3는 IgE 에피토프 대부분을 보유하는 것으로 예상된다[6]. SDS를 첨가하여 가열하는 것은 Ara h 1과 Jug r 2에서 유사한 변화를 유발시킬 것으로는 여겨지지 않는데, 이들 분자가 재조합 Fag e 3 mAb를 사용한 ELISA로 정량화되지 않았기 때문이다. 다당류 존재 하의 열처리(30-50분)는 달단종메밀(fagopyrum tataricum)의 비실린-유사 알레르겐인 Fag t 3에 구조적 변화를 일으킬 수 있다. 이는 메일라르(Maillard) 반응을 통해 면역원성을 현저하게 감소시킨다[10]. Fag t 3은 90℃에서 30분간 처리한 이후에도 안정적이었다. 따라서, 1% SDS를 첨가하여 100℃에서 5분간 열처리를 하는 동안 메일라르 반응이 일어나지 않았다고 생각된다.Recombinant Fag e 3 has excellent IgE reactivity, meaning that the recombinant Fag e 3 is very similar to its natural counterpart [7]. We have not found any structural differences in recombinant Fag e 3 based on reduced and unreduced gels (Figure 1). However, as the native state of Fag e 3 shows different reactivity to the mAb in the reducing conditions, the reducing conditions may cause a slight change in the natural state of Fag e 3 (Fig. 2). Fag e 3, which is structurally altered under reducing conditions, is expected to retain most of the IgE epitope, as native Fag e 3 exhibits good IgE reactivity based on IgE immunoblot analysis [6]. Heating with the addition of SDS is not considered to induce similar changes in Ara h 1 and Jug r 2, as these molecules have not been quantified by ELISA using recombinant Fag e 3 mAb. Heat treatment (30-50 min) in the presence of polysaccharides can cause structural changes in Fag t 3, a non-silyl-like allergen of the month-ending buckwheat (fagopyrum tataricum). This significantly reduces immunogenicity through the Maillard reaction [10]. Fag t 3 was stable even after 30 minutes of treatment at 90 ° C. Therefore, it is considered that the mullard reaction did not occur during the heat treatment at 100 ° C for 5 minutes by adding 1% SDS.

본 발명자들은 희석 완충액에서 Fag e 3(도 4)의 검출을 향상시키기 위해 계면활성제인 SDS를 사용했다. 메밀 단백질의 대략 12%가 비실린인 것으로 확인되었다(도 5). 여러가지 양념, 첨가물 및 다른 식료품들이 섞인 식품에서 알러지 유발 요소를 검출하는 것은 어려운 일 일수 있다. 따라서, 연속적인 희석에 앞서 계면활성제를 사용하여 항원을 가열함으로써 다양한 식품 및 환경에서 메밀 알레르겐을 추출하고 검출할 수 있다. 항원을 연속적으로 희석하기 전에 가열함으로써 ELISA의 민감도는 대략 7.5배 가량 향상되었다(도 6).We used a surfactant, SDS, to improve the detection of Fag e 3 (Figure 4) in dilute buffers. Approximately 12% of the buckwheat protein was found to be acyclic (Fig. 5). Detecting allergen-inducing elements in foods containing various spices, additives and other foodstuffs can be difficult. Thus, buckwheat allergens can be extracted and detected in a variety of foods and environments by heating the antigens using a surfactant prior to subsequent dilution. The sensitivity of the ELISA was improved approximately 7.5-fold by heating the antigen before serial dilution (Figure 6).

Ara h 1은 잘 알려진 비실린 알레르겐이다. Ara h 1은 소수성 상호작용을 통해 안정적인 삼량체(64kDa)를 형성한 열에 안정적인 단백질이다. 이 단백질은 땅콩 추출물에서 총 단백질의 12% 내지 16%를 이루고 있다[12-14]. Ara h 1은 땅콩 및 식품 추출물에서 뿐 아니라 다양한 환경에서도 측정되었다[11,14,15]. 메밀을 제공하는 식당, 메밀면을 생산하는 공장, 메밀이 포함된 식사 등 다양한 환경에서 Fag e 3이 검출될 가능성이 높다. 메밀은 직업적 노출이나, 주로 메밀가루로 오염된 메밀 왕겨로 속을 채운 베개로 인한 가정에서의 노출로 인한 흡입으로 예민해질 수 있다[16].Ara h 1 is a well-known bisacylated allergen. Ara h 1 is a thermostable protein that forms a stable trimer (64 kDa) through hydrophobic interaction. This protein makes up 12% to 16% of total protein in peanut extract [12-14]. Ara h 1 has been measured not only in peanuts and food extracts, but also in a variety of environments [11,14,15]. Fag e 3 is highly likely to be detected in a variety of environments such as a restaurant serving buckwheat, a factory producing buckwheat cotton, and a meal containing buckwheat. Buckwheat can be susceptible to occupational exposures or inhalation from home exposure to buckwheat flour filled with buckwheat flour mainly contaminated with buckwheat flour [16].

재조합 Fag e 3에 대한 mAb는 견과류의 비실린-유사 알레르겐을 인지한다. 비실린-유사 알레르겐은 또한 검은 호두(Jug n 2), 렌틸(Len c 1), 완두콩(Pis s 1), 캐슈(Ana o 1), 헤이즐(Cor a 1), 참깨(Sesi 3)에서도 나타난다. 완두콩과 땅콩간 임상적으로 연관성 있는 교차반응은 비실린-상동성 알레르겐인 Pis s 1과 Ara h 1에 기인한 것이라고 보고되었다[17]. 하지만, 이들 알레르겐 간에는 임상 교차반응성의 비율이 낮다.The mAbs for recombinant Fag e 3 recognize non-silyl-like allergens in nuts. Bis-serine-like allergens also occur in black walnut (Jug n 2), lentil (Len c 1), peas (Pis s 1), cashews (Ana o 1), hazel (Cor a 1) . A clinically relevant cross-reaction between pea and peanut was reported to be due to the non-silyl-homologous allergens Pis s 1 and Ara h 1 [17]. However, the ratio of clinical cross-reactivity among these allergens is low.

메밀 two-site ELISA키트는 이미 Crystal Chem Inc.(Downers Grove, IL, USA)와 ELISA systems(Windsor, Queensland, Australia)에서 생산된다. 이들 키트는 식품에서 메밀 알레르겐 오염의 감시를 위해 메밀 추출을 사용한다. 일본의 식품업계와 국가의 식품 통제기관 실험실에서는 24-kDa 알레르겐(추정 Fag e 1)을 검출하는 ALLERGENEYE ELISA 키트(Justia Legal Resources, Tokyo, Japan)를 사용하며, FASTKIT ELISA 키트(COSMO Bio CO., Ltd., Tokyo, Japan)를 사용한다(공고번호1106001, 2002)[18]. 메밀 DNA 검출 시스템(Shimadzu Cor., Kyoto Japan) 또한 이용가능하다. 현재의 식품 알러지 표시 시스템을 보완하기 위해 더 나은 메밀 알레르겐 검출 시스템을 개발하는 것은 중요한 목표이다. Fag e 2나 Fag e 3과 같이 임상적으로 관련있는 알레르겐의 검출은 전체 추출물의 진단적 가치보다 더 나은 진단적 가치가 있다[7,19].The buckwheat two-site ELISA kit is already produced by Crystal Chem Inc. (Downers Grove, IL, USA) and ELISA systems (Windsor, Queensland, Australia). These kits use buckwheat extraction for monitoring buckwheat allergen contamination in food. The Japanese food industry and national food control laboratory use the ALLERGENEYE ELISA kit (Justia Legal Resources, Tokyo, Japan) to detect 24-kDa allergens (estimated Fag e 1) and FASTKIT ELISA kit (COSMO Bio CO. Ltd., Tokyo, Japan) (Announcement No. 1106001, 2002) [18]. A buckwheat DNA detection system (Shimadzu Cor., Kyoto Japan) is also available. Developing better buckwheat allergen detection systems is an important goal to complement the current food allergy labeling system. The detection of clinically relevant allergens such as Fag e 2 or Fag e 3 has a better diagnostic value than the overall diagnostic value of the extract [7,19].

본 연구진은 본 연구에서 개발한 Fag e 3 ELISA 가 식품과 환경에서 메밀 알레르겐의 검출뿐 아니라 메밀 추출물의 표준화에 도움이 되기를 희망한다.We hope that the Fag e 3 ELISA developed in this study will help in the standardization of buckwheat extract as well as detection of buckwheat allergens in foods and environments.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the present invention. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

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한국세포주연구재단Korea Cell Line Research Foundation KCLRFBP00359KCLRFBP00359 2016030920160309 한국세포주연구재단Korea Cell Line Research Foundation KCLRFBP00360KCLRFBP00360 2016030920160309

Claims (12)

다음 단계를 포함하는 메밀 Fag e 3 알레르겐의 정량분석방법:
(a) 시료 내 Fag e 3 알레르겐을 해리(dissociation)시키는 단계;
(b) 상기 단계 (a)의 시료와 Fag e 3에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 접촉시키는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)의 시료로부터 Fag e 3 를 정량분석하는 단계.
Quantitative analysis of buckwheat Fag e 3 allergen comprising the following steps:
(a) dissociating the Fag e 3 allergen in the sample;
(b) contacting the sample of step (a) with an antibody or antigen-binding fragment thereof against Fag e3; And
(c) quantitatively analyzing Fag e 3 from the sample of step (b).
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)는 상기 시료에 계면활성제를 첨가한 후 가열하여 실시하는 것을 특징으로 하는 정량분석방법.
The quantitative analysis method according to claim 1, wherein the step (a) is performed by adding a surfactant to the sample and heating the sample.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 시료는 비환원 조건 하에서 추출된 것을 특징으로 하는 정량분석방법.
The method according to claim 1, wherein the sample of step (a) is extracted under non-reducing conditions.
제 1 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 2량체(dimerized) Fag e 3 를 인지하는 것을 특징으로 하는 정량분석방법.
2. The method according to claim 1, wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof recognizes a dimerized Fag e3.
제 1 항에 있어서, 상기 항체는 하이브리도마 세포(기탁번호: KCLRF-BP-00359 또는 KCLRF-BP-00360)에 의하여 생산된 것을 특징으로 하는 정량분석방법.
2. The method according to claim 1, wherein the antibody is produced by hybridoma cells (Accession No .: KCLRF-BP-00359 or KCLRF-BP-00360).
제 1 항에 있어서, 상기 정량분석방법은 ELISA 인 것을 특징으로 하는 정량분석방법.
The quantitative analysis method according to claim 1, wherein the quantitative analysis method is an ELISA.
제 6 항에 있어서, 상기 ELISA 는 포획항체로서 하이브리도마 세포(기탁번호: KCLRF-BP-00359) 에 의하여 생산된 항체, 및 검출항체로서 하이브리도마 세포(기탁번호: KCLRF-BP-00360)에 의하여 생산된 항체를 이용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 정량분석방법.
7. The method according to claim 6, wherein the ELISA comprises an antibody produced by hybridoma cells (accession number: KCLRF-BP-00359) as a capture antibody and hybridoma cells (accession number: KCLRF-BP- Lt; RTI ID = 0.0 > 1, < / RTI >
제 6 항에 있어서, 상기 정량분석방법은 Fag e 3 알레르겐의 검출한계가 0.8 μg/ml 인 것을 특징으로 하는 정량분석방법.
[7] The quantitative analysis method according to claim 6, wherein the detection limit of the Fag e3 allergen is 0.8 μg / ml.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 항체는 비실린-유사(vicilin-like) 알레르겐을 추가적으로 검출하는 것을 특징으로 하는 정량분석방법.
2. The method of claim 1, wherein the antibody of step (b) additionally detects a vicilin-like allergen.
포획항체로서 하이브리도마 세포(기탁번호: KCLRF-BP-00359) 에 의하여 생산된 항체, 및 검출항체로서 하이브리도마 세포(기탁번호: KCLRF-BP-00360)에 의하여 생산된 항체를 이용하는 메밀 Fag e 3 알레르겐의 정량분석키트.
The antibody produced by hybridoma cells (Accession No .: KCLRF-BP-00359) as a capture antibody and the antibody produced by hybridoma cells (accession number: KCLRF-BP-00360) e 3 Quantitative assay kit for allergen.
시료 내 Fag e 3 알레르겐에 대한 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주(기탁번호: KCLRF-BP-00359).
A hybridoma cell line (accession number: KCLRF-BP-00359) producing an antibody against Fag e 3 allergen in a sample.
시료 내 Fag e 3 알레르겐에 대한 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주(기탁번호: KCLRF-BP-00360).A hybridoma cell line (accession number: KCLRF-BP-00360) that produces an antibody against Fag e 3 allergen in a sample.
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