KR20170142157A - 생체분자의　계수분석　방법, 키트 및 장치, 그리고　그들의 이용 - Google Patents

생체분자의　계수분석　방법, 키트 및 장치, 그리고　그들의 이용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하나　또는　그　이상의　생체분자들을 동시 계수하여　정량하는 분석 방법, 키트 및 장치에 관한 것으로, 한 튜브에서 하나　또는　그　이상의　생체분자들을 동시에 계수 분석함으로써, 높은 재현성과 우수한 최소검출한계로 정량하고, 또한　기준물질과　서로 다른 생체분자를 동시에 분석함으로 내부정도관리를 하면서　계수하여　정량하는 생체분자의　계수분석　방법, 키트 및　장치,　그리고 그들을 활용한 텔레헬스(Telehealth) 기술을 제공한다.

Description

생체분자의　계수분석　방법, 키트 및 장치, 그리고　그들의 이용{Counting analysis of Biomolecules, the Kit and Apparatus, and Their Use}
본 발명은 일반적으로 시료에서의 하나　또는　그　이상의　생체분자들의 분석에 관한 것이며, 더욱 상세하게는 하나　또는　그　이상의　생체분자들을　내부정도관리를 하면서 계수하여　정량하는　생체분자의　계수분석　방법,　키트　및　장치, 그리고　그들을 활용한 텔레헬스(Telehealth) 기술에 관한　것이다.
생체분자는 질병의 발생 또는 진행과 병행하여 분비되거나 세포가　파괴되어　나오는 바이오마커들을 포함할 수 있고, 조직 또는　병소에 대한 말단 조직으로부터 혈류로 쉽게 퍼진다. 확인된 바이오마커 또는 바이오마커의 세트는 일반적으로 임상적으로 확인되거나, 그것이 선택된 본래의 의도된 용도를 위한 신뢰할 수 있는 생체분자이다. 생체분자는 소분자(small molec㎕es), 펩티드　및 단백질을 포함할 수 있다.
다양한 방법들이 생체분자를 확인하고 질병을 진단하기 위한 시도에 사용되고　있다. 단백질기반 마커의　분석　방법은 면역학적 분석방법, 2차원 전기영동방법 및　질량 분석방법을 포함한다.
다수의 생체분자를 측정하기 위하여 면역학적 분석방법은 항체-기반 다중 분석방법에 한계가 있다. 고품질 항체 어레이를 간단하게 프린트하여, 샌드위치 검정을 사용하지 않고 이 항체들에 결합된 생체분자를 측정할 수 있다. 항체-기반 다중 분석방법을 사용하는 생체분자 분석 방법은 진단목적 생체분자 분석에 커다란 한계가 있다. 이 한계들은 극미량(low-abundance)의 바이오마커 검출의 불가능, 전 동적 범위(entire dynamic range)의 프로테옴(proteome)의 동시　검사의　어려움, 샘플 처리와 분리에서의 재생 불가능 및 방법의 전체적인 재생 불가능 및 견고성(robustness)의 결여를 포함한다. 게다가, 이 방법에 의해 생산된 데이터에 오버피팅(over-fitting) 및 데이터에서의 편향(bias)이 있으며, 표적 질병 집단 내에서 바이오마커를 확인하고 입증하는 데 요구되는 분포 및 랜덤화의 관점에서, 적절한 조절을 포함하는 샘플 집단의 복잡성을 충분하게 반영하지 못하는 문제 등이 있다.
2차원 전기영동방법의 유용성은 낮은 검출 민감도; 단백질 용해도, 전하 및 소수성의 문제점; 및 단일 스폿을 나타내는 여러 단백질의 가능성에 의해 제한된다. 사용되는 포맷에 의존하는 질량 분석방법의 경우, 한계는 샘플 처리 및 분리, 극미량의 단백질(low abundance proteins)에 대한 민감도, 신호에 대한 잡음 고려사항 및 검출된 단백질을 즉시 확인할 수　없음에 한계가　있다.　2D 겔 및 질량 분석방법은 대략 1nM 농도 및 그보다 높은 농도로 혈액에 존재하는 단백질을 측정하며, 이 단백질의 앙상블은 질병과 연관성이　거의 바뀌지 않을　수　도　있다.　현재 더욱 낮은 농도에서 단백질 발현 레벨을 정확하게 측정할 수 있는 프로테오믹 생체분자 분석방법은 존재하지 않는다.　복잡한 인간 생물학에 대한 생화학 경로들에 관하여 많은 것이 알려져 있다. 많은 생화학 경로들이 마침내 병리 내에서 국소적으로 작용하는 분비된 단백질, 예를 들어 병리학에서 다른 세포들의 복제를 자극하기 위하여 분비되는 성장 인자 및 면역 시스템 등을 피하기 위하여 분비되는 다른 인자들에 의해 시작된다. 많은 이 분비된 단백질들이 주변분비 방식(paracrine fashion)으로 작용하는 동안, 몇몇은 체내에서 말초적(distally)으로 작용한다. 생화학 경로에 대한 기본 이해를 가지는 당업자들은 많은 병리-특이적 단백질들이 2D 겔 및 질량 분석법의 검출 한계 이하의 농도로(심지어는 그 이하의 농도)로 혈액 및 타액 등의 체액에 존재한다. 따라서, 질병관련　생체분자를 분석하기 위해서　선결해야　할　것은　면역학적　분석방법, 2D 겔 또는 질량 분석방법　한계를　극복하는 기술의　개발이다．　
또한, 최근 산업 발전이 이루어짐에 따라 건강관리(Health Care)의 관심이 높아지고 있다. 인터넷과 같은 온라인을 통한 정보의 송신과 수신이 자유로워짐에 따라 텔레헬스(telehealth)와 같은 새로운 형태의 진료방법이 도입되고 있는 것으로서, 텔레헬스는 원격의료장비를 이용하여 의사가 실시할 수 있는 문진, 정진, 시진을 하여 환자의 건강상태를 파악하고 검사결과를 온라인을 통해 환자에게 송신하는 방식을 활용한다. 의료서비스를 받을 수 없는 열악한 환경이나 거동이 불편한 고령자들과 이와 같은 고령자로 구성된 실버타운과 같이 주기적이고 지속적인 의료서비스가 필요한 경우, 원격진료를 활용한다면 피진료자가 공간 및 시간적 제약을 받지 않고 진료를 받을 수 있다는 장점이 있는 것이다. 또한 이러한 경우 외에도 지속적으로 환자의 생활관리가 필요한 당뇨병이나 심장병 또는 암수술 후의 환자와 같은 경우, 원격진료를 통해 환자가 주기적으로 병원에 진찰을 받으러 가야만 하는 불편함을 해소할 수 있고 환자진료 외의 생활전반에 걸쳐 환자의 건강상태를 쉽게 체크할 수 있다는 장점이 있는 것이다.
본 발명은 생체분자를 분석하는 기술로 기존의　면역학적　분석방법, 2D 겔 또는 질량 분석방법　한계를　극복하는 기술을 개발하고, 상기 개발기술에 의해 생산되는 생체정보, 사용자의 건강상태 정보와 기 구축된 임상정보를 통합 운영하는 텔레헬스 기술로 효율적인 건강관리에　필요한　기술을 제공하고자한다.　
따라서, 본 발명의 목적은 상기한 바와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명은 한　번의 검사로 하나　또는　그　이상의　생체분자에 대한 계수 방법으로 정량하는 다중검사에 관한 것으로 우수한 검출한계를 유지하면서 검사 비용을 절감하고,　내부정도관리를　하면서　계수하여　정량하는　생체분자의　계수분석　방법,　키트 및　장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 자동으로 극미량(low-abundance)의　생체분자를 계수할 수 있는 리포터를　이용한　생체분자의　계수분석　방법,　키트　 및　장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 개발기술에 의해 생산되는 생체정보, 사용자의 건강상태 정보와 기 구축된 임상정보를 통합 운영하는 텔레헬스 기술로 효율적인 건강관리에　필요한　기술을 제공하는 것이다.　
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은　또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
"샘플" 및 "시료"은 개인으로부터 얻어지거나 만약 그렇지 않으면 개인으로부터 유래된 임의의 물질, 생물학적 체액, 조직 또는 세포를 말하는 것으로 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 이것은 전혈, 백혈구, 말초혈액 단핵 세포, 연층(buffy coat), 혈장 및 혈청, 객담, 눈물, 점액, 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변, 정액, 침, 양수, 선액(gland㎕ar fluid), 림프액, 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 세포， 세포 추출물 및 뇌척수액(cerebrospinal fluid)를 포함한다. 이것은 또한 모든 절차 중 실험적으로 분리된 단편을 포함한다. 혈액 샘플은 혈청 또는 적혈구 세포 또는 백혈구 세포와 같은 특정 형태의 혈액 세포를 포함하는 단편으로 단편화될 수 있다. 샘플은 조직 및 체액 샘플의 조합과 같은 개인으로부터의 샘플 조합일 수 있다. 생물학적 샘플은 대변 샘플, 조직 샘플 또는 조직 생검으로부터의 샘플과 같은 균질화된 고체 물질을 포함하는 물질을 포함한다. 생물학적 샘플은 조직 배양 또는 세포 배양으로부터 유래된 물질을 포함한다. 생물학적 샘플을 얻기 위한 임의의 적절한 방법이 사용될 수 있다.
“생체분자”는 생체를 구성하고 기능을 담당하는 세포 및　분자로 가장 주된 것은 세균,　세포,　바이러스,　단백질, 핵산, 다당류 및 지질과 같은 크기가 큰 거대 분자들과 저분자물질로 스테로이드　호르몬,　아미노산, 뉴클레오티드, 단당류, 비타민 등의 유기물질, 철, 구리　등의 금속, 무기이온 등을　포함한다.
“내부정도관리”는　검사　중에　발생할　수　있는　계통오차를　방지하기　위하여　모든　검사에　대해서는　검사　전에　정도관리물질　혹은　정도관리물질에　준하는　물질을　사용하여　오차의　크기를　보정하여　오차가　있는　검사결과가　보고되는　것을　방지하는　것이다.　정도관리는 관리용 시료와 같은 외적표준을 사용하지 않고, 매회의 측정으로 얻을 수 있는 일군의 검사결과를 분석하여 측정치의 정밀도를 관리해 나가는 내부정도관리를 의미한다.
“표준물질”　혹은　“기준물질”은 정도관리 및 측정용의 물질로 분석하고자하는 시료에 항상 일정 양으로 존재하는 내부물질이거나 또는 상기 시료를 구성하는 생체분자들과 생물학적 분석방법에 의해 반응성이 없는 리간드에 결합하는 외부 생체분자를 사용할 수 있다.　
바람직하게는, 일반적으로 생체분자 분석의 경우 각종 시험, 검사시 비교를 위해 분석하고자하는 생체시료에 포함된 생체분자들로 내부정도관리를 한다. 상기 정도관리용 물질은 분석하고자하는 시료에 항상 일정량으로 존재하는 물질이 이상적이나 그렇지 못한 경우 시료에 포함되지 않는 물질인 외래물질을 사용할 수 있으며 바람직하게 분석하고자하는 시료가 생체시료인 경우 상기 생체시료에 포함되지 않는 외래생체분자들로 구성될 수 있다.
바람직하며, 본 발명에서 정도관리 및 측정용 표준물질 인간유래 생체시료를 분석하는 경우 인간유래 생체시료에 포함되지 않는 생체분자로 식물특이생체분자를 사용할 수 있다. 현재 인간, 대장균 및 식물의 일종인 애기장대(Arabidopsis thaliana) 등의 게놈 프로젝트가 종결되어 종 특이적 단백질들이 보고되어 있다. 본 발명에서는 인간유래 생체시료를 분석하기 위해, 표준물질로 대장균 또는 식물 등의 특이단백질을 사용할 수 있다.
생체분자의 농도를 측정하여 평가하는 방법은 정밀도, 정확도, 재현성 면에서 신뢰받을 수 있어야 한다. 생체분자를 분석하는데 있어서 정확도가 중요시되는 이유는 시료는 단백질을 포함한 여러 종류 물질 등의 매우 복잡한 조성으로 구성되어 있으며, 그중 분석하고자 하는 대상 생체분자는 소량 존재하기 때문에 미량 성분의 분석을 위하여 정도관리 및 측정용의 표준물질이 필요성이 매우 높다.
시료에 존재하는 분석을 방해하는 물질들의 영향과 미량 분석이라는 점 때문에 분석 값들의 실험실간 편차가 생길 수 있다. 실험실간의 편차를 줄이기 위하여, 분석하고자하는 시료들에 같은 농도의 생체분자가 균질하게 함유하고 있는 정도관리 및 측정용 표준물질이 필요하게 되었으며, 이러한 표준물질을 사용하여 여러 실험실에서 분석한 값을 비교하여 분석기기 조건 등을 검토하여 정확한 분석 조건을 이끌어 내게 되는 것이다. 또한 분석하고자하는 시료에 상기 표준물질은 균질하게 분포하여 각 시료마다의 편차를 최소화하고 분석의 신뢰성을 높일 수 있는 생체분자 분석 방법이 필요하다.
"표적분자"는 생물학적 샘플에 존재할 수 있는 관심이 있는 임의의 분자를 지칭하고 본 발명에서　생물학적 의미 결정을 위해 선택되는 생체분자와 상호 교환적으로 사용된다. 표적분자는 단백질의 경우에 아미노산 서열에서의 경미한 변화, 이황화 결합 형성(dis㎕fide bond formation), 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 분자의 본질을 실질적으로 변경시키지 않는 표지 성분과의 결합과 같은 임의의 다른 조작 또는 변경과 같은 특정 분자의 임의의 작은 변화를 포함한다. 대표적인 생체분자는 단백질, 폴리펩티드, 핵산, 탄수화물, 지질, 다당류, 당단백질, 호르몬, 수용체, 항원, 항체, 애피바디(affibodies), 항체 모방체(antibody mimics), 바이러스, 병원체, 독성 물질, 기질(substrates), 대사물질, 전이상태　유사체(transition state analogs), 보조인자(cofoactors), 억제제, 약물, 염료, 영양분, 성장 인자, 세포, 조직 및 임의의 앞서 말한 것들의 임의의 단편 또는 부분을 포함한다.
“리간드”는 특정 물질과 결합하고, 상호 작용 또는 그렇지 않으면 특정 물질과 연합하여 특정 물질의 기능에　작용하고, 변화시키고 또는 무효화하는 하나 또는 그 이상의 리간드에 특이적인 분자 또는 분자의 클러스터를　포함하는 구조를 언급한다. 압타머, 항체, 애드넥틴(adnectins), 안키린(ankyrins), 다른 항체 모조물(antibody mimetics) 및 다른 단백질 스캐폴드, 자가항체, 키메라, 소분자, F(ab')2 단편, 단일 사슬 항체 단편(single chain anbibody fragment), Fv 단편(Fv fragment), 단일 사슬 Fv 단편(single chain Fv fragment), 핵산(nucleic acid), 렉틴(lectin), 리간드 결합 수용체(ligand-binding receptor), 애피바디(affybodies), 나노바디(nanobodies), 각인된 고분자(imprinted polymer), 아비머(avimers), 펩티드 모조물(peptidomimetics), 호르몬 수용체, 시토카인 수용체, 및 합성 수용체 및 이것들의 변경 및 단편을 포함하나 이로 한정되는 것은 아니다.
본　발명의 '항체'는 다클론 항체 및 단클론 항체를 모두 포함하며, 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 단편도 사용될 수 있다. 항체 분자의 단편이란 적어도　항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 단일 사슬 Fv(scFv), Fab, F(ab'), F(ab')2, 단일 도메인 등을 포함한다.　본 발명의 '생체분자'는　항원처럼 항체와 결합하는 부위를 포함하고 있는 분자로, 항원분자에는 항원특이성을 결정하는 입체　분자 구조가 존재하고 그것과 대응하는 항체와 반응하며, 그 구조부위를 항원결정기 또는 에피토프라고 한다.　항체와 결합능이 있는 '항원'은 본 발명에서 사용하는 '생체분자'와 큰　차이가 없으며, 본 발명에서 혼용된다.
본 발명의 “압타머(aptamer)”는 저분자 화합물로부터 단백질까지 다양한 종류의 리셉터에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특성을 가지는 작은(20~60 뉴클레오티드) 단일가닥핵산(DNA 또는 RNA) 조각을 뜻한다. 압타머의 개발은 셀렉스(SELEX)라는 방법을 통해 시험관에서 이루어진다. 셀렉스는 'Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment'의 약자로서 1990년에 처음으로 개발되었는데(Tuerk, C. and Gold, L., 1990, Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science 249 (4968), 505-510; Ellington, A.D. and Szostak, J.W., 1990, In vitro selection of RNA molec㎕es that bind specific ligands. Nature 346 (6287), 818-822), 이 방법을 이용하여 특정 분자에 높은 결합력을 갖는 핵산압타머를 얻게 된다. 압타머는 리셉터에 대해 나노몰-피코몰 수준의 높은 결합력과 선택성을 지니고 있다는 점에서 항체와 유사한 특성을 가지는 핵산분자로 여겨지고 있다.
리간드에 결합하는 물질인 리셉터는 단백질, 펩티드,　핵산, 탄수화물, 지질(lipid), 다당류, 당단백질, 호르몬, 수용체, 항원, 항체, 바이러스, 병원균, 독성 물질,　기질, 대사산물, 전이 상태 유사체(transition state analog), 보조 인자(cofactor), 저해제, 약, 염료, 영양분, 성장 인자, 세포, 조직 등일 수 있고, 제한이 없으며 거의 모든 화학적 또는 생물학적 작동체(effector)가　될 것이며 어떤 크기의 분자들이든 사용될 수 있는 생체분자 등을 의미한다.
본　발명은 상기　하나　또는　그　이상의　생체분자를　계수하여　정량하는　방법을　제공하고자한다．　
하나　또는 그　이상의　생체분자로　구성된　시료에서　관심이　있는　하나　또는　그　이상의　생체분자를　계수하여　정량하는　방법을　제공하기　위해서,　상기　시료와　표지리간드를　반응시켜　코팅지지체－생체분자－표지리간드　복합체,　포획리간드－생체분자－표지리간드　복합체　또는　포획경쟁분자－표지리간드　복합체를　제조하고　수확하는　단계,　상기　수확한　복합체를　계수하컫　단계 및　상기　계수　분석한　결과로부터　시료의　생체분자를　분석하여　생체분자　값을　산정하는　단계로　구성하는　것을　특징으로　하는　코팅계수방법,　포획계수방법과　경쟁계수방법으로　구성된　생체분자　계수분석　방법,　키트 및　장치일　수　있다.
도１은　상기　생물분자　계수방법에서　사용하는　리포터,　표지리간드,　포획경쟁분자와　고정핵산분자의　구조로　도1에 도시된 바와 같이, “표지리간드” 는　리간드와　리포터가　결합한　구조를　말하는　것이며　생체분자와　특이적으로　결합하여　생체분자를　지시하는　특이신호를　발생하며　지지체의 특정한 부위에　리포터부분이　고정되어　발생하는 신호로　이미지인　스폿을　형성하도록　한다.　리포터에서　발생하는　신호는　생체분자와　생체분자에　상응하는　리간드를　특정적으로　지시하고　형성되는　스폿을　한　단위로　하여　생체분자를　계수화　할　수　있도록　한다.
도1에 도시된 바와 같이, “리포터”는　본　발명에 사용된 것으로서, 상기 생체분자 값에 대응하는 시그널을 발생시키고 그 시그널을 생성하는데 필요한 물질(들) 모두를　포함하는　개념으로　사용될　수　있다. 상기 생체분자　값은 형광(fluorescence), 화학발광(chemiluminescence), 전기화학 검출법(electrochemical detection methods), 양자점(quantum dots) 등을 포함하는 임의의 적절한 방법을 사용하여 분석된다.
본　발명에　사용하는　리포터는　하기 (일반식１), (일반식２) 및　(일반식３)과　같은　구조일 수도 있다.　　
５‘－반응성그룹－스페이서－반복구조부－신호발생부－스페이서-바이오틴－３’ (일반식１)
５‘－바이오틴－상보적　서열부위－신호발생부－반복구조부－３’ (일반식２)
５‘－반응성그룹－스페이서－신호발생부－반복구조부－３’　(일반식３)
(일반식 １)과　(일반식 ２) 리포터는　항체와　압타머　리간드　양쪽에　사용할　수　있으며　(일반식 １)　리포터는　상기　리간드의　반응성　그룹에　결합하는　표지리간드,　(일반식 ２)　리포터는　상기　리간드에　연결된　단일가닥핵산과　(일반식 ２) 리포터의　결합서열이　상보적인　결합하는　표지리간드를　제조할　수도　있다.
(일반식　３)　리포터는　압타머　리간드에　적합한　리포터이며　한쪽 끝에　바이오틴이　표지된　압타머의　다른　한쪽　끝에　있는　반응성　그룹과　결합하는　표지리간드를　제조할　수도　있다.
상기　리포터를　구성하는　구성단위　사이에　있는 스페이서(spacer)는　그　길이는 5~1,000개의 뉴클레오티드로　구성된　단일가닥핵산이며　리포터의　반응성　그룹에　결합하는　리간드　혹은　생체분자의　속성에　따라　그　길이를　결정할　수도　있다.
상기　리포터의 반응성 그룹은 표적표자　또는　리간드의 반응성 그룹과 선택적으로 커플링하기에 적합한 임의의 친핵성 또는 친전자성 그룹을 포함하며, 바람직한 반응성 그룹은 아미노그룹, 카르복실그룹, 치올그룹 등을 포함한다.
상기　리포터의 반응성 그룹은 반응성 친핵성 그룹인 디케톤, 아실 베타-락탐,　활성 에스테르, 할로케톤, 사이클로헥실 디케톤 그룹, 알데하이드 또는 말레이미드를 형성하기 위해 배열되는 하나 이상의 C=O 그룹을 포함한다. 다른 그룹은 락톤,　무수물, 및 알파-할로아세트아미드 또는 에폭사이드 및 기타의 공지된 친전자성 그룹이 포함된다.
상기 리포터의 신호발생부는　신호태그를　기본　구성단위로　하여　연속적으로　배열된　하나의 단위체를 구성하여　생체분자를　특이적으로　지시하도록　하는　신호태그가　반복적으로　이루어진　단일가닥핵산으로　여기서,　바람직하게 4~10　개의　신호태그로　구성될　수　있다.　신호태그에　부착된　단일가닥핵산으로　다른　신호태그와　연결되어　하나의　단위체를　형성하며　또한,　단위체가　연속적으로　연결된　구조체를　사용하여　신호강도를　강화할　수　도　있다.　이의 제조는 공지된 방법으로 실시할 수도 있다(미국 특허등록 번호 US 8,519,115 B2를 참조). 신호발생부의　단일가닥핵산의　한　쪽은　바이오틴,　다른　끝은　반복구조부　또는　스페이서가　결합할　수　있다.　
상기　신호태그는　형광태그와　화학발광　등이　있으며,　생체분자 값을 분석할 수 있도록 생체분자 또는 리간드를 표지하는데 사용될 수 있다. 상기 신호태그는 공지의 기술(미국 특허등록 번호 US 8,519,115 B2를 참조)을 사용하여 생체분자 또는 리간드에 대하여 특이적으로　지시하도록 구성될 수 있고, 그 후 대응하는 생체분자 값을 검출하기 위하여 사용될 수 있다.
상기 형광 표지는 형광 염료 분자로 상기 형광 염료 분자는 인돌륨 고리의 3-탄소 상의 치환기가 화학적 반응기 또는 복합 물질(conjugated substance)을 포함하는, 적어도 하나의 치환된 인돌륨 고리 시스템(indolium ring system)을 포함한다. 상기 염료 분자는 알렉사플루오르 488(AlexaFluor 488), 알렉사플루오르 532(AlexaFluor 532), 알렉사플루오르 647(AlexaFluor 647), 알렉사플루오르 680(AlexaFluor 680) 또는 알렉사플루오르 1000(AlexaFluor 1000)과 같은 알렉사플루오르 분자를 포함한다. 상기 염료 분자는 두개의 상이한 알렉사플루오르 분자와 같은 제1형 및 제2형의 염료 분자를 포함한다. 상기 염료 분자는 제1형 및 제2형 염료 분자를 포함하고, 두개의 염료 분자는 서로 다른 방출 스펙트럼(emissioni spectra)를 가진다.　신호태그는　공지된　기술로　염료분자를　코팅하여　가시광선　영역에서 다양한 색상을　구현하도록　제조된　나노섬유　또는　반응성　그룹이　코팅된　금，　은　나노입자를　연결시킨　복합물질　등도　사용할　수도　있다．
형광발광(fluorescence)은 넓은 범위의 분석에 적합한 다양한 기구를 사용하여 측정할 수 있다. 분광형광계로 미세역가 플레이트, 현미경 슬라이드, 프린팅된 어레이(printed arrary), 큐벳(cuvettes) 등을 분석할 수 있다.
화학발광 태그는 생체분자 값의 검출이 가능하도록 생체분자/리간드 복합체를 표지하는데 선택적으로 사용할 수 있다. 적절한 화학발광 물질은 임의의 옥살릴 클로라이드(oxalyl chloride), 로다민 6G, Ru(bipy)32 +, TMAE(tetrakis(dimethylamino)ethylene), 피로갈롤(1,2,3-트리히드록시벤젠)(Pyrogallol(1,2,3-trihydroxibenzene)), 루시레닌(Lucigenin), 퍼록시옥살레이트(peroxyosalates), 아릴 옥살레이트(Aryl oxalates), 아크리디늄 에스테르(Acridinium esters), 디오세테인(dioxetanes) 및 그 이외의 것들을 포함한다.
바람직하게, 상기　리포터은　바코드　시스템(barcode system)으로 4종류의 dye(Alexa dye 3종류, Cy3)를 길게 늘어트린 바코드 마다 특이한　신호를 형성할 수 있도록 제작된　단일가닥핵산이고 생체분자를 특이적으로 지시할 수 있으며, 최대 800개의 종류에 대해 특이한　신호를 형성할 수 있도록 제작하였다.　리포터 분자는 에피 형광 현미경에 의해 촬영할 때의 ~300　nm 나노 스폿을　형성하며, 각각의 선형 순차적 ７종류의 표시된 영역을 가진다.
상기 분석 방법은 상기 생체분자 값에 대응하는 분석 가능한 시그널을 생성하는 효소/기질 화합물을 분석할 수 있다. 일반적으로, 상기 효소는 분광광도법, 형광발광 및 화학발광을 포함하는 다양한 기술을 사용하여 측정할 수 있는 발색성(chromogenic) 기질의 화학적 변경을 할 수 있다. 상기 검출 방법은 측정가능한 시그널을 생성하는 형광발광, 화학발광, 방사성 핵종 또는 효소/기질 화합물의 조합일 수 있다. 멀티모달 시그널링(multimodal signaling)은 생체분자 분석에서 유일하고 유리한 특성을 가질 수 있다.
리포터의　반복구조부는 단일가닥핵산 단위체가　반복적으로　연결된　구조로　구조 단위체는 10~50개의　뉴클레오티드로　구성될 수 있으며 5~10개의　단위체가　연속적으로 연결된　구조가　바람직할 수도 있다. 구성　단위체들의　Tm(melting temperature) 변이를　최소화하도록　염기서열을　구성하며　바람직한 Tm의　차이는　１～２℃이다．　반복구조부의 염기서열은　고정핵산분자의　염기서열과　상보적　결합을　하여　리포터를　고형지지체에　고정시키는　역할을　수행할　수　있다.　　
도1에　도식된　바와　같이,　“포획리간드”는　리간드와　수확물질이　결합한　구조를　말하는 것이며　생체분자　또는　리간드와　수확물질　사이에　5~1,000개의 뉴클레오티드로　이루어진　단일가닥핵산인　스페이서(spacer)가　있을 수도 있다.
본　발명에서는 리간드에 대한 수확물질의　부가는 스페이서를　이용하거나　또는　직접　결합할　수도　있으며　수확물질은　자성비드나　비드이다．
“수확물질"은 본　발명에서 분자가 공유결합 또는 비공유결합 중 하나를 통하여 생체분자　또는　리간드에　직접 또는 간접적으로 부착될 수 있는 임의의 기질을 말하는 것으로 생체분자　 및　생체분자를　포함하는　복합체를　수확하기　위해　사용될 수도 있으며　카르복시(carboxy), 아미노(amino) 또는 하이드록실(hydroxyl)기와 같은 반응성 그룹,　리간드와 바이오틴(Biotin)을　사용하여　생체분자에　결합할　수　있다．　
바람직하게　수확물질은　비드　또는 자성비드(magnetic bead)을　사용할　수　있다.
도１에　도시된　바와　같은,　“포획경쟁분자”는　 분석하고자하는 생체분자　또는　분석하고자하는 생체분자에 대한 리간드와　상기　수확물질이　결합한　구조를　말하는　것이며　상기 생체분자　또는 상기　리간드와　수확물질　사이에　10~50염기로　이루어진　단일가닥핵산인　스페이서(spacer)가　있을　수도　있다.　상기 생체분자로　포획경쟁분자를　제조하는　경우는　리간드와　생체분자의　반응에서　상기 생체분자에　대한　경쟁분자이다.　포획경쟁분자는　상기 생체분자,　상기 생체분자의　유사체와　상기 리간드를　사용하여　제조할　수도　있다.
본　발명에서는　표적분자에　대한　수확물질의　부가는　스페이서를　이용하거나　또는　직접　결합할　수도　있으며　수확물질은　자성비드나　비드이다.
도1에 도시된 바와 같이, “고정핵산분자”는　리포터의　반복구조부를　구성하는 단위체의　염기서열에　상보적인　염기서열로　이루어진　단일가닥핵산이고　지지체결합물질이　단일가닥핵산에　표지된　구조이다.　바람직하게　단일가닥핵산은 10~50개의　뉴클레오티드로 구성될　수　있다.　고정핵산분자가　리포터의　반복구조부에　상보적으로　결합하여　형성된　복합체는　지지체결합물질에　의해　지지체에　결합함으로　리포터를　고형지지체에　고정시켜 유효한 스폿의 이미지를 형성할 수 있도록 한다.　
바람직하게 고정핵산분자에　대한　지지체결합물질은　바이오틴이고　단일가닥핵산의　한쪽 끝에　표지될　수　있다.
"지지체결합물질"은 본 발명에서 분자가 공유결합 또는 비공유결합 중 하나를 통하여 지지체에　직접 또는 간접적으로 부착될 수 있는 임의의 기질을 말하는 것으로 카르복시, 아미노 또는 하이드록실기와 같은 반응성 그룹,　리간드와 바이오틴을　포함하는　군에서　선택할　수　있다.　
바람직하게　상기　“결합지지체”의　제조에 사용하는 특정성분은　스트렙타비딘(streptavidin)　또는 아비딘(avidin)일 수도 있으며, 일실시례에서　아크릴(acrylic)인　지지체에 스트렙타비딘(streptavidin), 아비딘(avidin)이　코팅된　커버슬립이　적층하여　수행할　수도　있다.
바람직하게　지지체결합물질은　바이오틴(Biotin)을　사용할　수　있다.
본 발명은 생물학적　의미　결정을 위한 생체분자를 계수하는　방법에　관한　것으로　생체분자를 다중 검사하는 방법, 시약, 기구, 시스템 및 키트를 포함한다.
도２는 상기 코팅계수방법의 흐름도이고, 도２에 도시된 바와 같이, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 생체분자를　분석하고자하는　시료를 준비하는　단계,　상기　준비된　시료를　코팅지지체에　고정시키는　단계,　상기　생체분자가　고정된　코팅지지체에　표지리간드를　처리하여　코팅지지체－생체분자-표지리간드 복합체를　형성하는　반응용액을　제조하는　단계,　상기　반응용액에서 형성된　코팅지지체－생체분자-표지리간드　복합체를　정제하는 단계로　구성한다.
본　발명에서　상기　코팅계수방법에서　사용하는 “코팅지지체”는　나이트로셀룰로스(nitrocellulose) 막, ELISA　플레이트,　또는　C4, C8 또는 C18 알킬기(Alkyl group)이　코팅된　비드를　사용할　수도　있다.　
상기　지지체는 본원에서 분자가 공유결합 또는 비공유결합 중 하나를 통하여 직접 또는 간접적으로 부착될 수 있는 표면을 가지는 임의의 기질을 말하며，　본　발명에서 제공하는 장치를　제조하는　재료일　수도　있고，　또한，　본　발명에서　상기　지지체에　특정성분을　코팅하여　상기　표지리간드가　결합할　수　있는　기질을　제조할　수　있으며　이를　“결합지지체”라，　또한，　상기　코팅계수방법에서　상기　지지체에　특정성분들을　코팅하여　시료가　비특이적인　결합할　수　있는　기질을　제조할　수　있으며　이를　“코팅지지체”라고　지칭하였다.　본　발명에서　생물분자를　계수하는　장치를　상기　지지체로　제조할　수도　있다．
상기　지지체는 막, 칩(예를 들어, 단백질 칩), 슬라이드(예를 들어, 유리 슬라이드 또는 커버슬립), 컬럼, 속이 빈 형태(hollow), 고체, 반고체(semi-solid), 예를 들어 비드(bead)와 같은 세공(pore) 또는 공동(cravity)을 가지는 입자,　겔(gel), 광섬유 물질(fiber optic material)을 포함하는 섬유(fiber), 매트릭스(matrix) 및 샘플 용기(receptacle)를 포함할 수 있는 다양한 물리적 형태를 가질 수 있다.
지지체인　대표적인 샘플 용기는 샘플 웰(wells), 튜브, 모세관, 바이알 및 샘플을 고정할 수 있는 임의의 다른 관(vessel), 홈(groove) 또는 굴곡(indentation)을 포함한다.　샘플 용기는 미세역가 플레이트(microtiter plate), 슬라이드, 미세유동 장치 등과 같은 다중-샘플 플랫폼 상에 포함될 수 있다. 지지체는 천연 또는 합성 물질, 유기 또는 무기 물질로 이루어질 수 있다. 표지리간드를 포획하는 고체 지지체 조성물은 일반적으로 부착 방법(예를 들어, 공유 부착에 따라 부착된다. 다른 대표적 용기는 그 안에서 검정 및 관련 조작이 일어날 수 있는 미세액적(microdroplet) 및 미세유체(microfluid)가 조절되거나 부피가 커진 오일(b㎕k oil)/수성 유제를 포함한다. 적절한 고체 지지체는 플라스틱, 레진, 다당류, 실리카 또는 실리카소재인 물질, 기능화된 유리(functionalized glass), 개질된 실리콘(modified silicon), 탄소, 금속, 무기 유리(inorganic glasses), 막, 나일론, (실크, 울 및 코튼과 같은) 천연 섬유, 폴리머 등을 포함한다. 상기 물질은 포획리간드의 부착을 위해 사용되는 카르복시, 아미노 또는 하이드록실기와 같은 반응성 그룹과 스트렙타비딘（streptavidin), 아비딘(avidin) 등을 포함할 수 있는 지지체로 구성된다. 고분자성 지지체는 폴리스티렌(polystyrene), 폴리에틸렌 글리콜 테트라프탈레이트(polyethylene glycol tetraphthalate), 폴리비닐 아세테이트(polyvinyl acetate), 폴리비닐 클로라이드(polyvinyl chloride), 폴리비닐 피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone), 폴리아크릴로니트릴(polyacrylonitrile), 폴리메틸 메타크릴레이트(polymethyl methacrylate), 폴리테트라플루오로에틸렌(polytetrafluoroethylene), 부틸 고무(butyl rubber), 스티렌부타디엔 고무(styrenebutadiene rubber), 천연고무, 폴리에틸렌(polyethylene), 폴리프로필렌(polypropylene), (폴리)테트라플루오로에틸렌((poly)tetrafluoroethylene), (폴리)비닐리덴플루오라이드((poly)vinylidenefluoride), 폴리카보네이트(polycarbonate) 및 폴리메틸펜텐(polymethylpentene)을 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 적절한 고체 지지체 입자는 루미넥스 -타입 코드 입자(Luminex -type encoded particles), 자성 입자 및 유리 입자와 같은 코드 입자를 포함한다.
도３은　포획계수방법의 흐름도이고,　도３에 도시된 바와 같이, 본 발명은　하나 또는 그 이상의 생체분자를　분석하고자하는　시료를 준비하는　단계,　상기　준비된　시료에　포획리간드와　표지리간드를　노출시켜　포획리간드-생체분자-표지리간드 복합체를　형성하는　반응용액을　제조하는　단계,　상기　반응용액에서 형성된　포획리간드－생체분자-표지리간드　복합체를　정제하는　단계로 구성한다.
도４는　경쟁계수방법의　흐름도이고, 본 발명은　하나 또는 그 이상의 표적분자를　분석하고자하는　시료를 준비하는　단계, 상기　준비된　시료에　포획경쟁분자와　표지분자를　노출시켜　복합체를　형성하는　반응용액을　제조하는　단계 및　상기　반응용액에서 형성된　포획경쟁분자－표지분자　복합체를　정제하는　단계로 구성하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 상기　코팅계수법, 포획계수법과　경쟁계수법에서　정제한　표지리간드가　포함된　복합체의　표지리간드를 계수 분석하고　상기　분석결과로　부터　시료의 생체분자 값을 분석한다.
본 발명에서 코팅계수법 및 포획계수법에서 반응용액에 존재하는 생체분자는 표지리간드와 결합하여 생체분자-표지리간드 복합체를 형성하고 복합체의 형성정도는 생체분자의 양에 비례한다. 생체분자에　대한 정량분석 결과인 생체분자 값은 최종적으로 정제된 표지리간드를 포함하는 복합체에서 해리된 표지리간드에서 발생하는 신호인　스폿의 계수 분석하여　얻은　결과를 바탕으로 생체분자　값을　분석된다.
특히, 경쟁계수법은 상기 반응용액에서 형성된 포획경쟁분자－표지리간드 복합체(complex)를　분리하여　상기　복합체에서　해리된　표지리간드를 분석하여 결정한다. 즉, 분석하고자하는 생체분자와　포획경쟁분자의 표지리간드에　대한　반응은　 경쟁적 반응으로 생체분자－표지리간드　복합체와　포획경쟁분자-표지리간드 복합체를　형성한다．　반응용액에서 포획경쟁분자-표지리간드 복합체의 형성정도는 생체분자-표지리간드 복합체의 형성정도에 의존하여 결정됨으로 포획경쟁분자-표지리간드 복합체의 신호를 분석하여 생체분자 값을 결정할 수 있다.　포획경쟁분자－표지리간드　복합체만을　수확하여　표지리간드를　해리시켜 해리된　표지리간드에서 발생하는 신호인　스폿의 계수 분석하여　얻은　결과를 바탕으로 생체분자　값을　분석된다.
생체분자에　대한 정량분석 결과인 생체분자 값은 최종적으로 정제된 표지리간드를 포함하는 복합체에서 해리된 표지리간드를 계수하여 기 작성된 표준곡선을 이용하여 생체분자와 결합하는 표지리간드의 량을 평가하여 생체분자 값을 결정한다.
상기　코팅계수법,　포획계수법과　경쟁계수법의　상기 생체분자 값은 생물학적 샘플에서 하나 또는 그 이상의 생체분자를 연속적 분석이 가능하게 하는 다중분석을 사용하여 결정할　수　있다. 다중분석에서, 개개의　상기　복합체들에서　해리되고　개개의　생체분자를　지시하는　신호발생부위가　있는　표지리간드들을 지지체 상의 별개의 위치에 직접 또는 간접적으로, 공유결합 또는 비공유결합으로 고정화시킨다. 　다중분석은 지지체의 특정부위에　결합한　표지리간드에　있는　양자점(quantum dot)과 같은 신호발생부에서　발생하는　독특한　신호에　의해　둘　이상의　생체분자들을　구분할　수　있는　기구에　의해　실현한다．　개개의 기구는 생물학적 샘플에서 검출될 각각의 다중 생체분자 중 하나의 분석을 위하여 사용한다. 개개의 기구는 생물학적 샘플에서 각 생체분자를 동시에 처리할 수 있도록 구성될 수 있다. 예를 들면, 미세역가 플레이트는 플레이트 내의 각 웰이 생물학적 샘플에서 분석될 다중 생체분자 중 하나를 특별하게 분석하는데 사용되는 것처럼 사용할 수도 있다.
도５에　도식된 바와 같은,　생체분자　계수분석　장치(1)는 하나 또는 그 이상의　생체분자를　분석하고자하는　시료를　준비하는 시료처리구(20), 상기　준비된　시료의　생체분자들로부터　복합체를　형성시키고　상기　복합체에서　결합한　표지리간드를　해리하는 반응구(30)와　상기　해리된　표지리간드를　분석하는　분석구(40)가 제작되고,　상기　시료처리구(20),　반응구(30)와　분석구(40)를　상기 지지체(10)에서 노즐(52)로　연결하여　시료,　시약과　유체를　이송하는　유체이송부(50),　상기　장치　구성단위와　유체이송을　통합　운영　제어하는 운영제어시스템(60)와　상기　리포터　분석결과로부터　결정된　생체분자　값을　임상검사　값으로 전환하여 생물학적 의미를　결정하고,　생체정보를　입출력하며　외부　서버와　송수신하는　생물학적 의미 결정 시스템(100)을　포함할　수도　있다.　이는 예시에 불과하며 다른 구성을 더 포함할 수 있으며, 이와 달리 구성 중 일부를 생략하여 구현될 수도 있다.
상기　장치(1)는　지지체(10)에　시료처리부(20),　반응구(30),　분석구(40)와　노즐(52)들이　구성될　수도　있다.
목적하는 각 질병을　진단하는 생체분자와　리간드를　우선 선별한다. 분석하고자하는 시료(또는 사용자)에 대한 정보가 운영제어시스템(60)에 입력되고 유체이송구(50)는　시료,　포획리간드와 표지리간드가　시료처리구(20)를　걸쳐서　순차적으로　반응구(30)에 이송하고 혼합되어 반응용액을 제조한다. 포획리간드는 특정의 리간드에　수확물질을　포함하고 있으며 시료에　있는　생체분자와　리간드가　결합할 수 있다. 또한, 표지리간드는　생체분자를　리셉터로　하여　결합할　수　있는　리간드와 형광 태그 또는 양자점(quantum dot)로 이루어진 신호발생부를 포함하는 리포터 분자로 구성되어 있다. 각 리포터는 신호발생부의 신호로 특정 생체분자를 독특하게 동정할 수 있다.
상기　시료처리구(20)은　상기　시료를　리간드－리셉터　반응이 가능하도록　반응버퍼　등을　첨가하여　반응용액을　제조하는　챔버이고　상기　코팅계수방법에서　시료를　코팅지지체에　결합시키는　반응을　수행하는　챔버일　수도　있다.
상기 반응구(30)에서는 노즐(52)을　통해 시료처리구(20)에서　이송된　반응용액에 준비된 시약을 첨가하고　혼합기(31)에　의해　연속회전하면서　으로 반응하여　표지리간드를 포함하는　복합체를　제조하고 정제한다.　정제되고 표지리간드를 포함하는　복합체를　포획리간드의　자성비드로　자석(32)에　의해 정제하고 히터(33)로　가열하여　복합체의　표지리간드를　해리시킨　후,　해리된　표지리간드를　함유하는　상징액을　수확한다.
반응구(30)에서　수확한 상징액을　분석구(40)로　이송하고　상기 해리된　표지리간드는 표면, 예를 들면, 결합지지체인　스트렙타비딘-코팅된 표면(41) 위에 표지리간드의 바이오틴에 의해 캡처되고 표지리간드가 고정될 수 있다.　세척용액을　주입하여　세척을　２～３회　실시할　수도　있다．
운영제어시스템(60)의 관리로 상기 표면(41)을 영상장치(44)에　의해　현미경적으로 이미지화하기에 앞서, 표면(41)상에 모든 복합체를 동일한 방향으로 정렬시키기 위해 전기영동장치(42)로 전계(electric field)을 가하고　고정핵산분자가　주입되면　해리된 표지리간드의　리포터 단일가닥핵산과 고정핵산분자의 단일가닥핵산이 상보적 결합을 하고 고정핵산분자의 바이오틴이　표면(41)에　추가적으로　캡처되고　표지리간드가 고정될　수　있다.　잔여물은　잔여물 수집소(43)로　이송한다.　
상기와　같이　생체분자의 　계수에　의해　정량분석을　위한 목적으로 상업화된　제품을　사용할　수도 있다. 상업적으로 구입가능한 nCounter™ Analysis System(NanoString, Seattle, WA)이 이러한 분석을 할 수 있으나 이에 한정하는 것이 아니며 다른 시스템도 상기 분석에 이용될 수 있다. 　
마이크로유체(가령, "랩-온-칩(lab-on-a-chip)") 장치가 시료에서 생체분자의 정량분석을 위한 본 발명의 방법에 이용될 수 있다.　본　발명의　생체분자　　계수분석　장치(1)를　구성하는　시료처리구(20),　반응구(30),　분석구(40)와　유체이송구(50)를　마이크로유체　장치로　구동할　수　있다．　이런 장치는 본 명세서에서 기술된 바와 같이 가공되지 않은 시료에서 특정한 생체분자의 분석에 이용될 수 있다.
특정한 생체분자의 수준에서 변화를 검출하기 위해 다양한 영상장치(44)가 이용될 수 있다. 따라서 이런 마이크로유체 칩 기술은 본 명세서에서 기술된 방법에서 이용을 위한 진단과　예후 장치에 이용될 수 있다. 이들 마이크로유체 장치는 표지된 양자점 및 기타 리포터의 레이저 여기(laser excitation)를 통합할 수 있다. 이들 장치는 또한, 가시광선을 비롯한 다양한 검출 기전, 그리고 전하 결합 소자(charge-coupled device) 기초된 카메라를 비롯한 다양한 디지털 이미지화 센서 방법을 통한 결과적인 발광(emission)의 검출을 통합할 수 있다. 이들 장치는 또한, 결과적인 신호와 데이터를 진단 정보로 번역하기 위한 이미지 처리와 분석 능력을 통합할 수 있다.
리포터의 특정 신호를 검출 할 수　있는 기술 분야에서 사용 가능한 임의의 수단(44)에 의해 검출된다. 리포터가 형광 표지인 경우, 적절한 광원은 램프, 크세논 램프, 레이저, 발광 다이오드　등이　있으며 이들의 조합 아크에 한정되는 것은 아니다. 적절한　광원관　관련된　광학 검출 시스템은 역위형광 현미경(inverted fluorescent microscope), 에피-형광 현미경(epi-fluorescent microscope) 또는 공초점 현미경(confocal microscope)을 사용한다. 현미경은 리포터에　상응하는 스폿의 형광태그　순서를 결정하기 위해 충분한 공간 분해능으로 검출 할 수 있도록 사용된다. 표적 분자와　복합체를　형성하여　고형지지체에　고정된 리포터의 화상을 얻을 수　있다. 리포터이 세 가지 다른 색상인 알렉사 488（Alexa 488), Cy3 및 알렉사 647(Alexa 647) 를　사용한 경우, 각각의　염색시약은 상이한 채널들에서 분석되며, 스폿들의 행으로 볼 수　있도록　하는 제 1 및 제 2 레지스터는 몇 픽셀를 자리바뀜시켜 각각 개별적으로 등록할　수　있도록　한다(US 특허 제 7,4103,767).
현미경 대물렌즈에 대한 중요한 고려 사항은 개구 수(numerial aperture; NA)에 의해 결정되는 광학 해상도이다. 큰 NA를　사용하면 광학 해상도가　더　높다. 필요한 NA는 δ = 0.61λ / NA (δ = 광학 해상도 및 λ = 파장)에 기초하며 바람직하게는 1.07이다. 대물렌즈에 의한 수집되는 광량은 NA4 / 대물렌즈의　배율2에 의해 결정된다. 따라서, 가능한 많은 광을 수집하기 위해서, 높은 NA 및 낮은 배율인　접안렌즈를　사용하여야　한다.
CCD 카메라를 선택할 때, 첫 번째 고려 사항은 부분적으로 이미징 시스템의 해상도를 결정하는 최종 픽셀 크기이다. 최적의 광학 해상도는 CCD 카메라에 의해서만 결정되는　것은　아니다. 생체분자에　상응하는　각각의　스폿은 적어도 두개의 화소로　명확하게　구분되기　위해서는　광학 해상도는　210~300 nm이어야　하며　이는　60 X 확대 후에 CCD 칩　상에서는　12.6～18 μm에 해당한다.　또는, CCD 칩의 화소 크기는 거의 6.3～9.0 μm　이어야한다.　두번째 고려 사항은 화소 사이즈, 양자 효율, 판독 잡음 및 다크（dark) 노이즈　등의 많은 요인에 의해 결정되는 검출 감도이다. 높은 감도를 달성하기 위해, 큰 집적 영역을 줄 수 있는 큰 픽셀 크기, 높은 양자 효율, 저 노이즈 정성 카메라를 선택해야　한다. 이 기준에 적합한　카메라는　Hamamatsu 사의　Orca-Ag　카메라이다． 칩 크기가 1344 X 1024 픽셀이며 60 × 대물 렌즈를 사용하는 경우, 시야는 144 X 110 μm2이다.
본　발명의　생체분자는　낮은 1,000조분의 1몰 범위(femtomolar range)의 농도에서 측정되었다. 이것은 2D 겔 및/또는 질량 분석법을 사용하여 얻은 바이오마커 발견 실험에 비하여 약 4차수 정도 낮다.
도５에 도시된 바와 같이, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 생체분자를 계수하고　생물학적　의미를　생산하기 위해서,　사용자로부터　하나 또는 그 이상의　생체분자를　분석하고자하는　시료를　준비하는 시료처리구(20), 상기 시료에 포획리간드와 표지리간드를　노출시켜　반응용액에서 으로 생체분자-표지리간드 복합체와 포획리간드-표지리간드 복합체를　형성하는　반응구(30), 상기 형성된　포획리간드-표지리간드 복합체의　리포터를　분석하는　분석구(40), 상기　시료처리구(20), 반응구(30)와　분석구(40)를　노즐로　연결하여　시료,　시약 및　유체를　이송하는　유체이송구(50)　및　상기　장치의　구성단위와　유체이송을　운영　제어하고,　상기 분석구에서 입력되는　리포터　분석결과로부터　하나 또는 그 이상의 생체분자　값을 결정하고 운영제어시스템(60)으로　구성된　생체분자　계수　장치를 제공하고 있다.　이는 예시에 불과하며 다른 구성을 더 포함할 수 있으며, 이와 달리 구성 중 일부를 생략하여 구현될 수도 있다.
도5에 도시한 바와 같이, 상기 생물학적 의미 결정 시스템(100)은 크게 네 개의 부분 시스템으로 구성되어 있으며, 생물학적 의미 결정 엔진(104)인 ‘데이터분석/예측모델 생성’ 모듈과 ‘진단클라이언트’모듈, 상기 생체분자 계수분석 장치와의 연동 모듈인 ‘분석 장치 인터페이스’,　그리고 다른 모듈간의 통신과 데이터 저장을 담당하는 ‘통신서버’가 유기적으로 결합된 시스템일 수도 있다.
도6에 도시한 바와 같이, 상기 생물학적 의미 결정 시스템(100)의 구동은 크게 시스템 구축단계와 시스템 적용 단계로 구분되며, 시스템 구축 단계는 ① 질병의 특성을 잘 반영하도록 구성된 정상인/환자 표준시료 집합을 구성하여, ② 해당 시료 집합에 대한 정도관리 및 측정용의 표준물질을 활용하여 하나 또는 그 이상의 생체분자를 생체분자　계수분석을 실시하고, ③ 생체분자　값을 ‘생체분자　계수분석 장치 인터페이스 모듈’을 통해 시스템에 입력하고, ④ ‘데이터 분석/예측모델 생성’ 모듈에서 기본적인 전처리를 하여 인공신경망 알고리즘의 ’학습데이터‘를 생성하고, ⑤ 인공신경망 알고리즘으로 학습데이터를 이용하여 생물학적 의미 분석 모델을 생성하고, ⑥ 생성된 생물학적 의미 분석모델을 컴퓨터에 저장하는 과정이며, 시스템 적용 단계는 ① 상기 컴퓨터에 저장된 생물학적 의미 분석모델을 ‘생물학적 의미 분석 클라이언트’에 장착하고, ② ‘생물학적 의미 분석 클라이언트’를 구동하고, ③ 생체분자　계수분석 장치를 이용한 사용자 생체분자 값을 생성하고, ④ ‘생체분자　계수분석 장치 인터페이스’를 통한 데이터를 입력하고, ⑤ ‘생물학적 의미 분석 클라이언트’에서 임상검사 값의 분석 및 결과 가시화하며, ⑥ 상기 임상검사 값 및 생물학적 의미 분석 결과 컴퓨터에 저장하는 과정일 수도 있다.
사용자의 생체분자　값을 이용한 임상검사 값과 생물학적 의미를 결정하기 위한 구성은, 상기 사용자의 하나 또는 그 이상의 생체분자 값을 이용하여 생물학적 의미 결정 시스템에서 전 처리를 수행하는 모듈, 상기 생물학적 의미 분석 클라이언트를 로딩하여 사용자의 임상검사 값을 산정하고 이에 상응하는 생물학적 의미를 확인하는 모듈, 및 교차검정을 통해 시스템의 성능을 평가하는 모듈일 수도 있다.
도7에 도시된 바와 같이, 생물학적 의미가 잘 정의된 시료인 표준시료에 대한 하나 또는 그 이상의 생체분자 값으로 생물학적 의미에 따라 데이터베이스를 구축하여 특징선택을 한 후 선정된 특징인 생체분자로 학습된 분류기를 저장하는 단계와 사용자의 하나 또는 그 이상의 생체분자 값을 결정하고 상기에 추출된 유용한 생체분자들로 상기 학습되고 저장된 분류기를 이용하여 임상검사 값을 결정하고 생물학적 의미를 결정하는 단계로 시스템을 구성할 수 도 있다.
상기　하나 또는 그 이상의 생체분자 값을 대상으로부터 임상검사　값을 산정하고,　생물학적 의미를　결정하며,　사용자의　생체분자정보와 건강상태정보를　입출력하며　외부　서버와 송수신하는　생물학적 의미 결정 시스템(100)을　더　포함하는　것을　특징으로　하는　임상의사결정지원시스템을 제공하고 있다.
상기　임상검사　값은　질병이나 다른 상태를 진단, 치료, 완화, 처치, 예방을 목적으로 생물학적 의미에 관한 의사 결정(Decision Making)을 하는 과정을 지원하는 “분류”, “점수”, “지수”를　의미하고, 생물학적 의미가 결정된 시료 또는 시료를 채취한 사람의 임상 정보(Clinical Information) 및 상기　하나　또는　그　이상의　생체분자　값들을 수집한 후, 통계학적　기법　또는　기계학습알고리즘을 이용하여 상기　수집한 정보들로부터 질환을 추론 또는 판별할 수 있도록 하는　생산된 특이적 결과일 수도 있다.
도８에　도시한　바와　같이，　상기　입력되는 생체분자　값에서　상기　임상검사　값의　산정을　위해,　상기 하나 또는 그 이상의 생체분자에서 중요 변수를 찾아 차원을 축소하거나 특성의 변형을 통해 주요 생체분자들을 찾아내는 특징 선택(Feature Selection) 절차를　추가적으로 더 포함할 수도 있다.
상기　특징선택은　입력받은　학습 집단의 생체분자 값으로 최대한 정확한 출력을 내도록 학습을　수행하여　특징 집합의 개개별 특징의 독립된 생체분자 값만으로 평가하는　필터(filter)방법, 특징선택과 분류기를 하나의 쌍으로 결합하여　특정 분류기의 분류 성능을 평가 척도로 사용하는　래퍼(wrapper)방법,　특징선택과　분류기　학습이　동시에　일어나는　임베디드(Embedded) 방법　또는　필터방법과　래퍼　방법을　혼합한　하이브리드　방법으로　이루어진　군에서　선택되어진　방법으로　결정질 수도 있다. 특징 선택 방법은 특징 부분집합의 생성 방법에 따라 크게 두 가지 유형이 있은데, 첫 번째로, 필터방법은 특징에서 부분집합을 먼저 선택하여 이를 분류 알고리즘을 실행하는데 사용하는 것이다. 선택된 부분집합이 얼마나 좋은가에 대한 평가는 부분집합에 속한 특징과 분류 기준 사이의 고유 속성들을 이용하여 평가하게 된다. 필터방법의 예로 정보이득(information gain)을 들 수 있다. 이는 기계학습 분야에서 용어의 적합도 기준으로 자주 사용되며, 문서에서의 출현 빈도뿐 아니라 출현하지 않은 빈도까지 고려하여 각 범주에서의 용어 정보량을 계산 한다. 두 번째로, 래퍼방법은 최적의 특징을 찾기 위해 분류 알고리즘을 데이터세트(dataset)에 적용시키는 것이다. 필터방식과 달리, 직접 분류기를 사용하여 해당하는 특징 부분집합의 우수성을 평가하며, 사용할 분류기를 미리 결정한 후 매번 특징 부분집합이 생성될 때 마다 분류하고 그 분류 성능이 우수함의 척도가 된다. 래퍼 방법은 특질의 수가 많을 때 시간이 많이 걸린다. 래퍼방법의 대표적인 예는 유전 자 알고리즘(genetic algorithm, GA)이다.
상기 전 처리된 결과를 가지고 학습을 수행하여 환자의 모델을 생성하는 모듈은 선택된 특질들을 적합한 분류기(Classifier)를 통해 각 클래스별로 분류하는 절차이다.
본 발명에서 인공신경망(Artificial Neural Network)을 사용하였는데, 입력과 출력에 따라 행동을 결정하는 특성 때문에 패턴인식, 함수근사, 분류기법 등 다양한 분야에서 응용되고 있다. 인공신경망은 그 구조는 여러 개의 층(layers), 노드(nodes), 신경망간 연결 가중치로 구성된다. 본 발명에 사용하는 신경망 층간 연결방식은 전향(Feed-forward)방식이다. 입력패턴에 다라 각 노드에 대한 신경망 연결 가중치와 활성화 함수를 이용하여 출력값을 산출하였다. 생성된 결합정보를 통하여 어떤 일을 처리했을 때 추정한 값과 실제 결과 값이 상이한 경우, 산출된 값을 실제 결과 값과 비교하면서 오차를 줄이는 과정을 반복해서 찾아내는 방식이다.
상기　필터방법은 정보이득(information gain), 신호 대 잡음비(signal to noise　ratio), t-통계량, 피어슨 상관계수, 주성분 분석(principal　component analysis)으로　이루어진　군에서　선택되어지는　하나로 이루어지고， 여기서 상기 선택된 생체분자 값으로부터 상기 임상검사 값의 결정은　다층신경망, k-최근접 이웃, 결정 나무(decsion　tree), 지지 벡터 기계(support vector machines), 피셔의 선형판별식(Fisher's linear　discriminant analysis)으로　이루어진　군에서　선택되어지는　하나로 이루어진 분류기로 수행되는 것일 수도 있다.
상기　래퍼방법은 최적의 생체분자를 찾기 위해 분류 알고리즘을 데이터세트에 적용시키는 것으로　유전자 알고리즘(genetic algorithm, GA)일 수도 있다.
상기 생물학적 의미는 상기 시료 또는 시료를 채취한 사람의 생리적인 변화를 의미하고, 상기　임상검사　값에　상응하여　예방, 진단, 치료, 완화와 처치의　건강관리를 목적으로 의사 결정(Decision Making)을　하는　과정에　필요한　정보일 수도 있다.
상기 생물학적 의미 결정은 사용자의　상기　임상검사　값에　기초하여 하며, 실시일레로 사용자의 임상검사 값은 사용자와 대조군 또는 비교군 데이터베이스의 유사도일 수도 있으며　이런 경우에 상기 대조군과　비교군을 구성하는　시료들의 임상정보를 참조하여 생물학적 의미를 결정할 수도 있다.
상기 사용자의　생체정보는 생체분자 값, 임상검사 값과 생물학적 의미를 포함하는 생체분자정보 또는 사용자 건강상태정보로 이루어진 군에서 그 중의 어느 하나 이상을 포함할 수도 있다.
여기에서,　보다 구체적으로 상기 생체분자정보는, 본 발명의 생체분자　　계수　분석　장치를　포함한　의료 검사장비 등으로 측정한 시료 분석 결과 및 상기 시료 분석 결과를 측정한 의료 검사장비의 정보 및 물리적 객체(Object) 등을 포함할 수 있다. 상기　건강상태정보는 사용자의 건강상태를 알 수 있는 물리적 객체(Object), 디지털 이미지화 된 시각정보, 디지털 포멧(Digital Format)의 그래픽 디자인(Graphic Design) 및 디지털　이미지의　분석자료　등의　텍스트(Text) 정보를 더　포함하여 이루어질 수 있다.
또한, 상기 사용자 건강상태정보는 체중계 등을 이용하여 사용자가 측정한 사용자의 체중 계체 결과를 포함할 수 있으며, 체중계와 같이 측정 장치의 제품 종류가 특별히 중요하지 않은 경우에는, 달리 측정 장치는 제외하는 것으로 설정할 수도 있다. 아울러, 상기 사용자 건강상태정보는 하나 이상의 건강 검진 결과지(Res㎕t　Paper) 또는 생태분자 분석 결과지(예를 들어, 혈액 분석 결과지 등)와 같이 상기 단말 사용자의 건강상태를　나타내는 텍스트를 포함할 수 있으며, 상기 단말 사용자의 건강상태를 나타내는 텍스트는 스캔(Scan) 된 전자문서에 기재된 형태 또는 종이 그 자체에 기재된 형태　각각을 포함할 수 있다.
또한, 상기 사용자 건강상태 정보의 생산은 상기　건강상태정보뿐만이　아니라，　상기 무선통신부 자체에 의해서뿐만 아니라 기 설치된 어플리케이션에 의해 이루어질 수도 있으며, 상기 무선통신부 또는 무선통신부 내 기 설치된 어플리케이션은, 상기 입력된 사용자 건강상태정보 또는 상기 메모리부에 기 저장된 사용자 건강상태정보가, 미리 정해진 기준 이하의 품질(예를 들어, 화소, 해상도 등)인 경우 상기 사용자　건강상태정보를 재입력할 것을 요구할 수 있다.
도９에 도시된 바와 같이,　생물학적 의미결정시스템(100)은 무선통신부(101),　메머리부(102),　디스플레이부(103)와　생물학적 의미 결정 엔진(104)로　구성될 수 있다.　상기 생물학적 의미 결정 엔진(104)는 상기　메머리부(102)에　저장되어 있는　분석구(40)에 의해 생산된 생체분자　값으로부터 임상검사　값과　생물학적 의미를　결정하며 이를　디스플레이부(103)에서　표시할 수도 있으며,　무선통신부(101)는　상기　메머리부(102)에　저장되어 있는　분석구(40)에 의해 생산된 생체분자의 이미지정보와　생체분자　값, 생물학적 의미결정 엔진(104)에서 생산된 임상검사　값와　생물학적 의미, 또는 무선통신부(101)의 사용자 말단　또는　생물학적 의미 결정 엔진(104)에 포함된 　OCS(operation control system) 시스템을　통해서 새로이 입력되는 사용자 건강상태 정보를 입출력하거나　외부　서버와　송수신할　수도　있다.　
다만, 이하에서 언급되는 무선통신시스템은 도 4에 도시된 구성요소들 중 적어도 하나를 포함하나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니며, 도 4에는 각각 하나의 생물학적 의미결정시스템(100), 생체정보 관리서버(200) 및 네트워크(300)만이 도시되어 있으나, 이와 달리 본 발명이 적용될 수 있는 무선 통신 시스템에서는 하나 이상의 생물학적 의미결정시스템(100), 서버(200) 및 네트워크(300)가 존재할 수　있으며, 각각의 무선통신부 및 서버 간은 서로 다른 네트워크를 통하여 연결될 수 있다.
한편, 무선통신부(101)은 새로이 입력되는 사용자 건강상태정보 또는 상기 메모리부(102)에 기 저장된 사용자 건강상태정보를 무선 통신 네트워크(300)를 통해 생체정보 관리서버(200)로　전송할 수 있으며, 상기 사용자 건강상태정보의 전송은 상기 무선통신부에 기 설치된 어플리케이션에　의해 제어될 수 있다.
상기 무선통신부(101)로부터 사용자 생체분자정보　및　건강상태정보를 포함하는 생체정보를 수신한 생체정보 관리서버(200)는, 상기 수신된 생체정보를 상기 생체정보 관리서버(200) 내 메모리부(202)에 미리 정해진 기준에 따라　저장할 수 있으며, 상기 각 저장된 생체정보를 기반으로 생체 정보 분석을 수행할 수　있다.
상기 사용자의 생체분자정보의　입출력에서는　입력은 사용자의 생체분자정보는　상기 분석구(40)와 사용자　건강상태 정보는　무선통신부(101)에 있는 무선통신부(100)의 사용자단말 또는 OCS(operation control system) 시스템，　그리고 출력은 분석결과를 확인하는 화면과, 임상검사　값에　상응하는　생물학적　의미와　임상정보를 설명할 수 있는 화면(103)으로　구성될 수도 있다.
무선통신부(101)은 본 발명의 일실시예에 있어서 사용자의　생체분자 값, 임상검사 값과 생물학적 의미를 포함하는 생체분자정보,　사용자로부터 제공 받을 수 있는 사용자 건강상태정보를 입력받아 생체정보 관리서버(200)에 전송할 수 있는 장치를 의미한다. 이 때, 무선통신부에는 하나 이상의 어플리케이션(Application)이 설치되어 있을 수 있으며, 또한 하나 이상의 데이터가 기 저장되어 있을 수 있다.
무선통신부(101)의 사용자단말의 일례로, 사용자 장치, 터미널(Terminal), MS(Mobile Station), MSS(Mobile Subscriber　Station), SS(Subscriber Station), AMS(Advanced Mobile Station), WT(Wireless terminal), MTC(Machine-Type Communication) 장치, M2M(Machine-to-Machine) 장치, D2D 장치(Device-to-Device) 장치를 포함할 수 있다. 이는 물론 예시에 불과할 뿐이며, 본 발명에서의 무선통신부는 상술한 예시들 이외에도 현재 개발되어 상용화되었거나 또는 향후 개발될 데이터 전송이 가능한 모든 장치를 포함하는 개념으로 해석되어야 한다.
디스플레이부(103)은 생물학적 의미 결정 엔진(104)에서 처리되는 정보를 표시 출력한다. 또한, 무선통신부(101)에 있는 사용자단말이 통화 모드인 경우 통화와 관련된 UI(User Interface) 또는 GUI(Graphic User Interface)를 표시할 수 있다.　또한, 사용자단말이 화상 통화 모드 또는 촬영 모드인 경우, 촬영되거나 수신된 영상을 각각 혹은 동시에　표시할 수 있으며, 이 때 UI, GUI도 함께 표시할 수 있다.
이외에도 디스플레이부(103)은 액정 디스플레이(liquid crystal display), 박막 트랜지스터 액정 디스플레이(thin film transistor-liquid crystal display), 유기 발광 다이오드(organic light-emitting diode), 플렉　서블 디스플레이(flexible display), 3차원 디스플레이(3D display) 중에서 적어도 하나를 포함할 수도 있으며,　구현 형태에 따라 디스플레이부가 2개 이상 존재할 수도 있다. 예를 들어, 무선통신부(101)에는 외부 디스플레이부와 내부 디스플레이부가 동시에 구비될 수 있다.
디스플레이부는 HUD(Head up Display), HMD(Head mounted Display) 등으로 구현될 수 있다. HMD(Head mounted　Display)란 안경처럼 머리에 쓰고 대형 영상을 즐길 수 있는 영상표시장치다. HUD(Head up Display)는 사용자의　가시영역 내의 유리에 가상 화상(virtual image)을 투영시키는 영상표시장치이다.
생물학적 의미 결정엔진(104)는 무선통신부(101) 및 생체정보 관리서버(200)의 동작들을 지시(예를 들어, 제어, 조정, 관리 등)한다. 각각의 생물학적 의미 결정엔진(104, 204)은 프로그램 코드들　및 데이터를 저장하는 것이 가능한 메모리들(102, 202)과도 연결될 수 있다. 메모리부(102))는 생물학적 의미 결정엔진(104)에 연결되어 오퍼레이팅 시스템(operating system), 어플리케이션, 및 일반 파일(general files)들을 저장할 수 있다.
본 발명의 생물학적 의미 결정엔진(104)는 프로세서(Processor), 컨트롤러(controller), 마이크로 컨트롤러(microcontroller), 마이크로 프로세서(microprocessor), 마이크로 컴퓨터(microcomputer) 등으로도 호칭될 수　있다. 한편, 생물학적 의미 결정엔진들(104, 204)는 하드웨어(hardware) 또는 펌웨어(firmware), 소프트웨어, 또는 이들의 결합에 의해 구현될 수 있다.
펌웨어나 소프트웨어에 의한 구현의 경우, 본 발명의 일 실시예는 이상에서 설명된 기능 또는 동작들을 수행하는 모듈, 절차, 함수 등의 형태로 구현될 수 있다. 소프트웨어 코드는 메모리부(102)에 저장되어 생물학적 의미 결정엔진(104)에 의해 구동될 수 있다. 메모리는 상기 생물학적 의미 결정시스템(100) 및 외부 생체정보　관리서버(200)에 위치할 수 있으며, 이미 공지된 다양한 수단에 의해 상기 생물학적 의미 결정엔진(104)와 데이터를 송수신할 수 있다.
한편, 상술한 방법은, 컴퓨터에서 실행될 수 있는 프로그램으로 작성 가능하고, 컴퓨터 판독 가능 매체를 이용하여 상기 프로그램을 동작시키는 범용 디지털 컴퓨터에서 구현될 수 있다. 또한, 상술한 방법에서 사용된 데이터의 구조는 컴퓨터 판독 가능 매체에 여러 수단을 통하여 기록될 수 있다. 본 발명의 다양한 방법들을 수행하기 위한 실행 가능한 컴퓨터 코드를 저장하는 컴퓨터 판독 가능 매체는 마그네틱 저장매체(예를 들면, 롬, 플로피 디스크, 하드 디스크 등), 광학적 판독 매체(예를 들면, 시디롬, DVD 등)와 같은 저장 매체일 수도 있다.
생체정보　관리서버(200)는 무선 통신 네트워크를 통해 데이터 송수신이 가능한 객체를 의미하며, 상기 무선통신부(101)로부터 전송된 사용자 건강상태정보를 포함하는 데이터를 수신하는 장치를 의미할 수 있다.
또한, 상기 생체정보　관리서버(200)의 일예로 클라우드(Cloud) 서버, IMS(IP Multimedia Subsystem) 서버, 텔레포니 어플리케이션(Telephony Application) 서버, IM(Instant Messaging) 서버, MGCF(Media Gateway Control Function)서버, MSG(Messaging Gateway) 서버, CSCF(Call Session Control Function) 서버를 포함할 수 있으며, 상기 서버(200)는 PC(Personal Computer), 노트북 컴퓨터, 태블릿 PC(Tablet Personal Computer) 등 데이터를 송수신할 수 있는 객체를 지칭하는 장치로 구현될 수도 있다.
한편, 네트워크(300)는 생물학적 의미 결정 시스템(100)과 생체정보　관리서버(200)간의 사용자 생체분자정보와 건강상태정보를 포함하는 생체정보 등 데이터 송수신을 위한 데이터 통신망을 의미하며, 그 종류에는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 인터넷 프로토콜(IP)을 통하여 대용량 데이터의 송수신 서비스를 제공하는 아이피(IP: Internet Protocol)망 또는 서로 다른　IP 망을 통합한 올 아이피(All IP) 망일 수도 있다.
또한, 상기 네트워크(300)는 유선망, Wibro(Wireless Broadband)망, WCDMA를 포함하는 이동통신망, HSDPA(High　Speed Downlink Packet Access)망 및 LTE(Long Term Evolution) 망을 포함하는 이동통신망, LTE advanced(LTEA)를 포함하는 이동통신망, 위성 통신망 및 와이파이(Wi-Fi)망 중 하나 이거나 또는 하나 이상을 결합하여 이루어질 수 있다. 본 발명의 일시예에 따라 디지털 이미지를 이용하여 생체 정보를 관리하는 과정은 생물학적 의미결정 시스템(100), 생체정보　관리서버(200) 및 외부기기를 포함할 수도 있다.
도10에　도시된　바와　같이, 본 발명이 적용될 수 있는 무선 통신 시스템의 도면이고 무선통신 시스템은 생물학적 의미 결정시스템(100), 외부에　있는　생체정보 관리서버(200) 및 네트워크(300)로 구성될 수 있다.　본 발명의 일실시예에 따른 생체분자　계수　분석　장치에서　상기　사용자의 시료를　분석하여　하나　또는　그이상의　생체분자　값을　생산하고,　상기 생물학적　의사결정　시스템(100)에서　사용자의　건강상태정보,　자체적으로　분석한　임상검사　값과　생물학적　의미를　분석하여　생산한　생체분자정보를　사용자에게　제공하며,　추가적으로　상기 무선통신부(101) 또는 네트워코(300)으로　상기　생체정보를　외부에 있는　생체정보　서버(200)에　송신하여　더　많은　정보를　갖고　있는　생체정보　관리서버(200)의 무선통신부(201)에서　사용자의　건강관리에　도움을　줄 수 있는　생체정보를　추가적으로　생산하여　전문가(예를　들어,　의사,　간호사　 및　건강관리인　등)와　사용자가　네트워크(300)로　수신하여　그　내용을　확인할　수　있도록　하는　모선통신시스템을　구성할　수　있으며,　이는 예시에 불과하며 다른 구성을 더 포함할 수 있으며, 이와 달리 구성 중 일부를 생략하여 구현될 수도 있다.
무선통신시스템 내 상기 내부 생물학적　의미　결정　시스템(100)에 있어서, 외부에　더 많은 생체정보(예를　들어， 사용자 상태 평가, 환자의 활동, 식이, 검사, 투약, 처치, 사용자 교육 등 사용자 진료 지침 등에 도움을 주는 정보)로 이루어진 데어터베이스가 있는 생체정보 관리서버(Server)(200)를 더 포함하고, 상기 생물학적　의미　결정　시스템(100)은, 상기 분석구(40)에서 입력된 자료에서 생체분자정보를　생산하는　생물학적　의미　결정　엔진(104), 상기 생체분자정보와　무선통신부(101)에 있는 사용자단말 또는　OCS(operation control system) 시스템에서 입력되는 건강상태정보를　미리 정해진 기준에 따라 저장하는 메모리부(102), 및 상기 생체정보를 상기 메모리부(102)에 저장 또는 네트워크(300)으로　외부에　있는　생체정보 관리서버(Server)(200)에 전송하도록 제어하는 무선통신부(101)로 이루어지고, 상기 생체정보　분석은, 생체분자정보, 건강상태정보, 생체분자정보와　건강상태를 측정하는 장치의 정확도(Accuracy)에 관한 정보, 및 생체분자정보와　건강상태 측정 주기(Period)에 관한 정보 중 생체분자정보와　함께　적어도 하나 이상의 정보를 사용하여 생체정보를 생산하는 것을 포함하며, 이를 전송할 수 있는 하나 이상의 외부기기 관련 정보 중 적어도 하나 이상의 정보를 사용할 수도 있다. 이는 예시에 불과하며 다른 구성을 더 포함할 수 있으며, 이와 달리 구성 중 일부를 생략하여 구현될 수도 있다.
이 때, 상기 미리 정해진 기준은, 상기 건강상태정보가 포함된 디지털 이미지가, 상기 사용자의 식별정보(예를 들어, 이름, 성별, 나이, 지병 등 사용자의 개인 정보 등), 상기 건강상태정보의 측정 기관 정보(예를 들어, 병원 등 건강상태정보를 측정한 기관 또는 기관의 이름 등), 상기 건강상태정보보의 측정 시간정보(예를 들어, 측정 년도, 측정 날짜, 측정 시간 등) 및 상기 건강상태정보를 측정하는 장치 정보(예를 들어, 생체 관련 정보 측정 장치의 회사, 모델명 등) 중 하나 이상의 정보에 상응하도록 구분(separate) 및 정렬(sort)되어 상기 각 사용자별로 생체정보 관리서버(200)에 저장될 수도 있다.
상기 사용자 생체분자정보가 상기 사용자의 식별 정보, 상기 생체분자정보의 측정기관 정보, 상기　생체분자정보의 측정 시간 정보 및 상기 생체분자정보를 측정하는 장치 정보 중　생체분자정보와　더불어 하나 이상의 정보에 상응하도록 구분(separate) 및 정렬(sort)되어 각 사용자별로 생체정보 관리서버(200)에 저장될 수도 있다.
또한, 상기　생체정보 분석은, 상기 사용자의 생체분자정보에 대응되는 사용자 건강상태 정보(예를 들어, 상기 사용자의 나이, 성별, 지병 등을 고려하여 건강검진 필요 여부, 평균 건강지표에서의 사용자의　수준, 예상 수명, 사용자의 인지 능력, 사용자의 우울증 정도, 사용자의 뇌/혈관 질환 유무 등), 상기 건강상태를 측정하는 장치의 정확도(예를 들어, 생체 관련 정보를 측정하는 장치의 신뢰성 평가 정보　등)에 관한 정보 및 상기 사용자의 건강상태 측정 주기(예를 들어, 사용자에게 필요한 헬스케어 서비스의　알림 정보 및 필요한 서비스의 주기 정보) 관한 정보를 사용하는 것을 포함할 수 있다.
한편, 상기 생체정보 관리서버(200)는, 상기 수신받은 생체정보를　기반으로 더 많은 생체정보(예를　들어， 사용자 상태 평가, 환자의 활동, 식이, 검사, 투약, 처치, 사용자 교육 등 사용자 진료 지침 등에 도움을 주는 정보)로 이루어진 데어터베이스가 있는 생체정보 관리서버(200)에 구축된 생물학적 의미결정 엔진(204)로 생체정보 분석을 수행한 후, 상기 분석 결과를 포함하는 더 많은 생체정보를 상기 서버 메모리부(201)에 저장 및/또는 상기　무선통신부(101)로 전송할 수도 있다.
상기 생체정보 관리서버(200)로부터 상기 더 많은 생체정보 분석결과를 수신한 무선통신부(101)은, 상기 수신된 더 많은 생체정보 분석결과를 디스플레이 할 수 있으며, 이 경우, 상기 디스플레이부(103) 내 미리 설정된 기준에 따라 상기 생체정보 분석결과가 재정렬되어 표시될 수도 있다.
예를 들어, 사용자의 나이에 따라 정렬된 더 많은 생체정보　분석결과를 수신한 경우라 하더라도 상기 사용자가 지병 종류에　따라 구분된 생체정보 분석결과를 확인하고 싶은 경우, 상기 디스플레이부(103) 또는 상기 디스플레이부에 설치된 어플리케이션의 설정을 입력하거나 미리 입력해두어 상기 지병 종류에 따라 새롭게 재정렬된　더 많은 생체정보 분석결과를 확인할 수도 있다.
또한, 상기 무선통신부(101)은, 상기 수신된 더 많은 생체정보 분석결과 또는 상기 재정렬된 더 많은 생체정보 분석결과를 하나 이상의 외부기기로 전송할 수 있으며, 예를 들어 주변 병원 서버 등에 상기 생체정보 분석결과를 전송하는 경우,　상기 주변 병원에서 해당 생체정보 분석결과를 열람하거나 또는 상기 사용자의 진료 등에 활용할 수 있다는 효과가　존재한다.
한편, 본 발명의 다른 일실시예에 따르면 상기 디스플레이부(103)에 기 설치된 어플리케이션(예를 들어, 생체정보 관리 어플리케이션)은, 앞서 언급한　생체정보 분석결과외도 상기 메모리부(102)에 기 저장된 다른 타입(예를 들어, 동영상, 혈액 분석 데이터 등)의 사용자　생체정보 분석결과를 상기 생체정보 관리서버로 전송할 수 있다.
또한, 상기 생체정보 관리서버도 마찬가지로 상기 다른 타입의 생체정보를 기반으로 상기 생체정보 분석을 수행할 수 있으며, 그 분석 결과를 포함하는 생체정보 분석결과를 저장하거나 혹은　상기 무선통신부로 전송하여 상기 사용자가 활용할 수 있게끔 할 수도 있다.
또한, 생체정보 관리서버(200)의 신호 처리, 계층 처리 등 무선통신부와의 데이터 통신에 대한 전반적인 과정은 메모리(202) 및 생물학적 의미결정 엔진(204)에 의해 제어되며, 상기 메모리(202), 무선 통신부(201) 및 생물학적 의미결정 엔진(204) 간에는 연결 관계가 형성될 수 있다.
생물학적 의미결정 시스템(100)에 포함된 무선 통신부(101)은 앞서 언급한 바와 같이 송신부 및 수신부를 포함할 수　있으며, 송신부 및 수신부는 무선통신부(201) 또는 서버(200) 간에 데이터 또는 신호를 송신 및 수신하도록 구성될 수 있다.
생체정보 관리서버(200)에 포함된 생물학적 의미결정 엔진(204)는 무선 통신부(201) 내 송신부 및 수신부와 기능적으로 연결되어 송신부 및 수신부가 무선통신부(101)　및 생물학적 의미결정 시스템(100)들 간에 데이터 또는 신호를 송수신하는 과정을 제어하도록 구성될 수 있다. 또한, 생물학적 의미결정 엔진(204)는 전송할 데이터에 대한 각종 처리를 수행한 후 송신부로 전송할 수 있으며, 그 외 수신부가 수신한 데이터에 대한 처리를 수행할 수 있다.
생물학적 의미결정 엔진(204)는 교환된 데이터에 포함된 정보를 포함하여 사용자 상태 평가, 환자의 활동, 식이, 검사, 투약, 처치, 사용자 교육 등 사용자 진료 지침 등에 도움을 주는 정보들을 메모리부(202)에 저장할 수도 있다. 이와 같은 구조를　가지고 서버(200)는 다양한 실시 형태의 방법을 수행할 수 있다.
상기　생물학적　의미　결정　시스템(100)에 저장된 생체정보를 무선 통신 네트워크(300)를 통해 외부 생체정보 관리서버(200)로 전송하도록 제어하는 기능, 및 상기 전송에 대한 응답으로 무선통신부(201)로부터 더 많은 생체정보를 수신하는 무선통신부(101)을 포함하고, 상기 더 많은 생체정보는 상기 생체정보 관리서버(200)가 상기 무신통신 네트워크(300)에서 수신된 생체정보를 미리 정해진 기준에 따라 메모리부(202)에 저장하고 상기　생체정보　관리서버에　있는　생물학적　의미　결정　엔진(204)으로 생체정보 분석을 수행하는 것이고, 상기 생체정보　분석은, 상기 무선통신부(201)에서 수신 받은 사용자의 생체정보, 상기 생체정보 관리서버의　메모리부(202)에 저장된 사용자 상태 평가, 환자의 활동, 식이, 검사, 투약, 처치, 사용자 교육 등 사용자 진료 지침 등에 도움을 주는 정보에서 하나 이상을 이용하여 분석하고 더 많은 생체정보를 제공할 수도 있다.
상기 생체정보를 상기 생물학적　의미　결정　시스템 내 미리 설정된 기준에 따라 재정렬하여 디스플레이부(203)에　디스플레이　하는　기능, 및 상기 생체 분석 정보를 하나 이상의 외부기기로 각각 전송할 수 있는 기능을 더 포함할 수도 있다.
본 발명의 일실시예에 따른 생체분자　값을 이용한 생체정보를 관리하는 시스템에 대하여 보다 구체적인 예를 들어 설명하면, 사용자가　생체분자　정보　및 자신의 체중, 혈압, 혈당 등을 측정하거나 의사의 임상적 판단을 받은 후, 사용자자 단말 또는 상기 무선통신부 내 기 설치된 어플리케이션을 이용하여 사용자 건강상태 정보에 대한 상기 체중, 혈압, 혈당 등의 측정 검사지 또는 의사의 임상적 판단에 대한 진단서/처방전 등을 상기 무선통신부 또는 상기 무선통신부 내 기 설치된 어플리케이션으로 상기 입력된 측정 검사지를　저장한다.
그 후, 상기 생체정보는　생체정보 관리서버(200)로 전송하면, 상기 생체정보 관리서버는 상기 수신된 생체정보를 기반으로 사용자 상태 평가, 환자의 활동, 식이, 검사, 투약, 처치, 사용자 교육 등 사용자 진료 지침 등에 도움을 주는 정보를　메모리부(202)에　저장하는　생물학적　의미　결정　엔진(204)으로　생체정보 분석을 수행할 수 있으며, 이러한 생체정보 분석은 상기 생체정보 관리서버의 설정에 따라 자체적으로 수행될 수 있고, 수기입력 담당자가　직접 디지털 이미지에 나온 수치와 단위, 측정기 모델 명 등을 입력하여 수행될 수도 있다.
상기 생체정보　관리서버(200)생체정보 분석결과는 상기 생체정보 관리서버의　메모리부(202)에 저장될 수 있으며, 상기 저장과 함께 상기 무선통신부(101)로 전송되거나 상기 무선통신부(101)에서 상기 생체정보 관리서버에 저장된 생체정보 분석결과를 모니터링하여 이를 건강관리에 활용할 수 있게 된다.
본 발명의 일실시예에 따른 생체정보를 관리하는 시스템에서, 사용자 건강상태정보는 음식, 운동기록(예를 들어, 운동 시간, 운동 종류, 운동 횟수 등을 기록하거나 저장할 수 있는 물리적 객체 및 관련 어플리케이션의 디지털 이미지화 된 시각적 정보 등을 포함) 등을 포함할 수 있으며, 상기 음식 및 운동기록은 상기 무선통신부(100)를 통해 입력된 후 상기 생체정보 관리서버(200)로 전송됨으로써, 상기 생체정보 관리서버에서 생체정보 분석 수행의 기반이 될 수 있다.
이러한 경우, 상기 생체정보　분석결과는 사용자가 섭취한 음식의 칼로리 정보, 사용자가 운동으로 소모한 칼로리　소모량 등으로 나타내어 질 수 있으며, 위와 같이 본 발명의 실시예에 따르면 사용자가 최소한의 노력으로 자신과 관련된 모든 생체 데이터를 한 곳에서 관리할 수 있다는 효과가 있으며, 또한 사용자가 풍부한 생체 데이터를 바탕으로 하여 사용자의 건강상태를 실시간으로 모니터링하고 질병으로 발전하는 징후를 빨리 알 수 있다는　효과도 존재한다. 그 뿐만 아니라 사용자는 자신과 관련된 모든 생체 데이터를 한 곳에서 관리할 수 있게 되므로, 해당 생체 데이터를 의료 서비스를 제공받을 곳에 전달하면 의료서비스 제공자는 환자의 혈압, 혈당, 과거　질병 이력, 칼로리 섭취 및 칼로리 소모량 등을 정확하게 판단할 수 있게 되어 상기 사용자는 상기 의료서비스　제공자로부터 질적으로 보다 향상된 의료 서비스를 제공받을 수 있게 된다는 효과가 있다.
또한, 상기 생체정보 분석은, 상기 사용자 생체정보의 해석정보(예를 들어, 건강검진 결과지에 대한　상세한 설명 등), 상기 사용자의 건강상태를 측정하는 장치의 교체 주기 정보(예를 들어, 상기 건강상태　측정 장치의 수명, 교체 시기, 주문방법 및 주문 등), 미리 정해진 기간 내 상기 사용자의 생체정보의 통계 정보(예를 들어, 6개월간의 사용자의 생체정보의 변화량 또는 총괄 데이터 등) 및 상기 사용자 생체 정보를 전송할 수 있는 하나 이상의 외부기기 관련 정보(예를 들어, 주변 병원 정보, 주변 병원의 진료 예약 및 해당 병원으로의 생체 관련 정보 전송 등)를 제공하는 것을 포함할 수 있다.
도11은　상기　다양한　생체분자들을　분석하여　생산하는　상기　생체분자정보와　사용자의　건강상태정보를　통합　관리하여　상기　유용한　생체정보를　생산하는　도해로,　분석하고자하는　시료를　세포(세포,　세균 및 바이러스를　포함하는　생체분자)와　액체　시료로　구분하고　세포의　표면에　있는　생체분자는　상기 포획계수법으로　분석하고　상기 세포를　상기　포획리간드로　수확하여　분리한　핵산과　단백질을　추가적으로　분석을　할　수도　있다．　상기 세포 및　액체　시료에서　준비되는　핵산　시료는　nCounter assay 등을　포함하는　표준　분자생물학적　방법으로　분석하며,　상기 세포　및　액체　시료에서　준비되는　단백질　시료는　상기　생체분자　계수방법으로　분석한다.　상기　분석한　결과로부터　하나　또는　그　이상의　생체분자　값을　산정한다.　상기　생물학적　의미결정　시스템(100)으로　상기　특징선택으로　선정된　생체분자들로　사용자의　임상검사　값과　생물학적　의미를　포0朗求징』毁성隙憫ㅊ만─』暈鉞磯?.　사용자가　동의하는　건강상태정보와　상기　생체분자정보를　통합 관리하여　생체정보를　생산하여　사용자의　건강관리에　사용할　수　있다. 이는 예시에 불과하며 다른 구성을 더 포함할 수 있으며, 이와 달리 구성 중 일부를 생략하여 구현될 수도 있다.
이런　기술은　사람뿐만이　아니라　가축,　식물　등에　적용할　수도　있다．
본 발명은 세포,　세균,　바이러스,　조직　및　생체분자로 구성된　군에서　선택되어지는 하나 이상을　분석하는　것을　특징으로　하는　생체분자　계수분석　방법,　키트　 및　장치를 제공하고 이를 이용하여 효율적인 임상의사결정지원시스템을 개발하였다.
본원 발명의 실시예들과 관련된 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 상기 기재의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로, 개시된 방법들은 한정적인 관점이 아닌 설명적 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 발명의 상세한 설명이 아닌 특허청구 범위에 나타나며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
본원에 기재된 상기 생체분자　계수분석　방법, 키트 및 장치를 사용함으로써 극미량(low-abundance)의　생체분자를　포함한　많은 생체분자를　한 튜브에서 내부정도관리를 하면서 동시에　다중 검사하는　방법 및　장치를 제공하며, 이를 이용하여 건강관리를 효과적으로 할 수 있다.
도１은　리포터, 표지리간드, 포획경쟁분자와　고정핵산분자의　구조이고
도２는 항체(a)와 압타머(b)를 이용하여 　코팅계수방법으로 생체분자 계수분석　방법을　설명하는　흐름도이고,
도３은　항체(a)와 압타머(b)를 이용하여 포획계수방법으로 생체분자　계수분석　방법을　설명하는　흐름도이고,
도４는 항체(a)와 압타머(b)를 이용하여 　경쟁계수방법으로 생체분자　계수분석　방법을　설명하는　흐름도이고,
도５는　생체분자 계수분석 장치의　시스템　구성이고,
도６은　생물학적 의미결정 시스템의 소프트웨어 구조이고,
도７은 생물학적 의미 결정엔진에서 통합관리 도구 제어시스템의 역할이고,
도８은 생물학적 의미결정 시스템의 구동 단계이고,
도９는　생물학적 의미결정 시스템이 구동되는 무선통신시스템이고，
도10은　본 발명이 적용되는 무선통신시스템이고,
도11은　다양한 생체분자들을 분석하여 생산한　생체분자정보와　사용자의　건강상태정보를　통합　관리하여　유용한　생체정보를　생산하는　도해이고，
도12는　생체분자 계수분석의　결과　이미지이고,　
도13은　표준물질을 생체분자　포획계수분석에　의해　분석　결과이고,
도14는　표준물질을 생체분자　경쟁계수분석에　의한　분석　결과이고，
도15는　항체리간드를 이용한　생체분자　포획계수분석의　재현성　분석　결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
실시례 1. 포획리간드와　포획경쟁분자의　제조
포획리간드는　리간드와 수확물질을,　포획경쟁분자는　생체분자와　수확물질을　결합시켜　제조하였다. 이하에서　리간드와　생체분자를　분자로　통칭하여　기술하였으며　구분할　필요가　있을　경우만　나누어　기술하였다．
포획리간드 또는 포획경쟁분자는　분자에　직접　자성비드를　결합시키거나,　바이오틴(biotin)이　표지된 단일가닥핵산가닥을　결합시킨 후, 자성비드를　결합시켜　제조하였다.　본　발명에　사용한　리간드와　생체분자는　표 １ 및　표 ２와　같다.
분자와 활성화 자성비드(M-280 Tosylactivated magnetic beads, Dynal Biotech ASA, Norway)를 버퍼용액(0.1 M borate buffer, pH 9.5)에 넣고 상온에서 48시간 반응시켰다. 분자가 결합된 자성비드는 자석을 이용해서 분리가 가능하며, 동일한 버퍼용액으로 비드를 세척하여 결합하지 않은 분자를 제거하였다. 분자가 결합된 자성비드(이하 ‘포획리간드’)는 세척 후 0.1 %의 BSA(Bovine Serum Albumin, Sigma Co.) 용액으로 37℃에서 4시간 반응시켜 분자와 결합하지 않은 토실(tosyl)기를 불활성화시켰다. 이어 수차례 세척 후 버퍼용액(0.1 M PBS, pH 7.4)에 자성비드를 혼합하여 4℃에서 보관하였다.
분자에　대한　스페이서를　수확물질　부가는　먼저,　분자의　바이오틴화로　한쪽　 끝에　바이오틴이　표지되고　다른　한쪽　 끝에　반응성　그룹이　있는　단일가닥핵산을　주문　제조하여(Integrated DNA Technologies사, USA)　수행하였다．　
분자에 대한 반응성그룹의 부가는　Thunder-Link® oligo conjugation system (Innova Biosciences Ltd., 영국)을 사용하여 프로토콜에 따라 실시하였다.　분자에　대한　반응성　그룹의　부가는 100　㎕의 1　mg/ml 분자를 Antibody Activation Reagent 튜브에 첨가하여 실온에서 1시간 반응시켜 활성화시켰다. 반응성　그룹이　부가된　분자와　주문　제작된　단일가닥핵산의 결합은 상기 활성화된 반응용액을 준비된 컬럼을 이용하여 탈염시킨 후, 상기 탈염된 분자와 단일가닥핵산을 적절한 비율로 혼합하여 실온에서 12~24시간 반응시켰다. Conjugate Clean Up Reagent을 상기 반응용액에 첨가하여 10분간 반응시키고 15,000　g에서 5분간 원심분리하여 수확된 바이오틴이　표지된　분자에 Conjugate Clean Up Reagent을 첨가한 후 다시 원심분리하여 정제된 바이오틴이　표지된　분자를 수확하여 바이오틴이　표지된　분자를　제조하였다.
이상과 같이 준비된　바이오틴이 표지된 분자들과 스트렙타비딘이　코팅된 자성비드(Streptavidin-coupled Dynabeads, Dynal Biotech ASA, Norway)를 연속 회전하면서 반응시켜 자성비트가　부가된　분자를　제조하였고　이를　“포획리간드　또는　포획경쟁분자”라고　지칭하였다.
실시례 　2. 표지리간드 및　고정핵산분자의　제조
상기 표지리간드는 생체분자를 인지하여 결합하고 특이 신호를　발생시켜　생체분자를　지시하고 가시화하는　물질로　리간드와　리포터가　결합한　구조이다.　
항체 또는 압타머 리간드 모두에 사용하는　리포터는 ５‘－반응성그룹－스페이서－반복구조부－신호발생부위－스페이서－바이오틴－３’(일반식　1) 구성이다.　압타머를 리간드로 사용할　경우는　５‘－반응성그룹－스페이서－신호발생부－반복구조부－３’(일반식　３)로 구성된 단일가닥핵산(나노스트링 테크놀로지사, Seattle, WA-USA)인　리포터를,　한쪽 끝에 바이오틴을　표지하고 다른　한쪽　 끝에　반응성 그룹이 있는 압타머인　리간드를　주문제작하여　사용할　수도　있다(Integrated DNA Technologies사, USA).
본　발명에 사용하는 리간드는 항체와 압타머를 사용하였으며　표１ 및　표２와　같이　준비하였다.　
표지리간드　합성을　위한　리포터는 ５‘－스페이서－반복구조부－신호발생부위－스페이서-바이오틴－３’인 단일가닥핵산(나노스트링 테크놀로지사, Seattle, WA-USA)을　구입하여　반응성그룹을　단일가닥핵산의　５‘ 끝에　부가하여　준비하였다.　상기　리포터는 바코드　시스템(barcode system)으로 4종류의 dye(Alexa dye 3종류, Cy3)를 길게 늘어트린 바코드 마다 특이한　신호를 형성할 수 있도록 제작된　단일가닥핵산으로 생체분자를 특이적으로 지시할 수 있으며, 최대 800개의 종류에 대해 특이한　신호를 형성할 수 있도록 제작하였다.　리포터 분자는 에피 형광 현미경에 의해 촬영할 때의 ~300　nm 나노 스폿을　형성하며, 각각의 선형 순차적 ７종류의 표시된 영역을 가진다.
구입한 바코드시스템인 단일가닥핵산 리포터분자에　대한　반응성　그룹　부가는　Thunder-Link® oligo conjugation system(Innova Biosciences Ltd., 영국)을 사용하여 프로토콜에 따라 실시하였다. 100μl의 60~100μM 제작된 단일가닥핵산(나노스트링 테크놀로지사, Seattle, WA-USA)을 Oligo Activation Reagent 튜브에 첨가하며, 실온에서 1시간 반응시켜 활성화시켜　수행하였다.
항체에 대한 반응성 그룹의 부가는 100 ㎕의 1 mg/ml 항체를 Antibody Activation Reagent 튜브에 첨가하여 실온에서 1시간 반응시켜 활성화시켰다.
반응성 그룹이 부가된 항체와　리포터분자의 결합은 상기 활성화된 반응용액을 준비된 컬럼을 이용하여 탈염시킨 후, 상기 탈염된 리포터와 항체를 적절한 비율로 혼합하여 실온에서 12 ~ 24시간 반응시켰다. Conjugate Clean Up Reagent을 상기 표지리간드를 반응용액에 첨가하여 10분간 반응시키고 15,000g에서 5분간 원심분리하여 수확된 표지리간드에 Conjugate Clean Up Reagent을 첨가한 후 다시 원심분리하여 정제된 상기 표지리간드를 수확하였다.
고정핵산분자는　리포터분자의　반복구조부의　염기서열에　상보적인　염기서열이며　5‘ 끝에 바이오틴이 표지된 단일가닥핵산(나노스트링 테크놀로지사, Seattle, WA-USA)을　준비하였다.　
　본　발명에　사용된　생체분자 및　이에 상응하는 항체
표적분자　/　항체 카탈로그번호 제조사
E. coli Enoyl-ACP Reductase/ Anti-E. coli Enoyl-ACP Reductase antibody Sino Biological Inc. 중국
Phototropin 1 / Anti-Phototropin 1 antibody Cosmo Bio Co. Ltd. 일본
NGF/NGFβ／Anti-NGF/NGFβ antibody OKBB00229 Aviva Systems Biology
Amyloid beta (A4) Precursor Protein (APP) ／ Anti-Amyloid beta (A4) Precursor Protein (APP) antibody ab12266 abcam
τ (Tau) / Anti-τ (Tau) antibody T6402 SIGMA
phospho-Tau (pSer400) / Anti-phospho-Tau (pSer400) antibody T1700 SIGMA
C Reactive Protein (CRP)/ Anti-C Reactive Protein (CRP)antibody ab99995 abcam
TGF alpha / Anti-TGF alpha antibody ab9585 abcam
IL1 beta / Anti-IL1 beta antibody ab2105 abcam
Serum Amyloid A / Anti-Serum Amyloid A antibody ab200584 abcam
p53 / p53 Antibody (DO-7) MA5-12557 abcam
CEACAM5 / CEACAM5 Polyclonal Antibody MBS170144 BioSource
alpha Fetoprotein / alpha Fetoprotein antibody (alpha-Fetoprotein) (N-Term) ABIN356914 Biocompare
Testosterone / Anti-Testosterone antibody ab31389 abcam
Androstenedione / Anti-Androstenedione Antibody 252315 ABBIOTEC, 미국
Cortisol / Anti-Cortisol antibody C8409 SIGMA
Cortisone / Anti-Cortisone antibody ab157418 abcam
Aldosterone / Anti-Aldosterone Antibody PA1-85149 Thermo Fisher Scientific
Progesterone / Anti-Progesterone antibody ABIN2476209 Biocompare
E. coli / Anti-E. coli antibody ab25823 abcam
Listeria / Anti-Listeria Antibody 01-90-95 KPL, Inc.
Salmonella CSA-1 / Anti-Salmonella CSA-1 Antibody 01-91-99 KPL, Inc.
본　발명에　사용된　생체분자와　이에 상응하는 압타머
표적분자 압타머서열 참고자료
CEA 5'-rGprGprGprGpfCprGprGprAprAprGpfCprGpfUprGpfCpfUprGprGprGprCpfUprAprGprAprApfUprAprApfUprAprApfUprAprAprGprAprAprAprApfCpfAprAprGpfUprApfCpfUpfUpfUpfCprGpfUp-3’ 대한민국　등록특허 10-0667009
5’-rGprGprGprGprGprGprGpfCprGprGprGprGprGpfCprGpfUprGpfCpfUprGprGprGpfCpfCpfCpfCpfCpfUprGpfUpfCprGpfCprGprGprGpfUpfUprGpfCprGprGpfCprGpfUprGprGprGprGprGpfUprGprGprGpfUprGpfCpfCpfUprGprGprGpfUpfCpfCprGpfUprGprGpfCpfCpfCprGprGprGprGprGpfUpfCprGprGpfUprGprGprGpfUpfCpfCpfCpfCpfCpfCp-3’
ＨＥＲ－２ 5‘-fUpfCpfUprAprGpfCpfUpfCpfUpfCpfCpfUpfCpfUprAprGprAprGpfUprGprGprGpfCpfCpfUpfCpfUprAprGprAprGpfUpfUpfUprGprApfCpfUprGp-3’　 대한민국　공개특허 10-2011-0086433
5‘-rAprGprAprGprAprGprGprGprApfUpfUprGprGprApfUprAprGprGpfCprGpfUpfCpfUprGpfCprGpfUprGpfUpfCpfUpfCpfUpfCpfUprGpfC[fCprApfCpfUprApfCpfUprApfUprGprGprGprGp-3’
Interferon-y 5'-rGprGprGprAprGprGprApfCprGprApfUprGpfCprGprGprApfCprApfCpfCprGpfUpfUprAprApfUpfCpfUprGprAprGprGpfCpfCpfCpfUprGpfUpfCpfCpfUprApfUpfUpfCpfCpfUpfUpfCprApfCprGpfCpfCpfUpfCprAprGprAp-3' Aptagen
5'-rGprGprGprAprGprGprApnCprGprApnUprGpnCprGprGpnUprGprGpnUprAprGpnCprGpnCprGprApnUprApnUprAprGpnCprGpnCpnUprGprGpnUprAprGprGprGpnUpnUprGpnCpnCprGprGpnUprGprApnUpnCprAprGprApnCprGprApnCpnUpnCprGpnCpnCpnCprGprAp -
EGFR 5'-rGpfCpfCpfUpfUprAprGpfUprAprApfCprGpfUprGpfCpfUpfUpfUprGprApfUprGpfUpfCprGprApfUpfUpfCprGprApfCprAprGprGprAprGprGpfCp-3 Aptagen
PSMA 5'-rGprGprGprAprGprGprApfCprGprApfUprGpfCprGprGprApfUpfCprAprGpfCpfCprApfUprGpfUpfUpfUprApfCprGpfUpfCprApfCpfUpfCpfCpfUpfUprGpfUpfCprAprApfUpfCpfCpfUpfCprApfUpfCprGprGpfCp-3' Aptagen
Thrombin 5'-dGpdGpdTpdTpdGpdGpdTpdGpdTpdGpdGpdTpdTpdGpdGp-3 Aptagen
Tumor necrosis factor-alpha (TNFa) 5'-dTpdGpdGpdTpdGpdGpdApdTpdGpdGpdCpdGpdCpdApdGpdTpdCpdGpdGpdCpdGpdApdCpdApdAp-3' Aptagen
VEGF (165) 5'-dCpdApdApdTpdTpdGpdGpdGpdCpdCpdCpdGpdTpdCpdCpdGpdTpdApdTpdGpdGpdTpdGpdGpdGpdTp-3' Aptagen
Prion Protein 5'-rGprGprGprAprGprAprAprAprGprGprGprAprAprGpnCpnUpnUprGprAprGprGpnUprGpnCpnUprApnUprGprGprAprGpnUprGprGprAprGprGprAprGpnUpnUprGprAprAprGprGpnUprGpnUpnCprGprGprGprGpnUpnUprGprGpnCprAprGprAprAprGprAprAprGprGpnCprGprAprGpnCprGpnUprApnCprGprGprApnUpnCpnCprApnUpnCp-3 Aptagen
Acetylcholine Receptor Antibody 5'-nUprGprGprGpnCpnCprGprGprAprGprGpnUpnUprAprGpnCpnUpnUprGpnCpnCpnCprApnUprGprGpnCprAprAprGpnCprAprGprGprGpnCprGpnCpnCprApnCprGprGprApnCpnCpnCprAp-3 Aptagen
Human Osteopontin 5'-mCprGprGpmCpmCprApmCprAprGprAprApmUprGprAprAprAprAprApmCpmCpmUpmCprApmUpmCprGprApmUprGpmUpmUprGpmCprApmUprAprGpmUpmUprGp -3 Aptagen
ErbB2 5'-rAprGpfCpfCprGpfCprGprAprGprGprGprGprAprGprGprGprApfUprAprGprGprGpfUprAprGprGprGpfCprGpfCprGprGpfCpfUp-3' Aptagen
HIV-1 R5 gp120 5'-rGprGprGprAprGprApfCprAprAprGprApfCpfUprAprGprApfCprGpfCpfUpfCprAprApfUprGpfUprGprGprGpfCpfCprApfCprGpfCpfCpfCprGprApfUpfUpfUpfUprApfCprGpfCpfUpfUpfUpfUprApfCpfCpfCprGpfCprApfCprGpfCprGprApfUpfUprGprGpfUpfUpfUprGpfUpfUpfUpfUpfCprGprApfCprApfUprGprAprGprApfCpfUpfCprApfCprAprApfCprAprGpfUpfUpfCpfCpfCpfUpfUpfUprAprGpfUprGprAprGprGprGpfUpfUprAprApfUpfUp -3 Aptagen
HIV-1 R5 SU Glycoprotein 5'-rAprApfUpfUprAprApfCpfCpfCpfUpfCprApfCpfUprAprAprAprGprGprGprAprApfCpfUprGpfUpfUprGpfUprGprAprGpfUpfCpfUpfCprApfUprGpfUpfCprGprAprAprGprAprGpfCprGprGpfUpfUprAprAprGprGprGprAprGprApfUpfUpfUprAprGprGpfCprAprGpfCprAprGpfCpfUpfUprGprGprApfCprAprGpfUprGpfUprApfUpfCprGprGpfCpfUprGprAprGpfUpfUprGprAprGpfCprGpfUpfCpfUprAprGpfUpfCpfUpfUprGpfUpfCpfUp-3 Aptagen
Kanamycin 5'-rGprGprGprAprGprAprAprGprGpfCprGprGpfCprGpfCprGpfUprAprGprGpfCprGprAprGpfCpfUpfUpfUprAprGprGpfCpfCpfCprGprApfCprApfUpfUpfCpfCpfCpfCpfUprAprAprAprAprAprAprGpfCpfUpfUprGpfUpfUpfCpfUprApfUpfUpfCprGpfUprGprGprApfCprGprApfUprGpfCprGpfCprApfCp-3 Aptagen
Streptomycin 5'-rGprGprGprAprGprAprAprGprGpfCprGprGpfCprGpfCprGpfUprAprGprGpfCprGprAprGpfCpfUpfUpfUprAprGprGpfCpfCpfCprGprApfCprApfUpfUpfCpfCpfCpfCpfUprAprAprAprAprAprAprGpfCpfUpfUprGpfUpfUpfCpfUprApfUpfUpfCprGpfUprGprGprApfCprGprApfUprGpfCprGpfCprApfCp-3' Aptagen
Salmonella typhimurium 5‘-dApdGpdGpdTpdCpdTpdGpdTpdApdGpdGpdTpdCpdTpdGpdCpdGpdGpdGpdGpdCpdGpdTpdGpdGp-3’ 대한민국　등록특허 10-1459547
5‘-dCpdApdGpdCpdCpdApdGpdGpdApdTpdGpdGpdGpdApdGpdGpdTpdCpdTpdGpdTpdApdGpdGpdTpdCpdTpdGpdCpdGpdGpdGpdGpdCpdGpdTpdGpdGp-3’
Staphylococcus aureus 5'-dGpdCpdApdApdTpdGpdGpdTpdApdCpdGpdGpdTpdApdCpdTpdTpdCpdCpdGpdGpdGpdCpdTpdGpdGpdCpdCpdApdGpdApdTpdCpdApdGpdApdCpdCpdCpdCpdGpdGpdApdTpdGpdApdTpdCpdApdTpdCpdCpdTpdTpdGpdTpdGpdApdGpdApdApdCpdCpdApdCpdApdApdApdApdGpdTpdGpdCpdApdCpdGpdCpdTpdApdCpdTpdTpdTpdGpdCpdTpdApdAp-3' Aptagen
실시례 ３. 생체분자의　준비
생체분자　계수를　코팅계수법, 포획계수법과　경쟁계수법으로　수행하기 아래의　생체분자를　각각 100 ㎍/mL　농도로 만든 후 냉장(4℃) 보관하고, 이 용액을 단계적으로 희석하여　최종 생체분자의　농도를　1,000 pg/mL, 100 pg/mL, 10 pg/mL 0.1 pg/mL　및　０pg/mL이　되도록　하였다.　분석을　위해　각각의　생체분자를　반응용액으로　혼합하여　분석시료를　준비하여　사용하였다.
실시례 ３-1. 코팅계수방법에　사용한　생체분자
항체리간드를　분석을　위한　생체분자는　NGF/NGFβ, Amyloid beta (A4) Precursor Protein (APP), τ (Tau), phospho-Tau (pSer400), C Reactive Protein (CRP), TGF alpha, IL1 beta, Serum Amyloid A, p53, CEACAM5, alpha Fetoprotein 등 11종류의　단백질과 표준물질로 E. coli Enoyl-ACP Reductase(Fabl, 28kD)와 Phototropin 1(nph, 120kD)　등　２종류를 사용하였다.
압타머　리간드를　위한　생체분자는　CEA, HER-2,　Interferon-γ,　EGFR，　PSMA, Thrombin, Tumor necrosis factor-alpha (TNFa), VEGF (165)，　Prion Protein, Acetylcholine Receptor Antibody, Human Osteopontin, ErbB2, HIV-1 R5 gp120, HIV-1 R5 SU Glycoprotein　등의　１4종류의　고분자　단백질을　사용하였다.
실시례 ３-2. 포획계수방법에　사용한　생체분자
항체리간드를　분석을　위한　생체분자는　NGF/NGFβ, Amyloid beta (A4) Precursor Protein (APP), τ (Tau), phospho-Tau (pSer400), C Reactive Protein (CRP), TGF alpha, IL1 beta, Serum Amyloid A, p53, CEACAM5, alpha Fetoprotein 등 11종류의　단백질과　E. coli, ,Listeria, Salmonella CSA-1등　３종의　세균을, 그리고 표준물질로 E. coli Enoyl-ACP Reductase(Fabl, 28kD)와 Phototropin 1(nph, 120kD)　등　２종류를 사용하였다.
압타머　리간드를　위한　생체분자는　CEA, HER－２,　Interferon-y　등의　３종류의　단백질과　Salmonella typhimurium와　Staphylococcus aureus　등의　２종　세균을　사용하였다.
실시례 ３-3. 경쟁계수방법에　사용한　생체분자
항체리간드를 분석을 위한 생체분자는　cortisol, cortisone, testosterone, progesterone, androstendione과 aldosterone　등　６종류의 저분자　Steroid hormone과　 NGF/NGFβ, Amyloid beta (A4) Precursor Protein (APP), τ (Tau), phospho-Tau (pSer400), C Reactive Protein (CRP), TGF alpha, IL1 beta, Serum Amyloid A, p53, CEACAM5, alpha Fetoprotein 등 11종류의 고분자 단백질을, 그리고 표준물질로 E. coli Enoyl-ACP Reductase(Fabl, 28kD)와 Phototropin 1(nph, 120kD)　등　２종류를 사용하였다.
압타머　리간드를 위한 생체분자는　Kanamycin와　Streptomycin　등　２종류의　저분자　항생제와　CEA, HER２,　Interferon-y,　EGFR,　PSMA,　Thrombin,　Tumor necrosis factor-alpha (TNFa),　VEGF (165),　Prion Protein,　Acetylcholine Receptor Antibody, Human Osteopontin, ErbB2, HIV-1 R5 gp120, HIV-1 R5 SU Glycoprotein　등의　14종류의　고분자　단백질을　사용하였다.
실시례 ４. 생체분자　반응
본 발명에서 생체분자 분석을 위한　반응은　하기　반응용액에서　일어나는　리간드－리셉터　반응이다.　반응용액은　항체리간드의 경우는 10　mM PBS　버퍼（137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl， pH 7.4） 이며， 압타머　리간드의　경우는　셀렉스버퍼 (20 mM Tris-Cl buffer, pH 7.6 contained 100 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2 and 0.02% Tween）를　사용하였다.
반응용액에　세균번식저해를 위한　소듐아지드 0.05 내지 0.2%, 비특이적 결합 저해를 위한 우혈청알부민 0.1 내지 0.3%을 포함할　수도　있다. 반응온도는　압타머리간드의　경우는 SELEX 수행온도보다는 낮은 온도에서 수행하는 것이 이상적이며, 바람직하게는　반응온도는　20　내지 30℃의 온도이다.
생체분자　계수를　코팅계수법, 포획계수법과　경쟁계수법으로　수행하기　하기에서　최종적으로　정제되고　표지리간드를　포함하는　복합체를　제조한 다음,　다음과　같이 상기 복합체를 계수하기 위해 준비하였다.　
디스코에　부착된　생체분자－표지분자　복합체,　포획리간드－생체분자－표지리간드　복합체 또는　포획경쟁분자－표지리간드　복합체에서　해리된　표지리간드를　수확하기　위해서,　상기　정제한　물질에　100　㎕의　0.1X SSPE / 0.1 % tween-20　용액을　첨가하고 95 ℃에서 5 분간　처리한　후,　상기　복합체에서　해리된　표지리간드를　포함하는　상징액을　수확하였다.
45 μL의 전체 반응용액을 9 μL씩 분주하여 생체분자 경쟁적　계수 분석법을 위한 분석시료로 사용하였다. 시료 분석은 3 μL의 전체 반응용액을 3회 분석하였다.
실시례 ４-1.　코팅계수방법
25 ㎕의　생체분자　용액을 75 ㎕의 반응용액에 첨가하고 코팅지지체인 나이트로셀룰루로스 막(Nitrocellulose membrane) disc를 넣어 30분간 흔들어 주면서 반응시켜 시료를 준비하였다. 앞서 제작된 １㎕의 표지리간드　용액을 투입하여 30분간 반응시켜 디스크에　부착된　생체분자-표지리간드 복합체를 형성하였다. 과다　표지리간드와　비특이적　결합한　표지리간드를　제거하기　위해서,　상기　반응용액에　있는　상기　형성된　생체분자－표지리간드　복합체가　부착한　디스크를　150 ㎕의 0.1X SSPE / 0.1 % tween-20　용액을　첨가하여 3회 세척하고 정제하였다.
실시례 ４-2. 포획계수방법
25 ㎕의 생체분자 용액,　１㎕의　포획리간드　용액과　１㎕의 표지리간드　용액을 첨가한　100 ㎕의　반응용액을 　실온에서　30분간　연속　회전하면서　반응시켜　생체분자－표지리간드　복합체와　포획리간드－표지리간드　복합체를　형성시켰다.　
과잉　표지리간드, 포획리간드-생체분자－표지리간드　복합체, 비특이적 결합으로　결합한　표지리간드를 제거하기　위해서,　상기　반응용액에　150 ㎕의 반응용액 / 0.1 % tween-20　용액을　첨가하여　５분간　연속　회전한　후　포획리간드의 자성비드 (Invitrogen　사, USA)로　수확하는　방법으로 3 회 정제하였다.　비특이적　결합으로　표지리간드를　제거하기　위해서, 추가적으로　상기　수확한　침전물에 150 ㎕의 0.1X SSPE / 0.1 % tween-20　용액을　첨가하여 포획리간드의 자성비드 (Invitrogen　사, USA)로　수확하는　방법으로　3 회 정제하였다.
실시례 ４-3. 경쟁계수방법
경쟁계수방법은 시료를 구성하는 생체분자,　포획경쟁분자와　표지리간드의　반응은　상기　반응용액에서　일어나는　경쟁적　리간드－리셉터　반응를 이용한 분석이다.
25 ㎕의　생체분자　용액, １㎕의　포획경쟁분자　용액과　１㎕의 표지리간드　용액을 첨가한　100 ㎕　반응용액을 실온에서　30분간　연속　회전하면서　반응시켜　생체분자－표지리간드　복합체와　포획경쟁분자－표지리간드　복합체를　형성시켰다.　
과잉　표지리간드, 생체분자－표지리간드　복합체, 비특이적　결합으로　결합한　표지리간드를　제거하기 위해서, 상기　반응용액에　150 ㎕의 반응용액 / 0.1 % tween-20　용액을　첨가하여　５분간　연속　회전한　후　포획경쟁분자의 자성비드 (Invitrogen　사,　USA)로　수확하는　방법으로 3 회 정제하였다. 비특이적　결합으로　표지분자를　제거하기　위해서, 추가적으로　상기　수확한　침전물에 150 ㎕의 0.1X SSPE / 0.1 % tween-20　용액을　첨가하여 포획경쟁분자의 자성비드 (Invitrogen　사, USA)로　수확하는　방법으로3 회 정제하였다.
실시례 ５.　생체분자　계수분석
생체분자　계수분석을　위해서,　시료는 제조사의 프로토콜을 참조하여 본 발명의 분석방법에 따라 n카운터 프렙 스테이션 (나노스트링 테크놀로지사, Seattle, WA-USA)을 통해 가공되었고, n카운터 디지탈 분석기 (나노스트링 테크놀로지사, Seattle, WA-USA)로 수행하였다.
0.1 %　Tetraspeck 형광 마이크로 스피어 용액(Invitrogen　사, USA)을 1:5,000로 희석한　１㎕의　시약을 상기 실시례4에서　준비된　정제된 복합체 용액에 첨가하여 분석시료를 준비하였다. 상기 준비된　분석시료를 스트렙타비딘이 코팅된 커버 슬립(Optichem, Accelr8 Technology Corporation)이　포함되는　NanoString 유체 장치에 로팅하여　30 um 깊이인 미세유동 채널을 생성하였다. 분석시료는 수압에 의해 채널로 이동하여 상기　복합체에서　해리된　표지리간드의　바이오틴과 결합지지체인 채널에 있는 스트렙타비딘에 강력하게 결합하였다. 고정한 후, 표면을 90 ㎕의　1x TAE 용액으로 한번 세척하고, 각 웰에 40 ㎕의　TAE를 첨가하여 펴지도록 하였다. 표지리간드는 유체 채널에 1 분 동안 160 V /cm을 적용하여 펴진 상태로 정렬하였다.　펴진 표지리간드는 60 ㎕의　500 nM　고정핵산분자(모든 리포터 존재하는 반복구조에 상보적인 바이오틴이 표지된　올리고뉴클레오티드)를 첨가하여 표면에 추가적으로　고정화시켰다. 고정화 과정을 동안, 전류는 5 분 동안 유지되었다. 고정한 후 TAE 용액을 제거하고, 촬영용 안티광표백제(antiphotobleaching) SlowFade 시약 (Invitrogen 사)를 첨가하였다.　
표지리간드가 결합한 결합지지체는 Perfect Focus, 1.4 NA Plan Apo VC 60X oil-immersion lens (Nikontk, 일본), anX-cite 120 metal halide light source (Exfo 사, USA), automated H117 stage (Prior Scientific)와 Smart Shutter (Sutter Instrument, USA)가 갖추어진 Nikon Eclipse(니콘 이클립스) TE2000E로 촬영하였다. 전형적인 촬영 밀도는 FOV당 100~200개의 리포터를 카운팅하였다． 각각의　 field of view에 대해, 다른 여기 파장 (480, 545, 580, 622)에 네 개의 이미지는 MetaMorph(Universal Imaging Corporation, USA)　또는　사용자 정의 소프트웨어로 제어하는 Orca Ag CCD camera (Hamamatsu사, 일본)로　촬영하였다.　분석기 해상도는 600 FOV(field of view)로 설정하였다. 데이터를 다운로딩 하고, 추천된 바와 같이 (n카운터 데이타분석 지침들) 엑셀 상에서 분석하였다. 데이타는 처음에 제공된 양성 검정 대조군의 표준곡선을 사용하여 시료내의 기준물질 및 생체분자를 정상화하였다. 정상화된 값은 시료에 포함된 기준물질들의 값을 사용하여 생체분자 값을 전반적으로 평균 정상화를 수행하였다. 개별적 생체분자들을 위한 3회 수행한 에서 생체분자 수치들의 평균을 취하여 계산하였다.
상기 코팅계수분석법으로 항체 리간드를　이용한　반응은 11종의　단백질, 2종의 표준물질, 그리고 압타머 리간드를 이용한 반응은 14종의 단백질을 분석하였다. 상기 포획계수분석법으로 항체 리간드를　이용한　반응은　11종의 단백질, 3종의 세균, 2종의 표준물질, 그리고 압타머 리간드를 이용한 반응은 3종의 단백질, 2종의 세균을 분석하였다. 상기 경쟁계수방법으로 항체리간드를 이용한 반응은 6종의 저분자인 steroid hormone, 11종의 단백질,　2종의 표준물질,　그리고　압타머　리간드를　이용한　반응은 2종의 저분자인 항생제, 14종의 단백질종을　분석하였다.
생체분자 계수방법에 의한 ２종류의　표준물질로 구성된 모의(mock) 비교구와 표준물질을　포함한　여러　물질로　구성된　대조구에　대해　３회　분석하였다. 항체리간드를　이용한　분석결과를　살펴보면　다음과　같다.　표준물질로　이루어진　모의　비교구는 모든 반응을　위한 표준 농도 곡선을 작성하였으며 반응, 정제 및 포집 효율에서 약간의 차이가　있는 데이터를 정규화하기 위해 사용하였다.　먼저 ２종류　표준물질의 선형성, 동적 범위(dynamic range) 및 재현성을 조사했다. 포획계수법에　의해　표준물질을　분석한　이미지는 도12이며,　도 13은　포획계수법에,　도 14는　경쟁계수법에　의해　모의　비교구의　표준물질을 측정한 결과이며, (N = 6). 로그-로그 플롯상의 점을 중첩하여 나타낸 바와 같이, 각 분석에 대한 제어 신호의 값 (카운트) 0.5 fM과 50 fM 사이에서　재현성이 매우 높았다. 또한　분석　결과는 농도 대 카운트의 선형 회귀 상관 계수는 농도의　2.5 이상 로그에서 ≥0.998로　고도로 선형성이　있었다.
그런 다음, 샘플링 효율과　검출한계(limits of detection)를 검토했다. 샘플링 시스템의 효율은 그 반응에　있어서 대상의 이론적인　분자의 수로 생체분자에 대해 카운트 수를 나눔으로써 추정 할 수　있다. 예를 들어, 각 반응에서 ~0.1　fM의 생체분자는 ~1,800 분자이다. 모의 표본이 생체분자에 대한 평균 측정은 25카운트임으로 샘플링 효율은 ~１％이다. 분석의 검출 한계는 스튜던트 t-test를 이용하여 음성 대조군의 카운트와 가장　낮은 농도인 양성 대조군의 카운트를 비교하여 결정 하였다. 본　발명 반응에서 최저검출한계는 0.1 및 0.5 fM 사이였다.
항체 리간드를 이용한 포획계수법에 의한 13종의 생체분자인 단백질들과 코팅계수법에 의한　압타머　리간드를　이용한　14종의 생체분자인 단백질을 측정하는 시스템의 재현성을 평가하였다. 항체　리간드를　이용한　13종류의 생체분자에　대해　２번의 독립적인 반응에 대한 정규화 된 수는 로그-로그 스케일로 표시하였다(도 15). 본　발명의 시스템의　자료에　대한 선형회귀　분석결과는 상관계수는　0.9982로　재현성이 높음을 알　수　있다. 압타머　리간드를　이용한　경우도　이와　유사한　결과를　얻었다.
１：　생체분자 계수분석 장치　　　10：지지체
20：　시료처리구　　　　 21：시료주입구
22：　시약주입구　　　　 　30：　반응구
31：　혼합기　　　　　　　 32：　자석
33：　히터　　　　　　　　 40：　분석구
41：　슬라이드　　　　　　 42：　전기영동장치
43：　잔여물수집소　　　　 44：　영상장치
50：　유체제어부　　　　　 51：　시약저장고
52：　유체노즐　　　　　　 60：　운영제어시스템
100：　생물학적 의미결정 시스템 101：　무선통신부
102：　메모리부 103：　디스플레이부　
104：　생물학적 의미결정 엔진 200：생체정보 관리 서버
201 : 무선통신부 202 : 메모리부
203 : 디스플레이부 204 : 생물학적 의미결정 엔진
300：　네트워크

Claims (1)

  1. 하나 또는 그 이상의 생체분자로 구성된 시료에서 하나 또는 그 이상의 생체분자를　계수하여　정량하는　방법을　제공하기　위해서,
    상기 시료와 표지리간드를 반응시켜 코팅지지체에 부착된 생체분자와 표지리간드가 결합한 복합체(코팅지지체-생체분자-표지리간드 복합체), 포획리간드, 생체분자와 표지리간드가 결합한 복합체(포획리간드－생체분자－표지리간드 복합체)　또는　포획경쟁분자와 표지리간드가 결합한 복합체(포획경쟁분자－표지리간드　복합체)를　제조하고　수확하는　단계;
    상기　수확한　복합체를　계수하는　단계; 및
    상기 계수한 결과로부터 시료의 생체분자를　분석하여　생체분자　값을 결정하는 단계로 구성하는　것을　특징으로 하는 생체분자 계수분석 방법, 키트 및 장치.
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